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WO2017050917A1 - Nouveau procede de culture d'algues rouges unicellulaires - Google Patents

Nouveau procede de culture d'algues rouges unicellulaires Download PDF

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Publication number
WO2017050917A1
WO2017050917A1 PCT/EP2016/072582 EP2016072582W WO2017050917A1 WO 2017050917 A1 WO2017050917 A1 WO 2017050917A1 EP 2016072582 W EP2016072582 W EP 2016072582W WO 2017050917 A1 WO2017050917 A1 WO 2017050917A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biomass
phycocyanin
culture
galdieria
cyanidium
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/072582
Other languages
English (en)
Inventor
Olivier CAGNAC
Lannig RICHARD
Julie LABRO
Original Assignee
Fermentalg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=55178111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=WO2017050917(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Fermentalg filed Critical Fermentalg
Priority to JP2018515303A priority Critical patent/JP2018529343A/ja
Priority to CA2998973A priority patent/CA2998973A1/fr
Priority to EP16777576.6A priority patent/EP3353283A1/fr
Priority to US15/762,806 priority patent/US11162126B2/en
Publication of WO2017050917A1 publication Critical patent/WO2017050917A1/fr

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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
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    • A23L2/52—Adding ingredients
    • A23L2/58—Colouring agents
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/405—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from algae
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
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    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to the field of cultivation of unicellular red algae (ARUs).
  • the invention is particularly directed to a method for growing ARUs, characterized in that the particular conditions of the crop in terms of lighting and nutrient inputs can make it possible to obtain a biomass consisting of ARUs in quantity higher than the amounts obtainable under conventional culture conditions, said biomass may have at least a quantity of phycobiliproteins, particularly high phycocyanin and further an amount of antioxidants high.
  • the invention is also directed to the biomass obtainable by the method according to the invention, the uses of said biomass and the products that may comprise said biomass.
  • ARUs unicellular red algae
  • Some unicellular red algae (ARUs) may be of interest as an additional source of food, as they may be a source of protein, particularly phycobiliproteins, fiber, lipids, or antioxidants, particularly carotenoids. They can be used native, advantageously dried, but also transformed, for example reduced in the form of flours.
  • Rhodophyta are a large taxon of algae, mostly marine and mostly multicellular. They are characterized by a pigment composition with a single type of chlorophyll, chlorophyll "a", carotenoids and characteristic pigments, phycobiliproteins.
  • the sub-division Cyanidiophytina contains the class Cyanidiophyceae, which itself contains the order Cyanidiales, itself including the families of Cyanidiaceae or Galdieriaceae, themselves subdivided into the genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, to which belong Cyanidioschyzon merolae species 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita or Galdieria sulphuraria.
  • Phycobiliproteins are water-soluble pigments that are found in the phycobilisome, a photosynthetic complex present especially in cyanobacteria and certain microalgae.
  • the phycocyanin has an absorption peak between 610 nm and 655 nm
  • the phycoerythrin has an absorption peak of between 400 nm and 600 nm
  • the phycoerythrocyanine having absorption peaks at about 450, 525 and 570 nm
  • the allophycocyanin an absorption peak essentially centered at 650nm.
  • the production of phycobiliproteins worldwide is mainly obtained by cultivation of spirulina in open basin (raceway) and represents approximately 15,000 tons per year.
  • Phycocyanin extracted from spirulina is also sold as a dietary supplement in liquid form, or as a powder for use as a blue pigment in food. Phycocyanin is the only natural blue pigment approved by the US-FDA (FR Doc No: 2013-19550).
  • Spirulina cultures are mostly open-pit in hot geographical areas, with an optimal culture temperature of 37 ° C. These crops are therefore dependent on seasonal fluctuations (temperature, light). Spirulina has the disadvantage of a low productivity in biomass (g dry biomass / L / h) and / or phycocyanin (g phycocyanin / L / h) which does not allow the transition to a fermentor culture necessary for industrialization of phycocyanin production.
  • these cultures are also susceptible to contaminations by forms of cyanobacteria, close to spirulina, known to produce toxins such as microcystins [Rellan, S, et al. ; Food and Chemical Toxicology 47 (2009) 2189-2199].
  • microcystins can cause intestinal disorders, and long-term exposure to these toxins can cause liver cancer.
  • certain strains of spirulina such as for example Arthrospira platensis, are themselves producing toxins [Rellan, S, et al., Op. Cit.].
  • ARUs are known to produce phycocyanins, and the effect of light on ARU culture and their pigment compositions has been the subject of numerous laboratory studies [Sloth JK et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol. 28, No. 1-2, January 2006, 168-175; Graverholt OS et al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 77, No. 1, September 5, 2007, 69-75].
  • Nichols K & al. [Botanical Gazette, Vol. 124, No. 2, December 1, 1962, 85-93] have investigated the photoreceptor cell may be associated with the synthesis phycocyanins in mutants Ar ⁇ s, by varying the wavelength used to illuminate the cultures.
  • Steinmuler K & al. [Plant Physiology, Vol. 76, No. 4, December 1, 1984, 935-939] studied the culture of Arus in conditions of mixotrophy and found that the addition of glucose could inhibit the synthesis of phycobilliprotéines.
  • the present invention aims to provide such a method of cultivation of unicellular red algae (ARUs) enriched in phycobiliproteins and carotenoids.
  • ARUs unicellular red algae
  • the present invention relates to a process for the cultivation of unicellular red algae (ARUs) of the Cyanidiophyceae class, in a medium comprising at least one carbon source, said method comprising at least one lighting step in the form of a radiation having a narrow spectrum of wavelength between 400 and 550 nm.
  • ARUs unicellular red algae
  • the invention also relates to a biomass obtainable by the process according to the invention which has a phycobiliprotein content (phycocyanin and allophycocyanin) of between 29 and 250 mg / g of dry matter and advantageously a density of between 30 and 200 g / l of dry matter, preferably between 90 and 150 g / l of dry matter.
  • the invention also relates to the use of the biomass according to the invention for the preparation of phycocyanin and / or carotenoids.
  • the invention also relates to a phycocyanin that can be obtained from the biomass according to the invention.
  • the invention also relates to the use of the biomass according to the invention or phycocyanin according to the invention for human or animal food, cosmetics and / or as a dye.
  • the invention also relates to a product comprising at least one of biomass or phycocyanin according to the invention.
  • ARU shall be understood to mean “Rhodophytes, of the Cyanidiophytina Subdivision of the Cyanidiophyceae class of the order Cyanidiales of the families Cyanidiaceae or Galdieriaceae, genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, species Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita or even Galdieria sulphuraria ".
  • Cyanidiophyceae should be understood, subject to precision, as meaning "Cyanidiophyceae, of the order Cyanidiales, families of Cyanidiaceae or Galdieriaceae, genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, species Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita or Galdieria sulphuraria "; the use of the term “Cyanidiales” shall be understood, subject to accuracy, as meaning "Cyanidiales, families of Cyanidiaceae or Galdieriaceae, genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, species Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschy
  • Some ARUs are mixotrophic beings, capable of both heterotrophy
  • Mixotrophy is also called photo-heterotrophy.
  • the concept of mixotrophy is extended to the use of light not only for photosynthesis but also as a light signal that can induce a response of metabolism: for example pigment synthesis.
  • the predominantly heterotrophic mixotrophy makes it possible to produce molecules of algal origin by coupling the advantages of autotrophy and heterotrophy at the same time. It consists in introducing a light component that can be of low intensity and / or of short duration, with a culture medium that can contain one or more organic sources of carbon. As in heterotrophy, the ARUs consume an organic substrate, which makes it possible to reach a productivity (expressed in gram of dry biomass / L / h) and / or a concentration in biomass (expressed in gram of dry biomass / L) important, the chloroplast and the other structures sensitive to the light of the cell being then activated.
  • These light energy sensors may be organelles or specific structures within the cell such as chloroplast, stigma, chronoplast, chromoplast or phycobilisome, or may be individual molecules capable of responding to light and result in a cellular response such as rhodopsins, phytochromes, cryptochromes or aerochromas.
  • the molecules of interest produced by said ARUs may be of major industrial interest particularly in the fields of nutrition, cosmetics, green chemistry and energy.
  • These molecules of interest are varied such as, for example, carbohydrates, proteins, amino acids, advantageously essential amino acids and pigments, particularly photosynthetic pigments, the main ones being chlorophylls, carotenoids and phycobiliproteins.
  • the carotenoid term includes carotenes ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ or ⁇ -carotene, lycopene and phytoene) and xanthophylls (astaxanthin, antheraxanthine, citranaxanthin, cryptoxanthin, canthaxanthin, diadinoxanthine, diatoxanthin, flavoxanthin, fucoxanthin, lutein, neoxanthine, rhodoxanthine, rubixanthine, siphonaxanthin, violaxanthin, zeaxanthin).
  • Carotenoids are rather orange and yellow, fat-soluble pigments. They are synthesized by all algae, all green plants and by many fungi and bacteria (including cyanobacteria). They are absorbed by animals and humans in their food. Carotenoids have two main absorption peaks around 440 and 475 nm.
  • Carotenoids play an important role in nutrition and health, as many are provitamins A, and some also have anti-cancer and antioxidant activities. They further stimulate the synthesis of antibodies. Some of them are widely used in the food industry for their coloring properties, and also in the cosmetics and pharmaceutical industries for their antioxidant properties and their ability to photoprotect.
  • carotenoids are of great interest, such as lutein, zeaxanthin, and astaxanthin, the latter particularly for its important antioxidant power.
  • a culture of ARUs in a medium that can comprise at least one carbon source and a source of phosphorus and may furthermore comprise at least one lighting step, advantageously lighting with a light having a narrow spectrum centered on a given wavelength, particularly a spectrum centered at 455 nm, can make it possible to obtain a biomass whose amount in ARUs can be significantly improved compared to the cultures usually produced and moreover, it may contain a quantity of molecules of interest, particularly phycocyanin, allophycocyanin, zeaxanthin and ⁇ -carotenes, possibly greater than that obtainable in the cultures described in the prior art.
  • ARUs within the meaning of the invention are extremophilic organisms capable of withstanding very acidic pH (0.05-5), as well as very high temperatures (25-56 ° C). These organisms are often found near volcanoes or hot springs. Generally these mixotrophic organisms are able to use a a large number of carbon metabolites (glucose, glycerol, pentose ...) [Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger. "Heterotrophic Growth of Two Strains of the Acid-Thermophilic Red Alga Galdieria Sulfuraria.” Plant and Cell Physiology 36, no. 4 (June 1, 1995): 633-38].
  • Another advantage of the process developed by the Applicant is that it can be conducted in a bioreactor, moreover advantageously on an industrial scale.
  • a culture of ARUs within the meaning of the invention, using a culture medium comprising at least one carbon source and at least one assimilable source of phosphorus, said method comprising at least one step of lighting, can make it possible to obtain a productivity and / or biomass concentration significantly improved compared to the crops usually made, biomass which in addition can be rich in phycocyanin and / or carotenoids.
  • phycocyanin and / or carotenoids By “rich in phycocyanin and / or carotenoids” is meant in the present text that the concentration of phycobiliproteins and / or carotenoids in the biomass that can be produced after culture under the conditions according to the invention is greater than the concentration of phycobiliproteins and / or carotenoids that can be produced by a biomass of the same algae obtained after culturing under the conditions described in the prior art.
  • a significant advantage of the culture of Cyanidiophyceae fermenter under mixing conditions is that it allows to produce cultures of pure strain (or axenic) containing only one cell type inoculated in a sterile culture medium, thus avoiding the problems of contamination by toxic strains as can be observed for cultures of Spirulina platensis raceway or open ponds. Apart from higher productivity and / or biomass concentration, the fermentor culture mode also offers more guarantees from a health point of view.
  • the subject of the invention is primarily a process for the cultivation of unicellular red algae (ARUs) of the Cyanidiophyceae class, advantageously of the order of cyanidiales, most advantageously families of Cyanidiaceae or Galdieriaceae, particularly of the genus Cyanidioschyzon, Cyanidium.
  • ARUs unicellular red algae
  • Galdieria especially Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita or Galdieria sulphuraria, preferentially of the species Galdieria sulphuraria , using a medium comprising at least one carbon source, and at least one phosphorus source, said method comprising at least one lighting step.
  • Such culture conditions may make it possible to achieve higher biomass productivity and / or biomass concentration of the ARUs than the biomass productivity and / or the concentration obtained in the cultures described in the prior art. allow to obtain a quantity of said biomass larger than an amount of biomass obtained in the cultures described in the prior art and can promote a production of proteins by said biomass of up to 51% of the dry matter or more .
  • the illumination step of the process can be carried out with the aid of a white light or, advantageously, a blue light.
  • a white light or, advantageously, a blue light.
  • the Applicant has shown that the cultivation of ARUs, in the sense of the invention, in blue light promotes the production of phycocyanin with respect to the same culture but in white light.
  • the illumination step of the method can be carried out using a blue light.
  • blue light is understood to mean radiation having a narrow spectrum of wavelength between 400 and 550 nm, preferably between 420 nm and 500 nm. Such radiation can make it possible to obtain a biomass rich in phycocyanin and antioxidants, particularly carotenoids.
  • said spectrum can be centered at 455 nm and not extend beyond 25 nm on each side.
