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WO2015133547A1 - γ－グルタミルバリン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法 - Google Patents

γ－グルタミルバリン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法 Download PDF

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Publication number
WO2015133547A1
WO2015133547A1 PCT/JP2015/056425 JP2015056425W WO2015133547A1 WO 2015133547 A1 WO2015133547 A1 WO 2015133547A1 JP 2015056425 W JP2015056425 W JP 2015056425W WO 2015133547 A1 WO2015133547 A1 WO 2015133547A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
glu
val
protein
amino acid
synthase
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/056425
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
ちひろ 辻
博之 野崎
Original Assignee
味の素株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 味の素株式会社 filed Critical 味の素株式会社
Priority to EP15758161.2A priority Critical patent/EP3115463B1/en
Priority to JP2016506540A priority patent/JP6690529B2/ja
Publication of WO2015133547A1 publication Critical patent/WO2015133547A1/ja
Priority to US15/234,119 priority patent/US10508295B2/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y603/00—Ligases forming carbon-nitrogen bonds (6.3)
    • C12Y603/02—Acid—amino-acid ligases (peptide synthases)(6.3.2)
    • C12Y603/02002—Glutamate-cysteine ligase (6.3.2.2)

Definitions

  • the present invention relates to ⁇ -glutamylvaline synthase ( ⁇ -Glu-Val synthase) and a method for producing ⁇ -glutamylvalylglycine using the same.
  • ⁇ -Glutamylvalylglycine is useful in fields such as foods and pharmaceuticals.
  • Certain peptides such as ⁇ -glutamyl-L-valyl-glycine (hereinafter also referred to as “ ⁇ -Glu-Val-Gly”), have a calcium receptor activating effect.
  • Patent Document 1 a peptide having a calcium receptor activating effect can impart a rich taste to foods and drinks (Patent Document 2), and can improve the taste of low-fat foods, particularly fat-like richness and smoothness (Patent Document) 3) and it is known that the body feeling of sweet substances can be improved and the bitterness peculiar to sweet substances can be improved (Patent Document 4).
  • the peptide as described above has a preventive or therapeutic effect for diarrhea (Patent Document 5), diabetes (Patent Document 6), and a gastrointestinal bicarbonate secretion promoting effect (Patent Document 7). Yes.
  • chemical synthesis and enzymatic methods are known as methods for producing ⁇ -glutamyl tripeptide.
  • a chemical synthesis method a method of selectively obtaining ⁇ -glutamyl tripeptide from a dipeptide using N-protected glutamic anhydride is known (Patent Document 8).
  • a method using glutamic acid-cysteine ligase (GSHA) and glutathione synthetase (GSHB) is known (Patent Documents 9 and 10).
  • GSHA glutamic acid-cysteine ligase
  • GSHB glutathione synthetase
  • a method is also known in which Val-Gly is converted to ⁇ -glutamyl using ⁇ -glutamyltransferase to produce ⁇ -Glu-Val-Gly (Patent Document 11).
  • Glutamate-cysteine ligase is known as an enzyme (EC 6.3.2.2) that has the activity of catalyzing the reaction to produce ⁇ -Glu-Cys, ADP, and phosphate using Glu, Cys, and ATP as substrates. .
  • GSHA usually requires divalent metal ions such as Mg 2+ and Mn 2+ for enzymatic reactions.
  • Vmax / Km the ratio of ⁇ -Glu-Val production activity to ⁇ -Glu-Gly production activity when Mg 2+ is used as a cofactor can be calculated as 0.15.
  • Mn 2+ is used as a cofactor
  • Km 1.7 mM
  • Non-patent Document 2 when Glu, various amino acids, and ATP are used as a substrate in the presence of Mg 2+ and ⁇ -Glu-Gly production activity is 100%, ⁇ -Glu-Val production activity is 52 It is reported to be about%.
  • the ratio of the ⁇ -Glu-Val production activity to the ⁇ -Glu-Gly production activity can be calculated as 0.52.
  • the ratio of the ⁇ -Glu-Val production activity to the ⁇ -Glu-Gly production activity of GSHA in Escherichia coli is about 0.15 to 0.5.
  • GSHA derived from Proteus mirabilis a gram-negative bacterium, produces ⁇ -glutamyldipeptide using Mg 2+ or Mn 2+ as cofactors, Glu, various amino acids, and ATP as substrates. It is known to do (Non-patent Document 3).
  • ⁇ -Glu-Gly production activity is reported to be 14.5% and ⁇ -Glu-Val production activity is 7.2% when ⁇ -Glu-Cys production activity is taken as 100%. ing. That is, if a comparison is made based on these relative activities, the ratio of the ⁇ -Glu-Val production activity to the ⁇ -Glu-Gly production activity can be calculated as 0.50.
  • ⁇ -glutamylcysteine synthetase-glutatione synthetase derived from Streptococcus agalactiae produces ⁇ -glutamyldipeptide using Glu, various amino acids and ATP as a substrate in the presence of Mg 2+ It is known to do.
  • ⁇ -GCS-GS derived from Streptococcus agalactia
  • the ⁇ -Glu-Val production activity is about 21% when the ⁇ -Glu-Gly production activity is 100% (Non-patent Document 2). That is, if a comparison is made based on these relative activities, the ratio of the ⁇ -Glu-Val production activity to the ⁇ -Glu-Gly production activity can be calculated as 0.21.
  • Non-patent document 5 it is reported that ⁇ -Glu-Glu, ⁇ -Glu-Val, and ⁇ -Glu-Leu were isolated by applying a culture solution of Micrococcus glutamicus to various columns and separating peptides and the like. However, the biosynthetic pathway of these ⁇ -glutamyl dipeptides has not been reported.
  • Glutamate-cysteine ligase plays a role in generating ⁇ -Glu-Cys which is a precursor of glutathione in vivo.
  • GSHA can use various amino acids other than Cys as a substrate, but generally has a relatively low activity using Val, which is one of branched chain amino acids, as a substrate, compared to Cys. Therefore, when ⁇ -Glu-Val-Gly is produced from Glu, Val, and Gly using GSHA and glutathione synthase (GSHB), there is a problem that the yield of ⁇ -Glu-Val-Gly is low.
  • the present invention provides a protein having a ⁇ -Glu-Val producing activity suitable for producing ⁇ -Glu-Val ( ⁇ -Glu-Val synthase), and ⁇ -Glu-Val-Gly using the same. It is an object of the present invention to provide a manufacturing method for the above.
  • the present inventor has found that the ratio of ⁇ -Glu-Val production activity to ⁇ -Glu-Gly production activity is high ( ⁇ -Glu-Val production activity protein ( ⁇ -Glu-Val synthase) was found and the present invention was completed.
  • a process for producing ⁇ -Glu-Val and / or a salt thereof comprising the following step (A): (A) A step of producing ⁇ -Glu-Val by allowing the protein described in (a), (b) or (c) below to act on Glu and Val: (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22; (B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22, comprising an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and ⁇ -glutamylvaline A protein having a synthetic enzyme activity; (C) a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22 and having ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • a process for producing ⁇ -Glu-Val-Gly and / or a salt thereof comprising the following steps (A) and (B): (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val by allowing the protein described in (a), (b) or (c) below to act on Glu and Val; and (B) a step of (A) Step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by acting on ⁇ -Glu-Val and Gly produced in step: (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22; (B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22, comprising an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and ⁇ -glutamylvaline A protein having a synthetic enzyme activity; (C) a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22 and having ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly and / or a salt thereof comprising the following step (C): (C) A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by allowing the protein and glutathione synthase described in (a), (b), or (c) below to act on Glu, Val, and Gly: (A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22; (B) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22, comprising an amino acid sequence comprising substitution, deletion, insertion or addition of 1 to 10 amino acid residues, and ⁇ -glutamylvaline A protein having a synthetic enzyme activity; (C) a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22 and having ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly and / or a salt thereof comprising the following step (C): (C) A protein having a ⁇ -glutamyl valine synthase activity and a glutathione synthase having a ratio of ⁇ -glutamyl valine synthase activity to ⁇ -glutamylglycine synthase activity of 2.0 or more is added to Glu, Val, and Gly. A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by acting.
  • the protein is a purified enzyme.
  • the protein is an immobilized enzyme.
  • the protein is contained in a culture of a microorganism having the protein, a cultured microbial cell, or a processed product of the microbial cell.
