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WO2018074614A1 - 자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법 - Google Patents

자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법 Download PDF

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Publication number
WO2018074614A1
WO2018074614A1 PCT/KR2016/011649 KR2016011649W WO2018074614A1 WO 2018074614 A1 WO2018074614 A1 WO 2018074614A1 KR 2016011649 W KR2016011649 W KR 2016011649W WO 2018074614 A1 WO2018074614 A1 WO 2018074614A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
bar magnet
amplification
sample
continuous
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/011649
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
유문조
송강희
신은심
Original Assignee
휴스텝스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 휴스텝스 주식회사 filed Critical 휴스텝스 주식회사
Priority to PCT/KR2016/011649 priority Critical patent/WO2018074614A1/ko
Publication of WO2018074614A1 publication Critical patent/WO2018074614A1/ko

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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/04—Details of the conveyor system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices

Definitions

  • the present invention relates to a one-step automatic test (or diagnostic) equipment in which the extraction and amplification of a gene can be performed continuously. More specifically, the aspirator extracts a certain amount of the genetic material extracted in the gene extraction step, and then the subsequent gene.
  • An automatic quantitative dispenser configured to transfer a certain amount of the genetic material into the dispensing container by transfer to the amplification step, a continuous gene extraction-amplification equipment including the automatic quantitative dispenser, and a gene using the equipment To extract-amplify.
  • Examples of the substance to be tested include DNA, a messenger RNA encoding a protein, proteins related to them, specific metabolites, and the like.
  • the purpose of genetic testing includes prediction of risk of developing a genetic disease, identification of carriers, and the like.
  • Genetic testing requires gene extraction and gene amplification, of which gene extraction begins with the sampling phase.
  • a cotton swab is rubbed on the skin of a chicken and a sample containing the genetic material of contaminants such as bacteria is buried into the swab, and then the swab is placed in a test tube containing a specific solution.
  • various foreign substances are dispersed in a specific solution together with a sample on a cotton swab.
  • proteins or phospholipids surrounding a cell nucleus are destroyed by a specific solution, and the gene in the nucleus is released into a specific solution. You lose.
  • Magnetic beads used in the collecting step are known in the art, and include a ball-shaped magnetic material (for example, ferrous metal), a plastic or glass coating layer surrounding the magnetic material, and a silica coating layer covering the coating layer.
  • the silica coating layer has a property of attracting and attracting genes.
  • the bar magnet (more specifically, the electromagnet)
  • the magnetic material in the magnetic bead is attracted by the magnetic force of the bar magnet, and the magnetic bead gathers and sticks around the bar magnet.
  • a washing step is performed to remove impurities (foreign substances) other than the genes adsorbed on the magnetic beads.
  • washing steps are typically carried out twice, but there is no limit to the number of runs.
  • the washing step is performed in a container (eg, a test tube) containing a washing buffer (washing liquid or washing liquid).
  • a bar magnet having a plurality of magnetic beads stuck to it is transferred from a previous collecting step to a washing step, and then the bar magnet is placed in a test tube containing a washing buffer, and a current is cut off. To eliminate the magnetic force of the electromagnet.
  • the magnetic magnet is re-magnetized by flowing an electric current through the bar magnet from which the magnetic force is removed, so that a plurality of magnetic beads to which a gene (genetic material) is adsorbed again stick to the bar magnet.
  • the bar magnet which has a plurality of magnetic beads attached thereto, is transferred to the second washing step, and as described in the first washing step, the magnetic force of the bar magnet is removed, and after a certain time, the magnetic force of the bar magnet is reset.
  • the second wash is performed by recovering.
  • This gene elution step is performed using an elution buffer (eluent) that prevents the gene from sticking to the magnetic beads.
  • elution buffer eluent
  • the magnetic beads adhering to the rod magnets are dispersed in the ion buffer by inserting the bar magnets transferred from the previous washing step into the gene eluting step into a test tube containing the illu- tion buffer and blocking the current.
  • Patent Document 2 gene extraction method in one step
  • Patent Document 4 automatic purification device, multi-well plate kit, and a method of extracting nucleic acids from biological samples.
  • Eluents containing only genes through each of the above steps are quantified using a pipette or a divider, and then injected into a PCR (Polymerase Chain Reaction) amplifier capable of temperature control, thereby generating gene growth (amplification).
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • Patent Document 1 gene amplification apparatus and its production method
  • Patent Document 3 non-contact heating gene amplification system
  • Patent Document 1 Publication No. 10-2015-0024050
  • Patent Document 2 Publication No. 2002-0029477
  • Patent Document 3 Registration No. 10-1302748
  • Patent Document 4 Registration No. 10-1025135
  • the present invention has been made to solve the problems of the conventional genetic test equipment, and provides an automatic quantitative divider capable of transplanting a certain amount of the Illution buffer containing the gene from the gene extraction device to the gene amplification device.
  • the purpose is to.
  • the continuous gene extraction-amplification equipment employs a permanent magnet as a component for attracting magnetic beads used for gene collection, so that the equipment is The purpose is to provide a miniaturized and portable equipment.
  • the present invention has another object to provide a method in which the extraction and amplification of the gene can be carried out continuously through a series of processes.
  • a volume of liquid is formed in response to a volume change portion formed at one end of the connecting end to which the external actuator can be coupled, and a volume change portion generated when the external actuator is driven while being coupled to the connecting end of the volume variable. And a pipette portion connected to the other end of the volume variable portion so as to be sucked or discharged, and a locking jaw formed on the outer circumferential surface of the pipette portion.
  • a sample kit seat where a sample kit capable of performing gene extraction through an automated series of steps is placed, a PCR amplifier for performing gene amplification, and a waste unit disposed between the sample kit seat and the PCR amplifier;
  • a continuous gene extraction-amplification device comprising a rod magnet moving rail for transferring a rod magnet from a sample kit seating part to a PCR amplifier according to a given processing recipe, wherein the sample kit is for fitting at the end of the rod magnet.