  • the wavelength chosen will be between 430 and 480 nm, very preferably the wavelength chosen will be 455 nm.
  • the lighting can be produced by any means known to those skilled in the art, including one or more lamps, one or more tubes, one or more light emitting diodes (LEDs).
  • one or more lamps including one or more lamps, one or more tubes, one or more light emitting diodes (LEDs).
  • LEDs light emitting diodes
  • the Applicant has demonstrated that the method is even more effective when the illumination is performed by one or more light emitting diode (s) (LEDs).
  • LEDs light emitting diode
  • the lighting can be achieved by one or more LEDs.
  • the LEDs are preferably commercial LEDs.
  • Examples include LEDs from Seoul Optodevice Co., LTD (South Korea), Nichia Corporation (Japan), or from SunLED Corporation (USA).
  • the culture can be subjected to light radiation for a sufficient time corresponding at least to the time necessary for the desired growth rate, phycocyanin and / or carotenoid criteria. be filled.
  • the skilled person will know without excessive experimentation of this necessary time. He will adapt this time thanks to his knowledge of the field.
  • the conditions of mixotrophy can be obtained under discontinuous and / or variable lighting conditions over time.
  • Discontinuous lighting is understood as lighting punctuated by periods of darkness.
  • the lighting can be in particular in the form of flashes.
  • a flash in the sense of the invention, is a lighting of a given duration.
  • three notions are to be considered about lighting: the frequency or the number of flashes per unit of time, the duration of the flash and the intensity of the light emitted.
  • a low-frequency lighting whose number of flashes can be between approximately 2 and 3.6 ⁇ 10 4 per hour (5.4 ⁇ 10 -4 Hz at 10 Hz), preferably between 3 and 3.6 ⁇ 10 3 per hour (8 , 3.10 "4 Hz at 1 Hz). It is understood here that the number of flashes per hour can take any value between 2 and 36000 without it being necessary to list them all (2, 3, 4, ..., 35598, 35599, 36000);
  • a high-frequency illumination whose flash number can be between about 3.6 ⁇ 10 4 and 5.4 ⁇ 10 9 (10 Hz to 1, 5.10 6 Hz) per hour, preferably between 3.6 ⁇ 10 5 and 5, 4x10 9 (100 Hz to 1, 5.10 6 Hz). It is clear here that the number of flashes per hour can take all the values between 3.6 x 10 5 and 5.4 x 10 9 without it being necessary to list them all (36000, 36001, 36002, ... , 5399999998, 5399999999, 5400000000).
  • the duration of the flash can be between 1/150000 seconds and 1799 seconds (29 minutes and 59 seconds).
  • the duration of the flash may be preferably between 1/150000 second and 1/10 of a second.
  • the duration of the flash may be preferably between 1/10 of a second and 1799 seconds (29 minutes and 59 sec).
  • the intensity of the light provided in the form of flashes can be between 5 and 5000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 500 ⁇ . m “2 , s “ 1 , or 50 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , and more preferably between 150 and 300 ⁇ . m “2 , s “ 1 (1 ⁇ . nr 2, s "1 corresponds to 1 ⁇ m '2 , s " 1 (Einstein), a unit often used in the literature).
  • the number of flashes per hour can be chosen according to the intensity and the duration of the flashes (see above).
  • the notions of frequency, duration and luminous intensity apply to the illumination as provided by the invention, that is to say to the illumination produced by the chosen light source, advantageously by an LED, emitting light radiation of narrow spectrum between 400 and 550 nm preferably 420 and 500 nm, more preferably between 430 and 480 nm, very preferably centered at 455 nm and for the times considered according to the invention.
  • a preferred form of the invention may be a method according to the invention in which the lighting contribution can be made in the form of a discontinuous light in the form of flashes, obtained with LEDs emitting radiation having a narrow spectrum wavelength between 400 nm and 550 nm, preferably between 420 nm and 500 nm, more preferably between 430 and 480 nm, very preferably 455 nm wavelength.
  • the illumination may be variable, which means that the illumination is not interrupted by dark phases, but that the light intensity varies over time.
  • This variation in light intensity may be regular or not, and may be periodic or cyclic.
  • variable lighting is meant that the intensity of the light varies regularly at least twice an hour.
  • An example of the lighting conditions adapted to the method of the invention is described in the application WO 2012/035262.
  • the illumination may preferably have intensity variations whose amplitude may generally be between 5 ⁇ . m “2 , s “ 1 and 2000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 50 and 1500 ⁇ . m “2 , s “ 1 , more preferably between 50 and 200 ⁇ . m “2 , s “ 1 .
  • the illumination may have intensity variations whose amplitude may be between 5 and 1000 ⁇ . m “2 , s “ 1 , preferably between 5 and 400 ⁇ . m “2 , s “ 1 , these variations can take place between 2 and 3600 times per hour, preferably between 2 and 200 times per hour.
  • These cultivation conditions make it possible to provide a defined quantity of light.
  • This luminous contribution may comprise phases of discontinuous and / or variable lighting, with variations in intensity that may have identical or different amplitudes.
  • the culture conditions of the ARU strains may be the conditions known and used in the prior art to cultivate the retained strains, conditions to which a lighting step has been added.
  • the conditions which will make it possible to obtain the best productivity in biomass and / or the best concentration of biomass will be used.
  • this step may be incorporated into the processes described by the Applicant in the application WO2012 / 035262.
  • the culture can be carried out by any known culture technique, for example in flasks or in a reactor, but also in fermenters or in any container capable of growing ARUs, such as for example "raceway” type pools. openpond ", provided that said technique makes it possible to bring the ARUs into contact with at least the carbonaceous source, and furthermore is equipped with at least one light source emitting in wavelengths having a narrow spectrum of between 400 nm and 550 nm, preferably between 430 and 480 nm, very preferably centered at 455 nm, whose action on the culture may lead to the macroscopic composition of desired biomass that is to say a biomass rich in phycobiliproteins (phycocyanin and allophycocyanine) with intracellular contents of between 29 and 250 mg / g of dry matter, preferably between 35 and 150 mg / g of dry matter and optionally rich in antioxidant agents, in particular carotenoids, advantageously zeaxanthin and ⁇ -carotene, in contents
  • the Applicant has also been able to show that in the case of a batch culture when the concentrations of carbon (C) and phosphorus (P) in the initial culture medium are such that the P / C ratio of these concentrations (expressed in mole of phosphorus / mole of carbon) is less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more preferably less than 0.01054, still more advantageously less than 0.00527, preferentially less than 0.00263, very preferably less than 0, 00131, then the intracellular phycocyanin content of the biomass is increased relative to the intracellular phycocyanin content of a biomass obtained under the standard conditions of the prior art.
  • the Applicant has been able to show that when the quantities of phosphorus and carbon consumed are such that the P / C ratio of these quantities consumed (expressed in moles of phosphorus / mole of carbon) of these quantities consumed is less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more preferably less than 0.01054, still more preferably less than 0.00527, preferably less than 0.002637, very preferably less than 0.00131, then the phycocyanin content of the biomass is increased.
  • the sources of phosphorus may be chosen from the following species: phosphoric acid, phosphorus salts, advantageously sodium hydrogenophosphorus (Na 2 HPO 4 ), or sodium dihydrogenophosphorus (NahbPC), or potassium dihydrogenphosphorus (KH2PO4), or potassium hydrogenphosphorus (K2HPO4), or any mixture, in any proportion of at least two of these sources.
  • the carbon sources can be chosen from the following species: glucose, glycerol, acetate, sucrose or any mixture in any proportion of at least two of these sources.
  • a subject of the invention is also a process for culturing ARUs of the class Cyanidiophyceae, advantageously of the order of cyanidiales, very advantageously families of Cyanidiaceae or Galdieriaceae, particularly of the genera Cyanidioschyzon, Cyanidium or Galdieria, very particularly species Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caidarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita or Galdieria sulphuraria, preferentially of the species Galdieria sulphuraria, in a medium comprising at least a source of carbon, and at least one source of phosphorus, said method comprising at least one lighting step.
  • the concentrations of carbon and phosphorus in the initial culture medium may be such that the P / C ratio of these concentrations (expressed as mole of phosphorus / carbon mole) can be less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more preferably less than 0.01054, still more preferably less than 0.00527, preferentially less than 0.00263, most preferably less than 0 , 00131.
  • the quantities consumed in carbon and phosphorus during the cultivation may be such that the P / C ratio of these quantities consumed (expressed in moles of phosphorus / mole of carbon) may be less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more preferably less than 0.01054, still more advantageously less than 0.00527, preferably less than 0.00263, very preferably less than 0.00131.
  • the carbon concentrations and the phosphorus in the initial culture medium may be such that the P / C ratio of these concentrations (expressed in moles of phosphorus / mole of carbon) may be less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more advantageously less than 0 , 01054, still more preferably less than 0.00527, preferably less than 0.00263, most preferably less than 0.00131.
  • the quantities consumed in carbon and phosphorus during the cultivation may be such that the P / C ratio of these consumed quantities (expressed in moles of phosphorus / mole of carbon) may be less than 0.01898, advantageously less than 0.01503, more preferably less than 0.01054, still more preferably less than 0.00527, preferentially less than 0.00263, most preferably less than 0.00131.
  • the conditions of illumination by blue light can be those described above.
  • the process may comprise, simultaneously or independently, any other step necessary for the growth of the biomass or the production of the molecules of interest (phycocyanin and carotenoids), for example without being limiting one or more steps ) culture without light or one or more stage (s) of biomass recovery.
  • any other step necessary for the growth of the biomass or the production of the molecules of interest for example without being limiting one or more steps ) culture without light or one or more stage (s) of biomass recovery.
  • the culture according to the process may be carried out at a temperature between 15 ° C and 47 ° C, preferably between 22 ° C and 42 ° C.
  • the culture method can be used to cultivate a single strain of ARUs of a given genus, several strains of a given single genus, or several strains of different genera given (at least 2 species of 2 different genera). ).
  • the carbon source may be chosen from any carbon source known and usable according to the chosen strain.
  • the skilled person will easily choose the carbon source best suited to the strain to be cultivated.
  • a carbon source that can be used glucose, sucrose, acetate or glycerol [Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger, op. Cit.].
  • the organic carbon substrate contained in the culture medium may consist of complex molecules or a mixture of substrates.
  • Products resulting from the biotransformation of starch, for example from corn, wheat or potato, in particular starch hydrolysates, which consist of small molecules, constitute, for example, substrates organic carbon adapted to the cell culture mixotrophy of the invention.
  • the organic carbon substrate may have a concentration of between 5 mM and 1.5 M, preferably 50 mM and 800 mM.
  • the method according to the invention may further comprise a recovery step of the ARUs.
  • Said recovery of the ARUs can be achieved by any technique allowing the recovery of biomass, including filtration methods, gravimetric or under reduced pressure, decantation, or else precipitation methods followed by gravimetric filtration.
  • the invention also relates to the biomass obtainable by any one of the variants of the process according to the invention.
  • said biomass may have a density of at least 20 g / l in ARUs and up to about 200 g / l of dry matter, preferably at least 50 g / l of dry matter, more preferably at least 90 g / l of dry matter and up to about 150 g / l of dry matter.
  • said biomass may have an intracellular content of phycobiliproteins (phycocyanin and allophycocyanin) with intracellular contents of between 29 and 250 mg / g of dry matter, preferably between 35 and 150 mg / g of dry matter.
  • phycobiliproteins phycocyanin and allophycocyanin
  • said biomass may have an intracellular phycocyanin content of between 29 and 200 mg / g of dry matter, preferably between 40 and 100 mg / g of dry matter.
  • the phycobiliproteins, and particularly the phycocyanin, produced by said biomass can be extracted for use, for example, in the diet or as a dye.
  • the extraction of phycobiliproteins, and particularly phycocyanin, from said biomass can be carried out according to any extraction technique known to those skilled in the art, such as that described by Moon et al., 2014 (Myounghoon, Sanjiv K Mishra, Kim Chul Woong, William I Suh, Min S Park, and Ji-Won Yang.
  • the invention therefore also relates to a process for preparing phycocyanins which comprises the following steps:
  • the phycocyanin obtainable from said biomass has different properties that are noticeable with respect to the phycocyanin obtainable by culturing other organisms, particularly for example with respect to the phycocyanin obtainable by culturing spirulina.
  • Said phycocyanin obtainable from the biomass obtained according to the invention may have a blue color, little or no alteration in a solution whose pH is between 2 and 8, preferably between 3 and 7, very preferably between 4 and 5.
  • the phycocyanin obtainable from the biomass obtained according to the invention may have the advantage of little or no precipitation at acidic pH, particularly at a pH between 2 and 4, unlike the phycocyanin that can be obtained from a spirulina biomass.
  • This property makes phycocyanin obtainable from the biomass obtained according to the invention, particularly from a biomass of Galdieria sulphuraria, an excellent candidate for use in acidic, gaseous or non-gaseous beverages.
  • the phycocyanin obtainable from the biomass obtained according to the invention may have improved thermostability compared to phycocyanin extracted from spirulina for temperatures above 50 ° C (Moon et al., 2014).
  • the phycocyanin obtainable from the biomass obtained according to the invention may have an improved ethanol resistance compared to spirulina phycocyanin.
