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WO2017131353A1 - 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법 - Google Patents

섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법 Download PDF

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Publication number
WO2017131353A1
WO2017131353A1 PCT/KR2017/000031 KR2017000031W WO2017131353A1 WO 2017131353 A1 WO2017131353 A1 WO 2017131353A1 KR 2017000031 W KR2017000031 W KR 2017000031W WO 2017131353 A1 WO2017131353 A1 WO 2017131353A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cross
fibroblasts
differentiation
cartilage
chondrocytes
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/000031
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English (en)
French (fr)
Inventor
권혁준
Original Assignee
을지대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 을지대학교 산학협력단 filed Critical 을지대학교 산학협력단
Priority to US16/071,117 priority Critical patent/US11007229B2/en
Publication of WO2017131353A1 publication Critical patent/WO2017131353A1/ko

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    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
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    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Definitions

  • the present invention relates to a method of inducing cross differentiation of cells, and more particularly, to a method of inducing cross differentiation of fibroblasts into chondrocytes.
  • Cartilage is a unique tissue in the human body, with no blood vessels, no nerves, and poor regeneration.
  • Genes that induce overexpression of three proteins, SOX5, SOX6, and SOX9, which are known to be important for cartilage differentiation, were successfully introduced into skin cells and directly cross-differentiated into chondrocytes, but their properties as fibroblasts It is not completely removed and appears to be fibrocartilage rather than free cartilage (Ikeda, T., et al., Arthritis Rheum. 50: 3561-3573, 2004).
  • tissue regeneration research using iPSC stem cells made through dedifferentiation, is being actively conducted.
  • the induction of cross-differentiation by the above-described gene introduction has a problem in that the efficiency of gene introduction is low and the genes may be inserted into intracellular chromosomes and destroy other genes, thereby causing side effects such as cancer. Except for the gene transduction method, no efficient method for cross-differentiating fibroblasts into chondrocytes has been developed.
  • the present invention has been made to solve various problems including the above problems, and an object of the present invention is to provide a method of inducing cross differentiation of fibroblasts into chondrocytes more efficiently.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • the step of forming a fibroblast micro-communication for high-density culturing the fibroblasts to form a fibroblast micro-community provides a cross-differentiation method of skin-derived fibroblasts to chondrocytes comprising; and an electrical stimulation step of applying an electrical stimulation while culturing the fibroblast micro-community in a culture medium containing no growth factor.
  • a cross-differentiated chondrocyte produced by the cross-differentiation method.
  • a pharmaceutical composition for treating cartilage damage disease containing the cross-differentiated chondrocytes as an active ingredient.
  • Comparative Example 1 is a photomicrograph of morphological changes of adult fibroblasts in Comparative Example 1 (does not process anything), Comparative Example 2 (TGF- ⁇ 1 treatment) and the electrical stimulation treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of analysis of the marker gene expression of chondrocytes and fibroblasts in Comparative Example 1 (does not process anything) and electrostimulation treatment according to an embodiment of the present invention, real-time RT-PCR to be.
  • Figure 3 is a fluorescence micrograph showing the results of immunochemical staining (immunocytochemistry) for the collagen type 2 during the electrical stimulation treatment according to Comparative Example 1 and one embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is an optical micrograph showing the results of the analysis of alcian blue staining (proteoglycan) staining proteoglycan (electroteoglycan) in accordance with Comparative Example 1 and an embodiment of the present invention.
  • fibroblast refers to a type of cell that synthesizes extracellular matrix and collagen, the structural skeleton of animal tissue, and plays an important role in wound healing, the most common cell in animal connective tissue. to be.
  • connective tissue is one of four types of biological tissues that support, connect, or separate other tissues and organs in vivo.
  • skin cell refers to skin constituent cells, including melanocytes, in which pigmentation or melanin occurs when melanocytes are active.
  • the melanocytes absorb some of the ultraviolet rays that can be dangerous in the sun. It also has DNA repair enzymes to help repair UV damage, and people who lack the genes that make these enzymes are more likely to develop skin cancer.
  • Skin is known as the largest organ of the human body. On the surface, the skin covers the body, making up the largest surface of all organs. Moreover, in weight, the skin accounts for more weight than any organ in the body, which is about 15% of the total body weight. For the average adult human, the surface area of the skin is 1.5-2.0 m 2 , mostly about 2-3 mm thick. On average, 6.5 cm 2 (1 square inch) of skin has 650 sweat glands, 20 blood vessels, 60,000 melanocytes, and more than 1,000 nerve endings.
  • cartilage forms part of the joint in most cases, except for the process that occurs. When relatively little movement is required, cartilage joints form between cartilage and bone. On the other hand, when a lot of motion is required, the friction coefficient of the articular cartilage covering the synovial joint that the two cartilage surfaces are in contact with the synovial fluid is very low, and is due to the fact that the friction can move with little friction.
  • Cartilage is composed of chondrocytes and fibrous substrates.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor-beta
  • chondrocyte is the only cell found in healthy cartilage and performs the function of creating and maintaining a cartilaginous matrix consisting primarily of collagen and proteoglycans.
  • the parent cells to be converted to cartilage proliferate the number of mesenchymal tissue cells increases per unit area to form a dense structure, and the cells inside the mother gradually exhibit basophils, which are called chondrocytes.
  • Chondrocytes form a matrix with collagen fibers, and as the cells in the center continue to form more substrates, the chondrocytes separate from one another and differentiate into chondrocytes. Chondrocytes are contained in the lacunae and contain large amounts of fat and glycogen.
  • Cartilage cells and lumen vary in shape depending on their presence in the cartilage. Chondrocytes in the subchondral membrane are arranged so that their long axis is parallel to the surface, ie flat like fibroblasts. The cells in the deep cartilage and their lumen are generally rounded.
  • micromass refers to a three-dimensional cell culture formed by high density culture of cells without adventitious growth factors or three-dimensional scaffolds. Unlike conventional monolayer cultures, when cells are incubated at high density (about 1x10 6 to 1x10 8 cells / ml) so as not to touch the walls of the culture dish, the cells at the bottom adhere to the culture dish and the cells They are stacked and cultured three-dimensionally as a whole, and the three-dimensional stacked cells thus produced are called micro-clusters.
  • reprogramming / conversion / trans-differentiation refers to the process of inducing conversion between mature (differentiated) cells with completely different cell types in higher organisms. Unlike the process of reprogramming into induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and re-differentiating them into cells of interest, they induce conversion into cells of interest without going through the stages of induced pluripotent stem cells. Has a difference. Direct cross-differentiation is currently recognized for its potential use in disease modeling and drug discovery, and is expected to be applied to gene therapy and regenerative medicine in the future.
