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WO2015165746A1 - Verfahren zur produktion von l-aminosäuren unter verwendung eines alkaliphilen bakteriums - Google Patents

Verfahren zur produktion von l-aminosäuren unter verwendung eines alkaliphilen bakteriums Download PDF

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WO2015165746A1
WO2015165746A1 PCT/EP2015/058307 EP2015058307W WO2015165746A1 WO 2015165746 A1 WO2015165746 A1 WO 2015165746A1 EP 2015058307 W EP2015058307 W EP 2015058307W WO 2015165746 A1 WO2015165746 A1 WO 2015165746A1
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WO
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seq
sequence identity
sequence
polynucleotides
well
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/058307
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ines Ochrombel
Brigitte Bathe
Marleen Hasselmeyer
Jörn Kalinowski
Christian RÜCKERT
Marcus PERSICKE
Original Assignee
Evonik Degussa Gmbh
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from DE102014208199.8A external-priority patent/DE102014208199A1/de
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Priority to CN201580023593.6A priority patent/CN106574254A/zh
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    • C12Y305/02007—Imidazolonepropionase (3.5.2.7)
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    • C12Y305/03—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amidines (3.5.3)
    • C12Y305/03013—Formimidoylglutamate deiminase (3.5.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01049—Urocanate hydratase (4.2.1.49)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01003—Histidine ammonia-lyase (4.3.1.3)

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of L-amino acids, in which an alkaliphilic bacterium, in particular a strain of the species Corynebacterium humireducens, is used.
  • Corynebacterium are used, are known in the art.
  • Corynebacterium species are known, these species are usually used bacteria of the species Corynebacterium glutamicum, as this species has been found to be particularly advantageous for the production of L-amino acids.
  • the object of the present invention was to provide a new strain which, as an alternative to C. glutamicum, is either directly suitable for the production of L-amino acids because it has a significant overproduction of at least one L-amino acid or else at least as a promising starting strain for the development of a new L-amino acid production strain is considered.
  • Bacterium namely a bacterium of the species Corynebacterium humireducens, already naturally the L-amino acids L-alanine, L-glutamic acid and L-valine in a significant amount overproduced.
  • C. humireducens thus represents at the same time a suitable starting point for the production of further L-amino acid production strains. Because by corresponding diversion of the bacterial metabolism, the overproduction of said L-amino acids can be converted into an overproduction of other desired L-amino acids. The naturally occurring overproduction of L-alanine is probably due mainly to a highly efficient alanine dehydrogenase found in C. humireducens.
  • Corynebacteria have hitherto been described as hat genes, but none of them have such active hat genes whose presence already leads to an accumulation of L-glutamate in the cell interior of the wild type.
  • a first subject of the present invention is therefore a method for
  • an alkaliphilic bacterium preferably an alkaliphilic coryneform bacterium, in particular an alkaliphilic Corynebacterium, more preferably C. humireducens, is used in this process.
  • Alkaline bacteria according to the invention are preferably halotolerant and / or
  • an “alkaliphilic bacterium” is meant, according to the invention, a bacterium capable of growing at a pH of 8.5 to 1 1. Preferably, it is to be understood as meaning a bacterium which is also capable of to grow at a pH of 9 to 10.5.
  • halotolerant bacterium a bacterium capable of growing at water activities of 0.6 to 0.98, preferably including a bacterium which is capable of doing so Water activities grow from 0.75 to 0.9.
  • L-amino acid is to be understood as meaning in particular the proteinogenic L-amino acids.
  • the L-amino acid here is preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of the aspartate family , in particular L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine.
  • the L-amino acid is particularly preferably selected from L-alanine, L-valine, L-glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine, in particular from L-alanine, L-valine, L-glutamate and L- lysine.
  • the strain C. humireducens is described for the first time by Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (201 1), 61, 882-887). He was deposited with the DSMZ under the accession number DSM 45392, his 16S rRNA was deposited with EMBL and has accession number GQ421281.
  • the parent strain is a halotolerant, alkaliphilic, humic acid reducing bacterium.
  • the present invention likewise relates to an alanine dehydrogenase (Aid), characterized in that it has a sequence identity of at least 85 or 90%, preferably at least 92, 94, 96 or 98%, especially of 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 72.
  • a further subject of the present invention is therefore likewise a polynucleotide which codes for an alanine dehydrogenase according to the invention. It is preferably a polynucleotide having a sequence identity of at least 70 or 75%,
  • the present invention therefore also provides the enzymes of the hut cluster, selected from a) a urocanate hydratase (hutU), characterized in that it has a
  • a histidine-ammonialase (hutH), characterized in that it has a
  • Another object of the present invention are therefore also polynucleotides that code for the genes of the invention hat cluster.
  • polynucleotides preferably the following polynucleotides: a) a polynucleotide coding for a uroconate hydratase (hutU), and a
  • Sequence identity of at least 70 or 75%, preferably of at least 80 or 85%, more preferably of at least 90 or 95%, especially of 100%, to the sequence of position 301 to 1983 according to SEQ ID NO: 189 and / or under stringent conditions are hybridized with a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence from position 301 to 1983 according to SEQ ID NO: 189;
  • Sequence identity of at least 70 or 75%, preferably of at least 80 or 85%, more preferably of at least 90 or 95%, especially of 100%, to the sequence of position 301 to 1851 according to SEQ ID NO: 193 and / or under stringent conditions are hybridized with a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence from position 301 to 1851 according to SEQ ID NO: 193; and d) a polynucleotide encoding a formididoylglutamase (hutG), and a
  • Sequence is complementary to the sequence from position 301 to 1209 according to SEQ ID NO: 195.
  • stringent conditions is meant according to the invention washing at a salt concentration of 1 ⁇ SSC and 0.1% by weight SDS at a temperature of 80 ° C.
  • the present invention also relates to polynucleotides which are complementary to the coding polynucleotides according to the invention are.
  • the present invention also relates to vectors, in particular cloning and expression vectors, containing polynucleotides according to the invention.
  • vectors can correspondingly be incorporated into microorganisms, in particular coryneform bacteria, in particular of the genus Corynebacterium, or Enterobacteriaceae, in particular of the genus Escherichia.
  • a polynucleotide according to the invention can furthermore, for the purpose of expression of the encoded genes, also be incorporated into the genome of microorganisms, in particular into the genome of coryneform bacteria, in particular those of the genus Corynebacterium, or into the genome of Enterobacteriaceae, in particular those of the genus Escherichia.
  • Another subject of the present invention are accordingly recombinant microorganisms, preferably bacteria, especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium, particularly preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, and Enterobacteriaceae, especially those of the genus Escherichia, which is a novel Alanine dehydrogenase and / or one or more, preferably all, enzymes according to the invention of the hat cluster and / or one or more polynucleotides according to the invention and / or vectors according to the invention.
  • bacteria especially coryneform bacteria, especially those of the genus Corynebacterium, particularly preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, and Enterobacteriaceae, especially those of the genus Escherichia, which is a novel Alanine dehydrogenase and / or one or more, preferably all, enzymes according to the invention of the
  • a preferred object here are recombinant corynebacteria, in particular of the species C. humireducens and of the species C. glutamicum, which contain an alanine dehydrogenase according to the invention and / or a polynucleotide coding for them and / or at least one vector comprising this polynucleotide.
  • Further preferred objects here are recombinant corynebacteria, in particular of the species C. humireducens and of the species C. glutamicum, which contain at least one, preferably all, enzyme (s) of the hat cluster and / or polynucleotides coding for them and / or at least one containing these polynucleotides vector.
  • a particular object of the present invention are in particular also also
  • recombinant microorganisms preferably bacteria, in particular coryneform bacteria, especially those of the genus Cornyebacterium with the exception of the species C.
  • humireducens in particular of the species C. glutamicum, which contain an alanine dehydrogenase according to the invention and / or one or more, preferably all, enzymes according to the invention of the hat cluster and / or one or more polynucleotides according to the invention and / or vectors according to the invention.
  • a "recombinant microorganism” or “recombinant bacterium” is to be understood as meaning a microorganism or bacterium which has been subjected to at least one genetic engineering measure.
  • the genetic engineering measure may be, in particular, a targeted or undirected mutation, the incorporation of a foreign gene, and / or the overexpression or attenuation of a host or alien gene.
  • a targeted or undirected mutation the incorporation of a foreign gene, and / or the overexpression or attenuation of a host or alien gene.
  • inventive recombinant microorganism or a recombinant bacterium according to the invention by the overexpression or attenuation of at least one gene.
  • inventive recombinant microorganism or a recombinant bacterium according to the invention by the overexpression or attenuation of at least one gene.
  • Corynebacterium efficiens such as the type strain DSM44549
  • Corynebacterium glutamicum such as the type strain ATCC13032 or the strain R
  • Corynebacterium ammoniagenes such as the strain
  • Corynebacterium humireducens such as strain DSM 45392, and Corynebacterium pekinese, such as strain CGMCC no. 5361.
  • Particularly preferred are the species Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium humireducens. If in the context of this application the strain Corynebacterium humireducens is mentioned, it is preferably the strain DSM 45392 or a strain derived therefrom.
  • Some representatives of the species Corynebacterium glutamicum are also known in the art under other names.
  • Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium molassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium
  • Strains designated "ATCC” can be purchased from the American Type Culture Collection (Manassas, Va.) Strains designated “DSM” can be obtained from the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Germany). Strains designated “NRRL” may be derived from the
  • ARS Agricultural Research Service Patent Culture Collection
  • CGMCC China General Microbiological Culture Collection Center
  • Another object of the present invention is also a method for overproduction of an L-amino acid, characterized in that in this method an alanine dehydrogenase according to the invention and / or at least one
  • Inventive enzyme of the hat cluster preferably all the enzymes according to the invention of the hat cluster, and / or at least one polynucleotide according to the invention and / or a recombinant microorganism according to the invention, preferably a recombinant bacterium according to the invention, in particular a recombinant coryneform bacterium according to the invention, particularly preferably a recombinant corynebacterium according to the invention , especially a Corynebacterium of the species C. humireducens or C. glutamicum, is used.
  • a recombinant bacterium according to the invention in particular a recombinant coryneform bacterium according to the invention, particularly preferably a recombinant corynebacterium according to the invention , especially a Corynebacterium of the species C. humireducens or C. glutamicum, is used.
  • a preferred according to the invention is
  • the at least one polynucleotide according to the invention or the polypeptide encoded by it is used in over-expressed form.
  • a preferred subject matter of the present invention is a process for the overproduction of an L-amino acid, characterized in that in this process an alanine dehydrogenase according to the invention and / or at least one polynucleotide coding for them and / or at least one polynucleotide containing vector and / or a recombinant Corynebacterium, preferably of the species C. humireducens or C. glutamicum, which contains an alanine dehydrogenase according to the invention and / or at least one polynucleotide encoding it and / or at least one vector comprising this polynucleotide is used.
  • Another preferred subject of the present invention is therefore also a
  • Process for the overproduction of an L-amino acid characterized in that in this process at least one enzyme according to the invention of the hut cluster, preferably all enzymes according to the invention of the hat cluster, and / or at least one polynucleotide coding for this enzyme (s), preferably polynucleotides coding for all the enzymes of the hat cluster according to the invention, and / or at least one vector containing said polynucleotide (s) and / or a recombinant corynebacterium, preferably of the species C. humireducens or C.
  • glutamicum which contains at least one Enzyme of the hat cluster, preferably all enzymes of the hat cluster according to the invention, and / or at least one polynucleotide encoding this enzyme (s), preferably polynucleotides encoding all enzymes of the hat cluster according to the invention, and / or at least one of these (s) polynucleotide (s) comprising vector is used.
  • the L-amino acid produced according to the invention here is preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of aspartate Family, especially L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine, particularly preferred selected from L-alanine, L-valine, L-glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine, especially L-alanine, L-valine, L-glutamate and L-lysine.
  • the corynebacterium used in the production process according to the invention is preferably selected from C. humireducens and C. glutamicum.
  • overproduction or “overproduction” according to the invention with respect to the L-amino acid is meant that the microorganisms produce the L-amino acid beyond its own needs and either accumulate in the cell or excrete and accumulate in the surrounding nutrient medium ,
  • the microorganisms are preferably capable of> (at least) 0.25 g / l,> 0.5 g / l,> 1, 0 g / l,> 1, 5 g / l,> 2.0 g / l,> 4 g / l or> 10 g / l of the relevant L-amino acid in ⁇ (maximum) 120 hours, ⁇ 96 hours, ⁇ 48 hours, ⁇ 36 hours, ⁇ 24 hours or ⁇ 12 hours in the cell or in the To enrich or accumulate nutrient medium.
  • Recombinant microorganisms according to the invention in which polynucleotides according to the invention and / or vectors according to the invention have been introduced have, in a preferred embodiment, the ability to overproduce an L-amino acid even before the incorporation of the polynucleotides and / or vectors according to the invention.
  • the parent strains are preferably strains which have been produced by mutagenesis and selection, by recombinant DNA techniques or by a combination of both methods. It is obvious and requires no further explanation that one becomes one becomes one
  • Recombinant microorganism according to the invention can also be achieved by causing a wild strain, in which a polynucleotide according to the invention and / or a vector according to the invention is incorporated or incorporated, then by appropriate further genetic measures causes the L-amino acid to
  • Another subject of the present invention are also other polynucleotides from C. humireducens and the polypeptides encoded by these polynucleotides.
  • the subject of the present invention is therefore likewise: a) a threonine dehydratase (IIvA, EC 4.3.1 .19) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 106 and polynucleotides coding for these,
  • an isomeroreductase (IIvC, EC 1.1 .1 .86) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 100 and polynucleotides coding therefor,
  • a dihydroxy acid dehydratase (IIvD, EC 4.2.1.9) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 102 and polynucleotides coding therefor,
  • transaminase (IIvE, EC 2.6.1 .42) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 104 and polynucleotides coding therefor,
  • a 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.1 1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1 18 and for these h) a pantothenate synthase (PanC, EC 6.3.2.1) with a sequence identity of
  • Gdh glutamate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 124 as well as polynucleotides coding therefor,
  • glutamine synthetase 1 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 126 and polynucleotides coding therefor,
  • glutamine synthetase (glutamine synthetase 2) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 128 and polynucleotides coding therefor, I) a glutamate synthase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98
  • an isocitrate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 132 and polynucleotides coding therefor,
  • citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 136 and polynucleotides coding therefor,
  • PepC aminopeptidase C having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 138 as well as polynucleotides coding therefor,
  • pyruvate kinase 1 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 142 and polynucleotides coding therefor,
  • pyruvate kinase 2 a pyruvate kinase with a sequence identity of at least
  • Pgk phosphoglycerate kinase
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 152 and polynucleotides coding therefor,
  • Dehydrogenase 2 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 154 and polynucleotides coding for these,
  • TpiA triosephosphate isomerase
  • a fructose bisphosphate aldolase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 158 and polynucleotides coding therefor,
  • aa a 1-phosphofructokinase with a sequence identity of at least 90, 95 or
  • CBS cysteine synthase
  • CysK cysteine synthase
  • ee a cystathionine-beta (AecD) with a sequence identity of at least 90,
  • CysK cysteine synthase
  • the H protein of a glycine-cleaving system having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to
  • GcvP glycine-cleaving system
  • LipA lipoyl synthase
  • LipB lipoyl transferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 50 as well as polynucleotides coding therefor,
  • LplA lipoate protein ligase
  • GcvL dihydrolipoyl dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 96 and polynucleotides coding therefor,
  • yy an O-acetyl homoserine lyase (MetY) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 62 as well as polynucleotides coding therefor,
  • zz a preferably feedback-resistant pyruvate carboxylase (Pye, EC 6.4.1 .1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 64 as well as polynucleotides encoding same, aaa ) an optionally feedback-resistant D-3-phosphoglycerate
  • SerA Dehydrogenase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66 as well as polynucleotides coding therefor,
  • a phosphoserine aminotransferase (SerC) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1
  • ddd the subunit of a sulfate adenylyltransferase (CysD) with a
  • fff a sulfite reductase (CysI) with a sequence identity of at least 90, 95 or
  • ggg a NADPH-dependent glutamate synthase beta chain (CysJ) with a
  • yyj a sulfate transporter (CysZ) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 86 and polynucleotides coding therefor,
  • PtH1 a peptidyl tRNA hydrolase 1 (PtH1) with a sequence identity of at least
  • SEQ ID NO: 166 as well as polynucleotides encoding them,
  • an L-lysine exporter (LysE, lysine efflux permease) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 168, as well as polynucleotides coding therefor,
  • DapB dihydropicolinate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 170 and polynucleotides coding for these,
  • Sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 174 as well as polynucleotides coding for them.
  • Another subject of the present invention are also vectors containing the aforementioned polynucleotides, as well as recombinant microorganisms containing the aforementioned enzymes and / or polynucleotides and / or vectors.
  • the polypeptide and / or polynucleotide in question is present in the microorganism in overexpressed form.
  • the recombinant microorganisms are preferably coryneform bacteria, especially um
  • Corynebacteria especially those of the species C. humireducens or C. glutamicum.
  • Another object of the present invention is therefore also a method for
  • an L-amino acid preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acid Amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of the aspartate family, in particular L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L Isoleucine and L-threonine, more preferably selected from L-alanine, L-valine, L-glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine, especially from L-alanine, L-valine, L-glutamate and L-lysine in which at least one, preferably at least two, three or four, of said polynucleotides are present in overexpressed form, the method preferably being used in corynebacteria, in particular those of the type C.
  • Another subject of the present invention are also other polynucleotides from C. humireducens and the polypeptides encoded by these polynucleotides.