  • the glutathione synthetase is contained in a culture of a microorganism having the enzyme, a cultured microbial cell, or a processed product of the microbial cell.
  • the microorganism which is Escherichia coli.
  • Ratio of ⁇ -Glu-Val synthetic activity to ⁇ -Glu-Gly synthetic activity (B) / (A) and ⁇ - to the sum of ⁇ -Glu-Gly and ⁇ -Glu-Gly-Gly 1 hour after the start of the reaction
  • amino acids are L-forms unless otherwise specified.
  • ⁇ -glutamylvaline synthase ⁇ -Glu-Val synthase
  • ⁇ -glutamylvaline synthethase ⁇ -Glu-Val synthethase
  • Glu, Val, and ATP are used as substrates and ⁇ -Glu -A protein having an activity of catalyzing the reaction of producing Val, ADP and phosphoric acid. This activity is also referred to as “ ⁇ -glutamylvaline synthase activity” or “ ⁇ -Glu-Val production (synthesis) activity”.
  • the activity of catalyzing the reaction of producing ⁇ -Glu-Gly, ADP and phosphate using Glu, Gly and ATP as substrates is referred to as “ ⁇ -glutamylglycine synthase activity”. It is also referred to as “ ⁇ -Glu-Gly production (synthesis) activity”.
  • the activity of catalyzing the reaction of producing ⁇ -Glu-Cys, ADP and phosphate using Glu, Cys and ATP as substrates is referred to as “ ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity”. Also called.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase may or may not have an activity to produce ⁇ -glutamyl dipeptide other than ⁇ -glutamyl valine as long as it has ⁇ -glutamyl valine synthase activity. Also good. That is, for example, ⁇ -glutamylvaline synthase may or may not have ⁇ -glutamylcysteine synthetase activity. For example, ⁇ -glutamyl valine synthase may or may not have ⁇ -glutamylglycine synthase activity.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase preferably has no ⁇ -glutamylglycine synthase activity.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase preferably has a high ratio of ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity) to ⁇ -glutamyl glycine synthase activity (specific activity).
  • the ratio of ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity) to ⁇ -glutamyl glycine synthase activity (specific activity) is, for example, 2.0 or more, 5.0 or more, 10 or more , 15 or more, or 20 or more.
  • the ratio of ⁇ -glutamyl valine synthase activity (specific activity) to ⁇ -glutamyl glycine synthase activity (specific activity) may be, for example, 100 or less, or 50 or less. .
  • the ratio of specific activity can be calculated by measuring ⁇ -glutamylglycine synthase activity and ⁇ -glutamylglycine synthase activity under the conditions described in Example 11. Specific activity measurement conditions are as follows. The ⁇ -glutamyl valine synthase activity of the ⁇ -glutamyl valine synthase was measured using the reaction solution (100 mmol / L Tris-HCl buffer, 10 mmol / L Glu, 10 mmol / L Val, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L magnesium sulfate, pH 9 0.0) is added with an appropriate amount of ⁇ -glutamylvaline synthase, reacted at 30 ° C.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val per minute under these conditions is defined as 1 ⁇ U ⁇ -glutamylvaline synthase activity.
  • the ⁇ -glutamylglycine synthase activity of ⁇ -glutamylvaline synthase is determined according to the reaction solution (100 mmol / L Tris-HCl buffer, 10 mmol / L Glu, 10 mmol / L Gly, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L sulfuric acid).
  • ⁇ -glutamyl valine synthase An appropriate amount of ⁇ -glutamyl valine synthase is added to magnesium (pH 9.0), the reaction is performed at 30 ° C. for 30 minutes, and the measurement can be performed based on the amount of ⁇ -Glu-Gly produced.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Gly per minute under these conditions is defined as 1 ⁇ U of ⁇ -glutamylglycine synthase activity.
  • ⁇ -glutamylvaline can be efficiently produced using Glu and Val as raw materials by using ⁇ -glutamylglycine synthase having high ⁇ -glutamylvaline synthase activity (specific activity).
  • Examples of the ⁇ -glutamyl valine synthase include ⁇ -glutamyl valine synthase of bacteria belonging to the genus Kocuria, bacteria belonging to the genus Micrococcus, and bacteria belonging to the genus Corynebacterium.
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Cochria include Kocuria rosea and Kocuria rhizophila.
  • Examples of the genus Micrococcus include Micrococcus luteus.
  • Examples of Corynebacterium bacteria include Corynebacterium glutamicum. That is, ⁇ -glutamyl valine synthase may be, for example, a protein derived from such a bacterium.
  • the amino acid sequence of ⁇ -glutamylvaline synthase of Cochlear Rosea (AJ3132) and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 6 and 3, respectively.
  • the amino acid sequence of the ⁇ -glutamyl valine synthase of Koclear lysophylla DC2201 strain (ATCC 9341) and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 10 and 7, respectively.
  • the amino acid sequence of ⁇ -glutamylvaline synthase of Micrococcus luteus NCTC2665 strain (ATCC-15307) and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 16 and 11, respectively.
  • the amino acid sequence of ⁇ -glutamylvaline synthase of Corynebacterium glutamicum K051 strain (ATCC 13032) and the base sequence of the gene encoding it are shown in SEQ ID NOs: 22 and 17, respectively. That is, the ⁇ -glutamyl valine synthase may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22, for example. The ⁇ -glutamyl valine synthase may be a protein encoded by a gene having a base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 7, 11, or 17, for example.
  • the expression “having an (amino acid or base) sequence” includes the case of “including the (amino acid or base) sequence” and the case of “consisting of the (amino acid or base) sequence”.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase is a variant of the ⁇ -glutamyl valine synthase exemplified above (for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22). It may be.
  • a gene encoding ⁇ -glutamyl valine synthase (also referred to as “ ⁇ -glutamyl valine synthase gene”) may be a ⁇ -glutamyl valine synthase gene exemplified above (for example, as long as the original function is maintained) , A gene having a base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 7, 11, or 17).
  • Such a variant in which the original function is maintained may be referred to as a “conservative variant”.
  • conservative variants include the above-exemplified ⁇ -glutamylvaline synthase, homologues of genes encoding the same, and artificially modified variants.
  • the original function is maintained means that the variant of the gene or protein has a function (activity or property) corresponding to the function (activity or property) of the original gene or protein. That is, “the original function is maintained” means that in ⁇ -glutamyl valine synthase, a protein variant has ⁇ -glutamyl valine synthase activity. “The original function is maintained” means that in the ⁇ -glutamyl valine synthase gene, the variant of the gene has a protein (ie, ⁇ -glutamyl valine synthase activity that maintains the original function). Coding).
  • homologs of ⁇ -glutamyl valine synthase include proteins obtained from public databases by BLAST search or FASTA search using the above amino acid sequence as a query sequence.
  • the homologue of the ⁇ -glutamylvaline synthase gene can be obtained, for example, by PCR using chromosomes of various microorganisms as templates and oligonucleotides prepared based on these known gene sequences as primers.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase has one or several positions in the amino acid sequence (for example, a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, 10, 16, or 22). Or a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added.
  • the above “one or several” varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, Preferably, it means 1-20, more preferably 1-10, even more preferably 1-5, particularly preferably 1-3.
  • substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids described above is a conservative mutation that maintains the protein function normally.
  • a typical conservative mutation is a conservative substitution.
  • Conservative substitution is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid. In this case, between Gln and Asn, when it is a basic amino acid, between Lys, Arg, and His, when it is an acidic amino acid, between Asp and Glu, when it is an amino acid having a hydroxyl group Is a mutation that substitutes between Ser and Thr.
  • substitutions considered as conservative substitutions include substitution from Ala to Ser or Thr, substitution from Arg to Gln, His or Lys, substitution from Asn to Glu, Gln, Lys, His or Asp, Asp to Asn, Glu or Gln, Cys to Ser or Ala, Gln to Asn, Glu, Lys, His, Asp or Arg, Glu to Gly, Asn, Gln, Lys or Asp Substitution, Gly to Pro substitution, His to Asn, Lys, Gln, Arg or Tyr substitution, Ile to Leu, Met, Val or Phe substitution, Leu to Ile, Met, Val or Phe substitution, Substitution from Lys to Asn, Glu, Gln, His or Arg, substitution from Met to Ile, Leu, Val or Phe, substitution from Phe to Trp, Tyr, Met, Ile or Leu, Ser to Thr or Ala Substitution, substitution from Trp to Phe or Tyr, substitution
  • ⁇ -glutamyl valine synthase is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97%, based on the entire amino acid sequence as long as the original function is maintained.