  • iPSCs induced Pluripotent Stem Cells
  • collagen type 1 is the most abundant of collagen proteins that form neutrophil fibrous bundles known as collagen fibers and includes ⁇ 2 encoded by the COL1A1 gene and the ⁇ 2 encoded by the COLA1A2 gene.
  • the type 1 collagen is mainly found in tissues such as tendons and skin.
  • type 2 collagen is a collagen that is highly distributed in cartilage, about 20% of which is in the form of chondroitin, and mutations in the COL2A gene encoding it may cause diseases such as congenital vertebral dysplasia. do.
  • Aggrecan is a human protein that is carcinized by the ACAN gene known as cartilage specific proteoglycan nuclear protein (PS PCP) or chondroitin sulfate proteoglycan 1.
  • PS PCP cartilage specific proteoglycan nuclear protein
  • chondroitin sulfate proteoglycan 1 The protein is a member of lectican (chondroitin sulfate proteoglycan), an integral part of the extracellular matrix in cartilage tissue and supports compression in cartilage.
  • SOX9 refers to a human transcription factor protein encoded by the SOX-9 gene. SOX9 recognizes the CCTTGAG sequence along with the HMG-box DNA binding protein and regulates the transcription of steroidal gene 1 and anti-Müller hormone (AMH) genes during cartilage differentiation.
  • AMH anti-Müller hormone
  • TGF- ⁇ is a protein that plays an important role in tissue fibrosis and remodeling of the extracellular matrix (ECM). It refers to CCN2 / CTGF, PAI-1 and TIMP-1 as well as COL1A2. It is upregulated and the COL1A2 promoter of dermal fibroblasts has different activities depending on TGF- ⁇ stimulation.
  • the step of forming a fibroblast micro-communication for high-density culturing the fibroblasts to form a fibroblast micro-community provides a cross-differentiation method of skin-derived fibroblasts to chondrocytes comprising; and an electrical stimulation step of applying an electrical stimulation while culturing the fibroblast micro-community in a culture medium containing no growth factor.
  • the cross differentiation method may be performed in vitro.
  • the fibroblasts are fibers derived from tendons, ligaments, muscles, skin, corneas, periodontals, cartilage, bones, blood vessels, small intestine, large intestine or intervertebral discs. May be blast cells.
  • the fibroblasts may be seeded at a concentration of 1x10 6 to 1x10 8 cells / ml.
  • the electrical stimulation may be by direct current or alternating current.
  • the electrical stimulation has an electric field strength of 1 to 100 V / cm, 1 to 50 V / cm, 1 to 20 V / cm, 1 to 10 V / cm or 3 to 7 V / cm.
  • the electrical stimulation may be 1 to 100, 1 to 50, 1 to 20, 1 to 10 or 3 to 7 cycles per second, 1 to 30 ms, 1 to 20 ms, 1 to 15 ms Or 5 to 10 ms, and the electrical stimulation step may be performed for 12 hours to 10 days, 1 to 8 days, or 2 to 5 days.
  • a cross-differentiated chondrocyte produced by the cross-differentiation method.
  • a pharmaceutical composition for treating cartilage damage disease containing the cross-differentiated chondrocytes as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may be called a cell therapeutic agent because the active ingredient is cross-differentiated chondrocytes.
  • the cartilage damage disease may be meniscus damage, triangular fibrocartilage complex damage, cartilage damage or some cartilage damage due to repeated trauma, osteoarthritis (degenerative arthritis) or rheumatoid arthritis.
  • the route of administration of the cell therapy or pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • routes include parenteral administration, eg, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intravitreal administration and intraarticular administration, especially intraarticular administration of the affected area is most preferred, It is not limited to this.
  • the cell therapy agent or pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be formulated in a suitable form with a pharmaceutically acceptable carrier which is generally used.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include, for example, water, suitable oils, saline, carriers for parenteral administration such as aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • composition for cell therapy according to the present invention if necessary according to the administration method or dosage form, suspensions, dissolution aids, stabilizers, tonicity agents, preservatives, adsorption inhibitors, surfactants, diluents, excipients, pH adjusters, analgesics , Buffers, antioxidants, and the like may be appropriately included.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and formulations suitable for the present invention including those exemplified above, are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition.
  • Cell therapy or pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method that can be easily carried out by those skilled in the art Can be prepared in unit dose form or incorporated into a multi-dose container.
  • the cell therapy agent or pharmaceutical composition may be administered by any device capable of moving cross-differentiated chondrocytes, which are active ingredients, to a target lesion.
  • Cell therapy or pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention may comprise a therapeutically effective amount of cross-differentiated chondrocytes for the treatment of a disease.
  • the term 'therapeutically effective amount' means an amount of an active ingredient or pharmaceutical composition that induces a biological or medical response in a tissue system, animal or human, as thought by a researcher, veterinarian, physician or other clinical person, Amounts that induce alleviation of the symptoms of the disease or disorder. It will be apparent to those skilled in the art that the dosage of the cross-differentiated chondrocytes included in the cell therapy or pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the desired effect.
  • the content of cross-differentiated chondrocytes included in the cell therapy or pharmaceutical composition of the present invention can be easily determined by those skilled in the art, and the type of disease, the severity of the disease, the content of other components contained in the composition, the type of formulation, and It may be adjusted according to various factors including the age, body weight, general state of health, sex and diet of the patient, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used concurrently.
  • the cell therapy or pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be administered to a site (cell, tissue or organ) in need of treatment of a cartilage injury disease, such as an articular cavity in which damaged cartilage is present.
  • the dosage of the cell therapy agent or pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention is 1.0 ⁇ 10 5 -1.0 ⁇ 10 9 cells / kg (body weight), more preferably 1.0 ⁇ 10 6 , based on the cross-differentiated chondrocytes.
  • the dosage may be variously prescribed by factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and reaction sensitivity of the patient. These factors can be taken into account to properly adjust the dosage.
  • the number of administrations may be one or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or more than two sites for the administration site.
  • the same dosage as that of humans per kg or the volume ratio (for example, average value) of ischemic organs (heart, etc.) between the animal of interest and humans can be adjusted.
  • Equivalent amounts may be administered.
  • the animal to be treated according to the present invention include humans and mammals for other purposes, and specifically include humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, and the like. do.
  • Cell therapy or pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention in one embodiment, after separating the fibroblasts from the individual, treated them in vitro by the method according to the present invention after cross-differentiation into chondrocytes It may be used again in ex vivo cell therapy for the prevention or treatment of diseases transplanted into affected areas of the subject.
  • Example 1 Isolation of Fibroblasts from Various Tissues
  • Skin tissue of the forearm 3 cm away from the wrist of an adult man is cleaned by disinfecting with 70% isopropyl alcohol, and then anesthetized the area with 1% lidocaine, and skin tissue is collected with a 2-mm punch.