  • the present invention therefore also provides: a) a threonine synthase (ThrC, EC 4.2.3.1) having a sequence identity of
  • an isopropyl malate synthase (LeuA, EC 2.3.3.13) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1 10 and polynucleotides coding for these,
  • an isopropyl malate dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1 12 and polynucleotides coding therefor,
  • Sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequences according to SEQ ID NO: 198 or SEQ ID NO: 200 and to polynucleotides coding for them,
  • a DNA binding domain of the type HTH tetR having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 2 as well as polynucleotides coding therefor
  • a homoserine kinase ThrB, EC 2.7.1.39 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4 and polynucleotides coding for these
  • a glucose-6-phosphate isomerase (Pgi, EC 5.3.1.9) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1
  • a methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 12 as well as polynucleotides coding therefor,
  • an ATP-dependent methionine transporter (MetN) with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 14 as well as polynucleotides coding therefor,
  • a malate quinone oxidoreductase (Mqo, EC 1.1.99.16) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 176 and polynucleotides coding therefor, r) the El p subunit of a pyruvate dehydrogenase complex (AceE, EC 1 .2.4.1) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 178 and for these coding polynucleotides, s) a citrate synthase (GltA, EC 4.1 .3.7) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 180 as well as polynucleotides coding therefor,
  • a UDP-N-acetylmuramoyl-alanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase (MurE, EC 6.3.2.13) having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 184, as well as for these coding polynucleotides.
  • Another subject of the present invention are also vectors containing the aforementioned polynucleotides, as well as recombinant microorganisms containing the aforementioned enzymes and / or polynucleotides and / or vectors.
  • the polypeptide and / or polynucleotide in question is present in the microorganism in an off or attenuated form.
  • the recombinant microorganisms are preferably coryneform bacteria, above all corynebacteria, in particular those of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular of the species C. humireducens.
  • Another object of the present invention is therefore also a method for
  • an L-amino acid preferably selected from L-alanine, L-valine, L-amino acids of the glutamate family, in particular L-glutamate, L-glutamine, L-proline and L-arginine, and L-amino acids of the aspartate family , in particular L-aspartate, L-asparagine, L-methionine, L-lysine, L-isoleucine and L-threonine, more preferably selected from L-alanine, L-valine, L-glutamate, L-methionine, L-lysine and L-threonine, especially of L-alanine, L-valine, L-glutamate and L-lysine, in which at least one, preferably at least two, three or four, of said polynucleotides in switched off or attenuated form, wherein the method is preferably in corynebacteria, in particular those of the species C. humireducens
  • microorganisms or bacteria according to the invention in particular corynebacteria according to the invention, have, in particular, inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular
  • L-valine overproducing strains of the invention at least one, preferably at least 2 or 3, more preferably at least 4 or 5, of the following characteristics: a) an overexpressed polynucleotide (ilvA gene) encoding a threonine dehydratase (NvA, EC 4.3.1.19 ), preferably for a threonine dehydratase with a
  • Acetolactate synthase (NvB), preferably for the subunit of an acetolactate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 98, encoded,
  • an overexpressed polynucleotide which codes for the preferably feedback-resistant subunit of an acetolactate synthase (NvN, EC 4.1.3.18)
  • an overexpressed polynucleotide coding for an isomeroreductase (NvC , EC 1.1.1 .86), preferably for an isomeroreductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 100, encoded,
  • Dehydratase (NvD, EC 4.2.1.9), preferably for a dihydroxy acid dehydratase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 102, encoded,
  • an overexpressed polynucleotide (ilvE gene) which is suitable for a transaminase (NvE, EC 2.6.1.42), preferably for a transaminase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 104, coded,
  • an overexpressed polynucleotide encoding an acetolactate synthase (IIvH, EC 2.2.1.6), preferably an acetolactate synthase with a
  • thrB gene an attenuated polynucleotide (thrB gene) encoding a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39), preferably a homoserine kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4, encoded,
  • thrC gene an attenuated polynucleotide (thrC gene) encoding a threonine synthase
  • an overexpressed polynucleotide which is responsible for an optionally feedback-resistant homoserine dehydrogenase (Horn, EC 1 .2.1 .1 1), preferably for a homoserine dehydrogenase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98% , preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 46, encoded, k) an attenuated polynucleotide (leuA gene), which optionally represents
  • leuB gene an attenuated polynucleotide (leuB gene) encoding an isopropyl malate dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85), preferably an isopropyl malate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 1 12, encoded,
  • Isopropyl malate isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), preferably for the subunits of an isopropyl malate isomerase with sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequences according to SEQ ID NO: 1 14 and SEQ ID NO: 1 16, code,
  • Oxobutanoate hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.1 1), preferably for a 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 1 18, coded,
  • panC gene an overexpressed polynucleotide (panC gene), which for a pantothenate synthase (PanC, EC 6.3.2.1), preferably for a pantothenate synthase with a
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-valine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • L-amino acid in particular L-valine
  • microorganisms or bacteria according to the invention in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C.
  • glutamicum in particular L-glutamate overproducing strains according to the invention, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, of the following features, more preferably in combination with the overexpression of at least one hat gene according to the invention, in particular in combination with the overexpression of all hat genes according to the invention: a) an overexpressed polynucleotide (gdh) which is a glutamate dehydrogenase (Gdh), preferably for a glutamate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 124 encoded,
  • glucose synthetase 1 glutamine synthetase 1
  • glutamine synthetase 2 glutamine synthetase 1
  • glutamine synthetase 1 glutamine synthetase 1
  • glutamine synthetase 1 glutamine synthetase 1
  • glutamine synthetase 1 glutamine synthetase 1
  • glutamine synthetase 1 glutamine synthetase 1
  • glucose synthetase 2 a glutamine synthetase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 128 coded
  • an overexpressed polynucleotide which codes for a glutamate synthase, preferably for a glutamate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 130,
  • an overexpressed polynucleotide which codes for an isocitrate dehydrogenase, preferably an isocitrate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 132, f) an overexpressed one A polynucleotide which encodes an aconitate hydrase, preferably an aconate hydrase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 134,
  • an overexpressed polynucleotide coding for a citrate synthase preferably for a citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 136,
  • an overexpressed polynucleotide which codes for an aminopeptidase C (PepC), preferably an aminopeptidase C having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 138, i) an overexpressed polynucleotide which codes for a pyruvate dehydrogenase, preferably a pyruvate dehydrogenase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 140, j) an overexpressed one A polynucleotide encoding a pyruvate kinase (pyruvate kinase 1), preferably a pyruvate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 142, k) an overexpressed polynucleotide
  • gpmA overexpressed polynucleotide
  • GpmA 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase
  • GpmA 2,3-bisphosphoglycerate-dependent phosphoglycerate mutase
  • pgk an overexpressed polynucleotide (pgk) encoding a phosphoglycerate kinase (Pgk), preferably a phosphoglycerate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 150 coded,
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1
  • glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 152,
  • glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2
  • glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2 glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2
  • Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 154,
  • tpiA an overexpressed polynucleotide
  • TpiA a triosephosphate isomerase
  • a triosephosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 156 coded
  • r an overexpressed polynucleotide which codes for a fructose bisphosphate aldolase, preferably a fructose bisphosphate aldolase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 158,
  • an overexpressed polynucleotide encoding a 1-phosphofructokinase, preferably a 1-phosphofructokinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 160, t) an overexpressed one Polynucleotide encoding a 6-phosphofructokinase, preferably a 6-phosphofructokinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 162, u) an overexpressed polynucleotide (pgi) which codes for a glucose-6-phosphate isomerase, preferably a glucose-6-phosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6,
  • v attenuated polynucleotides (sucCD) encoding the subunits of a succinyl CoA ligase (SucCD, EC 6.2.1.5), preferably the subunits of a succinyl CoA ligase having sequence identities of at least 90, 95 or 98%, preferably 100 %, to the sequences according to SEQ ID NO: 198 or SEQ ID NO: 200.
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-glutamate, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • microorganisms or bacteria according to the invention in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-alanine overproducing strains according to the invention, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, of the following features, particularly preferably in combination with the overexpression of the ald gene according to the invention: a) an overexpressed polynucleotide (alaD) which codes for an alanine dehydrogenase (AlaD), preferably an alanine dehydrogenase from corynebacteria .
  • alaD overexpressed polynucleotide
  • an overexpressed polynucleotide which codes for a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GapA), preferably for a glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from corynebacteria
  • gapA overexpressed polynucleotide
  • GapA glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • IdhA switched-off or attenuated polynucleotide which is responsible for an L-lactate dehydrogenase (LdhA), preferably an L-lactate dehydrogenase
  • ppc switched off or attenuated polynucleotide
  • Phosphoenolpyruvate carboxylase preferably encoded for a phosphoenolpyruvate carboxylase from corynebacteria
  • a switched-off or attenuated polynucleotide which codes for an alanine racemase (Air), preferably an alanine racemase from corynebacteria.
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-alanine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • microorganisms or bacteria according to the invention in particular corynebacteria according to the invention, in particular inventive corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum, in particular L-methionine overproducing strains according to the invention, at least one, preferably at least two or three, more preferably at least four or five, the following features: a) an attenuated polynucleotide (mcbR) encoding a DNA binding domain of the type HTH tetR (McbR), preferably for a DNA binding domain having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 2 coded,
  • thrB gene an attenuated polynucleotide (thrB gene) encoding a homoserine kinase (ThrB, EC 2.7.1.39), preferably a homoserine kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 4, coded,
  • pgi an attenuated polynucleotide (pgi) encoding a glucose-6-phosphate isomerase (Pgi, EC 5.3.1.9), preferably a glucose-6-phosphate isomerase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 6, encoded,
  • an attenuated polynucleotide encoding a phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pck, EC 4.1.1.32), preferably a phosphoenolpyruvate carboxykinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 8, encoded, e) an attenuated polynucleotide (metQ) that binds to a D-methionine
  • Lipoprotein (MetQ) preferably for a D-methionine binding lipoprotein having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 10, encoded,
  • MethodP preferably for a methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 12, encoded,
  • an attenuated polynucleotide (metN) encoding an ATP-dependent methionine transporter (MetN), preferably an ATP-dependent methionine transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence coded according to SEQ ID NO: 14,
  • an attenuated polynucleotide encoding an S-adenosylmethionine synthase (MetK), preferably an S-adenosylmethionine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the
  • an attenuated polynucleotide which is suitable for a methionine import system permease (Metl), preferably for a methionine import system permease having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 18, coded,
  • Tetrahydrodipicolinate synthase (DapA), preferably for a 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 20, encoded, k) an overexpressed polynucleotide (CBS, cysK) which codes for a cysteine synthase (CBS, CysK), preferably for a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 22 .
  • CBS, cysK polynucleotide
  • cysteine synthase CBS, CysK
  • a carboxylate-amine ligase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 24,
  • Branched-chain amino acid transporters (BrnE), preferably one
  • Subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 30,
  • Branched-chain amino acid transporters (BrnF), preferably one
  • Subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 32,
  • cysE an overexpressed polynucleotide that is responsible for a serine acetyltransferase
  • CysE preferably for a serine acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO:
  • cysteine synthase preferably a cysteine synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 36,
  • gcvH overexpressed polynucleotide encoding the H protein of a glycine-cleaving system (GcvH), preferably an H protein with a
  • gcvP polynucleotide
  • GcvP glycine-cleaving system
  • gcvT polynucleotide encoding the T-protein of a glycine-cleaving system (GcvT), preferably a T-protein with a Sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence encoded according to SEQ ID NO: 42,
  • an overexpressed polynucleotide which is suitable for a serine hydroxymethyltransferase (GlyA), preferably for a serine hydroxymethyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 44 coded,
  • homoserine dehydrogenase preferably for a homoserine dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 46 encoded
  • NpA polynucleotide
  • LipA lipoyl synthase
  • NpB polynucleotide
  • LipB lipoyl transferase
  • an overexpressed polynucleotide which is suitable for a dihydrolipoyl dehydrogenase (Lpd), preferably for a dihydrolipoyl dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 52 coded,
  • an overexpressed polynucleotide which is suitable for a lipoate protein ligase (LplA), preferably for a lipoate protein ligase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 94 encoded,
  • cc an overexpressed polynucleotide (gcvL) which is suitable for a dihydrolipoyl dehydrogenase (GcvL), preferably for a Dihydrolipoyl dehydrogenase with a
  • polynucleotide which is suitable for a preferably feedback-resistant aspartate kinase (LysC), preferably for an aspartate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 54 encoded,
  • metalB an overexpressed polynucleotide that is responsible for a cystathionine gamma synthase (MetB), preferably a cystathinonine gamma synthase with a Sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the
  • Reductase preferably for a 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 58, encoded,
  • gg an overexpressed polynucleotide (metX) which is responsible for a homoserine
  • Acetyltransferase (MetX), preferably for a homoserine O-acetyltransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 60, encoded,
  • MethodY preferably for an O-acetyl homoserine lyase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to
  • an overexpressed polynucleotide which is responsible for a pyruvate carboxylase (Pye), preferably a pyruvate carboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID
  • an overexpressed polynucleotide (serA) which is suitable for an optionally feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA), preferably for a D-3
  • Phosphoglycerate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66, kk) an overexpressed polynucleotide (serB) suitable for a phosphoserine phosphatase (SerB), preferably for a phosphoserine phosphatase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66, kk) an overexpressed polynucleotide (serB) suitable for a phosphoserine phosphatase (SerB), preferably for a phosphoserine phosphatase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 66, kk) an overexpressed polynucleotide (serB) suitable for a phosphoserine phosphatase (SerB),
  • Aminotransferase preferably for a phosphoserine aminotransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 70, encoded,
  • an overexpressed polynucleotide encoding the subunit of a sulfate adenylyltransferase (CysD), preferably a subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence of SEQ ID NO: 74 coded, nn) an overexpressed polynucleotide (cysH) which is suitable for adenosine phosphosulfate reductase (CysH), preferably for adenosine phosphosulfate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 76 encoded,
  • sulfite reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 78,
  • cysJ polynucleotide coding for (CysJ), preferably one with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 80,
  • cysN an overexpressed polynucleotide (cysN) encoding the subunit of a sulfate adenylyltransferase (CysD), preferably a subunit having a
  • cystathionine-beta synthase preferably for a cystathionine-beta synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 84, coded,
  • ss an overexpressed polynucleotide (cysZ) which is suitable for a putative sulfate transporter (CysZ), preferably for a sulfate transporter having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 86, coded,
  • metalE an overexpressed polynucleotide
  • MetalE an overexpressed polynucleotide
  • MetalE a 5-methyltetrahydropteroyl triglutamate homocysteine methyltransferase
  • an overexpressed polynucleotide encoding a peptidyl tRNA hydrolase 1 (PtH1), preferably a peptidyl tRNA hydrolase 1 having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to
  • ptH2 an overexpressed polynucleotide (ptH2) encoding a peptidyl-tRNA-hydrolase 2 (PtH2), preferably a peptidyl-tRNA-hydrolase 2 with a
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-methionine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • microorganisms or bacteria according to the invention in particular corynebacteria according to the invention, have, above all
  • corynebacteria of the species C. humireducens or C. glutamicum according to the invention at least one, preferably at least 2 or 3, particularly preferably at least 4 or 5, of the following features: a) an overexpressed polynucleotide (dapA), which codes for a dihydrodipicolinate synthase (DapA, EC 4.2.1.52), preferably a dihydrodipicolinate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 20,
  • an overexpressed polynucleotide which is responsible for a preferably feedback-resistant aspartate kinase (LysC, EC 2.7.2.4), preferably for an aspartate kinase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, encodes the sequence according to SEQ ID NO: 54,
  • ddh an overexpressed polynucleotide (ddh) suitable for a diaminopimelate dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1.16), preferably a diaminopimelate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence coded according to SEQ ID NO: 202,
  • an overexpressed polynucleotide which is suitable for an aspartate semialdehyde dehydrogenase (Asd, EC 1 .2.1.1 1), preferably for an aspartate semialdehyde dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, coding for the sequence according to SEQ ID NO: 28, e) an overexpressed polynucleotide (lysA) suitable for a diaminopimelate decarboxylase (LysA, EC 4.1 .1.20), preferably for a diaminopimelate decarboxylase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 164, encoded,
  • an overexpressed polynucleotide (aat) encoding an aspartate aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1), preferably an aspartate aminotransferase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 166, encoded, g) an overexpressed polynucleotide (lysE) encoding an L-lysine exporter (LysE, lysine efflux permease), preferably an L-lysine exporter having a
  • dapB an overexpressed polynucleotide (dapB) encoding a dihydropicolinate reductase (DapB, EC 1 .3.1.26), preferably a dihydropicolinate reductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 170, encoded,
  • glucose-6-phosphate dehydrogenase (EC 1.1 .1 .49), preferably a glucose-6-phosphate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100% , encoded to the sequence according to SEQ ID NO: 172,
  • zwf an overexpressed polynucleotide which is responsible for the Zwf subunit of a glucose-6-phosphate dehydrogenase (Zwf, EC 1 .1 .1 .49), preferably for a
  • Subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 186, encoded,
  • OpcA Glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • n an overexpressed polynucleotide (gnd) encoding a phosphogluconic acid dehydrogenase (Gnd, EC 1 .1 .1.44), preferably a phosphogluconic acid dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 174, encoded,
  • a switched off or attenuated polynucleotide which is responsible for a malate quinone oxidoreductase (Mqo, EC 1 .1 .99.16), preferably for a malate quinone oxidoreductase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 176, encoded,
  • a switched-off or attenuated polynucleotide encoding the E1 p subunit of a pyruvate dehydrogenase complex (AceE, EC 1 .2.4.1), preferably an El p subunit having a sequence identity of at least 90, 95 or 98% , preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 178, encoded,
  • gltA switched-off or attenuated polynucleotide
  • gltA switched-off or attenuated polynucleotide
  • a citrate synthase preferably a citrate synthase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the Sequence according to SEQ ID NO: 180, encoded
  • mdh a switched-off or attenuated polynucleotide which is suitable for a malate dehydrogenase (Mdh, EC 1.1 .1 .37), preferably for a malate dehydrogenase having a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 182, encoded,
  • a switched-off or attenuated polynucleotide encoding a UDP-N-acetylmuramoyl-alanyl-D-glutamate-2,6-diaminopimelate ligase, 6-diaminopimelate ligase (MurE, EC 6.3.2.13), preferably an enzyme with a sequence identity of at least 90, 95 or 98%, preferably 100%, to the sequence according to SEQ ID NO: 184.