  • a pollution prevention tip storage unit in which the pollution prevention tip is stored;
  • a magnetic bead storage unit having a plurality of magnetic beads having magnetic beads that can stick to the rod magnets and silica coating layers to which the genes can be adsorbed;
  • a sample sample storage unit capable of injecting a liquid sample in which genes and inevitable impurities are mixed; Washing buffer storage for relatively high impurity concentration while increasing the gene concentration;
  • An illution buffer storage unit configured to store an illution buffer for containing only genes;
  • an automatic metering dispenser storage unit in which the metering dispenser is built in [1] is spaced apart from each other, and the disposal part includes an anti-fouling tip inserted at the end of the bar magnet and at the end of the bar magnet.
  • Continuous gene extraction-amplification equipment characterized in that consisting of a configuration formed on one side of the notch to enable separation (uncut).
  • a continuous gene extraction-amplification method characterized by automating all processes from gene extraction to gene amplification using the continuous gene extraction-amplification equipment described in [2] or [3].
  • the extraction and amplification of the gene can be automatically performed through a series of continuous processes.
  • the present invention is to overcome the difficulty of carrying a large volume by the components such as coils when using an existing electromagnet, using a permanent magnet to reduce the size to a small enough to carry a series of extraction and amplification while carrying in the field The process can be carried out efficiently.
  • FIG. 1 is a schematic configuration and use state of the automatic metering dispenser according to an embodiment of the present invention in chronological order, (a) is compressed by an external actuator in a state in which the metering dispenser is inserted into the test tube In this state, (b) shows the compression state in which the compression by the external actuator is performed in the state of (a), and (c) indicates that the external actuator moves in the opposite direction to the previous state in the state of (b).
  • the liquid in the test tube represents a fixed amount suction state in which a predetermined amount is sucked into the pipette part of the automatic metering dispenser. Departure state.
  • Figure 2 is a block diagram showing the schematic configuration of a continuous gene extraction-amplification equipment including an automatic quantitative divider according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a plan view illustrating an example of a sample kit in FIG. 2.
  • FIG. 4 is a view for explaining a process of continuously extracting and amplifying a gene using the continuous gene extraction-amplification equipment shown in FIG.
  • FIG. 5 is another diagram for describing a series of processes of continuously extracting and amplifying genes using the continuous gene extraction-amplification equipment shown in FIG. 2, and correspond to steps 3 to 6 of FIG. 4.
  • FIG. 1 illustrates a schematic configuration and use state of the automatic quantitative dispenser 100 according to an embodiment of the present invention in chronological order, (a) indicates that the automatic quantitative divider 100 is connected to the test tube 300. The reference state in which the compression by the external actuator is not performed in the inserted state is shown, and (b) indicates the compression state in which compression by the external actuator is performed in the state of (a).
  • (c) is a quantitative amount of the liquid 400 in the test tube 300 is sucked into the pipette portion 120 of the automatic quantitative dispenser 100 by operating the external actuator in the opposite direction in the state of (b) Indicated the suction state, (d) shows a departure state in which the automatic metering dispenser 100, which has sucked a certain amount of liquid 400, is separated from the test tube 300 and can be transferred to a subsequent step or a subsequent step.
  • the automatic metering dispenser 100 includes a volume variable part 110 having a connection end 111 to which an external actuator can be coupled at one end thereof, and an external actuator.
  • the volume variable portion 110 In response to the volume change amount of the volume variable portion 110 generated when it is driven in a state coupled to the connection end 111 of the volume variable portion 110, the volume variable portion 110 so as to suck or discharge a certain amount of liquid. It comprises a pipette 120 connected to the other end of the) and the locking step 130 formed on the outer peripheral surface of the pipette 120.
  • the volume variable part 110 has a bellows shape.
  • the volume (inner volume) decreases and when the external actuator moves away from the pipette part 120, the volume increases, and the pipette part 120 A predetermined amount of liquid is sucked in the c), or a predetermined amount of liquid is discharged from the pipette 120.
  • the locking jaw 130 formed on the outer circumferential surface of the pipette 120 is preferably an annular ring, but may be a form in which a part of the ring is cut.
  • the automatic metering dispenser 100 can be manufactured integrally by, for example, plastic injection molding.
  • the automatic quantitative divider 100 was developed for automatically transferring a certain amount of an illumination buffer containing a gene from a gene extraction device to a gene amplification device.
  • Other materials for example liquid chemicals, may be used for metered delivery.
  • the automatic metering dispenser 100 can be used wherever a quantitative transfer of liquid substance is required.
  • the automatic metering dispenser 100 is versatile and therefore, to emphasize that there is no limitation in the range of use, the external actuator for the drive element causing the volume change of the volume variable portion 110 is to be emphasized. It is given a comprehensive name, if limited to the field of genetic testing equipment, this external actuator corresponds to the bar magnet (200).
  • the bar magnet 200 is preferably composed of a permanent magnet.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a schematic configuration of a continuous gene extraction-amplification apparatus according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a plan view showing an example of a sample kit in FIG.
  • the continuous gene extraction-amplification equipment includes a sample in which a sample kit A1, in which a gene extraction can be performed through an automated series of processes, is placed.
  • the kit seating portion (A), the PCR amplifier (D) for performing gene amplification, the waste portion (C) disposed between the sample kit seating portion (A) and the PCR amplifier (D), and a given treatment recipe (operation method) It consists of a bar magnet moving rail (B) for transferring the bar magnet 200 toward the PCR amplifier (D) from the sample kit seating portion (A) according to the).
  • the rod magnet moving rail (B) is provided over the sample kit seating portion (A) and the PCR amplifier (D).