  • the sterile T25 flask was supplemented with glutamax and 1% penicillin / streptomycin, 1% HEPES, 1% sodium pyruvate and 20% heat-inactivated fetal bovine serum Dispense 2 ml of this added DMEM-F12 medium, remove the medium if the bottom of the flask is completely wet with medium, carefully place a piece of skin on the bottom of the medium, add 0.5 ml of the DMEM-F12 medium, and then Was transferred to a cell incubator at 5% CO 2 , 37 ° C. and incubated for 3 days.
  • the skin tissue can be collected from the earlobe area where peripheral nerves are less dense than the wrist part.
  • the cells were trypsinized and transferred to the T75 flask. .
  • Isolation of fibroblasts from muscle can be performed by Agley et al. (Agley et al., J. Cell Biol ., 126 (24): 5610-5625, 2013). Specifically, the muscle tissue was collected by a needle biopsy method with external inhalation from an adult male vastus lateralis, and then visible fat or connective tissue was removed, and the muscle tissue was collected at 2 mg / ml collagenase B ( collagenase B, Roche, Genrmay) and 2 mg / ml dipase II in basal medium (PromoCell, Germany), followed by grinding into smaller pieces of less than 1 mm3 and then separating muscle-derived cells at 15 minute intervals. The reaction was carried out at 37 ° C.
  • the enzyme separation is terminated by the addition of proliferation medium (PromoCell, Germany) and the cell suspension is passed through a 100 ⁇ m filter to remove myofiber debris and the filtered cells are centrifuged at 657 ⁇ g for 6 minutes at 20 ° C.
  • proliferation medium PromoCell, Germany
  • Isolation of fibroblasts from ligaments was basically performed by conventional methods (Ge et al., Cell Transplantation, 14: 573-583, 2005). Specifically, the femoral and tibial inserts of the hind limb knee ligaments of 2.2 to 2.5 kg male New Zealand white rabbit are removed, and then synovial sheath and perilagamentous tissues are removed from the ligaments. After separating the anterior cruciate ligament (ACL) and medial collateral ligament (MCL), carefully calibrate each ligament to the size of 1x1x1 mm and then 5 ml of 0.25% collagenase (Gibco, USA) for 6 hours shaking at 37 °C and washed twice with DMEM.
  • ACL anterior cruciate ligament
  • MCL medial collateral ligament
  • Ligament cells isolated from ACL were suspended in DMEM (pH 7.4) supplemented with 10% FBS, 10,000 U / ml penicillin, 10,000 U / ml streptomycin, 2 mM L-glutamine in T25 flasks at 37 ° C. 5% CO 2 . After culturing at intervals of 3 days under conditions, subculture until use or after freezing a portion using liquid nitrogen and stored in a -70 °C freezer until use.
  • the resulting connective tissue was washed five times with PBS containing antibiotics, and cut into approximately 1 ⁇ 1 ⁇ 1 mm size, and 5-6 pieces in a 35 mm dish were placed in a 5% CO2 cell culture medium for 30 minutes without adding medium. Once attached, add DMEM medium containing antibiotics and 10% fetal bovine serum. The medium is changed the next day and thereafter every three days. When the cells grown from the tissue reach the dense, wash with PBS, add 0.05% trypsin / 0.53 mM EDTA (Gibco, USA) and leave for 5 minutes in a 37 ° C, 5% CO 2 cell incubator to separate the cells from the culture dish. When 1 ml of DMEM medium containing 10% FBS is added, centrifugation is performed at 1000 rpm for 10 minutes, and only cells are passaged.
  • Example 1-1 The fibroblasts isolated in Example 1-1 were sufficiently cultured in a culture dish containing no growth factor (DMEM-high glucose, FBS 10%), and then 2 ⁇ 10 7 cells / ml 10 ⁇ l of the cell suspension was dropped in a 35 mm dish and placed in an incubator (37 ° C., CO 2 5%) for 1 hour to form micromass. Thereafter, 3 ml of the culture medium (DMEM-high glucose, FBS 10%) without any growth factor was added to the formed micro-complex, and a multi-channel electric stimulator (C-Pace stimulator, Ion-Optics Co., MA) was added thereto. The culture was applied while applying an electric field of 5 V / cm for 5 days at 0.008 seconds five times per second.
  • DMEM-high glucose, FBS 10% no growth factor
  • Example 1-1 After sufficiently incubating the skin-derived fibroblasts isolated in Example 1-1 in a culture dish, 10 ⁇ l of the cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 7 cells / ml was dropped onto a 35 mm culture dish to perform micromass culture. Was performed. Thereafter, 3 ml of the culture medium (DMEM-high glucose, FBS 10%) without adding any growth factor was added to the microcommunication and incubated for 3 days.
  • the culture medium DMEM-high glucose, FBS 10%
  • Example 1-1 After culturing the skin-derived fibroblasts isolated in Example 1-1 in a culture dish, 10 ⁇ l of the cell suspension at a concentration of 2 ⁇ 10 7 cells / ml was dropped onto a 35 mm culture dish to perform micro-culture. After that, 3 ml of the culture solution (DMEM-high glucose, FBS 10%) to which TGF- ⁇ 1 (10 ng / ml) was added was added to the formed micropopulation, and cultured for 3 days.
  • the culture solution DMEM-high glucose, FBS 10%
  • Comparative Example 1 which was not treated at all
  • Comparative Example 2 which was treated with growth factor TGF- ⁇
  • aggregation of cells was not observed despite the passage of time (Fig. 1 top and discontinuation).
  • Example 1 Following the morphological observation of Experimental Example 1, the cells treated by Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 to determine whether the fibroblasts were actually differentiated into chondrocytes by the method according to an embodiment of the present invention.
  • For the expression level of the cell phenotype marker gene was measured using real-time RT-PCR.
  • the secondary antibody (1: 200; Invitrogen) to which Alexa488 is attached was reacted at room temperature for 1 hour, washed three times with PBS containing 0.1% Triton X-100, and the nuclei were Hoechst 33258 (Dojindo, Tokyo). , Japan).
  • the chondrocyte differentiation marker protein type 2 collagen protein was not detected at all in Comparative Example 1 as a control, it was confirmed that it is clearly expressed in the cell of Example 1 to which the electrical stimulation was applied (see Fig. 3).
  • the results suggest that fibroblasts to which electrostimulation was substantially cross-differentiated into chondrocytes, unlike skin-derived fibroblasts that had not been treated with anything.
  • proteoglycans which are chondrocyte markers, were stained on untreated adult fibroblasts (Comparative Example 1) and electrostimulated fibroblasts (Example 2). Alsian blue staining was performed. Specifically, each cell was fixed for 20 minutes at room temperature using paraformaldehyde (4%), washed three times with PBS solution, and then added with an Alcyan blue solution (Nacalai tesque, INC., Japan) at pH 2.5. After reacting for 12 hours at room temperature, washed three times with PBS solution and observed. As a result, as shown in FIG.