  • a protein having an amino acid sequence having a homology of 99% or more is particularly preferable.
  • “homology” may refer to “identity”.
  • ⁇ -glutamylvaline synthase is a probe that can be prepared from the above base sequence (for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, 7, 11, or 17), for example, the above base, as long as the original function is maintained. It may be a protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary sequence to all or part of the sequence. Such a probe can be prepared, for example, by PCR using an oligonucleotide prepared based on the base sequence as a primer and a DNA fragment containing the base sequence as a template. “Stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • highly homologous DNAs for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, further preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more.
  • are hybridized and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or normal Southern hybridization washing conditions of 60 ° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, preferably 60 ° C., 0.1 ⁇ SSC And 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, conditions of washing once, preferably 2 to 3 times.
  • hybridization washing conditions include 50 ° C., 2 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase is a ⁇ -glutamyl valine synthase as described above except that the amino acid sequence or the base sequence of the gene encoding it is known at the time of filing of the present invention. Also good.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase may be a fusion protein with another peptide.
  • the “other peptide” is not particularly limited as long as ⁇ -glutamyl valine synthase has ⁇ -glutamyl valine synthase activity.
  • “Other peptides” can be appropriately selected depending on various conditions such as the purpose of use. Examples of “other peptides” include peptide tags, signal peptides, and protease recognition sequences. “Other peptides” may be linked to, for example, the N-terminus or C-terminus of ⁇ -glutamylvaline synthase, or both. As the “other peptide”, one type of peptide may be used, or two or more types of peptides may be used in combination.
  • Specific peptide tags include His tags, FLAG tags, GST tags, Myc tags, MBP (maltose binding protein), CBP (cellulose binding protein), TRX (Thioredoxin), GFP (green fluorescent protein), HRP (horseradish) peroxidase), ALP (Alkaline Phosphatase), and antibody Fc region.
  • His tag is a 6xHis tag.
  • the peptide tag can be used, for example, for detection and purification of the expressed ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • the signal peptide is not particularly limited as long as it functions in a host that expresses ⁇ -glutamylvaline synthase.
  • Examples of the signal peptide include a signal peptide recognized by the Sec-type secretory pathway and a signal peptide recognized by the Tat-type secretory pathway.
  • Specific examples of signal peptides recognized by the Tat secretion pathway include the TorA signal sequence of E. coli, the SufI signal sequence of E. coli, the PhoD signal sequence of Bacillus subtilis, the LipA signal sequence of Bacillus subtilis, and Arthrobacter globiformis.
  • An IMD signal sequence is mentioned (WO2013 / 118544).
  • protease recognition sequence examples include Factor Xa protease recognition sequence and proTEV protease recognition sequence.
  • the protease recognition sequence can be used, for example, to cleave the expressed ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase when ⁇ -glutamyl valine synthase is expressed as a fusion protein with a peptide tag, the ⁇ -glutamyl valine synthase is expressed by introducing a protease recognition sequence into the junction between the ⁇ -glutamyl valine synthase and the peptide tag.
  • a protease recognition sequence By cleaving the peptide tag from ⁇ -glutamyl valine synthase using a protease, ⁇ -glutamyl valine synthase without the peptide tag can be obtained.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be one obtained by substituting an arbitrary codon with an equivalent codon in the base sequence of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene exemplified above or a conservative variant thereof.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be modified to have an optimal codon depending on the codon usage frequency of the host to be used. Specifically, for example, when the start codon is other than ATG, the start codon can be changed to ATG.
  • the term “gene” is not limited to DNA as long as it encodes a target protein, and may include any polynucleotide. That is, “ ⁇ -glutamyl valine synthase gene” may mean any polynucleotide encoding ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be DNA, RNA, or a combination thereof.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be single-stranded or double-stranded.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be single-stranded DNA or single-stranded RNA.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be double-stranded DNA, double-stranded RNA, or a hybrid strand composed of a DNA strand and an RNA strand.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may contain both DNA and RNA residues in a single polynucleotide chain.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene contains RNA, the above description of DNA such as the base sequence may be read as appropriate according to the RNA.
  • the mode of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be appropriately selected according to various conditions such as the mode of use.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase can be produced by expressing a ⁇ -glutamyl valine synthase gene in a host having a ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • a host having a ⁇ -glutamyl valine synthase gene is also referred to as a host having ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase can also be produced by expressing a ⁇ -glutamyl valine synthase gene in a cell-free protein synthesis system.
  • a host having a ⁇ -glutamyl valine synthase gene may originally have a ⁇ -glutamyl valine synthase gene or may be modified to have a ⁇ -glutamyl valine synthase gene. Good.
  • Hosts that inherently have ⁇ -glutamyl valine synthase genes include bacteria from which each of the above ⁇ -glutamyl valine synthases is derived, for example, cochlear rosea (AJ3132), cochlear lysophila DC2201 strain (ATCC 9341) And Micrococcus luteus NCTC2665 strain (ATCC-15307) and Corynebacterium glutamicum K051 strain (ATCC-13032).
  • Examples of hosts modified to have a ⁇ -glutamyl valine synthase gene include hosts into which a ⁇ -glutamyl valine synthase gene has been introduced.
  • the host into which the ⁇ -glutamyl valine synthase gene is introduced is not particularly limited as long as it can express a functional ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • the host include bacteria, actinomycetes, yeast, fungi, plant cells, insect cells, and animal cells.
  • Preferred hosts include microorganisms such as bacteria and yeast. More preferred hosts include bacteria.
  • bacteria include gram negative bacteria and gram positive bacteria.
  • Gram-negative bacteria include bacteria belonging to the family Enterobacteriaceae such as Escherichia bacteria, Enterobacter bacteria, Pantoea bacteria and the like.
  • Gram-positive bacteria include coryneform bacteria such as Bacillus bacteria and Corynebacterium bacteria. Among them, Escherichia coli can be preferably used as the host.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be obtained by cloning from an organism having the ⁇ -glutamyl valine synthase gene. For cloning, nucleic acids such as genomic DNA and cDNA containing the same gene can be used. The ⁇ -glutamyl valine synthase gene can also be obtained by chemical synthesis (Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • the obtained ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be appropriately modified to obtain a variant thereof.
  • the gene can be modified by a known method.
  • a target mutation can be introduced into a target site of DNA by site-specific mutagenesis. That is, for example, the coding region of a gene can be modified by site-directed mutagenesis so that an amino acid residue at a specific site of the encoded protein includes substitution, deletion, insertion or addition.
  • site-directed mutagenesis a method using PCR (Higuchi, R., 61, in PCR technology, rlErlich, H. A. Eds., Stockton press (1989); Carter, P., ethMeth.
  • the method for introducing the ⁇ -glutamyl valine synthase gene into the host is not particularly limited.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be retained so that it can be expressed under the control of a promoter that functions in the host.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be present on a vector autonomously replicating outside the chromosome, such as a plasmid, or may be introduced on the chromosome.
  • the host may have only one copy of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene, or may have two or more copies.
  • the host may have only one type of ⁇ -glutamyl valine synthase gene or may have two or more types of ⁇ -glutamyl valine synthase genes.
  • the promoter for expressing the ⁇ -glutamyl valine synthase gene is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the “promoter that functions in the host” refers to a promoter having promoter activity in the host.
  • the promoter may be a host-derived promoter or a heterologous promoter.
  • the promoter may be a native promoter of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene or a promoter of another gene.
  • the promoter may be a stronger promoter than the intrinsic promoter of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • strong promoters that function in Enterobacteriaceae bacteria such as Escherichia coli include, for example, T7 promoter, trp promoter, trc promoter, lac promoter, tac promoter, tet promoter, araBAD promoter, rpoH promoter, PR promoter, and PL promoter is mentioned.
  • a strong promoter that functions in coryneform bacteria artificially redesigned P54-6 promoter (Appl. Microbiol.
  • the activity of the promoter can be increased by bringing the ⁇ 35 and ⁇ 10 regions in the promoter region closer to the consensus sequence (WO 00/18935).
