[go: up one dir, main page]

WO2016006697A1 - アンチセンス抗悪性腫瘍剤 - Google Patents

アンチセンス抗悪性腫瘍剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2016006697A1
WO2016006697A1 PCT/JP2015/069947 JP2015069947W WO2016006697A1 WO 2016006697 A1 WO2016006697 A1 WO 2016006697A1 JP 2015069947 W JP2015069947 W JP 2015069947W WO 2016006697 A1 WO2016006697 A1 WO 2016006697A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
cancer
oligonucleotide
expression
antisense
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/069947
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
賢二 中野
聡 小比賀
剛史 山本
Original Assignee
賢二 中野
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 賢二 中野 filed Critical 賢二 中野
Priority to JP2016532985A priority Critical patent/JP6722586B2/ja
Priority to US15/325,278 priority patent/US20170211073A1/en
Priority to EP15818219.6A priority patent/EP3168305A4/en
Publication of WO2016006697A1 publication Critical patent/WO2016006697A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/712—Nucleic acids or oligonucleotides having modified sugars, i.e. other than ribose or 2'-deoxyribose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications

Definitions

  • the present invention relates to an antisense antineoplastic agent.
  • the present invention is useful in fields such as medicine, medicine, and life science.
  • Transcription factor Y-box binding protein-1 (YB-1) is specifically expressed in tumor cells and tumor blood vessels and contributes to proliferation and resistance to treatment.
  • Patent Document 1 describes that YB-1 is a vascular endothelial cell-specific biomarker of tumor neovascularization, and suppresses tumor angiogenesis by suppressing the expression of YB-1, resulting in tumor growth.
  • the present invention provides a method for detecting tumor neovascular vascular endothelial cells, which comprises measuring the expression of YB-1 based on the knowledge that can be inhibited.
  • Patent document 2 discloses an oligonucleotide, particularly an oligonucleotide that can specifically hybridize to a nucleic acid encoding human YB-1.
  • Patent Document 3 discloses a novel molecule for antisense, an artificial nucleoside that can efficiently control the expression of a specific gene.
  • an amide bond is introduced into the crosslinked structure of 2 ′, 4′-bridged nucleic acid (BNA / LNA).
  • BNA / LNA has binding affinity for single-stranded RNA comparable to conventional 2 ', 4'-BNA / LNA and nuclease resistance superior to LNA, especially for single-stranded RNA Therefore, application to nucleic acid medicine is expected.
  • Patent Document 4 discloses that siRNA targeting a predetermined partial sequence of a gene encoding YB-1 induces apoptosis of vascular endothelial cells and inhibits lumen formation by vascular endothelial cells. . Reference 4 also shows that this siRNA is effective against refractory tumors and proliferative vascular diseases because it suppresses abnormal neovascularization in tumor sites and destroys excessively formed neovascularization. It states that.
  • siRNA or miRNA can be used to obtain a higher suppression effect than when an antisense nucleic acid is used.
  • siRNA and miRNA are rapidly degraded in the body by nuclease-degrading enzymes, have low stability, and because they are double-stranded nucleic acids, they cannot be taken into cells by themselves, requiring a delivery device. The However, an effective nucleic acid delivery device has not been developed.
  • antisense by an artificial nucleic acid LNA having a sugar chain appropriately cross-linked has nuclease resistance and is stable in the living body, but concerns of toxicity to the liver / kidney have been reported.
  • a new generation of artificial nucleic acid with increased nuclease resistance and complementary nucleic acid binding ability compared to the above LNA has recently been developed, and the suppression of liver hyperlipidemia factor expression and symptom improvement have been reported.
  • a highly versatile cancer therapy is possible if the malignant factor Y-box binding protein-1 (YB-1), which is highly expressed in cancer cells and tumor neovascular vessels, can be suppressed in vivo and tumor growth / metastasis can be inhibited.
  • YB-1 malignant factor Y-box binding protein-1
  • no target gene expression-suppressing nucleic acid structures such as siRNA and antisense that function in vivo without a delivery device have been found.
  • no useful nucleic acid delivery device has been reported yet.
  • An object of the present invention is to provide an artificial nucleic acid antisense antineoplastic agent capable of exerting an effect on a wide variety of malignant tumors in vivo regardless of the presence or absence of a delivery device.
  • the present invention provides the following.
  • An oligonucleotide having a length of 13 to 17 bases which comprises at least an 8 base length portion of the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and targets a polynucleotide encoding human YB-1, ie, YB- An oligonucleotide that regulates the expression of 1.
  • the oligonucleotide according to 2 which has a length of 15 bases.
  • oligonucleotide according to any one of 1 to 4, comprising at least one cross-linked nucleic acid.
  • crosslinked nucleic acid has any one nucleoside structure selected from the group consisting of:
  • Base represents a purin-9-yl group or a 2-oxo-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group optionally having one or more optional substituents selected from the group ⁇ ,
  • the ⁇ group is protected with a hydroxyl group, a hydroxyl group protected with a protecting group for nucleic acid synthesis, a linear alkyl group with 1 to 6 carbon atoms, a linear alkoxy group with 1 to 6 carbon atoms, a mercapto group, or a protecting group for nucleic acid synthesis.
  • R is selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • the aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom and one or more substituents selected from the ⁇ group.
  • a method for suppressing the expression of YB-1 in a cell or tissue comprising a step of bringing the oligonucleotide according to any one of 1 to 7 into contact with the cell or tissue.
  • a method for treating a disease or condition associated with the expression of YB-1 comprising a step of administering the oligonucleotide according to any one of 1 to 7 to a subject.
  • the disease or condition associated with the expression of YB-1 is cancer.
  • the cancer is stomach cancer, colon cancer, esophageal cancer, breast cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, lung cancer, malignant mesothelioma, or ovarian cancer.
  • the method according to 10 or 11 wherein the cancer is an anticancer drug resistant cancer.
  • the anticancer drug resistant cancer is a gemcitabine resistant pancreatic cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising the oligonucleotide according to any one of 1 to 7 and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition according to 14 for treating a disease or condition associated with expression of YB-1.
  • the pharmaceutical composition according to 15, for treating cancer.
  • the pharmaceutical composition according to 16 for treating gastric cancer, colon cancer, esophageal cancer, breast cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, lung cancer, malignant mesothelioma, or ovarian cancer.
  • an oligonucleotide capable of efficiently regulating the expression of YB-1 is provided.
  • YB-1 is highly expressed in cancer cells and new blood vessels of pancreatic / biliary tract cancer YB-1 antisense oligo BNA growth inhibitory effect YB-1 antisense oligo BNA suppresses cell cycle and induces apoptosis Antitumor effect of local administration of YB-1 antisense oligo BNA Antitumor effect of YB-1 antisense oligo BNA in blood Administration of YB-1 antisense oligo BNA in blood suppresses YB-1 expression in tumor / liver / kidney Evaluation of the safety of YB-1 antisense ⁇ oligo BNA during administration of blood (repeated administration of artificial nucleic acid (BNA) in blood induces liver dysfunction) Evolution of artificial nucleic acids by modification of cross-linked structure Safety improvement by artificial nucleic acid structure modification-LNA / BNA vs BNA amide (AmNA)- Antitumor effect of artificial nucleic acid YB-1 antisense oligo AmNA in blood
  • (C) Panel left, comparison of peritoneal seeding luciferase signal 21 days after treatment. Panel right, Tumor growth inhibition (n 4, P ⁇ 0.05). Antitumor effect on peritoneal dissemination of gastric cancer.
  • (C) Panel left, comparison of peritoneal seeding luciferase signal 21 days after treatment. Panel right Kaplan-Meier survival curve (n 5, P ⁇ 0.05). Anticancer agent sensitizing action by artificial nucleic acid YB-1 inhibitory antisense.
  • A Pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2.
  • Treatment includes prophylaxis and therapy and preferably refers to therapy.
  • the subject of treatment includes humans and non-human animals (eg, mice).
  • “A and / or B” refers to at least one of A and B. When only A is included, the case of A and B other than the case of only B is included.
  • the oligonucleotides of the invention target specific nucleic acid molecules and modulate their expression.
  • the target nucleic acid can be, for example, a cellular gene (or mRNA transcribed from the gene) whose expression is associated with a particular disease or disease state, or a nucleic acid molecule derived from an infectious agent.
  • the target nucleic acid encodes a malignant factor Y-box binding protein-1 (YB-1) that is highly expressed in cancer cells and tumor neovasculature.
  • the target nucleic acid can be single-stranded DNA, RNA, double-stranded DNA.
  • the oligonucleotide of the present invention hybridizes to a target region, segment or site in the target nucleic acid and regulates the expression of YB-1. Modulation includes controlling expression up and down (inhibiting), but preferably refers to controlling expression down. Regulation of expression can be confirmed at the mRNA or protein level.
  • oligonucleotide refers to a nucleotide that is an oligomer or polymer in which 2 to 50 identical or different nucleosides are linked by a phosphodiester bond or other internucleoside bond. Oligonucleotides include natural oligonucleotides and derivatives of natural oligonucleotides (which may be non-natural, artificial, or modified).
  • oligonucleotide includes single-stranded DNA or RNA and double-stranded DNA or RNA.
  • oligonucleotide of the present invention is a natural or non-natural single-stranded antisense oligonucleotide. Oligonucleotides also include those that are in the form of pharmaceutically acceptable salts, except as otherwise noted.
  • the oligonucleotide of the present invention is, for example, 13 to 18 bases long, preferably 13 to 17 bases long. In one preferred embodiment, it is 14 to 16 bases long, more preferably 15 bases long. Suppression of YB-1 expression means that expression is 75% or less, preferably 70% or less, when an appropriate control (for example, control oligonucleotide or oligonucleotide is not present) is used. More preferably 50% or even more preferably 30% or less. A detailed experimental method for evaluating the inhibition rate is described in Example 2 of the present specification.
  • the oligonucleotide of the present invention also contains at least an 8 base length portion of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (preferably SEQ ID NO: 2). In one of the preferred embodiments, at least a 10-base length portion, more preferably a 12-base length portion, more preferably a 14-base length portion of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (preferably SEQ ID NO: 2). Including.
  • One particularly preferred embodiment includes all of the sequences set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 (preferably SEQ ID NO: 2).
  • a 15mer comprising all of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or a 17mer comprising all of the sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and further comprising other sequences are examples of particularly preferred embodiments of the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing shows the sequence of an oligonucleotide that is used in the experiments described in the Examples section and has a high effect of suppressing YB-1 expression.
  • the oligonucleotide of the present invention may be modified. That is, it may be a derivative of a natural oligonucleotide (sometimes referred to as a non-natural type or an artificial type).
  • a nucleotide contains a nucleoside moiety, and a nucleoside is a base and sugar combination.
  • the base portion of a nucleoside is usually a heterocyclic base sometimes referred to as a “nucleobase” or simply “base”.
  • the two most common types of heterocyclic bases are purines and pyrimidines.
  • the nucleotide further comprises a phosphate group covalently linked to the sugar moiety of the nucleoside.
  • nucleosides that include a pentofuranose sugar may have a phosphate group attached to the 2 ′, 3 ′, or 5 ′ hydroxyl portion of the sugar.
  • phosphate groups covalently bond adjacent nucleosides together to form a linear polymer compound.
  • the phosphate group is commonly referred to as forming the internucleoside backbone of the oligonucleotide.
  • the normal linkage or backbone of RNA and DNA is a 3 ′ to 5 ′ phosphodiester linkage.
  • Oligonucleotide modifications may be at the sugar moiety and / or at the internucleoside linkage (main chain).
  • oligonucleotides with modified sugar moieties include those known as sugar partially crosslinked artificial nucleic acids BNA (Bridged Nucleic Acids).
  • BNA Binary Nucleic Acids
  • the oligonucleotide of the present invention may contain these.
  • a structure (nucleoside moiety) contained in a nucleotide having a modified sugar moiety, which can be applied to the present invention, is shown below.
  • oligonucleosides are well known to those skilled in the art. Among these, particularly preferred examples include those containing the following nucleoside structures.
  • Base has one or more arbitrary substituents selected from the ⁇ group.
  • Base is 6-aminopurin-9-yl group, 2,6-diaminopurine-9-yl group, 2-amino-6-chloropurine-9-yl group, 2-amino-6-fluoropurine-9- Yl group, 2-amino-6-bromopurine-9-yl group, 2-amino-6-hydroxypurine-9-yl group, 6-amino-2-methoxypurine-9-yl group, 6-amino-2 -Chloropurin-9-yl group, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl group, 2,6-dimethoxypurin-9-yl group, 2,6-dichloropurin-9-yl group, 6-mercapto Purin-9-yl group, 2-oxo-4-amino-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group, 4-amino-2-oxo-5-fluoro-1,2-dihydropyrimidin-1-yl group 4-amino-2-oxo
  • R is selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, an alkenyl group having 2 to 7 carbon atoms that may form a branch or a ring, and the ⁇ group.
  • the aryl group having 3 to 12 carbon atoms which may contain a hetero atom and one or more substituents selected from the ⁇ group.
  • R is a hydrogen atom, a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, a phenyl group, or a benzyl group, and more preferably, R is a hydrogen atom or a methyl group.