  • the cross-differentiation of fibroblasts into chondrocytes can be induced without using any gene therapy or growth factor in a very short period of 3 days.
  • This is simpler than the two-stage differentiation method of dedifferentiating cells that have been conventionally differentiated into stem cells and then re-differentiating them into chondrocytes, and dramatically lowering the possibility of cancer by using stem cells, as well as gene therapy. This is useful because it can minimize unwanted side effects.
  • the method according to an embodiment of the present invention can be very useful for the production of a therapeutic agent for cartilage damage.

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Abstract

본 발명은 세포의 교차분화 유도방법에 관한 것으로서, 섬유아세포를 고밀도 배양하여 섬유아세포 미세군집을 형성시키는 섬유아세포 미세군집 형성단계; 및 상기 섬유아세포 미세군집을 성장인자가 포함되지 않은 배양액에서 배양하면서 전류 또는 전기장을 가하는 전기자극 단계;를 포함하는 피부 유래 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화방법을 제공한다.

Description

섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법
본 발명은 세포의 교차분화 유도방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법에 관한 것이다.
연골조직은 인체 중에서도 아주 독특한 조직으로써 혈관이 없고, 신경 또한 없으며 또한 재생이 잘 일어나지 않는다. 연골분화에 중요하다고 알려진 전사인자인 SOX5, SOX6, SOX9 3종의 단백질의 과발현을 유도하는 유전자를 피부세포에 도입하여 연골세포로 직접 교차분화시키는 데 성공하였으나 세포의 섬유아세포(fibroblast)로서의 성질이 완전히 제거되지 않아 유리연골이 아닌 섬유연골인 것으로 보인다(Ikeda, T., et al., Arthritis Rheum. 50: 3561-3573, 2004). 4종의 전사인자를 분화된 세포에 도입하여 인공적으로 줄기세포로 만드는 역분화기술이 개발되면서 역분화를 통해 만든 줄기세포인 iPSC를 이용한 조직재생연구가 활발히 진행되고 있으나, iPSC를 이용한 조직재생은 역분화과정과 원하는 세포로 분화시키는 과정, 이렇게 두 단계를 거쳐야 하는 복잡성과 iPSC를 분화시킬 때 분화되지 않은 세포가 암을 유발할 수 있는 위험성 등의 단점이 있다. 상기 iPSC를 이용한 조직재생의 단점을 극복하고자 최근에는 이미 분화된 세포를 원하는 세포로 분화시키는 교차분화 기술개발의 중요성이 대두되고 있다. 특히, 피부세포는 환자의 몸에서 손쉽게 채취가 가능하고 증식시키기가 매우 쉽기 때문에 피부세포를 통한 교차분화로 조직을 재생하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 인공유도 줄기세포로 유도하는 전사인자 두 종(c-Myc, Klf4)과 연골분화를 유도하는 전사인자 Sox9 단백질의 과발현을 유도하는 유전자를 마우스의 피부세포에 도입하여 유리연골로 직접 교차분화시키는데 성공하였다는 보고가 있다(Hiramatsu, K. et al., Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011). 또한, 인공유도 줄기세포로 유도하는 전사인자 두 종(c-Myc 및 Klf4)와 연골분화를 유도하는 전사인자 Sox9의 과발현을 유도하는 유전자를 인간의 피부세포에도 도입할 경우 유리연골로 직접 교차분화가 가능하다는 보고가 있다(Outani, H. et al., PLoS ONE, 8:e77365, 2013).
그러나 상술한 유전자 도입에 의한 교차분화 유도는 유전자도입의 효율이 낮고 유전자가 세포내 염색체에 끼어들어가면서 다른 유전자를 파괴시켜 암의 발생과 같은 부작용을 야기할 수 있는 문제점이 있다. 상기 유전자 도입법 외에는 섬유아세포를 연골세포로 교차분화시키는 효율적인 방법은 개발되지 않고 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 보다 효율적인 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 섬유아세포를 고밀도 배양하여 섬유아세포 미세군집을 형성시키는 섬유아세포 미세군집 형성단계; 및 상기 섬유아세포 미세군집을 성장인자가 포함되지 않은 배양액에서 배양하면서 전기자극을 가하는 전기자극 단계;를 포함하는 피부 유래 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 교차분화방법에 의해 생성된 교차분화 연골세포가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 교차분화 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골손상 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 종래 방법보다 효율적인 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 비교예 1(아무것도 처리하지 않음), 비교예 2(TGF-β1 처리) 및 본 발명의 일 실시예에 따른 전기자극 처리시 성인의 섬유아세포의 형태변화를 관찰한 현미경 사진이다.
도 2는 비교예 1(아무것도 처리하지 않음)과 본 발명의 실시예에 따른 전기자극 처리시 연골세포 및 섬유아세포의 마커유전자의 발현양상을 확인한 것으로, 실시간 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비교예 1과 본 발명의 일 실시예에 따른 전기자극 처리시 제2형 콜라겐에 대한 면역화학염색(immunocytochemistry) 분석 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 4는 비교예 1과 본 발명의 일 실시예에 따른 전기자극 처리시 프로테오글리칸(proteoglycan)을 염색하는 알시안블루염색(alcian blue staining) 분석 결과를 나타내는 광학현미경 사진이다.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 용어 "섬유아세포"는 동물 조직의 구조적 골격인 세포외 기질 및 콜라겐을 합성하는 유형의 세포를 의미하며, 주로 상처 치유에서 중요한 역할을 수행하며, 동물의 결합조직에서 가장 흔한 세포이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "결합조직(connective tissue)"는 생체에서 다른 조직 및 기관을 지지, 연결 또는 분리하는 네 가지 유형의 생물학적 조직 중 하나이다.