  • the highly active promoter include various tac-like promoters (Katashkina JI et al. Russian Patent application 2006134574) and pnlp8 promoter (WO2010 / 027045). Methods for evaluating promoter strength and examples of strong promoters are described in Goldstein et al. (Prokaryotickpromoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev.,. 1, 105-128 (1995)).
  • a terminator for termination of transcription can be arranged downstream of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in the host.
  • the terminator may be a host-derived terminator or a heterologous terminator.
  • the terminator may be a specific terminator of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene, or may be a terminator of another gene. Specific examples of the terminator include T7 terminator, T4 terminator, fd phage terminator, tet terminator, and trpA terminator.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be introduced into a host using a vector containing the gene, for example.
  • a vector containing a ⁇ -glutamyl valine synthase gene is also referred to as an expression vector or a recombinant vector of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • An expression vector for the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be constructed by, for example, ligating a DNA fragment containing the ⁇ -glutamyl valine synthase gene with a vector that functions in the host.
  • a transformant introduced with the vector By transforming the host with an expression vector of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene, a transformant introduced with the vector can be obtained, that is, the gene can be introduced into the host.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell can be used.
  • the vector is preferably a multicopy vector.
  • the vector preferably has a marker such as an antibiotic resistance gene in order to select a transformant.
  • the vector may be equipped with a promoter or terminator for expressing the inserted gene.
  • the vector may be, for example, a vector derived from a bacterial plasmid, a vector derived from a yeast plasmid, a vector derived from a bacteriophage, a cosmid, or a phagemid.
  • vectors capable of autonomous replication in bacteria of the Enterobacteriaceae family such as Escherichia coli, specifically, for example, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pBR322, pSTV29 (all available from Takara Bio Inc.), pACYC184, pMW219 (Nippon Gene), pTrc99A (Pharmacia), pPROK vector (Clontech), pKK233-2 (Clontech), pET vector (Novagen), pQE vector (Qiagen), pACYC, Hiroshi
  • the host range vector RSF1010 can be mentioned.
  • vectors capable of autonomous replication in coryneform bacteria include, for example, pHM1519 (Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., .48, 2901- 2903 (1984)); plasmids having improved drug resistance genes; plasmid pCRY30 described in JP-A-3-210184; plasmid pCRY21 described in JP-A-2-72876 and US Pat. No. 5,185,262.
  • a ⁇ -glutamyl valine synthase gene containing a unique promoter region may be directly incorporated into the vector, and the coding region of ⁇ -glutamyl valine synthase is placed downstream of the above promoter. They may be combined and then incorporated into the vector, or the coding region of ⁇ -glutamyl valine synthase may be incorporated downstream of the promoter inherent on the vector.
  • the vectors, promoters, and terminators that can be used in various microorganisms are described in detail in, for example, “Basic Course of Microbiology 8, Genetic Engineering, Kyoritsu Shuppan, 1987”, and these can be used.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be introduced into the host chromosome, for example.
  • Introduction of a gene into a chromosome can be performed, for example, using homologous recombination (Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • homologous recombination Examples of gene introduction methods using homologous recombination include the Red-driven integration method (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97).
  • a transduction method using a phage Only one copy of the gene may be introduced, or two copies or more may be introduced.
  • multiple copies of a gene can be introduced into a chromosome by performing homologous recombination with a sequence having multiple copies on the chromosome as a target. Examples of sequences having many copies on a chromosome include repetitive DNA sequences (inverted DNA) and inverted repeats present at both ends of a transposon.
  • homologous recombination may be performed by targeting an appropriate sequence on a chromosome such as a gene unnecessary for carrying out the present invention.
  • the gene can also be randomly introduced onto the chromosome using transposon or Mini-Mu (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985, US Pat. No. 5,882,888, EP805867B1).
  • a ⁇ -glutamyl valine synthase gene containing a unique promoter region may be directly incorporated into the chromosome, and the coding region of ⁇ -glutamyl valine synthase may be incorporated into the promoter as described above. After binding downstream, it may be incorporated into the chromosome, or the coding region of ⁇ -glutamylvaline synthase may be incorporated downstream of the promoter originally present on the chromosome.
  • the introduction of a gene onto a chromosome can be attributed to, for example, Southern hybridization using a probe having a base sequence complementary to all or part of the gene, or a primer prepared based on the base sequence of the gene. Can be confirmed by PCR.
  • the transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • a transformation method for example, a method in which a recipient cell is treated with calcium chloride to increase DNA permeability as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162), as described for Bacillus subtilis, a method of preparing competent cells from cells at the growth stage and introducing DNA (Duncan, C. H. , Wilson, G. A. and Young, F. E .., 1997. Gene 1: 153-167).
  • recombinant DNA is prepared by transforming DNA-receptive cells, such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, into a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • DNA-receptive cells such as those known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast
  • a protoplast or spheroplast state that easily incorporates recombinant DNA.
  • a host that originally has a ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be modified so that the expression of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene is increased.
  • Methods for increasing the expression of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene include increasing the copy number of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene and improving the transcription efficiency of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • An increase in the copy number of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be achieved by introducing the ⁇ -glutamyl valine synthase gene into the host. The introduction of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be performed as described above.
  • the introduced ⁇ -glutamylvaline synthase gene may be derived from the same species or from a different species.
  • the transcription efficiency of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene can be improved by replacing the promoter of the ⁇ -glutamyl valine synthase gene with a stronger promoter. Examples of stronger promoters include those described above.
  • the host having the ⁇ -glutamyl valine synthase gene may be modified so that the activity of the protein involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide is reduced.
  • An example of a protein involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide is ⁇ -glutamyltransferase (GGT).
  • GGT ⁇ -glutamyltransferase
  • the activity of GGT can be reduced by disrupting the ggt gene encoding GGT.
  • the base sequence of the Escherichia coli ggt gene and the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene are shown in SEQ ID NOs: 29 and 30, respectively.
  • Protein activity decreases means that the activity per cell of the protein is decreased compared to wild-type strains and parental unmodified strains, and the activity is completely lost. including. Specifically, “the activity of the protein is decreased” means that the number of molecules per cell of the protein is decreased and / or the function per molecule of the protein compared to the unmodified strain. Means that it is decreasing. In other words, “activity” in the case of “decrease in protein activity” means not only the catalytic activity of the protein but also the transcription amount (mRNA amount) or translation amount (protein amount) of the gene encoding the protein. May be. Note that “the number of molecules per cell of the protein is decreased” includes a case where the protein does not exist at all.
  • the function per molecule of the protein is reduced includes the case where the function per molecule of the protein is completely lost.
  • the activity of the protein is not particularly limited as long as it is lower than that of the non-modified strain. For example, it is 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0, compared to the non-modified strain. %.
  • the modification that reduces the activity of the protein is achieved, for example, by reducing the expression of a gene encoding the protein.
  • Gene expression decreases means that the expression level of the gene per cell decreases as compared to an unmodified strain such as a wild strain or a parent strain. “Gene expression decreases” specifically means that the amount of gene transcription (mRNA amount) decreases and / or the amount of gene translation (protein amount) decreases. Good. “Gene expression decreases” includes the case where the gene is not expressed at all. In addition, “the expression of the gene is reduced” is also referred to as “the expression of the gene is weakened”. Gene expression may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to an unmodified strain.
  • the decrease in gene expression may be due to, for example, a decrease in transcription efficiency, a decrease in translation efficiency, or a combination thereof.
  • gene expression can be reduced by altering expression regulatory sequences such as the promoter of the gene, Shine-Dalgarno (SD) sequence (also called ribosome binding site (RBS)), spacer region between RBS and start codon. Can be achieved.
  • SD Shine-Dalgarno
  • RBS ribosome binding site
  • the expression control sequence is preferably modified by 1 base or more, more preferably 2 bases or more, particularly preferably 3 bases or more. Further, part or all of the expression regulatory sequence may be deleted.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by manipulating factors involved in expression control.
  • Factors involved in expression control include small molecules (such as inducers and inhibitors) involved in transcription and translation control, proteins (such as transcription factors), nucleic acids (such as siRNA), and the like.
  • reduction of gene expression can be achieved, for example, by introducing a mutation that reduces gene expression into the coding region of the gene.
  • gene expression can be reduced by replacing codons in the coding region of the gene with synonymous codons that are used less frequently in the host.
  • gene expression itself may be reduced by gene disruption as described below.
