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WO2017195778A1 - 認知症の診断マーカー及びそれを用いた認知症罹患鑑別方法 - Google Patents

認知症の診断マーカー及びそれを用いた認知症罹患鑑別方法 Download PDF

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WO2017195778A1
WO2017195778A1 PCT/JP2017/017543 JP2017017543W WO2017195778A1 WO 2017195778 A1 WO2017195778 A1 WO 2017195778A1 JP 2017017543 W JP2017017543 W JP 2017017543W WO 2017195778 A1 WO2017195778 A1 WO 2017195778A1
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WO
WIPO (PCT)
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disease
alzheimer
subject
mannose
terminal
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/017543
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
橋本　康弘
京香 星
浩美 伊藤
たかし 本多
芳樹 山口
雅倫 長江
Original Assignee
橋本　康弘
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 橋本　康弘 filed Critical 橋本　康弘
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Priority to US16/099,822 priority patent/US20190113528A1/en
Priority to JP2018517032A priority patent/JP6680873B2/ja
Publication of WO2017195778A1 publication Critical patent/WO2017195778A1/ja

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/02—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates involving antibodies to sugar part of glycoproteins

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for distinguishing dementia, particularly Alzheimer's disease, and mild cognitive impairment that can progress to Alzheimer's disease from other central nervous diseases, and a method for distinguishing morbidity and determining a disease state using the same.
  • AD Alzheimer's disease
  • a cognitive dysfunction dementia associated with memory impairment and thought disorder.
  • Symptoms such as behavioral disorder or personality change. It is the most common dementia, accounting for about 60-80% of all dementia patients. Although it usually occurs in elderly people over 65 years of age, some of them also develop under 64 years of age and are called juvenile Alzheimer's disease.
  • AD patients The number of dementia patients worldwide is estimated at 35 million as of 2010, and is expected to double every 20 years and reach 110 million by 2050. Of these, approximately 70% are considered AD patients. In developed countries in particular, the economic and mental burden of the national and patient-related people has become serious due to an increase in medical expenses accompanying the increase in AD patients and nursing care problems, and this is becoming a major social problem.
  • Familial (hereditary) AD is also a genetic disease caused by mutations in the amyloid precursor protein (APP) gene and presenilin 1 (PSEN1) gene, and is a hydrophobic peptide in the brain of amyloid ⁇ protein (A ⁇ ) It begins to agglutinate and accumulate in the nerve cells, and then, after the tau protein, which is a microtubule protein, is hyperphosphorylated and fibrotic, the nerve cells are destroyed and the brain contracts. It is known that sporadic cases occupying most of AD are basically caused by a similar pathological process.
  • APP amyloid precursor protein
  • PSEN1 presenilin 1
  • AD therapeutics have been developed that inhibit the onset process. However, most have not yet been shown to be fully effective in clinical trials. This is thought to be because the study drug is not ineffective and the study group is not appropriate.
  • the group of subjects that had been undergoing clinical trials in the past was a stage in which brain lesions due to AD progressed and massive neuronal cell death occurred. However, even if treatment is started at this stage, nerve recovery cannot usually be expected. That is, it is considered that an effective therapeutic effect could not be obtained because the administration time of the therapeutic agent was too late (Non-patent Document 1). Therefore, if an AD therapeutic agent can be administered at an appropriate administration timing, that is, at an early stage where neuronal cell death can be avoided, it should be possible to verify its effectiveness.
  • MCI mild cognitive impairment
  • AD transitional MCI is also a suitable timing for administration of an AD therapeutic agent in order to obtain an effect of preventing the onset of AD or delaying the progression of AD. To that end, it is essential to develop an early diagnosis method for AD and a method for distinguishing AD-transfer MCI.
  • AD neurodegenerative diseases
  • ventricular enlargement brain atrophy
  • AD is generally diagnosed by pathologically demonstrating amyloid plaques and neurofibrillary tangles in postmortem autopsy brains, but it has been difficult to visualize amyloid plaques as imaging findings during survival.
  • Pittsburgh compound (PiB) labeled with 11 C which is a positron radioactive isotope
  • tau PET using 6-[(3- 18 F-fluoro-2-hydroxy) propoxy] -2- (4-methylaminophenyl) quinolone ( 18 F-THK5117) (Non-Patent Document 3).
  • these test methods can detect AD at a relatively early stage, they are effective in verifying early administration of AD therapeutics in clinical trials, but they take a long time to diagnose and are expensive. It is not very appropriate as a normal diagnostic method.
  • Non-patent Document 2 an excessively phosphorylated tau protein, amyloid ⁇ 42 (A ⁇ 42) peptide, cytokine in an inflammatory disease, or the like is used as an AD diagnostic marker.
  • cytokines can be measured with high sensitivity, they have a drawback of poor disease specificity.
  • phosphorylated tau protein is an excellent AD diagnostic marker, the appearance of this protein means the death of nerve cells, which is insufficient for the early diagnosis of AD in which nerve cell death should be avoided.
  • tau protein is increased in dementia such as frontotemporal dementia and progressive supranuclear palsy, so it is difficult to say that it is a biomarker specific for AD.
  • a ⁇ 42 peptide also has a problem that it does not change until after the disease has progressed.
  • the present invention develops a biomarker that can be used as an index for differentiation of AD disease or a biomarker capable of determining the pathological condition of AD progression or cure, and a simple early diagnosis method and pathological condition determination of AD using the biomarker It is an object to provide a method.
  • Tf glycoprotein exists in serum as sialylated Tf with sialic acid at the non-reducing end (FIG. 1A), but in cerebrospinal fluid, sialylated Tf and non-sialylated Tf without sialic acid at the non-reducing end It exists as two types of Tf sugar chain isoforms.
  • Tf index sialylated Tf / non-sialylated Tf
  • iNPH abnormal cerebrospinal fluid metabolism
  • human Tf has sugar chains added to asparagine at positions 432 (N432) and 630 (N630) when the starting methionine is position 1.
  • N630 sugar chain has N-acetylglucosamine (often abbreviated herein as “GlcNAc”) at the non-reducing end, and bisecting GlcNAc and core fucose. It is qualified.
  • the N432 sugar chain also has GlcNAc at the non-reducing end, but is modified with bisecto GlcNAc alone and has no core fucose.
  • subgroup 2 FIG. 1C
  • the sugar chain of N630 is the same as that of subgroup 1, but the sugar chain of N432 is mannose (in this specification, (Often abbreviated as “Man”).
  • Tf subgroup 2 containing a sugar chain having mannose at the non-reducing end as a diagnostic marker for AD and MCI
  • Tf subgroup 2 present in cerebrospinal fluid uses lectins and antibodies.
  • the present inventors have found that it can be quantified and that the amount correlates with the progress of AD and MCI, and has completed the present invention.
  • the present invention is based on the above findings and provides the following.
  • An AD diagnostic marker comprising a Tf glycoprotein containing a sugar chain having at least one mannose at the non-reducing end or a Tf fragment containing the sugar chain.
  • An AD diagnostic kit comprising a Man-binding molecule and a Tf-binding molecule for detecting the AD diagnostic marker according to any one of (1) to (4).
  • Man-binding molecule is selected from the group consisting of mannose-binding lectins, anti-mannose antibodies, and aptamers to mannose.
  • Tf-binding molecule is an aptamer against an anti-Tf antibody and / or Tf protein.
  • (9) A method for differentiating AD disease, wherein the amount of the AD diagnostic marker according to (1) or (2) present in a predetermined amount of body fluid obtained from a subject and a control body group is changed to a Man-binding molecule and Tf
  • the measurement value of the AD diagnostic marker is significantly higher in the subject by comparing the measurement value obtained by the measurement step using the binding molecule and obtaining the measurement value, and the measurement value of the subject and the control group obtained in the measurement step.
  • the method further comprises a comparative differentiation step of identifying the subject as having AD.
  • AD migration type MCI discrimination method wherein the amount of AD diagnostic marker according to (1) or (2) present in a predetermined amount of body fluid obtained from a subject and a group of healthy subjects is determined as a Man-binding molecule And the measurement step of obtaining a measured value using a Tf-binding molecule, the measured value of the AD diagnostic marker in the group of subjects and healthy subjects obtained in the measuring step are compared, and the measured value of the AD diagnostic marker is tested.
  • the method wherein the subject is suffering from MCI comprising a comparative differentiation step of differentiating the subject as suffering from AD-transition MCI if significantly higher in the body.
  • AD diagnostic marker of the present invention it is possible to diagnose AD morbidity or morbidity and to determine AD pathology.
  • the AD diagnostic kit of the present invention it is possible to detect an AD diagnostic marker easily and at a relatively low cost, thereby distinguishing the affliction or possibility of affliction of AD in a subject who is a sample provider, And / or the pathological condition can be determined.
  • AD disease detection method of the present invention it is possible to determine whether a subject, particularly a patient suffering from some central nervous disease, is suffering from AD or the possibility of suffering from AD. It can also determine the disease state of the affected AD.
  • AD transfer type MCI patients who are likely to transfer to AD among patients suffering from MCI can be easily discriminated with high accuracy.
  • a to C Conceptual diagrams showing structures of three Tf sugar chain isoforms of Tf glycoprotein present in cerebrospinal fluid.
  • A is a terminal Sia-Tf glycoprotein with two sialic acid non-reducing terminal sugar chains (sialylated Tf)
  • B is a terminal GlcNAc-Tf glycoprotein with two non-reducing terminal sugar chains (non-sialylated Tf subprotein) Group 1)
  • C represents a terminal Man-Tf glycoprotein (non-sialylated Tf subgroup 2) having one Man non-reducing terminal sugar chain and one GlcNAc non-reducing terminal sugar chain.
  • D It is a figure which shows the result of the western blotting of cerebrospinal fluid and serum using an anti- Tf antibody.
  • a detected in cerebrospinal fluid and serum indicates terminal Sia-Tf glycoprotein.
  • b detected only in cerebrospinal fluid appears to be one type of Tf glycoprotein, but two types of Tf glycoproteins (subgroup 1 and subgroup 1 and glycoproteins) are terminal GlcNAc-Tf glycoprotein and terminal Man-Tf glycoprotein. 2) including.
  • Terminal Man-Tf, Terminal GlcNAc-Tf and Terminal Sia-Tf Tf glycoprotein preparations were electrophoresed and then silver-stained (A), immunoblot using anti-Tf antibody (B), and UDA A lectin blot diagram (C) using lectins is shown.
  • A silver-stained
  • B immunoblot using anti-Tf antibody
  • C UDA
  • the result of the immunoprecipitation reaction using the anti- Tf antibody of Tf in cerebrospinal fluid is shown.
  • the supernatant fraction after reacting anti-Tf antibody-bound beads with cerebrospinal fluid (unbound fraction), the fraction bound with anti-Tf antibody-bound beads (elution fraction), and the unprepared cerebrospinal fluid of the starting material
  • A the result after detection of the sample after electrophoresis by silver staining
  • B the result of detection by immunoblot using an anti-Tf antibody
  • C UDA lectin blot
  • a represents terminal Sia-Tf
  • b represents terminal Man-Tf / terminal GlcNAc-Tf (terminal Man-Tf in C)
  • c represents Man glycoprotein (GP-X) other than terminal Man-Tf.
  • A is a measurement principle diagram of the UDA lectin / antibody sandwich ELISA method for detecting terminal Man-Tf.
  • a indicates an anti-Tf antibody that is a capture antibody
  • b indicates a UDA lectin.
  • B shows a calibration curve when terminal Man-Tf (terminal Tri-Man-Tf) is used.
  • Anti-Tf antibody was immobilized on a microtiter plate to capture free Tf, and terminal Man-Tf was detected and quantified with UDA lectin.
  • the terminal Sia-Tf is not detected because it does not bind to the UDA lectin.
  • terminal Tri-Man-Tf is used as a standard.
  • AD Alzheimer's disease
  • MCI mild cognitive impairment
  • iNPH idiopathic normal pressure hydrocephalus
  • DLB / FTD Lewy body dementia / frontotemporal dementia
  • NC healthy controls
  • Alzheimer's disease diagnostic marker 1-1 Outline
  • the diagnostic marker of the present invention comprises a glycoprotein or a peptide fragment thereof present in a body fluid, and can diagnose or determine the possibility of AD disease or determine the pathological condition of AD in a subject.
  • 1-2 Definitions Terms used in this specification are defined below.
  • AD Alzheimer transitional mild cognitive impairment
  • MCI cognitive impairment
  • diagnosis refers to determination of disease morbidity or morbidity or disease state.
  • diagnosis usually, the diagnostic action is the exclusive business of a doctor, veterinarian, or dentist, but the diagnosis in this specification includes an auxiliary action that assists the diagnosis by the doctor, etc. without going through the action of the doctor, etc. .
  • differentiation of disease means to determine whether or not the disease is affected. It also includes discrimination from other diseases with similar lesions and pathologies.
  • “possibility of being affected” refers to the probability of suffering from a specific disease in the future.
  • a specific disease is AD
  • the possibility of transition from MCI to AD is also included.
  • disease state refers to a specific disease state, its degree and stage. For example, mild (mild), moderate (moderate), and severe (severe) can be mentioned as the degree of the condition, and early, middle, and late can be mentioned as the stage.
  • pathological condition includes not only the state of a disease at a specific time point of a patient, but also the transition of the state of the disease from one time point to another time point. For example, the state of progress and the degree of the disease whose disease state worsens with the passage of time, or the state of cure and the degree of the disease that improves with the passage of time can be included. Therefore, in the present specification, “determination of disease state” means determination of the state and degree of a specific time point in a disease such as dementia, and transition of the state of the disease from one time point to another (whether it is progressing). Or improvement).
  • body fluid refers to a liquid sample collected from a subject and a control body.
  • Examples include cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid), blood (including serum, plasma and interstitial fluid), urine, lymph, digestive fluid, ascites, pleural effusion, perineural fluid, extracts of tissues or cells, and the like. . Cerebrospinal fluid or blood is preferable, and cerebrospinal fluid is more preferable.
  • the cerebrospinal fluid is a colorless and transparent extracellular fluid existing only around the central nervous system (CNS) of the brain and spinal cord. Other organs” It is separated by the dura mater and by the blood-brain barrier and the blood-cerebrospinal fluid barrier, which is largely exuded from the brain parenchyma and between the brain cells and the cerebrospinal fluid. Recent studies have revealed that there is virtually no barrier (Wang C, et al., 2012, Cerebrospinal Fluid: Physiology, biomarker and methodology. In: V. S, Dolezal, T., editor. Cerebrospinal Fluid: Functions, Composition and Disorders. New York: Nova Science Publishers; pp.1-37.) In this cerebrospinal fluid, there are many proteins derived from the central nervous system. It is known that expression increases and decreases.
  • glycoprotein refers to a protein to which one or more sugar chains are added.
  • sugar chains are added as one of post-translational modifications and are present in more than 50% of proteins in vivo.
  • Sugar chains play an important role in imparting various functions to proteins such as protein stabilization, protection, physiological activity, antigen-antibody reaction, viral infection and pharmacokinetics.
  • the “peptide fragment (including its sugar chain)” is a peptide comprising a part of the glycoprotein and including an amino acid residue to which a sugar chain is added.
  • the position 432 consisting of a part of terminal Man-Tf, which is the third Tf sugar chain isoform described in “1-3. Configuration” described later, and having a mannose non-reducing terminal sugar chain added thereto.
  • a peptide containing the asparagine residue is not particularly limited.
  • the lower limit may be a length that can include an epitope, for example, 8 amino acids or more, preferably 10 or 15 amino acids or more, more preferably 20 or 30 amino acids or more, and the upper limit is a glycoprotein. It is sufficient that the amino acid has less than the total length of
  • Mannose non-reducing terminal sugar chain refers to a sugar chain having at least one mannose at the non-reducing terminal.
  • the number of non-reducing end Man does not matter. One may be present at the non-reducing end of a linear sugar chain, or one or more may be present at a plurality of branched non-reducing ends.
  • the term “plurality” means 2 to 10, 2 to 9, 2 to 8, 2 to 7, 2 to 6, 2 to 5, 2 to 4, or 2 to 3 An individual. It is preferred that all non-reducing terminal sugars are mannose.
  • High Man type (high mannose type) sugar chains and mixed type sugar chains having mannose at at least one non-reducing end correspond to Man non-reducing end sugar chains.