본 문서에서 사용되는 용어 "피부세포"는 피부는 멜라닌 세포가 활동하면서 색소 형성, 혹은 멜라닌이 생기는데 멜라닌 세포를 포함한 피부 구성 세포들을 의미한다. 상기 멜라닌 세포는 햇볕 안의 위험할 수 있는 자외선 중 일부를 흡수한다. 이는 또한 DNA 수리 효소들을 가지고 있어 UV 피해를 회복하도록 돕고, 이러한 효소들을 만드는 유전자가 결핍된 사람들은 피부암에 걸릴 확률이 높다. 피부는 인체의 가장 큰 기관으로 알려져 있다. 표면에서는, 피부는 몸을 덮음으로써, 모든 기관 중 가장 큰 표면을 차지한다. 더욱이, 중량에서도, 피부는 체내의 어떤 기관 하나보다도 더 많은 무게를 차지하는데, 이는 전체 체중의 15% 가량이 된다. 평균적인 성인 인간에게는, 피부의 표면적은 1.5-2.0 m2이고, 대부분 두께가 2-3 mm 정도이다. 평균적으로 6.5 cm2(1 제곱 인치)의 피부는 650개의 땀샘과, 20개의 혈관과, 60,000개의 멜라닌 세포와, 1,000개가 넘는 신경 말단을 가지고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "연골"은 발생하는 과정을 제외하면, 대부분의 경우에서 관절의 일부를 이루고 있다. 움직임이 비교적 적게 필요한 경우, 골과 골 사이를 연골로 연결하는 연골 관절 형태를 보인다. 한편, 많은 운동이 필요한 경우에는 두 개의 연골면이 활액을 사이에 두고 접촉하는 활막관절을 덮고 있는 관절연골의 마찰계수가 매우 낮아서, 마찰이 거의 없이 움직일 수 있다는 사실에 기인한다. 연골은 연골세포, 섬유질기질로 구성된다. 상기 연골로의 분화를 촉진시키기 위한 성장인자의 최소조건은 초기에 1-2회의 transforming growth factor-beta (TGF-β)의 투여로 충분한 연골형성을 얻을 수 있다면 조직공학적인 신생연골의 형성이 좀 더 경제적으로 이루어질 수 있으며, 연골형성의 정도는 TGF-β의 투여회수에 비례하여 계속적인 투여가 필요하다(Kim, H.J., et al., Cells Tissues Organs, 190:1-10, 2009).
본 문서에서 사용되는 용어 "연골세포"는 건강한 연골에서 발견되는 유일한 세포로서, 주로 콜라겐 및 프로테오글리칸으로 구성되는 연골성 기질(cartilaginous matrix)를 생성하고 유지하는 기능을 수행한다. 연골로 변환될 모체세포가 증식함에 따라, 간엽 조직 세포들의 단위 면적 당 수가 늘어나서 치밀한 구조를 이루며, 모체의 내부에 있는 세포는 차츰 호염성을 나타내는데, 이러한 세포를 연골아세포(chondroblast)라 한다. 연골아세포는 교원 섬유와 기질을 형성하는 바, 중심부에 있는 세포가 계속해서 더 많은 기질을 형성함에 따라, 연골 모세포들이 서로 분리되면서 연골세포(chondrocyte)로 분화된다. 연골세포는 소강(lacunae) 속에 들어 있으며, 다량의 지방질과 글리코겐을 함유 하고 있다. 연골 세포와 소강은 연골 내에서 그들의 존재하는 위치에 따라, 모양이 변화한다. 연골하막에 있는 연골 세포는 그 장축이 표면에 평행하도록, 즉 섬유아세포와 같이 평평하게 배열된다. 연골 심층에 있는 세포와 그의 소강은 일반적으로 둥근 형태로 되어 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "미세군집(micromass)"은 외래성 성장인자나 3차원 스캐폴드 없이 세포를 고밀도 배양하여 형성된 3차원 세포배양체를 의미한다. 통상의 단일층 배양(monolayer culture)와 달리 세포를 고밀도(약 1x106 내지 1x108 cells/ml)로 배양접시의 벽에 닿지 않도록 점적하여 배양할 경우, 바닥의 세포들은 배양접시에 부착하며, 세포들이 전체적으로는 3차원적으로 적층되어 배양되는데 이렇게 생성된 3차원 적층 세포들을 미세군집이라고 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "교차분화(reprogramming/conversion/trans- differentiation)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정을 의미한다. 상기는 유도만능 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 과정과 달리, 유도만능 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가진다. 현재 직접 교차분화는 질병모델링과 신약발굴 등에 이용될 가능성을 인정받고 있으며, 미래에는 유전자 치료 그리고 재생의학 등에도 응용될 수 있을 것이라 기대된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "제1형 콜라겐"은 콜라겐 섬유라고 알려진 호중성 섬유다발을 형성하는 콜라겐 단백질 중 가장 풍부한 단백질로서 COL1A1유전자에 의해 인코딩되는 α1 및 COLA1A2 유전자에 의해 인코딩되는 α2를 포함한다. 상기 제1형 콜라겐은 주로 힘줄 및 피부와 같은 조직에서 발견된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "제2형 콜라겐"은 연골에 많이 분포하는 콜라겐으로서, 약 20%가 콘드로이틴 형태를 나타내고 있으며, 이를 암호화하는 COL2A 유전자의 돌연변이가 선천성 척추골단 이형성증과 같은 질환의 원인이 되기도 한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "Aggrecan(AGC)"는 연골특이성 프로테오글리칸 핵 단백질(PS PCP) 또는 콘드로이틴 황산 프로테오글리칸 1 으로 알려진 ACAN 유전자에 의해 암화화되는 인체 단백질이다. 상기 단백질은 렉티칸(콘드로이틴 황산 프로테오글리칸)의 구성원으로서, 연골조직에서 세포외 기질의 통합적인 부분이고 연골에서 압축을 지탱하고 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "SOX9"는 SOX-9 유전자에 의해 암호화된는 인체 전사인자 단백질을 의미한다. SOX9은 HMG-box(고운동성군-박스)의 DNA 결합 단백질과 함께 CCTTGAG 시퀀스를 인식하며, 연골 분화하는 동안에 스테로이드성 유전인자 1과 항-뮐러 호르몬(AMH) 유전자의 전사를 조절한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "TGF-β"는 조직의 섬유화 및 세포외기질(extacellular matrix, ECM)의 리모델링에서 중요한 역할을 하는 단백질로서, COL1A2 뿐만 아니라 CCN2/CTGF, PAI-1 및 TIMP-1를 상향 조절하며, 피부 섬유아세포의 COL1A2 프로모터는 TGF-β 자극에 따라 그 활성이 달라진다.
발명의 상세한 설명:
이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 섬유아세포를 고밀도 배양하여 섬유아세포 미세군집을 형성시키는 섬유아세포 미세군집 형성단계; 및 상기 섬유아세포 미세군집을 성장인자가 포함되지 않은 배양액에서 배양하면서 전기자극을 가하는 전기자극 단계;를 포함하는 피부 유래 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화방법을 제공한다.
상기 교차분화방법은 체외(in vitro)에서 수행될 수 있다.
상기 교차분화방법에 있어서, 상기 섬유아세포는 힘줄(tendon), 인대(ligament), 근육, 피부, 각막, 치주, 연골(cartilage), 뼈, 혈관, 소장, 대장 또는 추간판(intervertebral disc) 유래의 섬유아세포일 수 있다.
상기 교차분화방법에 있어서, 상기 섬유아세포는 1x106 내지 1x108 cells/ml의 농도로 파종될 수 있다.
상기 교차분화방법에 있어서, 상기 전기자극은 직류 전류 또는 교류 전류에 의한 것일 수 있다.