  • the term "phycocyanin resistance" (at acidic pH, temperature and / or ethanol) means an absence of loss of color or a loss of color less than that described for phycocyanin. extracted from Spirulina platensis. Quantification of color alteration can be measured by spectrophotometer by comparing the absorbance of an aqueous solution under standard temperature and pH conditions, as described by Moon (2014), and then comparing these results to those obtained. conditions of high temperature, acidic or alkaline pH, and / or when adding ethanol in the solution for example.
  • the invention also relates to phycocyanin obtainable according to the process of the invention, said phycocyanin being resistant to a temperature between 70 ° C and 0 ° C, preferably between 65 ° C and 25 ° C, very preferably between 60 ° C and 50 ° C, and / or resistant to a pH of between 8 and 2, preferably between 3 and 7, very preferably between 4 and 5, and / or resistant to an ethanol concentration of between 50% and 1%, preferably of between 40% and 10%, very preferably between 20 and 30%
  • the invention also relates to the use of phycocyanin obtainable according to the method of the invention, in food, animal or human, as a dietary supplement, or as a dye, particularly as food coloring.
  • the cake that can be obtained after extraction of the phycocyanin from the biomass of ARUs that can be obtained by the method according to the invention can be used as a dietary supplement rich in proteins and carotenoids, in human food or animal.
  • said biomass may have an intracellular content of carotenoids of between 0.1 and 10 mg / g of dry matter, advantageously between 0.250 and 1 mg / g of dry matter.
  • ARUs have a significant potential for use in many fields, such as, for example, human or animal nutrition, cosmetics and medicine.
  • said biomass of ARUs obtainable according to the invention can be used after harvest either directly, optionally dried or after transformation.
  • said biomass may be used in the form of flours entering food compositions or in the form of food supplements.
  • the biomass of ARUs that can be obtained according to the invention can be transformed into flour according to any method known to those skilled in the art. It can thus be envisaged, for example, that the ARUs can be separated from the culture medium, lysed and reduced to fine particles (average diameter of 10 microns), and then dried.
  • the invention also relates to any use of the biomass of ARUs obtainable according to the invention in any known field of use of ARUs, particularly, food or feed, cosmetics, medicine.
  • the biomass obtained after culture of ARUs according to the method of the invention can make it possible to obtain in particular a flour rich in antioxidants, in particular carotenoids (particularly zeaxanthin and ⁇ -carotenes) in contents of between 0.1 and 10 mg.
  • a flour rich in antioxidants in particular carotenoids (particularly zeaxanthin and ⁇ -carotenes) in contents of between 0.1 and 10 mg.
  • / g of dry matter advantageously between 0.25 and 1 mg / g of dry matter, in particular zeaxanthin in a content of between 0.05 and 5 mg / g of dry matter, advantageously between 0.1 and 1 mg / g of dry matter, and / or ⁇ -carotene at a content of 0.05 and 5 mg / g of dry matter, advantageously between 0.1 and 1 mg / g of dry matter, meeting a need, particularly in the 'industry food, because more appetizing, tastier, providing antioxidants in large quantities and can be used in animal or human food.
  • the invention therefore relates to a flour that can be obtained after transformation of the biomass into ARUs that can be obtained by the process according to the invention.
  • said product can be used pure or mixed with other conventionally used ingredients, particularly in food or in food. cosmetic.
  • the invention also relates to any product that may comprise at least the algal biomass obtainable according to the invention.
  • the invention also relates to any product which may comprise at least flour resulting from the transformation of the algal biomass obtainable according to the invention. DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 1 describes the optimization of the growth of Galdieria sulphuraria in Bioreactor. It shows the evolution of the biomass concentration as a function of time of a strain of Galdieria sulphuraria according to the trophic mode of culture used. The results show that the conditions of mixotrophy (-0-) make it possible to obtain a faster and significantly improved growth of the strain with respect to heterotrophic conditions (- ⁇ -). This curve also shows that the concentration of dry biomass is significantly higher at the end of culture with mixotrophic conditions than with the conditions of heterotrophy.
  • Figure 2 shows the effect of blue light on growth and pigment production.
  • FIG. 2A shows the intracellular phycocyanin content expressed in mg / g of dry matter (DW) (j) and the estimated cell concentration of the biomass by measuring the optical density at 800 nm ([]). The test was performed in white light and blue light. The measurements were made at 180h and 250h.
  • FIG. 2B shows the amount of chlorophyll (
  • FIGS. 3A and 3C are the representation of the growth of the strain as a function of time in the presence of 1 (- ⁇ -), 2 (- ⁇ -), 4 (-O-) and 8 (- ⁇ -) g / Ammonium sulfate (Figure 3A) or 250 (- ⁇ -), 500 (- ⁇ -), 1000 (-O-) and 2000 (- ⁇ -) mg KH 2 PO 4 ( Figure 3C).
  • FIGS. 3B and 3D represent the intracellular content of phycocyanin expressed in mg / g of dry matter in the strains of the cultures in the presence of 1 ((), 2 ( ⁇ ), 4 ([[) and 8 ([[g) / L (NH 4 ) 2 S0 4 , at 250 h ( Figure 3B) or 250 (
  • Figure 4 shows the combined effects of blue light and phosphorus limitation on pigment production on Galdieria sulphuraria crops. It shows in A the intracellular phycocyanin content expressed in mg / g of dry matter obtained under the various conditions tested.
  • Figure 4B shows the intracellular contents of chlorophyll (1), ⁇ -carotene (@) and zeaxanthin (0) in the same cultures.
  • Figure 5 shows the continuous fermenter culture monitoring with blue luminous counterpanes (455 nm)
  • Figure 6 shows the physicochemical characteristics of phycocyanin extracted from Galdieria sulphuraria compared to phycocyanin extracted from Spirulina platensis.
  • A pH resistance test
  • B Temperature resistance
  • C Resistance to ethanol:
  • the phycocyanin extracted from Galdieria sulphuraria has good resistance to temperature: more than 40% of pigmentation remaining after 30 minutes at 70 ° C.
  • Example 1 Optimization of growth in fermenter.
  • Galdieria sulphuraria also called Cyanidium caldarium
  • Heterotrophy and Mixotrophy 30 g / L glycerol, 8 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 1 g / L KH 2 PO 4 , 716 mg / L MgSO 4 , 44 mg / L CaCl 2 , 3 mL / L of Fe-EDTA stock solution (FeS0 4 to 6.9g / L and EDTA-Na 2 to 9.3g / L) and 4 ml / L of metal trace solution (3.09g / L EDTA-Na 2 , 0.080g / L CuSO 4 , 5H 2 O, 2.860 g / LH 3 B0 3 , 0.040 g / L NaV0 3 , 4H 2 0, 1.820 g / L MnCl 2 , 0.040 g / L CoCl 2 , 6H 2 O, 0.220 g / L ZnSO 4 , 7H 2 0, 0.017g / L Na 2
  • the cultures are carried out in reactors of 1 to 2 L of useful volume with dedicated automata and supervision by computer station.
  • the pH of the culture is regulated by the addition of base (solution of 14% ammonia (w NH3 / w) and / or acid (4N sulfuric acid solution) .
  • the culture temperature is set at 42 ° C. C.
  • Stirring is carried out by means of 3 agitating stirrers: 1 Rushton turbine with 6 straight blades positioned at the lower end of the stirring shaft above the "sparger” and 2 HTPG2 tripaline propellers placed on the
  • the dissolved oxygen pressure in the liquid phase is regulated in the medium throughout the culture, by the rotation speed of the stirring shaft (250-1800 rpm), the flow rate air and / or oxygen ventilation
  • the control parameters, integrated in the supervisory automaton, make it possible to maintain a dissolved oxygen partial pressure in the liquid phase of between 5 and 30% of the saturation value. by air under identical conditions of temperature, pressure and composition of the medium. ure was between 50 and 300 hours.
  • the heterotrophy (- ⁇ -) The glycerol substrate is provided by a fed discontinuous type of pipe. No light input is made.
  • the glycerol substrate is provided by a fed-type discontinuous pipe and a light input is achieved.
  • the cultivation in Mixotrophy makes it possible to obtain a higher biomass concentration faster than those obtained with cultures in heterotrophic or autotrophic mode.
  • Table 2 A) and B): Amino acid content of Galdieria sulphuraria grown under conditions of mixotrophy (A) and heterotrophy (B). The protein content estimated by the Kjeldahl method was estimated at 51.5% and 37% respectively with an N-6.25x factor.
  • each Erlenmeyer flask 100 ml of medium is inoculated at 0.1% (v / v) with an aged 240 h pre-culture.
  • the Erlenmeyer flasks are independently illuminated with a white LED or blue LED system (455 nm).
  • the luminous intensity for each of the conditions is 100 ⁇ nr 2 s- 1 .
  • the cells are cultured at a temperature of 42 ° C.
  • Tests with blue light lengths of 475 nm show an effect similar to that of 455 nm; it is therefore possible to use the entire range of blue light wavelength to promote the production of phycocyanin.
  • Example 3 Effect of the composition of the culture medium on the production of phycocyanin.
  • Galdieria sulphuraria also called Cyanidium caldarium
  • KH 2 PO 4 concentrations 250 mg / L, 500 mg / L, 1 g / L and 2 g / L are required.
  • the pH is adjusted to 3 with H 2 S0 4 36 N and then sterilized.
  • the same protocol is applied for media or the nitrogen concentration varies, this time keeping the concentration of KH2PO4 at an initial value of 1 g / l.
  • the phycocyanin content was estimated per gram of dry matter at different culture times by the method described by Moon et al. [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1-6] (A).
  • Other pigments such as chlorophyll and carotenoids were estimated by an HPLC assay method known to those skilled in the art (B).
  • the cells are illuminated with white light (100 ⁇ E m “2 , s " 1 ).
  • the Applicant has been able to determine that for equivalent growths (FIG. 3C), that is to say that for nonrestrictive phosphorus concentrations, the phycocyanin production was greater in a medium containing 250 mg / l of KH 2 PO 4 (ie 0.0025 mole of phosphorus / L) to that obtained in a medium containing 2 g / l of KH2PO4 (ie mole of phosphorus / L) (FIG. 3B).
  • the higher the P / C ratio of the initial concentrations in the medium expressed in moles of phosphorus / mole of carbon
  • the method of batch culture is intended to maintain a phosphorus level in the medium for combining growth and production phycobiliproteins and carotenoids, by determining a range of phosphorus concentration "ideal. Contrary to what was described in International application WO2015107312 for chlorella, phosphorus deficiency does not induce an overall increase in protein content in Galdieria sulphuraria According to our results the phycobiliprotein concentration increases while the protein content of biomass (AA% ) stay fixed.
  • Example 4 Combined effects of blue light and phosphorus concentration on the production of phycocyanins and carotenoids.
  • a phosphorus concentration range, in the form of KH 2 P0 4 , in the presence of blue light or white light was used to grow strains of
  • each Erlenemeyer flask 100 ml of medium are inoculated at 0.1% (v / v) with an aged 240 h pre-culture.
  • the Erlenmeyer flasks are independently illuminated with a white LED or blue LED system (455 nm).
  • the luminous intensity for each of the conditions is 100 ⁇ nr 2 s- 1 .
  • the cells are cultured at a temperature of 42 ° C. under moderate agitation (200 rpm) .
  • the growth of the cells is monitored every 24 hours by Absorbance measurement at 800 nm. Results:
  • strains have a difference in color ranging from green blue to pale yellow through green.
  • Table 4 below shows the concentrations of the various pigments in the biomass after 250 hours of growth.
  • Example 5 Combined effects of blue light and phosphorus concentration on the production of phycocyanins and carotenoids in continuous culture
  • the Gladieria strain UTEX 2919 was cultured under the conditions of Example 1, with 500 mg of KH2PO4 and a blue counterblade delivering up to 3 Watts of light power at a wavelength of 455 nm.
  • the feed medium is sized to obtain between 60 and 65 g of dry matter per liter of must.
  • the concentration of each element of the medium is adjusted in order to respect the ratios of the medium used for the base of the tank described in Example 1.
  • the light is maintained at 50% of the maximum power. From 600 hours of culture, considered as the production phase, the light output is increased to 100% or 3 Watts.
  • Figure 5 A (-0-) growth monitoring by dry matter; (- ⁇ -) Growth monitoring by absorbance measurement at 800 nm.
  • Figure 5B Measurement of changes in intracellular phycocyanin content during culture.
  • the Gladieria strain UTEX 2919 was cultured under the conditions of Example 2.
  • phycocyanins was extracted according to the protocol described by Moon et al., 2014 (op.citus). The phycocyanin measured in blue is measured by absorbance at 618 nm using a spectrophotometer (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro). Percentage loss of color is measured relative to the measurement of sample absorbance under reference conditions, pH 6 for pH test, 25 ° C for temperature test, 0% ethanol for resistance to alcohol.
  • the pH was lowered gradually by adding a citric acid solution to the phycocyanin preparation.
  • a sample of the phycocyanin solution is taken and its absorbance at 618 nm measured.
  • the phycocyanin solution is placed for 30 minutes in a water bath preheated to 70 ° C, after cooling at room temperature the absorbance of the sample at 618 nm is measured.