  • the modification that decreases the activity of the protein can be achieved, for example, by destroying a gene encoding the protein. “Gene is disrupted” means that the gene is modified so that it does not produce a normally functioning protein. “Does not produce a protein that functions normally” includes the case where no protein is produced from the same gene, or the case where a protein whose function (activity or property) per molecule is reduced or lost is produced from the same gene. It is.
  • Gene disruption can be achieved, for example, by deleting part or all of the coding region of the gene on the chromosome. Furthermore, the entire gene including the sequences before and after the gene on the chromosome may be deleted.
  • the region to be deleted may be any region such as an N-terminal region, an internal region, or a C-terminal region as long as a decrease in protein activity can be achieved. Usually, the longer region to be deleted can surely inactivate the gene. Moreover, it is preferable that the reading frames of the sequences before and after the region to be deleted do not match.
  • gene disruption is, for example, introducing an amino acid substitution (missense mutation) into a coding region of a gene on a chromosome, introducing a stop codon (nonsense mutation), or adding or deleting 1 to 2 bases. It can also be achieved by introducing a frameshift mutation (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)).
  • gene disruption can be achieved, for example, by inserting another sequence into the coding region of the gene on the chromosome.
  • the insertion site may be any region of the gene, but the longer the inserted sequence, the more reliably the gene can be inactivated.
  • the other sequence is not particularly limited as long as it reduces or eliminates the activity of the encoded protein, and examples thereof include marker genes such as antibiotic resistance genes and genes useful for the production of target substances.
  • Modifying a gene on a chromosome as described above includes, for example, deleting a partial sequence of the gene and preparing a deleted gene modified so as not to produce a normally functioning protein.
  • the host is transformed with the recombinant DNA containing, and the homologous recombination is caused between the deletion type gene and the wild type gene on the chromosome, thereby replacing the wild type gene on the chromosome with the deletion type gene. Can be achieved.
  • the recombinant DNA can be easily manipulated by including a marker gene in accordance with a trait such as auxotrophy of the host.
  • the modification that reduces the activity of the protein may be performed by, for example, a mutation treatment.
  • Mutation treatments include X-ray irradiation, UV irradiation, and N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), ethylmethanesulfonate (EMS), and methylmethanesulfonate (MMS). ) And the like.
  • all of the plurality of subunits may be modified or only a part may be modified as long as the activity of the protein decreases as a result. . That is, for example, all of a plurality of genes encoding these subunits may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • all the activities of the plurality of isozymes may be reduced, or only a part of the activities may be reduced. That is, for example, all of a plurality of genes encoding these isozymes may be destroyed, or only a part of them may be destroyed.
  • the decrease in the activity of the protein can be confirmed by measuring the activity of the protein.
  • the decrease in protein activity can also be confirmed by confirming that the expression of the gene encoding the protein has decreased.
  • the decrease in gene expression can be confirmed by confirming that the transcription amount of the gene has decreased, or confirming that the amount of protein expressed from the gene has decreased.
  • the amount of transcription of the gene has been reduced by comparing the amount of mRNA transcribed from the same gene with that of the unmodified strain.
  • methods for evaluating the amount of mRNA include Northern hybridization, RT-PCR, and the like (Molecular cloning (Cold spring spring Laboratory Laboratory, Cold spring Harbor (USA), 2001)).
  • the amount of mRNA may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the amount of protein may be reduced to, for example, 50% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 0% compared to the unmodified strain.
  • the gene has been destroyed by determining part or all of the nucleotide sequence, restriction enzyme map, full length, etc. of the gene according to the means used for the destruction.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase By culturing a host having a ⁇ -glutamyl valine synthase gene, ⁇ -glutamyl valine synthase can be expressed. At that time, gene expression is induced as necessary.
  • Host culture conditions and gene expression induction conditions may be appropriately selected according to various conditions such as marker type, promoter type, and host type.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as the host can proliferate and can express ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, a sulfur source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • Examples of the carbon source include sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates
  • alcohols such as glycerol and ethanol
  • organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid.
  • Nitrogen sources include inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, and aqueous ammonia.
  • Sulfur sources include inorganic sulfur compounds such as sulfates, sulfites, sulfides, hyposulfites, thiosulfates,
  • Inorganic ions include calcium ions, magnesium ions, manganese ions, potassium ions, iron ions, and phosphate ions.
  • organic components include organic trace nutrient sources.
  • organic micronutrients include required substances such as vitamin B1, yeast extract containing them, and the like.
  • the culture temperature may be, for example, 20 ° C to 45 ° C, preferably 24 ° C to 45 ° C.
  • the culture is preferably aeration culture.
  • the oxygen concentration at that time may be adjusted to, for example, 5 to 50%, preferably about 10% of the saturated concentration.
  • the pH during the culture is preferably 5-9.
  • inorganic or organic acidic or alkaline substances such as calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia, etc. can be used for pH adjustment.
  • a culture containing ⁇ -glutamyl valine synthase can be obtained by culturing preferably for about 10 to 120 hours under the above conditions.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase can accumulate, for example, in the host cell.
  • Cells may be appropriately read as “cells” depending on the type of host.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase may be used as it is contained in the microbial cells or the like, and may be appropriately separated and purified from the microbial cells and used as a crude enzyme fraction or a purified enzyme.
  • the cell when ⁇ -glutamylvaline synthase accumulates in the host cell, the cell can be appropriately disrupted, dissolved, or extracted to recover ⁇ -glutamylvaline synthase.
  • the cells can be recovered from the culture by centrifugation or the like.
  • Cell disruption, lysis, extraction or the like can be performed by a known method. Examples of such a method include ultrasonic crushing method, dynomill method, bead crushing, French press crushing, and lysozyme treatment. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • the culture supernatant can be obtained by centrifugation or the like, and ⁇ -glutamyl valine synthase can be recovered from the culture supernatant.
  • Purification of ⁇ -glutamylvaline synthase can be performed by a known method used for enzyme purification. Examples of such methods include ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and isoelectric point precipitation. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination. Purification of ⁇ -glutamyl valine synthase can be performed to a desired degree. For example, when a component involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide such as GGT coexists with ⁇ -glutamylvaline synthase, it is preferable to remove such component.
  • a component involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide such as GGT coexists with ⁇ -glutamylvaline synthase, it is preferable to remove such component.
  • the purified ⁇ -glutamyl valine synthase can be used as “ ⁇ -glutamyl valine synthase” in the method of the present invention.
  • the ⁇ -glutamyl valine synthase may be used in a free state, or may be used in the state of an immobilized enzyme immobilized on a solid phase such as a resin.
  • any fraction containing ⁇ -glutamyl valine synthase may be used as “ ⁇ -glutamyl valine synthase” in the method of the present invention.
  • the fraction containing ⁇ -glutamyl valine synthase is not particularly limited as long as it is contained so that ⁇ -glutamyl valine synthase can act on Glu and Val.
  • fractions include a culture of a host having a ⁇ -glutamyl valine synthase gene (host having ⁇ -glutamyl valine synthase), a cell recovered from the culture (cultured cell), Disrupted microbial cells, lysates of the microbial cells, extracts of the microbial cells (cell-free extract), treated microbial cells such as immobilized microbial cells immobilized with acrylamide, carrageenan, etc. Examples include culture supernatants recovered from the culture, partially purified products (crudely purified products), and combinations thereof. Any of these fractions may be used alone or together with purified ⁇ -glutamyl valine synthase.
  • Glutathione synthase is usually composed of ⁇ -Glu-Cys, Gly and ATP as substrates, glutathione ( ⁇ -Glu-Cys-Gly), ADP and phosphate. It is known as an enzyme (EC 6.3.2.3) that has the activity of catalyzing the reaction that produces the. In the present invention, this activity is also referred to as “glutathione synthase activity”.
  • ⁇ -Glu-Val, Gly, and ATP are used as substrates, and the activity of catalyzing the reaction to produce ⁇ -Glu-Val-Gly, ADP, and phosphate is expressed as “ ⁇ -glutamylvalylglycine synthase ( gamma-Glutamylvalylglycine synthethase) activity ”or“ ⁇ -Glu-Val-Gly production (synthesis) activity ”.
  • glutathione synthetase having ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity refers to a protein having ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity.
  • glutathione synthetase may or may not have an activity to produce ⁇ -glutamyltripeptide other than ⁇ -glutamylvalylglycine as long as it has ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity. Also good. That is, for example, glutathione synthetase may or may not have glutathione synthetase activity.