  • the bridged nucleotide more preferably has the following nucleoside structure.
  • Base and R are as defined above.
  • the sugar moiety may be cross-linked at least one, preferably several (for example, 3 or more, preferably 4 or more, more preferably 5 or 6) of the nucleotides constituting the oligonucleotide. .
  • Oligonucleotides of the invention may be oligonucleotides containing modified backbones or unnatural internucleoside linkages.
  • Preferred modified oligonucleotide backbones containing a phosphorus atom therein include, for example, phosphorothioates, chiral phosphorothioates, phosphorodithioates, phosphotriesters, aminoalkylphosphotriates having the usual 3'-5 'linkage.
  • Methyl and other alkyl phosphonates including esters, 3'-alkylene phosphonates, 5'-alkylene phosphonates and chiral phosphonates, phosphinates, phosphoramidates including 3'-amino phosphoramidates and aminoalkyl phosphoramidates, thiono phosphoramidates Dates, thionoalkyl phosphonates, thionoalkyl phosphotriesters, selenophosphates and boranophosphates, their 2'-5 'linked analogs, and one or more internucleotide linkages therein are 3' to 3 '5' 5 ', or 2' is a bond from the 2 ', those having the opposite polarity.
  • Preferred oligonucleotides with opposite polarity are single 3 'to 3' linkages at the 3 'terminal internucleotide linkage, i.e. a single reverse nucleoside residue that can be abasic (nucleobase Is deleted, or alternatively has a hydroxyl group).
  • Various salts, mixed salts, and free acid forms are also included. Methods for preparing such phosphorus-containing bonds are well known to those skilled in the art.
  • modified oligonucleotide backbones that do not contain a phosphorus atom therein are short chain alkyl or cycloalkyl internucleoside bonds, heteroatoms and internucleoside bonds mixed with alkyl or cycloalkyl, or one or more. , Having a main chain formed by internucleoside linkages of short-chain heteroatoms or heterocyclics.
  • oligonucleosides include those having morpholino linkages (partially formed from the sugar portion of the nucleoside), siloxane backbones, sulfides, sulfoxides, and sulfone backbones, formacetyl and thioformacetyl backbones, methyleneformacetyl and thiols.
  • Methods for preparing such oligonucleosides are well known to those skilled in the art.
  • oligonucleotide containing a modified backbone or non-natural internucleoside linkage is a phosphorothioate type (S) oligonucleotide.
  • a phosphorothioate-type oligonucleotide refers to an oligonucleotide having a phosphodiester bond in which the oxygen atom of the phosphate group is replaced with a sulfur atom.
  • a phosphorothioate-type oligonucleotide is preferable in that it exhibits resistance to a nucleolytic enzyme.
  • the phosphorothioate type (S-formation) can be made at some or all of the internucleoside linkages contained in the oligonucleotide.
  • Oligonucleotides may be modified on both sugar and main chain. Particularly preferred examples of such oligonucleotides are: Such an oligonucleotide can be prepared as appropriate by those skilled in the art, and there are a plurality of companies that offer consignment synthesis services, which can be outsourced to other companies.
  • the nucleotide sequence (sometimes referred to as a base sequence) may be a sequence consisting only of natural nucleotides, or a derivative of a natural nucleotide (modified, It may be a non-natural type or an artificial type).
  • the symbol C or c indicates that the nucleotide moiety of the nucleotide is cytosine or a derivative thereof (for example, a modified form of cytosine, specifically 5-methylcytosine, 2'-O-methylcytosine etc.); the part other than the base is not particularly limited and may be a natural type, the sugar part may be a bridged type; the main chain or internucleoside linkage is For example, the phosphorothioate type in which the oxygen atom of the phosphate group in the phosphodiester bond is substituted with a sulfur atom (sometimes referred to as S) may be used.
  • S sulfur atom
  • nucleotide or base sequence refers to 5-methylcytosine, unless otherwise specified.
  • N or n means nucleotides (DNA or RNA) whose base moiety is adenine, guanine, cytosine, thymidine / uracil, unknown or other bases. Yes, preferably DNA)) or the base itself.
  • a nucleotide or base sequence is described in capital letters, it means a base or nucleotide that is a sugar partial cross-linked type, unless otherwise specified.
  • the oligonucleotides of the invention can be administered directly to any pharmaceutically acceptable salt, ester, or salt of such an ester, or its biologically active metabolite or residue when administered to an animal, including a human. It can be (or indirectly) any other compound that can be provided.
  • a pharmaceutically acceptable salt is a physiologically and pharmaceutically acceptable salt of a compound of the invention, ie a salt that retains the desired biological activity of the parent compound and does not impart undesired toxicological effects thereto.
  • Preferred examples of pharmaceutically acceptable salts and their use for oligonucleotides are well known to those skilled in the art.
  • Preferred specific examples of pharmaceutically acceptable salts for oligonucleotides include, but are not limited to, (a) salts formed with cations such as polyamines such as sodium, potassium, ammonium, magnesium, calcium, spermine and spermidine. (B) acid addition salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, etc.
  • acetic acid oxalic acid, tartaric acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, Organics such as gluconic acid, citric acid, malic acid, ascorbic acid, benzoic acid, tannic acid, palmitic acid, alginic acid, polyglutamic acid, naphthalenesulfonic acid, methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, naphthalenedisulfonic acid, polygalacturonic acid Salts formed with acids, and (d) elements such as chlorine, bromine and iodine Salts formed from the anion can be exemplified.
  • the pharmaceutical composition according to the embodiment of the present invention can be in various dosage forms and adopt various administration routes. That is, the pharmaceutical compositions of the present invention can be administered by an appropriate route, depending on whether local or systemic treatment is desired and on the part to be treated. Administration can be local or systemic, oral or parenteral. Examples of parenteral administration include administration through mucous membranes such as the eye, vagina, rectum; thoracic, pulmonary, intratracheal, or nasal by inhalation or insufflation (including spraying as a dry powder or aerosol, for example). Administration into the epidermis by application or application; Subcutaneous administration by injection or implantation; Intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular or intracranial (including intrathecal or intraventricular) by injection or infusion. Is mentioned.
  • Subjects to be treated with the pharmaceutical composition include animals.
  • the animal can be a mammal such as a mouse, rat, dog, guinea pig, human, non-human primate, cat, or pig.
  • Non-human primates include monkeys and chimpanzees.
  • Other examples can be laboratory animals such as mice, rats, dogs, non-human primates, cats, or pigs.
  • the subject of treatment can be a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the treatment of diseases or conditions associated with the expression of YB-1.
  • a specific example of a disease or condition associated with YB-1 expression is cancer.
  • the cancer includes gastric cancer, colon cancer, esophageal cancer, breast cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, lung cancer, malignant mesothelioma, or ovarian cancer.
  • An accelerator may be added to the pharmaceutical composition of the present invention to promote the uptake of oligonucleotides at the cellular level.
  • cationic lipids such as LIPOFECTIN TM reagent (Junichi et al., US Pat. No. 5,705,188), polycation molecules such as cationic glycerol derivatives, and polylysine (Lollo et al., International Patent Publication No. WO 97/30731) can be used.
  • One embodiment considered to be particularly preferable is to dissolve the lyophilized active ingredient with physiological saline or the like immediately before administration and administer it intravenously, intraperitoneally or locally by injection or infusion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used with other pharmaceutical compositions containing chemotherapeutic agents and can be used on subjects who have become resistant to chemotherapy.
  • chemotherapeutic agents include nucleotide analogs. More specifically, purine analogs such as thioguanine, fludarabine phosphate (F-Ara-A, fludara), cladribine (2-CdA, leustatin) are included. Also included are pyrimidine analogs such as cytarabine (Ara-C, kiloside) and gemcitabine (GEM, gemzar). Gemcitabine is used in the treatment of pancreatic cancer.
  • daunorubicin examples are daunorubicin, daunomycin, dactinomycin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, esorubicin, bleomycin, mafosfamide, ifosfamide, cytosine arabinoside, bischloroethylnitrosourea, busulfan, mitomycin C, actinomycin D, mithromycin, Prednisone, hydroxyprogesterone, testosterone, tamoxifen, dacarbazine, procarbazine, hexamethylmelamine, pentamethylmelamine, mitozantrone, amsacrine, chlorambucil, methylcyclohexylnitrosourea, nitrogen mustard, melphalan, cyclophosphamide, 6-mercaptopurine, 6 -Thioguanine, cytarabine, 5-azacytidine, hydroxyurea, deoxycoform
  • the pharmaceutical composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the active ingredient oligonucleotide.
  • the pharmaceutical composition may be used in combination with an anticancer agent.
  • An antitumor effect can be expected to be improved by using an anticancer agent having an action mechanism different from that of the pharmaceutical composition.
  • the composition of the invention comprises one or more oligonucleotides that target the first nucleic acid, in particular oligonucleotides, and one or more additional oligonucleotides that target the second nucleic acid target.
  • the composition of the invention may comprise two or more oligonucleotides targeted to different regions of the same nucleic acid target. Numerous examples of oligonucleotides are known in the art. Two or more linked compounds can be used together or sequentially.
  • Dosing is designed based on the severity and responsiveness of the disease state to be treated within the course of treatment lasting days to months or until cure is achieved or reduction of the disease state is achieved. can do.
  • the optimal dosing schedule can be calculated by measuring the accumulation of the drug in the patient's body. Persons of ordinary skill can easily determine optimum dosages, dosing methodologies and frequencies. Optimal dosages will vary depending on the relative potency of the individual oligonucleotides and can generally be assessed based on the EC 50 found to be effective in in vitro and in vivo animal models.
  • the dosage of active ingredient is 0.01 ⁇ g to 100 g per kg body weight, 0.1 ⁇ g to 10 g per kg body weight, 1.0 ⁇ g to 1 g per kg body weight, 10.0 ⁇ g to 100 mg per kg body weight, per kg body weight 100 ⁇ g to 10 mg, or 1 mg to 5 mg per kg body weight, once a day, once a week, once a month or once a year, or once every 2-20 years, or once Can be administered multiple times.
  • One skilled in the art can readily assess the frequency of administration based on the measured residence time and concentration of the drug in bodily fluids or tissues.
  • the patient After successful treatment, it may be desirable to have the patient receive maintenance therapy to prevent recurrence of the disease state, in which case the oligonucleotide is within the range of 0.01 ⁇ g to 100 g per kg body weight, Administer at a maintenance dose of at least once per day to once every 20 years.
  • the effect of treatment with the therapeutic composition can be assessed after collection of tissue or fluid from the patient or subject undergoing treatment. It is known in the art that a biopsy sample can be collected from a particular tissue without causing adverse effects on the patient or subject.
  • the tissue and its constituent cells include blood (eg, hematopoietic cells such as human hematopoietic progenitor cells, human hematopoietic stem cells, CD34 + cells, CD4 + cells), lymphocytes and other blood cells, bone marrow, breast , Cervix, colon, esophagus, lymph node, muscle, peripheral blood, oral mucosa and skin.
  • blood eg, hematopoietic cells such as human hematopoietic progenitor cells, human hematopoietic stem cells, CD34 + cells, CD4 + cells
  • lymphocytes and other blood cells eg, lymphocytes and other blood cells, bone marrow, breast , Cervix, colon, esophagus,
  • the body fluid and its constituent cells include, but are not limited to, blood, urine, semen, synovial fluid, lymph fluid and cerebrospinal fluid.
  • Tissue or body fluid collected from the patient can be evaluated from the expression level of the target mRNA or protein.
  • the expression level of mRNA or protein of other genes known or suspected to be associated with a particular disease state, condition or phenotype can be assessed.
  • mRNA levels can be measured or assessed by real-time PCR, Northern blot, in situ hybridization or DNA array analysis. Protein levels can be measured or assessed using ELISA, immunoblot, quantitative protein analysis, protein activity analysis (eg, caspase activity analysis), immunohistochemistry or immunocytochemistry.
  • biomarkers associated with the disease or condition in the aforementioned tissues and fluids collected from the patient or subject to be treated by clinical methods of procedures known in the art include glucose, cholesterol, lipoprotein, triglyceride, free fatty acids and other markers of glucose and lipid metabolism; lipoprotein (a) or Lp (a) or apolipoprotein B; liver transaminase, bilirubin, albumin, Blood urea nitrogen, creatine and other markers of renal and liver function; interleukins, tumor necrosis factor, intracellular adhesion molecules, C-reactive protein and other markers of inflammation; testosterone, estrogen and other hormones; tumor markers Including but not limited to vitamins, minerals and electrolytes. Examples of the present invention will be described below, but the scope of the present invention is not limited to the examples.
  • BNA refers to LNA / 2′4′-BNA unless otherwise specified.
  • Example 1 Confirmation of YB-1 expression in pancreatic cancer and biliary tract cancer
  • YB-1 which is involved in anticancer drugs and radiation resistance, is known to be highly expressed in many cancer types and tumor blood vessels, but its expression in anticancer drugs and radiation-resistant pancreatic / biliary tract cancers is not yet clear.
  • Example 2 Screening and evaluation of antisense oligonucleic acid