  • the bar magnet 200 is not only movable in the horizontal direction along the bar magnet moving rail (B), as shown in Figure 2, the sample kit seating portion (A) and waste (C) and the PCR amplifier ( It is comprised so that lifting up and down in the vertical direction toward D) is possible.
  • the sample kit A1 has a structure of 7 columns ⁇ 10 rows, and the number of rows may vary.
  • the sample kit A1 is formed in a row with a total of seven storage units spaced from each other, specifically, an anti-contamination tip storage unit in which an anti-contamination tip 500 for inserting at an end of the bar magnet 200 is stored.
  • a magnetic bead storage unit (a2) storing a plurality of magnetic beads having a silica coating layer capable of adsorbing magnetic material and genes that can stick to the rod magnet 200, and a liquid mixed with genes and unavoidable impurities
  • a sample sample storage unit (a3) capable of injecting a sample of the sample, two washing buffer storage units (a4 and a5) for relatively high impurity concentration and relatively high impurity concentration, and an illution buffer for containing only genes
  • the waste portion (C), as illustrated in Figure 4, the notch that allows the entry of the bar magnet 200 and the separation and removal of the contamination prevention tip 500 fitted to the end of the bar magnet 200 is one side. Consists of a configuration formed on.
  • the PCR amplifier D is provided above the amplifying unit D1, the lower heater D2 fixedly installed below the amplifying unit D1, and above the amplifying unit D1 to the amplifying unit D1. It consists of a movable upper heater D3, and the upper heater moving rail D4 in which the upper heater D3 is transportably installed. Since this configuration is known in the art, a detailed description thereof will be omitted.
  • FIG. 4 is a view illustrating a process of continuously extracting and amplifying a gene using a continuous gene extraction-amplification apparatus according to the present invention
  • FIG. 5 is a diagram corresponding to steps 3 to 6 of FIG.
  • the sample kit A1 illustrated in FIG. 3 is disposed on the sample kit seating portion A.
  • FIG. 3 is a diagrammatic representation of the sample kit seating portion A.
  • the bar magnet 200 is moved to just above the contamination prevention tip storage part a1 of the sample kit A1.
  • the anti-fouling tip 500 of the rubber material contained in the anti-fouling tip storage unit a1 is inserted into the end of the bar magnet 200 (1 step).
  • the bar magnet 200 When the anti-fouling tip 500 is covered on the end of the bar magnet 200, the bar magnet 200 is raised as it is, and then the bar magnet 200 is moved directly above the magnetic bead storage unit a2.
  • the magnetic bead 600 contained in the magnetic bead storage part a2 includes a ball-shaped magnetic body 610, a coating layer 620 of plastic or glass material surrounding the magnetic body 610. Since it is composed of a silica coating layer 630 surrounding the coating layer 620, when the end of the bar magnet 200 into the magnetic bead storage portion (a2), the plurality of magnetic beads stored in the magnetic bead storage portion (a2) Magnetic bead 600 is stuck to the bar magnet 200 (step 2).
  • a predetermined amount of liquid that is, a sample sample
  • a predetermined amount of liquid that is, a sample sample
  • the protein or phospholipid surrounding the cell nucleus is destroyed by a specific solution and the gene in the cell nucleus is released is injected into the sample sample storage unit a3 in advance.
  • the bar magnet 200 is moved to just above the washing buffer storage unit a4.
  • the bar magnet 200 When the bar magnet 200 is located directly above the washing buffer storage unit a4, the bar magnet 200 is lowered to lock the end of the bar magnet 200 to which the magnetic bead 600 is attached to the washing buffer. Vibration (shake or churning) in, to cause the impurities attached to the magnetic beads 600 with the gene to some extent to fall off (step 4).
  • step 5 After raising the bar magnet 200 to which the magnetic bead 600 is stuck, it moves to the second washing buffer storage unit a5 and repeats the same process as in step 4 (step 5). .
  • the bar magnet 200 to which the magnetic beads 600 are attached is moved to the upper portion of the illu- tion buffer storage a6, and then lowered to enter the illu- tion buffer storage a6, and the magnetic beads 600 are moved. While the portion of the bar magnet 200 is attached to the vibration buffer is applied to the vibration state, the gene is released from the surface of the magnetic bead 600, while the magnetic bead 600 itself is a bar magnet 200 Make sure they stick together (step 6).
  • the bar magnet 200 is moved to the place where the waste portion C is located, and then the rod magnet is lifted or the waste portion C is raised and lowered to prevent contamination of the rod magnet 200. Peel off tip 500.
  • the bar magnet 200 is moved immediately above the automatic metering dispenser storage unit a7 of the sample kit A1, and then lowered. It is coupled to the connection end 111 (step 8).
  • the bar magnet 200 to which the automatic quantitative divider 100 is coupled is moved upward and lowered to the illu- tion buffer storage unit a6, and then lowered. This sucks into the pipette 120 of the automatic metering dispenser 100.
  • the bar magnet 200 to which the automatic quantitative divider 100 is coupled is moved to the PCR amplifier D, while the upper heater D3 of the PCR amplifier D is moved to either side of the amplifier D1.
  • the pipette part 120 is inserted into the amplification part D1, and the volume variable part (s) into the bar magnet 200 is discharged from the pipette part 120 containing an amount of genes. Press 110).

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Abstract

본 발명에 따른 자동 정량 분주기는, 막대자석이 결합 가능한 접속단이 일측 단부에 형성된 체적가변부와, 체적가변부의 체적 변화량에 대응하여 일정량의 액체를 흡입 또는 배출할 수 있도록 체적가변부의 타측 단부에 연결된 피펫부와, 피펫부의 외주면에 형성된 걸림턱을 포함하여 구성된다.