  • a further subject of the present invention is accordingly also a process for the overproduction of an L-amino acid, in particular L-lysine, in which such a microorganism or such a bacterium is used.
  • the aforementioned polynucleotides and polypeptides used or to be used in the method according to the invention are preferably derived from corynebacteria, in particular from C. glutamicum or C. humireducens, more preferably from C. humireducens.
  • overexpression is generally understood as meaning an increase in the intracellular concentration or activity of a ribonucleic acid, a protein (polypeptide) or an enzyme which is encoded by a corresponding DNA in a microorganism in comparison to the parent strain (parent strain) or wild-type strain
  • An initial stem (parent strain) is the strain on which the
  • the increase in concentration or activity can be achieved, for example, by increasing the copy number of the corresponding coding polynucleotides chromosomally or extrachromosomally by at least one copy.
  • a widely used method of increasing the copy number consists of incorporating the corresponding coding polynucleotide into a vector, preferably a plasmid, which is replicated by a microorganism, in particular a coryneform bacterium.
  • transposons, insertion elements (IS elements) or phages as vectors. The art describes a wealth of suitable vectors.
  • Another common method of overexpression is chromosomal gene amplification.
  • at least one additional copy of the polynucleotide of interest is inserted into the chromosome of a coryneform
  • Another method for achieving overexpression is to link the corresponding gene or allele in a functional manner (operably linked) with a promoter or an expression cassette.
  • Suitable promoters for Corynebacterium glutamicum are described for example in FIG. 1 of the review article by Patek et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 311-323 (2003)) and in summary presentations such as the "Handbook of Corynebacterium glutamicum” (Ed .: Lothar Eggeling and Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005) )) or the book “Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology” (Ed .: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)).
  • the variants of the dapA promoter described by Vasicova et al for example the promoter A25, can be used.
  • the gap promoter of Corynebacterium glutamicum can be used.
  • the well-known Amann et al. (Gene 69 (2), 301-315 (1988)) and promoters T3, T7, SP6, M13, lac, tac, and trc, described to Amann and Brosius (Gene 40 (2-3), 183-190 (1985)) become.
  • such a promoter may be inserted upstream of the subject gene, typically at a distance of about 1-500 nucleobases from the start codon.
  • the activity or concentration of the corresponding polypeptide is preferably at least 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, at most, preferably 1000 % or 2000%, based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to
  • the concentration of a protein can be determined by 1 - and 2-dimensional protein gel separation and subsequent optical identification of the protein concentration with appropriate evaluation software in the gel.
  • a common method for preparing the protein gels in coryneform bacteria and for identifying the proteins is that described by Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712-23 (2001)).
  • the protein concentration can also be determined by Western blot hybridization with an antibody specific for the protein to be detected (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and subsequent optical evaluation with appropriate software for
  • Polypeptids or an enzyme which are encoded by a corresponding DNA, in a microorganism, compared to the parent strain (parent strain) or
  • the parent strain is the strain on which the mitigation was performed.
  • the attenuation may be achieved by reducing the expression of a polypeptide, for example by using a weak promoter, or by using an allele which codes for a polypeptide having a lower activity and optionally combining these measures.
  • the attenuation can also be achieved by completely inhibiting the expression of the polypeptide, for example by switching off the coding gene.
  • the activity or concentration of the corresponding polypeptide is preferably increased by at least 10%, 25%, 50% or 75%, at most 100%, based on the activity or concentration of the polypeptide in the strain prior to the attenuation-inducing measure, reduced. In a preferred
  • Amino acid production generally enzymes, which in comparison to the wild form a lower Have sensitivity to inhibition by the produced L-amino acid and / or analogs thereof.
  • a feedback-resistant aspartate kinase (LysC FBR ) is understood to be an aspartate kinase which has a lower sensitivity to inhibition by mixtures of lysine and threonine or mixtures of AEC (aminoethylcysteine) and threonine or lysine alone or AEC alone compared to wild-type ,
  • AEC aminoethylcysteine
  • glutamicum are further referred to the following publications: JP1993184366-A, JP1994062866-A, JP1994261766-A, JP1997070291-A, JP1997322774-A, JP1998165180-A, JP1998215883-A, US5688671-A, EP0387527, WO00 / 63388, US3732144, JP6261766, Jetten et al. (1995; Applied
  • the following feedback-resistant aspartate kinases from C. humireducens are preferably used: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T31I, G359D.
  • Hom FBR homoserine dehydrogenase
  • strains are preferably used which accordingly contain a feedback-resistant acetolactate synthase.
  • leucine production preferably strains are used, which accordingly contain a feedback-resistant isopropyl malate synthase (LeuA FBR ).
  • LeuA FBR feedback-resistant isopropyl malate synthase
  • strains are preferably used which accordingly contain a feedback-resistant glutamate-5-kinase (ProB FBR ).
  • ProB FBR glutamate-5-kinase
  • arginine preferably strains are used which accordingly contain a feedback-resistant ornithine carbamoyltransferase (ArgF FBR ).
  • strains are preferably used in serine production, which accordingly contain a feedback-resistant D-3-phosphoglycerate dehydrogenase (SerA FBR ).
  • SerA FBR D-3-phosphoglycerate dehydrogenase
  • Pyc FBR feedback-resistant pyruvate carboxylases
  • strains are preferably used in the tryptophan production, the
  • a feedback-resistant phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase (AroG FBR or AroH FBR ) included.
  • Microorganisms according to the invention in particular bacteria of the genus Corynebacterium, can be used continuously - as described, for example, in WO 05/021772 - or discontinuously in the batch process (batch cultivation or batch process) or in the fed-batch (feed process) or repeated-fed batch process (repetitive feed method) for the purpose of producing the L-amino acid.
  • batch cultivation or batch process or in the fed-batch (feed process) or repeated-fed batch process (repetitive feed method) for the purpose of producing the L-amino acid.
  • the culture medium or fermentation medium to be used must suitably satisfy the requirements of the respective strains. Descriptions of culture media of various microorganisms are contained in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). The terms culture medium and fermentation medium or medium are mutually exchangeable.
  • sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats, such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol, methanol and ethanol and organic acids such as acetic acid or lactic acid.
  • sugars and carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, sucrose-containing solutions from sugar beet or sugar cane production, starch, starch hydrolyzate and cellulose, oils and fats, such as soybean oil, sunflower oil, peanut oil and Coconut fat, fatty acids such as palmitic acid, stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol, methanol and ethanol
  • organic nitrogen-containing compounds such as peptones, yeast extract, meat extract, malt extract, corn steep liquor, soybean meal and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride,
  • Ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate can be used.
  • the nitrogen sources can be used singly or as a mixture.
  • a phosphorus source can phosphoric acid, potassium dihydrogen phosphate or
  • Dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salts are used.
  • the culture medium must further contain salts, for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • salts for example, in the form of chlorides or sulfates of metals such as sodium, potassium, magnesium, calcium and iron, such as magnesium sulfate or ferric sulfate, necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids such as homoserine and vitamins such as thiamine, biotin or pantothenic acid in addition to the above substances can be used.
  • the said feedstocks may be added to the culture in the form of a one-time batch or fed in a suitable manner during the cultivation.
  • the pH is generally adjusted to a value of 6.0 to 9.0, preferably 6.5 to 8.
  • antifoams such as, for example, fatty acid polyglycol esters, can be used.
  • suitable, selectively acting substances, such as antibiotics may be added to the medium.
  • Gas mixtures such as air entered into the culture.
  • liquids enriched with hydrogen peroxide is also possible.
  • the fermentation at elevated pressure, for example at a pressure of 0.03 to 0.2 MPa, driven.
  • the temperature of the culture is usually 20 ° C to 45 ° C, and preferably 25 ° C to 40 ° C.
  • the cultivation is continued until a maximum of the desired L-amino acid, has formed. This goal is usually reached within 10 hours to 160 hours. In continuous Procedures are longer cultivation times possible.
  • the activity of the bacteria leads to an accumulation (accumulation) of the L-amino acid in the fermentation medium and / or in the bacterial cells.
  • the analysis of L-amino acids to determine the concentration at one or more times in the course of the fermentation can be carried out by separating the L-amino acids by ion exchange chromatography, preferably cation exchange chromatography followed by post-column derivatization using ninhydrin, as described by Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1 190-1206 (1958)). Instead of ninhydrin and ortho-Phtadialdehyd can be used for Nachklaklaivatmaschine. For a review on ion exchange chromatography, see Pickering (LC-GC (Magazine of Chromatography Science) 7 (6), 484-487 (1989)).
  • RP reversed-phase chromatography
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the invention accordingly also provides a process for preparing an L-amino acid, which comprises carrying out the following steps: a) fermentation of the microorganisms according to the invention, in particular
  • coryneform bacteria preferably of the genus Corynebacterium, more preferably of the species Corynebacterium glutamicum or Corynebacterium humireducens, in a suitable nutrient medium, and b) accumulation of the L-amino acid in the nutrient medium and / or in the cells of said bacteria. Subsequently, the preparation or production or recovery of a L-amino acid-containing product takes place in liquid or solid form.
  • a fermentation broth containing the relevant L-amino acid is obtained.
  • a fermentation broth is understood as meaning a fermentation medium or nutrient medium in which a microorganism has been cultivated for a certain time and at a certain temperature.
  • the fermentation medium or the media used during the fermentation contains / contain all substances or
  • Fermentation medium or the starting materials such as vitamins such as biotin or salts such as magnesium sulfate.
  • the organic by-products include substances which are produced by the microorganisms used in the fermentation in addition to the desired L-amino acid and optionally excreted. These include sugars such as trehalose.
  • the fermentation broth is removed from the culture vessel or fermentation vessel, optionally collected, and used to provide an L-amino acid-containing product in liquid or solid form.
  • the term "recovery of the L-amino acid-containing product" is used for this purpose.
  • the L-amino acid-containing fermentation broth itself represents the product obtained.
  • Fermentation medium or the starting materials from the fermentation broth to achieve a concentration or purification of the L-amino acid. In this way, products are isolated which have a desired content of L-amino acid.
  • the partial (> 0% to ⁇ 80%) to complete (100%) or nearly complete (> 80% to ⁇ 100%) removal of the water (measure a)) is also referred to as drying.
  • the type strain of C. humireducens (DSM 45392) was cultured in the shake flask approach.
  • the C. humireducens strain was incubated in 10 ml BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours. Subsequently, 10 ml shake flask medium were placed on a
  • OD 6 6o in 0.2 inoculated and cultured at 37 ° C at 200 rpm, 48 h.
  • this Medium were 20 g of ammonium sulfate, 0.4 g MgS0 4 * 7H 2 0, 0.6 g KH 2 P0 4 and 10 g of yeast extract dissolved in 750 ml H 2 0. The pH of the solution was adjusted to 7.8 with 20% NH 4 OH and the solution was then autoclaved.
  • a vitamin solution (pH 7 with NH 4 OH) consisting of 0.25 g / l thiamine, 50 mg / l cyanocobalamin, 25 mg / l biotin and 1, 25 g / l pyridoxine were added. Furthermore, 140 ml of a sterile-filtered 50% glucose solution and 50 g of dry autoclaved CaC0 3 were added and the medium was then made up to one liter.
  • the type strain of C. humireducens produces after 48 h of cultivation in
  • the measured values are given after culturing with cells and those of the empty medium.
  • Example 2 Glutamate Performance Test
  • the type strain of C. humireducens DSM 45392
  • the C. humireducens strain was incubated in 10 ml BHI liquid medium (Brain Heart infusion, Merck) (37 g / l H 2 O) as preculture at 37 ° C. at 200 rpm for 24 hours.
  • 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 6 6o on 0.2 and cultured at 37 ° C at 200 rpm, 48 h.
  • the supernatant from four parallel cultures was subjected to HPLC analysis to determine the glutamate content with a detection limit of> 0.01 g / l.
  • the remaining ingredients were prepared separately and filtered sterile. 20 ml of 50% (w / v) glucose, 1 ml of 1% (w / v) CaCl 2 , 1 ml of 1 M MgSO 4 , 1 ml of 0.02% biotin and 1 ml of trace element solution (1 g FeS0 4 ⁇ 7 H 2 0, 1 g MnS0 4 7 x H 2 0, 0.1 g ZnS0 4 x 7 H 2 0, 0.021 g CuS0 4 x 5 H 2 0, 0.002 g NiCl 2 x 6 H 2 0 to 100 ml H 2 0) was added to the medium and then filled with sterile H 2 0 to 1000 ml.
  • AEC + threonine screening were cultured in shake flasks and subjected to a performance test for their lysine synthesis on a shake flask scale.
  • the C. humireducens strain and the isolated AEC + threonine resistant C. humireducens clones were incubated in 10 ml BHI liquid medium (Brain Heart infusion; Merck) (37 g / l H 2 O) as pre-culture at 37 ° C. incubated for 24 h.
  • 10 ml of shake flask medium were inoculated to an OD 6 6o on 0.2 and cultured at 37 ° C at 200 rpm, 48 h. to
  • Morpholinopropanesulfonic acid 25 g (NH 4) 2 S0 4, 0.1 g KH 2 P0 4, 1 g MgS0 4 * 7H 2 0, 0.01 g CaCl 2 * 2H 2 0, 0.01 g of FeS0 4 * 7H 2 0, 0.005 g MnS0 4 * H 2 0 dissolved in 750 ml H 2 0, the pH was adjusted to 7.0 with ammonia water and autoclaved. Subsequently, 25 g of dry autoclaved CaC0 3 were added. The remaining ingredients were prepared separately and filtered sterile.
  • MOPS Morpholinopropanesulfonic acid
  • the supernatant from two parallel cultures was subjected to HPLC analysis to determine the L-lysine contents with a detection limit of> 0.01 g / l.
  • the lysine end titers and yields of the cultivations are shown in the table below.
  • Table 3 Mean values and standard deviation of the lysine end titers of two parallel cultures with AEC + threonine resistant C. humireducens clones after 48 h cultivation in

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Abstract

Überraschenderweise wurde gefunden, dass alkaliphile Bakterien der Gattung Corynebacterium von Natur aus dazu geeignet sind, L-Aminosäurn zu produzieren.

Description

Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren unter Verwendung eines alkaliphilen
Bakteriums
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren, in welchem ein alkaliphiles Bakterium, insbesondere ein Stamm der Spezies Corynebacterium humireducens, verwendet wird.
Verfahren zur Produktion von L-Aminosäuren, in welchen Bakterien der Gattung
Corynebacterium eingesetzt werden, sind dem Fachmann bekannt.
Obwohl zahlreiche Corynebacterium-Arten bekannt sind, werden in diesen Verfahren üblicherweise Bakterien der Art Corynebacterium glutamicum eingesetzt, da sich diese Art als besonders vorteilhaft für die Produktion von L-Aminosäuren herausgestellt hat.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen neuen Stamm zur Verfügung zu stellen, der als Alternative zu C. glutamicum entweder unmittelbar für die Produktion von L- Aminosäuren in Frage kommt, weil er eine signifikante Überproduktion an mindestens einer L-Aminosäure aufweist, oder aber zumindest als erfolgversprechender Ausgangsstamm für die Entwicklung eines neuen L-Aminosäuren-Produktionsstamms in Betracht kommt.
Um als Ausgangsstamm für die Entwicklung eines neuen L-Aminosäuren- Produktionsstamms in Frage zu kommen, ist bereits eine relativ geringe L-Aminosäure- Überproduktion ausreichend. Denn durch Überexpression oder Abschwächung von Genen bzw. Enzymen, deren förderlicher oder schädlicher Einfluss auf die Produktion der betreffenden Aminosäure bekannt ist, sowie gegebenenfalls durch ungerichtete Mutagenese kann ausgehend von einem solchen Ausgangsstamm die L-Aminosäure-Ausbeute entsprechend erhöht werden.
Erfindungsgemäß wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein alkaliphiles
Bakterium, nämlich ein Bakterium der Art Corynebacterium humireducens, bereits natürlicherweise die L-Aminosäuren L-Alanin, L-Glutaminsäure und L-Valin in signifikanter Menge überproduziert.
Weiterhin konnte durch Kultivierung auf einem Medium, das AEC sowie gegebenenfalls Threonin enthält, ein C. humireducens-Stamm erhalten werden, der signifikante Mengen an L-Lysin produziert. C. humireducens stellt damit zugleich einen geeigneten Ausgangspunkt für die Herstellung weiterer L-Aminosäure-Produktionsstämme dar. Denn durch entsprechende Umleitung des bakteriellen Stoffwechsels kann die Überproduktion der genannten L-Aminosäuren in eine Überproduktion anderer gewünschter L-Aminosäuren umfunktioniert werden. Die natürlicherweise auftretende Überproduktion an L-Alanin ist vermutlich vor allem auf eine hoch effiziente Alanin-Dehydrogenase zurückzuführen, die in C. humireducens aufgefunden wurde. Nur für wenige weitere Corynebakterien wurden bislang Alanin-Dehydrogenasen beschrieben, für keines jedoch eine derart aktive Alanin-Dehydrogenase, deren Anwesenheit bereits zu einer Akkumulation von L-Alanin im Zellinnern des Wildtyps führt. Die natürlicherweise auftretende Überproduktion an L-Glutamat ist vermutlich vor allem auf hoch effiziente hut-Gene („histidine utilization"-Gene) zurückzuführen. Das hut-Cluster besteht aus den vier Genen hutU (Urocanat-Hydratase), hutl (Imidazolon-Propionase), hutH (Histidin-Ammonialyase) und hutG (Formididoylglutamase). Nur für wenige weitere
Corynebakterien wurden bislang hut-Gene beschrieben, für keines jedoch derart aktive hut- Gene, deren Anwesenheit bereits zu einer Akkumulation von L-Glutamat im Zellinneren des Wildtyps führt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren ein alkaliphiles Bakterium, vorzugsweise ein alkaliphiles coryneformes Bakterium, insbesondere ein alkaliphiles Corynebacterium, besonders bevorzugt C. humireducens, eingesetzt wird.