  • Various candidate antisense oligonucleic acids are synthesized, introduced into various cancer cells using the gene transfer reagent Lipofectamine RNAiMax, and screened using the ability to suppress YB-1 expression as an indicator, 70% or more at 5-20nM concentration ASO # 1 and ASO # 10 showing the knockdown efficiency were found (data not shown). The structure of ASO # 10 is shown below.
  • ASO # 10 also sometimes referred to as “YB-1 ASO”. TCTcctgcaccCTGg, SEQ ID NO.:2
  • TCTcctgcaccCTGg SEQ ID NO.:2
  • ASO # 10 is introduced at a final concentration of 50 nM for pancreatic cancer cells and 5 nM for vascular endothelial cells using the gene transfer reagent Lipofectamine® RNAiMax. The proliferation ability was measured by the assay method.
  • ASO # 10 we synthesized significantly inhibited the growth of pancreatic cancer / vascular endothelial cells compared to the control antisense oligonucleic acid (CATttcgaagtACTc, SEQ ID NO: 3) (FIG. 2). It has been confirmed that gastric cancer and breast cancer are also knocked down by ASO # 10.
  • Example 3 Cell cycle analysis and confirmation of apoptosis induction by YB-1 ASO BNA
  • Example 3 Cell cycle analysis and confirmation of apoptosis induction by YB-1 ASO BNA
  • YB-1 ASO has a G2 / M fraction compared to control antisense oligo BNA (CATttcgaagtACTc, SEQ ID NO .: 3 in the sequence, capital letters correspond to BNA. The same applies in the following examples).
  • the subG1 fraction was significantly increased (17.7 vs 2.0% for HUVEC; 18.7 vs 1.3% for HPAEC), and an increase in apoptosis was also observed.
  • vascular endothelial HUVEC cells were administered with fluorescent FITC-labeled Annexin V, and the fluorescence was observed.
  • YB-1 ASO BNA binds to extracellular phosphatidylserine, a marker of apoptosis. Although an increase in Annexin V-positive cells was observed, cells treated with the control antisense oligo BNA hardly showed Annexin V.
  • Example 4 Effect of local administration of YB-1 ASO BNA
  • MiaPaCa-luc pancreatic cancer cells that stably express luciferase were transplanted subcutaneously into the thighs of nude mice to create subcutaneous tumors approximately 6-7 mm in size.
  • YB-1 ASO BNA final concentration 10 ⁇ M
  • atelocollagen implant was mixed with atelocollagen implant at a volume ratio of 1: 1 and administered locally into the tumor (once a week, a total of 2 times), and the tumor volume (luciferase activity) was measured over time. Evaluation was performed by imaging.
  • YB-1 ASO BNA significantly reduced tumor volume compared to control antisense oligo BNA, and macroscopic findings on Day 17 showed that tumors regressed to white tone in the YB-1 ASO BNA group. Admitted.
  • the control antisense BNA group tumor growth accompanied by redness was observed (FIG. 4).
  • Example 5 Effects of administration of YB-1 ASO BNA in blood
  • SUIT2 pancreatic cancer and HCT116 colon cancer cells were transplanted subcutaneously into the nude mouse thigh to create a subcutaneous tumor about 6-7 mm in size.
  • YB-1 ASO BNA 200 ⁇ g / 200 ⁇ L
  • YB-1 ASO BNA suppressed tumor growth by 1 / 4-1 / 5 compared to control antisense BNA (FIG. 5).
  • YB-1 ASO BNA (indicated as “ASO # 10” in FIG. 6; 200 ⁇ g / 200 ⁇ L) is administered into the blood from the tail vein (weekly) to nude mice that have created the HCT116 colon cancer subcutaneous tumor. Once, a total of 2 times), 48 hours after the final administration, subcutaneous tumors, liver and kidney were collected, RNA was extracted, and YB-1 expression was analyzed by real-time RT-PCR. YB-1 ASO BNA significantly suppressed tumor, liver and kidney YB-1 expression to about 1/3 compared to control antisense BNA.
  • YB-1 ASO BNA showed YB-1 expression in the tumor tissue and expression of the neovascular marker CD31 compared to control antisense BNA. And the suppression of YB-1 expression in vivo was confirmed (FIG. 6).
  • Example 7 Confirmation of safety by YB-1 ASO BNA administration in blood
  • a blood test examined the safety of YB-1 ASO BNA, which showed antitumor effects, in the blood.
  • Nude mice were given YB-1 ASO BNA (indicated as “ASO-YBX1” in FIG. 7) at a concentration of 100 ⁇ g / 200 ⁇ L, 200 ⁇ g / 200 ⁇ L after a single dose in the blood from the tail vein.
  • Blood was collected after time, and blood biochemical tests were performed on ALT, T.Bil, BUN, and Creatinin items to evaluate liver and kidney function.
  • YB-1 ASO BNA and control antisense BNA also showed abnormal functions. I did not admit. However, when repeated administration was repeated three times, only YB-1 ASO BNA showed an increase in liver function markers AST and T.Bil, but there was no functional abnormality in control antisense BNA and saline control (Fig. 7).
  • Example 8 Cross-linked artificial nucleic acid AmNA
  • Co-inventors: Obiga, Yamamoto et al. (Osaka University) have been developing cross-linked artificial nucleic acids and optimizing their cross-linked structure (bottom left of Fig. 8).
  • Cross-linked artificial nucleic acid called AmNA has succeeded in reducing the binding power to DNA while maintaining the target RNA binding ability equivalent to conventional 2 ', 4'-BNA / LNA. It is a cross-linked artificial nucleic acid with excellent properties (upper right of FIG. 8).
  • Example 9 Effect of YB-1 ASO AmNA on blood function by blood administration
  • YB-1 ASO BNA indicated as “ASO # 10” in FIG. 9
  • YB-1 ASO AmNA in FIG. 9
  • ASO # 10 AmNA was dissolved in 200 ⁇ L of each oligonucleotide in 200 ⁇ L of physiological saline and administered into the blood from the tail vein (once a week, 3 times in total) Blood was collected 48 hours after the final administration and subjected to blood biochemistry.
  • the structure of YB-1 ASO AmNA is shown below.
  • YB-1 ASO prepared with 2 ', 4'-BNA / LNA is significantly increased in AST and ALT markers of liver dysfunction compared to Control ASO, whereas YB-1 synthesized with AmNA ASO did not induce liver dysfunction (FIG. 9).
  • YB-1 ASO AmNA is highly safe.
  • Example 10 Antitumor effect of YB-1 ASO AmNA administered in blood
  • Example 9 the antitumor effect by administration of AmNA type YB-1 ASO in blood, which was confirmed to be higher safety than ASO composed of conventional BNA, was examined.
  • human colon cancer cell HCT116 into the subcutaneous part of the nude mouse and forming a subcutaneous tumor with a diameter of 6-7 mm (average tumor volume 78 vs 72 mm 3 )
  • 200 ⁇ g of YB-1 ASO AmNA from the tail vein / 200 ⁇ L of blood was administered (once every other week for a total of 2 times).
  • Tumor volume was calculated by the formula.
  • the YB-1 ASO AmNA group was suppressed to about 1/5 in both tumor diameter and tumor weight as compared to the control antisense group (FIG. 10). * P ⁇ 0.05
  • Example 11 Antitumor effect of YB-1 ASO AmNA on anticancer drug resistant cancer cells
  • a human pancreatic cancer SUIT2 cell line was prepared by culturing pancreatic cancer resistant to the anticancer drug gemcitabine for a long time in a medium containing a low concentration of gemcitabine (IC50 value: resistant strain 100 nM vs parental strain 5 nM).
  • IC50 value resistant strain 100 nM vs parental strain 5 nM.
  • a subcutaneous tumor was prepared in the same manner as in Example 10, and YB-1 ASO AmNA and control antisense were administered in the blood at 200 ⁇ g / 200 ⁇ L in the same protocol (once every other week, twice in total). Compared to the control antisense group, the YB-1 ASO AmNA group was suppressed to about 1/3 in both tumor diameter and tumor weight, and it was clear that the anti-tumor drug-resistant cancer cells were effective. (Figure 11). * P ⁇ 0.05
  • Example 12 Comparison of YB-1 expression inhibitory effect of various antisenses.
  • Each antisense at a predetermined concentration was introduced into various cancer cells by the method of Example 2, and an RNA sample was collected 48 hours later and analyzed by qRT-PCR. The results are shown in FIG.
  • HsYBX1-839-BNA18 ASO # 16
  • HsYBX1-840-BNA18 ASO # 17
  • the nucleotide written in capital letters is BNA.
  • Example 13 Confirmation of YB-1 expression suppression by YB-1 ASO AmNA
  • FIG. 13A shows the results when ASO # 1 AmNA and # 10 AmNA were administered twice to the HCT116 (colon cancer) subcutaneous tumor model (one week after the first administration and the second administration).
  • FIG. 13B shows the results when ASO # 1AmNA and # 10AmNA were administered twice to the SUIT2-GR (pancreatic cancer) subcutaneous tumor model (one week after the first administration and the second administration).
  • FIG. 13C shows the results when ASO # 10 AmNA was administered once a week for a total of 4 times.
  • Example 14 Antitumor effect on pancreatic cancer and colon cancer by repeated blood administration
  • a subcutaneous tumor model was created by transplanting gemcitabine-resistant pancreatic cancer SUIT2-GR and colon cancer HCT116 into the nude mouse subcutaneously, and once the tumor diameter of 50 mm 3 was formed, once a week for 3 weeks, # 10 AmNA YB-1 Anti Sense was administered from 10 mg / kg BW tail vein. Tumor diameter was measured over time. Even in the weekly administration protocol, as shown in Table 3, there was no problem in safety, and a significant inhibitory effect on subcutaneous tumors was observed on days 14 and 21 (FIG. 14 (A)).
  • Table 3 shows the results of measuring blood samples in treatment experiments. There was no abnormality in general blood and biochemical tests.
  • Example 15 Antitumor effect on lung cancer
  • a subcutaneous tumor model of Lewis lung cancer was created, and after the tumor diameter of 50 mm 3 was formed, # 10 AmNA YB-1 antisense was administered from the 10 mg / kg BW tail vein once a week for 3 weeks. Tumor diameter was measured over time.
  • a photograph of the subcutaneous tumor on the 21st day of treatment showed a small subcutaneous tumor in the # 10 AmNA YB-1 antisense administration group compared to the control group (FIG. 15 (A)).
  • On day 14 and day 21 of treatment tumor growth was significantly suppressed in the # 10AmNA YB-1 antisense administration group as compared to the control antisense group (FIG. 15 (B)).
  • (* P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.01; n 5)
  • Example 15 Antitumor effect on malignant mesothelioma
  • # 10AmNA YB-1 antisense was introduced into the malignant mesothelioma cell line H226 using the reagent Lipofectamine RNAiMax, and the expression of YB-1 was examined by real-time RT-PCR.
  • YB-1 expression suppression (A) and growth suppression (B) by # 10AmNA YB-1 antisense were observed in a concentration-dependent manner. * P ⁇ 0.001.
  • tumor diameter 50 mm 3 was formed, once a week, for 2 weeks, # 10 AmNA YB-1 antisense was administered from 10 mg / kg BW tail vein, Tumor diameter was measured over time. The results are shown in FIG. 15 (C).
  • the left panel shows a photograph of the subcutaneous tumor after treatment.
  • Example 16 Antitumor effect on malignant mesothelioma
  • # 10AmNA YB-1 antisense was introduced into the malignant mesothelioma cell line H226 using the reagent Lipofectamine RNAiMax, and the expression of YB-1 was examined by real-time RT-PCR.
  • YB-1 expression suppression (A) and growth suppression (B) by # 10AmNA YB-1 antisense were observed in a concentration-dependent manner. * P ⁇ 0.001.
  • tumor diameter 50 mm 3 was formed, once a week, for 2 weeks, # 10 AmNA YB-1 antisense was administered from 10 mg / kg BW tail vein, Tumor diameter was measured over time. The results are shown in FIG. 16 (C).
  • the left panel shows a photograph of the subcutaneous tumor after treatment.
  • Example 17 Antitumor effect on peritoneal dissemination of ovarian cancer
  • # 10AmNA YB-1 antisense was introduced into the ovarian cancer cell line SKOV3 using the reagent Lipofectamine RNAiMax, and the expression of YB-1 was examined by real-time RT-PCR. Suppression of YB-1 expression (FIG. 17 (A)) and growth suppression (FIG. 17 (B)) by # 10AmNA YB-1 antisense were observed in a concentration-dependent manner. * P ⁇ 0.001.
  • Example 18 Antitumor effect on peritoneal dissemination of gastric cancer
  • # 10AmNA YB-1 antisense was introduced into the gastric cancer cell line AS44 using the reagent Lipofectamine RNAiMax, and expression of YB-1 was examined by real-time RT-PCR.
  • # 10AmNA YB-1 antisense suppressed YB-1 expression suppression (A) and concentration-dependent growth suppression (B). * P ⁇ 0.001.
  • a peritoneal dissemination model of the Luciferase stably expressing gastric cancer cell line AS44-luc was prepared, and 10 mg / kg BW intraperitoneally was administered # 10 AmNA YB-1 antisense once a week for 1 week after 1 week of cancer transplantation. Tumor volume was evaluated by luciferase activity over time. The results are shown in FIG. 18 (C).
  • the left panel shows a comparison of peritoneal seeding luciferase signals 21 days after treatment.
  • Example 19 Sensitizing effect of anticancer agent by artificial nucleic acid YB-1 inhibitory antisense
  • # 10 AmNA YB-1 antisense 5 nM was introduced into the pancreatic cancer cell line MIA PaCa-2 (Fig. 19 (A)) and ovarian cancer cell line SKOV-3 (Fig. 19 (B)) with the reagent Lipofectamine RNAiMax.
  • the cell killing effect of anticancer drugs was compared with and without antisense. Enhancement of the cell killing effect by introduction of low concentration # 10AmNA YB-1 antisense was observed. Concentrations of anti-cancer drugs that showed the same cell killing effect are shown in blue (5-FU) and red (Gemcitabine).
  • Example 20 Radiosensitization by artificial nucleic acid YB-1 inhibitory antisense
  • # 10AmNA YB-1 antisense (10 nM) was introduced into the pancreatic cancer cell line SUIT-2 with the reagent Lipofectamine RNAiMax, and the cell killing effect by X-ray irradiation was compared with the presence or absence of antisense. The results are shown in FIG. Enhancement of the cell killing effect by introduction of low concentration YB-1 antisense was observed.
  • Example 21 Comparison of YB-1 knockdown efficiency by antisense prepared from natural nucleic acid, LNA / BNA, AmNA nucleic acid
  • YB-1 natural nucleic acid antisense (NA), LNA / BNA nucleic acid antisense (BNA), AmNA nucleic acid antisense (AmNA) are added to vascular endothelial cell lines (HUVEC, HPAEC) and pancreatic cancer cell lines (MiaPaCa2-) Introduced at each concentration. RNA was extracted 24 hours later, and YB-1 expression was evaluated by real-time RT-PCR. The results are shown in FIG.
  • the knockdown efficiency of YB-1 by AmNA nucleic acid antisense was significantly higher than that of natural nucleic acid antisense and LNA nucleic acid antisense.
  • Example 23 Comparison of YB-1 knockdown efficiency by 15-18mer
  • 15-18mer oligonucleotides were introduced into pancreatic cancer cell lines (MIA PaCa-2), colon cancer cell lines (HCT-116) and ovarian cancer cell lines (SKOV3) at various concentrations.
  • RNA was extracted 24 hours later, and YB-1 expression was evaluated by real-time RT-PCR.
  • the structures of oligonucleotides other than 15mer are shown below.
  • the present invention is useful in fields such as pharmaceutical manufacturing, medical care, and life science.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