Description

자동 정량 분주기 및 상기 분주기를 포함하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비와 연속식 유전자 추출-증폭 방법
본 발명은 유전자의 추출과 증폭이 연속으로 이루어질 수 있는 원-스텝 자동 검사(또는 진단) 장비에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 유전자 추출 단계에서 추출된 유전자 물질을 일정량 흡입한 다음, 후속 공정인 유전자 증폭 단계로 이송하여, 유전자 물질을 분주 용기 내에 일정량 주입(분주)할 수 있도록 구성된 자동 정량 분주기와, 이 자동 정량 분주기를 포함하여 구성된 연속식 유전자 추출-증폭 장비 및 상기 장비를 사용하여 유전자를 추출-증폭하는 방법에 관한 것이다.
분자생물학·유전자공학 등이 발전하면서 동물이나 인간을 대상으로 한 유전자 검사가 도입·응용되고 있다.
유전자 검사의 대상 물질로서는, DNA나 단백질을 코딩하는 메신저 RNA 및 이들과 관련이 있는 단백질과 특정 대사물 등을 들 수 있다.
또한, 유전자 검사를 행하는 목적으로는, 유전 질환이 나타날 위험성의 예측과 보인자의 동정 등이 포함된다.
유전자 검사는 유전자 추출과 유전자 증폭을 필수로 하며, 그 중, 유전자 추출은 검체 채취 단계로부터 시작된다.
예로서, 검체 채취 단계에서는, 닭의 피부에 면봉을 비벼, 박테리아와 같은 오염물의 유전자 성분이 포함되어 있는 검체를 면봉에 묻게 한 후, 이 면봉을 특정 용액이 담겨 있는 시험관에 집어넣는다. 이렇게 하면, 면봉에 묻어 있는 검체와 더불어 여러 가지 이물질이 특정 용액에 분산되고, 이 과정에서, 세포 핵을 감싸고 있는 단백질이나 인지질이 특정 용액에 의해 파괴되어, 핵 속에 들어 있는 유전자가 특정 용액에 풀어지게 된다.
이어서, 시험관 속의 특정 용액에 분산되어 있는 유전자를, 마그네틱 비드를 사용하여 포집하는 포집 단계가 실시된다.
포집 단계에서 사용하는 마그네틱 비드는, 이 기술분야에서는 공지된 것으로서, 볼 형상의 자성체(예를 들면, 철 금속)와, 자성체를 둘러싸는 플라스틱이나 유리 재질의 피복층과, 이 피복층을 감싼 실리카 코팅층으로 구성되어 있는데, 이 실리카 코팅층은, 유전자를 끌어당겨 흡착하는 성질을 지니고 있다.
따라서, 다수의 마그네틱 비드를 시험관 내에 투입하면, 특정 용액에 분산되어 있던 유전자가 마그네틱 비드의 표면(즉, 실리카 코팅층)에 달라붙게 된다.
이 상태에서, 막대자석(보다 구체적으로는, 전자석)을 시험관 내에 집어넣으면, 마그네틱 비드 속의 자성체가 막대자석의 자력에 이끌려, 마그네틱 비드가 막대자석 주위로 모여들어 달라붙게 된다.
이어서, 마그네틱 비드에 흡착된 유전자 이외의 불순물(이물질)을 제거하는 세척 단계가 실시된다.
*세척 단계는 통상적으로 2회 실시되지만, 실시 횟수에 어떤 제한이 있는 것은 아니다. 또한, 세척 단계는 워싱 버퍼(세척액 또는 세정액)가 담겨 있는 용기(예를 들면, 시험관)에서 행해진다.
보다 구체적으로, 제1세척 단계에서는, 다수의 마그네틱 비드가 달라붙어 있는 막대자석을 이전의 포집 단계에서 세척 단계로 이송한 다음, 이 막대자석을 워싱 버퍼가 담겨 있는 시험관 내에 집어넣고, 전류를 차단하여 전자석의 자력을 제거한다.
이리하면, 막대자석에 달라붙어 있던 다수의 마그네틱 비드가 막대자석으로부터 떨어져 나와 시험관 내의 워싱 버퍼에 분산되게 된다.
이후, 자력이 제거된 막대자석에 전류를 흘려 막대자석을 다시 자화시킴으로써 유전자(유전물질)가 흡착되어 있는 다수의 마그네틱 비드가 다시 막대자석에 달라붙게 한다.
이어서, 다수의 마그네틱 비드가 달라붙어 있는 이 막대자석을 제2세척 단계로 이송하여, 제1세척 단계에서 설명한 바와 동일하게, 막대자석의 자력을 제거하고, 일정 시간 경과 후에 막대자석의 자력을 다시 회복시킴으로써 2회째 세척을 행한다.
다음으로, 유전자 용출 단계가 실시된다.
이 유전자 용출 단계는, 유전자가 마그네틱 비드에 달라붙지 않게 하는 일루션 버퍼(용리액)를 사용하여 수행된다.
보다 구체적으로, 이전의 세척 단계에서 유전자 용출 단계로 이송되어 온 막대자석을, 일루션 버퍼가 담겨 있는 시험관에 집어넣고 전류를 차단함으로써, 막대자석에 달라붙어 있던 마그네틱 비드를 일루션 버퍼에 분산시킨다.
이 상태에서 일정 시간이 경과한 후, 막대자석에 전류를 다시 흘려 자화시키면, 유전자가 떨어져 나간 마그네틱 비드만 막대자석에 달라붙게 된다.
이 외의 유전자 추출 방법이 기재된 선행기술문헌으로서, 예를 들면, 특허문헌 2(한 단계에 의한 유전자 추출 방법)와 특허문헌 4(자동정제장치, 멀티 웰 플레이트 키트 및 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 방법) 등이 공지되어 있다.
이상의 각 단계를 거쳐 유전자만 들어 있게 된 용리액은 피펫 등의 분주기를 사용하여 정량을 취한 후, 온도조절이 가능한 PCR(Polymerase Chain Reaction) 증폭기에 주입함으로써, 유전자 증식(증폭)이 이루어진다.