Erfindungsgemäße alkaliphile Bakterien sind vorzugsweise halotolerant und/oder
Huminsäure-reduzierend.
Unter einem„alkaliphilen Bakterium" ist erfindungsgemäß ein Bakterium zu verstehen, das dazu in der Lage ist, bei einem pH-Wert von 8,5 bis 1 1 zu wachsen. Vorzugsweise ist darunter ein Bakterium zu verstehen, das auch dazu in der Lage, bei einem pH-Wert von 9 bis 10,5 zu wachsen.
Unter einem„halotoleranten Bakterium" ist erfindungsgemäß ein Bakterium zu verstehen, das dazu in der Lage ist, bei Wasseraktivitäten von 0,6 bis 0,98 zu wachsen. Vorzugsweise ist darunter ein Bakterium zu verstehen, das auch dazu in der Lage ist, bei Wasseraktivitäten von 0,75 bis 0,9 zu wachsen.
Unter„L-Aminosäure" sind erfindungsgemäß insbesondere die proteinogenen L- Aminosäuren zu verstehen. Die L-Aminosäure ist hierbei vorzugsweise ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L-Arginin, sowie L- Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L- Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin. Die L-Aminosäure ist besonders bevorzugt ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin, vor allem aus L- Alanin, L-Valin, L-Glutamat und L-Lysin.
Der Stamm C. humireducens wird zum ersten Mal beschrieben durch Wu et al. (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (201 1 ), 61 , 882-887). Er wurde bei der DSMZ hinterlegt unter der Hinterlegungsnummer DSM 45392, seine 16S rRNA wurde bei EMBL hinterlegt und hat die Zugangsnummer GQ421281 . Bei dem Ausgangsstamm handelt es sich um ein halotolerantes, alkaliphiles, Huminsäure reduzierendes Bakterium.
Weitere Informationen über C. humireducens sind folgenden Publikationen zu entnehmen: Wu et al. (Microb. Biotechnol. (2013), 6(2), 141 -149), Lin et al. (Bioresour. Technol. (2013), 136, 302-308). Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend ebenso eine Alanin- Dehydrogenase (Aid), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 72 aufweist.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein Polynukleotid, das für eine erfindungsgemäße Alanin-Dehydrogenase kodiert. Es handelt sich hierbei vorzugsweise um ein Polynukleotid, das eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %,
vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1365 gemäß SEQ ID NO: 71 aufweist und/oder um ein Polynukleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz zu der Sequenz gemäß Position 301 bis 1365 gemäß SEQ ID NO: 71 komplementär ist.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch die Enzyme des hut- Clusters, ausgewählt aus a) einer Urocanat-Hydratase (hutU), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 190 aufweist; b) einer Imidazolon-Propionase (hutl), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 192 aufweist;
c) einer Histidin-Ammonialyase (hutH), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 194 aufweist; und d) einer Formididoylglutamase, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 196 aufweist. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso Polynukleotide, die für die erfindungsgemäßen Gene des hut-Clusters kodieren. Es handelt sich hierbei
vorzugsweise um folgende Polynukleotide: a) ein Polynukleotid, das für eine Uroconat-Hydratase (hutU) kodiert, und eine
Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1983 gemäß SEQ ID NO: 189 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 1983 gemäß SEQ ID NO: 189 ist;
b) ein Polynukleotid, das für eine Imidazolon-Propionase (hutl) kodiert, und eine
Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1509 gemäß SEQ ID NO: 191 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 1509 gemäß SEQ ID
NO: 191 ist;
c) ein Polynukleotid, das für eine Histidin-Ammonialyase (hutH) kodiert, und eine
Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1851 gemäß SEQ ID NO: 193 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 1851 gemäß SEQ ID NO: 193 ist; und d) ein Polynukleotid, das für eine Formididoylglutamase (hutG) kodiert, und eine
Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1209 gemäß SEQ ID NO: 195 aufweist und/oder unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid hybridisiert, dessen
Sequenz komplementär zu der Sequenz von Position 301 bis 1209 gemäß SEQ ID NO: 195 ist.
Unter„stringenten Bedingungen" ist erfindungsgemäß zu verstehen Waschen bei einer Salzkonzentration von 1 x SSC und 0,1 Gew.-% SDS bei einer Temperatur von 80°C. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die zu den erfindungsgemäßen kodierenden Polynukleotiden komplementär sind.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind entsprechend auch Vektoren, insbesondere Klonierungs- und Expressionsvektoren, die erfindungsgemäße Polynukleotide enthalten. Diese Vektoren können entsprechend in Mikroorganismen, insbesondere in coryneforme Bakterien, vor allem der Gattung Corynebacterium, oder Enterobacteriaceae, vor allem der Gattung Escherichia, eingebaut werden.
Ein erfindungsgemäßes Polynukleotid kann weiterhin zwecks Expression der kodierten Gene auch in das Genom von Mikroorganismen, insbesondere in das Genom von coryneformen Bakterien, insbesondere solchen der Gattung Corynebacterium, oder in das Genom von Enterobacteriaceaae, insbesondere solchen der Gattung Escherichia, eingebaut werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind entsprechend auch rekombinante Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien, vor allem solche der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art C. humireducens oder C. glutamicum, sowie Enterobacteriaceae, vor allem solche der Gattung Escherichia, die eine erfindungsgemäße Alanin-Dehydrogenase und/oder ein oder mehrere, vorzugsweise alle, erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters und/oder ein oder mehrere erfindungsgemäße Polynukleotide und/oder erfindungsgemäße Vektoren enthalten.
Ein bevorzugter Gegenstand sind hierbei rekombinante Corynebakterien, insbesondere der Art C. humireducens und der Art C. glutamicum, die eine erfindungsgemäße Alanin- Dehydrogenase und/oder ein für diese kodierendes Polynukleotid und/oder mindestens einen dieses Polynukleotid umfassenden Vektor enthalten. Weiterer bevorzugter Gegenstand sind hierbei rekombinante Corynebakterien, insbesondere der Art. C. humireducens und der Art. C. glutamicum, die mindestens ein, vorzugsweise alle, Enzym(e) des hut-Clusters und/oder für diese kodierende Polynukleotide und/oder mindestens einen diese Polynukleotide umfassenden Vektor enthalten. Ein besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind insbesondere auch
rekombinante Mikroorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere coryneforme Bakterien, vor allem solche der Gattung Cornyebacterium mit Ausnahme der Art C.
humireducens, insbesondere der Art. C. glutamicum, die eine erfindungsgemäße Alanin- Dehydrogenase und/oder ein oder mehrere, vorzugsweise alle, erfindungsgemäße Enzyme des hut-Clusters und/oder ein oder mehrere erfindungsgemäße Polynukleotide und/oder erfindungsgemäße Vektoren enthalten.
Unter einem„rekombinanten Mikroorganismus" bzw.„rekombinanten Bakterium" ist erfindungsgemäß ein Mikroorganismus bzw. Bakterium zu verstehen, der/das mindestens einer gentechnischen Maßnahme unterzogen wurde. Bei der gentechnischen Maßnahme kann es sich hierbei insbesondere um eine zielgerichtete oder ungerichtete Mutation, den Einbau eines wirtsfremden Gens und/oder die Überexpression oder Abschwächung eines wirtseigenen oder wirtsfremden Gens handeln. Vorzugsweise zeichnet sich ein
erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus bzw. ein erfindungsgemäßes rekombinantes Bakterium durch die Überexpression oder Abschwächung mindestens eines Gens aus. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich ein
erfindungsgemäßer Mikroorganismus bzw. ein erfindungsgemäßes Bakterium hierbei durch die Überexpression der erfindungsgemäßen Alanin-Dehydrogenase bzw. des für sie kodierenden Polynukleotids aus. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich ein erfindungsgemäßer Mikroorganismus bzw. ein erfindungsgemäßes
Bakterium durch die Überexpression mindestens eines erfindungsgemäßen Enzyms des hut- Clusters, insbesondere aller erfindungsgemäßer Enzyme des hut-Clusters, bzw. der entsprechenden für die Enzyme kodierenden Polynukleotide aus.
Innerhalb der Gattung Corynebacterium werden erfindungsgemäß Stämme bevorzugt, die auf folgenden Arten beruhen: Corynebacterium efficiens, wie zum Beispiel der Typstamm DSM44549, Corynebacterium glutamicum, wie zum Beispiel der Typstamm ATCC13032 oder der Stamm R, Corynebacterium ammoniagenes, wie zum Beispiel der Stamm
ATCC6871 , Corynebacterium humireducens, wie zum Beispiel der Stamm DSM 45392, sowie Corynebacterium pekinese, wie zum Beispiel der Stamm CGMCC No. 5361 . Besonders bevorzugt sind die Arten Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium humireducens. Sofern im Rahmen dieser Anmeldung vom Stamm Corynebacterium humireducens die Rede ist, handelt es sich vorzugsweise um den Stamm DSM 45392 oder um einen davon abgeleiteten Stamm. Einige Vertreter der Art Corynebacterium glutamicum sind im Stand der Technik auch unter anderen Bezeichnungen bekannt. Hierzu gehören beispielsweise: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium lilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium
lactofermentum ATCC13869 und Brevibacterium divaricatum ATCC14020. Der Begriff „Micrococcus glutamicus" für Corynebacterium glutamicum war ebenfalls gebräuchlich. Einige Vertreter der Art Corynebacterium efficiens wurden im Stand der Technik auch als Corynebacterium thermoaminogenes bezeichnet, wie zum Beispiel der Stamm FERM BP- 1539.
Angaben zur taxonomischen Einordnung von Stämmen der Gruppe der coryneformen Bakterien findet man unter anderem bei Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433- 1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bacteria, p 1 15-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., London, UK), Kämpfer und Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al (International Journal of Systematic Bacteriology 41 , 255-260 (1991 )), Fudou et al (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 52, 1 127-1 131 (2002)) und in der US-A-5,250,434.
Stämme mit der Bezeichnung„ATCC" können von der American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung„DSM" können von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung„NRRL" können von der
Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, US) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung„FERM" können vom National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1 -1 -1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japan) bezogen werden. Stämme mit der Bezeichnung„CGMCC" können vom China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC, Beijing, China) bezogen werden.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend ebenso ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren eine erfindungsgemäße Alanin-Dehydrogenase und/oder mindestens ein
erfindungsgemäßes Enzym des hut-Clusters, vorzugsweise alle erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters, und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder ein erfindungsgemäßer rekombinanter Mikroorganismus, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes rekombinantes Bakterium, insbesondere ein erfindungsgemäßes rekombinantes coryneformes Bakterium, besonderes bevorzugt ein erfindungsgemäßes rekombinantes Corynebakterium, vor allem ein Corynebacterium der Art C. humireducens oder C. glutamicum, eingesetzt wird. In einer erfindungsgemäß bevorzugten
Ausführungsform wird hierbei das mindestens eine erfindungsgemäße Polynukleotid bzw. das durch dieses kodierte Polypeptid in überexprimierter Form eingesetzt.
Ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist hierbei ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren eine erfindungsgemäße Alanin-Dehydrogenase und/oder mindestens ein für diese kodierendes Polynukleotid und/oder mindestens ein dieses Polynukleotid enthaltender Vektor und/oder ein rekombinantes Corynebakterium, vorzugsweise der Art C. humireducens oder C. glutamicum, das eine erfindungsgemäße Alanin-Dehydrogenase und/oder mindestens ein für diese kodierendes Polynukleotid und/oder mindestens einen dieses Polynukleotid umfassenden Vektor enthält, eingesetzt wird.
Weiterer bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein
Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym des hut-Clusters, vorzugsweise alle erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters, und/oder mindestens ein für diese(s) Enzym(e) kodierendes Polynukleotid, vorzugsweise für alle erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters kodierende Polynukleotide, und/oder mindestens ein diese(s) Polynukleotid(e) enthaltender Vektor und/oder ein rekombinantes Corynebakterium, vorzugsweise der Art. C. humireducens oder C. glutamicum, das mindestens ein erfindungsgemäßes Enzym des hut- Clusters, vorzugsweise alle erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters, und/oder mindestens ein für diese(s) Enzym(e) kodierendes Polynukleotid, vorzugsweise für alle erfindungsgemäßen Enzyme des hut-Clusters kodierende Polynukleotide, und/oder mindestens einen diese(s) Polynukleotid(e) umfassenden Vektor enthält, eingesetzt wird.
Die erfindungsgemäß produzierte L-Aminosäure ist hierbei vorzugsweise ausgewählt aus L- Alanin, L-Valin, L-Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L-Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin, besonders bevorzugt ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin, vor allem aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutamat und L-Lysin.
Das in erfindungsgemäßen Produktionsverfahren eingesetzte Corynebakterium ist vorzugsweise ausgewählt aus C. humireducens und C. glutamicum. Unter„Überproduzieren" bzw.„Überproduktion" ist erfindungsgemäß in Bezug auf die L- Aminosäure zu verstehen, dass die Mikroorganismen die L-Aminosäure über ihren eigenen Bedarf hinaus produzieren und entweder in der Zelle anreichern oder in das sie umgebende Nährmedium ausscheiden und dort akkumulieren. Vorzugsweise sind die Mikroorganismen hierbei dazu in der Lage > (mindestens) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, > 1 ,0 g/l, > 1 ,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4 g/l oder > 10 g/l der betreffenden L-Aminosäure in < (maximal) 120 Stunden, < 96 Stunden, < 48 Stunden, < 36 Stunden, < 24 Stunden oder < 12 Stunden in der Zelle oder im Nährmedium anzureichern bzw. zu akkumulieren.