　本発明は、デリバリーデバイスの有無に関わらず、生体内で広範囲の種類の悪性腫瘍に対して効果を発揮しうる人工核酸アンチセンス抗悪性腫瘍剤として、13～17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、YB-1の発現を調節するオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号2の配列からなり、糖部分架橋型のヌクレオシド構造を有し、かつヌクレオチド間結合がホスホロチオエート型である。

Description

アンチセンス抗悪性腫瘍剤
　本発明は、アンチセンス抗悪性腫瘍剤に関する。本発明は、医薬、医療、ライフサイエンス等の分野で有用である。
　転写因子Y-box binding protein-1 (YB-1) は腫瘍細胞や腫瘍血管に特異的に高発現し、増殖や治療抵抗性に寄与する。特許文献1は、YB-1が腫瘍新生血管の血管内皮細胞特異的なバイオマーカーであること、そしてYB-1の発現を抑制することにより、腫瘍血管新生を抑制し、結果的に腫瘍の増殖を阻害し得るとの知見に基づき、YB-1の発現を測定することを含む、腫瘍新生血管血管内皮細胞の検出方法を提供する。また、特許文献2は、オリゴヌクレオチド、特にヒトYB-1をコードする核酸に特異的にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを開示している。
　一方、特許文献3は、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス用の新規な分子、人工ヌクレオシドを開示する。このヌクレオシドは、2',4'-架橋型核酸(BNA/LNA)の架橋構造にアミド結合が導入されている。従来の2',4'-BNA/LNAに匹敵する一本鎖RNAに対する結合親和性と、LNAを上回るヌクレアーゼ耐性とを有し、特に、一本鎖RNAに対しては非常に強い結合親和性を有するため、核酸医薬への応用が期待されている。
　他方、特許文献4は、YB-1をコードする遺伝子の所定の部分配列を標的配列とするsiRNAが、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導し、血管内皮細胞による管腔形成を阻害することを開示する。引用文献4はまた、このsiRNAは、腫瘍部位等における異常な血管の新生を抑制し、また過度に形成された新生血管を破壊するため、難治性腫瘍や増殖性血管疾患に対して有効である旨を述べている。
特開2011-88876号公報 米国特許公報6140126号 国際公開公報WO2011/052436 特開2013-216627号
　標的遺伝子の発現を阻害する方法として、siRNAやmiRNAを用いることにより、アンチセンス核酸を用いる場合に比較してより高い抑制効果が得られうることが知られている。siRNAやmiRNAは、体内ではヌクレアーゼ分解酵素により急速に分解され、安定性が低く、また二本鎖核酸であることから単体では細胞内に取込まれないという問題があり、デリバリーデバイスが必要とされる。しかし、有効な核酸用デリバリーデバイスは開発されていない。
　一方、糖鎖を適切に架橋した人工核酸LNAによるアンチセンスは、ヌクレアーゼ耐性を有し、生体内で安定であるが、肝臓/腎臓への毒性の懸念が報告されている。また、上記LNAに比較してヌクレアーゼ耐性と相補性核酸結合能がより増した新世代の人工核酸が最近開発され、肝臓の高脂血症因子の発現抑制と症状改善が報告されている。
　しかしながら、抗腫瘍効果と安全性を生体内で確保した人工核酸アンチセンス構造体は未だ存在しない。
　癌細胞と腫瘍新生血管に高発現する悪性化因子Y-box binding protein-1 (YB-1)を生体内で抑制し、腫瘍の増大・転移を阻害できれば、汎用性の高い癌治療法が可能となるが、デリバリーデバイスなしでも生体内で機能するsiRNAやアンチセンス等の標的遺伝子発現抑制核酸構造体は見出されていない。また、核酸用デリバリーデバイスも未だ有用なものが報告されていない。
　本発明は、デリバリーデバイスの有無に関わらず、生体内で広範囲の種類の悪性腫瘍に対して効果を発揮しうる人工核酸アンチセンス抗悪性腫瘍剤を提供することを課題とする。
　本発明は以下を提供する。
[1]　13～17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、ヒトYB-1をコードするポリヌクレオチドを標的とする、すなわちYB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチド。
[2]　14～16塩基長である、1に記載のオリゴヌクレオチド。
[3]　15塩基長である、2に記載のオリゴヌクレオチド。
[4]　配列番号1または配列番号2の配列からなる、オリゴヌクレオチド。
[5]　少なくとも1つの架橋型核酸を含む、1～4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
[6]　架橋型核酸が、下記からなる群より選択されるいずれか一のヌクレオシド構造を有する、5に記載のオリゴヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 (式IおよびII中、
　Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,　2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。)。
[7]　少なくとも1つのホスホロチオエート型ヌクレオチドを含む、1～6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
[8]　1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、細胞または組織と接触させる工程を含む、細胞または組織におけるYB-1の発現の抑制方法。
[9]　1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、対象に投与する工程を含む、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置方法。
[10]　YB-1の発現に関連した疾患または状態が、癌である、9に記載の方法。
[11]　癌が、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌である、10に記載の方法。
[12]　癌が、抗癌剤耐性の癌である、10または11に記載の方法。
[13]　抗癌剤耐性の癌が、ゲムシタビン耐性の膵癌である、12に記載の方法。
[14]　1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
[15]　YB-1の発現に関連した疾患または状態を処置するための、14に記載の医薬組成物。
[16]　癌を処置するための、15に記載の医薬組成物。
[17]　胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌を処置するための、16に記載の医薬組成物。
[18]　抗癌剤耐性の癌を処置するための、16または17に記載の医薬組成物。
[19]　ゲムシタビン耐性の膵癌を処置するための、18に記載の医薬組成物。
[20]　皮下投与用または経口投与用である、請求項14～19のいずれか1項記載の医薬組成物。
　本発明により、YB-1の発現を効率的に調節可能なオリゴヌクレオチドが提供される。
YB-1は膵・胆道癌の癌細胞・新生血管で高発現する YB-1アンチセンスオリゴBNAの増殖抑制効果 YB-1アンチセンスオリゴBNAの細胞周期抑制とアポトーシス誘導 YB-1アンチセンスオリゴBNAの局所投与による抗腫瘍効果 YB-1アンチセンスオリゴBNAの血中投与による抗腫瘍効果 YB-1アンチセンスオリゴBNAの血中投与は腫瘍/肝臓/腎臓のYB-1発現を抑制する YB-1アンチセンス オリゴBNAの 血中投与の安全性評価(人工核酸(BNA)の血中反復投与は肝機能障害を誘発する) 架橋構造の改変による人工核酸の進化 人工核酸構造改変による安全性の改善　-　LNA/BNA vs BNAamide (AmNA)　- 人工核酸YB-1アンチセンスオリゴAmNAの血中投与による抗腫瘍効果 人工核酸YB-1アンチセンスオリゴAmNAの血中投与による抗腫瘍効果(Gemcitabine耐性膵癌に対して抗腫瘍効果を発揮) 様々なアンチセンスオリゴ核酸のYB-1発現抑制効果の比較。A：MiaPaCa2(膵癌細胞)、B：GBd-15細胞、C：TGBC2細胞 HCT116(大腸癌)皮下腫瘍モデルにASO_#1_AmNまたはASO_#10_AmNAを2回投与した場合のYB-1発現抑制効果。Saline; n=2、Ctrl; n=2、#1 AmNA; n=3、#10 AmNA; n=3 SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO_#1_AmNまたはASO_#10_AmNAを2回投与した場合のYB-1発現抑制効果。Saline; n=2、Ctrl; n=2、#1 AmNA; n=3、#10 AmNA; n=3 SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO_#10_AmNAを4回投与した場合の、YB-1発現抑制効果。 反復血中投与による膵癌・大腸癌に対する抗腫瘍効果。(A) 皮下腫瘍の増殖抑制。 (B)癌細胞へのアポトーシス誘導。(C)腫瘍組織の微小血管密度の抑制。 肺癌に対する抗腫瘍効果。(A)治療21日目の皮下腫瘍の写真。(B) Growth inhibition of LLC s.c. tumor(＊P<0.05, **P<0.01; n＝5) 悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果。 (A)YB-1 KD efficiency. *P<0.001. (B)悪性中皮腫細胞株：H226の写真(C)パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真。パネル右、治療21目の腫瘍重量(n=3, P<0.05)。 卵巣癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果。(A) #10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制。(B) 細胞増殖抑制。*P<0.001. (C)パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較。パネル右、Tumor growth inhibition(n=4, P<0.05)。 胃癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果。(A) #10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制。(B)濃度依存性の増殖抑制。*P<0.001. (C)パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較。パネル右Kaplan-Meier生存曲線(n=5, P<0.05)。 人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる抗癌剤増感作用。(A)膵癌細胞株MIA PaCa-2。(B)卵巣癌細胞株SKOV-3。 人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる放射線増感作用。 天然核酸、LNA/BNA、AmNA核酸から作成されたアンチセンスによるYB-1ノックダウン効率の比較。血管内皮細胞株(HUVEC, HPAEC)、膵癌細胞株(MiaPaCa2-)。*P < 0.01 vs BNA, P<0.0001 vs NA siRNAとAmNA-AONによるYB-1ノックダウン効率の比較。(A)mRNAレベル。 (B)蛋白レベル。*P < 0.05 15mer~18merによるYB-1ノックダウン効率の比較。
　数値範囲を「X～Y」で表す際は、その範囲は両端の値を含む。処置は、予防および治療を含み、好ましくは治療を指す。処置の対象は、ヒトである場合と非ヒト動物(例えば、マウス)である場合とを含む。「Aおよび/またはB」は、A、Bのうち、少なくとも一方であることを指し、Aのみである場合、Bのみである場合以外に、AおよびBである場合を含む。
〔標的〕
  本発明のオリゴヌクレオチドは、特定の核酸分子を標的とし、その発現を調節する。一般に、標的核酸は、例えば、その発現が特定の疾患または疾患状態に関連する細胞遺伝子(または遺伝子から転写されたmRNA)、または感染性因子由来の核酸分子であり得る。本発明において、標的核酸は、癌細胞と腫瘍新生血管に高発現する悪性化因子Y-box binding protein-1 (YB-1)をコードする。標的核酸は、一本鎖DNA、RNA、二本鎖DNAであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸内の標的領域、セグメントまたは部位にハイブリダイズし、YB-1の発現を調節する。調節は、発現を上方に制御することと、下方に制御すること(阻害)を含むが、好ましくは発現を下方に制御することを指す。発現の調節は、mRNAレベル、または 蛋白レベルで、確認することができる。
〔オリゴヌクレオチド〕
　本発明は、YB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドというとき、同一または異なるヌクレオシドが、リン酸ジエステル結合またはそれ以外のヌクレオシド間結合で2～50個結合した、オリゴマーまたはポリマーであるヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドは、天然型オリゴヌクレオチドと、天然型オリゴヌクレオチドの誘導体(非天然型、人工型、修飾された、ということもある。)とを含む。そのような誘導体としては、例えば、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；リン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられる。オリゴヌクレオチドというとき、特に記載した場合を除き、一本鎖のDNAまたはRNA、二本鎖のDNAまたはRNAを含む。本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様の一つは、天然型または非天然型の、一本鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはまた、特に記載した場合を除き、医薬として許容される塩の形態であるものを含む。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば13～18塩基長であり、好ましくは13～17塩基長である。好ましい態様の一つにおいては、14～16塩基長であり、より好ましくは15塩基長である。YB-1の発現を抑制するとは、適切な対照(例えばコントロールとなるオリゴヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドが存在しない)を用いた場合に対して、発現が75％以下であること、好ましくは70％以下であること、より好ましくは50％かであること、さらに好ましくは30％以下であることをいう。抑制率を評価するための詳細な実験方法は、本願明細書の実施例2等に述べられている。