  • the “non-reducing terminal (sugar)” of a sugar chain refers to a terminal sugar that does not have a free hydroxyl group in the sugar chain of a glycoprotein and therefore does not exhibit reducing properties. Examples include non-reducing terminal mannose (non-reducing terminal Man), non-reducing terminal GlcNAc, and non-reducing terminal sialic acid (non-reducing terminal Sia).
  • the “reducing terminal (sugar)” of the sugar chain is a terminal sugar having a free hydroxyl group and exhibiting reducibility.
  • the reducing sugar has a hemiacetal or ketal structure, and usually the reducing terminal sugar is bound to the protein.
  • the “subject” refers to an application target in each aspect of the present invention. Although it is an individual in principle, it also includes tissues and cells. Specific examples include mammalian individuals, preferably humans, dogs, cats, horses and the like. Preferably it is a human. In the case of an individual, life and death are not questioned, but a living body is preferable. In addition, the individual may be any of a diseased subject having some kind of disease, an individual who may have a disease, or a healthy subject.
  • disease affected body refers to an individual suffering from a specific disease.
  • the main diseased subject in the present specification is an AD subject or an MCI subject (particularly an AD-transition MCI subject), and an “individual who is likely to suffer from a disease” includes, for example, MCI It is an individual with the possibility of transition from AD to AD.
  • “healthy body” refers to an individual in a healthy state.
  • “Healthy state” means a state that is not affected by at least a central nervous disease such as AD and MCI, and preferably a healthy state free of a disease or disorder. Therefore, “disease control” described in Examples described later corresponds to one form of a healthy body in the present specification.
  • a healthy body is mainly used as a control body which is a reference for comparison with a subject. Accordingly, in this specification, the subject and the healthy subject are at least the same species. Furthermore, it is preferable that conditions, such as subspecies (including race), sex, age (including monthly and weekly age), height, and weight, are the same.
  • AD diagnostic marker of the present invention is composed of a peptide fragment containing a glycoprotein or a sugar chain, and suffers from AD or AD-transition MCI in a subject, It is a biomarker that can diagnose the possibility of transition from MCI to AD.
  • the protein constituting the glycoprotein is a transferrin (Tf) protein.
  • Tf protein is a carrier protein having a molecular weight of about 80 KDa that reversibly binds to two iron (Fe) ions and is responsible for its in vivo transport.
  • a specific example of transferrin is a human Tf protein composed of 698 amino acid residues and consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • Tf protein normally exerts its function as a glycoprotein.
  • the Tf protein to which a sugar chain is added in this way is often referred to as “Tf glycoprotein”.
  • the sugar chain includes an N-linked sugar chain added to the side chain of an asparagine (Asn: N) residue in the amino acid sequence of the protein, and a serine (Ser: S) or threonine (Thr: T) residue.
  • O-linked side chains added to side chains are known.
  • the sugar chain of the Tf glycoprotein constituting the AD diagnostic marker of the present invention is an N-linked sugar chain that is added to two asparagine residues (N432 and N630) as described above.
  • Tf glycoproteins have three isoforms (hereinafter referred to as “Tf sugar chain isoforms”) that share a protein portion and differ only in the structure of the N-linked sugar chain to be added.
  • the AD diagnostic marker of the present invention is one of them, and is composed of terminal Man-Tf corresponding to the third Tf sugar chain isoform described later.
  • three types of Tf sugar chain isoforms in Tf glycoprotein will be described.
  • the first Tf sugar chain isoform corresponds to the above-mentioned sialylated Tf and is a Tf glycoprotein having a structure in which two sialic acid non-reducing terminal sugar chains are added as shown in FIG. .
  • the “sialic acid non-reducing terminal sugar chain” refers to a sugar chain having ⁇ 2,6-sialic acid at the non-reducing terminal.
  • a Tf sugar chain isoform to which a sialic acid non-reducing terminal sugar chain is added is often referred to as “terminal Sia-Tf (glycoprotein)”.
  • the terminal Sia-Tf is present in both serum and cerebrospinal fluid as shown by a in FIG.
  • Terminal Sia-Tf is considered to be a Tf glycoprotein that is biosynthesized in the liver due to the similarity of the sugar chain structure to other glycoproteins.
  • the second Tf sugar chain isoform corresponds to the above-mentioned non-sialylated Tf subgroup 1 and is a Tf glycoprotein to which two GlcNAc non-reducing terminal sugar chains are added as shown in FIG. 1B.
  • GlcNAc non-reducing terminal sugar chain refers to a sugar chain having N-acetylglucosamine (GlcNAc) at the non-reducing end.
  • a Tf sugar chain isoform to which a GlcNAc non-reducing terminal sugar chain is added is often referred to as “terminal GlcNAc-Tf (glycoprotein)”.
  • Terminal GlcNAc-Tf is produced in cells of the central nervous system such as the brain and / or spinal cord, and is thought to be a brain-type glycoprotein found mainly in cerebrospinal fluid.
  • the third Tf sugar chain isoform corresponds to the aforementioned non-sialylated Tf subgroup 2, and as shown in FIG. 1C, one of the two sugar chains has a Man non-reducing terminal sugar chain, On the other hand, it is a Tf glycoprotein to which a GlcNAc non-reducing terminal sugar chain is added. More specifically, in the case of a human Tf protein, N432 is a Tf glycoprotein to which a Man non-reducing terminal sugar chain is added, and N630 is a GlcNAc non-reducing terminal sugar chain. In the present specification, the Tf sugar chain isoform having the aforementioned sugar chain structure is often referred to as “terminal Man-Tf (glycoprotein)”.
  • terminal Man-Tf and terminal GlcNAc-Tf have similar mobility, both bands appear to overlap as shown in Fig. 1D b in Western blot, and are detected as one kind of sugar chain isoform. . Therefore, terminal GlcNAc-Tf has been known as a cerebrospinal fluid-specific Tf glycoprotein, but the existence of terminal Man-Tf has not been known.
  • the terminal Man-Tf is considered to be a brain-type glycoprotein as well as the terminal GlcNAc-Tf.
  • the second and third Tf sugar chain isoforms are brain-type glycoproteins, they are mainly present in the cerebrospinal fluid.
  • the cerebrospinal fluid components are also present in the lymphatic vessels in the head and neck, the spinal nerve roots, and the like, and also leak into the serum in a small amount.
  • prostaglandin D2 synthase is a cerebrospinal fluid-specific brain-type glycoprotein, and a concentration of about 1% can be detected in blood. Therefore, the second and third Tf sugar chain isoforms can also be present in body fluids other than cerebrospinal fluid.
  • Each Tf sugar chain isoform described above is specific to the cell type, and its quantitative change reflects the pathological state of the cell type from which it is derived. It can therefore be a useful diagnostic marker for disease.
  • terminal GlcNAc-Tf serves as an index marker for iNPH (Japanese Patent Laid-Open No. 2010-121980).
  • terminal Man-Tf does not serve as an iNPH marker, but is a Tf sugar chain isoform constituting the AD diagnostic marker of the present invention.
  • the amount of terminal Man-Tf in body fluid (mainly in cerebrospinal fluid) is significantly increased in AD transition type MCI affected body and AD affected body compared with a healthy body or a healthy body group. Such an increase is not observed in other central nervous system diseases. Therefore, it can be a useful marker in discriminating between AD-transition type MCI and non-AD-transition type MCI, and in discriminating AD from other central nervous diseases having similar lesions and pathologies.
  • the amount of terminal Man-Tf in body fluid (mainly in the cerebrospinal fluid) is significantly higher than that in healthy subjects or groups of healthy subjects
  • the MCI is an AD migration type MCI, and it can be determined that there is a high possibility of migration to AD in the future.
  • the MCI can be determined as AD non-transition type MCI.
  • AD Alzheimer's disease
  • DLB dementia with Lewy bodies
  • FTD frontotemporal dementia
  • both late AD and iNPH are very similar in that both remarkable morphological changes such as ventricular enlargement and dementia are seen, and it is not easy to distinguish them.
  • iNPH is caused by excess of cerebrospinal fluid, it can be completely cured by draining excess cerebrospinal fluid with a simple minor operation (for example, shunting by bypassing the ventricle and abdominal cavity with a tube).
  • a simple minor operation for example, shunting by bypassing the ventricle and abdominal cavity with a tube.
  • a simple minor operation for example, shunting by bypassing the ventricle and abdominal cavity with a tube.
  • AD pathology is initiated by A ⁇ aggregation, which becomes an amyloid plaque observed in early AD.
  • a ⁇ aggregation is normally suppressed because of the physiological mechanism that flushes A ⁇ in the cerebrospinal fluid circulation. Therefore, it is considered that a part of iNHP causes a decrease in washing of A ⁇ due to insufficiency of cerebrospinal fluid and facilitates progression of AD pathology.
  • terminal GlcNAc-Tf which is one of the Tf sugar chain isoforms in the same body fluid (mainly in the cerebrospinal fluid), serves as a diagnostic marker for iNPH as described above. Therefore, in iNPH, there is no significant difference in the amount of terminal Man-Tf in body fluid (mainly in the cerebrospinal fluid) compared to healthy subjects or groups of healthy subjects, but the terminal GlcNAc in body fluid (mainly in the cerebrospinal fluid) -Tf amount is significantly reduced.
  • significant means statistically significant.
  • Statistically significant means that when the difference between the measured value and the control value of the test subject is statistically processed, there is a significant difference between the two. If it is this invention, the significant difference between both corresponds when the difference of the measured value of the amount of terminal Man-Tf of a test subject and a healthy body group is processed statistically. For example, if the risk value (significance level) of the obtained value is small, specifically less than 5% (p ⁇ 0.05), less than 1% (p ⁇ 0.01), or less than 0.1% ( p ⁇ 0.001). “P (value)” shown here indicates a probability that the assumption is accidentally correct in the distribution assumed by the statistic in the statistical test.
  • test method for statistical processing is not particularly limited as long as a known test method capable of determining the presence or absence of significance is appropriately used. For example, Student's t test, covariate analysis of variance, etc. can be used.
  • the amount of terminal Man-Tf increases in correlation with the degree of disease progression. That is, as the amount of terminal Man-Tf in the body fluid (mainly in the cerebrospinal fluid) increases as compared with the healthy body or the healthy body group, the symptom progresses and indicates that it is severe. Conversely, when the disease is cured, the amount of terminal Man-Tf decreases in relation to the degree of cure, and can return to the amount of a healthy body or a group of healthy bodies. Therefore, terminal Man-Tf can be a diagnostic marker that reflects the pathology of AD. 2.
  • summary The 2nd aspect of this invention is an Alzheimer's disease diagnostic kit (AD diagnostic kit).
  • the kit of the present invention is capable of detecting the AD diagnostic marker according to the first aspect that can be contained in a sample, thereby distinguishing the subject who is the sample provider from AD disease or the possibility of being affected, and // The pathological condition can be determined.
  • the AD diagnostic kit of the present invention contains a mannose-binding molecule and a transferrin-binding molecule as essential components. Also, other components can be included as selective components.
  • Mannose binding molecule Man binding molecule
  • Man binding molecule refers to a molecule that recognizes and binds to mannose constituting the sugar chain of glycoprotein. The recognition and binding of the target molecule is preferably highly specific.
  • the Man binding molecule may be a peptide, a nucleic acid, a low molecular compound, or a combination thereof.
  • the “low molecular compound” refers to an organic compound or an inorganic compound having a molecular weight of 500 or less other than peptides or nucleic acids.
  • the sugar chain mannose recognized by the Man-binding molecule may be any of a reducing end mannose, a non-reducing end mannose, or a mannose inside the sugar chain. Terminal mannose is preferable, and non-reducing terminal mannose is more preferable.
  • Man binding molecules include mannose binding proteins and mannose binding nucleic acids. Each will be described below.
  • Mannose-binding protein examples include mannose-binding lectin, anti-mannose antibody, and active fragments thereof.
  • Mannose-binding lectin is a lectin that binds to sugar chains containing mannose, preferably sugar chains containing terminal mannose, more preferably sugar chains containing non-reducing terminal mannose.
  • Mannose-binding lectins described in http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch and the like can be mentioned.
  • the lectin may cause a difference in apparent sugar chain binding specificity between the case where the target molecule is a glycoprotein and the case where the target molecule is only a sugar chain.
  • UDA lectins derived from nettle are classified as GlcNAc-binding lectins when the target molecule is a sugar chain, but as shown in FIG. 2, when the target molecule is a glycoprotein, the terminal Man-Tf It binds specifically to the non-reducing terminal Man but does not bind to the terminal GlcNAc-Tf. Therefore, it is preferable to examine the binding of lectin to mannose using not only the sugar chain but also the terminal Man-Tf which is the target molecule.
  • the Man-binding lectin constituting the kit of the present invention is a lectin that binds to a sugar chain mannose of terminal Man-Tf, preferably a terminal mannose of terminal Man-Tf, more preferably a non-reducing terminal Man of terminal Man-Tf. is there.
  • a commercially available lectin may be used as the Man-binding lectin.
  • biotinylated UDA lectin Cat No BA-8005-1; EY
  • BC2L-A lectin derived from bacteria Backholderia cenocepacia lectin-A; Wako Pure Chemical Industries
  • Anti-mannose antibody or active fragment thereof
  • Anti-mannose antibody is a sugar chain containing mannose, preferably a sugar chain containing terminal mannose, more preferably a sugar chain containing non-reducing terminal Man. An antibody that recognizes and binds.
  • the active fragment refers to a partial fragment of an antibody that retains antigen binding and immune response activity.
  • the anti-Man antibody may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or a recombinant antibody. Monoclonal antibodies or recombinant antibodies are preferred to allow more specific detection.
  • the globulin type of the antibody is not particularly limited and may be any of IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, and IgY, with IgG and IgM being preferred.
  • the biological species derived from the antibody of this embodiment is not particularly limited. It can be derived from any animal including mammals and birds. Examples include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, donkeys, sheep, camels, horses, chickens, and humans.
  • the “recombinant antibody” refers to, for example, a chimeric antibody, a humanized antibody, and a synthetic antibody.
  • a “chimeric antibody” is an antibody in which the constant region of the light and heavy chains (C region: Constant region) is replaced with the C region of the light and heavy chains of another antibody.
  • C region Constant region
  • an antibody in which the C region of the light and heavy chains is replaced with the C region of an appropriate human antibody is applicable. That is, in this case, the variable region (V region: Variable region) including the CDR is derived from a mouse antibody, and the C region is derived from a human antibody.
  • Humanized antibody is also referred to as a reshaped human antibody, and is a mosaic antibody in which the CDR in a human-derived antibody against the target antigen is replaced with the CDR of the human antibody.
  • a recombinant antibody gene in which a DNA sequence encoding each CDR region (CDR1 to CDR3) of a mouse anti-human non-reducing terminal Man antibody is replaced with a corresponding DNA sequence encoding each CDR derived from an appropriate human antibody It corresponds to an antibody obtained by preparing and expressing it.
  • “Synthetic antibody” refers to an antibody synthesized by using a chemical method or a recombinant DNA method.
  • a monomeric polypeptide molecule in which one or more VL and one or more VH of a specific antibody are artificially linked through a linker peptide having an appropriate length and sequence, or a multimeric polypeptide thereof Applicable.
  • Specific examples of such polypeptides include single chain Fv (scFv: single chain Fragment of variable region) (Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL), diabody ), Triabody or tetrabody.
  • VL and VH are usually located on separate polypeptide chains (light chain and heavy chain).
  • Single-chain Fv is a synthetic antibody fragment having a structure encompassed by one polypeptide chain, in which V regions on these two polypeptide chains are connected by a flexible linker having a sufficient length. Within a single chain Fv, both V regions can self-assemble with each other to form one functional antigen binding site.
  • Single-stranded Fv can be obtained by integrating and expressing a recombinant DNA encoding it in the phage genome using known techniques.
  • a diabody is molecule having a structure based on a dimeric structure of a single chain Fv (Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448).
  • Triabodies and tetrabodies have their trimer and tetramer structures based on a single-chain Fv structure as in diabodies. These are trivalent and tetravalent antibody fragments, respectively, and may be multispecific antibodies.
  • the anti-Man antibody preferably has a high affinity with a dissociation constant with terminal Man-Tf of 10 ⁇ 8 M or less, preferably 10 ⁇ 9 M or less, more preferably 10 ⁇ 10 M or less.