다양한 유전자 증폭 방법이 특허문헌 1(유전자 증폭 장치 및 이의 제조 방법)과 특허문헌 3(비접촉 가열식 유전자 증폭시스템) 등으로 공지되어 있다.
그런데 현존하는 유전자 검사 장비는 유전자(핵산) 추출장치와 유전자 증폭장치가 별개로 구성되어 있어, 유전자 추출에서 유전자 증폭까지의 과정을 자동화하지 못하고 있는 실정이다.
그 이유는, 유전자 추출장치에 의해 추출된 유전자를 함유하고 있는 용리액(일루션 버퍼)을, 유전자 증폭장치에 자동으로 공급할 수 있는 정량 분주기가 없기 때문이다.
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 1) 특허문헌 1: 공개번호 10-2015-0024050
(특허문헌 2) 특허문헌 2: 공개번호 특2002-0029477
(특허문헌 3) 특허문헌 3: 등록번호 10-1302748
(특허문헌 4) 특허문헌 4: 등록번호 10-1025135
본 발명은 이러한 종래 구성의 유전자 검사 장비가 갖고 있는 문제점을 개선하기 위해 안출된 것으로, 유전자가 함유된 일정량의 일루션 버퍼를, 유전자 추출장치로부터 유전자 증폭장치로 이식할 수 있는 자동 정량 분주기를 제공하는 데에 목적이 있다.
또한, 본 발명은 이러한 자동 정량 분주기를 포함하여 구성되는 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 제공하는 데에 다른 목적이 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 실시형태에 따른 연속식 유전자 추출-증폭 장비는, 유전자 포집에 사용되는 마그네틱 비드를 끌어 모으는 구성요소로서 영구자석을 채용함에 따라, 전자석을 채용한 경우와 비교하여, 장비가 소형화되어 휴대가 가능한 장비를 제공함에 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 유전자의 추출과 증폭이 일련의 과정을 통해 연속적으로 시행될 수 있는 방법을 제공하는 데에 또 다른 목적이 있다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 구성상 특징은 다음과 같다.
[1] 외부 작동기가 결합 가능한 접속단이 일측 단부에 형성된 체적가변부와, 외부 작동기가 체적가변부의 접속단에 결합된 상태에서 구동될 때 발생하는 체적가변부의 체적 변화량에 대응하여 일정량의 액체를 흡입 또는 배출할 수 있도록 체적가변부의 타측 단부에 연결된 피펫부와, 피펫부의 외주면에 형성된 걸림턱을 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 자동 정량 분주기.
[2] 자동화된 일련의 과정을 통해 유전자 추출을 실행할 수 있는 시료 키트가 재치되는 시료 키트 안착부와, 유전자 증폭을 실행하는 PCR증폭기와, 시료 키트 안착부와 PCR증폭기 사이에 배치되는 폐기부와, 주어진 처리 레시피에 따라 시료 키트 안착부로부터 PCR증폭기 쪽으로 막대자석을 이송하는 막대자석 이동레일을 포함하여 구성되는 연속식 유전자 추출-증폭 장비로서, 그 중 시료 키트는, 막대자석의 단부에 끼우기 위한 오염방지 팁이 저장된 오염방지 팁 저장부와; 막대자석에 달라붙을 수 있는 자성체 및 유전자가 흡착될 수 있는 실리카 코팅층을 가진 다수의 마그네틱 비드가 저장된 마그네틱 비드 저장부와; 유전자 및 불가피한 불순물이 섞여 있는 액상의 검체를 주입할 수 있는 샘플 검체 저장부와; 유전자 농도는 상대적으로 높이면서 불순물 농도는 상대적으로 낮추는 워싱 버퍼 저장부와; 유전자만 함유되도록 하는 일루션 버퍼가 저장된 일루션 버퍼 저장부; 및 상기 [1]에서의 자동 정량 분주기가 내장된 자동 정량 분주기 저장부가 서로 간격을 두고 배치된 구성으로 이루어지며, 또한, 폐기부는, 막대자석의 진입과 막대자석의 단부에 끼워진 오염방지 팁의 분리제거(벗김)를 가능하게 하는 노치가 일측에 형성된 구성으로 이루어진 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비.
[3] 상기 [2]에 있어서, 둘 이상의 워싱 버퍼 저장부가 서로 간격을 두고 인접하여 배치된 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비.
[4] 상기 [2] 또는 [3]에 기재된 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 사용하여 유전자 추출에서부터 유전자 증폭까지의 모든 과정을 자동화한 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 방법.
본 발명에 따르면, 간단한 구성의 자동 정량 분주기를 사용함으로써, 유전자의 추출과 증폭이 일련의 연속된 과정을 통해 자동으로 행해질 수 있다.
본 발명은 기존의 전자석을 사용시의 코일등의 구성품에 의해 부피가 커져서 휴대가 어려운 점을 극복하고자, 영구자석을 사용하여 그 크기를 휴대가 가능한 정도로 작게하여서 현장에서 휴대하면서 추출과 증폭의 일련의 과정을 효율적으로 실시할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 자동 정량 분주기의 개략적인 구성과 사용 상태를 시간 순으로 도시한 것으로서, (a)는 자동 정량 분주기가 시험관에 삽입된 상태에서 외부 작동기에 의한 압축이 행해지지 않은 기준상태를 나타내고, (b)는 (a)의 상태에서 외부 작동기에 의한 압축이 행해진 압축상태를 나타내며, (c)는 (b)의 상태에서 외부 작동기가 그 전과 반대방향으로 움직여 시험관 속의 액체가 자동 정량 분주기의 피펫부 내에 일정량 흡입된 정량 흡입상태를 나타내고, (d)는 일정량의 액체를 흡입한 자동 정량 분주기가 시험관으로부터 분리되어 후속단계 또는 후속공정으로 이송 가능하게 된 이탈상태를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 자동 정량 분주기를 포함하여 구성된 연속식 유전자 추출-증폭 장비의 개략적인 구성을 나타낸 블록도.