  • Figure 6A shows that phycocyanin extracted from the strain Galdieria sulphuraria
  • FIG. 6B shows that the phycocyanin extracted from the strain Galdieria sulphuraria (UTEX 2919) still has more than 40% of its coloration after 30 minutes of incubation at 70 ° C.
  • Figure 6C shows that phycocyanin extracted from the strain Galdieria sulphuraria

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Abstract

La présente demande concerne le domaine de la culture des algues, particulièrement des algues rouges unicellulaires (ARUs). L'invention s'adresse particulièrement à un procédé de culture d'algues rouges unicellulaires caractérisé en ce que les conditions particulières de la culture en termes d'éclairage et de nutriments permettent d'obtenir une biomasse, riche en protéines, pouvant présenter une quantité en ARUs améliorée, et apte à produire outre des pigments, particulièrement de la phycocyanine et les caroténoïdes: du β-carotène et de la zéaxanthine, L'invention s'adresse également à la biomasse susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, aux utilisations de ladite biomasse et aux produits pouvant comprendre de ladite biomasse.

Description

NOUVEAU PROCEDE DE CULTURE D'ALGUES ROUGES UNICELLULAIRES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la culture des algues rouges unicellulaires (ARUs).
L'invention s'adresse particulièrement à un procédé de culture d'ARUs, caractérisé en ce que les conditions particulières de la culture en termes d'éclairage et d'apports de nutriments peuvent permettre d'obtenir une biomasse constituée d'ARUs en quantité supérieure par rapport aux quantités pouvant être obtenues dans des conditions de culture classiques, ladite biomasse pouvant présenter au moins une quantité en phycobiliprotéines, particulièrement en phycocyanine élevée et en outre une quantité en agents antioxydants élevée.
L'invention s'adresse également à la biomasse susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention, aux utilisations de ladite biomasse et aux produits pouvant comprendre de ladite biomasse.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Certaines algues rouges unicellulaires (ARUs) peuvent être intéressantes comme source additionnelle de nourriture, car elles peuvent être source de protéines, particulièrement des phycobiliprotéines, de fibres, de lipides, ou encore d'agents antioxydants particulièrement des caroténoïdes. Elles peuvent être utilisées natives, avantageusement séchées, mais aussi transformées, par exemple réduites sous forme de farines.
Elles peuvent être utilisées dans l'alimentation humaine ou animale, comme supplément nutritionnel ou incorporées en petite quantité dans des aliments.
Les algues rouges, ou Rhodophytes (division des Rhodophyta), sont un grand taxon d'algues pour la plupart marines et pour la plupart multicellulaires. Elles sont caractérisées par une composition pigmentaire avec un seul type de chlorophylle, la chlorophylle "a ", des caroténoïdes et des pigments caractéristiques, les phycobiliprotéines.
Parmi les Rhodophytes il existe une sous-division, les Cyanidiophytina, qui sont des
ARUs qui vivent dans des sources chaudes acides.
La sous-division des Cyanidiophytina renferme la classe des Cyanidiophyceae, qui elle-même renferme l'ordre des Cyanidiales, lui-même englobant les familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, elles-mêmes subdivisées en les genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, auxquelles appartiennent les espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria.
Les phycobiliprotéines sont des pigments hydrosolubles que l'on retrouve dans le phycobilisome, complexe photosynthétique présent notamment chez les cyanobactéries et certaines microalgues. Il existe quatre types de phycobiliprotéines : la phycocyanine, la phycoérythrine, l'allophycocyanine. La phycocyanine présente un pic d'absorption situé entre 610 nm et 655 nm, la phycoérythrine présente un pic d'absorption situé entre 400 nm et 600 nm, la phycoérythrocyanine présentant des pics d'absorption à environ 450, 525 et 570 nm et l'allophycocyanine un pic d'absorption essentiellement centré à 650nm.
La production de phycobiliprotéines mondiale est essentiellement obtenue par culture de spiruline en bassin ouvert (raceway) et représente à peu près 15 000 tonnes par an.
La phycocyanine extraite de spiruline est également vendue comme complément alimentaire sous forme liquide, ou sous forme de poudre pour être utilisée comme pigment bleu dans l'alimentaire. La phycocyanine est le seul pigment bleu naturel approuvé par l'US-FDA (FR Doc No: 2013-19550).
Les cultures de spiruline se font majoritairement à ciel ouvert dans des zones géographiques chaudes, la température optimale de culture étant de 37°C. Ces cultures sont donc dépendantes des fluctuations saisonnières (température, lumière). La spiruline présente l'inconvénient d'une faible productivité en biomasse (g biomasse sèche/L/h) et/ou phycocyanine (g phycocyanine/L/h) qui ne permet pas le passage à une culture en fermenteur nécessaire à une industrialisation de la production de phycocyanine.
De plus ces cultures sont également sensibles à des contaminations par des formes de cyanobactéries, proches de la spiruline, connues pour produire des toxines telles que les microcystines [Rellan, S, et coll. ; Food and Chemical Toxicology 47 (2009) 2189- 2195]. Les microcystines peuvent provoquer des troubles intestinaux, et une exposition à long terme à ces toxines peut provoquer des cancers du foie. En outre, certaines souches de spiruline, comme par exemple Arthrospira platensis, sont elles-mêmes productrices de toxines [Rellan, S, et coll., opus cit.].
Des essais de cultures axéniques de spiruline en bioréacteurs fermés ont été rapportés dans la littérature en utilisant une souche d'Arthrospira platensis [Chen, Feng, and Yiming Zhang ; Enzyme and Microbial Technology 20, no. 3 (February 15, 1997): 221-24]. Toutefois, à la connaissance de la Demanderesse aucune production de spiruline en bioréacteurs à échelle industrielle n'a été rapportée.
On comprend donc qu'outre une faible productivité en biomasse et/ou phycocyanine, la garantie de la sécurité sanitaire des productions destinées à l'utilisation directe de biomasses de spiruline en alimentation humaine ou animale n'est pas évidente et nécessite un contrôle qualité extrêmement précis.
Les ARUs sont connues pour produire des phycocyanines, et l'effet de la lumière sur la culture des ARUs et leurs compositions en pigments a fait l'objet de nombreuses études de laboratoire [Sloth JK & al., Enzyme and Microbial Technology, Vol.28, n° 1 -2, Janvier 2006, 168-175 ; Graverholt OS & al., Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 77, n° 1 , 5 septembre 2007, 69-75]. Nichols K & al. [Botanical Gazette, Vol. 124, n° 2, 1 er décembre 1962, 85-93] ont étudié les photorécepteurs cellulaires susceptibles d'être associés à la synthèse des phycocyanines dans des ARUs mutants, en faisant varier les longueurs d'ondes employées pour éclairer les cultures. Steinmuler K & al. [Plant Physiology, Vol. 76, n° 4, 1 er décembre 1984, 935-939] ont étudié la culture des ARUs dans des conditions de mixotrophie et constaté que l'ajout de glucose pouvait inhiber la synthèse des phycobilliprotéines.
Il existe donc un besoin en une nouvelle source de phycobiliprotéines, particulièrement de phycocyanine, dont les méthodes de culture pourraient permettre de contourner les inconvénients connus des cultures de spiruline.
Il serait intéressant de disposer d'un procédé de culture d'ARUs qui permettrait d'obtenir une biomasse desdites algues présentant une quantité d'algues augmentée par rapport aux quantités généralement obtenues par les procédés de culture desdites algues connus dans l'art antérieur, qui plus est avantageusement riche en métabolites d'intérêt particulièrement en phycobiliprotéines, particulièrement en phycocyanine, et/ou en agent antioxydants comme par exemple les caroténoïdes.
La présente invention vise à fournir un tel procédé de culture d'algues rouges unicellulaires (ARUs) enrichies en phycobiliprotéines et caroténoïdes.
EXPOSE DE L'INVENTION
La présente invention concerne un procédé de culture d'algues rouges unicellulaires (ARUs) de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu comprenant au moins une source de carbone, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm.
L'invention concerne aussi une biomasse susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention qui présente une teneur en phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) comprise entre 29 et 250 mg/g de matière sèche et avantageusement une densité en ARUs comprise entre 20 et 200 g/L de matière sèche, préférentiellement entre 90 et 150 g/L de matière sèche. L'invention concerne également l'utilisation de la biomasse selon l'invention pour la préparation de phycocyanine et/ou de caroténoïdes.
L'invention concerne également une phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse selon l'invention.
L'invention concerne aussi l'utilisation de la biomasse selon l'invention ou la phycocyanine selon l'invention pour l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique et/ou comme colorant.
L'invention concerne également un produit comprenant au moins de la biomasse ou une phycocyanine selon l'invention.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Par la suite dans le présent texte, par commodité et sous réserve de précision, l'emploi de "ARU" doit s'entendre comme signifiant "Rhodophytes, de la sous-division des Cyanidiophytina. de la classe des Cyanidiophyceae de l'ordre des Cyanidiales des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria".
De même l'emploi du terme "Cyanidiophyceae" doit être compris, sous réserve de précision, comme signifiant "Cyanidiophyceae, de l'ordre des Cyanidiales, des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria" ; l'emploi du terme "Cyanidiales" doit être compris, sous réserve de précision, comme signifiant "Cyanidiales, des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria" ; l'emploi de l'expression "Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae" doit être compris, sous réserve de précision, comme signifiant "Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria" ; l'emploi de l'expression " Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria ", doit être compris, sous réserve de précision, comme signifiant " Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldahum, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria".
Il faut aussi noter que, telles qu'elles peuvent être utilisées dans la description et les revendications, les formes singulières "un", "une", "le" et "la" englobent les références à leurs pluriels, sauf si le contexte en convient clairement autrement.
Certaines ARUs sont des êtres mixotrophes, capable à la fois d'hétérotrophie
(consommation de substrat organique carboné apporté par le milieu de culture) et d'autotrophie (utilisation de la lumière pour capter le CO2 via la photosynthèse). La mixotrophie est également appelée photo-hétérotrophie. La notion de mixotrophie est étendue à l'utilisation de la lumière non seulement pour la photosynthèse mais également comme signal lumineux pouvant induire une réponse du métabolisme : par exemple la synthèse de pigments.
La mixotrophie à dominante hétérotrophe permet de produire des molécules d'origine algale en couplant à la fois les avantages de l'autotrophie et de l'hétérotrophie. Elle consiste à introduire une composante lumineuse pouvant être de faible intensité et/ou de courte durée, avec un milieu de culture pouvant contenir une ou plusieurs sources organiques de carbone. Comme en hétérotrophie, les ARUs consomment un substrat organique, ce qui permet d'atteindre une productivité (exprimée en gramme de biomasse sèche/L/h) et/ou une concentration en biomasse (exprimée en gramme de biomasse sèche/L) importante, le chloroplaste et les autres structures sensibles à la lumière de la cellule étant alors activés.
Ces capteurs d'énergie lumineuse peuvent être des organites ou structures spécifiques au sein de la cellule tels que le chloroplaste, le stigma, le chronoplaste, le chromoplaste ou le phycobilisome, ou peuvent être des molécules individuelles capables de répondre à la lumière et d'entraîner une réponse cellulaire comme les rhodopsines, les phytochromes, les cryptochromes ou les auréochromes.
Ces photorécepteurs permettent d'augmenter la productivité de la cellule ainsi que de permettre la synthèse de toutes les molécules pouvant être métabolisées par une ARU. Les molécules d'intérêt, produites par lesdites ARUs, peuvent présenter un intérêt industriel majeur particulièrement dans les domaines de la nutrition, de la cosmétique, de la chimie verte et de l'énergie. Ces molécules d'intérêt sont variées telles que par exemple des carbohydrates, des protéines, des acides aminés, avantageusement des acides aminés essentiels et des pigments, particulièrement des pigments photosynthétiques, dont les principaux sont les chlorophylles, les caroténoïdes et les phycobiliprotéines.
Le terme de caroténoïde regroupe les carotènes (α, β, ε, γ, δ ou ζ-carotène, lycopène et phytoène) et les xanthophylles (astaxanthine, anthéraxanthine, citranaxanthine, cryptoxanthine, canthaxanthine, diadinoxanthine, diatoxanthine, flavoxanthine, fucoxanthine, lutéine, néoxanthine, rhodoxanthine, rubixanthine, siphonaxanthine, violaxanthine, zéaxanthine). Les caroténoïdes sont des pigments plutôt orange et jaune, liposolubles. Ils sont synthétisés par toutes les algues, toutes les plantes vertes et par de nombreux champignons et bactéries (dont les cyanobactéries). Ils sont absorbés par les animaux et les êtres humains dans leur nourriture. Les caroténoïdes ont deux principaux pics d'absorption situés autour de 440 et 475 nm.
Les caroténoïdes jouent un rôle important dans la nutrition et la santé, car plusieurs sont des provitamines A, et certains présentent aussi des activités anti-cancer et antioxydantes. Ils stimulent en outre la synthèse d'anticorps. Certains d'entre eux sont largement utilisés dans l'industrie agro-alimentaire pour leurs propriétés colorantes, et également dans les industries cosmétiques et pharmaceutiques pour leurs propriétés antioxydantes et leur capacité de photoprotection.
Certains caroténoïdes présentent un grand intérêt, comme la lutéine, la zéaxanthine, et l'astaxanthine, cette dernière particulièrement pour son important pouvoir antioxydant.