  • the dissociation constant can be measured using a technique known in the art. For example, it may be measured using a speed evaluation kit software by a BIAcore system (GE Healthcare).
  • the polyclonal antibody of this embodiment used in this step is prepared by immunizing a suitable animal with a non-reducing terminal Man sugar chain as an antigen or a glycoprotein fragment consisting of several amino acids containing an asparagine residue added thereto, It can be recovered from animals by methods known in the art. Monoclonal antibodies can also be obtained by known methods that are conventional techniques in the art. For example, after immunizing a mouse with the antigen, antibody-producing cells are collected from the immunized mouse. The antibody-producing cells may be fused to a myeloma cell line, thereby generating hybridoma cells and identifying hybridomas that produce monoclonal antibodies that bind to the terminal molecule, terminal Man-Tf.
  • the “antibody fragment” is a peptide fragment having the antigen-binding activity of the above-mentioned antibody, and examples thereof include Fab, F (ab ′) 2 , Fv and the like.
  • modification includes a label necessary for antibody detection or a functional modification necessary for antigen-specific binding activation.
  • label include the above-described fluorescent substances, fluorescent proteins (for example, PE, APC, GFP), enzymes (for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, glucose oxidase), or biotin or (strept) avidin.
  • modification include glycosylation of an antibody performed to adjust the affinity of the target molecule, terminal Man-Tf, to the non-reducing terminal Man sugar chain.
  • a substitution is introduced into an amino acid residue constituting the glycosylation site to remove the glycosylation site, and thereby the glycosylation site at that site is removed.
  • FR framework region
  • Mannose-binding nucleic acid includes, for example, a nucleic acid aptamer for mannose.
  • Nucleic acid aptamer is an aptamer composed of nucleic acids, which is firmly attached to the target substance by the three-dimensional structure formed on the basis of the secondary structure and tertiary structure of the single-stranded nucleic acid molecule through hydrogen bonding, etc.
  • a ligand molecule having the ability to bind specifically. Specifically, it is a nucleic acid aptamer that recognizes and binds to the structure of mannose, preferably non-reducing terminal mannose and its surrounding sugar chains.
  • the nucleic acid aptamer used in the present specification can be prepared by a method known in the art.
  • an in-vitro sorting method using the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method can be mentioned.
  • the SELEX method is ⁇ selecting RNA molecules bound to target molecules from an RNA pool composed of a large number of RNA molecules having a random sequence region and primer binding regions at both ends thereof. After the recovered RNA molecules are amplified by RT-PCR reaction, transcription is performed using the obtained cDNA molecules as a template to obtain amplification products of the selected RNA molecules, which are used as the next round RNA pool.
  • the base sequence lengths of the random sequence region and the primer binding region are not particularly limited. In general, the random sequence region is preferably in the range of 20 to 80 bases, and the primer binding region is preferably in the range of 15 to 40 bases.
  • RNA pool consisting of RNA molecules or DNA molecules that did not bind to molecules similar to the target molecule was previously mixed with molecules similar to the target molecule and RNA pool or RNA pool.
  • the SELEX method is a known method, and a specific method may be performed according to, for example, Pan et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92: 11509-11513).
  • a nucleic acid molecule finally obtained by executing the above method using a sugar chain mannose as a target molecule can be used as a nucleic acid aptamer for mannose.
  • RNA aptamer and a DNA aptamer are generally known, but the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer in the present specification is not particularly limited.
  • DNA aptamer, RNA aptamer, aptamer composed of a combination of DNA and RNA, and the like are included.
  • RNA aptamers are frequently used, but DNA aptamers are superior in terms of stability, production cost in chemical synthesis, and the number of steps in aptamer production.
  • the nucleic acid aptamer used in this step is a fluorescent substance (for example, FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, Cyanine3, Cyanine5, Cyanine7, FAM, HEX, VIC, fluorescamine, and so on as long as the binding ability to the target molecule is not inhibited. And derivatives thereof, rhodamine and its derivatives, etc.), radioisotopes (for example, 32 P, 33 P, 35 S), or labeling substances such as biotin or (strept) avidin.
  • fluorescent substance for example, FITC, Texas, Cy3, Cy5, Cy7, Cyanine3, Cyanine5, Cyanine7, FAM, HEX, VIC, fluorescamine, and so on as long as the binding ability to the target molecule is not inhibited.
  • rhodamine and its derivatives, etc. radioisotopes
  • labeling substances such as biotin or (strept) avidin.
  • Tf binding molecule refers to a substance that recognizes and binds to the Tf protein constituting the protein portion of the terminal Man-Tf that is the target molecule.
  • the recognition and binding of the target molecule is preferably highly specific.
  • Such substances include peptides, nucleic acids, low molecular compounds, or combinations thereof.
  • Tf binding molecules include Tf binding proteins and Tf binding nucleic acids. Each will be described below.
  • Tf binding protein includes, for example, an anti-Tf antibody or an active fragment thereof.
  • Anti-Tf antibody is an antibody that recognizes and binds to the Tf protein, preferably the Tf protein portion of terminal Man-Tf.
  • the constitution and production method of the anti-Tf antibody of the present invention are specifically described in “(ii) Anti-mannose antibody or active fragment thereof” in “(1) Mannose-binding molecule (A) Mannose-binding protein”. Since the present invention conforms to that, the description thereof is omitted here.
  • Tf-binding nucleic acid includes, for example, nucleic acid aptamers for Tf protein.
  • the configuration of the nucleic acid aptamer and the method for producing the nucleic acid aptamer are specifically described in “(1) Mannose-binding molecule (B) Mannose-binding nucleic acid”, and the same applies to the present invention.
  • the nucleic acid molecule finally obtained by executing the above method using the target molecule as a Tf protein can be used as a nucleic acid aptamer for the Tf protein.
  • Selection component The kit of the present embodiment may further contain an albumin-binding molecule as a selection component. Specific examples of albumin binding molecules include blue sepharose, anti-albumin antibodies or active fragments thereof.
  • Man binding molecule, Tf binding molecule and / or albumin binding molecule may be immobilized on a carrier as necessary, or may be labeled with a fluorescent dye or a luminescent substance.
  • the kit of the present embodiment includes a column (spin column or the like) for filling the Man binding molecule, Tf binding molecule and / or albumin binding molecule, a washing buffer (PBS buffer, physiological saline or the like). ) And / or instructions describing the protocol and the like.
  • a column spin column or the like
  • PBS buffer physiological saline or the like
  • the kit of this embodiment may contain a specific central nervous system disease diagnostic marker binding substance.
  • the “specific central nervous system disease diagnostic marker binding substance” herein refers to a substance that can specifically recognize and bind to a known central nervous system disease index marker.
  • an antibody against a specific terminal GlcNAc glycoprotein or an active fragment thereof is applicable.
  • Specific examples include an antibody against terminal GlcNAc-Tf (an anti-terminal GlcNAc-Tf antibody) or an active fragment thereof, which is an index marker for iNPH. 3.
  • summary The 3rd aspect of this invention is AD disease differentiation method.
  • the method for distinguishing AD disease of the present invention comprises measuring the amount of the AD diagnostic marker of the first aspect present in the body fluid derived from the subject and comparing it with the amount of the AD diagnostic marker present in the body fluid derived from the control body group. By this, it is possible to distinguish the subject from having AD. 3-2.
  • the AD disease differentiation method of the present invention includes (1) a measurement step and (2) a comparative differentiation step as essential steps. Hereinafter, each step will be specifically described.
  • Measurement step refers to the measurement of the amount of AD marker according to the first aspect contained in a predetermined amount of body fluid obtained from the subject and the control body group, preferably cerebrospinal fluid. This is a step of obtaining a measured value.
  • the “subject” in this embodiment refers to an animal individual that is subjected to the differentiation method of this embodiment for the purpose of detecting AD.
  • the subject can be, for example, an individual with unknown central nervous system disease, such as a health check-up examinee, or an individual with an unknown disease name but known to have some central nervous system disease. May be. In the former case, the presence or absence of AD in the subject can be distinguished, and in the latter case, it can be determined whether the central nervous disease in the subject is AD or other central nervous disease.
  • control body refers to an individual that serves as a reference for comparison with the subject in the identification method of the present embodiment.
  • the control body is sufficient as a healthy body, but when determining the pathological condition of AD in the differentiation method of this embodiment, the control body is affected by AD transition type MCI in order to set a high reference value. , And can be early AD affected.
  • a group consisting of a plurality of control bodies is referred to as a “control body group”.
  • the “plurality” here is preferably 3 or more.
  • the control body group includes a healthy body group, an AD transitional MCI affected body group, an early AD affected body group, and the like. In principle, each control body constituting the control body group is an individual having the same state.
  • the bodily fluid obtained from refers to a bodily fluid collected from each of the subject and the control body group. Cerebrospinal fluid or blood is preferable.
  • the method for collecting cerebrospinal fluid and blood is not particularly limited as long as it is a known method.
  • cerebrospinal fluid it may be collected by lumbar puncture. Lumbar puncture is less invasive because it can reduce pain or less by using a commercially available local anesthetic in advance, and can reduce side effects by using an atraumatic needle, This method is suitable for collecting cerebrospinal fluid.
  • blood it may be collected according to a known blood collection method.
  • the body fluids of the subject and the control body should be of the same type as each other so that if one is cerebrospinal fluid, the other is cerebrospinal fluid.
  • Predetermined amount refers to a predetermined amount by volume or weight. Although the predetermined amount is not particularly limited, it is necessary that the AD diagnostic marker according to the first aspect contained in at least a body fluid of an AD patient, preferably a cerebrospinal fluid, is measurable.
  • the spinal fluid may be 5 ⁇ L to 1 mL, or the amount of cerebrospinal fluid protein may be 5 ⁇ g to 200 ⁇ g.
  • the predetermined amount of body fluid to be measured is the same for the subject and the control.
  • the “measurement value” is a value indicating the amount of the AD diagnostic marker measured in this step.
  • the measured value may be an absolute value such as volume or weight, or a relative value such as concentration, ionic strength, absorbance or fluorescence intensity.
  • a body fluid derived from a subject preferably cerebrospinal fluid (referred to as “subject fluid”) and a body fluid derived from a control body group (referred to as “control fluid”), preferably cerebrospinal fluid
  • control spinal fluid preferably cerebrospinal fluid
  • the amount of the AD diagnostic marker contained in each predetermined amount is measured using a Man-binding molecule and a Tf-binding molecule.
  • the Man-binding molecule includes a Man-binding lectin such as UDA lectin or BC2L-A lectin, and the Tf-binding molecule includes an anti-Tf antibody.
  • the method for measuring an AD diagnostic marker is not particularly limited as long as it is a known glycoprotein quantification method using a Man-binding molecule and a Tf-binding molecule.
  • an immunological detection method using an antibody e.g., an immunological detection method using an antibody, a lectin detection method using a lectin, a mass spectrometry method, or a combination thereof.
  • immunological detection methods include enzyme immunoassay (including ELISA and EIA methods), fluorescence immunoassay, radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, surface plasmon resonance (SPR method) , Quartz crystal microbalance (QCM) method, immunoturbidimetric method, latex agglutination immunoassay method, latex turbidimetric method, erythrocyte agglutination reaction, particle agglutination reaction method, colloidal gold method, capillary electrophoresis, Western blotting or immunization Histochemical method (immunostaining method) can be mentioned.
  • the lectin detection method includes a lectin blotting method.
  • Mass spectrometry includes high performance liquid chromatograph mass spectrometry (LC-MS), high performance liquid chromatograph tandem mass spectrometry (LC-MS / MS), gas chromatograph mass spectrometry (GC-MS), and gas chromatograph tandem mass. Analytical methods (GC-MS / MS), capillary electrophoresis mass spectrometry (CE-MS) and ICP mass spectrometry (ICP-MS) can be mentioned.
  • a sandwich ELISA method using a lectin and an antibody and an automated method using the same principle preferably a high-throughput lectin inhibition-automatic latex agglutination method can be used.
  • a combination method of detecting each of a sugar chain and a protein as a target in terminal Man-Tf constituting an AD diagnostic marker is a preferable measurement method because glycoprotein can be quantified with high accuracy.
  • terminal Man-Tf is adsorbed through a body fluid (for example, cerebrospinal fluid) containing terminal Man-Tf, which is an AD diagnostic marker, on a carrier such as a plate on which an anti-Tf antibody is adsorbed.
  • terminal Man-Tf is adsorbed through a body fluid (for example, cerebrospinal fluid) on a carrier such as a plate on which UDA lectin is adsorbed, and then terminal Man-Tf is detected with an anti-Tf antibody.
  • a body fluid for example, cerebrospinal fluid
  • the measured value of the control body group in the said measurement process differs from the measured value of a test subject, and does not necessarily need to measure each time.
  • body fluid for example, cerebrospinal fluid
  • a method for measuring an AD diagnostic marker, and measurement conditions are kept constant, the previously measured values of the control body group can be reused. Therefore, when the amount of AD diagnostic marker obtained from the body fluid of the control body under various conditions is measured in advance, it is made into a database and compared with the measured value of the subject, the measurement measured under the same condition A value may be selected and used as necessary.
  • Comparative differentiation process refers to comparing the measured values of AD diagnostic markers in the subject and the control group, and identifying AD disease in the subject or determining the pathology of AD from the results. It is a process to do.
  • the measurement value of the control body group may be an average measurement value of each control body constituting the control body group.
  • a known protein having no quantitative difference in the cerebrospinal fluid may be used as an endogenous control. Examples of such endogenous control protein include albumin.
  • control group is a healthy group
  • the subject is identified as having AD.
  • the subject is suffering from any central nervous system disorder
  • the subject is suffering from AD, and in other central nervous disorders except MCI associated with AD It can be distinguished.
  • control group is a group suffering from MCI
  • the measured value of the subject is significantly higher than the measured value of the control group, the subject is identified as having a high possibility of transition from MCI to AD.
  • control group is an early AD affected group
  • the subject's AD is determined to be progressing if the measured value of the subject is significantly higher than the control group. If there is no significant difference, it is determined that the AD disease state of the subject is maintained. 4).
  • summary The 3rd aspect of this invention is a disease differentiation method of AD transfer type
  • the method for distinguishing AD-transferred MCI of the present invention comprises measuring the amount of the AD diagnostic marker of the first aspect present in a body fluid derived from a subject, preferably in cerebrospinal fluid, and in a body fluid derived from a healthy body group, preferably By comparing with the amount of AD diagnostic marker present in the cerebrospinal fluid, it is possible to distinguish that a subject suffering from MCI suffers from AD-transition MCI. 4-2.
  • Method The AD transfer type MCI disease differentiation method of the present invention also includes the measurement step and the comparative differentiation step as essential steps as in the AD disease differentiation method of the third aspect. Since the structure and procedure of each process are also the same as those of the third aspect of the AD disease identification method in principle, only the points different from the third aspect will be described here.
  • the AD migration type MCI disease differentiation method of the present invention is different from the AD disease differentiation method of the third aspect in that the control body is limited to a healthy body and the subject is an MCI body body suffering from MCI. There are some.
  • AD migration type MCI As mentioned above, there are cases where symptoms do not progress in MCI and cases where AD progresses to AD. The latter is AD migration type MCI, but it was difficult to differentiate between normal MCI and AD migration type MCI with the prior art. If it is possible to distinguish AD transition type MCI patients existing in MCI, it is possible to start early treatment such as administration of AD treatment drugs, avoiding massive neuronal cell death and preventing migration to AD be able to. In other words, if the AD migration type MCI can be identified, the onset of AD can be prevented.
  • the subject is suffering from MCI and the measured value of the subject is significantly higher than the measured value of the healthy subject group in the comparison and determination step, the subject is suffering from AD-transition-type MCI. Discriminate.
  • terminal GlcNAc-Tf was further digested with hexosaminidase to obtain a Tf sugar chain isoform preparation having mannose (terminal Man-Tf).
  • terminal Man-Tf is a terminal Tri-Man-Tf having three Man non-reducing terminal sugar chains.
  • Electrophoresis was performed using these samples, ie, terminal Sia-Tf, terminal GlcNAc-Tf, and terminal Man-Tf.