상기 교차분화방법에 있어서, 상기 전기자극은 1 내지 100 V/cm, 1 내지 50 V/cm, 1 내지 20 V/cm, 1 내지 10 V/cm 또는 3 내지 7 V/cm의 전기장 세기를 가질 수 있고, 상기 전기자극은 초당 1 내지 100회, 1 내지 50회, 1 내지 20회, 1 내지 10회 또는 3 내지 7회의 주기로, 각 회당 1 내지 30 ms, 1 내지 20 ms, 1 내지 15 ms 또는 5 내지 10 ms 동안 인가될 수 있고, 상기 전기자극 단계는 12시간 내지 10일, 1 내지 8일, 또는 2 내지 5일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 교차분화방법에 의해 생성된 교차분화 연골세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 상기 교차분화 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골손상 질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다. 상기 약학적 조성물은 유효성분이 교차분화 연골세포이므로 달리 세포치료제라고 할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 연골손상 질환은 반월상연골 손상, 삼각섬유연골 복합체 손상, 반복된 외상에 의해 심한 연골 손상 또는 일부 연골의 손상, 골관절염(퇴행성 관절염) 또는 류마티스성 관절염일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예컨대, 그러한 경로에는 비경구 투여, 예를 들어, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 활막강내 투여 및 관절강내 투여가 포함되며, 특히 환부의 관절강내 투여가 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 또한 본 발명에 따른 세포치료용 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 최신판]에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한 상기 세포치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분인 교차분화 연골세포가 표적 환부로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 교차분화 연골세포를 포함할 수 있다. 용어 '치료적으로 유효한 양'은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물에 포함되는 교차분화 연골세포의 투여량은 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다.
그러므로 본 발명의 세포치료제 또는 약학적 조성물 내에 포함되는 교차분화 연골세포의 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 일 실이예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 연골손상 질환의 치료가 필요한 부위(세포, 조직 또는 장기), 예컨대 손상된 연골이 존재하는 관절강에 투여될 수 있다.
상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 일 실시예 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 상기 교차분화 연골세포를 기준으로 1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0×106 내지 1.0×108 세포/kg(체중)일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개 부위 또는 2개 부위 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 허혈기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 세포치료제 또는 약학적 조성물은 일 구현예에서, 개체로부터 섬유아세포를 분리하여, 이를 생체외(in vitro)에서 본원에 따른 방법으로 처리하여 연골세포로 교차분화시킨 후 이를 다시 상기 개체의 환부에 이식하는 질환의 예방 또는 치료를 위한 엑스 비보(ex vivo) 세포 치료법에 사용될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 각종 조직으로부터 섬유아세포의 분리
1-1: 피부조직으로부터 섬유아세포의 분리
성인 남성의 손목으로부터 3 cm 떨어진 팔뚝의 피부조직을 70% 이소프로필 알코올로 깨끗이 닦아 소독한 후, 상기 소독부위를 1% 리도카인으로 국소마취한 후 2-mm 펀치로 피부조직을 채취하여, 피부 생검을 4-5 조각으로 추가 절제한 후, 멸균된 T25 플라스크에 글루타맥스(glutamax)가 보충되고 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% HEPES, 1% 피루브산 나트륨 및 20% 열-불활성화 우태아혈청이 첨가된 DMEM-F12 배지 2 ml을 분주하고, 플라스트 바닥이 배지로 완전히 젖으면 배지를 제거한 다음, 배지 바닥에 피부 조각을 조심스럽게 놓고, 상기 DMEM-F12 배지 0.5 ml을 가한 후, 상기 플라스크를 5% CO2, 37℃의 조건의 세포배양기로 옮긴 후 3일간 배양하였다. 상기 피부조직은 손목 부위 말고 말초신경이 덜 밀집된 귓볼 부분에서 채취하는 것이 가능하다.
그런 다음, 매일 플라스크를 관찰하여 피부조직으로부터 세포들이 자라나오면, 1 ml 정도의 추가 배지를 조심스럽게 가한 후, 최초 세포층으로부터 섬유아세포들이 자라나오는 것을 확인되면, 트립신을 처리하여 세포들은 T75 플라스크로 옮겼다.
1-2: 근육으로부터 섬유아세포의 분리
근육으로부터 섬유아세포의 분리는 Agley 등의 방법으로 수행할 수 있다(Agley et al., J. Cell Biol., 126(24): 5610-5625, 2013). 구체적으로 성인 남성 외측광근(vastus lateralis)으로부터 외부 흡입을 가미한 바늘 생검 방법으로 근육조직을 채취한 다음, 눈에 보이는 지방 또는 결합조직을 제거하고 근육조직을 2 mg/ml의 콜라게나제 B(collagenase B, Roche, Genrmay) 및 2 mg/ml의 dipase II 가 첨가된 기본 배지(PromoCell, Germany) 내에서 1 mm3 미만의 더 작은 조각으로 분쇄한 후, 15분 간격으로 근육-유래 세포를 분리시키기 위해 추가적으로 분쇄하면서 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 상기 효소 분리는 증식 배지(PromoCell, Germany)의 첨가에 의해 종결되고 세포 현탁액을 100 μm 필터에 통과시켜 근섬유 파편을 제거하고, 여과된 세포를 20℃에서 6분간 657 xg로 원심분리한다.
1-3: 인대로부터의 섬유아세포의 분리
인대로부터 섬유아세포의 분리는 기본적으로 종래의 방법으로 수행하였다 (Ge et al., Cell Transplantation, 14: 573-583, 2005). 구체적으로 2.2 내지 2.5 kg의 웅성 뉴질랜드 흰토끼의 뒷다리 무릎 인대의 되퇴골 삽입부 및 경골 삽입부를 제거한 후, 인대로부터 활막초(synovial sheath) 및 인대주변부 조직(perilagamentous tissues)을 제거한다. 전방십자인대(anterior cruciate ligament, ACL) 및 내측측부인대(medial collateral ligament, MCL)을 분리한 후 각 인대를 1x1x1 mm의 크기로 조심시럽게 절제한 후 5 ml의 0.25% 콜라게나제(Gibco, USA)로 37℃에서 6시간 동안 진탕반응시킨 후 DMEM으로 2번 세척한다. ACL로부터 분리된 인대 세포를 T25 플라스크에서 10% FBS, 10,000 U/ml 페니실린, 10,000 U/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민이 보충된 DMEM(pH 7.4)에 현탁하여 37℃ 5% CO2의 조건에서 3일 간격으로 배양한 후, 사용전까지 계대배양하거나 일부를 액체질소를 이용하여 동결시킨 후 -70℃ 냉동고에 사용 전까지 보관한다.