  • Glutathione synthetase ⁇ - Guru Tamil valyl glycine synthetase activity for example, the reaction solution 12.5 mM ⁇ -Glu-Val composition, 12.5 mM Gly, 12.5 mM ATP , 12.5 mM MgS0 4, 2 mM dithiothreitol, 100 mM Tris- An HCl buffer (pH 8.0), a reaction temperature of 37 ° C., and a reaction time of 1 minute to 50 hours can be measured using an appropriate amount of glutathione synthetase.
  • the enzyme activity that produces 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val-Gly in 1 minute under these conditions is defined as 1 U of ⁇ -glutamylvalylglycine synthase activity.
  • glutathione synthetase examples include GshB protein encoded by Escherichia coli gshB gene and Gsh2 protein encoded by Saccharomyces cerevisiae GSH2 gene. Further, examples of glutathione synthetase include mutant glutathione synthetase described in WO2013 / 054447.
  • the base sequence of the gshB gene of Escherichia coli K-12 MG1655 strain corresponds to the sequence at positions 3,089,900 to 3,090,850 in the genome sequence registered in the NCBI database as GenBank accession NC_000913.3.
  • the nucleotide sequence of the gshB gene of MG1655 strain (same for Escherichia coli K-12 W3110 strain) is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the same gene is shown in SEQ ID NO: 28. That is, glutathione synthetase may be a protein encoded by a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 27, for example.
  • the glutathione synthetase may be a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28, for example.
  • the glutathione synthetase may be a variant of the above glutathione synthetase as long as it has ⁇ -glutamylvalylglycine synthetase activity.
  • the glutathione synthetase may be a fusion protein with another peptide.
  • the description regarding the fusion protein in the above-mentioned ⁇ -glutamyl valine synthase can be applied mutatis mutandis.
  • Glutathione synthase can be produced by expressing a glutathione synthase gene in a host having a gene encoding glutathione synthase (also referred to as “glutathione synthase gene”).
  • a host having a glutathione synthetase gene is also referred to as a host having a glutathione synthetase.
  • a host having a glutathione synthetase gene may be one that inherently has a glutathione synthetase gene or may be modified to have a glutathione synthetase gene.
  • Examples of the host having the glutathione synthase gene inherently include microorganisms such as Escherichia coli having the gshB gene and Saccharomyces cerevisiae having the GSH2 gene.
  • Examples of the host modified to have the glutathione synthetase gene include a host into which the glutathione synthetase gene has been introduced. Moreover, you may modify
  • the host for expressing the glutathione synthetase gene may be modified so that the activity of a protein involved in the degradation of ⁇ -glutamyl peptide such as ⁇ -glutamyltransferase (GGT) is reduced.
  • Glutathione synthase can also be produced by expressing a glutathione synthase gene in a cell-free protein synthesis system.
  • glutathione synthase using a host having a glutathione synthase gene
  • the above description regarding the production of ⁇ -glutamyl valine synthase using a host having a ⁇ -glutamylvaline synthase gene can be applied mutatis mutandis.
  • the produced glutathione synthetase (a purified glutathione synthetase or a fraction containing glutathione synthetase) can be used as the “glutathione synthase” in the method of the present invention.
  • Glutathione synthase may be produced alone or together with ⁇ -glutamylvaline synthase.
  • glutathione synthetase and ⁇ -glutamyl valine synthase can be produced together by expressing them in a host having both glutathione synthetase gene and ⁇ -glutamyl valine synthase gene.
  • the present invention utilizes a method for producing ⁇ -Glutamylvalylglycine ( ⁇ -Glu-Val-Gly)
  • the present invention utilizes a method for producing ⁇ -Glu-Val using ⁇ -glutamylvaline synthase and ⁇ -glutamylvaline synthase
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly is provided. These methods are collectively referred to as “the method of the present invention”.
  • the present invention provides a method for enzymatically producing ⁇ -Glu-Val-Gly using ⁇ -glutamyl valine synthase. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention (enzyme method)”.
  • ⁇ -Glu-Val can be produced by reacting Glu and Val by using ⁇ -glutamylvaline synthase. That is, the present invention provides a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val by allowing ⁇ -glutamylvaline synthase to act on Glu and Val. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val of the present invention (enzyme method)”. The produced ⁇ -Glu-Val can be appropriately recovered from the reaction solution.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced using the generated ⁇ -Glu-Val as a raw material.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly using ⁇ -Glu-Val as a raw material a method using glutathione synthetase is known (Japanese Patent Laid-Open No. 2012-85637). Specifically, by using glutathione synthetase, ⁇ -Glu-Val and Gly can be reacted to generate ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • one embodiment (also referred to as “first embodiment”) of the production method (enzyme method) of ⁇ -Glu-Val-Gly according to the present invention is to allow (A) ⁇ -glutamylvaline synthase to act on Glu and Val.
  • the step (A) and the step (B) may be performed separately, or may be performed simultaneously in part or all of the periods. That is, for example, the step (A) and the step (B) may be started at the same time, or the step (B) may be started during or after the completion of the step (A).
  • step (A) and step (B) can be started simultaneously.
  • step (A) is started under conditions where glutathione synthase and / or Gly are not present in the reaction system, and glutathione synthase and / or Gly is present in the reaction system during or after the completion of the step (A).
  • a process (B) can be started.
  • ⁇ -Glu-Val generated in step (A) may be recovered, and step (B) may be performed using the recovered ⁇ -Glu-Val.
  • ⁇ -Glu-Val may be used in step (B) after being appropriately subjected to treatments such as purification, dilution, concentration, drying and dissolution.
  • process (A) of the manufacturing method (enzyme method) of (gamma) -Glu-Val of this invention can be implemented by the aspect similar to implementing the process (A) of a 1st aspect independently, for example.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced by reacting Glu, Val and Gly by using ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase. That is, another embodiment (also referred to as “second embodiment”) of the production method (enzyme method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention comprises (C) ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase. A process for producing ⁇ -Glu-Val-Gly by acting on Glu, Val, and Gly.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase, glutathione synthase, Glu, Val, and Gly are allowed to coexist in the reaction system, so that ⁇ -glutamyl valine synthase and glutathione synthase are Glu, Val, and ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced by collectively acting on Gly.
  • ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase are also collectively referred to as “enzyme”.
  • Glu, Val, and Gly are also collectively referred to as “amino acids”.
  • ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Val-Gly are also collectively referred to as “peptides”.
  • Glu, Val, Gly, and ⁇ -Glu-Val are also collectively referred to as “substrate”.
  • the “substrate” may further include ATP unless otherwise specified.
  • the reaction between an enzyme and the corresponding substrate is also called an “enzymatic reaction”.
  • each enzyme used in the method of the present invention is as described above. That is, as each enzyme, for example, a purified enzyme, an arbitrary fraction containing the enzyme, or a combination thereof can be used. As each enzyme, one type of enzyme may be used, or two or more types of enzymes may be used in combination.
  • amino acid a commercially available product may be used, and an amino acid produced and obtained as appropriate may be used.
  • the production method of the amino acid is not particularly limited, and for example, a known method can be used.
  • Amino acids can be produced, for example, by chemical synthesis, enzymatic reaction, or a combination thereof.
  • An amino acid can be produced, for example, by culturing a microorganism capable of producing the amino acid and recovering the amino acid from the culture.
  • a microorganism having an amino acid-producing ability for example, an amino acid-producing bacterium as described later can be used.
  • an amino acid can be manufactured by collect
  • amino acid a purified product purified to a desired level may be used, or a material containing the amino acid may be used.
  • the material containing an amino acid is not particularly limited as long as it contains the amino acid in such a manner that the enzyme can act on the amino acid.
  • Specific examples of the amino acid-containing material include, for example, a culture obtained by culturing a microorganism having the ability to produce the amino acid, a culture supernatant separated from the culture, and a cell isolated from the culture And processed products such as concentrates (concentrated liquids) and concentrated dry products.
  • the amino acid and the peptide may be a free form, a salt thereof, or a mixture thereof. That is, the term “amino acid” may mean a free amino acid, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified.
  • the term “peptide” may mean a free peptide, a salt thereof, or a mixture thereof, unless otherwise specified.
  • the salt is not particularly limited as long as it is chemically acceptable.