  • the amount of each glycoprotein used for electrophoresis was 80 ng for silver staining, 80 ng for immunoblotting, and 160 ng for UDA lectin blotting.
  • LaemmLi sample buffer was added to each glycoprotein and heated, and then subjected to SDS / PAGE using a 5-20% gradient polyacrylamide gel.
  • the electrophoresis was performed at a constant current of 20 mA for 75 minutes.
  • the separated protein was subjected to protein staining using a commercially available silver staining kit (Cat No.291-50301; Wako).
  • a patient who has been suspected of having a neurological disorder and collected cerebrospinal fluid but has not been diagnosed as a result of neurological disorder, such as headache, neuralgia and dizziness. The results are shown in FIG. A band was detected in the vicinity of 74 kDa corresponding to the mobility of Tf from both AD patients (AD) and disease control (Control). Chromatographic scanner quantification showed that the signal intensity increased approximately 1.5-fold in the cerebrospinal fluid of three AD patients.
  • Example 2 Analysis of terminal Man-Tf in cerebrospinal fluid by immunoprecipitation> (the purpose) It is verified by immunoprecipitation that Tf near 74 kDa detected from the cerebrospinal fluid by UDA lectin in Example 1 is due to terminal Man-Tf.
  • UDA lectins bind to all glycoproteins with a non-reducing terminal mannose (terminal Man glycoprotein). Therefore, by utilizing the phenomenon, it was verified whether or not there exists a glycoprotein (glycoprotein that gives a noise signal) that is a terminal Man glycoprotein in cerebrospinal fluid and exhibits the same mobility as the terminal Man-Tf.
  • Immunobeads in which an anti-Tf antibody and Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Cat No. 17-0618-02; GE Healthcare Japan) were bound were prepared.
  • the beads and cerebrospinal fluid were incubated at 4 ° C. for 3 hours. After incubation, the supernatant was collected as the unbound fraction of beads. Thereafter, the beads were washed three times with TBST (Tris buffered saline-0.05% Tween), and LaemmLi sample buffer was added to the beads to elute the bound fraction.
  • TBST Tris buffered saline-0.05% Tween
  • cerebrospinal fluid diluted with buffer, or 15-150 ng / mL terminal Man-Tf was added to the wells and incubated.
  • biotinylated UDA lectin was added and incubated.
  • streptavidin labeled with Horse radish peroxidase (HRP) was added and incubated.
  • TMB as a chromogenic substrate was added to develop color at room temperature, and the reaction was stopped with 1M phosphoric acid, and then OD 450 was measured.
  • a calibration curve was prepared using the terminal Tri-Man-Tf preparation, and the terminal Man-Tf in the cerebrospinal fluid was quantified.
  • the terminal Man-Tf amount in iNPH showing dementia was also 16.892 ⁇ 6.173 ⁇ g / mL, and no significant difference from the disease control was observed.
  • iNPH showed a trend toward a decrease in Man-Tf levels compared to that of disease controls, but no significant difference was observed.
  • the terminal Man-Tf amount of iNPH was significantly different from the terminal Man-Tf amount of AD (p ⁇ 0.001).
  • the iNPH group and AD group could be differentiated with a sensitivity of 74.1% and specificity of 90.0%.
  • sensitivity 90.0%
  • specificity 81.5%
  • MCI 231.3 ⁇ 89.8
  • AD 147.8 ⁇ 45.3
  • p ⁇ 0.001 The ratio of Man-Tf / p-Tau is significantly higher in MCI (231.3 ⁇ 89.8) than AD (147.8 ⁇ 45.3) (p ⁇ 0.001), as shown in Figure 9, and Man-Tf is earlier than p-Tau It was shown to rise. This suggests that Man-Tf correlates with AD pathology earlier than p-Tau, a neuronal cell death marker.
  • terminal Man-Tf was considered a phenomenon peculiar to AD and its progression.
  • the increase in terminal Man-Tf in MCI also suggests that terminal Man-Tf increases at the pre-AD lesion stage. Therefore, terminal Man-Tf can be expected to be applied to determine the effects of AD therapeutics.
  • terminal Man-Tf is useful for differentiating from other dementias, particularly iNPH, and may be an auxiliary diagnostic marker for tauopathy.
  • Example 5 Immunohistochemistry of Alzheimer's disease brain using anti-Tf antibody> (the purpose) Terminal Man-Tf has been suggested to increase as AD progresses. Therefore, the expression change of Tf glycoprotein in AD brain is analyzed by immunohistochemistry.
  • the AD brain tissue was fixed with a phosphate buffer containing 15% formalin, and then a paraffin block was prepared. Thin slices (5 ⁇ m) were deparaffinized and then incubated overnight at 4 ° C. with anti-Tf polyclonal antibody (DAKO; 1: 1000).
  • the primary antibody binding site was visualized with Histofine reagent (Nichirei). Specifically, after washing the section, an enzyme / second antibody labeled polymer in which a peroxidase and a Fab ′ second antibody were bound to an amino acid polymer was bound to a primary antibody, and a peroxidase-DAB reaction was performed. (result)
  • the results are shown in FIG.
  • anti-human Tf antibody showed positive images of astrocyte-like cells (c).
  • positive fibers were observed in the neuropil of the cortical layer I (molecular layer), and they were arranged in bundles especially under the buffy coat (b).

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Abstract

認知症、特にアルツハイマー病、及びアルツハイマー病に進行し得る軽度認知障害を他の中枢神経疾患と識別するための、又は認知症の病態の判定が可能な、バイオマーカーを開発し、そのバイオマーカーを用いた認知症の早期診断方法及び病態判定方法の提供を課題とする。　非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖を含むトランスフェリン糖タンパク質又は前記糖鎖を含むトランスフェリン断片をアルツハイマー病診断マーカーとして使用する。

Description

認知症の診断マーカー及びそれを用いた認知症罹患鑑別方法
　本発明は、認知症、特にアルツハイマー病、及びアルツハイマー病に進行し得る軽度認知障害を他の中枢神経疾患と識別するバイオマーカー、またそれを用いた認知症の罹患鑑別方法及び病態判定方法に関する。
　アルツハイマー病（Alzheimer's disease：以下、本明細書においてはしばしば「AD」と略称する）は、不可逆的な進行性中枢神経疾患の一種であり、記憶障害や思考障害を伴う認知機能障害（認知症）、行動障害、又は人格変化等の症状を呈する。認知症の中では最も多い疾患であり、認知症患者全体の約60～80％を占めている。一般には65歳以上の高齢者で発症するが、一部は64歳以下でも発症し、若年性アルツハイマー病と呼ばれている。
　全世界における認知症の患者数は、2010年時点で3,500万人と推定されており、今後20年ごとに倍増し、2050年には1億１千万人に達すると予想されている。このうち、約70％がAD患者と考えられている。特に先進諸国では、AD患者の増加に伴う医療費の増大や介護問題等で国や患者関係者達の経済的又は精神的負担が深刻化しており、大きな社会的問題となりつつある。
　家族性（遺伝性）ADは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子やプレセニリン1（PSEN1）遺伝子の変異を原因とする遺伝子疾患でもあり、疎水性のペプチドであるアミロイドβタンパク質（Aβ）の脳内の神経細胞に凝集蓄積に始まり、その後、微小管タンパク質であるtauタンパク質が過リン酸化されて線維化した後に、神経細胞が破壊され、脳が萎縮することにより発症する。ADの大部分を占める孤発性の症例でも、基本的には同様の病理プロセスにより発症することが知られている。
　現在、ADの発症機序に基づき、その発症プロセスを阻害するAD治療薬が多数開発されている。しかし、そのほとんどは、臨床治験での十分な有効性が未だに示されていない。これは、治験薬が無効なのではなく、治験対象群が適切でないためだと考えられている。従来臨床治験が行われていた対象群は、ADによる脳病変が進行し、大量の神経細胞死が生じた段階であった。ところが、この段階で治療を開始しても通常、神経の回復は望めない。つまり、治療薬の投与時期が遅すぎたために、有効な治療効果を得ることができなかったと考えられている（非特許文献１）。したがって、適切な投与時期、すなわち、神経細胞死を回避可能な早期の段階でAD治療薬を投与することができれば、その有効性の検証が可能なはずである。
　ところで、物忘れ外来で認知症が疑われる患者は、通常、認知症スコア等の検査に基づいて正常群、軽度認知障害（mild cognitive impairment：以下、本明細書においてはしばしば「MCI」と略称する）、及びADの3群に分類される。長期観察研究結果から、MCI患者の一部は、将来ADを発症するが、残りはMCIのまま留まることが知られている。つまり、MCI患者の一部は、極めて初期のAD患者と解することができる。このような将来ADに移行し得るMCI（本明細書では、しばしば「アルツハイマー病移行型軽度認知障害（AD移行型MCI）」と表記する）患者では神経細胞死がほとんど生じていない。それ故に、AD移行型MCI患者は、AD治療薬の有効性を確認する治験対象群として非常に望ましい。またAD移行型MCIは、ADの発症の予防する又は進行を遅延させる効果を得る上で、AD治療薬の好適な投与時期でもある。そのためには、ADの早期診断方法やAD移行型MCIの鑑別方法の開発が不可欠である。
　現在は、MRI又はCT等の画像診断技術の進歩により脳における形態学的変化や病的変化、例えば、微少な出血や腫瘍の発見が可能となっている。ところが、ADのような神経変性疾患は、10～20年の長期にわたって形態学的な変化が進行するため、脳室拡大（脳萎縮）等のAD特有の変化を画像で捉えることができるのは、大量の神経細胞死が生じた後である。したがって、脳の形態学的変化からADを早期に診断することは難しい。またMCIでは脳の形態学的変化がほとんど認めらないため脳の形態学的変化からAD移行型MCIを鑑別することは困難である。
　さらに、ADは、一般に死後の剖検脳でアミロイド斑と神経原繊維変化を病理学的に証明することによって確定診断されるが、生存時にアミロイド斑を画像所見として描出することは、これまで困難であった。最近になってポジトロン放射性アイソトープである11Cで標識した[11C]Pittsburgh compound (PiB)を放射性画像診断薬として患者体内に導入して、アミロイドPET（positron emission tomography：陽電子放出断層撮影）により脳内のアミロイドタンパク質の蓄積を描出する方法、又は6-[(3-18F-fluoro-2-hydroxy)propoxy]-2-(4-methylaminophenyl)quinolone(18F-THK5117)を使用したタウPETが行なわれている（非特許文献３）。これらの検査方法は、比較的早期の段階でADを検出できることから、臨床治験におけるAD治療薬の早期投与の検証に有効ではあるが、診断にかかる時間が長く、また費用が高額なことから、通常の診断方法としてはあまり適切でない。
　したがって、近年では、簡便で低コストなバイオマーカーが求められている。例えば、ADの早期診断マーカーには、ADの原因因子を用いる方法も開発されている。具体的には、過剰にリン酸化されたtauタンパク質、アミロイドβ42（Aβ42）ペプチド、又は炎症性疾患におけるサイトカイン等をAD診断マーカーとする方法が挙げられる（非特許文献２）。しかし、サイトカインは、感度よく測定できるものの、疾患特異性に乏しいという欠点がある。リン酸化tauタンパク質は、優れたAD診断マーカーではあるが、このタンパク質の出現は、神経細胞の死を意味しており、神経細胞死を回避すべきADの早期診断用としては不十分である。また、前頭側頭型認知症や進行性核上麻痺等の認知症でもtauタンパク質は増加するためADに特異的なバイオマーカーとも言い難い。一方、Aβ42ペプチドについても病気が進行した後でなければ変化しないという問題がある。
Selkoe D.J., 2012, Science 337: 1488-92. Mattsson N et al., JAMA. 2009, 302(4):385-93 Li Y et al., 2015, J Nucl Med., 56(2):270-3.