도 3은 도 2에 있어서의 시료 키트의 일 예를 나타낸 평면도.
도 4는 도 2에 도시된 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 사용하여 연속적으로 유전자를 추출-증폭하는 과정을 설명하기 위한 도면.
도 5는 도 2에 도시된 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 사용하여 연속적으로 유전자를 추출-증폭하는 일련의 과정을 설명하기 위한 또 다른 도면으로서, 도 4의 ③∼⑥단계에 대응되는 도면.
본 발명을 충분히 이해시키기 위해, 본 발명의 바람직한 실시형태가 첨부 도면에 의거하여, 이하에서 구체적으로 설명된다.
여기서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 형태로 변형될 수 있으므로, 본 발명의 범위가 아래에서 설명하는 실시형태로 국한되어 해석되어서는 안 된다. 다시 말해, 아래에서 설명되는 실시형태는 이 기술 분야에서 평균적인 지식을 가진 자가 본 발명을 더욱 완전하게 이해할 수 있게 하는 용도로만 제공되는 것이다.
또한, 각 도면에 있어서, 주요 구성요소의 형상 등은 실시형태에 관한 설명이 더 잘 이해되도록 하기 위해, 과장되게 표현되어 있을 수 있다.
또한, 본 발명의 기술 요지를 불필요하게 흩트릴 수 있다고 판단되는 공지의 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략된다.
[자동 정량 분주기의 구성]
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 자동 정량 분주기(100)의 개략적인 구성과 사용 상태를 시간 순으로 도시한 것으로, (a)는 자동 정량 분주기(100)가 시험관(300)에 삽입된 상태에서 외부 작동기에 의한 압축이 행해지지 않은 기준상태를 나타내고, (b)는 (a)의 상태에서 외부 작동기에 의한 압축이 행해진 압축상태를 나타낸다. 또한, (c)는 (b)의 상태에서 외부 작동기가 이전과 반대방향으로 작동하여 시험관(300) 속의 액체(400)가 자동 정량 분주기(100)의 피펫부(120) 내에 일정량 흡입된 정량 흡입상태를 나타내고, (d)는 일정량의 액체(400)를 흡입한 자동 정량 분주기(100)가 시험관(300)으로부터 분리되어 후속단계 또는 후속공정으로 이송 가능하게 된 이탈상태를 나타낸다.
도 1에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명의 일 실시형태에 따른 자동 정량 분주기(100)는, 외부 작동기가 결합 가능한 접속단(111)이 일측 단부에 형성된 체적가변부(110)와, 외부 작동기가 체적가변부(110)의 접속단(111)에 결합된 상태에서 구동될 때 발생하는 체적가변부(110)의 체적 변화량에 대응하여 일정량의 액체를 흡입 또는 배출할 수 있도록 체적가변부(110)의 타측 단부에 연결된 피펫부(120)와, 피펫부(120)의 외주면에 형성된 걸림턱(130)을 포함하여 구성되어 있다.
체적가변부(110)는 벨로우즈 형태로서, 외부 작동기가 피펫부(120) 쪽으로 움직일 때에는 체적(내부용적)이 감소하고, 피펫부(120)로부터 멀어지는 쪽으로 움직일 때에는 체적이 증가하여, 피펫부(120) 내에 일정량의 액체가 흡입되거나, 또는, 피펫부(120)로부터 일정량의 액체가 배출되도록 되어 있다.
피펫부(120)의 외주면에 형성된 걸림턱(130)은 환상의 링인 것이 바람직하지만, 링의 일부분이 절개된 형태여도 무방하다.
이 자동 정량 분주기(100)는, 예를 들면, 플라스틱 사출 성형에 의해 일체로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시형태에 따른 자동 정량 분주기(100)는, 유전자를 함유하고 있는 일정량의 일루션 버퍼를, 유전자 추출장치로부터 유전자 증폭장치로 자동으로 이송하기 위해 개발된 것이지만, 유전자 이외의 다른 물질, 예를 들면 액상의 화학 물질을 정량 이송하는 데에 사용해도 무방하다.
다시 말해, 본 발명에 따른 자동 정량 분주기(100)는 액상 물질의 정량 이송이 요구되는 곳이라면, 어디라도 사용 가능하다.
이와 같이, 본 발명에 따른 자동 정량 분주기(100)는 범용성이 있기 때문에, 사용범위에 제한이 없다는 점을 강조하기 위해, 체적가변부(110)의 체적 변화를 야기하는 구동 요소에 대해 외부 작동기라는 포괄적인 명칭을 부여하였는데, 유전자 검사 장비 분야로만 국한할 경우, 이 외부 작동기는 막대자석(200)에 대응된다.
상기 막대자석(200)은, 바람직하게는 영구자석으로 구성된다.
[연속식 유전자 추출-증폭 장비의 구성]
도 2는 본 발명의 일 실시형태에 따른 연속식 유전자 추출-증폭 장비의 개략 구성을 나타낸 블록도이고, 도 3은 도 2에 있어서의 시료 키트의 일 예를 나타낸 평면도이다.
도 2 및 도 3에 예시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시형태에 따른 연속식 유전자 추출-증폭 장비는, 자동화된 일련의 과정을 통해 유전자 추출을 실행할 수 있는 시료 키트(A1)가 재치되는 시료 키트 안착부(A)와, 유전자 증폭을 실행하는 PCR증폭기(D)와, 시료 키트 안착부(A)와 PCR증폭기(D) 사이에 배치되는 폐기부(C), 및 주어진 처리 레시피(작동방식)에 따라 시료 키트 안착부(A)로부터 PCR증폭기(D) 쪽으로 막대자석(200)을 이송하는 막대자석 이동레일(B)을 포함하여 이루어진 형태로 구성되어 있다.