  • the salt of ⁇ -Glu-Val-Gly is a chemically acceptable edible salt. If there is no particular limitation.
  • “chemically acceptable edible salt” specifically, for acidic groups such as carboxyl groups, ammonium salts, salts with alkali metals such as sodium and potassium, calcium and magnesium, etc. Salts with alkaline earth metals, aluminum salts, zinc salts, salts with organic amines such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine, salts with basic amine acids such as arginine and lysine Can be mentioned.
  • acidic groups such as carboxyl groups, ammonium salts, salts with alkali metals such as sodium and potassium, calcium and magnesium, etc. Salts with alkaline earth metals, aluminum salts, zinc salts, salts with organic amines such as triethylamine, ethanolamine, morpholine, pyrrolidine, piperidine, piperazine, dicyclohexylamine, salts with basic amine acids such as arginine and lysine
  • a “chemically acceptable edible salt” specifically, for a basic group, for example, with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, etc. Salt, acetic acid, citric acid, benzoic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, succinic acid, tannic acid, butyric acid, hibenzic acid, pamoic acid, enanthic acid, decanoic acid, teocric acid, salicylic acid, lactic acid, oxalic acid, mandelic acid And salts with organic carboxylic acids such as malic acid and salts with organic sulfonic acids such as methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid and p-toluenesulfonic acid.
  • an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, nitric acid, hydrobromic acid, etc. Salt, ace
  • the enzyme reaction may be carried out in a batch type or a column type.
  • the enzyme reaction can be carried out by mixing the enzyme and the substrate in the reaction solution in the reaction vessel.
  • the enzyme reaction may be performed by standing or may be performed with stirring.
  • the enzyme reaction can be carried out by passing a reaction solution containing a substrate through a column filled with immobilized cells or immobilized enzyme.
  • the reaction solution water, a buffer solution or the like containing necessary components can be used.
  • the reaction solution may contain, for example, an enzyme, a substrate, ATP, and a divalent metal ion.
  • the combination of components used for the enzyme reaction can be appropriately selected according to the type of process to be performed and the embodiment thereof (whether a plurality of processes are performed simultaneously).
  • Both ⁇ -glutamyl valine synthase and glutathione synthase utilize ATP for the enzymatic reaction. Therefore, ATP is appropriately supplied to the reaction system. That is, the reaction system (reaction solution) may contain ATP. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of ATP.
  • the method for supplying ATP is not particularly limited as long as ATP can be used for the enzymatic reaction.
  • ATP can be added to the reaction solution in any form such as powder or aqueous solution. ATP may be supplied to the reaction system by, for example, a method for generating or regenerating ATP.
  • a method of generating or regenerating ATP As a method of generating or regenerating ATP, a method of supplying ATP from a carbon source using Corynebacterium bacteria (Hori, H et al., Appl.lMicrobiol. Biotechnol. 48 (6): 693-698 ( 1997)), ATP regeneration using yeast cells and glucose (Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69 (4): 784-789 (2005)), phosphoenolpyruvate and Regenerating ATP using pyruvate kinase (C. (Aug'e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett.
  • reaction solution may contain a divalent metal ion.
  • Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of a divalent metal ion.
  • Preferred divalent metal ions include Mg 2+ and Mn 2+ .
  • the concentration of the divalent metal ion may be, for example, 1 to 200 mM.
  • Reaction conditions are not particularly limited as long as ⁇ -Glu-Val-Gly is produced.
  • the pH of the reaction solution may be, for example, usually 6.0 to 10.0, preferably 6.5 to 9.0.
  • the reaction temperature may be, for example, usually 15 to 50 ° C., preferably 15 to 45 ° C., more preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 200 hours for each of the step (A) and the step (B) of the first aspect.
  • the reaction time may be, for example, 5 minutes to 200 hours for the step (C) of the second embodiment.
  • the flow rate of the reaction solution may be a rate such that the reaction time is within the range of the reaction time exemplified above.
  • the concentration of each substrate in the reaction solution may be, for example, usually 0.1 to 2000 mM, preferably 1 to 2000 mM, more preferably 10 to 1000 mM.
  • the molar ratio of each substrate in the first aspect is appropriately referred to the molar ratio of each substrate in the second aspect. May be.
  • the amount of enzyme used can be set based on the enzyme activity, for example.
  • the amount of ⁇ -glutamylvaline synthase used is usually 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 500 U, for example, in terms of ⁇ -Glu-Val production activity with respect to the total amount of 1 lummol of Glu and Val More preferably, it may be 0.1 to 100 ⁇ U.
  • the amount of glutathione synthetase used is, for example, converted to ⁇ -Glu-Val-Gly production activity with respect to 1 ⁇ mmol of the total amount of ⁇ -Glu-Val and Gly. In general, it may be 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 500 U, more preferably 0.1 to 100 U.
  • the amount of glutathione synthetase used in the step (C) of the second embodiment is, for example, ⁇ -Glu-Val-Gly with respect to a total amount of 1 ⁇ mmol of half of Glu, half of Val and total amount of Gly. In terms of production activity, it may be generally 0.01 to 1000 U, preferably 0.1 to 500 U, more preferably 0.1 to 100 U.
  • the usage-amount of the glutathione synthetase in a 1st aspect is suitably used. It may be helpful.
  • reaction conditions may be uniform from the start to the end of the enzyme reaction, or may change during the enzyme reaction. “The reaction conditions change in the course of the enzymatic reaction” includes not only that the reaction conditions change temporally but also that the reaction conditions change spatially. “Reaction conditions vary spatially” means that, for example, when a column-type enzyme reaction is performed, reaction conditions such as reaction temperature and enzyme concentration differ depending on the position on the flow path.
  • a reaction solution containing ⁇ -Glu-Val-Gly can be obtained.
  • the formation of ⁇ -Glu-Val-Gly can be confirmed by a known method used for detection or identification of a compound. Examples of such a method include HPLC, LC / MS, GC / MS, and NMR. One of these methods may be used alone, or two or more thereof may be used in appropriate combination.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be appropriately recovered from the reaction solution. The recovery of ⁇ -Glu-Val-Gly can be performed by a known method used for separation and purification of compounds.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly may contain components other than ⁇ -Glu-Val-Gly, such as components and moisture used for the production of ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly may be purified to a desired degree.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly is, for example, 30% (w / w) or more, 50% (w / w) or more, 70% (w / w) or more, 80% (w / w) or more, 90% ( It may be purified to a purity of w / w) or higher, or 95% (w / w) or higher. Further, ⁇ -Glu-Val can be recovered in the same manner as ⁇ -Glu-Val-Gly.
  • the present invention provides a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly by fermentation using ⁇ -glutamylvaline synthase. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention (fermentation method)”.
  • ⁇ -Glu-Val can be produced by fermentation from Glu and Val. That is, the present invention relates to a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising (A) a step of producing ⁇ -Glu-Val from Glu and Val by culturing a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase in a medium. provide. This method is also referred to as “a method for producing ⁇ -Glu-Val of the present invention (fermentation method)”. The produced ⁇ -Glu-Val can be appropriately recovered from the culture.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced by fermentation from ⁇ -Glu-Val and Gly. That is, one embodiment (also referred to as “third embodiment”) of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention is (A) culturing a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase in a medium.
  • step (B) culturing a microorganism having glutathione synthase in a medium to produce ⁇ from ⁇ -Glu-Val and Gly produced in step (A)
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly which comprises a step of producing -Glu-Val-Gly.
  • the step (A) and the step (B) may be performed separately, or may be performed simultaneously during a part or all of the periods. That is, for example, the step (A) and the step (B) may be started at the same time, or the step (B) may be started during or after the completion of the step (A).
  • the step (A) and the step (B) may be carried out using a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase and a microorganism having a glutathione synthetase which is separate from the microorganism. A single microorganism having both ⁇ -glutamyl valine synthase and glutathione synthase may be used.
  • step (A) and step (B) are simultaneously performed.
  • the ⁇ -Glu-Val produced in the step (A) may be recovered, and the recovered ⁇ -Glu-Val may be added to the medium to perform the step (B).
  • ⁇ -Glu-Val may be used in step (B) after being appropriately subjected to treatments such as purification, dilution, concentration, drying and dissolution.