　本発明は、AD罹患鑑別の指標となるバイオマーカー又はAD進行度や治癒度の病態判定が可能なバイオマーカーを開発し、また、そのバイオマーカーを用いたADの簡易な早期診断方法及び病態判定方法を提供することを課題とする。
　これまでに本発明者らは、中枢神経系には固有の糖鎖構造を有する糖タンパク質が存在すると仮定し、髄液と血清間で糖鎖部分が異なる糖タンパク質を様々な抗体を用いてスクリーニングした。その結果、その様な特徴を有する糖タンパク質として、トランスフェリン（Transferrin）（本明細書では、しばしば「Tf」と略称する）糖タンパク質が同定された。Tf糖タンパク質は、血清中では非還元末端にシアル酸を有するシアル酸化Tf（図１A）として存在するが、髄液中では、シアル酸化Tfと非還元末端にシアル酸を持たない非シアル酸化Tfの2種類のTf糖鎖アイソフォームとして存在する。さらに、シアル酸化Tf／非シアル酸化Tfの比率（Tfインデックス）は、髄液代謝異常に基づく認知症である特発性正常圧水頭症（idiopathic Normal Pressure Hydrocephalus）（本明細書では、しばしば「iNPH」と略称する）の指標マーカーになることを示した（特開2010-121980；Futakawa et al., 2012, Neurobiol Aging, 33: 1807-15.）。
　本発明者らは、上記知見に基づき、さらなる研究を重ねた結果、それまで1種類のアイソフォームと考えられてきた非シアル酸化Tfには、さらに2つのサブグループ（サブグループ1及びサブグループ2）が包含されていることを見出した（Nagae et al., 2014, Glycobiology, 24, 693-702）。
　図１で示すように、ヒトTfは、開始メチオニンを1位としたときに432位（N432）及び630位（N630）のアスパラギンに糖鎖が付加されている。非シアル酸化Tfのサブグループ1（図１B）では、N630の糖鎖が非還元末端にN-アセチルグルコサミン（本明細書では、しばしば「GlcNAc」と略称する）を持ち、かつバイセクトGlcNAc及びコアフコースで修飾されている。また、N432の糖鎖も非還元末端にGlcNAcを持つが、バイセクトGlcNAcのみで修飾されており、コアフコースを持たない。一方、本発明者らが新たに見出したサブグループ2（図１C）では、N630の糖鎖はサブグループ1と同様であるが、N432の糖鎖が非還元末端にマンノース（本明細書では、しばしば「Man」と略称する）を持つ。
　今回、本発明者らは、非還元末端にマンノースを持つ糖鎖を含むTfサブグループ2がAD及びMCIの診断マーカーとなること、髄液中に存在するTfサブグループ2がレクチンや抗体を用いることで定量可能であること、そしてその量がADやMCIの進行度と相関することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明は上記知見に基づくものであって、以下を提供する。
　（１）非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖を含むTf糖タンパク質又は前記糖鎖を含むTf断片からなるAD診断マーカー。
　（２）前記糖鎖が配列番号１で示すアミノ酸配列からなるTfタンパク質の432位のアスパラギン残基に付加されている、（１）に記載のAD診断マーカー。
　（３）初期AD又はAD移行型MCIの鑑別用である、（１）又は（２）に記載のAD診断マーカー。
　（４）ADと他の認知症との鑑別用である、（１）又は（２）に記載のAD診断マーカー。
　（５）（１）～（４）のいずれかに記載のAD診断マーカーを検出するための、Man結合分子及びTf結合分子を含む、AD診断キット。
　（６）前記Man結合分子がマンノース結合レクチン、抗マンノース抗体、及びマンノースに対するアプタマーからなる群から選択される、（５）に記載の診断キット。
　（７）前記マンノース結合レクチンがUDAレクチン又はBC2L-Aレクチンである、（６）に記載の診断キット。
　（８）前記Tf結合分子が抗Tf抗体及び／又はTfタンパク質に対するアプタマーである、（５）～（７）のいずれかに記載の診断キット。
　（９）AD罹患鑑別方法であって、被験体及び対照体群から得られた所定量の体液中に存在する（１）又は（２）に記載のAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び対照体群の測定値を比較して、AD診断マーカーの測定値が被験体で有意に高いときに、その被験体がADに罹患していると鑑別する比較鑑別工程を含む前記方法。
　（１０）前記対照体群が健常体群である、（９）に記載の罹患鑑別方法。
　（１１）前記対照体群が初期AD罹患体群である、（９）に記載の罹患鑑別方法。
　（１２）前記被験体が中枢神経疾患に罹患している、（９）又は（１０）に記載の罹患鑑別方法。
　（１３）AD移行型MCI鑑別方法であって、被験体及び健常体群から得られた所定量の体液中に存在する（１）又は（２）に記載のAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、前記測定工程で得られた被験体及び健常体群におけるAD診断マーカーの測定値を比較して、AD診断マーカーの測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体がAD移行型MCIに罹患していると鑑別する比較鑑別工程を含み、前記被験体がMCIに罹患している前記方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-094385号の開示内容を包含する。
　本発明のAD診断マーカーによれば、ADの罹患又は罹患可能性の診断やADの病態を判定できる。
　本発明のAD診断キットによれば、容易に、かつ比較的低コストでAD診断マーカーを検出することができ、それによって試料提供者である被験体のADの罹患又は罹患の可能性の鑑別、及び／又は病態の判定ができる。
　本発明のAD罹患鑑別方法によれば、被験体、特に何らかの中枢神経疾患に罹患している患者が、ADに罹患していること又はADへの罹患可能性を鑑別することができる。また、罹患しているADの病態を判定することもできる。
　本発明のAD移行型MCI鑑別方法によれば、MCI罹患患者の中でADに移行し得る可能性のあるAD移行型MCI患者を容易に、かつ高い精度で鑑別することができる。
A～C：髄液中に存在するTf糖タンパク質の3種のTf糖鎖アイソフォームの構造を示す概念図である。Aはシアル酸非還元末端糖鎖を2本有する末端Sia-Tf糖タンパク質（シアル酸化Tf）を、BはGlcNAc非還元末端糖鎖を2本有する末端GlcNAc-Tf糖タンパク質（非シアル酸化Tfサブグループ1）を、そしてCはMan非還元末端糖鎖とGlcNAc非還元末端糖鎖をそれぞれ1本ずつ有する末端Man-Tf糖タンパク質（非シアル酸化Tfサブグループ2）を示す。D：抗Tf抗体を用いた髄液及び血清のウェスタンブロットの結果を示す図である。髄液及び血清で検出されたaは、末端Sia-Tf糖タンパク質を示す。一方、髄液のみで検出されたbは、見かけ上、1種のTf糖タンパク質に見えるが、末端GlcNAc-Tf糖タンパク質と末端Man-Tf糖タンパク質の2種のTf糖タンパク質（サブグループ1及び2）を含む。 UDAレクチンの糖鎖結合特異性を示す図である。末端Man-Tf、末端GlcNAc-Tf及び末端Sia-Tfの各Tf糖タンパク質標品を電気泳動した後に、銀染色した図（A)、抗Tf抗体を用いたイムノブロット図（B）、及びUDAレクチンを用いたレクチンブロット図（C)を示す。 AD群（n=3）及び疾患コントロール群（n=4）から得た髄液中のMan-TfをUDAレクチンブロットで分析した結果を示す。 髄液中のTfの抗Tf抗体を用いた免疫沈降反応の結果を示す。抗Tf抗体結合ビーズと髄液を反応させた後の上清画分（非結合画分）、抗Tf抗体結合ビーズとの結合画分（溶出画分）、及び出発材料の未調製髄液の電気泳動後のサンプルを銀染色で検出した結果（A）、抗Tf抗体を用いたイムノブロットで検出した結果（B）、及びUDAレクチンブロットで検出した結果（C）を示している。aは末端Sia-Tfを、bは末端Man-Tf／末端GlcNAc-Tf（Cでは末端Man-Tf）を、またcは末端Man-Tf以外のMan糖タンパク質（GP-X）を示す。 Aは、末端Man-Tfを検出するためのUDAレクチン／抗体サンドイッチELISA法の測定原理図である。図中、aは捕捉抗体である抗Tf抗体を、bはUDAレクチンを示す。Bは、末端Man-Tf（末端Tri-Man-Tf）を用いたときの検量線を示す。マイクロタイタープレートに抗Tf抗体を固定して遊離のTfを捕捉し、末端Man-TfをUDAレクチンにて検出し定量した。末端Sia-Tfは、UDAレクチンと結合しないので検出されない。検量線では標準として末端Tri-Man-Tfを用いている。 アルツハイマー病（AD）群、軽度認知障害（MCI）群、特発性正常圧水頭症（iNPH）群、レビー小体型認知症／前頭側頭型認知症（DLB/FTD）群、及び健常対照（NC）群の5群において、髄液中の末端Man-TfをUDAレクチン／抗体サンドイッチELISA法にて定量した結果である。 抗Tf抗体を用いたAD脳（大脳皮質）の免疫組織化学の結果である。図中、aは軟膜を、枠内のｂは陽性繊維束を、そして円で囲んだ領域のcは星状細胞様の細胞を示す。AD脳では、星状細胞様の細胞体が染色されている。また、皮質第Ｉ層(分子層)のニューロピルに陽性線維が観察され、特に軟膜下では束状に配列していた。 AD群、MCI群、iNPH群、DLB/FTD群、及びNC群の5群において、髄液中の末端Man-TfをBC2LAレクチン／抗体サンドイッチELISA法にて定量した結果である。 同一髄液試料に対するBC2LAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値と既知のAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）の測定値の比率（Man-Tf/p-Tau）を示す図である。 同一髄液試料に対するUDAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値と既知のAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）の測定値の比率（Man-Tf/p-Tau）を示す図である。
１．アルツハイマー病診断マーカー
１－１．概要
　本発明の第１の態様は、アルツハイマー病（AD）診断マーカーである。本発明の診断マーカーは、体液中に存在する糖タンパク質又はそのペプチド断片からなり、被験体におけるADの罹患又は罹患可能性の診断やADの病態判定できる。
１－２．定義
　本明細書で使用する用語について、以下で定義をする。
　本明細書において「アルツハイマー病（Alzheimer's disease；AD）」とは、前述のように、認知症、行動障害、又は人格変化等の症状を呈する不可逆的な進行性中枢神経疾患である。なお、後述するように、本明細書ではアルツハイマー移行型軽度認知障害（AD移行型MCI）はADに包含される。
　本明細書において「軽度認知障害（mild cognitive impairment;MCI）」とは、認知機能（記憶、決定、理由付け、実行等）のうち1つに機能障害を生じ、その結果、認知機能の軽微な低下が認められるものの、日常生活には支障がない状態をいう。本明細書においては、MCIを中枢神経疾患に含める。前述のように、MCI患者の一部は、進行に伴い将来的にADに移行するAD移行型MCIに罹患している。AD移行型MCIは最終的にADに移行するため、本明細書においてはAD移行型MCIをMCIのカテゴリーではなく、ADのカテゴリーに包含する。
　本明細書において「診断」とは、疾患の罹患鑑別若しくは罹患可能性、又は疾患の病態を判断することをいう。通常、診断行為は、医師、獣医師、又は歯科医の専権業務であるが、本明細書における診断は、医師等の行為を介することなく、医師等による診断を補助する補助的行為を包含する。
　本明細書において「罹患（の）鑑別」とは、特定の疾患に罹患しているか、いないかを判断することをいう。病変や病状が類似する他の疾患との識別も含む。
　本明細書において「罹患（の）可能性」とは、将来、特定の疾患に罹患する確率をいう。本明細書においては、特定の疾患をADとした場合に、MCIからADへの移行可能性も含む。
　本明細書において「疾患（の）病態」とは、特定の疾患の状態、及びその程度や病期をいう。例えば、状態の程度であれば軽症（軽度）、中等症（中度）、及び重症（重度）が挙げられ、病期であれば初期、中期、及び後期が挙げられる。本明細書における「病態」は、患者の特定の時点における疾患の状態だけでなく、ある時点から他の時点までの疾患の状態の推移を含む。例えば、疾患の状態が時間経過と共に悪化する疾患の進行状況やその度合い、または逆に時間経過と共に改善する疾患の治癒状況やその度合いも含み得る。したがって、本明細書において「病態の判定」とは、認知症のような疾患における特定の時点の状態や程度の判定、及びある時点から他の時点までの疾患の状態の推移（進行しているか、又は改善しているか）の判定を含む。
　本明細書において、「体液」とは、被験体及び対照体から採取される液状試料をいう。例えば、髄液（脳脊髄液）、血液（血清、血漿及び間質液を含む）、尿、リンパ液、消化液、腹水、胸水、神経根周囲液、各組織若しくは細胞の抽出液等が挙げられる。好ましくは髄液又は血液、より好ましくは髄液である。
　本明細書において、「髄液（cerebrospinal fluid：CSF)とは、脳と脊髄の中枢神経系（CNS：Central Nerve System）周囲にのみ存在する無色透明の細胞外液をいう。他の臓器とは硬膜によって、また血液とは血液脳関門や血液脳脊髄液関門によって、隔てられている。髄液は、その大部分が脳の実質より滲出することや、脳細胞と髄液との間には障壁が事実上存在しないことが近年の研究から明らかとなっている（Wang C, et al., 2012, Cerebrospinal Fluid: Physiology, biomarker and methodology. In: V. S, Dolezal, T., editor. Cerebrospinal Fluid: Functions, Composition and Disorders. New York: Nova Science Publishers; pp.1-37.）。この髄液中には、中枢神経系由来のタンパク質が多数存在し、中枢神経系疾患に伴い、その発現が増減することが知られている。
　本明細書において「糖タンパク質」とは、一以上の糖鎖が付加したタンパク質をいう。糖タンパク質において糖鎖は、翻訳後修飾の一つとして付加され、生体内のタンパク質の50%以上に存在するとされている。糖鎖は、タンパク質の安定化、保護、生理活性、抗原抗体反応、ウイルス感染及び体内動態等に関与する等、様々な機能をタンパク質に付与する重要な役割を担う。
　本明細書において「（その糖鎖を含む）ペプチド断片」とは、前記糖タンパク質の一部からなり、かつ糖鎖が付加されたアミノ酸残基を含むペプチドである。本発明においては、特に後述の「１－３．構成」に記載した第３のTf糖鎖アイソフォームである末端Man-Tfの一部からなり、かつマンノース非還元末端糖鎖が付加した432位のアスパラギン残基を含むペプチドをいう。ペプチド断片のアミノ酸数は特に限定はしない。糖タンパク質の一部であることから下限はエピトープを包含し得る長さ、例えば、8アミノ酸以上、好ましくは10又は15アミノ酸以上、より好ましくは20又は30アミノ酸以上であればよく、上限は糖タンパク質の全長未満のアミノ酸を有していればよい。
　本明細書において、「マンノース非還元末端糖鎖（Man非還元末端糖鎖）」とは、非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖をいう。非還元末端Manの数は問わない。直鎖状の糖鎖の非還元末端に1個存在していてもよいし、分岐した複数の非還元末端に1個又は複数個存在していてもよい。本明細書において「複数個」とは、2～10個、2～9個、2～8個、2～7個、2～6個、2～5個、2～4個、又は2～3個をいう。全ての非還元末端糖がマンノースであることが好ましい。高Man型（ハイマンノース型）糖鎖や少なくとも1つの非還元末端にマンノースを有する混合型糖鎖は、Man非還元末端糖鎖に該当する。
　本明細書において、糖鎖の「非還元末端（糖）」とは、糖タンパク質の糖鎖において、フリーのヒドロキシル基が存在せず、それ故に還元性を示さない末端糖をいう。例えば、非還元末端マンノース（非還元末端Man）、非還元末端GlcNAc、及び非還元末端シアル酸（非還元末端Sia）が挙げられる。一方、糖鎖の「還元末端（糖）」とは、フリーのヒドロキシル基を有した還元性を示す末端糖である。還元糖は、ヘミアセタール又はケタール構造をとり、通常は還元末端糖がタンパク質に結合している。
　本明細書において「被験体」とは、本発明の各態様における適用対象をいう。原則として個体であるが、組織や細胞も包含する。具体例として、個体であれば哺乳動物個体、好ましくはヒト、イヌ、ネコ、ウマ等が挙げられる。好ましくはヒトである。個体の場合、生死は問わないが、生体であることが好ましい。また、個体は、何らかの疾患を有する疾患罹患体、疾患の罹患可能性のある個体、又は健常体のいずれであってもよい。
　本明細書において「疾患罹患体」とは、特定の疾患に罹患している個体をいう。例えば、本明細書における主な疾患罹患体は、AD罹患体又はMCI罹患体（特にAD移行型MCI罹患体）であり、また、「疾患の罹患可能性のある個体」とは、例えば、MCIからADへの移行可能性のある個体である。
　本明細書において「健常体」とは、健常状態にある個体をいう。「健常状態」とは、少なくとも中枢神経疾患、例えばAD及びMCI等に罹患していない状態、好ましくは疾患や障害のない健全な状態を意味する。したがって、後述する実施例に記載の「疾患コントロール」は、本明細書では健常体の一形態に該当する。本明細書において健常体は、主に被験体との比較基準である対照体として使用される。したがって、本明細書において被験体と健常体は、少なくとも同一種である。さらに、亜種（人種を含む）、性別、年齢（月例、週齢を含む）、身長、体重等の条件が同一であることが好ましい。また本明細書では複数の健常体からなる集団を「健常体群」と称する。
１－３．構成
　本発明の「アルツハイマー病診断マーカー（AD診断マーカー）」は、糖タンパク質又は糖鎖を含むペプチド断片で構成され、被験体におけるAD又はAD移行型MCIの罹患、又はADの罹患可能性、すなわちMCIからADへの移行可能性を診断可能なバイオマーカーである。
　本発明のAD診断マーカーにおいて、糖タンパク質を構成するタンパク質は、トランスフェリン（Transferrin;Tf）タンパク質である。Tfタンパク質は、2個の鉄（Fe）イオンと可逆的に結合し、その生体内輸送を担う分子量約80KDaのキャリアタンパク質である。トランスフェリンの具体例として、698個のアミノ酸残基で構成され、配列番号１で示すアミノ酸配列からなるヒトTfタンパク質が挙げられる。Tfタンパク質は、通常、糖タンパク質としてその機能を発揮している。このように糖鎖が付加されたTfタンパク質を本明細書では、しばしば「Tf糖タンパク質」と表記する。