La Demanderesse a montré, de manière surprenante et après de longues recherches, qu'une culture d'ARUs dans un milieu pouvant comprendre au moins une source de carbone et une source de phosphore et pouvant comprendre en outre au moins une étape d'éclairage, avantageusement un éclairage par une lumière présentant un spectre étroit centré sur une longueur d'onde donnée, particulièrement un spectre centré à 455 nm, peut permettre d'obtenir une biomasse dont la quantité en ARUs peut être nettement améliorée par rapport aux cultures habituellement réalisées et qui plus est pouvant contenir une quantité de molécules d'intérêt, particulièrement de la phycocyanine, de l'allophycocyanine, de la zéaxanthine et des β-carotènes, éventuellement supérieure à celle pouvant être obtenue dans les cultures décrites dans l'art antérieur.
Les ARUs au sens de l'invention, sont des organismes extrémophiles capables de supporter des pH très acides (0,05-5), ainsi que des températures très élevées (25- 56°C). On trouve ces organismes souvent près des volcans ou des sources d'eaux chaudes. Généralement ces organismes mixotrophiques sont capables d'utiliser un nombre important de métabolites carbonés (glucose, glycérol, pentose...) [Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger. "Heterotrophic Growth of Two Strains of the Acido- Thermophilic Red Alga Galdieria Sulphuraria." Plant and Cell Physiology 36, no. 4 (June 1 , 1995): 633-38].
Un autre avantage du procédé mis au point par la Demanderesse est qu'il peut être conduit en bioréacteur, qui plus est avantageusement à l'échelle industrielle.
A la connaissance de la demanderesse aucune production industrielle (en bioréacteur) d'ARUs en autotrophie, mixotrophie ou hétérotrophie n'est connue.
La Demanderesse a particulièrement montré qu'une culture d'ARUs, au sens de l'invention, utilisant un milieu de culture comprenant au moins une source de carbone et au moins une source assimilable de phosphore, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage, peut permettre d'obtenir une productivité et/ou une concentration en biomasse nettement améliorée par rapport aux cultures habituellement réalisées, biomasse qui en outre peut être riche en phycocyanine et/ou en caroténoïdes.
Par "riche en phycocyanine et/ou en caroténoïdes" on entend dans le présent texte que la concentration en phycobiliprotéines et/ou de caroténoïdes dans la biomasse pouvant être produite après culture dans les conditions selon l'invention est plus importante que la concentration de phycobiliprotéines et/ou de caroténoïdes pouvant être produite par une biomasse des mêmes algues obtenue après culture dans les conditions décrites dans l'art antérieur.
Un avantage non négligeable de la culture de Cyanidiophyceae en fermenteur en conditions de mixotrophie est qu'elle permet de réaliser des cultures de souche pure (ou axénique) ne contenant qu'un seul type cellulaire inoculé dans un milieu de culture stérile, évitant ainsi les problèmes de contamination par des souches toxiques comme cela peut- être observé pour des cultures de Spirulina platensis en raceway ou open ponds. Hormis une productivité et/ou une concentration en biomasse plus élevée, le mode de culture en fermenteur offre également plus de garanties d'un point de vue sanitaire.
Ainsi l'invention a pour objet premier un procédé de culture d'algues rouges unicellulaires (ARUs) de la classe des Cyanidiophyceae, avantageusement de l'ordre des Cyanidiales, très avantageusement des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, particulièrement des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très particulièrement des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria, préférentiellement de l'espèce Galdieria sulphuraria, utilisant un milieu comprenant au moins une source de carbone, et au moins une source de phosphore, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage.
De telles conditions de culture peuvent permettre d'atteindre une productivité en biomasse et/ou une concentration en biomasse plus importante des ARUs que la productivité en biomasse et/ou la concentration obtenue(s) dans les cultures décrites dans l'art antérieur, peuvent permettre d'obtenir une quantité de ladite biomasse plus grandes qu'une quantité de biomasse obtenue dans les cultures décrites dans l'art antérieur et peuvent favoriser une production de protéines par ladite biomasse pouvant atteindre jusqu'à 51 % de la matière sèche voire plus.
Selon l'invention, l'étape d'éclairage du procédé peut être réalisée à l'aide d'une lumière blanche ou, avantageusement, d'une lumière bleue. En effet, la Demanderesse a mis en évidence le fait que la culture des ARUs, au sens de l'invention, en lumière bleue favorise la production de phycocyanine par rapport à la même culture mais en lumière blanche. Ainsi selon une variante de l'invention l'étape d'éclairage du procédé peut être réalisée à l'aide d'une lumière bleue.
Selon l'invention, par lumière bleue on entend un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm, préférentiellement entre 420 nm et 500 nm. Un tel rayonnement peut permettre d'obtenir une biomasse riche en phycocyanine et en agents antioxydants, particulièrement en caroténoïdes. Selon une variante de l'invention ledit spectre peut être centré à 455 nm et ne pas s'étendre au-delà de 25 nm de chaque côté. De préférence selon l'invention, la longueur d'onde choisie sera comprise entre 430 et 480 nm, très préférentiellement la longueur d'onde choisie sera de 455 nm.
Selon l'invention, l'éclairage peut être produit par tout moyen connu de l'homme du métier, notamment une ou plusieurs lampes, un ou plusieurs tubes, une ou plusieurs diodes électroluminescentes (DELs).
La Demanderesse a démontré que le procédé est encore plus efficace lorsque l'éclairage est réalisé par une ou plusieurs diode(s) électroluminescente(s) (DEL).
Ainsi, selon une variante de l'invention, l'éclairage peut être réalisé par une ou plusieurs DELs. Les DELs sont de préférence des DELs du commerce.
A titre d'exemple on citera les DEL provenant de chez Séoul Optodevice Co., LTD (Corée du Sud), de chez Nichia Corporation (Japon), ou encore de chez SunLED Corporation (Etats-Unis).
Selon le procédé de l'invention la culture peut être soumise au rayonnement lumineux pendant un temps suffisant correspondant au moins au temps nécessaire pour que les critères de taux de croissance, de phycocyanine et/ou de caroténoïdes désirés soient remplis. L'homme du métier saura sans expérimentation excessive juger de ce temps nécessaire. Il saura adapter ce temps grâce à ses connaissances du domaine.
Plus particulièrement, les conditions de mixotrophie peuvent être obtenues dans des conditions d'éclairage discontinu et/ou variable au cours du temps.
Par éclairage discontinu, il faut entendre un éclairage ponctué par des périodes d'obscurité. L'éclairage peut être notamment sous forme de flashs. Un flash, au sens de l'invention, est un éclairage lumineux de durée donnée.
Selon l'invention, 3 notions sont à considérer à propos de l'éclairage: la fréquence ou le nombre de flashs par unité de temps, la durée du flash et l'intensité de la lumière émise.
En termes de fréquence selon l'invention, on définit, selon le nombre de flashs par unité de temps utilisé dans le procédé selon l'invention deux types d'éclairage :
- un éclairage à basse fréquence dont le nombre de flashs peut être compris entre environ 2 et 3,6 104 par heure (5,4.10"4 Hz à 10 Hz), préférentiellement entre 3 et 3,6 103 par heure (8,3.10"4 Hz à 1 Hz). On entend bien ici que le nombre de flashs par heure peut prendre toutes les valeurs comprises entre 2 et 36000 sans qu'il soit nécessaire de toutes les citer (2, 3, 4,..., 35598, 35599, 36000) ;
- un éclairage à haute fréquence dont le nombre de flashs peut être compris entre environ 3,6 x104 et 5,4 x 109 (10 Hz à 1 ,5.106 Hz) par heure, préférentiellement entre 3,6x105 et 5,4x109 (100 Hz à 1 ,5.106 Hz). On entend bien ici que le nombre de flashs par heure peut prendre toutes les valeurs comprises entre 3,6 x105 et 5,4 x 109 sans qu'il soit nécessaire de toutes les citer (36000, 36001 , 36002,..., 5399999998, 5399999999, 5400000000).
En termes de durée selon l'invention, quelle que soit la fréquence d'éclairage choisie, la durée du flash peut être comprise entre 1/150000 de seconde et 1799 secondes (29 minutes et 59 secondes).
Bien évidement lorsque l'on utilise un éclairage à haute fréquence la durée du flash pourra être préférentiellement comprise entre 1/150000 de seconde et 1/10 de seconde.
Et lorsque l'on utilise un éclairage à basse fréquence la durée du flash pourra être préférentiellement comprise entre 1/10 de seconde et 1799 secondes (29 minutes et 59 sec).
En termes d'intensité lumineuse selon l'invention, l'intensité de la lumière apportée sous forme de flashs peut être comprise entre 5 et 5000 μηηοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 500 μηηοΙ. m"2, s"1, ou 50 et 400 μηηοΙ. m"2, s"1, et plus préférentiellement entre 150 et 300 μηιοΙ. m"2, s"1 (1 μηηοΙ. nr2. s"1 correspond à 1 μΕ m'2, s"1 (Einstein), unité souvent utilisée dans la littérature).
Selon l'invention le nombre de flashs par heure peut être choisi en fonction de l'intensité et de la durée des flashs (voir ci-dessus).
Selon l'invention les notions de fréquence, de durée et d'intensité lumineuse s'appliquent à l'éclairage tel que le prévoit l'invention, c'est-à-dire à l'éclairage produit par la source lumineuse choisie, avantageusement par une DEL, émettant un rayonnement lumineux de spectre étroit compris entre 400 et 550 nm de préférence 420 et 500 nm, encore plus préférentiellement comprise entre 430 et 480 nm, très préférentiellement centré à 455 nm et pendant les temps considérés selon l'invention.
Une forme préférée de l'invention pourra être un procédé selon l'invention dans lequel l'apport d'éclairage peut être réalisé sous la forme d'une lumière discontinue sous forme de flashs, obtenue avec des DELs émettant un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 nm et 550 nm, préférentiellement entre 420 nm et 500 nm, encore plus préférentiellement comprise entre 430 et 480 nm, très préférentiellement de longueur d'onde de 455nm.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, l'éclairage peut être variable, ce qui signifie que l'éclairage n'est pas interrompu par des phases d'obscurité, mais que l'intensité lumineuse varie au cours du temps. Cette variation de l'intensité de lumière peut être régulière ou non, et peut être périodique ou cyclique. Selon l'invention, on peut aussi procéder à un apport lumineux alliant des phases d'éclairage continues et des phases d'éclairage discontinues.
Par éclairage variable, on entend que l'intensité de la lumière varie de manière régulière au moins deux fois par heure. Un exemple des conditions d'éclairage adaptées à la méthode de l'invention est décrit dans la demande WO 2012/035262.
L'éclairage peut présenter, de préférence, des variations d'intensité dont l'amplitude peut être généralement comprise entre 5 μηηοΙ. m"2, s"1 et 2000 μηηοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 50 et 1500 μιτιοΙ. m"2, s"1, plus préférentiellement entre 50 et 200 μηηοΙ. m"2, s"1.
Selon un mode de réalisation préféré, l'éclairage peut présenter des variations d'intensité dont l'amplitude peut être comprise entre 5 et 1000 μιτιοΙ. m"2, s"1, de préférence entre 5 et 400 μιτιοΙ. m"2, s"1, ces variations pouvant avoir lieu entre 2 et 3600 fois par heure, de préférence entre 2 et 200 fois par heure. Ces conditions de culture permettent d'apporter une quantité définie de lumière. Cet apport lumineux peut comporter des phases d'éclairage discontinu et/ou variable, avec des variations d'intensité pouvant avoir des amplitudes identiques ou différentes.
Selon l'invention, les conditions de culture des souches d'ARUs pourront être les conditions connues et utilisées dans l'art antérieur pour cultiver les souches retenues, conditions auxquelles une étape d'éclairage aura été ajoutée. Avantageusement, on utilisera les conditions qui permettront d'obtenir la meilleure productivité en biomasse /et/ou la meilleure concentration en biomasse.
L'homme du métier saura intégrer l'étape d'éclairage selon l'invention dans un procédé connu, afin une biomasse qui réponde aux critères selon l'invention en taux de croissance et en taux de métabolites d'intérêt, particulièrement en taux de caroténoïdes et/ou de phycobiliprotéines, recherchés. A cet égard, on pourra citer les procédés décrits par Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger (opus cit.).
Les procédés permettant d'obtenir une productivité en biomasse ou une concentration en biomasse important pourront être privilégiés. Comme exemple de procédé on pourra citer celui décrit par exemple par Graverholt et coll., [Appl. Microbiol. Biotechnol. (2007) 77:69-75].
Plus particulièrement cette étape pourra être intégrée dans les procédés décrits par la demanderesse dans la demande WO2012/035262.