　本発明のオリゴヌクレオチドはまた、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の、少なくとも8塩基長部分を含む。好ましい態様の一つにおいては、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の、少なくとも10塩基長部分、より好ましくは12塩基長部分、さらに好ましくは14塩基長部分を含む。特に好ましい態様の一つにおいては、配列番号1または配列番号2(好ましくは配列番号2)に記載の配列の全部を含む。配列番号2に記載の配列の全部を含む15mer、または配列番号2に記載の配列の全部を含み、さらに他の配列を含む17merは、本発明の特に好ましい態様の例である。配列表の配列番号2には、実施例の項に記載した実験で使用し、YB-1発現の抑制効果の高いオリゴヌクレオチドの配列が示されている。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾されていてもよい。すなわち、天然型オリゴヌクレオチドの誘導体(非天然型、人工型ということもある。)であってもよい。当該分野で公知であるように、ヌクレオチドは、ヌクレオシド部分を含み、ヌクレオシドは、塩基と糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は、時々「核酸塩基」または単に「塩基」と呼ばれるヘテロ環塩基である。ヘテロ環塩基の2つの最も一般的な種類は、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むものである。ペントフラノース糖を含むかかるヌクレオシドは、リン酸基が、該糖の2'、3'、または5'ヒドロキシル部に結合し得る。オリゴヌクレオチドの形成においては、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを互いに共有結合させ、線状高分子化合物を形成する。オリゴヌクレオチド内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間主鎖を形成するものと一般に称されている。RNAおよびDNAの通常の結合または主鎖は、3'から5'へのリン酸ジエステル結合である。
　オリゴヌクレオチドの修飾は、糖部分であってもよく、および/またはヌクレオシド間結合(主鎖)においてされていてもよい。
　糖部分が修飾されたオリゴヌクレオチドの例として、糖部分架橋型人工核酸BNA(Bridged Nucleic Acid)として知られているものが挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、これらを含んでいてもよい。本発明に適用可能な、糖部分が修飾されたヌクレオチドに含まれる構造(ヌクレオシド部分)を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　このようなオリゴヌクレオシドの調製法は、当業者にはよく知られている。これらのうち、特に好ましい例は、以下のヌクレオシド構造を含むものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上述の、本発明に適用可能な、糖部分が修飾されたヌクレオチドに含まれる構造(ヌクレオシド部分)、ならびに式IおよびII中、Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,　2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなる。
　Baseは、6-アミノプリン-9-イル基、2,6-ジアミノプリン-9-イル基、2-アミノ-6-クロロプリン-9-イル基、2-アミノ-6-フルオロプリン-9-イル基、2-アミノ-6-ブロモプリン-9-イル基、2-アミノ-6-ヒドロキシプリン-9-イル基、6-アミノ-2-メトキシプリン-9-イル基、6-アミノ-2-クロロプリン-9-イル基、6-アミノ-2-フルオロプリン-9-イル基、2,6-ジメトキシプリン-9-イル基、2,6-ジクロロプリン-9-イル基、6-メルカプトプリン-9-イル基、2-オキソ-4-アミノ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、4-アミノ-2-オキソ-5-フルオロ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、4-アミノ-2-オキソ-5-クロロ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-メトキシ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-メルカプト-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-ヒドロキシ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、2-オキソ-4-ヒドロキシ-5-メチル-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基、または4-アミノ-5-メチル-2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基(5-メチルシトシン-1-イル、またはmCと表すこともある。)であってもよい。
　Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。
　より好適には、Rは、水素原子、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、さらに好適には、Rは、水素原子またはメチル基である。
　架橋型ヌクレオチドは、より好ましくは下記のヌクレオシド構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式中、BaseおよびRは、上で定義したとおりである。
　糖部分の架橋は、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドのうち、少なくとも1つ、好ましくは数個(例えば、3つ以上、好ましくは4つ以上、さらに好ましくは5または6つ)においてされていてもよい。
  本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。
  リン原子をその中に含む、好ましい修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖としては、例えば、通常の3'-5'結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合された類似体、ならびにその中の一つ以上のヌクレオチド間結合が3'から3'、5'から5'、または2'から2'への結合である、逆の極性を有するものが挙げられる。逆の極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、3'末端ヌクレオチド間結合において、単一の、3'から3'への結合、すなわち、無塩基であり得る単一の逆のヌクレオシド残基(核酸塩基が、欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する)を含む。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形もまた、含まれる。このようなリン含有結合の調製法は、当業者にはよく知られている。
  リン原子をその中に含有しない、好ましい、修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルが混合されたヌクレオシド間結合、または一つ以上の、短鎖ヘテロ原子の、もしくはヘテロ環式の、ヌクレオシド間結合により形成される主鎖を有する。これらとしては、(一部はヌクレオシドの糖部分から形成された)モルホリノ結合を有するもの、シロキサン主鎖、スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖、リボアセチル(riboacetyl)主鎖、アルケン含有主鎖、スルファメート主鎖、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖、スルホネートおよびスルホンアミド主鎖、アミド主鎖、ならびに混合されたN、O、S、およびCH2成分部分を有する他のものが挙げられる。このようなオリゴヌクレオシドの調製法は、当業者にはよく知られている。
　修飾された主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの特に好ましい実施態様の一つは、ホスホロチオエート型(S化)のオリゴヌクレオチドである。ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドのリン酸基の酸素原子を硫黄原子で置換したものを指す。ホスホロチオエート型オリゴヌクレオチドは、核酸分解酵素に対して耐性を示す点で好ましい。ホスホロチオエート型(S化)は、オリゴヌクレオチドに含まれる一部または全部のヌクレオシド間結合においてすることができる。 
　オリゴヌクレオチドは、糖および主鎖の双方において修飾されていてもよい。このようなオリゴヌクレオチドの特に好ましい例は、下記のものである。このようなオリゴヌクレオチドの調製は、当業者であれば適宜行うことができ、また合成受託サービスを行う会社が複数存在しており、他社へ委託して製造することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　なお、配列番号Xに記載の配列というとき、そのヌクレオチド配列(塩基配列ということもある。)は、天然型のヌクレオチドのみからなる配列であってもよく、天然型ヌクレオチドの誘導体(修飾された、非天然型、人工型ということもある。)を含む配列であってもよい。すなわち、配列に関し、本明細書、請求の範囲、図面および配列表において記号Cまたはcは、そのヌクレオチドの塩基部分はシトシンまたはその誘導体（例えばシトシンの修飾体、具体的には5-メチルシトシン、2'-O-メチルシトシン等)であり；塩基以外の部分は、特に限定されず、天然型であってもよく、糖部分は架橋型であってもよく；主鎖またはヌクレオシド間結合は、例えばリン酸ジエステル結合中のリン酸基の酸素原子が硫黄原子で置換されたホスホロチオエート型(S化ということもある。)であってもよい。「A」または「a」、「G」または「g」、「T」または「t」、「U」または「u」においても同様である。またヌクレオチドまたは塩基配列に関し、「5」は、特に記載した場合を除き、5-メチルシトシンを指す。さらにヌクレオチドまたは塩基配列に関し、「N」または「n」は、特に記載した場合を除き、塩基部分が、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン/ウラシル、不明または他の塩基であるヌクレオチド（DNAまたはRNAであり、DNAであることが好ましい。）または塩基自体を指す。ヌクレオチドまたは塩基配列が大文字で記載された際は、特に記載した場合を除き、糖部分架橋型である塩基またはヌクレオチドを指す。
〔製剤〕
  本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の医薬として許容される、塩、エステル、もしくはかかるエステルの塩、またはヒトを含む動物に投与すると、その生物学的に活性のある代謝産物もしくは残留物を(直接もしくは間接的に)提供し得る任意の他の化合物であり得る。
  医薬として許容される塩は、本発明の化合物の生理学的におよび医薬として許容される塩、すなわち親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望まれない毒物学的効果をそれに付与しない塩のことを言う。オリゴヌクレオチドについての、医薬として許容される塩およびその使用の好ましい例は、当業者にはよく知られている。
　オリゴヌクレオチドに関して、医薬として許容される塩の好ましい具体例としては、限定されないが、(a)ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミン、などの陽イオンで形成された塩、(b)無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などで形成された酸付加塩、(c)例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アルコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの有機酸で形成された塩、ならびに(d)塩素、臭素、およびヨウ素などの元素の陰イオンから形成された塩が挙げられる。
　本発明の実施形態に係る医薬組成物は、種々の剤形とし、種々の投与経路を採ることができる。すなわち、本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望まれるかどうか、および治療される部分により、適切な経路で投与できる。投与は、局所的または全身的、経口または非経口であり得る。非経口投与の例としては、眼、膣、直腸等の粘膜を介しての投与；吸入または通気(例えばドライパウダーまたはエアロゾルとして噴霧することを含む。)による、胸腔、肺、気管内、または鼻腔内への投与；塗布または貼付による表皮への投与；注射または埋め込みによる皮下投与；注射または点滴による静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内または頭蓋内(髄腔内または脳室内を含む。)が挙げられる。
　医薬組成物により処置される対象は、動物を含む。動物は、マウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒト、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの哺乳動物であり得る。ヒト以外の霊長類としては、サル、およびチンパンジーが挙げられる。他の例は、マウス、ラット、イヌ、ヒト以外の霊長類、ネコ、またはブタなどの実験動物であり得る。好ましい態様では、処置の対象はヒトであり得る。
　本発明の医薬組成物は、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置のために用い得る。YB-1の発現に関連した疾患または状態の具体的な例は、癌である。癌には、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌が含まれる。