1-4: 치은 조직으로부터의 섬유아세포의 분리
치은조직으로부터 섬유아세포의 분리는 임 등의 방법으로 수행하였다(임현필 외, 대한치과보철학회지 제44권 제1호, pp. 112-123, 2006). 먼저, 치주 수술 후 얻어진 건강한 치은 조직을 항생제가 함유된 인산완충용액(PBS)으로 5회 세척한 후 0.2% dispase(Gibco, USA)가 함유된 Hank's balanced salt solution(Gibco, USA)내에 4℃, 16 내지 22시간 두어 상피와 결합조직을 분리한다. 얻어진 결합조직을 항생제가 함유된 PBS로 5회 세척하고 약 1x1x1 mm 크기로 세절한 후 35 mm 배양접시에 5-6개 조각을 배지 첨가 없이 30분 동안 5% CO2 세포배양기에 두어 조직이 배양접시에 부착되면 항생제와 10% 우태아혈청이 함유된 DMEM 배지를 첨가한다. 다음날 배지를 교환하고 그 후로는 3일 마다 교환한다. 조직으로부터 성장된 세포가 밀생에 도달하면 PBS로 세척한 후 0.05% 트립신/0.53 mM EDTA(Gibco, USA)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 세포배양기 내에 5분간 두어, 세포가 배양접시로부터 분리되면 10% FBS가 함유된 DMEM 배지 1 ㎖를 첨가한 후 1000 rpm에서 10분간 원심분리하고 세포만을 모아 계대배양한다.
실시예 2: 섬유아세포의 미세군집 배양 및 전기자극 인가
상기 실시예 1-1에서 분리된 섬유아세포(fibroblast)를 어떠한 성장인자도 첨가하지 않은 배양액(DMEM-high glucose, FBS 10%)을 담은 배양접시에서 충분히 배양한 후, 2 X 107 cells/㎖ 농도의 세포현탁액 10 ㎕를 35 mm 배양접시에 떨어뜨리고 나서 이를 1시간 동안 인큐베이터(37℃, CO2 5%)에 두어 미세군집(micromass)을 형성시켰다. 그 후 형성된 미세군집에 어떠한 성장인자도 첨가하지 않은 배양액(DMEM-high glucose, FBS 10%) 3 ㎖를 넣고, 여기에 다채널 전기자극 장치(C-Pace stimulator, Ion-Optics Co., MA)를 사용하여 5 V/cm의 전기장을 0.008초씩 초당 5회 간격으로 3일간 인가하면서 배양하였다.
비교예 1:
상기 실시예 1-1에서 분리된 피부유래 섬유아세포를 배양접시에서 충분히 배양한 후, 2 X 107 cells/㎖ 농도의 세포현탁액 10 ㎕를 35 mm 배양접시에 떨어뜨려 미세군집(micromass) 배양을 수행하였다. 그 후 상기 미세군집에 어떠한 성장인자도 첨가하지 않은 배양액(DMEM-high glucose, FBS 10%) 3 ㎖를 넣고 3일간 배양하였다.
비교예 2:
상기 실시예 1-1에서 분리된 피부유래 섬유아세포를 배양접시에서 충분히 배양한 후, 2 X 107 cells/㎖ 농도의 세포현탁액 10 ㎕를 35 mm 배양접시에 떨어뜨려 미세군집 배양을 수행하였다. 그 후 형성된 미세군집에 TGF-β1(10 ng/㎖)을 첨가한 배양액(DMEM-high glucose, FBS 10%) 3 ㎖를 넣고 3일간 배양하였다.
실험예 1: 세포 형태학적 변화 관찰
상기 실시예에서 특정 전기자극 조건(5 V/cm의 전기장세기, 8 ms의 인가시간, 5 Hz 주파수)으로 피부세포가 응집되면서 연골세포로 효과적으로 분화된다는 것을 증명하였다. 상기 결과로 인해 본 발명에서 보여준 장점 및 효과로는 실제 생체 내에서 연골분화시에 일어나는 응집현상이 효과적으로 유도되었다(도 1 하단 참조).
반면, 아무런 처리를 하지 않은 비교예 1 및 성장인자 TGF-β를 처리한 비교예 2의 경우 시간의 경과에도 불구하고 세포의 응집현상은 관찰되지 않았다(도 1 상단 및 중단).
실험예 2: 마커유전자 발현 변화 관찰
2-1: 실시간 RT- PCR 분석
상기 실험예 1의 형태학적 관찰에 이어, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법에 의해 섬유아세포가 실제 연골세포로 교차분화되었는지 확인하기 위해 상기 실시예 1 그리고 비교예 1 및 2에 의해 처리된 세포에 대하여 실시간 RT-PCR을 이용하여 세포 표현형 표지유전자의 발현수준을 측정하였다. 구체적으로, 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행한 결과, 전기자극만 처리시(실시예 1) 피부세포 표지유전자인 COL1A1(약 1/10배) 및 COL1A2(약 1/5배)의 발현은 아무것도 처리하지 않은 대조군(비교예 1)과 TGF-β1처리군 대비 크게 감소하였고, 연골세포 표지유전자인 COL2A(약 20배), AGC(약 5배) 및 SOX9(약 9배)은 발현이 크게 증가하였다(도 2 참조).
프라이머명 핵산서열(5'->3') 서열번호
COL1A1-F GTCGAGGGCCAAGACGAAG 1
COL1A1-R CAGATCACGTCATCGCACAAC 2
COL1A2-F AATTGGAGCTGTTGGTAACGC 3
COL1A2-R CACCAGTAAGGCCGTTTGC 4
COL2A1-F GTGGAGCAGCAAGAGCAA 5
COL2A1-R TGTTGGGAGCCAGATTGT 6
AGC-F AGGAGACAGAGGGACACGTC 7
AGC-R TCCACTGGTAGTCTTGGGCAT 8
SOX9-F TTCCGCGACGTGGACAT 9
SOX9-R TCAAACTCGTTGACATCGAAGGT 10
GAPDH-F ACCCAGAAGACTGTGGATGG 11
CAPDH-R TTCTAGACGGCAGGTCAGGT 12
2-2: 면역화학염색
연골세포로의 분화여부를 더 확인하기 위해, 아무것도 처리하지 않은 성인의 섬유아세포(비교예 1)와 전기자극을 가한 섬유아세포(실시예 2)에 대하여 제2형 콜라겐에 대한 면역화학분석을 수행하였다. 구체적으로, 각 세포들을 파라포름알데하이드(4%)를 이용하여 실온에서 20분 동안 고정시키고 PBS 용액으로 3번 씻어낸 후, Triton X-100(0.3%)을 포함한 양의 혈청(5%)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹반응을 시켰다. 그 후, 토끼에서 생산한 type II collagen 항체(1:500; EnoGene Biotech, New York, NY, USA)을 4°C에서 12시간 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 3회 세척하였다. 그런 다음, Alexa488가 부착된 2차항체(1:200; Invitrogen)를 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 0.1% Triton X-100을 포함한 PBS로 3번 세척한 후, 핵을 Hoechst 33258(Dojindo, Tokyo, Japan)로 염색하였다. 그 결과, 연골세포 분화 표지 단백질인 제2형 콜라겐 단백질은 대조군인 비교예 1에서는 전혀 검출되지 않았으나, 전기자극을 인가한 실시예 1의 세포에서는 뚜렷하게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 상기 결과는 아무것도 처리하지 않은 피부유래 섬유아세포와 달리 전기자극을 가한 섬유아세포가 연골세포로 실질적으로 교차분화했음을 시사하는 것이다.