Selon l'invention, la culture peut être réalisée par toute technique de culture connue, par exemple en fioles ou en réacteur, mais aussi en fermenteurs ou encore dans tout contenant apte à la croissance de ARUs comme par exemple des bassins de type "raceway/openpond", à condition que ladite technique permette de mettre en contact les ARUs avec au moins la source carbonée, et en outre soit équipée d'au moins une source de lumière émettant dans les longueurs d'onde présentant un spectre étroit comprise entre 400 nm et 550 nm, de préférence comprise entre 430 et 480 nm, très préférentiellement centrée à 455 nm, dont l'action sur la culture pourra conduire à la composition macroscopique de biomasse désirée c'est-à-dire une biomasse riche en phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) avec des teneurs intracellulaires comprises entre 29 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 35 et 150 mg/g de matière sèche et éventuellement riche en agents antioxydants en particulier en caroténoïdes, avantageusement de la zéaxanthine et du β-carotène, en teneurs comprises entre 0,1 et 10 mg/g, avantageusement entre 0,250 et 1 mg/g. Ces performances de productivité en biomasse sèche/ou en concentration en biomasse sèche et de teneur intracellulaire en phycobiliprotéines et en caroténoïdes peuvent être également atteintes en bioréacteurs de 1 m3, 4 m3, 10 m3 et 200 m3, qui sont des volumes couramment utilisés en production industrielle.
La Demanderesse a en outre pu montrer que dans le cas d'une culture discontinue lorsque les concentrations du carbone (C) et du phosphore (P) dans le milieu de culture initial sont telles que le rapport P/C de ces concentrations (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) est inférieur à 0.01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131 , alors la teneur intracellulaire en phycocyanine de la biomasse est augmentée par rapport à la teneur intracellulaire en phycocyanine d'une biomasse obtenue dans les conditions standard de l'art antérieur .
De même en culture alimentée de type discontinue ou continue, la Demanderesse a pu montrer que lorsque les quantités consommées de phosphore et de carbone sont telles que le rapport P/C de ces quantités consommées (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) de ces quantités consommées est inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,002637, très préférentiellement inférieur à 0,00131 , alors la teneur de phycocyanine de la biomasse est augmentée.
Selon l'invention, les sources de phosphore peuvent être choisies parmi les espèces suivantes : l'acide phosphorique, les sels de phosphore, avantageusement de l'hydrogénophosphore de sodium (Na2HP04), ou du dihydrogénophosphore de sodium (NahbPC ), ou du dihydrogénophosphore de potassium (KH2PO4), ou de l'hydrogénophosphore de potassium (K2HPO4), ou tout mélange, en toute proportion d'au moins deux de ces sources.
Selon l'invention, les sources de carbone peuvent être choisies parmi les espèces suivantes : glucose, glycérol, acétate, saccharose ou tout mélange en toute proportion d'au moins deux de ces sources.
Ainsi l'invention a aussi pour objet un procédé de culture d'ARUs de la classe des Cyanidiophyceae, avantageusement de l'ordre des Cyanidiales, très avantageusement des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, particulièrement des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très particulièrement des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caidarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria, préférentiellement de l'espèce Galdieria sulphuraria, dans un milieu comprenant au moins une source de carbone, et au moins une source de phosphore, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage.
Selon une première variante du procédé selon l'invention, dans le cas d'une culture discontinue, les concentrations en carbone et en phosphore dans le milieu de culture initial peuvent être telles que le rapport P/C de ces concentrations (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131 .
Selon une deuxième variante du procédé selon l'invention, dans le cas d'une culture alimentée de type discontinue ou continue, les quantités consommées en carbone et phosphore au cours de la culture peuvent être telles que le rapport P/C de ces quantités consommées (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131 .
Selon des variantes préférées du procédé selon l'invention, celui-ci peut être réalisé selon les variantes décrites ci-dessus mais comprenant en outre au moins une étape d'éclairage réalisée à l'aide d'une lumière bleue.
Ainsi selon encore une autre variante préférée du procédé selon l'invention, dans le cas d'une culture discontinue, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage réalisée à l'aide d'une lumière bleue, les concentrations en carbone et en phosphore dans le milieu de culture initial peuvent être telles que le rapport P/C de ces concentrations (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131.
Et selon encore une autre variante préférée du procédé selon l'invention, dans le cas d'une culture alimentée de type discontinue ou continue, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage réalisée à l'aide d'une lumière bleue, les quantités consommées en carbone et phosphore au cours de la culture peuvent être telles que le rapport P/C de ces quantités consommées (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) peut être inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131. Selon ces variantes les conditions d'éclairage par la lumière bleue peuvent être celles décrites précédemment.
Avantageusement selon l'invention le procédé peut comprendre, simultanément ou indépendamment, toute autre étape nécessaire à la croissance de la biomasse ou à la production des molécules d'intérêt (phycocyanine et caroténoïdes) comme par exemple sans être limitatif une ou plusieurs étape(s) de culture sans lumière ou encore une ou plusieurs étape(s) de récupération de la biomasse.
D'une manière générale selon l'invention, la culture selon le procédé pourra s'effectuer à une température comprise entre 15°C et 47°C, avantageusement entre 22°C et 42°C.
Selon l'invention le procédé de culture peut être utilisé pour cultiver une seule souche d'ARUs d'un genre donné, plusieurs souches d'un seul genre donné, ou plusieurs souches de genres différents donnés (au moins 2 espèces de 2 genres différents).
Selon l'invention la source carbonée peut être choisie parmi toute source carbonée connue et utilisable selon la souche choisie. L'homme du métier saura sans difficulté choisir la source carbonée la mieux adaptée à la souche à cultiver. A titre d'exemple on peut citer entre autre comme source carbonée utilisable le glucose, le saccharose, l'acétate ou encore le glycérol [Wolfgang Gross and Claus Schnarrenberger, opus cit.].
Le substrat carboné organique contenu dans le milieu de culture peut consister en des molécules complexes ou en un mélange de substrats. Les produits issus de la biotransformation de l'amidon, par exemple à partir de maïs, de blé ou de pomme de terre, notamment les hydrolysats de l'amidon, qui sont constitués de molécules de petite taille, constituent, par exemple, des substrats carbonés organiques adaptés à la culture en mixotrophie des cellules selon l'invention.
Les quantités de sources carbonées utilisées selon le procédé dépendront bien évidement de la souche choisie. L'homme du métier saura là encore sans difficulté adapter les quantités de source carbonée à la souche à cultiver sous forme pure ou en mélange.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le substrat carboné organique pourra avoir une concentration comprise entre 5 mM et 1 ,5 M, de préférence 50 mM et 800 mM.
Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre une étape de récupération des ARUs. Ladite récupération des ARUs peut être réalisée par toute technique permettant la récupération de la biomasse, notamment les méthodes de filtration, gravimétrique ou sous pression réduite, de décantation, ou bien encore des méthodes de précipitation suivie d'une filtration gravimétrique. L'invention concerne également la biomasse susceptible d'être obtenue par l'une quelconque des variantes du procédé selon l'invention.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une densité en ARUs d'au moins 20 g/L et jusqu'à environ 200 g/L de matière sèche, préférentiellement d'au moins 50 g/L de matière sèche, plus préférentiellement d'au moins 90 g/L de matière sèche et jusqu'à environ 150 g/L de matière sèche.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en phycobiliprotéines (phycocyanine et allophycocyanine) avec des teneurs intracellulaires comprises entre 29 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 35 et 150 mg/g de matière sèche.
Selon l'invention encore ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en phycocyanine comprise entre 29 et 200 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 40 et 100 mg/g de matière sèche.
Selon l'invention les phycobiliprotéines, et particulièrement la phycocyanine, produites par ladite biomasse peuvent être extraites pour être utilisées par exemple dans l'alimentation ou encore comme colorant. L'extraction des phycobiliprotéines, et particulièrement de la phycocyanine, à partir de ladite biomasse peut se faire selon toute technique d'extraction connue de l'homme du métier comme par exemple celle décrite par Moon et coll., 2014 (Myounghoon, Sanjiv K Mishra, Chul Woong Kim, William I Suh, Min S Park, and Ji-Won Yang. "Isolation and Characterization of Thermostable Phycocyanin from Galdieria Sulphuraria" 31 (2014): 1-6) ou par Jouen et coll., 1999 (Jaouen, P., B. Lepine, N. Rossignol, R. Royer, and F. Quemeneur. "Clarification and Concentration with Membrane Technology of a Phycocyanin Solution Extracted from Spirulina Platensis." Biotec nology Techniques 13, no. 12 (December 1999): 877-81. doi:10.1023/A:1008980424219.) ou dans le brevet FR2789399A1 .
L'invention concerne donc aussi un procédé de préparation de phycocyanines qui comprend les étapes suivantes :
a) cultiver des ARUS de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu de culture comprenant au moins une source de carbone avec au moins une étape d'éclairage sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm, pour obtenir un mout de fermentation comprenant lesdites ARUs dans le milieux de culture, à une densité cellulaire d'au moins 20 g/L de matière sèche, tel que défini précédemment et ci-après,
b) récupérer la biomasse obtenue à partir du mout de fermentation,
c) récupérer les phycocyanines à partir de la biomasse. La phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de ladite biomasse présente des propriétés différentes notables par rapport à la phycocyanine susceptible d'être obtenue par culture d'autre organisme, particulièrement par exemple par rapport à la phycocyanine susceptible d'être obtenue par culture de spiruline.
Ladite phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria sulphuraria, peut présenter une coloration bleue, pas ou peu altérée dans une solution dont le pH est compris entre 2 et 8, préférentiellement entre 3 et 7, très préférentiellement entre 4 et 5.
De plus, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria sulphuraria, peut présenter l'avantage de peu ou pas précipiter à pH acide, particulièrement à un pH compris entre 2 et 4, contrairement à la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir d'une biomasse de spiruline. Cette propriété fait de la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria sulphuraria, un excellent candidat pour une utilisation dans des boissons acides, gazeuses ou non gazeuses.
De plus, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria sulphuraria, peut présenter une thermostabilité améliorée par rapport à celle à la phycocyanine extraite de spiruline pour des températures supérieures à 50°C (Moon et al., 2014).
Enfin, la phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse obtenue selon l'invention, particulièrement à partir d'une biomasse de Galdieria sulphuraria, peut présenter une résistance à l'éthanol améliorée par rapport à la phycocyanine de spiruline.
Selon l'invention on entend par "résistance de la phycocyanine", (au pH acide, à la température et/ou à l'éthanol) une absence de perte de coloration ou une perte de coloration inférieure à ce qui est décrit pour la phycocyanine extraite de Spirulina platensis. La quantification de l'altération de la couleur peut se mesurer au spectrophotomètre en comparant l'absorbance d'une solution aqueuse dans des conditions standard de température et de pH, comme décrit par Moon (2014), puis de comparé ces résultats à ceux obtenues des conditions de température élevée, pH acide ou alcalin, et/ou en cas d'ajout d'éthanol dans la solution par exemple.
Ainsi l'invention concerne également de la phycocyanine susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'invention, ladite phycocyanine pouvant être résistante à une température comprise entre 70°C et 0°C, préférentiellement entre 65°C et 25°C, très préférentiellement entre 60°C et 50°C, et/ou résistante à un pH compris entre 8 et 2, préférentiellement compris entre 3 et 7, très préférentiellement compris entre 4 et 5, et/ou résistante à une concentration en éthanol comprise entre 50% et 1 %, préférentiellement de comprise entre 40% et 10%, très préférentiellement comprise entre 20 et 30%
L'invention concerne également l'utilisation de la phycocyanine susceptible d'être obtenue selon le procédé de l'invention, dans l'alimentation, animale ou humaine, comme complément alimentaire, ou encore comme colorant, particulièrement comme colorant alimentaire.
Le tourteau susceptible d'être obtenu après extraction de la phycocyanine à partir de la biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention peut être utilisé comme complément alimentaire riche en protéines et caroténoïdes, dans l'alimentation humaine ou animale.
Selon l'invention ladite biomasse peut présenter une teneur intracellulaire en caroténoïdes comprise entre 0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,250 et 1 mg/g de matière sèche.
Les ARUs présentent un potentiel d'utilisation important dans beaucoup de domaines dont on citera par exemple, l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique, la médecine.
Selon l'invention, ladite biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention peut être utilisée après récolte soit directement, éventuellement séchée, soit après transformation. En particulier ladite biomasse peut être utilisée sous la forme de farines entrant dans des compositions alimentaires ou sous forme de compléments alimentaires.
La biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention peut être transformée en farine selon tout procédé connu de l'homme du métier. On peut ainsi envisager par exemple que les ARUs puissent être séparées du milieu de culture, lysées et réduites en particules fines (diamètre moyen de 10 microns), puis séchées.
L'invention concerne également toute utilisation de la biomasse d'ARUs susceptible d'être obtenue selon l'invention dans tout domaine connu d'utilisation des ARUs, particulièrement, l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique, la médecine.
La biomasse obtenue après culture de ARUs selon le procédé de l'invention peut permettre d'obtenir en particulier une farine riche en agents antioxydants, en particulier en caroténoïdes (particulièrement zéaxanthine et β-carotènes) en teneurs comprises entre 0,1 et 10 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,25 et 1 mg/g de matière sèche dont en particulier de la zéaxanthine en une teneur comprise entre 0,05 et 5 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,1 et 1 mg/g de matière sèche, et/ou du β- carotène en une teneur 0,05 et 5 mg/g de matière sèche, avantageusement entre 0,1 et 1 mg/g de matière sèche, répondant à un besoin en particulièrement dans l'industrie alimentaire, parce que plus appétentes, ayant meilleur goût, apportant des antioxydants en quantité importante et pouvant être utilisable dans l'alimentation animale ou humaine.