Erfindungsgemäße rekombinante Mikroorganismen, in die erfindungsgemäße Polynukleotide und/oder erfindungsgemäße Vektoren eingebracht wurden, besitzen in einer bevorzugten Ausführungsform bereits vor dem Einbau der erfindungsgemäßen Polynukleotide und/oder Vektoren die Fähigkeit eine L-Aminosäure überzuproduzieren. Bei den Ausgangsstämmen handelt es sich bevorzugt um Stämme, die durch Mutagenese und Selektion, durch rekombinante DNA-Techniken oder durch eine Kombination beider Methoden hergestellt wurden. Es ist offensichtlich und bedarf keiner weiteren Erklärungen, dass man zu einem
erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismus auch dadurch gelangen kann, indem man einen Wildstamm, in welchem ein erfindungsgemäßes Polynukleotid und/oder ein erfindungsgemäßer Vektor enthalten ist oder eingebaut wurde, anschließend durch geeignete weitere genetische Maßnahmen dazu veranlasst, die L-Aminosäure zu
produzieren bzw. die L-Aminosäure-Produktion zu erhöhen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch weitere Polynukleotide aus C. humireducens sowie die durch diese Polynukleotide kodierten Polypeptide. Durch
Überexpression der entsprechenden Polynukleotide bzw. Polypeptide kann die
Aminosäureproduktion bestimmter L-Aminosäuren positiv beeinflusst werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso: a) eine Threonindehydratase (llvA, EC 4.3.1 .19) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 106 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
b) die Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (NvB), die eine Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 98, aufweist, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
c) eine Isomeroreduktase (llvC, EC 1.1 .1 .86) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 100 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
d) eine Dihydroxy-acid Dehydratase (llvD, EC 4.2.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 102 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
e) eine Transaminase (llvE, EC 2.6.1 .42) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 104 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
f) eine Acetolactat-Synthase (llvH, EC 2.2.1 .6) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 122 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
g) eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.1 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 18 sowie für diese kodierende Polynukleotide, h) eine Pantothenat-Synthase (PanC, EC 6.3.2.1 ) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 120 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
i) eine Glutamat-Dehydrogenase (Gdh) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 124 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
j) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 126 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
k) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 128 sowie für diese kodierende Polynukleotide, I) eine Glutamat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98
%, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 130 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
m) eine Isocitrat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 132 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
n) eine Aconitat-Hydrase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 134 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
o) eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 136 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
p) eine Aminopeptidase C (PepC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 138 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
q) eine Pyruvat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 140 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
r) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 142 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
s) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens
90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 144 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
t) eine Enolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %,
vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 146 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
u) eine 2,3-Bisphosphoglycerat-abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 148 sowie für diese kodierende Polynukleotide, v) eine Phosphoglycerat-Kinase (Pgk) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 150 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
w) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat- Dehydrogenase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 152 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
x) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-
Dehydrogenase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 154 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
y) eine Triosephosphat-lsomerase (TpiA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90,
95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 156 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
z) eine Fructosebisphosphataldolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 158 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
aa) eine 1 -Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 160 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
bb) eine 6-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 162 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
cc) eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1 .39) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 4 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
dd) eine Cystein-Synthase (CBS, CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90,
95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
ee) eine Cystathionin-Betalyase (AecD) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90,
95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
ff) eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Asd, EC 1.2.1.1 1 ) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28 sowie für diese kodierende Polynukleotide, gg) die kleinere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren
(BrnE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise
100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30 sowie für diese kodierende
Polynukleotide, hh) die größere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnF) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ii) eine Serin-Acetyltransferase (CysE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
jj) eine Cystein-Synthase (CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
kk) das H-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvH) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 38 sowie für dieses kodierende Polynukleotide,
II) das P-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvP) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40 sowie für dieses kodierende Polynukleotide,
mm) das T-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvT) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42 sowie für dieses kodierende Polynukleotide, nn) eine Serin-Hydroxymethyltransferase (GlyA) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 44 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
oo) eine gegebenenfalls feedbackresistente Homoserin-Dehydrogenase (Horn, EC
1 .2.1 .1 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise
100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46 sowie für diese kodierende
Polynukleotide,
pp) eine Lipoyl-Synthase (LipA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 48 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
qq) eine Lipoyl-Transferase (LipB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 50 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
rr) eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (Lpd) mit einer Sequenzidentität von mindestens
90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 52 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ss) eine Lipoat-Protein-Ligase (LplA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 94 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
tt) eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (GcvL) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 96 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
uu) eine vorzugsweise feedbackresistente Aspartat-Kinase (LysC, EC 2.7.2.4) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 sowie für diese kodierende Polynukleotide, vv) eine Cystathionin-gamma-Synthase (MetB) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 56 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
ww) eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58 sowie für diese kodierende Polynukleotide, xx) eine Homoserin-O-Acetyltransferase (MetX) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 60 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
yy) eine O-Acetylhomoserin-Lyase (MetY) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 62 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
zz) eine vorzugsweise feedbackresistente Pyruvat-Carboxylase (Pye, EC 6.4.1 .1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64 sowie für diese kodierende Polynukleotide, aaa) eine gegebenenfalls feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-
Dehydrogenase (SerA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 66 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
bbb) eine Phosphoserin-Phosphatase (SerB) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 68 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
cec) eine Phosphoserin-Aminotransferase (SerC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 70 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ddd) die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysD) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 74 sowie für diese kodierende Polynukleotide, eee) eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase (CysH) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 76 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
fff) eine Sulfit-Reduktase (CysI) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder
98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 78 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
ggg) eine NADPH-abhängige Glutamatsynthase-beta-Kette (CysJ) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 80 sowie für diese kodierende Polynukleotide, hhh) die große Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysN) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 82 sowie für diese kodierende Polynukleotide, iii) eine Cystathionin-beta-Synthase (CysY) mit einer Sequenzidentität von mindestens
90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 84, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
jjj) ein Sulfat-Transporter (CysZ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 86 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
kkk) eine 5-Methyltetrahydropteroyl-triglutamat-homocystein-Methyltransferase
(MetE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise
100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 88 sowie für diese kodierende
Polynukleotide,
III) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 (PtH1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens
90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 90 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
mmm) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 (PtH2) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 92, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
nnn) eine Diaminopimelat-Dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1 .16) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 202 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ooo) eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA, EC 4.1.1.20) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 164 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ppp) eine Aspartat-Aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 166, sowie für diese kodierende Polynukleotide,
qqq) ein L-Lysin-Exporter (LysE, Lysin-Efflux-Permease) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 168, sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
rrr) eine Dihydropicolinat-Reduktase (DapB, EC 1.3.1 .26) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 170 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
sss) eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1 .1 .49) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 172 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ttt) die Zwf-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Zwf, EC 1 .1 .1.49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 186 sowie für diese kodierende Polynukleotide, uuu) die OpcA-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (OpcA, EC 1 .1 .1 .49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise
100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 188 sowie für diese kodierende
Polynukleotide,
vvv) eine Phosphogluconsäure-Dehydrogenase (Gnd, EC 1.1 .1 .44) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 174 sowie für diese kodierende Polynukleotide.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Vektoren, die die zuvor genannten Polynukleotide enthalten, sowie rekombinanten Mikroorganismen, die die zuvor genannten Enzyme und/oder Polynukleotide und/oder Vektoren enthalten. Das betreffende Polypeptid und/oder Polynukleotid liegt hierbei in einer bevorzugten Ausführungsform in dem Mikroorganismus in überexprimierter Form vor. Bei den rekombinanten Mikroorganismen handelt es sich hierbei vorzugsweise um coryneforme Bakterien, vor allem um
Corynebakterien, insbesondere solchen der Art C. humireducens oder C. glutamicum.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur
Überproduktion einer L-Aminosäure, vorzugsweise ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L- Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L- Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin, besonders bevorzugt ausgewählt aus L- Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin, vor allem aus L-Alanin, L- Valin, L-Glutamat und L-Lysin, in welchem mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei, drei oder vier, der genannten Polynukleotide in uberexprimierter Form vorliegen, wobei das Verfahren vorzugsweise in Corynebakterien, insbesondere solchen der Art. C.
humireducens oder C. glutamicum, durchgeführt wird.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch weitere Polynukleotide aus C. humireducens sowie die durch diese Polynukleotide kodierten Polypeptide. Durch
Ausschaltung oder Abschwächung der entsprechenden Polynukleotide bzw. Polypeptide kann die Aminosäureproduktion bestimmter L-Aminosäuren positiv beeinflusst werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher ebenso: a) eine Threonin-Synthase (ThrC, EC 4.2.3.1 ) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 108 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
b) eine Isopropylmalat-Synthase (LeuA, EC 2.3.3.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 10 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
c) eine Isopropylmalat-Dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 12 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
d) die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), die
Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 14 bzw. SEQ ID NO: 1 16 aufweisen sowie für diese kodierende Polynukleotide,
e) die Untereinheiten einer Succinyl-CoA-Ligase (SucCD, EC 6.2.1 .5) mit
Sequenzidentitäten von jeweils mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 198 bzw. SEQ ID NO: 200 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
f) eine DNA-Bindungsdomäne vom Typ HTH tetR (McbR) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sowie für diese kodierende Polynukleotide, g) eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
h) eine Glucose-6-phosphat-lsomerase (Pgi, EC 5.3.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 6 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
i) eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Pck, EC 4.1.1 .32) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 sowie für diese kodierende Polynukleotide, j) ein D-Methionin bindendes Lipoprotein (MetQ) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 sowie für dieses kodierende Polynukleotide,
k) ein Methionin-Transporter (MetP) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
I) ein ATP-abhängiger Methionin-Transporter (MetN) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14 sowie für diesen kodierende Polynukleotide,
m) eine S-Adenosylmethionin-Synthase (MetK) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 16 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
n) eine Methionin-Importsystem-Permease (Metl) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
o) eine 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC 4.3.3.7) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 sowie für diese kodierende Polynukleotide, p) eine Carboxylat-Amin-Ligase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
q) eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase (Mqo, EC 1.1.99.16) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 176 sowie für diese kodierende Polynukleotide, r) die El p-Untereinheit eines Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (AceE, EC 1 .2.4.1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 178 sowie für diese kodierende Polynukleotide, s) eine Citrat-Synthase (GltA, EC 4.1 .3.7) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 180 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
t) eine Malat-Dehydrogenase (Mdh, EC 1.1 .1 .37) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 182 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
u) eine UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamat-2,6-diaminopimelat-Ligase (MurE, EC 6.3.2.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 184, sowie für diese kodierende Polynukleotide.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Vektoren, die die zuvor genannten Polynukleotide enthalten, sowie rekombinanten Mikroorganismen, die die zuvor genannten Enzyme und/oder Polynukleotide und/oder Vektoren enthalten. Das betreffende Polypeptid und/oder Polynukleotid liegt hierbei in einer bevorzugten Ausführungsform in dem Mikroorganismus in ausgeschalteter oder abgeschwächter Form vor. Bei den rekombinanten Mikroorganismen handelt es sich hierbei vorzugsweise um coryneforme Bakterien, vor allem um Corynebakterien, insbesondere solche der Art C. humireducens oder C. glutamicum, vor allem der Art C. humireducens.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur
Überproduktion einer L-Aminosäure, vorzugsweise ausgewählt aus L-Alanin, L-Valin, L- Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L- Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L-Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin, besonders bevorzugt ausgewählt aus L- Alanin, L-Valin, L-Glutamat, L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin, vor allem aus L-Alanin, L- Valin, L-Glutamat und L-Lysin, in welchem mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei, drei oder vier, der genannten Polynukleotide in ausgeschalteter oder abgeschwächter Form vorliegen, wobei das Verfahren vorzugsweise in Corynebakterien, insbesondere solchen der Art. C. humireducens oder C. glutamicum, durchgeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt hierbei gleichzeitig mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei, drei oder vier, der in der zuvor aufgeführten Liste genannten
Polynukleotide in überexprimierter Form vor. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere
erfindungsgemäße L-Valin-Überproduktionsstämme, mindestens eines, vorzugsweise mindestens 2 oder 3, besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, der folgenden Merkmale auf: a) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvA-Gen), das für eine Threonindehydratase (NvA, EC 4.3.1.19), vorzugsweise für eine Threonindehydratase mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 106, kodiert,
b) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvB-Gen), das für die Untereinheit einer
Acetolactat-Synthase (NvB), vorzugsweise für die Untereinheit einer Acetolactat- Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 98, kodiert,
c) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvN-Gen), das für die vorzugsweise feedback- resistente Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (NvN, EC 4.1.3.18) kodiert, d) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvC-Gen), das für eine Isomeroreduktase (NvC, EC 1.1.1 .86), vorzugsweise für eine Isomeroreduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 100, kodiert,
e) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvD-Gen), das für eine Dihydroxy-acid
Dehydratase (NvD, EC 4.2.1 .9), vorzugsweise für eine Dihydroxy-acid Dehydratase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 102, kodiert,
f) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvE-Gen), das für eine Transaminase (NvE, EC 2.6.1.42), vorzugsweise für eine Transaminase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 104, kodiert,
g) ein überexprimiertes Polynukleotid (ilvH-Gen), das für eine Acetolactat-Synthase (llvH, EC 2.2.1.6), vorzugsweise für eine Acetolactat-Synthase mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 122, kodiert,
h) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrB-Gen), das für eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1 .39), vorzugsweise für eine Homoserinkinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4, kodiert,
i) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrC-Gen), das für eine Threonin-Synthase
(ThrC, EC 4.2.3.1 ), vorzugsweise für eine Threonin-Synthase mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 108, kodiert,
j) ein überexprimiertes Polynukleotid (hom-Gen), das für eine gegebenenfalls feedback- resistente Homoserin-Dehydrogenase (Horn, EC 1 .2.1 .1 1 ), vorzugsweise für eine Homoserin-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46, kodiert, k) ein abgeschwächtes Polynukleotid (leuA-Gen), das für eine gegebenenfalls
feedback-resistente Isopropylmalat-Synthase (LeuA, EC 2.3.3.13), vorzugsweise für eine Isopropylmalat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 10, kodiert,
I) ein abgeschwächtes Polynukleotide (leuB-Gen), das für eine Isopropylmalat- Dehydrogenase (LeuB, EC 1.1 .1 .85), vorzugsweise für eine Isopropylmalat- Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 12, kodiert,
m) abgeschwächte Polynukleotide (leuCD-Gene), die für die Untereinheiten einer
Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), vorzugsweise für die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase mit Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 14 und SEQ ID NO: 1 16, kodieren,
n) ein überexprimiertes Polynukleotid (panB-Gen), das für eine 3-Methyl-2-
Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.1 1 ), vorzugsweise für eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 18, kodiert,
o) ein überexprimiertes Polynukleotid (panC-Gen), das für eine Pantothenat-Synthase (PanC, EC 6.3.2.1 ), vorzugsweise für eine Pantothenat-Synthase mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 120, kodiert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Valin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird. In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Glutamat-Überproduktionsstämme, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf, besonders bevorzugt in Kombination mit der Überexpression mindestens eines erfindungsgemäßen hut-Gens, insbesondere in Kombination mit der Überexpression aller erfindungsgemäßer hut-Gene: a) ein überexprimiertes Polynukleotid (gdh), das für eine Glutamat-Dehydrogenase (Gdh), vorzugsweise für eine Glutamat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 124 kodiert,
b) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamin-Synthetase (Glutamin- Synthetase 1 ), vorzugsweise für eine Glutamin-Synthetase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 126 kodiert,
c) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamin-Synthetase (Glutamin- Synthetase 2), vorzugsweise für eine Glutamin-Synthetase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 128 kodiert,
d) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glutamat-Synthase, vorzugsweise für eine Glutamat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 130 kodiert,
e) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Isocitrat-Dehydrogenase, vorzugsweise für eine Isocitrat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 132 kodiert, f) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Aconitat-Hydrase, vorzugsweise für eine Aconat-Hydrase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 134 kodiert,
g) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Citrat-Synthase, vorzugsweise für eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 136 kodiert,
h) ein überexprimiertes Polynukleotid (pepC), das für eine Aminopeptidase C (PepC), vorzugsweise für eine Aminopeptidase C mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 138 kodiert, i) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Dehydrogenase, vorzugsweise für eine Pyruvat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 140 kodiert, j) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 1 ), vorzugsweise für eine Pyruvat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 142 kodiert, k) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 2), vorzugsweise für eine Pyruvat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 144 kodiert, I) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Enolase, vorzugsweise für eine Enolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 146 kodiert,
m) ein überexprimiertes Polynukleotid (gpmA), das für eine 2,3-Bisphosphoglycerat- abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA), vorzugsweise für eine Phosphoglycerat- Mutase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100
%, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 148 kodiert,
n) ein überexprimiertes Polynukleotid (pgk), das für eine Phosphoglycerat-Kinase (Pgk), vorzugsweise für eine Phosphoglycerat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 150 kodiert,
o) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 1 ), vorzugsweise für eine
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 152 kodiert,
p) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase 2), vorzugsweise für eine
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 154 kodiert,
q) ein überexprimiertes Polynukleotid (tpiA), das für eine Triosephosphat-Isomerase (TpiA), vorzugsweise für eine Triosephosphat-Isomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 156 kodiert, r) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Fructosebisphosphataldolase, vorzugsweise für eine Fructosebisphosphataldolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 158 kodiert,
s) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine 1 -Phosphofructokinase, vorzugsweise für eine 1 -Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 160 kodiert, t) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine 6-Phosphofructokinase, vorzugsweise für eine 6-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 162 kodiert, u) ein überexprimiertes Polynukleotid (pgi), das für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase, vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 kodiert,
v) abgeschwächte Polynukleotide (sucCD), die für die Untereinheiten einer Succinyl-CoA- Ligase (SucCD, EC 6.2.1.5), vorzugsweise für die Untereinheiten einer Succinyl-CoA- Ligase mit Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 198 bzw. SEQ ID NO: 200 kodieren.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Glutamat, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.
In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Alanin-Überproduktionsstämme, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf, besonders bevorzugt in Kombination mit der Überexpression des erfindungsgemäßen ald-Gens: a) ein überexprimiertes Polynukleotid (alaD), das für eine Alanin-Dehydrogenase (AlaD), vorzugsweise für eine Alanin-Dehydrogenase aus Corynebakterien kodiert,
b) ein überexprimiertes Polynukleotid (gapA), das für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase (GapA), vorzugsweise für eine Glycerinaldehyd-3-phosphat- Dehydrogenase aus Corynebakterien kodiert, c) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (IdhA), das für eine L-Lactat- Dehydrogenase (LdhA), vorzugsweise für eine L-Lactat-Dehydrogenase aus
Corynebakterien kodiert,
d) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (ppc), das für eine
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (Ppc), vorzugsweise für eine Phosphoenolpyruvat- Carboxylase aus Corynebakterien kodiert,
e) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (alr), das für eine Alanin- Racemase (Air), vorzugsweise für eine Alanin-Racemase aus Corynebakterien kodiert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Alanin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.