  本発明の医薬組成物へは、細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込み促進のために、促進剤が添加されてもよい。例えば、LIPOFECTINTM試薬(Junichiら,米国特許第5,705,188号)等のカチオン脂質、カチオングリセロール誘導体、およびポリリシン(Lolloら,国際特許公開WO 97/30731号)等のポリカチオン分子が使用できる。
　特に好ましいと考えられる実施態様の一つは、凍結乾燥した有効成分を、投与直前に生理食塩水等で溶解し、静脈内、腹腔内または局所へ、注射または点滴により投与することである。
  本発明の医薬組成物は、化学療法薬剤を含む他の医薬組成物とともに用いることができ、また化学療法で耐性となった対象に対して用い得る。かかる化学療法薬剤の例には、ヌクレオチドアナログが含まれる。より具体的には、プリンアナログ、例えばチオグアニン、リン酸フルダラビン(F-Ara-A、フルダラ)、クラドリビン(2-CdA、ロイスタチン)が含まれる。また、ピリミジンアナログ、例えば、シタラビン(Ara-C、キロサイド)やゲムシタビン(GEM、ジェムザール)が含まれる。ゲムシタビンは膵癌の治療で用いられる。他の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビスクロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトザントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、4-ヒドロキシペルオキシシクロホスホラミド、5-フルオロウラシル(5-FU)、5-フルオロデオキシウリジン(5-FUdR)、メトトレキサート(MTX)、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド(VP-16)、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール(DES)等である。
　医薬組成物は、有効成分であるオリゴヌクレオチドに加えて、医薬として許容される担体を含むようにしてもよい。医薬組成物は、抗癌剤と併用してもよい。医薬組成物と異なる作用機序を有する抗癌剤を併用することで、抗腫瘍効果の向上が期待できる。
  別の態様において、本発明の組成物は、第1の核酸を標的にする1つ以上のオリゴヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチド、および第2の核酸標的を標的にする1つ以上のさらなるオリゴヌクレオチドを含み得る。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的にした2つ以上のオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドの多数の例が当該分野において公知である。2つ以上の結合した化合物が、一緒にまたは連続して使用できる。
  投与は、数日～数ヶ月続く治療の過程内で、または治癒が達成されるか、または疾患状態の減少が達成されるまで、治療すべき疾患状態の重篤度および反応性に基づき、設計することができる。最適な投与スケジュールは、患者の身体内での薬物の蓄積を測定することにより計算できる。当業者であれば、最適な投薬量、投与方法および頻度を容易に決定できる。最適な投薬量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効能に依存して変動し、一般的には、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて効果的であることが見出されているEC50に基づいて評価できる。一般的に、有効成分の投薬量は、体重1kg当たり0.01μg～100 g、体重1kg当たり0.1μg～10 g、体重1kg当たり1.0μg～1 g、体重1kg当たり10.0μg～100 mg、体重1kg当たり100μg～10 mg、または体重1kg当たり1 mg～5 mgであり、1日毎に、1週間毎に、1ヶ月毎にもしくは1年毎に1回以上、または2～20年毎に、単回または複数回、投与できる。当業者は、投与の頻度を、体液または組織中での測定された薬物の滞留時間および濃度に基づいて容易に評価し得る。首尾良い治療の後、患者に、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けさせることが望ましくあり得るが、この場合、オリゴヌクレオチドを、体重1kg当たり0.01μg～100 gの範囲内で、1日毎に1回以上～20年毎に1回、維持投薬量で投与する。
  治療用組成物での治療の効果は、該治療を受けている患者または対象から組織または体液を回収した後に評価できる。生検試料は、患者または対象に有害な効果をもたらすことなく特定の組織から回収され得ることが当該分野で公知である。ある態様において、組織およびその構成細胞には、血液(例えば、ヒト造血前駆細胞、ヒト造血幹細胞、CD34＋細胞、CD4＋細胞等の造血細胞)、リンパ球および他の血液系細胞、骨髄、乳房、子宮頚部、結腸、食道、リンパ節、筋肉、末梢血、口腔粘膜および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。他の態様において、体液およびその構成細胞には、血液、尿、精液、滑液、リンパ液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。患者から採取した組織または体液は、標的mRNAまたはタンパク質の発現レベルから評価できる。さらに、特定の疾患状態、状態または表現型と関連することが知られているかまたは疑われている他の遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現レベルを評価し得る。mRNAレベルは、リアルタイムPCR、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーションまたはDNAアレイ分析により測定され得るか、または評価できる。タンパク質レベルは、ELISA、免疫ブロット、定量タンパク質分析、タンパク質活性分析(例えば、カスパーゼ活性分析)、免疫組織化学または免疫細胞化学を用いて測定され得るか、または評価できる。さらに、治療の効果は、当該分野で公知の手順の臨床的方法により、治療を受ける患者または対象から回収した前述の組織および体液における疾患または状態に関連するバイオマーカーを測定することにより評価できる。これらのバイオマーカーには、グルコース、コレステロール、リポタンパク質、トリグリセリド、遊離脂肪酸ならびにグルコースおよび脂質代謝の他のマーカー；リポタンパク質(a)またはLp(a)またはアポリポタンパク質B；肝臓トランスアミナーゼ、ビリルビン、アルブミン、血中尿素窒素、クレアチンならびに腎機能および肝機能の他のマーカー；インターロイキン、腫瘍壊死因子、細胞内接着分子、C反応性タンパク質および炎症の他のマーカー；テストステロン、エストロゲンおよび他のホルモン；腫瘍マーカー;ビタミン、ミネラルおよび電解質が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下、本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲は、実施例に限定されない。
　以下の実施例中、BNAとは、特に記載した場合を除き、LNA/2'4'-BNAを指す。
〔実施例1：膵癌および胆道癌におけるYB-1発現確認〕
　抗癌剤や放射線抵抗性に関与するYB-1は多くの癌種や腫瘍血管に高発現することが知られているが、抗癌剤や放射線耐性の膵・胆道癌での発現は未だ明らかではない。我々は臨床検体(ホルマリン固定標本から作製したパラフィン包埋切片)を用いて膵癌および胆道癌におけるYB-1発現を免疫染色で検討した。膵癌40例中37例の膵管癌細胞に高発現を認め、腫瘍血管にも癌細胞ほどの高頻度ではないが、YB-1高発現を認めた(40例中24例)。一方、胆道癌組織においては、癌細胞におけるYB-1発現は中程度で37例中26例に認め、膵・胆道癌でのYB-1高発現を確認した(図1)。
〔実施例2：アンチセンスオリゴ核酸のスクリーニングおよび評価〕
　候補アンチセンスオリゴ核酸を種々合成し、種々の癌細胞に対して遺伝子導入試薬Lipofectamine RNAiMaxを用いて導入して、YB-1発現抑制能を指標にスクリーニングを行い、5-20nM濃度で70％以上のノックダウン効率を示すASO#1およびASO#10を見出した(データ示さず)。ASO#10の構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　次に膵癌・血管内皮細胞に対するASO#10(「YB-1 ASO」と表すこともある。TCTcctgcaccCTGg、SEQ ID NO.:2)による増殖抑制効果を検討した。細胞を96穴プレートに60％コンフルエントで撒き、翌日、遺伝子導入試薬Lipofectamine RNAiMaxを用いて、ASO#10を膵癌細胞には最終濃度50nMで、血管内皮細胞には5nMで導入し、経時的にMTTアッセイ法にて増殖能を測定した。我々が合成したASO#10はコントロールアンチセンスオリゴ核酸(CATttcgaagtACTc、SEQ ID NO.:3)に比較して、有意に膵癌・血管内皮細胞の増殖抑制効果を認めた(図2)。なお、ASO#10により、胃癌および乳癌もノックダウンされることを確認済みである。
〔実施例3：YB-1 ASO BNAによる、細胞周期解析、アポトーシスの誘導確認〕
　実施例2で認めた癌・血管内皮細胞の増殖抑制効果の機序を明らかにするために、血管内皮細胞(1x105/well)に上記と同じ条件でYB-1 ASO BNA(TCTcctgcaccCTGg、SEQ ID NO.:2　配列中、大文字の箇所がBNAに相当する。以下の実施例において同じ。)5nMの濃度で導入した。導入72時間後に、細胞をPI (1μg/ml,) 30min, 37℃インキュベーションし、その後Flow cytometer (FACS CantoII) にて細胞周期解析を行った。YB-1 ASOはコントロールアンチセンスオリゴBNA(CATttcgaagtACTc、SEQ ID NO.:3　配列中、大文字の箇所がBNAに相当する。以下の実施例において同じ。)に比較して、G2/M分画が有意に減少し(22.1 vs 14.5% for HUVEC; 28.5 vs 14.0% for HPAEC細胞)、G2/M arrestが誘導された。更に、subG1分画が有意に増加し(17.7 vs 2.0% for HUVEC; 18.7 vs 1.3% for HPAEC)、アポトーシスの増加も認められた。
　アポトーシスの誘導の確認のため、血管内皮HUVEC細胞に蛍光FITC標識したAnnexin Vを投与し、その蛍光を観察したところ、YB-1 ASO BNAにより、アポトーシスのマーカーである細胞膜外フォスファチジルセリンと結合したAnnexin V陽性細胞の増加が認められたが、コントロールアンチセンスオリゴBNAで処理した細胞にはほとんどAnnexin Vを認めなかった。
　マイクロアレイを行ったところ、HUVEC、HPAEC細胞とも細胞周期・細胞分裂に関連する広範な遺伝子の発現抑制が認められた。蛋白質を抽出し、G2/M移行に関与するCDK1, Cyclin　B1の発現レベルを比較したところ、YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスオリゴに比較して、明らかに発現を抑制していると認められた(図3)。
〔実施例4：YB-1 ASO BNAの局所投与による効果〕
　ルシフェラーゼを安定発現するMiaPaCa-luc膵癌細胞をヌードマウス大腿皮下に移植して約6-7mm大の皮下腫瘍を作成した。YB-1 ASO BNA(最終濃度 10 μM)をアテロコラーゲンインプラントと容量比1：1で混合し腫瘍内に局所投与し(毎週1回、計2回)、経時的に腫瘍容量(ルシフェラーゼ活性)をIVISイメージングにて評価した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスオリゴBNAに比較して、有意に腫瘍量の抑制が認められ、Day 17日目の肉眼的所見でも、YB-1 ASO BNA群では腫瘍は白色調に退縮を認めた。一方、コントロールアンチセンスBNA群では発赤を伴う腫瘍の増大を認めた(図4)。
〔実施例5：YB-1 ASO BNAの血中投与による効果〕
　SUIT2膵癌およびHCT116大腸癌細胞をヌードマウス大腿皮下に移植して約6-7mm大の皮下腫瘍を作成した。YB-1 ASO BNA(200 μg/200 μL)を尾静脈から血中投与し(毎週1回、計3回)、経時的に腫瘍径を計測し腫瘍量を測定した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して、1/4～1/5と腫瘍増大を抑制した(図5)。
〔実施例6：YB-1 ASO BNAの血中投与によるYB-1発現抑制の確認〕
　上記HCT116大腸癌皮下腫瘍を作成したヌードマウスに、YB-1 ASO BNA(図6中では「ASO#10」と表記されている。200 μg/200 μL)を尾静脈から血中投与し(毎週1回、計2回)、最終投与48時間後に皮下腫瘍、肝臓、腎臓を採取してRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を解析した。YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して有意に腫瘍、肝臓、腎臓のYB-1発現が約1/3に抑制されていた。更に、腫瘍の凍結切片を用いてYB-1の免疫染色を行ったところ、YB-1 ASO BNAはコントロールアンチセンスBNAに比較して腫瘍組織内のYB-1発現と新生血管マーカーのCD31の発現が低下しており、生体内でのYB-1発現抑制が確認できた(図6)。
〔実施例7：YB-1 ASO BNAの血中投与による安全性の確認〕
　抗腫瘍効果を認めたYB-1 ASO BNAの血中投与による安全性を血液検査で検討した。ヌードマウスにYB-1 ASO BNA(図7中では、「ASO-YBX1」と表記されている。)100μg/200 μL, 200 μg/200 μLの濃度で尾静脈から血中単回投与した後48時間後に採血し、肝・腎機能を評価するためにALT,　T.Bil, BUN, Creatininの項目に関して、血液生化学検査を行ったところ、YB-1 ASO BNA、コントロールアンチセンスBNAとも機能異常を認めなかった。しかし、3回反復投与した場合、YB-1 ASO BNAのみ肝機能マーカーAST, T.Bilの上昇を認めたが、コントロールアンチセンスBNAと生食コントロールでは機能異常は認めなかった(図7)
〔実施例8：架橋型人工核酸AmNA〕