　糖鎖には、タンパク質のアミノ酸配列におけるアスパラギン（Asn:N）残基の側鎖に付加されたN結合型糖鎖と、セリン（Ser:S）残基又はスレオニン（Thr:T）残基の側鎖に付加されたO結合型側鎖が知られている。本発明のAD診断マーカーを構成するTf糖タンパク質の糖鎖は、前述のように2か所（N432及びN630）のアスパラギン残基に付加されるN結合型糖鎖である。
　Tf糖タンパク質には、タンパク質部分が共通で、付加されるN結合型糖鎖の構造のみが異なる3種のアイソフォーム（本明細書では「Tf糖鎖アイソフォーム」と称する）が存在する。本発明のAD診断マーカーは、その1つであり、後述する第３のTf糖鎖アイソフォームに相当する末端Man-Tfで構成されている。以下、Tf糖タンパク質における3種のTf糖鎖アイソフォームについて説明をする。
　第１のTf糖鎖アイソフォームは、前述のシアル酸化Tfに相当し、図１のAに示すように、2本のシアル酸非還元末端糖鎖が付加された構造を有するTf糖タンパク質である。「シアル酸非還元末端糖鎖」とは、非還元末端にα2,6シアル酸を持つ糖鎖をいう。本明細書では、シアル酸非還元末端糖鎖が付加されたTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端Sia-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端Sia-Tfは、図１Dのaで示すように血清及び髄液のいずれにも存在しているが、特に血清中に多量に存在することから、「血清Tf（糖タンパク質）」とも言われる。末端Sia-Tfは、他の糖タンパク質との糖鎖構造の類似性から肝臓で生合成されるTf糖タンパク質と考えられている。
　第２のTf糖鎖アイソフォームは、前述の非シアル酸化Tfサブグループ1に相当し、図１のBに示すように、2本のGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質である。「GlcNAc非還元末端糖鎖」とは、非還元末端にN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）を持つ糖鎖をいう。本明細書では、GlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端GlcNAc-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端GlcNAc-Tfは、脳及び／又は脊髄のような中枢神経系の細胞で産生され、主として髄液中に見られる脳型糖タンパク質と考えられている。
　第３のTf糖鎖アイソフォームは、前述の非シアル酸化Tfサブグループ2に相当し、図１のCに示すように、2本の糖鎖のうち一方にMan非還元末端糖鎖が、また他方にGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質である。より具体的には、ヒトTfタンパク質であれば、N432にMan非還元末端糖鎖が付加され、N630にはGlcNAc非還元末端糖鎖が付加されたTf糖タンパク質が該当する。本明細書では、前述の糖鎖構造を有するTf糖鎖アイソフォームをしばしば「末端Man-Tf（糖タンパク質）」と表記する。末端Man-Tfと末端GlcNAc-Tfは、移動度が近似するため、ウェスタンブロットでは図１Dのbで示すように両者のバンドが重複して見かけ上、1種の糖鎖アイソフォームとして検出される。それ故に、これまで髄液特異的なTf糖タンパク質として末端GlcNAc-Tfは知られていたが、末端Man-Tfの存在は知られていなかった。末端Man-Tfも末端GlcNAc-Tfと同様に、脳型糖タンパク質と考えられている。
　上述のように、第２及び第３のTf糖鎖アイソフォームは、脳型糖タンパク質であることから、主として髄液中に存在する。ただし、髄液中の成分（髄液成分）の一部は、頭頸部のリンパ管中や脊髄神経根等にも存在し、また微量ながら血清中にも漏出することが知られている。例えば、プロスタグランジンD2合成酵素は、髄液特有の脳型糖タンパク質であるが、その1％程度の濃度が血中から検出され得る。したがって、第２及び第３のTf糖鎖アイソフォームも髄液以外の体液中にも存在し得る。
　上述した各Tf糖鎖アイソフォームは、細胞種に特異的であり、その量的変化は由来する細胞種の病的状態を反映する。それ故に、疾患の有用な診断マーカーとなり得る。
　例えば、末端GlcNAc-Tfは、iNPHの指標マーカーとなることが知られている（特開2010-121980号）。
　一方、末端Man-Tfは、iNPHの指標マーカーにはならないが、本発明のAD診断マーカーを構成するTf糖鎖アイソフォームである。体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量は、健常体又は健常体群と比較して、AD移行型MCI罹患体及びAD罹患体において有意に増加している。このような増加は、他の中枢神経疾患では認められない。したがって、AD移行型MCIとAD非移行型MCIの識別、及びADと病変や病状が類似する他の中枢神経疾患との識別においても有用なマーカーとなり得る。例えば、問診等による初期診察でMCIに罹患していると診断された患者において、健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量が有意に多い場合、そのMCIはAD移行型MCIであり、将来ADに移行する可能性が高いと判定することができる。一方、末端Man-Tf量に有意差がない場合には、そのMCIはAD非移行型MCIと判定することができる。
　また、例えば、初期ADの症状と、レビー小体型認知症（dementia with Lewy bodies）（本明細書では、しばしば「DLB」と表記する）又は前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia）（本明細書では、しばしば「FTD」と表記する）の初期症状は、区別が難しく、症候学的差異からの鑑別は容易ではない。特にFTDではADと同様に体液中（主として髄液中）のリン酸化tauタンパク質の増加が見られ、既存の最も有効とされるAD診断マーカーも利用できないとされている。しかし、DLBやFTDでは、健常体又は健常体群と比較して、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量に有意差が認められない。したがって、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量を測定することでADと、DLB又はFTDを容易に鑑別することができる。
　さらに、例えば、後期ADとiNPHは、共に脳室拡大という顕著な形態変化と認知症が見られる点で極めて類似しており、その鑑別は容易ではない。iNPHは髄液の過剰が原因であることから、簡単な小手術（例えば脳室と腹腔をチューブでバイパスするシャント術）で過剰髄液を排液すれば完治可能である。すなわち“治る”認知症であることからその正確な診断が求められている。ところが、日本におけるiNPH患者数は31万人と推測されているにもかかわらず、本疾患の根治手術を受けている患者は年間1200人（予想患者数の0.4％）にすぎない。これは、多くiNPH患者がADと誤診され、治療の恩恵を受けられないまま放置されていることを示唆している。また、近年、iNPHとADの合併例が多数報告されている。一般に、AD病理は、Aβの凝集によって開始され、このAβの凝集体が早期ADで観察されるアミロイド斑となる。しかし、通常は、髄液の循環でAβを洗い流す生理的メカニズムが働くためAβの凝集は抑制されている。それ故に、iNHPの一部では、髄液の循環不全によるAβの洗い流しの低下が生じ、AD病理が進行しやすくなると考えられている。実際、iNPH患者においてADマーカー陽性例（合併例）と陰性例を比較すると、前者では記憶や遅延想起等の回復が良好ではないことが報告されている(Kazui et al, 2016, J Neurol Sci, 369:236-41. doi: 10.1016/j.jns.2016.08.040. Epub 2016 Aug 19)。したがって、iNPHとADそれぞれの早期診断マーカーを測定し、合併例と非合併例を鑑別することは、治療効果の予測に重要である。ここで、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tfは、AD診断マーカーとなる。一方、同じ体液中（主として髄液中）のTf糖鎖アイソフォームの一つである末端GlcNAc-Tfは、前述のようにiNPHの診断マーカーとなる。それ故に、iNPHでは、健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量に有意差が認められないが、体液中（主として髄液中）の末端GlcNAc-Tf量は有意に少なくなる。一方、ADやAD移行型MCIでは健常体又は健常体群と比較して体液中（主として髄液中）の末端GlcNAc-Tf量に有意差は認められないが、末端Man-Tfが増加する。したがって、体液中（主として髄液中）に存在するそれぞれの診断マーカーを測定することで、両疾患を容易に、かつ高い精度で識別することが可能となる。
　なお、本明細書において、「有意」とは、統計学的に有意であることをいう。統計学的に有意とは、被験対象の測定値と対照値の差異を統計学的に処理したときに、両者間に有意差があることをいう。本発明であれば、被験体と健常体群の末端Man-Tf量の測定値の差異を統計学的に処理したときの両者間の有意差が該当する。例えば、得られた値の危険率（有意水準）が小さい場合、具体的には5％より小さい場合（p<0.05）、1％より小さい場合（p<0.01）、又は0.1％より小さい場合（p<0.001）が挙げられる。ここで示す「p（値）」は、統計学的検定において、統計量が仮定した分布の中で、仮定が偶然正しくなる確率を示す。したがって「p」が小さいほど、仮定が真に近いことを意味する。統計学的処理の検定方法は、有意性の有無を判断可能な公知の検定方法を適宜使用すればよく、特に限定しない。例えば、スチューデントt検定法、共変量分散分析等を用いることができる。
　末端Man-Tf量は、疾患の進行度と相関して増加する。すなわち、体液中（主として髄液中）の末端Man-Tf量が健常体又は健常体群と比較して多いほど症状は進行しており、重度であることを示す。逆に、疾患が治癒した場合には、その治癒度に相関して末端Man-Tf量は、減少し、健常体又は健常体群の量に戻り得る。それ故に、末端Man-Tfは、ADの病態を反映する診断マーカーとなり得る。
２．アルツハイマー病診断キット
２－１．概要
　本発明の第２の態様は、アルツハイマー病診断キット（AD診断キット）である。本発明のキットは、試料中に含まれ得る第１態様に記載のAD診断マーカーを検出することができ、それによって試料提供者である被験体のADの罹患又は罹患の可能性の鑑別、及び／又は病態の判定ができる。
２－２．構成
　本発明のAD診断キットは、必須の構成物としてマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を含む。また、選択的な構成物として他の構成物を含むことができる。
２－２－１．必須構成物
（１）マンノース結合分子
　本明細書において「マンノース結合分子（Man結合分子）」とは、糖タンパク質の糖鎖を構成するマンノースを認識し、結合する分子をいう。標的分子の認識及び結合は、特異性が高いことが好ましい。Man結合分子は、ペプチド、核酸、低分子化合物、又はそれらの組み合わせのいずれであってもよい。本明細書において「低分子化合物」とは、ペプチド又は核酸以外の分子量500以下の有機化合物又は無機化合物をいう。またMan結合分子が認識する糖鎖マンノースは、還元末端マンノース、非還元末端マンノース又は糖鎖内部のマンノースのいずれであってもよい。好ましくは末端マンノースであり、より好ましくは非還元末端マンノースである。
　Man結合分子の具体例として、マンノース結合タンパク質やマンノース結合核酸が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
　（Ａ）マンノース結合タンパク質
　「マンノース結合タンパク質（Man結合タンパク質）」には、例えば、マンノース結合レクチンや抗マンノース抗体又はその活性断片が挙げられる。
　　（ｉ）マンノース結合レクチン
　「マンノース結合レクチン（Man結合レクチン）」は、マンノースを含む糖鎖、好ましくは末端マンノースを含む糖鎖、より好ましくは非還元末端マンノースを含む糖鎖に結合するレクチンである。例えば、http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearchに記載の45種のマンノース結合レクチン等が挙げられる。ところで、レクチンには、標的分子が糖タンパク質の場合と、糖鎖のみの場合とでは、見かけ上の糖鎖結合特異性に差異を生じる場合がある。例えば、イラクサ（Urtica dioica）由来のUDAレクチンは、標的分子が糖鎖の場合にはGlcNAc結合レクチンに分類されるが、図２で示すように標的分子が糖タンパク質の場合、末端Man-Tfの非還元型末端Manには特異的に結合するが、末端GlcNAc-Tfには結合しない性質となる。したがって、レクチンのマンノースへの結合は糖鎖のみでなく標的分子である末端Man-Tfを用いて検討することが好ましい。つまり、本発明のキットを構成するMan結合レクチンは、末端Man-Tfの糖鎖マンノース、好ましくは末端Man-Tfの末端マンノース、より好ましくは末端Man-Tfの非還元末端Manに結合するレクチンである。Man結合レクチンは、市販のレクチンを利用してもよい。例えば、ビオチン化UDAレクチン（Cat No BA-8005-1；EY社）や、細菌由来のBC2L-Aレクチン（Burkholderia cenocepacia lectin-A；和光純薬工業）を利用することができる。
　　（ｉｉ）抗マンノース抗体又はその活性断片
　「抗マンノース抗体（抗Man抗体）」は、マンノースを含む糖鎖、好ましくは末端マンノースを含む糖鎖、より好ましくは非還元型末端Manを含む糖鎖を認識して結合する抗体である。
　「その活性断片」とは、抗原結合性や免疫応答活性を保持している抗体の部分断片をいう。
　抗Man抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は組換え抗体のいずれであってもよい。より特異的な検出を可能にするためには、モノクローナル抗体又は組換え抗体が好ましい。抗体のグロブリンタイプは、特に限定されるものではなく、IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgYのいずれであってもよいが、IgG及びIgMが好ましい。また、本態様の抗体の由来生物種は、特に限定はしない。哺乳動物及び鳥を含めたあらゆる動物由来とすることができる。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ウマ、ニワトリ、又はヒトなどが挙げられる。
　本明細書において前記「組換え抗体」とは、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体及び合成抗体をいう。
　「キメラ抗体」とは、ある抗体において、軽鎖及び重鎖の定常領域（C領域：Constant region）を他の抗体の軽鎖及び重鎖のC領域で置換した抗体である。例えば、マウス抗ヒトモノクローナル抗体において、その軽鎖及び重鎖のC領域を適当なヒト抗体のC領域と置換した抗体が該当する。つまり、この場合、CDRを包含する可変領域（V領域：Variable region）はマウス抗体由来であり、C領域はヒト抗体由来となる。
　「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、標的抗原に対するヒト以外の哺乳動物由来の抗体中のCDRとヒト抗体のCDRとを置換したモザイク抗体である。例えば、マウス抗ヒト非還元型末端Man抗体の各CDR領域（CDR１～CDR3）をコードするDNA配列を、適当なヒト抗体由来の対応する各CDRをコードするDNA配列と置換した組換え抗体遺伝子を調製し、それを発現させることによって得られる抗体が該当する。
　「合成抗体」とは、化学的方法又は組換えDNA法を用いることによって合成した抗体をいう。例えば、適当な長さと配列を有するリンカーペプチド等を介して、特定の抗体の一以上のVL及び一以上のVHを人工的に連結させた一量体ポリペプチド分子、又はその多量体ポリペプチドが該当する。このようなポリペプチドの具体例としては、一本鎖Fv（scFv ：single chain Fragment oｆ variable region）（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995, Pierce Chemical Co., Rockford, IL参照）、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）又はテトラボディ(tetrabody)等が挙げられる。免疫グロブリン分子において、VL及びVHは、通常別々のポリペプチド鎖（軽鎖と重鎖）上に位置する。一本鎖Fvは、これら2つのポリペプチド鎖上のV領域を十分な長さの柔軟性リンカーによって連結し、1本のポリペプチド鎖に包含した構造を有する合成抗体断片である。一本鎖Fv内において両V領域は、互いに自己集合して1つの機能的な抗原結合部位を形成することができる。一本鎖Fvは、それをコードする組換えDNAを、公知技術を用いてファージゲノムに組み込み、発現させることで得ることができる。ダイアボディは、一本鎖Fvの二量体構造を基礎とした構造を有する分子である(Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448)。トリアボディ、及びテトラボディは、ダイアボディと同様に一本鎖Fv構造を基本としたその三量体、及び四量体構造を有する。それぞれ、三価、及び四価の抗体断片であり、多重特異性抗体であってもよい。
　抗Man抗体は、末端Man-Tfとの解離定数が、10-8M以下、好ましくは10-9M以下、より好ましくは10-10M以下の高い親和性を有することが好ましい。上記解離定数は、当該分野で公知の技術を用いて測定することができる。例えば、BIAcoreシステム（GE Healthcare社）により速度評価キットソフトウェアを用いて測定してもよい。
　本工程で使用する本態様のポリクローナル抗体は、抗原となる非還元型末端Man糖鎖、又はそれが付加したアスパラギン残基を含む数アミノ酸からなる糖タンパク質断片を適当な動物に免疫した後、免疫動物から当該分野で公知の方法により回収ことができる。また、モノクローナル抗体も当該分野の慣用技術である公知の方法により得ることができる。例えば、前記抗原でマウスを免疫した後、免疫マウスから抗体産生細胞を採取する。その抗体産生細胞を骨髄腫（ミエローマ）細胞株に融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を生成し、そして標的分子である末端Man-Tfに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定すればよい。