L'invention concerne donc une farine susceptible d'être obtenue après transformation de la biomasse en ARUs susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'invention.
Quelle que soit la forme d'utilisation du produit susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention (biomasse native ou transformée), ledit produit peut être utilisé pur ou mélangé à d'autres ingrédients classiquement utilisés, particulièrement en alimentation ou en cosmétique.
L'invention concerne également tout produit pouvant comprendre au moins de la biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention. L'invention concerne aussi tout produit pouvant comprendre au moins de la farine issue de la transformation de la biomasse d'algues susceptible d'être obtenue selon l'invention. DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 décrit l'optimisation de la croissance de Galdieria sulphuraria en Bioréacteur. Elle montre l'évolution de la concentration en biomasse en fonction du temps d'une souche de Galdieria sulphuraria selon le mode trophique de culture utilisé. Les résultats montrent que les conditions de mixotrophie (-0-) permettent d'obtenir une croissance de la souche plus rapide et nettement améliorée par rapport à des conditions d'hétérotrophie (-♦-). Cette courbe montre également que la concentration en biomasse sèche est nettement supérieure en fin de culture avec des conditions de mixotrophie qu'avec les conditions d'hétérotrophie.
La Figure 2 montre l'effet de la lumière bleue sur la croissance et la production de pigments.
o La figure 2A montre la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de matière sèche (DW) (j) et la concentration cellulaire de la biomasse estimée par mesure de la densité optique à 800nm ([]). L'essai a été réalisé en lumière blanche et en lumière bleue. Les mesures ont été faites à 180h et 250h.
o La figure 2B montre la quantité de chlorophylle (|), de β-carotène (0) et de zéaxanthine (0) dans les mêmes cultures, en lumière blanche et en lumière bleue, à 180h et 250h.
La Figure 3 montre l'effet de l'azote et du phosphore sur la croissance et la production de phycocyanine. Elle montre les résultats obtenus lors de l'essai visant à tester l'influence de la concentration en azote (Figure 3A et 3B), la concentration en phosphore (Figure 3C et 3D) sur les cultures de Galdieria sulphuraria. Les figures 3A et 3C sont la représentation de la croissance de la souche en fonction du temps en présence de 1 (-Δ-), 2 (-□-), 4 (-O-) et 8 (-♦-) g/L de sulfate d'ammonium (Figure 3A) ou de 250 (-Δ-), 500 (-□-), 1000 (-O-) et 2000 (-♦-) mg de KH2P04 (Figure 3C).
Les Figures 3B et 3D représentent la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de matière sèche dans les souches des cultures en présence de 1 ((), 2 (§), 4 ([[) et 8 ([[) g/L (NH4)2S04, à 250 h (Figure 3B) ou de 250 (|), 500 (|), 1000 ([]) et 2000 ([]) mg de Phosphore de KH2PO4 (Figure 3D).
La Figure 4 montre les effets combinés de la lumière bleue et de la limitation en phosphore sur la production de pigments sur des cultures de Galdieria sulphuraria. Elle montre en A la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de matière sèche obtenue dans les différentes conditions testées. La figure 4B montre les teneurs intracellulaires en chlorophylle (1), en β-carotène (@) et en zéaxanthine (0) dans les mêmes cultures.
La Figure 5 montre le suivi de culture en Fermenteur en mode continu avec contre- pales lumineuses bleues (455 nm)
o En A le suivi de croissance de la souche de Galdieria sulphuraria en fermenteur par mesure d'absorbance à 800 nm, et par mesure de masse sèche par litre de moût.
o En B montre la teneur intracellulaire en phycocyanine exprimée en mg/g de matière sèche (MS)
La Figure 6 montre les caractéristiques physicochimiques de la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria comparée à la phycocyanine extraite de Spirulina platensis. (A) Test de résistance au pH, (B) Résistance à la température. (C) Résistance à l'éthanol:
o En A que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une bonne résistance au pH : moins de 20 % de perte de pigmentation jusqu'à pH 2.75, la perte devenant plus importante jusqu'à pH 2.
o En B que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une bonne résistance à la température : plus de 40% de pigmentation restante après 30 minutes à 70°C.
o En C que la phycocyanine extraite de Galdieria sulphuraria présente une bonne résistance à l'éthanol : 40 % de perte de pigmentation à 30 % d'éthanol, environ 70% à 50% d'éthanol. EXEMPLES
Exemple 1 : Optimisation de la croissance en Fermenteur.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture
Hétérotrophie et Mixotrophie : 30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 716mg/L MgS04, 44mg/L CaCI2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeS04 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4 ml/L de solution de trace métal (3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuS04,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaV03, 4H20 ; 1 ,820g/L MnCI2 ; 0,040g/L CoCI2,6H20 ; 0,220g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024! 4H20).
Conditions de culture :
Les cultures sont réalisées dans des réacteurs de 1 à 2 L de volume utile avec automates dédiés et supervision par station informatique. Le pH de la culture est régulé via l'ajout de base (solution d'ammoniaque 14% (w NH3/w) et/ou d'acide (solution d'acide sulfurique 4N). La température de culture est fixée à 42 °C. L'agitation est réalisée grâce à 3 mobiles d'agitation : 1 turbine Rushton à 6 pâles droites positionnée à l'extrémité inférieure de l'arbre d'agitation au-dessus du "sparger" et 2 hélices tripâles HTPG2 placés sur l'arbre d'agitation. La pression en oxygène dissous dans la phase liquide est régulée dans le milieu tout au long de la culture, par la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation (250-1800 t/min), le débit de ventilation par l'air et/ou d'oxygène. Les paramètres de régulation, intégrés dans l'automate de supervision, permettent de maintenir une pression partielle en oxygène dissous dans la phase liquide comprise entre 5 et 30 % de la valeur de saturation par l'air dans des conditions identiques de température, de pression et de composition du milieu. Le temps de culture a été compris entre 50 et 300 heures.
Afin de d'optimiser la croissance des souches d'ARUs différents modes trophiques ont été testés :
- l'hétérotrophie (-♦-) Le substrat glycérol est apporté par une conduite de type discontinue alimentée. Aucun apport de lumière n'est réalisé.
- la mixotrophie (-0-) : Le substrat glycérol est apporté par une conduite de type discontinue alimentée et un apport de lumière est réalisé.
- Résultats
Les performances en fin de croissance des différentes conditions sont résumées dans le tableau 1 suivant Mixotrophie Hétérotrophie
Temps (h) 100 350
Concentration cellulaire (g biomasse sèche/L) 98 68
Rendement (g/ g de substrat carboné) 0,5 0,5
Productivité (g biomasse sèche/L/h) 0,98 0,19
Tableau 1
La culture en Mixotrophie permet d'obtenir plus rapidement une concentration en biomasse supérieure à celles obtenues avec des cultures en mode hétérotrophe ou autotrophe.
La productivité de biomasse en mixotrophie est de 0,98 g biomasse/L/h, contre 0,19 g biomasse/L/h en hétérotrophie. On note que dans l'art antérieur Graverholt et collaborateurs, ont obtenu une productivité de 0,286 g/L/h en hétérotrophie [Graverholt et col., opus cit.].
Les résultats sont présentés à la figure 1.
En plus d'une croissance plus rapide, la présence de lumière permet de favoriser la production de protéines dans les cellules, celle-ci pouvant atteindre 51 ,56 % de la matière sèche en mixotrophie contre 29,57 % en hétérotrophie (Tableau 2 : Analyses du contenu en acide aminé de biomasse de G. sulphuraria ou de S. platensis).
Figure imgf000022_0001
Tableau 2 : A) et B) : Contenu en acides aminés de Galdieria sulphuraria cultivée en conditions de mixotrophie (A) et d'hétérotrophie (B). Le contenu protéique estimé par la méthode de Kjeldahl a été estimé à 51.5% et 37% respectivement avec un facteur N- 6.25x. C) : Contenu en acides aminés d'un échantillon de Spirulina platensis commerciale. Le contenu protéique estimé par la méthode de Kjeldahl a été estimé à 65% avec un facteur N-6.25x. Le contenu élevé en protéines de Galdieria sulphuraria en fait un bon candidat pour entrer dans la préparation de compléments alimentaires et ainsi concurrencer la spiruline sur ce marché car son aminoscore est supérieur à celui recommandé par la FAO et ses scores sont supérieurs à ceux de la spiruline pour 4 des 7 acides aminés essentiels pour la nutrition humaine (Tableau. 3) :
Figure imgf000023_0001
Tableau. 3 : Aminoscores comparant l'apport journalier recommandé par la FAO et les quantités apportés par les souches de cette étude (mg/g de protéines) (adapté de la recommandation 92 nourriture et nutrition de la FAO.
Exemple 2 : Effet de la lumière bleue sur la production de phycocyanine en fioles d'Erlenmeyer sur la souche Galdieria sulphuraria.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (ou Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2S04, 1 g/L KH2P04, 716mg/L MgS04, 44mg/L CaCI2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeS0 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4 ml/L de solution de trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuS04,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaVOs, 4H20 ; 1 ,820g/L MnCI2 ; 0,040g/L CoCI2,6H20 ; 0,220g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Conditions de culture ;
Dans chaque fiole d'Erlenmeyer 100 mL de milieu sont inoculés à 0,1 % (v/v) avec une pré-culture âgée de 240h. Pour tester l'effet de la lumière combinée à la concentration en phosphore, on illumine de façon indépendante les fioles d'Erlenmeyer avec un système de LED blanche ou de LED bleue (455 nm). L'intensité lumineuse pour chacune des conditions est de 100 μηηοΙ nr2 s"1. Les cellules sont cultivées à une température de 42°C sous agitation modérée (200 tours/minute). Le suivi de la croissance des cellules est effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm. Lorsque la phase de stationnaire est atteinte (environ 190h) 50 mL de suspension cellulaire sont prélevés afin d'effectuer une mesure de masse sèche par filtration, des mesures de concentration en phosphore dans le milieu grâce à une mesure par Reflectoquant® (méthodes connue de l'homme du métier).
L'estimation de la teneur intracellulaire en phycocyanine par gramme de matière sèche a été réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite par Moon et collaborateur [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1 -6] (A). Les autres pigments comme la chlorophylle et les caroténoïdes ont été estimés par une méthode de dosage par HPLC connue de l'homme du métier (B).
Résultats
Cet essai montre que déjà à 180h la concentration en phycocyanine est 300% plus élevée en lumière bleue qu'en lumière blanche (Fig. 2A). A 250h cette différence bien que significative n'est plus que de 25%.
En analysant le contenu en phosphore du milieu à 250h, on constate qu'il en reste environ 100 mg/L pour les Erlenmeyers en lumière bleue alors qu'en lumière blanche il reste 5 mg/L et que nous sommes en dessous des valeurs en phosphore du milieu induisant la production phycocyanine comme nous le verrons plus tard dans le point 3. A 180h les souches ne contiennent pas de chlorophylle mais déjà du β-carotène et de la zéaxanthine (Fig. 2B).
Des essais avec des longueurs de lumière bleue de 475 nm montrent un effet similaire à celle de 455 nm ; il est donc envisageable d'utiliser toute la plage de longueur d'onde de lumière bleue pour favoriser la production de phycocyanine.
A part la lumière blanche seul la lumière bleue a permis d'obtenir une croissance de la souche avec production de phycocyanine.
L'exposition à la lumière bleue permet une croissance plus ou moins équivalente à celle observée en lumière blanche, avec une augmentation importante de la teneur intracellulaire de PC par gramme de masse sèche (Figure 2).
Exemple 3 : Effet de la composition du milieu de culture sur la production de phycocyanine.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (aussi appelée Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
Pour tester l'effet de la concentration en phosphore on effectue un suivi des cultures sur 4 milieux différents. Ces milieux sont composés d'une même base :
30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2S04, 716mg/L MgS04, 44mg/L CaCI2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeS0 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4 ml/L de solution de trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuS04,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaVOs, 4H20 ; 1 ,820g/L MnCI2 ; 0,040g/L CoCI2,6H20 ; 0,220g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Pour la limitation en phosphore on impose des concentrations en KH2P04 de 250mg/L, 500mg/L, 1 g/L, et 2g/L. Une fois les milieux assemblés, on ajuste le pH à 3 avec du H2S04 36N puis on les stérilise. Le même protocole est appliqué pour les milieux ou la concentration en azote varie, cette fois ci en gardant la concentration en KH2PO4 à une valeur initiale de 1 g/l.
Conditions de culture ;
Dans chaque fiole d'Erlenmeyer 100 ml de milieu sont inoculés à 0,1 % avec une préculture âgée de 240h. Les cellules sont cultivées à une température de 42°C sous agitation modérée (140 tours/minute) avec un éclairage constant par tube fluorescent (Osram 865 Cool Day light) à 100 μηηοΙ m"2 s"1. Le suivi de la croissance des cellules est effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm.
L'estimation de la teneur en phycocyanine par gramme de matière sèche a été réalisée à différents temps de culture grâce à la méthode décrite par Moon et collaborateur [Moon et al., Korean J. Chem. Eng., 2014, 1 -6] (A). Les autres pigments comme la chlorophylle et les caroténoïdes ont été estimés par une méthode de dosage par HPLC connue de l'homme du métier (B).