　共同発明人：小比賀、山本らは(大阪大学)架橋型人工核酸の開発並びにその架橋構造の最適化を進めてきた(図8左下)。AmNAと呼ばれる架橋型人工核酸は従来の2',4'-BNA/LNAと同等の標的RNA結合能を維持しつつ、DNAに対しては結合力を低下させることに成功しており、RNA選択性に優れた架橋型人工核酸である(図8右上)。さらに、In vitroでのヌクレアーゼ(3'-エキソヌクレアーゼ)に対する分解耐性に関する比較実験で、これまでに開発されてきた関連の架橋型人工核酸2',4'-BNAに比べ高い耐性能力を示している(前掲特許文献3)。
〔実施例9：YB-1 ASO AmNAの血中投与による肝機能への影響〕
　実施例7と同様に、担癌ヌードマウスの尾静脈からYB-1 ASO BNA(図9中では、「ASO #10」と表記されている。)およびYB-1 ASO AmNA(図9中では、「ASO #10 AmNA」と表記されている。)を 200 μgのオリゴヌクレオチドを、各々200 μLの生理食塩水に溶解し、尾静脈から血中投与して(毎週1回、計3回)、最終投与の48時間後に血液を採取し、血液生化学検査を行った。YB-1 ASO AmNAの構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　2',4'-BNA/LNA で作成したYB-1 ASOは、肝機能障害のマーカーのAST, ALTがControl ASOに比較して有意に上昇するのに対して、AmNAで合成したYB-1 ASOは肝機能障害を誘発しなかった(図9)。YB-1 ASO AmNAの高い安全性を示している。
〔実施例10：YB-1 ASO AmNAの血中投与による抗腫瘍効果〕
　実施例9で従来のBNAで構成されるASOに比較して高い安全性が認められたAmNAタイプのYB-1 ASOの血中投与による抗腫瘍効果を検討した。ヌードマウス大腿皮下部にヒト大腸癌細胞HCT116を移植し、直径が6-7mmの皮下腫瘍が形成されてから(平均腫瘍容量 78 vs 72 mm3)、尾静脈からYB-1 ASO AmNAを 200 μg/200 μL血中投与した(隔週1回、計2回)。継時的に腫瘍径を計測し、(長径)x(短径)2/2の計算式で算出した腫瘍容量をコントロールアンチセンス群と比較した。2回目の投与後1週間目(day 28)に皮下腫瘍を採取し、重量を比較した。YB-1 ASO AmNA群はコントロールアンチセンス群に比較して、腫瘍径でも腫瘍重量でも約1/5に抑制された(図10)。＊P<0.05
〔実施例11：YB-1 ASO AmNAの抗癌剤耐性癌細胞に対する抗腫瘍効果〕
　抗癌剤ゲムシタビン耐性の膵癌を長期間低濃度のゲムシタビン含有培地で培養することでヒト膵癌SUIT2細胞株を作成した(IC50値：耐性株100 nM vs 親株5 nM)。皮下腫瘍を実施例10と同様に作成し、同じプロトコールでYB-1 ASO AmNAおよびコントロールアンチセンスを200 μg/200 μL血中投与した(隔週1回、計2回)。YB-1 ASO AmNA群はコントロールアンチセンス群に比較して、腫瘍径でも腫瘍重量でも約1/3に抑制され、抗癌剤耐性癌細胞に対しても抗腫瘍効果を発揮することがあきらかとなった(図11)。＊P<0.05
〔実施例12：種々のアンチセンスのYB-1発現抑制効果の比較〕
　所定の濃度の各アンチセンスを、実施例2の方法で種々の癌細胞に用いて導入し、48時間後にRNA sampleを採取して、qRT-PCRで解析した。結果を図12に示す。
　本研究で用いたアンチセンス核酸の配列を下表にまとめた。HsYBX1-839-BNA18=ASO#16, HsYBX1-840-BNA18=ASO#17およびHsYBX1-841-BNA18=ASO#18は、18merで1つずつターゲットサイトをずらしたものである。なお、大文字で記載されたヌクレオチドはBNAであり、例えばCCTは5(L)5(L)T(L)を意味し、5(L)=LNA_mCである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
〔実施例13：YB-1 ASO AmNAによるYB-1発現抑制の確認〕
　実施例6と同様の方法で、AmNAタイプのYB-1 ASOのYB-1発現抑制効果を確認した。本研究で用いたアンチセンス核酸の配列を下表にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　図13Aに、HCT116(大腸癌)皮下腫瘍モデルにASO #1 AmNAおよび#10 AmNAを2回投与(1回目の投与1週間後に、2回目を投与)した場合の結果を示す。図13Bに、SUIT2-GR(膵癌)皮下腫瘍モデルにASO#1AmNA, #10AmNAを2回投与(1回目の投与1週間後に、2回目を投与)した場合の結果を示す。図13Cに、ASO #10 AmNAを週1回、計4回投与した場合の結果を示す。
〔実施例14：反復血中投与による膵癌・大腸癌に対する抗腫瘍効果〕
　ゲムシタビン耐性膵癌SUIT2-GRおよび大腸癌HCT116をヌードマウス大腿皮下に移植することにより皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、3週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与した。継時的に腫瘍径を測定した。毎週投与のプロトコールでも表3のごとく、安全性に問題なく、day14, 21には皮下腫瘍の有意な抑制効果が認められた(図14(A))。
　表3に、治療実験における血液サンプルを測定した結果を示す。血液一般、生化学検査に異常を認めなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　実施例3の方法に準じて、in vitro膵癌細胞株SUIT2に、#10AmNA YB-1アンチセンスを20nMで導入した。Flow cytometer(FACS)解析、およびアポトーシスマーカー：PARPp85、Caspase-3のWestern blot解析で、膵癌細胞においてアポトーシス誘導が認められた(図14(B))。
　腫瘍組織の微小血管密度の抑制。治療実験(A)のSUIT2-GR皮下腫瘍における新生血管マーカーCD31の免疫染色を行った。その結果、#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与により微小血管密度が減少し、新生血管阻害が誘導されたことが認められた(図14(C))。
〔実施例15：肺癌に対する抗腫瘍効果〕
　肺癌Lewis lung cancerの皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、3週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与した。継時的に腫瘍径を測定した。その結果、治療21日目の皮下腫瘍の写真で、コントロール群に比較して#10AmNA YB-1アンチセンス投与群の小さな皮下腫瘍を認めた(図15(A))。治療14日目、21日目には#10AmNA YB-1アンチセンス投与群において、有意にコントロールアンチセンス群より腫瘍の増大が抑制された(図15(B))。(＊P<0.05, **P<0.01; n＝5)
〔実施例15：悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果〕
　悪性中皮腫細胞株H226に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、増殖抑制 (B)が認められた。*P<0.001.
　悪性中皮腫細胞株H226の皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、2週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図15(C)に示す。パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍重量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、腫瘍の増大が抑制された(n=3, P<0.05)。
〔実施例16：悪性中皮腫に対する抗腫瘍効果〕
　悪性中皮腫細胞株H226に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、増殖抑制 (B)が認められた。*P<0.001.
　悪性中皮腫細胞株H226の皮下腫瘍モデルを作成し、腫瘍径50mm3が形成されてから、毎週1回、2週間、#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW尾静脈より投与し、継時的に腫瘍径を測定した。結果を図16(C)に示す。パネル左は治療後の皮下腫瘍の写真を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍重量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、腫瘍の増大が抑制された(n=3, P<0.05)。
〔実施例17：卵巣癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果〕
　卵巣癌細胞株SKOV3に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。濃度依存性に#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(図17(A))、増殖抑制(図17 (B))が認められた。*P<0.001. 
　Luciferase安定発現卵巣癌細胞株SKOV3の腹膜播種モデルを作成し、癌移植1週間後から毎週1回、2週間#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW腹腔内に投与し、継時的にluciferase活性で腫瘍量を評価した。結果を図17(C)に示す。パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較を示す。パネル右で示すように、有意に腫瘍量は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群で、コントロール群に比較して、抑制された(n=4, P<0.05)。
〔実施例18：胃癌腹膜播種に対する抗腫瘍効果〕
　胃癌細胞株AS44に対して#10AmNA YB-1アンチセンスを試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 YB-1の発現をreal-time RT-PCRで検討した。#10AmNA YB-1アンチセンスによるYB-1発現抑制(A)、濃度依存性の増殖抑制(B)が認められた。*P<0.001. 
　Luciferase安定発現胃癌細胞株AS44-lucの腹膜播種モデルを作成し、癌移植1週間後から毎週1回、2週間#10AmNA YB-1アンチセンスを10mg/kg BW腹腔内に投与した。継時的にluciferase活性で腫瘍量を評価した。結果を図18(C)に示す。パネル左は治療21日後の腹膜播種luciferaseシグナルの比較を示す。パネル右Kaplan-Meier生存曲線で示されるように、生存率は#10AmNA YB-1アンチセンス血中投与群は、コントロール群に比較して有意に延長した(n=5, P<0.05)。
〔実施例19：人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる抗癌剤増感作用〕
　膵癌細胞株MIA PaCa-2(図19(A))、卵巣癌細胞株SKOV-3(図19(B))に対して#10AmNA YB-1アンチセンス(5 nM)を試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 抗癌剤による殺細胞効果をアンチセンスの有無で比較した。低濃度#10AmNA YB-1アンチセンス導入による殺細胞効果の増強が認められた。同等の殺細胞効果を認めた抗癌剤濃度を青(5-FU)、赤色(Gemcitabine)で示す。
〔実施例20：人工核酸YB-1阻害アンチセンスによる放射線増感作用〕
　膵癌細胞株SUIT-2に対して#10AmNA YB-1アンチセンス(10 nM)を試薬Lipofectamine RNAiMaxで導入し、 X線照射による殺細胞効果をアンチセンスの有無で比較した。結果を図20に示す。低濃度YB-1アンチセンス導入による殺細胞効果の増強が認められた。
〔実施例21：天然核酸、LNA/BNA、AmNA核酸から作成されたアンチセンスによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
　血管内皮細胞株(HUVEC, HPAEC)、膵癌細胞株(MiaPaCa2-)に YB-1天然型核酸アンチセンス(NA)、LNA/BNA型核酸アンチセンス(BNA), AmNA型核酸アンチセンス(AmNA)を各濃度で導入した。24時間後にRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を評価した。結果を図21に示す。AmNA型核酸アンチセンスによるYB-1のノックダウン効率は有意に天然型核酸アンチセンス、LNA型核酸アンチセンスよりも高かった。The graph shows mean ± SD (n=3). *P < 0.01 vs BNA, P<0.0001 vs NA
〔実施例22：siRNAとAmNA-AONによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
　膵癌細胞株(AsPC-1, MIA PaCa-2, Suit-2)に YB-1 siRNA または　YB-1 #10AmNAを導入(最終濃度20nM)。48時間後にRNAと蛋白質を抽出し、real-time RT-PCR、Western blotにてYB-1発現をmRNA(A) 、蛋白レベル(B)で評価した。結果を図22に示す。siRNA, #10AmNA-AONによるmRNAレベルのノックダウン効率はともに高く、明らかな差を認めなかった。一方、蛋白レベルでのノックダウン効率はAmNA-AONが明らかにsiRNAよりも著明であった。The graph shows mean ± SD (n=3). *P< 0.05
〔実施例23：15~18merによるYB-1ノックダウン効率の比較〕
　膵癌細胞株(MIA PaCa-2)、大腸癌細胞株(HCT-116)および卵巣癌細胞株(SKOV3)に15~18merのオリゴヌクレオチドを各濃度で導入した。24時間後にRNAを抽出し、real-time RT-PCRにてYB-1発現を評価した。15mer以外の用いたオリゴヌクレオチドの構造を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　結果を図23に示す。細胞によっては、16merまたは17merのアンチセンスによるYB-1のノックダウン効率が優れていた。
　本発明は、医薬品製造、医療、およびライフサイエンス等の分野で有用である。