보다 구체적으로, 상기 막대자석 이동레일(B)은, 시료 키트 안착부(A)와 PCR증폭기(D) 사이의 상방에 걸쳐 설치되어 있다.
또한, 상기 막대자석(200)은 도 2에 도시된 바와 같이 막대자석 이동레일(B)을 따라 수평방향으로 이동 가능할 뿐 아니라, 시료 키트 안착부(A)와 폐기부(C)와 PCR증폭기(D)를 향해 수직방향으로 승강 가능하게 구성되어 있다.
상기 시료 키트(A1)는, 도 3에 예시된 바와 같이, 7열×10행의 구조로 이루어져 있는데, 이 행 수는 달라질 수 있다.
시료 키트(A1)는 하나의 행에 총 7개의 저장부가 서로 간격을 두고 형성되어 있는데, 구체적으로는, 막대자석(200)의 단부에 끼우기 위한 오염방지 팁(500)이 저장된 오염방지 팁 저장부(a1)와, 막대자석(200)에 달라붙을 수 있는 자성체 및 유전자가 흡착될 수 있는 실리카 코팅층을 가진 다수의 마그네틱 비드가 저장된 마그네틱 비드 저장부(a2)와, 유전자 및 불가피한 불순물이 섞여 있는 액상의 검체를 주입할 수 있는 샘플 검체 저장부(a3)와, 유전자 농도는 상대적으로 높이면서 불순물 농도는 상대적으로 낮추는 2개의 워싱 버퍼 저장부(a4, a5)와, 유전자만 함유되도록 하는 일루션 버퍼가 저장된 일루션 버퍼 저장부(a6), 및 상술한 자동 정량 분주기(100)가 내장된 자동 정량 분주기 저장부(a7)로 이루어져 있다.
또한, 폐기부(C)는, 도 4에 예시된 바와 같이, 막대자석(200)의 진입 및 막대자석(200)의 단부에 끼워진 오염방지 팁(500)의 분리제거를 가능하게 하는 노치가 일측에 형성된 구성으로 이루어져 있다.
또한, PCR증폭기(D)는, 증폭부(D1)와, 증폭부(D1)의 하부에 고정설치된 하부히터(D2)와, 증폭부(D1)의 상부에 설치되어 증폭부(D1)에 대해 이동 가능한 상부히터(D3), 및 이 상부히터(D3)가 이송 가능하게 설치된 상부히터 이동레일(D4)로 이루어져 있다. 이 구성은 당해 기술분야에서 공지된 것이므로 구체적인 설명은 생략한다.
[연속으로 유전자를 추출-증폭하는 방법]
도 4는 본 발명에 따른 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 사용하여 연속적으로 유전자를 추출-증폭하는 과정을 설명하기 위한 도면이며, 도 5는 도 4의 ③∼⑥단계에 대응되는 도면이다.
먼저, 도 3에 예시된 시료 키트(A1)를 시료 키트 안착부(A)에 배치한다.
이 상태에서, 시료 키트(A1)의 오염방지 팁 저장부(a1)의 바로 위쪽까지, 막대자석(200)을 이동시킨다.
이어서, 막대자석(200)을 하강시켜, 오염방지 팁 저장부(a1)에 들어 있는 고무 재질의 오염방지 팁(500)을 막대자석(200)의 단부에 끼운다(①단계).
막대자석(200)의 단부에 오염방지 팁(500)이 씌워지면, 막대자석(200)을 그대로 상승시킨 후, 마그네틱 비드 저장부(a2)의 바로 위쪽으로 막대자석(200)을 이동시킨다.
마그네틱 비드 저장부(a2) 내에 들어있는 마그네틱 비드(600)는, 도 5에 도시된 것처럼, 볼 형상의 자성체(610)와, 자성체(610)를 둘러싸는 플라스틱이나 유리 재질의 피복층(620)과, 피복층(620)을 감싸고 있는 실리카 코팅층(630)으로 구성되어 있기 때문에, 마그네틱 비드 저장부(a2) 안으로 막대자석(200)의 단부를 진입시키면, 마그네틱 비드 저장부(a2) 내에 들어 있던 다수의 마그네틱 비드(600)가 막대자석(200)에 달라붙게 된다(②단계).
한편, 샘플 검체 저장부(a3)에는, 세포 핵을 감싸고 있는 단백질이나 인지질이 특정 용액에 의해 파괴되어 세포 핵 속의 유전자가 풀려져 있는 액체(즉, 샘플 검체)가 미리 일정량 주입되어 있다.
이 상태에서, 마그네틱 비드(600)가 달라붙어 있는 막대자석(200)을 샘플 검체 저장부(a3) 안으로 진입시키면, 유전자와 함께 불순물이 마그네틱 비드(600)의 실리카 코팅층(630)에 흡착된다(③단계).
이어서, 막대자석(200)을 상승시킨 후, 워싱 버퍼 저장부(a4)의 바로 위쪽까지 막대자석(200)을 이동시킨다.
막대자석(200)이 워싱 버퍼 저장부(a4)의 바로 위에 위치되면 막대자석(200)을 하강시켜, 마그네틱 비드(600)가 붙어 있는 막대자석(200)의 단부를 워싱 버퍼에 잠기게 한 상태에서 진동(흔들기 또는 휘젓기)을 가해, 유전자와 더불어 마그네틱 비드(600)에 달라붙어 있던 불순물이 어느 정도 떨어져 나가게 한다(④단계).
그 뒤를 이어, 마그네틱 비드(600)가 달라붙어 있는 막대자석(200)을 상승시킨 후, 두 번째 워싱 버퍼 저장부(a5) 쪽으로 이동시켜, 상기 ④단계에서와 동일한 과정을 반복한다(⑤단계).