Résultats :
La figure 3 présente les résultats de ces essais
(A) Croissance de la souche en présence de différentes concentration en (NhU^SC dans le milieu initial.
(B) Estimation de la teneur intracellulaire en phycocyanine dans la biomasse en fin de culture ;
(C) Croissance de la souche en présence de différentes concentrations en KH2PO4 dans le milieu initial ;
(D) Estimation de la quantité de PC dans la biomasse à 180h et 250h :
Pour ces expériences les cellules sont éclairées par de la lumière blanche (100 μ E m"2, s"1).
Hormis, l'ajout de quantités importantes d'azotes dans le milieu culture visant à favoriser la production de phycocyanine, la Demanderesse a pu mettre en évidence que la quantité de phosphore dans le milieu est prépondérante pour la production de phycobiliprotéines et de caroténoïdes (Figure 3).
La Demanderesse a pu déterminer que pour des croissances équivalente (Figure 3C), c'est à dire que pour des concentrations en phosphore non restrictives, la production de phycocyanine était supérieure dans un milieu contenant 250 mg/l de KH2PO4 (soit 0.0025 mole de phosphore/L) à celle obtenue dans un milieu contenant 2 g/l de KH2PO4 (soit mole de phosphore/L) (Figure 3B).
De façon linéaire plus la concentration en phosphore dans le milieu initial est importante pour une concentration dans le milieu initial en source de carbone fixe, plus la teneur intracellulaire en phycocyanine diminue, et inversement. Autrement dit, plus le rapport P/C des concentrations initiales dans le milieu (exprimé en mole de phosphore/mole de carbone) est important, plus la teneur intracellulaire en phycocyanine et en caroténoïdes dans la biomasse augmente.
De ce fait, le procédé de culture discontinue vise à maintenir un niveau de phosphore dans le milieu permettant de combiner croissance et production de phycobiliprotéines et de caroténoïdes, en déterminant une gamme de concentration en phosphore" idéale. Contrairement à ce qui a été décrit dans la demande internationale WO2015107312 pour les chlorelles, la carence en phosphore n'induit pas une augmentation de la teneur en protéines de façon globale chez Galdieria sulphuraria. Selon nos résultats la concentration en phycobiliprotéines augmente alors que la teneur en protéines de la biomasse (AA%) reste stable.
Exemple 4 : Effets combinés de la lumière bleue et de la concentration en phosphore sur la production de phycocyanines et de caroténoïdes.
Matériel et méthodes
Souche : Galdieria sulphuraria (ou Cyanidium caldarium) UTEX#2919
Milieu de culture :
30 g/L glycérol, 8 g/L (NH4)2S04, 716mg/L MgS04, 44mg/L CaCI2, 3 mL/L de solution stock Fe-EDTA (FeS0 à 6,9g/L et d'EDTA-Na2 à 9,3g/L ) et 4 ml/L de solution de trace métal ( 3,09g/L EDTA-Na2 ; 0,080g/L CuS04,5H20 ; 2,860g/L H3B03 ; 0,040g/L NaVOs, 4H20 ; 1 ,820g/L MnCI2 ; 0,040g/L CoCI2,6H20 ; 0,220g/L ZnS04,7H20 ; 0,017g/L Na2Se03 ; 0,030g/L (NH4)6Mo7024, 4H20).
Conditions de culture :
Une gamme de concentration en phosphore, sous forme de KH2P04, en présence de lumière bleue ou de lumière blanche a été utilisée pour faire croître des souches de
Galdieria sulphuraria en Erlenmeyer pendant 250h.
Figure imgf000026_0001
Dans chaque fiole d'Erlenemeyer 100 ml_ de milieu sont inoculés à 0,1 % (v/v) avec une pré-culture âgée de 240h. Pour tester l'effet de la lumière combinée à la concentration en phosphore, on illumine de façon indépendante les fioles d'Erlenmeyer avec un système de LED blanche ou de LED bleue (455 nm). L'intensité lumineuse pour chacune des conditions est de 100 μηηοΙ nr2 s"1. Les cellules sont cultivées à une température de 42°C sous agitation modérée (200 rpm). Le suivi de la croissance des cellules est effectué toutes les 24h par mesure d'absorbance à 800 nm. Résultats :
La figure 4 présente les résultats de ces essais
Visuellement les souches présentent une différence de coloration allant du vert bleu au jaune pâle en passant par le vert.
De façon similaire à ce qui a été décrit dans les expériences précédentes on retrouve l'effet positif de la lumière bleue et de la carence en phosphore.
Si l'on compare de façon croisée les données il apparaît clairement que la condition la plus favorable pour la production de pigments que ce soit de la phycocyanine, des caroténoïdes ou de la chlorophylle, est une culture en lumière bleue en présence de faible concentration de phosphore.
Le tableau 4 ci-dessous montre les concentrations des différents pigments dans la biomasse après 250 h de croissance.
Figure imgf000027_0001
*: (mg/g de matière sèche)
Tableau 4. Concentration des différents pigments dans la biomasse après 250 h de croissance.
Bien que significatif dans les deux cas, l'effet de la concentration en phosphore est beaucoup plus marqué en présence de lumière bleue que de lumière blanche, les concentrations pouvant être multipliées par deux pour la phycocyanine (Figure 4A et Tableau 4), par 4,5 pour les β-carotènes, et par 7 pour la zéaxanthine (Figure 4B et Tableau 4).
Exemple 5 : Effets combinés de la lumière bleue et de la concentration en phosphore sur la production de phycocyanines et de caroténoïdes en culture continue
Conditions de culture :
La souche Gladieria UTEX 2919 a été cultivée dans les conditions de l'exemple 1 , avec 500 mg de KH2P04 et une contre-pale bleue délivrant jusqu'à 3 Watts de puissance lumineuse à une longueur d'onde de 455 nm. Le milieu d'alimentation est dimensionné pour obtenir entre 60 et 65 g de matière sèche par litre de moût. La concentration de chaque élément du milieu est ajustée afin de respecter les ratios du milieu utilisé pour le pied de cuve décrit dans l'exemple 1.
Pour la première phase de culture correspondant a la culture en batch, fed batch et puis à la stabilisation au alentour de 60 g de MS/L, la lumière est maintenu à 50% de la puissance maximale. A partir de 600 heures de culture, considéré comme la phase de production, la puissance lumineuse est passé a 100% soit 3 Watts.
Figure 5 A: (-0-) suivi de croissance par matière sèche ; (-□-) suivi de croissance par mesure d'absorbance à 800 nm.
Figure 5 B: Mesure de l'évolution du contenu intracellulaire en phycocyanine au cours de la culture.
Résultats :
Après 3 semaines le régime de permanant de culture a été établi entre 60 et 65 g de MS par litre de moût (Figure 5A). Lorsque la puissance de lumière est augmenter à 600h s'en suit une augmentation progressive de la teneur en PC dans la biomasse jusqu'à atteindre 40 mg/g de MS. En moyenne la teneur en PC mesurée sur les 200 dernières heures culture reste proche de cette valeur.
Exemple 6 : Caractérisation physicochimique de la phycocyanine extraite de la souche Gladieria UTEX 2919 cultivée selon l'invention.
Protocoles des tests
La souche Gladieria UTEX 2919 a été cultivée dans les conditions de l'exemple 2.
Pour ces essais la phycocyanines a été extraite selon le protocole décrit par Moon et al., 2014 (op.citus). La phycocyanine mesure de couleur bleue se fait par mesure d'absorbance à 618 nm grâce à un spectrophotomètre (Amersham Biosciences Ultra Spec 2100 Pro). La perte de couleur exprimée en pourcentage se calcule de façon relative à la mesure de l'absorbance de l'échantillon dans les conditions de référence, pH 6 pour le test pH, 25°C pour le test de température, 0 % d'éthanol pour la résistance à l'alcool.
Pour le test de résistance en condition acide le pH est descendu de façon graduelle par ajout d'une solution d'acide citrique à la préparation de phycocyanine. Pour chaque valeur de pH un échantillon de la solution de phycocyanine est prélevé et son absorbance à 618 nm mesuré.
Pour les essais de résistance à la température la solution de phycocyanine est placée pendant 30 minutes dans un bain-marie préalablement chauffé à 70°C, après refroidissement à température ambiante l'absorbance de l'échantillon à 618 nm est mesurée.
Pour les essais de résistance à l'alcool, 1 volume de solution de phycocyanine est mélangé à 1 volume équivalent d'une solution d'éthanol à 0%, 40 %, 60% , 80%, et 100% pour obtenir au final une solution de phycocyanine contenant 0%, 20%, 30%, 40%, et 50% respectivement. Après 1 heure d'incubation une mesure d'absorbance à 618 nm est effectuée pour chaque mélange.
Résultats :
Les résultats de ces essais sont présentés à la figure 6
La figure 6A montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria sulphuraria
(UTEX 2919) présente encore plus de 80% de sa coloration à pH 2.75.
La figure 6B montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria sulphuraria (UTEX 2919) présente encore plus de 40% de sa coloration après 30 minutes d'incubation à 70°C.
La figure 6C montre que la phycocyanine extraite de la souche Galdieria sulphuraria
(UTEX 2919) présente encore plus de 30% de sa coloration après 1 heure d'incubation dans 40% d'éthanol.
Ces résultats peuvent être comparés à ceux décrits dans l'art antérieur pour la phycocyanine de spiruline (http://www.dlt-spl.co.jp/business/en/spirulina/linablue.htm.
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WO2012/035262

Claims

Procédé de culture d'algues rouges unicellulaires (ARUs) de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu comprenant au moins une source de carbone, ledit procédé comprenant au moins une étape d'éclairage sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm.
Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les ARUs sont de l'ordre des Cyanidiales, très avantageusement des familles des Cyanidiaceae ou des Galdieriaceae, particulièrement des genres Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, très particulièrement des espèces Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201 , Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou encore Galdieria sulphuraria, préférentiellement de l'espèce Galdieria sulphuraria.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, caractérisé en ce que l'éclairage est sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 420 nm et 500 nm, avantageusement entre 430 et 480 nm, très préférentiellement 455 nm.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la source carbonée est choisie parmi le glucose, du saccharose, de l'acétate ou encore du glycérol.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la source carbonée est à une concentration dans le milieu initial comprise entre 5 mM et 1 ,5 M, de préférence 50 mM et 800 mM.
Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que dans le cas d'une culture discontinue les concentrations en carbone et en phosphore dans le milieu de culture initial ou, dans le cas d'une culture alimentée de type discontinue ou continue les quantités consommées en carbone et phosphore au cours de la culture, peuvent être telles que le rapport P/C de ces concentrations exprimé en mole de phosphore/mole de carbone est inférieur à 0,01898, avantageusement inférieur à 0,01503, plus avantageusement inférieur à 0,01054, encore plus avantageusement inférieur à 0,00527, préférentiellement inférieur à 0,00263, très préférentiellement inférieur à 0,00131 .
7. Biomasse susceptible d'être obtenue par le procédé tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle présente une densité en ARUs comprise entre 20 et 200 g/l de matière sèche, préférentiellement entre 90 et 150 g/l de matière sèche.
8. Biomasse selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle présente une teneur en phycobiliprotéines (phycocyanine et allaophycocyanine) comprise entre 29 et 250 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 35 et 150 mg/g de matière sèche.
9. Biomasse selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle présente une teneur en phycocyanine comprise entre 29 et 200 mg/g de matière sèche, préférentiellement entre 40 et 100 mg/g de matière sèche.
10. Biomasse selon l'une quelconque des revendications 6 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend une phycocyanine présentant une coloration bleue pas ou peu altérée dans une solution dont le pH est compris entre 8 et 2, préférentiellement entre 7 et 3, très préférentiellement entre 4 et 5, et/ou présentant une coloration bleue pas ou peu altérée à des températures supérieures à 50°C et/ou présentant une coloration bleue pas ou peu altérée à l'éthanol.
1 1 . Procédé de préparation de phycocyanines qui comprend les étapes suivantes : a) cultiver des ARUS de la classe des Cyanidiophyceae, dans un milieu de culture comprenant au moins une source de carbone avec au moins une étape d'éclairage sous la forme d'un rayonnement présentant un spectre étroit de longueur d'onde comprise entre 400 et 550 nm, selon l'une des revendications 1 à 6, pour obtenir un mout de fermentation comprenant lesdites ARUs dans le milieu de culture, à une densité cellulaire d'au moins 20 g/L de matière sèche,
b) récupérer la biomasse obtenue à partir du mout de fermentation, et
c) récupérer les phycocyanies à partir de la biomasse.
12. Utilisation de la biomasse telle que décrite à l'une quelconque des revendications 6 à 10, pour l'alimentation humaine ou animale, la cosmétique.
13. Utilisation de la biomasse telle que décrite à l'une quelconque des revendications 6 à 10, pour la préparation de phycocyanine et/ou de caroténoïdes.
14. Produit comprenant au moins de la biomasse telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 7 à 12.
15. Phycocyanine susceptible d'être obtenue à partir de la biomasse telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 6 à 10 ou obtenue par le procédé selon la revendication 1 1 .
16. Utilisation de la phycocyanine telle que décrite à la revendication 15 en alimentation et/ou comme colorant.
17. Produit comprenant au moins de la phycocyanine telle que décrite à la revendication 15
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