In einer weiteren erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Methionin-Überproduktionsstämme, mindestens eines, vorzugsweise mindestens zwei oder drei, besonders bevorzugt mindestens vier oder fünf, der folgenden Merkmale auf: a) ein abgeschwächtes Polynukleotid (mcbR), das für eine DNA-Bindungsdomäne vom Typ HTH tetR (McbR), vorzugsweise für eine DNA-Bindungsdomäne mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 kodiert,
b) ein abgeschwächtes Polynukleotid (thrB-Gen), das für eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1.39), vorzugsweise für eine Homoserinkinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4, kodiert,
c) ein abgeschwächtes Polynukleotid (pgi), das für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase (Pgi, EC 5.3.1.9), vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-lsomerase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, kodiert,
d) ein abgeschwächtes Polynukleotid (pck), das für eine Phosphoenolpyruvat- Carboxykinase (Pck, EC 4.1.1 .32), vorzugsweise für eine Phosphoenolpyruvat- Carboxykinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8, kodiert, e) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metQ), das für ein D-Methionin bindendes
Lipoprotein (MetQ), vorzugsweise für ein D-Methionin bindendes Lipoprotein mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10, kodiert,
f) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metP), das für einen Methionin-Transporter
(MetP), vorzugsweise für einen Methionin-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12, kodiert,
g) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metN), das für einen ATP-abhängigen Methionin- Transporter (MetN), vorzugsweise für einen ATP-abhängigen Methionin-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14, kodiert,
h) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metK), das für eine S-Adenosylmethionin- Synthase (MetK), vorzugsweise für eine S-Adenosylmethionin-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16, kodiert,
i) ein abgeschwächtes Polynukleotid (metl), das für eine Methionin-Importsystem- Permease (Metl), vorzugsweise für eine Methionin-Importsystem-Permease mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18, kodiert,
j) ein abgeschwächtes Polynukleotid (dapA), das für eine 4-Hydroxy-
Tetrahydrodipicolinat-Synthase (DapA), vorzugsweise für eine 4-Hydroxy- Tetrahydrodipicolinat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20, kodiert, k) ein überexprimiertes Polynukleotid (CBS, cysK), das für eine Cystein-Synthase (CBS, CysK), vorzugsweise für eine Cystein-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22 kodiert,
I) ein abgeschwächtes Polynukleotid, das für eine Carboxylat-Amin-Ligase,
vorzugsweise für eine Carboxylat-Amin-Ligase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24 kodiert,
m) ein überexprimiertes Polynukleotid (aecD), das für eine Cystathionin-Betalyase
(AecD), vorzugsweise für eine Cystathionin-Betalyase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (asd), das für eine Aspartat-semialdehyd- Dehydrogenase (Asd), vorzugsweise für eine Aspartat-semialdehyd-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (metH), das für eine 5-Methyltetrahydrofolat-
Homocysteinmethyltransferase (MetH, EC 2.1.1 .13) kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (brnE), das für die kleinere Untereinheit eines
Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnE), vorzugsweise für eine
Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (brnF), das für die größere Untereinheit eines
Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnF), vorzugsweise für eine
Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (cysE), das für eine Serin-Acetyltransferase
(CysE), vorzugsweise für eine Serin-Acetyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 34 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (cysK), das für eine Cystein-Synthase (CysK), vorzugsweise für eine Cystein-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (gcvH), das für das H-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvH), vorzugsweise für ein H-Protein mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (gcvP), das für das P-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvP), vorzugsweise für ein P-Protein mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40 kodiert,
ein überexprimiertes Polynukleotid (gcvT), das für das T-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvT), vorzugsweise für ein T-Protein mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42 kodiert,
w) ein überexprimiertes Polynukleotid (glyA), das für eine Serin- Hydroxymethyltransferase (GlyA), vorzugsweise für eine Serin- Hydroxymethyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 44 kodiert,
x) ein überexprimiertes Polynukleotid (hom), das für eine gegebenenfalls feedback- resistente Homoserin-Dehydrogenase (Hom), vorzugsweise für eine Homoserin- Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46 kodiert,
y) ein überexprimiertes Polynukleotid (NpA), das für eine Lipoyl-Synthase (LipA),
vorzugsweise für eine Lipoyl-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 48 kodiert, z) ein überexprimiertes Polynukleotid (NpB), das für eine Lipoyl-Transferase (LipB), vorzugsweise für eine Lipoyl-Transferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 50 kodiert,
aa) ein überexprimiertes Polynukleotid (Ipd), das für eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (Lpd), vorzugsweise für eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 52 kodiert,
bb) ein überexprimiertes Polynukleotid (IplA), das für eine Lipoat-Protein-Ligase (LplA), vorzugsweise für eine Lipoat-Protein-Ligase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 94 kodiert,
cc) ein überexprimiertes Polynukleotid (gcvL), das für eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (GcvL), vorzugsweise für eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 96, kodiert,
dd) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysC), das für eine vorzugsweise feedback- resistente Aspartat-Kinase (LysC), vorzugsweise für eine Aspartat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 kodiert,
ee) ein überexprimiertes Polynukleotid (metB), das für eine Cystathionin-gamma- Synthase (MetB), vorzugsweise für eine Cystathinonin-gamma-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der
Sequenz gemäß SEQ ID NO: 56, kodiert,
ff) ein überexprimiertes Polynukleotid (metF), das für eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-
Reduktase (MetF), vorzugsweise für eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58, kodiert,
gg) ein überexprimiertes Polynukleotid (metX), das für eine Homoserin-O-
Acetyltransferase (MetX), vorzugsweise für eine Homoserin-O-Acetyltransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 60, kodiert,
hh) ein überexprimiertes Polynukleotid (metY), das für eine O-Acetylhomoserin-Lyase
(MetY), vorzugsweise für eine O-Acetylhomoserin-Lyase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 62, kodiert,
ii) ein überexprimiertes Polynukleotid (pyc), das für eine Pyruvat-Carboxylase (Pye), vorzugsweise für eine Pyruvat-Carboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 64, kodiert,
jj) ein überexprimiertes Polynukleotid (serA), das für eine gegebenenfalls feedback- resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerA), vorzugsweise für eine D-3-
Phosphoglycerat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 66, kodiert, kk) ein überexprimiertes Polynukleotid (serB), das für eine Phosphoserin-Phosphatase (SerB), vorzugsweise für eine Phosphoserin-Phosphatase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 68, kodiert,
II) ein überexprimiertes Polynukleotid (serC), das für eine Phosphoserin-
Aminotransferase (SerC), vorzugsweise für eine Phosphoserin-Aminotransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 70, kodiert,
mm) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysD), das für die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysD), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 74 kodiert, nn) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysH), das für eine Adenosin-Phosphosulfat- Reduktase (CysH), vorzugsweise für eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 76 kodiert,
oo) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysl), das für eine Sulfit-Reduktase (Cysl),
vorzugsweise für eine Sulfit-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 78 kodiert,
pp) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysJ), das für (CysJ), vorzugsweise für eine mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 80, kodiert,
qq) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysN), das für die Untereinheit einer Sulfat- Adenylyltransferase (CysD), vorzugsweise für eine Untereinheit mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 82, kodiert,
rr) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysY), das für eine Cystathionin-beta-Synthase (CysY), vorzugsweise für eine Cystathionin-beta-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 84, kodiert,
ss) ein überexprimiertes Polynukleotid (cysZ), das für einen putativen Sulfat-Transporter (CysZ), vorzugsweise für einen Sulfat-Transporter mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 86, kodiert,
tt) ein überexprimiertes Polynukleotid (metE), das für eine 5-Methyltetrahydropteroyl- triglutamat-homocystein-Methyltransferase (MetE), vorzugsweise für ein Protein mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 88, kodiert,
uu) ein überexprimiertes Polynukleotid (ptH1 ), das für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 (PtH1 ), vorzugsweise für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß
SEQ ID NO: 90, kodiert,
vv) ein überexprimiertes Polynukleotid (ptH2), das für eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 (PtH2), vorzugsweise für eine eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 92, kodiert. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Methionin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weisen erfindungsgemäße Mikroorganismen oder Bakterien, insbesondere erfindungsgemäße Corynebakterien, vor allem
erfindungsgemäße Corynebakterien der Art C. humireducens oder C. glutamicum, insbesondere erfindungsgemäße L-Lysin-Überproduktionsstämme, mindestens eines, vorzugsweise mindestens 2 oder 3, besonders bevorzugt mindestens 4 oder 5, der folgenden Merkmale auf: a) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapA), das für eine Dihydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC 4.2.1.52), vorzugsweise für eine Dihydrodipicolinat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20, kodiert,
b) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysC), das für eine vorzugsweise feedback- resistente Aspartat-Kinase (LysC, EC 2.7.2.4), vorzugsweise für eine Aspartat-Kinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 kodiert,
c) ein überexprimiertes Polynukleotid (ddh), das für eine Diaminopimelat- Dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1 .16), vorzugsweise für eine Diaminopimelat- Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 202 kodiert,
d) ein überexprimiertes Polynukleotid (asd), das für eine Aspartat-Semialdehyd- Dehydrogenase (Asd, EC 1 .2.1.1 1 ), vorzugsweise für eine eine Aspartat- Semialdehyd-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28, kodiert, e) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysA), das für eine Diaminopimelat- Decarboxylase (LysA, EC 4.1 .1.20), vorzugsweise für eine Diaminopimelat- Decarboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 164, kodiert,
f) ein überexprimiertes Polynukleotid (aat), das für eine Aspartat-Aminotransferase (AaT, EC 2.6.1 .1 ), vorzugsweise für eine Aspartat-Aminotransferase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 166, kodiert, g) ein überexprimiertes Polynukleotid (lysE), das für einen L-Lysin-Exporter (LysE, Lysin-Efflux-Permease), vorzugsweise für einen L-Lysin-Exporter mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 168, kodiert,
h) ein überexprimiertes Polynukleotid (pyc), das für eine Pyruvat-Carboxylase (Pyc, EC 6.4.1 .1 ), vorzugsweise für eine Pyruvat-Carboxylase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64, kodiert,
i) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapF), das für eine Diaminopimelat-Epimerase (DapF, EC 5.1 .1 .7) kodiert,
j) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapB), das für eine Dihydropicolinat-Reduktase (DapB, EC 1 .3.1.26), vorzugsweise für eine Dihydropicolinat-Reduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 170, kodiert,
k) ein überexprimiertes Polynukleotid, das für eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1 .1 .49), vorzugsweise für eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 172, kodiert,
I) ein überexprimiertes Polynukleotid (zwf), das für die Zwf-Untereinheit einer Glucose- 6-phosphat-Dehydrogenase (Zwf, EC 1 .1 .1 .49), vorzugsweise für eine Zwf-
Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 186, kodiert,
m) ein überexprimiertes Polynukleotid (opcA), das für die OpcA-Untereinheit einer
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (OpcA, EC 1.1 .1 .49), vorzugsweise für eine OpcA-Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 188, kodiert,
n) ein überexprimiertes Polynukleotid (gnd), das für eine Phosphogluconsäure- Dehydrogenase (Gnd, EC 1 .1 .1.44), vorzugsweise für eine Phosphogluconsäure- Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 174, kodiert,
o) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (mqo), das für eine Malat- Chinon-Oxidoreduktase (Mqo, EC 1 .1 .99.16), vorzugsweise für eine Malat-Chinon- Oxidoreduktase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 176, kodiert, p) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid, das für die E1 p- Untereinheit eines Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (AceE, EC 1 .2.4.1 ), vorzugsweise für eine El p-Untereinheit mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 178, kodiert,
q) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (gltA), das für eine Citrat- Synthase (GltA, EC 4.1 .3.7), vorzugsweise für eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 180, kodiert,
r) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (mdh), das für eine Malat- Dehydrogenase (Mdh, EC 1.1 .1 .37), vorzugsweise für eine Malat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 182, kodiert,
s) ein ausgeschaltetes oder abgeschwächtes Polynukleotid (murE), das für eine UDP- N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamat-2,6-diaminopimelat-Ligase, 6-Diaminopimelat- Ligase (MurE, EC 6.3.2.13), vorzugsweise für ein Enzym mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 184, kodiert.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist entsprechend auch ein Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, insbesondere L-Lysin, in welchem ein derartiger Mikroorganismus bzw. ein derartiges Bakterium eingesetzt wird.
Die zuvor genannten, in erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten bzw. einzusetzenden Polynukleotide und Polypeptide stammen vorzugsweise aus Corynebakterien, insbesondere aus C. glutamicum oder C. humireducens, besonders bevorzugt aus C. humireducens.
Unter„Überexpression" ist erfindungsgemäß allgemein eine Erhöhung der intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins (Polypeptids) oder eines Enzyms, die durch eine entsprechende DNA kodiert werden, in einem Mikroorganismus im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder Wildtypstamm zu verstehen. Unter einem Ausgangsstamm (Elternstamm) versteht man den Stamm, an dem die zur
Überexpression führende Maßnahme durchgeführt wurde.
Die Erhöhung der Konzentration oder Aktivität lässt sich beispielsweise dadurch erzielen, dass man die Kopienzahl der entsprechenden kodierenden Polynukleotide chromosomal oder extrachromosomal um mindestens eine Kopie erhöht. Eine weit verbreitete Methode zur Erhöhung der Kopienzahl besteht darin, dass man das entsprechende kodierende Polynukleotid in einen Vektor, bevorzugt ein Plasmid, einbaut, der von einem Mikroorganismuns, insbesondere einem coryneformen Bakterium, repliziert wird. Weiterhin kann man als Vektoren Transposons, Insertionselemente (IS-Elemente) oder Phagen einsetzen. Im Stand der Technik ist eine Fülle geeigneter Vektoren beschrieben.
Eine andere verbreitete Methode zur Erzielung einer Überexpression ist das Verfahren der chromosomalen Genamplifikation. Bei dieser Methode wird mindestens eine zusätzliche Kopie des interessierenden Polynukleotids in das Chromosom eines coryneformen
Bakteriums eingefügt. Derartige Amplifikationsverfahren sind beispielsweise in der WO 03/014330 oder WO 03/040373 beschrieben.
Eine weitere Methode zur Erzielung einer Überexpression besteht darin, das entsprechende Gen beziehungsweise Allel in funktioneller Weise (operably linked) mit einem Promotor beziehungsweise einer Expressionskassette zu verknüpfen. Geeignete Promotoren für Corynebacterium glutamicum sind beispielsweise in der Fig. 1 des Übersichtsartikel von Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1 -3), 31 1 -323 (2003)) und in zusammenfassenden Darstellungen wie dem„Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Eds.: Lothar Eggeling und Michael Bott, CRC Press, Boca Raton, US (2005)) oder dem Buch„Corynebacteria, Genomics and Molecular Biology" (Ed.: Andreas Burkovski, Caister Academic Press, Norfolk, UK (2008)) beschrieben. In gleicher Weise können die von Vasicova et al (Journal of Bacteriology 181 , 6188-6191 (1999)) beschriebenen Varianten des dapA-Promotors, beispielsweise der Promotor A25 eingesetzt werden. Weiterhin kann der gap-Promotor von Corynebacterium glutamicum (EP 06007373) verwendet werden. Schließlich können die hinlänglich bekannten von Amann et al. (Gene 69(2), 301 -315 (1988)) und Amann und Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) beschriebenen Promotoren T3, T7, SP6, M13, lac, tac und trc verwendet werden. Ein derartiger Promotor kann beispielsweise stromaufwärts des betreffenden Gens, typischerweise im Abstand von ungefähr 1 - 500 Nukleobasen vom Startkodon, eingefügt werden.
Durch die Maßnahme der Überexpression wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids vorzugsweise um mindestens 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% oder 500%, maximal bis vorzugsweise 1000% oder 2000%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur
Überexpression führenden Maßnahme, erhöht. Die Konzentration eines Proteins kann über 1 - und 2-dimensionale Proteingelauftrennung und anschließende optische Identifizierung der Proteinkonzentration mit entsprechender Auswertesoftware im Gel bestimmt werden. Eine gebräuchliche Methode zur Präparation der Proteingele bei coryneformen Bakterien und zur Identifizierung der Proteine ist die von Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001 )) beschriebene Vorgehensweise. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls durch Western-Blot-Hybridisierung mit einem für das nachzuweisende Protein spezifischen Antikörper (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) und anschließender optischer Auswertung mit entsprechender Software zur
Konzentrationsbestimmung (Lohaus und Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 38: 2630-2647 (1999)) bestimmt werden. Die Aktivität kann mit Hilfe eines geeigneten Enzymtest bestimmt werden.
Der Begriff„Abschwächung" bezeichnet erfindungsgemäß die Verringerung der
intrazellulären Konzentration oder Aktivität einer Ribonukleinsäure, eines Proteins
(Polypeptids) oder eines Enzyms, die durch eine entsprechende DNA kodiert werden, in einem Mikroorganismus, im Vergleich zum Ausgangsstamm (Elternstamm) oder
Wildtypstamm. Als Ausgangsstamm (Elternstamm) wird der Stamm bezeichnet, an dem die Maßnahme der Abschwächung durchgeführt wurde.
Die Abschwächung kann erzielt werden, indem die Expression eines Polypeptids, beispielsweise durch Verwendung eines schwachen Promotors, verringert wird oder indem ein Allel verwendet wird, das für ein Polypeptid mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert. Die Abschwächung kann auch dadurch erreicht werden, indem die Expression des Polypeptids vollständig unterbunden wird, beispielsweise dadurch, dass das kodierende Gen ausgeschaltet wird. Durch die Maßnahme der Abschwächung wird die Aktivität oder Konzentration des entsprechenden Polypeptids vorzugsweise um mindestens 10%, 25%, 50% oder 75%, maximal um 100%, bezogen auf die Aktivität oder Konzentration des Polypeptids im Stamm vor der zur Abschwächung führenden Maßnahme, reduziert. In einer bevorzugten
Ausführungsform besteht die Abschwächung in der vollständigen Ausschaltung der
Expression des betreffenden Polypeptids.
Unter feedback-resistenten Enzymen versteht man im Zusammenhang mit der
Aminosäureproduktion generell Enzyme, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch die produzierte L-Aminosäure und/oder Analoga davon aufweisen.
So versteht man insbesondere unter einer feedback-resistenten Aspartatkinase (LysCFBR) eine Aspartatkinase, die im Vergleich zur Wildform eine geringere Empfindlichkeit gegenüber der Hemmung durch Mischungen von Lysin und Threonin oder Mischungen von AEC (Aminoethylcystein) und Threonin oder Lysin alleine oder AEC alleine aufweisen. Für die Lysin-Produktion werden entsprechend Stämme, die solche feedbackresistenten bzw.
desensibilisierten Aspartatkinasen enthalten, bevorzugt eingesetzt.
Literaturbekannt sind beispielsweise folgende feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. glutamicum: A279T, A279V, S301 F, S301Y, T308I, T31 11, R320G, G345D, S381 F. Bzgl. feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. glutamicum wird weiterhin auf folgende Veröffentlichungen verwiesen: JP1993184366-A, JP1994062866-A, JP1994261766-A, JP1997070291 -A, JP1997322774-A, JP1998165180-A, JP1998215883-A, US5688671 -A, EP0387527, WO00/63388, US3732144, JP6261766, Jetten et al. (1995; Applied
Microbiology Biotechnology 43: 76-82). Feedback-resistente Aspartatkinasen aus C.
glutamicum sind in der NCBI-GenBank unter folgenden Zugangsnummern hinterlegt:
E05108, E06825, E06826, E06827, E08177, E08178, E08179, E08180, E08181 , E08182, E12770, E14514, E16352, E16745, E16746, I74588, I74589, I74590, 174591 , I74592, I74593, I74594, I74595, I74596, I74597, X57226, L16848, L27125. Bevorzugt werden erfindungsgemäß folgende feedback-resistenten Aspartatkinasen aus C. humireducens eingesetzt: D274Y, A279E, S301Y, T308I, T31 1 I, G359D.