　「抗体フラグメント」とは、前述の抗体の抗原結合活性を有するペプチド断片であって、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv等が挙げられる。
　本工程で使用する抗体又はその抗体フラグメントは、修飾されていてもよい。ここでいう「修飾」とは、抗体検出に必要な標識、又は抗原特異的結合活性化に必要な機能上の修飾を含む。標識には、例えば、前述の蛍光物質、蛍光タンパク質（例えば、PE、APC、GFP）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジンによる標識が挙げられる。また、修飾には、標的分子である末端Man-Tfの非還元末端Man糖鎖に対する親和性を調整するため行われる抗体のグリコシル化等が挙げられる。具体的には、例えば、抗体のフレームワーク領域（FR：Framework region）において、グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基に、置換を導入してグリコシル化部位を除去し、それによって、その部位のグリコシル化を喪失させる改変等がある。
　（Ｂ）マンノース結合核酸
　「マンノース結合核酸（Man結合核酸）」には、例えば、マンノースに対する核酸アプタマーが挙げられる。
　「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、及び三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合する能力を持つリガンド分子をいう。具体的には、マンノース、好ましくは非還元末端マンノース、及びその周辺糖鎖の構造を認識して結合する核酸アプタマーである。
　本明細書で使用する核酸アプタマーは、当該分野で公知の方法により作製することができる。例えば、SELEX（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）法を用いた試験管内選別法が挙げられる。SELEX法とは、例えば、RNAアプタマーを分離する場合であれば、「ランダム配列領域とその両端にプライマー結合領域を有する多数のRNA分子によって構成されるRNAプールから標的分子に結合したRNA分子を選択する。回収したRNA分子をRT-PCR反応によって増幅した後、得られたcDNA分子を鋳型として転写を行い、選択されたRNA分子の増幅産物を得て、それを次のラウンドのRNAプールにする」という一連のサイクルを数～数十ラウンド繰り返して、標的分子に対して、より結合力の強いRNA分子を選択する方法である。一方、SELEX法で、DNAアプタマーを分離する場合も基本手順は同じであるが、回収したDNA分子を増幅する際にRT-PCR反応を経る必要がない。ランダム配列領域とプライマー結合領域の塩基配列長は特に限定はしない。一般的にランダム配列領域は、20～80塩基、プライマー結合領域は、それぞれ15～40塩基の範囲が好ましい。標的分子への特異性を高めるためには、予め標的分子に類似する分子とRNAプール又はRNAプールとを混合し、標的分子に類似する分子と結合しなかったRNA分子又はDNA分子からなるプールを用いればよい。なお、SELEX法は、公知の方法であり、具体的な方法は、例えば、Panら（Proc. Natl. Acad. Sci. 1995, U.S.A.92：11509-11513）に準じて行えばよい。
　本発明では、標的分子を糖鎖マンノースとして、上記の方法を実行することにより最終的に得られた核酸分子をマンノースに対する核酸アプタマーとして利用することができる。
　核酸アプタマーは、一般に、RNAアプタマーとDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は特に限定はしない。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNAとRNAの組み合わせで構成されるアプタマー等を含む。一般的にはRNAアプタマーが頻用されるが、安定性、化学合成における製造コスト、及びアプタマー製造における工程数の点ではDNAアプタマーが優れている。
　本工程で使用する核酸アプタマーは、標的分子への結合能を阻害しない範囲において、蛍光物質（例えば、FITC、Texas、Cy3、Cy5、Cy7、Cyanine3、Cyanine5、Cyanine7、FAM、HEX、VIC、フルオレサミン及びその誘導体、及びローダミン及びその誘導体等）、放射性同位元素（例えば、32P、33P、35S）、又はビオチン若しくは（ストレプト）アビジン等の標識物質により標識することもできる。
（２）Tf結合分子
　本明細書において「Tf結合分子」とは、標的分子である末端Man-Tfのタンパク質部分を構成するTfタンパク質を認識して結合する物質をいう。標的分子の認識及び結合は、特異性が高いことが好ましい。このような物質には、ペプチド、核酸、低分子化合物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
　Tf結合分子の具体例として、Tf結合タンパク質やTf結合核酸が挙げられる。以下、それぞれについて説明をする。
　（Ａ）Tf結合タンパク質
　「Tf結合タンパク質」には、例えば、抗Tf抗体又はその活性断片が挙げられる。
　　（ｉ）抗Tf抗体
　「抗Tf抗体」は、Tfタンパク質、好ましくは末端Man-TfのTfタンパク質部分を認識して結合する抗体である。
　本発明の抗Tf抗体の構成やその作製方法については、前記「（１）マンノース結合分子（Ａ）マンノース結合タンパク質」の「（ｉｉ）抗マンノース抗体又はその活性断片」で具体的に記載しており、本発明でもそれに準じることから、ここではその説明を省略する。
　（Ｂ）Tf結合核酸
　「Tf結合核酸（Tf結合核酸）」には、例えば、Tfタンパク質に対する核酸アプタマーが挙げられる。
　核酸アプタマーの構成やその作製方法については、前記「（１）マンノース結合分子（Ｂ）マンノース結合核酸」で具体的に記載しており、本発明でもそれに準じることから、ここではその説明を省略する。なお、本発明では、標的分子をTfタンパク質として、上記の方法を実行することにより最終的に得られた核酸分子をTfタンパク質に対する核酸アプタマーとして利用することができる。
２－２－２．選択構成物
　本実施形態のキットは、選択構成物として、さらに、アルブミン結合分子を含んでいてもよい。アルブミン結合分子の具体例としては、例えば、ブルーセファロース又は抗アルブミン抗体若しくはその活性断片が挙げられる。
　上記Man結合分子、Tf結合分子及び／又はアルブミン結合分子は、必要に応じて担体に固定化されているか、あるいは蛍光色素又は発光物質等で標識化されていてもよい。
　上記構成物の他、本実施形態のキットは、前記Man結合分子、Tf結合分子及び／又はアルブミン結合分子を充填するためのカラム（スピンカラム等）、洗浄用バッファー（PBSバッファー、生理食塩水等）、及び／又はプロトコル等を記載した説明書等を包含することができる。
　さらに、本実施形態のキットは、特定中枢神経系疾患診断マーカー結合物質を含んでいてもよい。ここでいう「特定中枢神経系疾患診断マーカー結合物質」とは、既知の中枢神経系疾患用指標マーカーを特異的に認識し、それに結合できる物質を言う。例えば、特定の末端GlcNAc糖タンパク質に対する抗体又はその活性断片が該当する。具体例として、iNPHの指標マーカーである末端GlcNAc-Tfに対する抗体（抗末端GlcNAc-Tf抗体）又はその活性断片が挙げられる。
３．アルツハイマー病の罹患鑑別方法
３－１．概要
　本発明の第３の態様は、AD罹患鑑別方法である。本発明のAD罹患鑑別方法は、被験体由来の体液中に存在する第１態様のAD診断マーカーの量を測定し、対照体群由来の体液中に存在するAD診断マーカーの量と比較することによって、被験体のAD罹患を鑑別することができる。
３－２．方法
　本発明のAD罹患鑑別方法は、（１）測定工程、及び（２）比較鑑別工程を必須の工程として含む。以下、各工程について具体的に説明をする。
（１）測定工程
　「測定工程」とは、被験体及び対照体群から得られた体液、好ましくは髄液の所定量あたりに含まれる第１態様に記載のADマーカーの量を測定してその測定値を得る工程である。
　本態様における「被験体」は、ADの検出を目的として本態様の鑑別方法に供される動物個体をいう。被験体は、例えば健康診断の受診者のように中枢神経疾患の罹患が不明な個体や、疾患名は未同定ながら何らかの中枢神経疾患に罹患していることが判明している個体のいずれであってもよい。前者の場合、被験体におけるAD罹患の有無が鑑別可能となり、後者の場合、被験体における中枢神経疾患がADかそれ以外の中枢神経疾患かを判定することができる。
　本態様において「対照体」とは、本態様の鑑別方法において被験体との比較基準となる個体をいう。通常のAD罹患鑑別方法において対照体は健常体で足りるが、本態様の鑑別方法においてADの病態を判定する場合には、比較基準値を高く設定するために対照体をAD移行型MCI罹患体、及び初期AD罹患体にすることもできる。また、本明細書では複数の対照体からなる集団を「対照体群」と称する。ここでいう「複数」とは、好ましくは3以上である。対照体群には、健常体群、AD移行型MCI罹患体群、及び初期AD罹患体群等が挙げられる。対照体群を構成する各対照体は、原則として同様の状態の個体とする。
　「から得られた体液」とは、前記被験体及び対照体群のそれぞれから採取された体液をいう。好ましくは髄液又は血液である。髄液及び血液の採取方法は、既知の方法であればよく、特に限定はしない。例えば、髄液であれば腰椎穿刺により採取すればよい。腰椎穿刺は、事前に市販の局所麻酔薬を用いることで、痛みを採血以下にすることが可能であり、また無外傷性針を用いることで、副作用を軽減できることから侵襲性が比較的低く、髄液を採取する場合には好適な方法である。血液であれば、公知の採血方法に従って採取すればよい。なお、被験体と対照体の体液は、一方が髄液であれば他方も髄液とするように、原則として互いに同種の体液とする。
　「所定量」は、容量又は重量により予め定められた量をいう。所定量は特に限定はしなが、少なくともAD患者の体液中、好ましくは髄液中に含まれる第１態様に記載のAD診断マーカーが測定可能な量である必要がある。例えば、髄液が5μL～1mL、又は髄液タンパク質量として、5μg～200μgあればよい。測定する体液の所定量は、被験体と対照体で同一である。
　本明細書において「測定値」とは、本工程で測定されるAD診断マーカーの量を示す値である。測定値は、容量又は重量のような絶対値であってもよく、また濃度、イオン強度、吸光度又は蛍光強度のような相対値であってもよい。
　本工程では、被験体由来の体液（「被験体体液」という）、好ましくは髄液（「被験体髄液」という）と対照体群由来の体液（「対照体液」という）、好ましくは髄液（「対照髄液」という）のそれぞれの所定量中に含まれるAD診断マーカーの量をMan結合分子及びTf結合分子を用いて測定する。
　Man結合分子及びTf結合分子の構成については、第２態様で詳述していることから、ここでは具体的な説明を省略する。一例として、Man結合分子にはUDAレクチン又はBC2L-Aレクチン等のMan結合レクチンが、またTf結合分子には抗Tf抗体が挙げられる。
　AD診断マーカーの測定方法は、Man結合分子及びTf結合分子を用いて測定する公知の糖タンパク質の定量方法であればよく、特に限定はしない。例えば、抗体を用いた免疫学的検出法、レクチンを用いたレクチン検出法、質量分析法又はそれらの組み合わせ法が挙げられる。
　免疫学的検出法には、例えば、酵素免疫測定法（ELISA法、EIA法を含む）、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法（RIA）、発光免疫測定法、表面プラズモン共鳴法（SPR法）、水晶振動子マイクロバランス（QCM）法、免疫比濁法、ラテックス凝集免疫測定法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応法、金コロイド法、キャピラリー電気泳動法、ウェスタンブロット法又は免疫組織化学法（免疫染色法）が挙げられる。
　レクチン検出法には、レクチンブロッティング法が挙げられる。
　質量分析法には、高速液体クロマトグラフ質量分析法（LC-MS）、高速液体クロマトグラフタンデム質量分析法（LC-MS/MS）、ガスクロマトグラフ質量分析法（GC-MS）、ガスクロマトグラフタンデム質量分析法（GC-MS/MS）、キャピラリー電気泳動質量分析法（CE-MS）及びICP質量分析法（ICP-MS）が挙げられる。
　組み合わせ法には、例えば、レクチンと抗体を用いたサンドイッチELISA法及びそれと同様の原理を用いた自動化法、好ましくは、ハイスループットレクチン阻害‐自動ラテックス凝集法を利用することができる。AD診断マーカーを構成する末端Man-Tfにおいて、糖鎖とタンパク質のそれぞれを標的として検出する組み合わせ法は、糖タンパク質を高い精度で定量することができるため、好ましい測定方法である。組み合わせ法の具体例として、抗Tf抗体を吸着させたプレート等の担体にAD診断マーカーである末端Man-Tfを含む体液（例えば、髄液）を通して末端Man-Tfを吸着させ、その後Man結合分子であるUDAレクチンをプローブとして末端Man-Tfを検出する方法が挙げられる。また、逆にUDAレクチンを吸着させたプレート等の担体に体液（例えば、髄液）を通して末端Man-Tfを吸着させ、その後抗Tf抗体で末端Man-Tfを検出する方法もある。
　上記分析法は、いずれも当該分野に公知の技術であって、それらの方法に準じて行えばよい。例えば、Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York；Christopher J., et al., 2005, Chemical Review,105:1103-1169；Iijima Y. et al., 2008,.The Plant Journal, 54,949-962；Hirai M. et al.,2004, Proc Natl Acad Sci USA, 101(27) 10205-10210；Sato S, et al., 2004,,The Plant Journal, 40(1)151-163；Shimizu M. et al., 2005, Proteomics, 5,3919-3931に記載の方法に準じて行うことができる。また、各メーカーからタンパク質定量キットが市販されており、それらを利用することもできる。
　なお、前記測定工程における対照体群の測定値は、被験体の測定値と異なり、必ずしもその都度測定する必要はない。例えば、体液（例えば、髄液）の所定量、AD診断マーカーの測定方法、測定条件を一定にしておけば、以前に測定した対照体群の測定値を再利用することができる。それ故、様々な条件下で対照体の体液から得られたAD診断マーカー量を予め測定しておき、それをデータベース化して、被験体の測定値と比較する際に、同条件で測定した測定値を必要に応じて選択して使用してもよい。
（２）比較鑑別工程
　「比較鑑別工程」とは、被験体及び対照体群におけるAD診断マーカーの測定値を比較して、その結果から被験体におけるADの罹患を鑑別する又はADの病態を判定する工程である。
　本工程では、前記測定工程で得られた被験体と対照体群における同種のAD診断マーカーの測定値を比較する。対照体群の測定値は、対照体群を構成する各対照体の平均測定値でよい。また、被験体及び対照体群の測定値を補正するために、髄液中で量的差異のない公知のタンパク質を内在性コントロールとして用いてもよい。このような内在性コントロール用タンパク質として、例えば、アルブミンが挙げられる。
　比較の結果は、対照体群に応じて以下のように鑑別する。
　対照体群が健常体群であれば、被験体の測定値が対照体群の測定値よりも有意に高い場合に、その被験体はADに罹患していると鑑別する。この場合、被験体がいずれかの中枢神経疾患に罹患していることが予め判明していれば、その被験体はADに罹患しており、ADに関連するMCIを除く他の中枢神経疾患ではないと鑑別できる。
　対照体群がMCI罹患体群であれば、被験体の測定値が対照体群の測定値よりも有意に高い場合に、その被験体はMCIからADへ移行可能性が高いと鑑別する。
　対照体群が初期AD罹患体群であれば、被験体の測定値が対照体群よりも有意に高い場合に、その被験体のADは進行していると判定する。有意差がない場合には、その被験体のADの病態は現状維持されていると判定する。
４．アルツハイマー病移行型軽度認知障害罹患鑑別方法
４－１．概要
　本発明の第３の態様は、AD移行型MCIの罹患鑑別方法である。本発明のAD移行型MCIの鑑別方法は、被験体由来の体液中、好ましくは髄液中に存在する第１態様のAD診断マーカーの量を測定し、健常体群由来の体液中、好ましくは髄液中に存在するAD診断マーカーの量と比較することによって、MCIに罹患している被験体がAD移行型MCIに罹患していることを鑑別できる。
４－２．方法
　本発明のAD移行型MCI罹患鑑別方法も第３態様のAD罹患鑑別方法と同様に測定工程、及び比較鑑別工程を必須の工程として含む。各工程の構成及び手順も原則として第３態様のAD罹患鑑別方法と同じであることから、ここでは第３態様と異なる点についてのみ説明する。
　本発明のAD移行型MCI罹患鑑別方法が第３態様のAD罹患鑑別方法と異なる点として、対照体が健常体に限定されていることと、被験体がMCIに罹患しているMCI罹患体であることが挙げられる。
　前述のようにMCIには症状が進行しないケースと、ADに進行するケースが存在する。後者がAD移行型MCIであるが、通常のMCIとAD移行型MCIを鑑別することは従来技術では困難であった。もしもMCIの中に存在するAD移行型MCI患者を鑑別できれば、AD治療薬を投与する等、早期治療を開始することが可能となり、大量の神経細胞死を回避してADへの移行を阻止することができる。つまり、AD移行型MCIの罹患鑑別ができればAD発症を予防することができる。
　被験体がMCI罹患体である場合、比較判定工程において、被験体の測定値が健常体群の測定値よりも有意に高い場合には、その被験体はAD移行型MCIに罹患していると鑑別する。
＜実験例１：UDAレクチンの結合特異性＞
（目的）
　本実施例で用いるUDAレクチンの糖鎖結合特異性を検証する。
（方法）
　3種のTf糖鎖アイソフォームの標品を調製した。α2,6シアル酸を非還元末端に持つ末端Sia-Tfは、血清から精製して得た。この末端Sia-Tfをシアリダーゼ、ガラクトシダーゼで消化した。この処理により末端Sia-Tf糖鎖の非還元末端に、ガラクトース、GlcNAc（末端GlcNAc-Tf）を持ったTf糖鎖アイソフォーム標品が得られた。続いて、末端GlcNAc-Tfを、さらにヘキソサミニダーゼで消化し、マンノース（末端Man-Tf）を持ったTf糖鎖アイソフォーム標品が得られた。なお、ここでの末端Man-Tfは、3つのMan非還元末端糖鎖を有する末端Tri-Man-Tfである。 