이어서, 마그네틱 비드(600)가 달라붙어 있는 막대자석(200)을 일루션 버퍼 저장부(a6)의 바로 위쪽으로 이동시킨 후, 일루션 버퍼 저장부(a6) 내로 진입하도록 하강시켜, 마그네틱 비드(600)가 붙어 있는 막대자석(200) 부분이 일루션 버퍼에 잠기게 한 상태에서 진동을 가해, 마그네틱 비드(600)의 표면으로부터 유전자가 떨어져 나가게 하는 한편, 마그네틱 비드(600) 자체는 막대자석(200)에 그대로 달라붙어 있게 한다(⑥단계).
그 다음에, 막대자석(200)을 폐기부(C)가 있는 곳까지 이동시킨 후, 막대자석을 승강시키거나 또는 폐기부(C)를 승강시켜, 막대자석(200)의 단부에 끼워진 오염방지 팁(500)을 벗겨낸다.
이 상태에서, 시료 키트(A1)의 자동 정량 분주기 저장부(a7) 바로 위쪽으로 막대자석(200)을 이동시킨 후 하강시켜, 막대자석(200)의 단부를 자동 정량 분주기(100)의 접속단(111)에 결합시킨다(⑧단계).
그 뒤, 자동 정량 분주기(100)가 결합된 막대자석(200)을, 일루션 버퍼 저장부(a6)의 위쪽으로 이동시킨 후 하강시킴으로써, 상기 ⑥단계를 통해 유전자가 분산되어 있는 일루션 버퍼의 일정량을 자동 정량 분주기(100)의 피펫부(120)로 빨아들인다.
이후, 자동 정량 분주기(100)가 결합된 막대자석(200)을, PCR증폭기(D) 쪽으로 이동시키는 한편, PCR증폭기(D)의 상부히터(D3)를 어느 한쪽으로 이동시켜 증폭부(D1)가 개방되도록 한 상태에서, 증폭부(D1) 안으로 피펫부(120)를 끼워넣고, 일정량의 유전자가 함유된 일루션 버퍼가 피펫부(120)에서 배출되도록 막대자석(200)으로 체적가변부(110)를 압압한다.
이로써, 유전자 추출에서부터 유전자 증폭까지의 모든 과정이 자동으로 처리된다.
부호의 설명
100…자동 정량 분주기
110…체적가변부
111…접속단
120…피펫부
130…걸림턱
200…막대자석(영구자석)
300…시험관
400…액체
500…오염방지 팁
600…마그네틱 비드
610…자성체
620…피복층
630…실리카 코팅층
A…시료 키트 안착부
A1…시료 키트
a1…오염방지 팁 저장부
a2…마그네틱 비드 저장부
a3…샘플 검체 저장부
a4…워싱 버퍼 저장부
a5…워싱 버퍼 저장부
a6…일루션 버퍼 저장부
a7…자동 정량 분주기 저장부
B…막대자석 이동레일
C…폐기부
D…PCR증폭기
D1…증폭부
D2…하부히터
D3…상부히터
D4…상부히터 이동레일

Claims (4)

  1. 외부 작동기가 결합 가능한 접속단이 일측 단부에 형성된 체적가변부와,
    외부 작동기가 체적가변부의 접속단에 결합된 상태에서 구동될 때 발생하는 체적가변부의 체적 변화량에 대응하여 일정량의 액체를 흡입 또는 배출할 수 있도록 체적가변부의 타측 단부에 연결된 피펫부와;
    피펫부의 외주면에 형성된 걸림턱을 포함하여 구성되되,
    상기 외부작동기가 액체를 포함하는 시험관으로 하강할 때, 피펫부 외주면에 형성된 걸림턱이 시험관 가장자리에 걸려 체적가변부의 체적이 축소된 상태에서 외부작동기를 상승시킬 때 액체가 흡입되는 것을 특징으로 하는 자동 정량 분주기.
  2. 자동화된 일련의 과정을 통해 유전자 추출을 실행할 수 있는 시료 키트가 재치되는 시료 키트 안착부와, 유전자 증폭을 실행하는 PCR증폭기와, 시료 키트 안착부와 PCR증폭기 사이에 배치되는 폐기부와, 주어진 처리 레시피에 따라 시료 키트 안착부로부터 PCR증폭기 쪽으로 막대자석을 이송하는 막대자석 이동레일을 포함하여 구성되는 연속식 유전자 추출-증폭 장비로서,
    상기 시료 키트는,
    막대자석의 단부에 끼우기 위한 오염방지 팁이 저장된 오염방지 팁 저장부와;
    막대자석에 달라붙을 수 있는 자성체 및 유전자가 흡착될 수 있는 실리카 코팅층을 가진 다수의 마그네틱 비드가 저장된 마그네틱 비드 저장부와;
    유전자 및 불가피한 불순물이 섞여 있는 액상의 검체를 주입할 수 있는 샘플 검체 저장부와;
    유전자 농도는 상대적으로 높이면서 불순물 농도는 상대적으로 낮추는 워싱 버퍼 저장부와;
    유전자만 함유되도록 하는 일루션 버퍼가 저장된 일루션 버퍼 저장부; 및
    제1항의 자동 정량 분주기가 내장된 자동 정량 분주기 저장부가 서로 간격을 두고 배치된 구성으로 이루어지며,
    상기 폐기부는,
    막대자석의 진입 및 막대자석의 단부에 끼워진 오염방지 팁의 분리제거(벗김)를 가능하게 하는 노치가 일측에 형성된 구성으로 이루어진 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 워싱 버퍼 저장부가 서로 간격을 두고 인접하여 둘 이상 배치된 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 장비.
  4. 청구항 2 또는 3에 기재된 연속식 유전자 추출-증폭 장비를 사용하여, 유전자 추출에서부터 유전자 증폭까지의 모든 과정을 자동화한 것을 특징으로 하는 연속식 유전자 추출-증폭 방법.
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