2-3: 알시안블루 염색
연골세포로의 분화여부를 더 확인하기 위해, 아무것도 처리하지 않은 성인의 섬유아세포(비교예 1)와 전기자극을 가한 섬유아세포(실시예 2)에 대하여 연골세포 표지인자인 프로테오글리칸(proteoglycan)을 염색하는 알시안블루 염색을 수행하였다. 구체적으로, 각 세포들을 파라포름알데하이드(4%)를 이용하여 실온에서 20분 동안 고정시키고 PBS 용액으로 3번 씻어낸 후, pH 2.5인 알시안블루 용액(Nacalai tesque, INC., Japan)을 첨가하여 실온에서 12시간 동안 반응시킨 후, PBS 용액으로 3회 세척한 후 관찰하였다. 그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 전기자극이 없었던 비교예 1(대조군)의 경우는 프로테오글리칸이 거의 발현되지 않았지만 어떠한 성장인자도 도입하지 않은 채 단순히 전기자극만을 가하면서 섬유아세포를 배양액(DMEM/F12, FBS 10%)에서 3일간 배양한 실시예 2의 경우는 프로테오글리칸이 뚜렷하게 발현되고 있음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
본 발명의 일 실시예에 따른 방법을 사용할 경우, 3일이라는 매우 짧은 기간에 그 어떠한 유전자요법이나 성장인자의 사용 없이 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화를 유도할 수 있음을 알 수 있다. 이는 종래의 분화가 완료가 된 세포를 줄기세포로 탈분화시킨 후 이를 다시 연골세포로 분화시키는 2단계 분화방법에 비해 더욱 간단하며, 줄기세포 사용으로 인한 암 발생의 가능성을 획기적으로 낮출 뿐만 아니라 유전자 요법을 사용하지 않기 때문에 원하지 않은 부작용을 최소화할 수 있다는 점에서 매우 유용하다. 더구나, 섬유아세포는 피부, 인대, 근육, 치주 등의 조직으로부터 수득이 용이하고 대량으로 증식이 가능하기 때문에, 분리 및 증식이 쉽지 않은 간엽계 줄기세포를 대신하여 보다 경제적이고 대량으로 연골세포를 생산하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 방법은 연골손상 치료제의 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예 및 실험예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 섬유아세포를 고밀도 배양하여 섬유아세포 미세군집을 형성시키는 섬유아세포 미세군집 형성단계; 및
    상기 피부세포 집합체를 성장인자가 포함되지 않은 배양액에서 배양하면서 전기자극을 가하는 전기자극 단계를 포함하는 피부 유래 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화방법.
  2. 제1항에 있어서,
    체외(in vitro)에서 수행되는, 교차분화방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 섬유아세포는 힘줄(tendon), 인대(ligament), 근육, 피부, 치주, 각막, 연골(cartilage), 뼈, 혈관, 소장, 대장 또는 추간판(intervertebral disc) 유래의 섬유아세포인, 교차분화방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 섬유아세포는 1x106 내지 1x108 cells/ml의 농도로 파종되는, 교차분화방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 전기자극은 직류 전류 또는 교류 전류에 의한 것인, 교차분화방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 전기자극은 0.1 내지 100 V/cm의 전기장 세기를 갖는, 교차분화방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 전기자극은 초당 1 내지 100회의 주기로 각 회당 1 내지 50 ms 동안 인가되는, 교차분화방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 전기자극 단계는 1 내지 10일간 수행되는, 교차분화방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 교차분화된 피부조직 유래의 교차분화 연골세포.
  10. 제9항의 교차분화 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골손상 질환의 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 연골손상 질환은 반월상연골 손상, 삼각섬유연골 복합체 손상, 반복된 외상에 의해 심한 연골 손상 또는 일부 연골의 손상, 골관절염(퇴행성 관절염) 또는 류마티스성 관절염인, 약학적 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101653197B1 (ko) * 2016-01-29 2016-09-01 을지대학교 산학협력단 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법
KR102761351B1 (ko) * 2021-09-30 2025-02-04 주식회사 유스바이오글로벌 연골 전구 세포 응집체 형성 장치 및 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050044849A (ko) * 2003-11-07 2005-05-13 학교법인 인하학원 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법
KR20120029367A (ko) * 2010-09-16 2012-03-26 연세대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화합물의 용도
US20130089908A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-11 Courtney M. Creecy Alternating Electric Current Directs, Enhances, and Accelerates Mesenchymal Stem Cell Differentiation Into Either Osteoblasts or Chondrocytes But Not Adipocytes
KR20140137882A (ko) * 2013-05-24 2014-12-03 가톨릭대학교 산학협력단 중간엽줄기세포의 분화 유도용 조성물 및 분화 유도 방법
KR101653197B1 (ko) * 2016-01-29 2016-09-01 을지대학교 산학협력단 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20050044849A (ko) * 2003-11-07 2005-05-13 학교법인 인하학원 중간엽 줄기세포로부터 연골세포를 분화시키는 방법
KR20120029367A (ko) * 2010-09-16 2012-03-26 연세대학교 산학협력단 중간엽 줄기세포의 연골 세포로의 분화 유도를 위한 화합물의 용도
US20130089908A1 (en) * 2011-09-28 2013-04-11 Courtney M. Creecy Alternating Electric Current Directs, Enhances, and Accelerates Mesenchymal Stem Cell Differentiation Into Either Osteoblasts or Chondrocytes But Not Adipocytes
KR20140137882A (ko) * 2013-05-24 2014-12-03 가톨릭대학교 산학협력단 중간엽줄기세포의 분화 유도용 조성물 및 분화 유도 방법
KR101653197B1 (ko) * 2016-01-29 2016-09-01 을지대학교 산학협력단 섬유아세포의 연골세포로의 교차분화 유도방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALT, ECKHARD ET AL.: "Fibroblasts Share Mesenchymal Phenotypes with Stem Cells, but Lack Their Differentiation and Colony-forming Potential", BIOLOGY OF THE CELL, vol. 103, no. 4, April 2011 (2011-04-01), pages 197 - 208, XP055264640 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019073055A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Imba - Institut Für Molekulare Biotechnologie Gmbh ENHANCED REPROGRAMMING OF SOMATIC CELLS

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