Ebenso werden bei der Threonin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die
entsprechend eine feedback-resistente Homoserin-Dehydrogenase (HomFBR) enthalten.
Ebenso werden bei der Isoleucin-Produktion und Valin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Acetolactat-Synthase enthalten.
Ebenso werden bei der Leucin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Isopropylmalat-Synthase (LeuAFBR) enthalten.
Ebenso werden bei der Prolin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Glutamat-5-Kinase (ProBFBR) enthalten. Ebenso werden bei der Arginin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente Ornithin-Carbamoyltransferase (ArgFFBR) enthalten. Ebenso werden bei der Serin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die entsprechend eine feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerAFBR) enthalten.
Ebenso werden bei der Methionin-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die
entsprechend eine feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (SerAFBR) und/oder feedback-resistente Pyruvat-Carboxylasen (PycFBR) enthalten.
Ebenso werden bei der Tryptophan-Produktion bevorzugt Stämme eingesetzt, die
entsprechend eine feedback-resistente Phospho-2-dehydro-3-Deoxyheptonat-Aldolase (AroGFBR oder AroHFBR) enthalten.
Hinsichtlich weiterer bevorzugter Eigenschaften des erfindungsgemäß einzusetzenden L- Aminosäuren überproduzierenden C. humireducens-Stamms wird auf die oben zitierte
Veröffentlichung von Wu et al. (201 1 ) sowie die weiteren oben genannten Veröffentlichungen verwiesen.
Erfindungsgemäße Mikroorganismen, insbesondere Bakterien der Gattung Corynebacterium, können kontinuierlich - wie beispielsweise in der WO 05/021772 beschrieben- oder diskontinuierlich im Batch-Verfahren (Satzkultivierung bzw. Satzverfahren) oder im Fed- Batch- (Zulaufverfahren) oder Repeated-Fed-Batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion der L-Aminosäure kultiviert werden. Eine Zusammenfassung allgemeiner Art über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) verfügbar.
Das zu verwendende Kulturmedium beziehungsweise Fermentationsmedium muss in geeigneter weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch„Manual of Methods for General Bacteriology,, der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981 ) enthalten. Die Begriffe Kulturmedium und Fermentationsmedium beziehungsweise Medium sind gegenseitig austauschbar.
Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlenhydrate wie z.B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Saccharose-haltige Lösungen aus der Zuckerrüben- oder Zuckerrohrherstellung, Stärke, Stärkehydrolysat und Cellulose, Öle und Fette, wie zum Beispiel Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie zum Beispiel Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie zum Beispiel Glycerin, Methanol und Ethanol und organische Säuren, wie zum Beispiel Essigsäure oder Milchsäure verwendet werden.
Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-haltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid,
Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden.
Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder
Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muss weiterhin Salze beispielsweise in Form von Chloriden oder Sulfaten von Metallen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Calcium und Eisen enthalten, wie zum Beispiel Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren beispielsweise Homoserin und Vitamine beispielsweise Thiamin, Biotin oder Pantothensäure zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden.
Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid,
Kaliumhydroxid, Ammoniak beziehungsweise Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Der pH wird im Allgemeinen auf einen Wert von 6,0 bis 9,0 vorzugsweise 6,5 bis 8 eingestellt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel, wie zum Beispiel Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, wie zum Beispiel Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-haltige
Gasmischungen, wie zum Beispiel Luft in die Kultur eingetragen. Die Verwendung von Flüssigkeiten, die mit Wasserstoffperoxid angereichert sind, ist ebenfalls möglich.
Gegebenenfalls wird die Fermentation bei Überdruck, beispielsweise bei einem Druck von 0,03 bis 0,2 MPa, gefahren. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Bei batch-Verfahren wird die Kultivierung solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der gewünschten L-Aminosäure, gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht. Bei kontinuierlichen Verfahren sind längere Kultivierungszeiten möglich. Durch die Tätigkeit der Bakterien kommt es zu einer Anreicherung (Akkumulation) der L-Aminosäure im Fermentationsmedium und/oder in den Bakterienzellen.
Beispiele für geeignete Fermentationsmedien finden sich unter anderem in den
Patentschriften 5,770,409, US 5,840,551 und US 5,990,350 oder US 5,275,940.
Die Analyse von L-Aminosäuren zur Bestimmung der Konzentration zu einem oder mehreren Zeitpunkt(en) im Verlauf der Fermentation kann durch Trennung der L-Aminosäuren mittels lonenaustauschchromatographie vorzugsweise Kationenaustauschchromatographie mit anschließender Nachsäulenderivatisierung unter Verwendung von Ninhydrin erfolgen, so wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1 190-1206 (1958)) beschrieben. Anstelle von Ninhydrin kann auch ortho-Phtadialdehyd zur Nachsäulenderivatisierung eingesetzt werden. Einen Übersichtsartikel zur lonenaustauschchromatographie findet man bei Pickering (LC-GC (Magazine of Chromatographie Science) 7(6), 484-487 (1989)).
Es ist ebenfalls möglich eine Vorsäulenderivatisierung beispielsweise unter Verwendung von ortho-Phtadialdehyd oder Phenylisothiocyanat vorzunehmen und die entstandenen
Aminosäurederivate durch Reversed-Phase-Chromatographie (RP) vorzugsweise in Form der Hochleistungsflüssigkeits-chromatographie (HPLC) aufzutrennen. Eine derartige
Methode ist beispielsweise bei Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51 : 1 167-1 174 (1979)) beschrieben. Die Detektion erfolgt photometrisch (Absorption, Fluoreszenz).
Eine zusammenfassende Darstellung zur Aminosäureanalyse findet man unter anderem im Lehrbuch„Bioanalytik" von Lottspeich und Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland 1998).
Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend auch ein Verfahren zur Herstellung einer L- Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass man folgende Schritte durchführt: a) Fermentation der erfindungsgemäßen Mikroorganismen, insbesondere
coryneformen Bakterien, bevorzugt der Gattung Corynebacterium, besonders bevorzugt der Art Corynebacterium glutamicum oder Corynebacterium humireducens, in einem geeignetem Nährmedium, und b) Akkumulation der L-Aminosäure in dem Nährmedium und/oder in den Zellen der genannten Bakterien. Anschließend erfolgt die Bereitstellung bzw. Herstellung oder Gewinnung eines L- Aminosäure haltigen Produktes in flüssiger oder fester Form.
Durch die Maßnahmen der Fermentation erhält man eine Fermentationsbrühe, welche die betreffende L-Aminosäure enthält. Unter einer Fermentationsbrühe versteht man ein Fermentationsmedium bzw. Nährmedium, in dem ein Mikroorganismus für eine gewisse Zeit und bei einer gewissen Temperatur kultiviert wurde. Das Fermentationsmedium beziehungsweise die während der Fermentation eingesetzten Medien enthält/enthalten sämtliche Substanzen beziehungsweise
Komponenten, die eine Vermehrung des Mikroorganismus und eine Bildung der
gewünschten L-Aminosäure sicherstellen.
Bei Abschluss der Fermentation enthält die entstandene Fermentationsbrühe
dementsprechend a) die infolge der Vermehrung der Zellen des Mikroorganismus entstandene Biomasse (Zellmasse) des Mikroorganismus, b) das im Laufe der Fermentation gebildete L-Aminosäure, c) die im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte, und d) die durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten
Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe wie beispielsweise Vitamine wie Biotin oder Salze wie Magnesiumsulfat. Zu den organischen Nebenprodukten gehören Stoffe, die von den bei der Fermentation eingesetzten Mikroorganismen neben der gewünschten L-Aminosäure erzeugt und gegebenenfalls ausgeschieden werden. Hierzu gehören auch Zucker wie zum Beispiel Trehalose.
Die Fermentationsbrühe wird dem Kulturgefäß beziehungsweise dem Fermentationsbehälter entnommen, gegebenenfalls gesammelt, und dazu verwendet, ein L-Aminosäure haltiges Produkt in flüssiger oder fester Form bereitzustellen. Hierfür wird auch der Ausdruck „Gewinnen des L-Aminosäure haltigen Produktes" verwendet. Im einfachsten Fall stellt die L- Aminosäure-haltige Fermentationsbrühe selbst das gewonnene Produkt dar.
Durch eine oder mehrere der Maßnahmen ausgewählt aus der Gruppe a) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) Entfernung des Wassers, b) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%) Entfernung der Biomasse, wobei diese gegebenenfalls vor der Entfernung inaktiviert wird,
c) teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) Entfernung der im Laufe der Fermentation gebildeten organischen Nebenprodukte, und d) teilweise (> 0%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80%, > 90%, > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99%, > 99,3%, > 99,7%) Entfernung der durch die Fermentation nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten
Fermentationsmediums beziehungsweise der Einsatzstoffe, aus der Fermentationsbrühe erzielt man eine Konzentrierung bzw. Reinigung der L- Aminosäure. Auf diese Weise werden Produkte isoliert, die einen gewünschten Gehalt an L- Aminosäure aufweisen.
Die teilweise (> 0% bis < 80%) bis vollständige (100%) oder nahezu vollständige (> 80% bis < 100%) Entfernung des Wassers (Maßnahme a)) wird auch als Trocknung bezeichnet.
Durch vollständige oder nahezu vollständige Entfernung des Wassers, der Biomasse, der organischen Nebenprodukte und der nicht verbrauchten Bestandteile des eingesetzten Fermentationsmediums gelangt man zu reinen ((> 80 Gew.-%, > 90 Gew.-%) oder hochreinen (> 95 Gew.-%, > 97 Gew.-%, > 99% Gew.-%) Produktformen der L-Aminosäure. Für die Maßnahmen gemäß a), b), c) oder d) ist im Stand der Technik eine Fülle von technischen Anleitungen verfügbar.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 : L-Alanin- und L-Valin-Leistungstest
Für den L-Alanin-/L-Valin-Leistungstest wurde der Typstamm von C. humireducens (DSM 45392) im Schüttelkolbenansatz kultiviert. Dazu wurde der C. humireducens Stamm in 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H20) als Vorkultur bei 37°C mit 200 rpm 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Schüttelkolbenmedium auf eine
OD66o on 0,2 inokuliert und bei 37°C mit 200 rpm, 48 h lang kultiviert. Zur Herstellung dieses Mediums wurden 20 g Ammoniumsulfat, 0,4 g MgS04 *7H20, 0,6 g KH2P04 und 10 g Hefeextrakt in 750 ml H20 gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 20% NH4OH auf 7,8 eingestellt und die Lösung anschließend autoklaviert. Anschließend wurden 4 ml einer Vitaminlösung (pH 7 mit NH4OH), bestehend aus 0,25 g/l Thiamin, 50 mg/l Cyanocobalamin, 25 mg/l Biotin und 1 ,25 g/l Pyridoxin, hinzugefügt. Des Weiteren wurden 140 ml einer sterilfiltrierten 50%igen Glukoselösung und 50 g trockenautoklaviertes CaC03 hinzugefügt und das Medium anschließend auf einen Liter aufgefüllt.
Nach der Kultivierung wurde jeweils vom Überstand von vier parallelen Kulturen eine HPLC- Analyse zur Bestimmung des Gehaltes an Alanin und Valin mit einer Nachweisgrenze von >0,01 g/l durchgeführt.
Der Typstamm von C. humireducens produziert nach 48 h Kultivierung in
Schüttelkolbenmedium bei 37°C, 200 rpm im Schüttelkolbenmaßstab rund 0,81 g/l Alanin (Netto-Ausbeute: 0,01 1 gAianin gGiukose) und 1 ,6 g/l Valin (Netto-Ausbeute: 0,022 gvaiin gGiukose) (Tab. 1 ). Tab. 1 : Analytikwerte eines Schüttelkolbenversuches mit dem Typstamm von C.
humireducens. Aufgeführt sind die gemessenen Werte nach der Kultivierung mit Zellen und die des leeren Mediums.
Figure imgf000043_0001
Beispiel 2: Glutamat-Leistungstest Für den L-Glutamat-Leistungstest wurde der Typstamm von C. humireducens (DSM 45392) im Schüttelkolbenansatz kultiviert. Dazu wurde der C. humireducens Stamm in 10 ml BHI- Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H20) als Vorkultur bei 37°C mit 200 rpm 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Schüttelkolbenmedium auf eine OD66o on 0,2 inokuliert und bei 37°C mit 200 rpm, 48 h lang kultiviert. Zur Herstellung dieses Mediums wurden 20 g Ammoniumsulfat, 0,4 g MgS04 *7H20, 0,6 g KH2P04 und 10 g Hefeextrakt in 750 ml H20 gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 20% NH4OH auf 7,8 eingestellt und die Lösung anschließend autoklaviert. Anschließend wurden 4 ml einer Vitaminlösung (pH 7 mit NH4OH) , bestehend aus 0,25 g/l Thiamin, 50 mg/l Cyanocobalamin, 25 mg/l Biotin und 1 ,25 g/l Pyridoxin hinzugefügt. Des Weiteren wurden 140 ml einer sterilfiltrierten 50%igen Glukoselösung und 50 g trockenautoklaviertes CaC03 hinzugefügt. Daraufhin kamen noch 5 ml einer 400 mM sterilfiltierten Threonin-Stammlösung hinzu und das Medium wurde anschließend auf einen Liter aufgefüllt.
Nach der Kultivierung wurde jeweils vom Überstand von vier parallelen Kulturen eine HPLC- Analyse zur Bestimmung des Glutamatgehaltes mit einer Nachweisgrenze von >0,01 g/l durchgeführt.
Der Typstamm von C. humireducens produzierte nach 48 h Kultivierung in
Schüttelkolbenmedium bei 37°C, 200 rpm im Schüttelkolbenmaßstab 1 ,8 (+/-0.6) g/l L- Glutamat. Die Ausgangskonzentration an L- Glutamat im Medium lag bei 0,78 (+/-0,1 ) g/l.
Beispiel 4: AEC-Screening
Zehn Einzelklone des wildtypischen Stammes C. humireducens (DSM 45392) wurden in jeweils 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H20) in
Schüttelkolben über Nacht bei 37°C mit 200 rpm kultiviert. Anschließend wurden jeweils 100 μΙ der Übernachtkultur auf Minimalmedium-Agarplatten mit 25 mM S-2-Aminoethyl-L- Cystein (AEC) (MW=164 g/mol) ausplattiert und drei Tage lang bei 37°C inkubiert. Zur Herstellung des Minimalmediums wurden 5 g (NH4)2S04, 5 g Harnstoff, 2 g KH2P04, 2 g K2HP04, 10 g MOPS in 750 ml H20 gelöst, der pH-Wert wurde mit 1 M KOH auf 7,6 eingestellt und autoklaviert. Die restlichen Bestandteile wurden getrennt angesetzt und steril filtriert. Dabei wurden 20 ml 50% (w/v) Glukose, 1 ml 1 % (w/v) CaCI2, 1 ml 1 M MgS04, 1 ml 0,02% Biotin und 1 ml Spurenelementlösung (1 g FeS04 x 7 H20, 1 g MnS04 7 x H20, 0,1 g ZnS04 x 7 H20, 0,021 g CuS04 x 5 H20, 0,002 g NiCI2 x 6 H20 auf 100 ml H20) dem Medium hinzugefügt und anschließend mit sterilem H20 auf 1000 ml aufgefüllt. Für die Kultivierung auf Festmediumplatten wurde dem Medium 15 g/l Agar-Agar (Merck) zugesetzt. Sichtbare Einzelkolonien wurden erneut auf frische Minimalmedium-Agarplatten mit 25 mM AEC und 12,5 mM Threonin als fraktionierter Ausstrich ausplattiert und drei Tage bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden jeweils 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H20) im Schüttelkolben mit einem Einzelklon inokuliert und über Nacht bei 37°C mit 200 rpm schüttelnd inkubiert, anschließend mit 10% Glycerin versetzt und bei -80°C als Rückstellmuster gelagert. Sequenzanalyse des /ysC-Sequenz Bereiches
Zur Analyse der /ysC-Sequenz Bereiche der isolierten Einzelklone, wurde der entsprechende Genbereich von lysC mittels Primern (lysC_for: 5'AGACGAAAGGCGGCCTACAC3' und lysC_rev: 5TCCAGGATCGAGCGCATCAC3') und PCR-Technik amplifiziert. Die erhaltenen DNA-Sequenzen wurden mit Hilfe der Software Clone Manager analysiert. Durch die
Analyse der /ysC-Sequenz der isolierten AEC + Threonin resistenten C. humireducens Klone wurden folgende Punktmutationen identifiziert:
Tab. 2: Identifizierte Veränderungen im /ysC-Gen von AEC + Threonin resistenten
C. humireducens Klonen und dadurch verursachte Aminosäureaustausche.
Figure imgf000045_0001
Beispiel 5: L-Lysin-Leistungstest
Der Typstamm C. humireducens und die isolierten Einzelklone aus dem
AEC + Threonin Screening wurden in Schüttelkolben kultiviert und einem Leistungstest bezüglich ihrer Lysinsynthese im Schüttelkolbenmaßstab unterzogen. Hierzu wurde der C. humireducens Stamm und die isolierten AEC + Threonin resistenten C. humireducens Klone in 10 ml BHI-Flüssigmedium (Brain-Heart-Infusion; Merck) (37 g/l H20) als Vorkultur bei 37°C mit 200 rpm 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Schüttelkolbenmedium auf eine OD66o on 0,2 inokuliert und bei 37°C mit 200 rpm, 48 h lang kultiviert. Zur
Herstellung dieses Mediums wurden 7,5 g Cornsteep Liquor (50%), 20 g
Morpholinopropansulfonsäure (MOPS), 25 g (NH4)2S04, 0,1 g KH2P04, 1 g MgS04 *7H20, 0,01 g CaCI2 *2H20, 0,01 g FeS04 *7H20, 0,005 g MnS04 *H20 in 750 ml H20 gelöst, der pH- Wert wurde mit Ammoniakwasser auf 7,0 eingestellt und autoklaviert. Anschließend wurden 25 g trocken autoklaviertes CaC03 hinzugefügt. Die restlichen Bestandteile wurden getrennt angesetzt und steril filtriert. Dabei wurden 90 ml 50% (w/v) Glukose und 10 ml einer Lösung von 30 mg/l Thiamin und 20 mg/l Biotin dem Medium hinzugefügt und anschließend mit sterilem H20 auf 1000 ml aufgefüllt.