Claims (20)

　13～17塩基長のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも8塩基長部分を含み、YB-1の発現を調節する、オリゴヌクレオチド。
　14～16塩基長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
　15塩基長である、請求項2に記載のオリゴヌクレオチド。
　配列番号1または配列番号2の配列からなる、オリゴヌクレオチド。
　少なくとも1つの架橋型ヌクレオチドを含む、請求項1～4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
　架橋型ヌクレオチドが、下記からなる群より選択されるいずれか一のヌクレオシド構造を有する、請求項5に記載のオリゴヌクレオチド
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  (式IおよびII中、
　Baseは、α群から選択される任意の置換基を1以上有していてもよいプリン-9-イル基または2-オキソ-1,2-ジヒドロピリミジン-1-イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数1から6の直鎖アルキル基、炭素数1から6の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数1から6の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数1から6の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
　Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、該α群から選択されるいずれかの置換基を1以上有していてもよく、そしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。)。
　少なくとも1つのホスホロチオエート型ヌクレオチドを含む、請求項1～6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
　請求項1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、細胞または組織と接触させる工程を含む、細胞または組織におけるYB-1の発現の調節方法。
　請求項1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドを、対象に投与する工程を含む、YB-1の発現に関連した疾患または状態の処置方法。
　YB-1の発現に関連した疾患または状態が、癌である、請求項9に記載の方法。
　癌が、胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌である、請求項10に記載の方法。
　癌が、抗癌剤耐性の癌である、請求項10または11に記載の方法。
　抗癌剤耐性の癌が、ゲムシタビン耐性の膵癌である、請求項12に記載の方法。
　請求項1～7のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド、および医薬として許容される担体を含む、医薬組成物。
　YB-1の発現に関連した疾患または状態を処置するための、請求項14に記載の医薬組成物。
　癌を処置するための、請求項15に記載の医薬組成物。
　胃癌、大腸癌、食道癌、乳癌、膵癌、胆道癌、肺癌、悪性中皮腫、または卵巣癌を処置するための、請求項16に記載の医薬組成物。
　抗癌剤耐性の癌を処置するための、請求項15または16に記載の医薬組成物。
　ゲムシタビン耐性の膵癌を処置するための、請求項18に記載の医薬組成物。
　皮下投与用または経口投与用である、請求項14～19のいずれか1項記載の医薬組成物。
PCT/JP2015/069947 2014-07-10 2015-07-10 アンチセンス抗悪性腫瘍剤 WO2016006697A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016532985A JP6722586B2 (ja) 2014-07-10 2015-07-10 アンチセンス抗悪性腫瘍剤
US15/325,278 US20170211073A1 (en) 2014-07-10 2015-07-10 Antisense antineoplastic agent
EP15818219.6A EP3168305A4 (en) 2014-07-10 2015-07-10 Antisense antineoplastic agent

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462023067P 2014-07-10 2014-07-10
US62/023,067 2014-07-10

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016006697A1 true WO2016006697A1 (ja) 2016-01-14

Family

ID=55064324

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2015/069947 WO2016006697A1 (ja) 2014-07-10 2015-07-10 アンチセンス抗悪性腫瘍剤

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20170211073A1 (ja)
EP (1) EP3168305A4 (ja)
JP (1) JP6722586B2 (ja)
WO (1) WO2016006697A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018180005A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
WO2019013141A1 (ja) 2017-07-10 2019-01-17 国立大学法人大阪大学 Ｔｄｐ－４３の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途
WO2019131719A1 (ja) 2017-12-27 2019-07-04 神戸天然物化学株式会社 高脂溶性ホスホラミダイトの製造
WO2020009151A1 (ja) 2018-07-04 2020-01-09 国立大学法人名古屋大学 タウのスプライシングを制御するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途
JP2020519615A (ja) * 2017-05-08 2020-07-02 オーグマニティ ナノ リミテッド 急速に進化する生物学的実体の処置

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114540349B (zh) * 2020-11-27 2024-11-22 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 结合yb-1蛋白的核酸分子

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039352A1 (fr) * 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
WO2001030800A1 (en) * 1999-10-26 2001-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of y-box binding protein 1 expression
WO2011052436A1 (ja) * 2009-10-29 2011-05-05 国立大学法人大阪大学 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド
JP2011088876A (ja) * 2009-10-26 2011-05-06 Univ Of Occupational & Environmental Health Japan 腫瘍新生血管血管内皮細胞の新しいバイオマーカーとそれを標的とした癌治療薬
JP2013216627A (ja) * 2012-04-10 2013-10-24 Kyushu Univ アポトーシス誘導剤及び癌治療薬

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039352A1 (fr) * 1997-03-07 1998-09-11 Takeshi Imanishi Nouveaux analogues de bicyclonucleoside et d'oligonucleotide
WO2001030800A1 (en) * 1999-10-26 2001-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of y-box binding protein 1 expression
JP2011088876A (ja) * 2009-10-26 2011-05-06 Univ Of Occupational & Environmental Health Japan 腫瘍新生血管血管内皮細胞の新しいバイオマーカーとそれを標的とした癌治療薬
WO2011052436A1 (ja) * 2009-10-29 2011-05-05 国立大学法人大阪大学 架橋型人工ヌクレオシドおよびヌクレオチド
JP2013216627A (ja) * 2012-04-10 2013-10-24 Kyushu Univ アポトーシス誘導剤及び癌治療薬

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RAHMAN, S. M. A. ET AL.: "RNA interference with 2',4'-bridged nucleic acid analogues", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 18, no. 10, 2010, pages 3474 - 3480, XP055057706 *
See also references of EP3168305A4 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018180005A1 (ja) * 2017-03-31 2018-10-04 国立研究開発法人日本医療研究開発機構 コンドロイチン硫酸生合成を阻害するアンチセンス核酸
JP2020519615A (ja) * 2017-05-08 2020-07-02 オーグマニティ ナノ リミテッド 急速に進化する生物学的実体の処置
WO2019013141A1 (ja) 2017-07-10 2019-01-17 国立大学法人大阪大学 Ｔｄｐ－４３の発現量を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途
WO2019131719A1 (ja) 2017-12-27 2019-07-04 神戸天然物化学株式会社 高脂溶性ホスホラミダイトの製造
WO2020009151A1 (ja) 2018-07-04 2020-01-09 国立大学法人名古屋大学 タウのスプライシングを制御するアンチセンスオリゴヌクレオチド及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2016006697A1 (ja) 2017-04-27
US20170211073A1 (en) 2017-07-27
EP3168305A4 (en) 2018-01-03
JP6722586B2 (ja) 2020-07-15
EP3168305A1 (en) 2017-05-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101176245B1 (ko) ＨＩＦ－１ａ 발현의 억제를 위한 효능적 ＬＮＡ 올리고뉴클레오티드
JP6722586B2 (ja) アンチセンス抗悪性腫瘍剤
JP5107047B2 (ja) Ｌｎａオリゴヌクレオチドおよび癌の処置
ES2329131T3 (es) Compuestos oligomericos para modular la expresion de survivina.
TW201723176A (zh) Ｋｒａｓ表現之調節劑
EA015570B1 (ru) Фармацевтическая композиция
US20030087861A1 (en) Combined approach to treatment of cancer using a c-myc antisense oligomer
JP2014511686A (ja) 転写のシグナル伝達及び活性化因子３（ｓｔａｔ３）発現の調節
DK2898887T3 (en) Combination of telomerase inhibitor and gemcitabine for the treatment of cancer
JP2006518197A (ja) ラス発現の改変のためのオリゴマー化合物
KR101142080B1 (ko) 전립선암 및 다른 암의 치료 방법 및 조성물
CA2727285A1 (en) Inhibition of hrp-3 using modified oligonucleotides
WO2022031237A1 (en) Modulation of signal transducer and activator of transcription 3 (stat3) expression
CN101437942A (zh) 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
JP2024535869A (ja) Ｗｆｄｃ２の発現を調節するアンチセンス化合物
EP3330378B1 (en) Modified sirna, and pharmaceutical composition containing same
JP6934695B2 (ja) 核酸医薬とその使用
WO2021039879A1 (ja) 胃癌分子標的核酸医薬
TW201014594A (en) RNA antagonists targeting Hsp27
JP7017193B2 (ja) Ｒｎａ作用抑制剤及びその利用
US20240076672A1 (en) Double-helix oligonucleotide construct comprising double-stranded mirna and use thereof
EP4403634A1 (en) Antisense compound that regulates expression of wfdc2

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15818219

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016532985

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015818219

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015818219

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15325278

Country of ref document: US