　これらの標品、すなわち末端Sia-Tf、末端GlcNAc-Tf、及び末端Man-Tfを用いて電気泳動を行った。泳動に用いた各糖タンパク質量は、銀染色法では80ng、イムノブロット法では80ng、UDAレクチンブロット法では160ngとした。各糖タンパク質にLaemmLi サンプルバッファーを加えて加熱した後、5～20％グラジェント・ポリアクリルアミドゲルを用いてSDS/PAGEに供した。泳動は、20mAの定電流で75分電気泳動した。分離されたタンパク質は市販の銀染色キット（Cat No.291-50301；Wako社）を用いてタンパク染色を行った。同様に分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に350mAで45分間、電気的に転写した。ブロットの1枚は、3%スキムミルク-PBST（Phosphate-buffered saline-0.1% Tween）でブロッキングした後に0.5μg/mLの抗Tf抗体（Cat No.A80-128A；BETHYL社）と24℃で2時間反応させた。検出は、0.13μg/mLのホースラディッシュパーオキシダーゼで標識した二次抗体（抗Goat IgG抗体；Cat No.705-035-147；Jackson社）と反応させた後、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Cat No. 34075；PCC社）を用いて発色させ、クロマトスキャナー（AE-9300H Ez-Capture MG Quick Manual for ImageSaver6；ATTO社）にて画像解析をした。ブロットの他の1枚は、1%BSA-PBSでブロッキング後に1μg/mLのビオチン化UDA（Cat No. BA-8005-1；EY社）と24℃で90分間反応させた。その後、1mg/mLのHRP標識ストレプトアビジ（StAv-HRP；Cat No. 21126；PCC社）と24℃で90分間反応させた後、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（Cat No. 34075 PCC社）で発色させて、上記のイムノブロットと同様にクロマトスキャナーにて検出した。
（結果）
　結果を図２に示す。3種の精製Tf糖鎖アイソフォームは電気泳動後の銀染色により主要バンドが単一であることが示された（図２A）。また、3種のTf糖鎖アイソフォームは、抗Tf抗体に対して同程度の反応性を示した（図２B)。ところが、UDAレクチンブロット法では、末端Man-Tfのみがシグナルを与え、末端GlcNAc-Tf及び末端Sia-Tfではシグナルが観察されなかった（図２C）。この結果から、UDAレクチンは、末端Man-Tfに特異的なプローブであることが示された。
＜実施例１：髄液中のTfの検出＞
（目的）
　UDAレクチンを用いて実際に髄液中のTfを検出する。
（方法）
　インフォームドコンセントを得たAD患者3名、及び対照用の疾患コントロール4名から腰椎穿刺により3mLの髄液を採取した。続いて、採取した髄液サンプルをUDAレクチンブロット法により分析した。UDAレクチンブロット法は実験例１に準じた。なお、「疾患コントロール」とは、中枢神経疾患に罹患していない非中枢神経疾患者をいう。例えば、頭痛、神経痛、めまいのように、神経疾患が疑われて髄液採取を行なったものの結果的に神経疾患の診断がなされなかった患者が該当する。
（結果）
　図３に結果を示す。AD患者（AD）及び疾患コントロール（Control）のいずれからもTfの移動度に一致する74kDa付近にバンドが検出された。クロマトスキャナーの定量により、AD患者3名の髄液では、このシグナル強度が約1.5倍に増加していることが示された。
＜実施例２：髄液中の末端Man-Tfの免疫沈降法による分析＞
（目的）
　実施例１でUDAレクチンにより髄液中から検出された74kDa付近のTfが末端Man-Tfによるものであることを、免疫沈降法により検証する。
（方法）
　UDAレクチンは、非還元末端マンノースを持つ全ての糖タンパク質（末端Man糖タンパク質）に結合する。そこで、現象を利用して、髄液中の末端Man糖タンパク質で、かつ末端Man-Tfと同じ移動度を示す糖タンパク質（ノイズシグナルを与える糖タンパク質）が存在するか否かを検証した。
　抗Tf抗体とProtein G Sepharose 4 Fast Flow（Cat No. 17-0618-02；GEヘルスケア・ジャパン社）を結合させたイムノビーズを調製した。このビーズと髄液を4℃で3時間インキュベートした。インキュベート後に、上清をビーズの非結合画分として回収した。その後、ビーズをTBST（Tris buffered saline-0.05% Tween）で3回洗浄した後、ビーズにLaemmLi サンプルバッファーを加えて、結合画分を溶出した。未調製の髄液、上清画分、結合画分のそれぞれを、上記実験例1と同様の方法で、電気泳動法（銀染色）、抗Tf抗体を用いたイムノブロット法、及びUDAレクチンを用いたレクチンブロット法にて分析した。
（結果）
　図４に結果を示す。
　Ａで示す銀染色において、髄液では74kDa付近に2本のバンドａ及びｂが検出された（レーン１）。この2本のバンドは、免疫沈降の上清画分からは消失し（レーン２）、結合画分に回収された（レーン３）ことから、両者ともTfと考えられた。なお、この電気泳動は還元剤添加で行っているため、髄液中の２本のTfバンドは近接している。
　実際、Ｂで示す抗Tf抗体を用いたイムノブロットでは、ａ及びｂのバンドは抗Tf抗体と反応性を示し（レーン３）、Tfであることが確認された。
　Ｃで示すレクチンブロット法では、低分子量側のbのみがUDAレクチンと反応性を示した（レーン３）。なお、Nagae et al.（Glycobiology, 2014, 24, 693-702）において、低分子量側のバンドは、末端Man-Tfと末端GlcNAc-Tfの混合物（本明細書では、しばしば「末端Man-Tf／末端GlcNAc-Tf」と表記する）であることが示されており、UDAレクチンが末端Man-Tfのみを検出したことを鑑みれば、上記の結果と矛盾しない。したがって、UDAレクチンにより髄液中から検出された74KDa付近のTfは末端Man-Tfであることが明らかとなった。
　なお、上清画分では末端Man-Tfよりも僅かに低分子量側で弱いバンド（ｃ）が検出された。これは、末端Man-Tf以外のマンノース含有糖タンパク質（GP-X）と考えられた。GP-Xが存在してもレクチンブロットによる末端Man-Tfの定量は可能であることがわかった。
＜実施例３：UDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法の開発＞
（目的）
　レクチンブロット法では20サンプルの分析に2日を要する。そこで、測定効率が高く、末端Man-Tfに特異性の高い定量法としてUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を開発する。
（方法）
　マイクロタイタープレートの各ウェルに0.05M Carbonate-Bicarbonate pH9.6バッファーで希釈した2μg/mLの抗Tf抗体（Cat No. A80-128A;BETHYL社）、又は抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（クローン7B2；ミクリ免疫研究所（株））を加え、4℃で一晩インキュベートした。プレートをTBS-0.05% Tweenバッファーで1回洗浄後、10% N101(Cat No.S410-03012；日油)-TBSで１時間以上ブロッキングを行った。続いて、髄液を界面活性剤の存在下で変性処理した。プレートをバッファーで1回洗浄後に、バッファーで希釈した髄液、又は15～150 ng/mLの末端Man-Tfをウェルに加え、インキュベートした。バッファーで洗浄した後、ビオチン化UDAレクチンを加え、インキュベートした。バッファーで5回洗浄後、Horse radish peroxidase (HRP)で標識したストレプトアビジンを加え、インキュベートした。バッファーで5回洗浄後、発色基質であるTMBを加えて室温で発色させ、1Mリン酸で反応停止した後に、OD450を測定した。末端Tri-Man-Tf標品を用いて検量線を作成し、髄液中の末端Man-Tfの定量を行った。
（結果）
　結果を図５に示す。末端Tri-Man-Tf標品を用いた検量線は、10～150 ng/mLの範囲で直線性を示した。この標品の髄液に対する添加回収実験では、78-91％の値を示した。日差再現性は10.5％以内であった。以上により、UDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法は髄液中末端Man-Tfの定量に有用であることが示された。
＜実施例４：各種認知症患者の髄液中における末端Man-Tf量の検証＞
（目的）髄液中の末端Man-TfがADの罹患鑑別及び病態指標として有用であることを検証する。
（方法）
　実施例３のUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を用いて各種の認知症、すなわち、アルツハイマー病（AD）、軽度認知障害（MCI）、特発性正常圧水頭症（iNPH）、レビー小体型認知症／前頭側頭型認知症（DLB/FTD）、及び疾患コントロールにおける髄液中の末端Man-Tfの濃度を測定した。濃度は、実施例３で作製した15～150 ng/mLの末端Tri-Man-Tf標品を用いた検量線を利用して決定した。
（結果）
　図６に結果を示す。AD患者の髄液中に含まれる末端Man-Tf量は25.543 ± 6.526μg/mLであり、これは、疾患コントロールの末端Man-Tf量である20.50 ± 5.41μg/mLに比べて有意に増加していた（p＝0.011）。
　また、AD前病変を含むMCI（本発明におけるAD移行型MCI）群においても末端Man-Tf量は27.264 ± 6.105μg/mLであり、有意な増加が認められた（p＝0.002）。
　他の認知症疾患であるDLB／FTDで末端Man-Tf量を測定したところ、20.448 ± 5.338μg/mLであり、疾患コントロールとの有意差は認められなかった。一方、ADの末端Man-Tf量とは有意差を示した（p＝0.003）。
　また、認知症を示すiNPHにおける末端Man-Tf量も16.892 ± 6.173μg/mLであり、疾患コントロールとの有意差は認められなかった。iNPHはMan-Tf量が疾患コントロールのそれと比較して減少傾向を示したが、有意差は認められなかった。一方、iNPHの末端Man-Tf量はADの末端Man-Tf量とは有意差を示した（p＜0.001）。結果として、iNPH群とAD群を感度74.1 %、特異度90.0 %で鑑別することができた。
　リン酸化Tauは、ADで上昇する髄液マーカーとして確立されているが、FTD等の他のタウオパチーでも上昇するという問題がある。そこで、FTD群（n=10）のみで末端Man-Tfを測定したところ、21.0 ± 45.29μg/mLであった。この測定値は、疾患コントロールとは有意差がないが、ADと有意差が認められた（p＝0.014）。
　以上の結果はUDAレクチン/抗体サンドイッチELISA法を用いて末端Man-Tfの定量を行なったものである。他のレクチンを用いた場合も同様の結果が得られるか否かについて検証するため、末端マンノース結合性レクチンであるリコンビナントBC2LAレクチンを用いたBC2LAレクチン/抗体サンドイッチELISA法による測定も行なった。BC2LAレクチン/抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定では、iNPH群（6.3 ± 2.6 μg/mL: n=27）とAD群（12.3 ± 3.9 μg/mL: n=30）を感度96.4%、特異度77.8%で鑑別することができた。また、MCI群 (14.846 ± 7.101μg/mL: n=20) とも感度90.0%、特異度81.5%で鑑別された（図８）。また、物忘れ外来での髄液採取時には「正常」と診断され、その後、MCIへと進行した症例およびMCIからADに進行した症例（n=7）では、iNPHに比べて、2倍の値（p=0.001）を示した。すなわち、Man-Tfはアルツハイマー病の早期より上昇することが示された。
　Man-Tfの測定に用いた髄液試料を使って、代表的なAD診断マーカーであるリン酸化tauタンパク質（p-Tau）を測定した（n=28）。BC2LA／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値とp-Tau値の相関を調べたところ、ADではr＝0.885の極めて強い相関を示し、MCI（n=19）でもr＝0.729の強い相関が示された。Man-Tf/p-Tauの比率は、図９に示すようにAD（147.8 ± 45.3）よりMCI（231.3 ± 89.8）で有意に高く（p < 0.001）、Man-Tfがp-Tauより早期に上昇することが示された。これは、Man-Tfが神経細胞死マーカーであるp-Tauよりも早期のAD病理に相関することを示唆している。
　同様に、UDAレクチン／抗体を用いたELISA法によるMan-Tfの測定値とp-Tau値の相関も調べた。その結果、AD（n=28）ではr＝0.710の強い相関を示した。一方、MCI（n=19）でもr＝0.576の相関が認められた。Man-Tf/p-Tauの比率は、図１０に示すようにAD（326.9 ± 122.7）よりもMCI（474.2 ± 215.2）で高く（p=0.011）、Man-Tfがp-Tauよりも早期（MCI期）に増加することが示された。
　以上の結果から、末端Man-TfはAD及びその進行に特有の現象と考えられた。また、MCIにおける末端Man-Tfの増加は、末端Man-TfがAD前病変の段階でも増加することを示唆している。したがって、末端Man-TfはAD治療薬の効果判定への応用が期待され得る。
　したがって、末端Man-Tfは、他の認知症、特にiNPHとの鑑別に有用であり、また、タウオパチーの補助診断マーカーにもなりうると考えられる。
＜実施例５：抗Tf抗体を用いたアルツハイマー病脳の免疫組織化学＞
（目的）
　末端Man-Tfは、ADの進行に伴って増加することが示唆されている。そこで、AD脳におけるTf糖タンパク質の発現変化を免疫組織化学により分析する。
（方法）
　ADの脳組織は、15％ホルマリンを含むリン酸バッファーで固定した後、パラフィンブロックを作製した。薄切切片（5μm）を脱パラフィン後、抗Tfポリクローナル抗体（DAKO社；1：1000)と共に4℃で一晩インキュベートした。一次抗体結合部位をヒストファイン試薬（Nichirei社）にて可視化した。具体的には、切片を洗浄後、アミノ酸ポリマーにペルオキシダーゼとFab'にした第二抗体を結合させた酵素・第二抗体標識ポリマーを一次抗体に結合させて、ペルオキシダーゼ-DAB反応を行った。
（結果）
　図７に結果を示す。AD脳では、抗ヒトTf抗体により星状細胞様の細胞（ｃ）が陽性像を示した。また、皮質第Ｉ層（分子層）のニューロピルに陽性線維が観察され、特に軟膜下では束状に配列していた（ｂ）。以上の結果は、TfのAD脳における病的発現を示すものと考えられる。このTfシグナルの糖鎖アイソフォームは未決定であるが、髄液中の末端Man-Tfの増加と矛盾しない結果と考えられる。
　なお、Connorらは、抗Tf抗体による免疫組織化学によりADの「cerebral cortical white matter」の星状細胞の陽性像を報告している（J Neurosci Res. 1992 Jan;31(1):75-83）。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　非還元末端に少なくとも1個のマンノースを持つ糖鎖を含むトランスフェリン糖タンパク質又は前記糖鎖を含むトランスフェリン断片からなるアルツハイマー病診断マーカー。
  2. 　前記糖鎖が配列番号１で示すアミノ酸配列からなるトランスフェリンタンパク質の432位のアスパラギン残基に付加されている、請求項１に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
  3. 　初期アルツハイマー病又はアルツハイマー病移行型軽度認知障害の鑑別用である、請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
  4. 　アルツハイマー病と他の認知症との鑑別用である、請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカー。
  5. 　請求項１～４のいずれか一項に記載のアルツハイマー病診断マーカーを検出するための、マンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を含む、アルツハイマー病診断キット。
  6. 　前記マンノース結合分子がマンノース結合レクチン、抗マンノース抗体、及びマンノースに対するアプタマーからなる群から選択される、請求項５に記載の診断キット。
  7. 　前記マンノース結合レクチンがUDAレクチン又はBC2L-Aレクチンである、請求項６に記載の診断キット。
  8. 　前記トランスフェリン結合分子が抗トランスフェリン抗体及び／又はトランスフェリンタンパク質に対するアプタマーである、請求項５～７のいずれか一項に記載の診断キット。
  9. 　アルツハイマー病の罹患鑑別方法であって、
    　被験体及び対照体群から得られた所定量の体液中に存在する請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカーの量をマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、
    　前記測定工程で得られた被験体及び対照体群の測定値を比較して、アルツハイマー病診断マーカーの測定値が被験体で有意に高いときに、その被験体がアルツハイマー病に罹患していると鑑別する比較鑑別工程
    を含む前記方法。
  10. 　前記対照体群が健常体群である、請求項９に記載の罹患鑑別方法。
  11. 　前記対照体群が初期アルツハイマー病罹患体群である、請求項９に記載の罹患鑑別方法。
  12. 　前記被験体が中枢神経疾患に罹患している、請求項９又は１０に記載の罹患鑑別方法。
  13. 　アルツハイマー病移行型軽度認知障害の鑑別方法であって、
    　被験体及び健常体群から得られた所定量の体液中に存在する請求項１又は２に記載のアルツハイマー病診断マーカーの量をマンノース結合分子及びトランスフェリン結合分子を用いて測定し、測定値を得る測定工程、
    　前記測定工程で得られた被験体及び健常体群におけるアルツハイマー病診断マーカーの測定値を比較して、アルツハイマー病診断マーカーの測定値が被験体で有意に高い場合、その被験体がアルツハイマー病移行型軽度認知障害に罹患していると鑑別する比較鑑別工程
    を含み、前記被験体が軽度認知障害に罹患している前記方法。
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