Nach der Kultivierung wurde jeweils vom Überstand zwei paralleler Kulturen eine HPLC- Analyse zur Bestimmung der L-Lysingehalte mit einer Nachweisgrenze von >0,01 g/l durchgeführt. Die Lysin-Endtiter und Ausbeuten der Kultivierungen sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
Tab. 3: Mittelwerte und Standardabweichung der Lysin-Endtiter von zwei parallelen Kulturen mit AEC + Threonin resistenten C. humireducens Klonen nach 48 h Kultivierung in
Schüttelkolbenmedium bei 37°C, 200 rpm.
Lysin (g/l)
Mittelwert Stabw.
Typstamm C. humireducens 0, 13 0,01
C. humireducens AEC Thr r#1 1 ,33 0,08
C. humireducens AEC Thr r#2 1 ,33 0,08
C. humireducens AEC Thr r#3 1 ,25 0,01
C. humireducens AEC Thr r#4 1 ,29 0,01
C. humireducens AEC Thr r#5 1 ,24 0,09
C. humireducens AEC Thr r#6 0,85 0,04
C. humireducens AEC Thr r#7 1 , 12 0,00
C. humireducens AEC Thr r#9 1 , 18 0,02
C. humireducens AEC Thr r#10 1 ,34 0,03

Claims

Patentansprüche
Alanin-Dehydrogenase, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenzidentität von mindestens 85 % zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 72 aufweist.
Polynukleotid, das für eine Alanin-Dehydrogenase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
a) Polynukleotide, die für eine Alanin-Dehydrogenase gemäß Anspruch 3 kodieren; b) Polynukleotide, die eine Sequenzidentität von mindestens 75 % zu der Sequenz von Position 301 bis 1365 gemäß SEQ ID NO: 71 aufweisen;
c) Polynukleotide, die zu Polynukleotiden gemäß (a) oder (b) komplementär sind.
Enzyme des hut-Clusters, ausgewählt aus
a) einer Urocanat-Hydratase (hutU), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 192 aufweist;
b) einer Imidazolon-Propionase (hutl), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 194 aufweist;
c) einer Histidin-Ammonialyase (hutH), dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 196 aufweist; und
d) einer Formididoylglutamase, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine
Sequenzidentität von mindestens 85 oder 90 %, vorzugsweise mindestens 92, 94, 96 oder 98 %, vor allem 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 198 aufweist.
Polynukleotide, die für Enzyme des hut-Clusters kodieren, ausgewählt aus
a) Polynukleotid, das für eine Uroconat-Hydratase (hutU) gemäß Anspruch 5(a) kodiert und vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von
mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1983 gemäß SEQ ID NO: 191 aufweist; b) Polynukleotid, das für eine Imidazolon-Propionase (hutl) gemäß Anspruch 5(b) kodiert und vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1509 gemäß SEQ ID NO: 193 aufweist;
c) Polynukleotid, das für eine Histidin-Ammonialyase (hutH) gemäß Anspruch 5(c) kodiert und vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1851 gemäß SEQ ID NO: 195 aufweist; und
d) Polynukleotid, das für eine Formididoylglutamase (hutG) gemäß Anspruch 5(d) kodiert und vorzugsweise eine Sequenzidentität von mindestens 70 oder 75 %, vorzugsweise von mindestens 80 oder 85 %, besonders bevorzugt von mindestens 90 oder 95 %, vor allem von 100 %, zu der Sequenz von Position 301 bis 1209 gemäß SEQ ID NO: 197 aufweist.
e) Polynukleotide, die zu den Polynukleotiden gemäß (a) bis (d) komplementär sind.
5. Rekombinanter Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens eine Alanin-Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 und/oder mindestens ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2 enthält.
6. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Mikroorganismus die Alanin-Dehydrogenase gemäß Anspruch 1 und/oder das Polynukleotid gemäß Anspruch 2 in überexprimierter Form vorliegt.
7. Rekombinanter Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein Enzym, vorzugsweise alle Enzyme, des hut-Clusters gemäß Anspruch 3 und/oder mindestens ein Polynukleotid, vorzugsweise für alle Enzyme des hut-Clusters kodierende Polynukleotide, gemäß Anspruch 4 enthält.
8. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Enzym, vorzugsweise alle Enzyme, des hut-Clusters gemäß Anspruch 3 und/oder das mindestens eine Polynukleotid, vorzugsweise alle für Enzyme des hut-Clusters kodierende Polynukleotide gemäß Anspruch 4 in überexprimierter Form vorliegen.
9. Rekombinanter Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch
gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um ein Corynebacterium, vorzugsweise der Art C. humireducens oder C. glutamicum, handelt.
10. Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure in einem Mikroorganismus,
dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 oder 3 und/oder ein Polynukleotid gemäß Anspruch 2 oder 4 und/oder ein rekombinanter Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 5 bis 9 eingesetzt wird.
1 1 . Verfahren zur Überproduktion einer L-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, dass in diesem Verfahren ein alkaliphiles Bakterium eingesetzt wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem
alkaliphilen Bakterium um ein alkaliphiles coryneformes Bakterium, insbesondere um eine alkaliphiles Corynebacterium, vorzugsweise um C. humireducens, handelt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die überproduzierte L-Aminosäure ausgewählt ist aus L-Alanin, L-Valin, L-Aminosäuren der Glutamat-Familie, insbesondere L-Glutamat, L-Glutamin, L-Prolin und L-Arginin, sowie L-Aminosäuren der Aspartat-Familie, insbesondere L-Aspartat, L-Asparagin, L- Methionin, L-Lysin, L-Isoleucin und L-Threonin.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die überproduzierte L- Aminosäure ausgewählt ist aus L-Alanin, L-Valin, L-Glutaminsäure und L-Lysin.
15. Enzyme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) eine Threonindehydratase (NvA, EC 4.3.1 .19) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 106 sowie für diese kodierende Polynukleotide, b) die Untereinheit einer Acetolactat-Synthase (NvB), die eine Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 98, aufweist, sowie für diese kodierende Polynukleotide, c) eine Isomeroreduktase (llvC, EC 1 .1 .1.86) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 100 sowie für diese kodierende Polynukleotide, d) eine Dihydroxy-acid Dehydratase (NvD, EC 4.2.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO:
102 sowie für diese kodierende Polynukleotide, e) eine Transaminase (NvE, EC 2.6.1 .42) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 104 sowie für diese kodierende Polynukleotide, f) eine Acetolactat-Synthase (llvH, EC 2.2.1 .6) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 122 sowie für diese kodierende Polynukleotide, g) eine Threonin-Synthase (ThrC, EC 4.2.3.1 ) mit einer Sequenzidentität von
mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 108 sowie für diese kodierende Polynukleotide, h) eine gegebenenfalls feedback-resistente Isopropylmalat-Synthase (LeuA, EC
2.3.3.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 10 sowie für diese kodierende Polynukleotide, i) eine Isopropylmalat-Dehydrogenase (LeuB, EC 1.1.1.85) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID
NO: 1 12 sowie für diese kodierende Polynukleotide, j) die Untereinheiten einer Isopropylmalat-Isomerase (LeuCD, EC 4.2.1.33), die Sequenzidentitäten von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu den
Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 14 bzw. SEQ ID NO: 1 16 aufweisen sowie für diese kodierende Polynukleotide, k) eine 3-Methyl-2-Oxobutanoat-Hydroxymethyltransferase (PanB, EC 2.1.2.1 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 18 sowie für diese kodierende Polynukleotide, I) eine Pantothenat-Synthase (PanC, EC 6.3.2.1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 120 sowie für diese kodierende Polynukleotide, m) eine Glutamat-Dehydrogenase (Gdh) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 124 sowie für diese kodierende Polynukleotide, n) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 126 sowie für diese kodierende Polynukleotide, o) eine Glutamin-Synthetase (Glutamin-Synthetase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 128 sowie für diese kodierende Polynukleotide, p) eine Glutamat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 130 sowie für diese kodierende Polynukleotide, q) eine Isocitrat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 132 sowie für diese kodierende Polynukleotide, r) eine Aconitat-Hydrase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 134 sowie für diese kodierende Polynukleotide, s) eine Citrat-Synthase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 136 sowie für diese kodierende Polynukleotide, t) eine Aminopeptidase C (PepC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 138 sowie für diese kodierende Polynukleotide, u) eine Pyruvat-Dehydrogenase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 140 sowie für diese kodierende Polynukleotide, v) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 142 sowie für diese kodierende Polynukleotide, w) eine Pyruvat-Kinase (Pyruvat-Kinase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 144 sowie für diese kodierende Polynukleotide, x) eine Enolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 146 sowie für diese kodierende Polynukleotide, y) eine 2,3-Bisphosphoglycerat-abhängige Phosphoglycerat-Mutase (GpmA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 148 sowie für diese kodierende Polynukleotide, z) eine Phosphoglycerat-Kinase (Pgk) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 150 sowie für diese kodierende Polynukleotide, aa) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat- Dehydrogenase 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %,
vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 152 sowie für diese kodierende Polynukleotide, bb) eine Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Glycerin-3-phosphat- Dehydrogenase 2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %,
vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 154 sowie für diese kodierende Polynukleotide, cc) eine Triosephosphat-Isomerase (TpiA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 156 sowie für diese kodierende Polynukleotide, dd) eine Fructosebisphosphataldolase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 158 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ee) eine 1 -Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 160 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ff) eine 6-Phosphofructokinase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 162 sowie für diese kodierende Polynukleotide, gg) abgeschwächte Polynukleotide (sucCD), die für die Untereinheiten einer Succinyl- CoA-Ligase (SucCD, EC 6.2.1.5) kodieren, hh) eine DNA-Bindungsdomäne vom Typ HTH tetR (McbR) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ii) eine Homoserinkinase (ThrB, EC 2.7.1 .39) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 sowie für diese kodierende Polynukleotide, jj) eine Glucose-6-phosphat-lsomerase (Pgi, EC 5.3.1.9) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6 sowie für diese kodierende Polynukleotide, kk) eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (Pck, EC 4.1.1 .32) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
II) ein D-Methionin bindendes Lipoprotein (MetQ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 10 sowie für dieses kodierende Polynukleotide, mm) ein Methionin-Transporter (MetP) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 sowie für diesen kodierende Polynukleotide, nn) ein ATP-abhängiger Methionin-Transporter (MetN) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 14 sowie für diesen kodierende Polynukleotide, oo) eine S-Adenosylmethionin-Synthase (MetK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 16 sowie für diese kodierende Polynukleotide, pp) eine Methionin-Importsystem-Permease (Metl) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 18 sowie für diese kodierende Polynukleotide, qq) eine 4-Hydroxy-Tetrahydrodipicolinat-Synthase (DapA, EC 4.3.3.7) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 sowie für diese kodierende Polynukleotide, rr) eine Cystein-Synthase (CBS, CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 22 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ss) eine Carboxylat-Amin-Ligase mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 24 sowie für diese kodierende Polynukleotide, tt) eine Cystathionin-Betalyase (AecD) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 26 sowie für diese kodierende Polynukleotide, uu) eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase (Asd, EC 1 .2.1 .1 1 ) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 28 sowie für diese kodierende Polynukleotide, vv) ein überexprimiertes Polynukleotid (metH), das für eine 5-Methyltetrahydrofolat- Homocysteinmethyltransferase (MetH, EC 2.1.1 .13) kodiert, ww) die kleinere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 30 sowie für diese kodierende Polynukleotide, xx) die größere Untereinheit eines Transporters für verzweigt-kettige Aminosäuren (BrnF) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 32 sowie für diese kodierende Polynukleotide, yy) eine Serin-Acetyltransferase (CysE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 34 sowie für diese kodierende Polynukleotide, zz) eine Cystein-Synthase (CysK) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 36 sowie für diese kodierende Polynukleotide, aaa) das H-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvH) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 38 sowie für dieses kodierende Polynukleotide, bbb) das P-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvP) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 40 sowie für dieses kodierende Polynukleotide, ccc) das T-Protein eines Glycin spaltenden Systems (GcvT) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 42 sowie für dieses kodierende Polynukleotide, ddd) eine Serin-Hydroxymethyltransferase (GlyA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 44 sowie für diese kodierende Polynukleotide, eee) eine gegebenenfalls feedback-resistente Homoserin-Dehydrogenase (Horn, EC 1 .2.1.1 1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 46 sowie für diese kodierende Polynukleotide, fff) eine Lipoyl-Synthase (LipA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 48 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ggg) eine Lipoyl-Transferase (LipB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 50 sowie für diese kodierende Polynukleotide, hhh) eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (Lpd) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 52 sowie für diese kodierende Polynukleotide, iii) eine Lipoat-Protein-Ligase (LplA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 94 sowie für diese kodierende Polynukleotide, jjj) eine Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (GcvL) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 96 sowie für diese kodierende Polynukleotide, kkk) eine feedbackresistente Aspartat-Kinase (LysC, EC 2.7.2.4) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 54 sowie für diese kodierende Polynukleotide, III) eine Cystathionin-gamma-Synthase (MetB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 56 sowie für diese kodierende Polynukleotide, mmm) eine 5,10-Methylentetrahydrofolat-Reduktase (MetF) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 58 sowie für diese kodierende Polynukleotide, nnn) eine Homoserin-O-Acetyltransferase (MetX) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 60 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ooo) eine O-Acetylhomoserin-Lyase (MetY) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 62 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ppp) eine feedbackresistente Pyruvat-Carboxylase (Pye, EC 6.4.1.1 ) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 64 sowie für diese kodierende Polynukleotide, qqq) eine gegebenenfalls feedback-resistente D-3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase
(SerA) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 66 sowie für diese kodierende Polynukleotide, rrr) eine Phosphoserin-Phosphatase (SerB) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 68 sowie für diese kodierende Polynukleotide, sss) eine Phosphoserin-Aminotransferase (SerC) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 70 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ttt) die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysD) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 74 sowie für diese kodierende Polynukleotide, uuu) eine Adenosin-Phosphosulfat-Reduktase (CysH) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 76 sowie für diese kodierende Polynukleotide, vvv) eine Sulfit-Reduktase (Cysl) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 78 sowie für diese kodierende Polynukleotide, www) eine NADPH-abhängige Glutamatsynthase-beta-Kette (CysJ) mit einer
Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 80 sowie für diese kodierende Polynukleotide, xxx) die Untereinheit einer Sulfat-Adenylyltransferase (CysN) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 82 sowie für diese kodierende Polynukleotide, yyy) eine Cystathionin-beta-Synthase (CysY) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 84, sowie für diese kodierende Polynukleotide, zzz) ein Sulfat-Transporter (CysZ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 86 sowie für diesen kodierende Polynukleotide, aaaa) eine 5-Methyltetrahydropteroyl-triglutamat-homocystein-Methyltransferase (MetE) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 88 sowie für diese kodierende Polynukleotide, bbbb) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 1 (PtH1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 90 sowie für diese kodierende Polynukleotide, cccc) eine Peptidyl-tRNA-Hydrolase 2 (PtH2) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 92, sowie für diese kodierende Polynukleotide, dddd) ein überexprimiertes Polynukleotid (ddh), das für eine Diaminopimelat- Dehydrogenase (Ddh, EC 1.4.1 .16) kodiert, eeee) eine Diaminopimelat-Decarboxylase (LysA, EC 4.1.1 .20) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 164 sowie für diese kodierende Polynukleotide, ffff) eine Aspartat-Aminotransferase (AaT, EC 2.6.1.1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 166, sowie für diese kodierende Polynukleotide, gggg) ein L-Lysin-Exporter (LysE, Lysin-Efflux-Permease) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 168, sowie für diesen kodierende Polynukleotide, hhhh) ein überexprimiertes Polynukleotid (dapF), das für eine Diaminopimelat-Epimerase (DapF, EC 5.1 .1 .7) kodiert, iiii) eine Dihydropicolinat-Reduktase (DapB, EC 1.3.1 .26) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 170 sowie für diese kodierende Polynukleotide, jjjj) eine Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (EC 1.1.1 .49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 172 sowie für diese kodierende Polynukleotide, kkkk) die Zwf-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (Zwf, EC 1 .1 .1 .49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 186 sowie für diese kodierende Polynukleotide,
IIII) die OpcA-Untereinheit einer Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (OpcA, EC
1 .1 .1.49) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 188 sowie für diese kodierende Polynukleotide, mmmm) eine Phosphogluconsäure-Dehydrogenase (Gnd, EC 1.1 .1 .44) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 174 sowie für diese kodierende Polynukleotide, nnnn) eine Malat-Chinon-Oxidoreduktase (Mqo, EC 1 .1 .99.16) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 176 sowie für diese kodierende Polynukleotide, oooo) die El p-Untereinheit eines Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (AceE, EC 1.2.4.1 ) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 178 sowie für diese kodierende Polynukleotide, pppp) eine Citrat-Synthase (GltA, EC 4.1 .3.7) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 180 sowie für diese kodierende Polynukleotide, qqqq) eine Malat-Dehydrogenase (Mdh, EC 1.1 .1 .37) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 182 sowie für diese kodierende Polynukleotide, rrrr) eine UDP-N-acetylmuramoylalanyl-D-glutamat-2,6-diaminopimelat-Ligase (MurE, EC 6.3.2.13) mit einer Sequenzidentität von mindestens 90, 95 oder 98 %, vorzugsweise 100 %, zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 184, sowie für diese kodierende Polynukleotide.
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