  • process (A) of the manufacturing method (fermentation method) of (gamma) -Glu-Val of this invention can be implemented by the aspect similar to implementing the process (A) of a 3rd aspect independently, for example.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly can be fermented from Glu, Val, and Gly by using a microorganism having both ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase. That is, another embodiment (also referred to as “fourth embodiment”) of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val-Gly of the present invention has (C) ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly comprising a step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly from Glu, Val, and Gly by culturing a microorganism in a medium.
  • microorganisms having ⁇ -glutamylvaline synthase In the fermentation method, terms such as enzyme, amino acid, peptide, substrate and enzyme reaction are used in the same meaning as in the enzyme method.
  • microorganisms having ⁇ -glutamylvaline synthase microorganisms having glutathione synthase, and microorganisms having ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase are also collectively referred to as “microorganisms”.
  • each amino acid serving as a substrate is not particularly limited as long as the amino acid can be used in an enzyme reaction.
  • each amino acid may be biosynthesized by a microorganism used in each step, added to a medium, or a combination thereof. That is, for example, all of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by microorganisms, and all of Glu, Val, and Gly may be added to the medium. Further, for example, one or two amino acids of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by a microorganism, and other amino acids may be added to the medium. Any of Glu, Val, and Gly may be biosynthesized by a microorganism and added to the medium.
  • one embodiment of the production method (fermentation method) of ⁇ -Glu-Val of the present invention is, for example, (A1) by culturing a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase in a medium containing Glu and Val.
  • a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising a step of producing -Glu-Val, wherein (A2) a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase and having the ability to produce Glu and Val It may be a method for producing ⁇ -Glu-Val comprising a step of producing ⁇ -Glu-Val by culturing in a medium.
  • one aspect of the third aspect is, for example, a method for producing ⁇ -Glu-Val-Gly including any one of (A1) and (A2) and (B1) and (B2). May be: (A1) A step of producing ⁇ -Glu-Val by culturing a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase in a medium containing Glu and Val; (A2) producing ⁇ -Glu-Val by culturing a microorganism having ⁇ -glutamylvaline synthase and having the ability to produce Glu and Val in a medium; (B1) A step of producing ⁇ -Glu-Val-Gly by culturing a microorganism having glutathione synthase in a medium containing ⁇ -Glu-Val and Gly produced in step (A1) or (A2); (B2) ⁇ -Glu-Val by culturing a microorganism having glutathione synthase and having the ability to produce Gly in a medium containing ⁇
  • one aspect of the fourth aspect is, for example, by culturing a microorganism having (C1) ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase in a medium containing Glu, Val, and Gly.
  • a step of producing ⁇ -Gly-Gly-Vly-Gly, comprising (C2) ⁇ -glutamylvaline synthase and glutathione synthase, and Glu, Val, and Gly A method of producing ⁇ -Glu-Val-Gly, which comprises culturing a microorganism having the production ability of ⁇ -Glu-Val-Gly in a medium.
  • the microorganism having ⁇ -glutamyl valine synthase the microorganism having the ⁇ -glutamyl valine synthase gene as described above can be used as it is or after being appropriately modified.
  • the microorganism having glutathione synthetase the microorganism having the glutathione synthetase gene as described above can be used as it is or after being appropriately modified.
  • the microorganisms having ⁇ -glutamyl valine synthase and glutathione synthase the microorganisms having both the ⁇ -glutamyl valine synthase gene and the glutathione synthase gene as described above can be used as they are, or appropriately modified. .
  • the microorganism having an amino acid-producing ability may be one that originally has an amino acid-producing ability, or one that has been modified to have an amino acid-producing ability.
  • a microorganism having an amino acid-producing ability can be obtained by imparting an amino acid-producing ability to a microorganism, or by enhancing the amino acid-producing ability of a microorganism. Either the provision or enhancement of enzyme production ability such as introduction of ⁇ -glutamyl valine synthase gene and / or glutathione synthetase gene and the provision or enhancement of amino acid production ability may be performed first.
  • a microorganism having ⁇ -glutamyl valine synthase and / or glutathione synthase and capable of producing an amino acid is a microorganism having ⁇ -glutamyl valine synthase and / or glutathione synthase. It may be obtained by modifying so as to have it, or it may be obtained by modifying a microorganism having amino acid-producing ability so as to have ⁇ -glutamylvaline synthase and / or glutathione synthase.
  • L-amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by a method conventionally used for breeding amino acid-producing bacteria such as coryneform bacteria or Escherichia bacteria (Amino Acid Fermentation, Academic Publishing Center, Inc., 1986). (May 30, 1st edition issued, see pages 77-100). Examples of such methods include acquisition of auxotrophic mutants, acquisition of L-amino acid analog-resistant strains, acquisition of metabolic control mutants, and recombination with enhanced activity of L-amino acid biosynthetic enzymes. The creation of stocks.
  • the L-amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by reducing the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of the target L-amino acid to produce a compound other than the target L-amino acid. It can be carried out.
  • an odhA-deficient strain obtained from Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869 was introduced into a recombinant strain in which the mviN gene having a V197M mutation was introduced (JP 2010- 161970), Pantoea agglomerans strain AJ13355 (patent No.
  • gltA citrate synthase
  • Brevibacterium lactofermentum a gltA gene derived from Brevibacterium lactofermentum
  • tyrosine residue at position 397 of glutamine synthetase is replaced with other amino acid residues
  • Examples include bacteria belonging to the genus Escherichia having a substituted glutamine synthetase (US Patent Application Publication No. 2003-0148474).
  • L-valine-producing bacteria include Escherichia coli VL1970 strain (US Pat. No. 5,658,766), a genus belonging to the genus Escherichia, and a mutation that requires lipoic acid for growth and / or a mutation that lacks H + -ATPase.
  • Escherichia in which a DNA fragment containing the ilvGMEDA operon that expresses at least each gene of ilvG, ilvM, ilvE, and ilvD and does not express threonine deaminase activity has been introduced into the cell.
  • Examples include genus bacteria (WO96 / 06926). That is, for example, amino acid-producing ability can be imparted or enhanced by introducing these modifications into a microorganism.
  • the microorganism may be modified so that the ability to take in the amino acid added to the medium is improved.
  • the microorganism may be modified so as to improve the ability to discharge the produced ⁇ -Glu-Val out of the microbial cell according to the utilization mode, and the ⁇ -Glu-Val added to the medium may be changed. It may be modified to improve the ability to capture.
  • the microorganism may be modified so that the ability to discharge the produced ⁇ -Glu-Val-Gly out of the cell body is improved.
  • Culture conditions are not particularly limited as long as microorganisms can grow and ⁇ -Glu-Val-Gly is produced.
  • the description of the culture conditions in the above-described method for producing ⁇ -glutamylvaline synthase can be referred to.
  • Both ⁇ -glutamyl valine synthase and glutathione synthase utilize ATP for the enzymatic reaction. Therefore, ATP is appropriately supplied to the reaction system. That is, the reaction system may contain ATP. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of ATP.
  • the method for supplying ATP is not particularly limited as long as ATP can be used for the enzymatic reaction. ATP may be produced, for example, by a microorganism used in each step, or may be supplied to the reaction system by a method for producing or regenerating ATP as described above.
  • a co-culture system such as a method in which a microorganism having an enhanced ATP regeneration system by normal energy metabolism or a microorganism having the ability to regenerate ATP by the action of polyphosphate kinase coexists in a culture solution ( JP-B-7-16431 and JP-B-6-69386) can be preferably used.
  • ⁇ -glutamyl valine synthase usually requires a divalent metal ion for the enzyme reaction. Therefore, the reaction system may contain a divalent metal ion. Any of the steps (A) to (C) can be carried out in the presence of a divalent metal ion.
  • the amino acid When using a medium containing an amino acid, the amino acid may be contained in the medium from the beginning of the culture or may be added to the medium at any time during the culture.
  • the timing of addition can be appropriately changed according to various conditions such as the culture time. As an example, it is preferably 0 to 50 hours before the end of the culture, more preferably 0.1 to 24 hours, and particularly preferably 0. .5-6 hours ago.
  • the amino acid may be added once or multiple times, or may be added continuously.
  • the concentration of each amino acid in the medium may be, for example, usually 0.1 to 2000 mM, preferably 1 to 2000 mM, more preferably 10 to 1000 mM.
  • the description regarding the molar ratio of each substrate in the reaction liquid in an enzyme method may apply mutatis mutandis.
  • ⁇ -Glu-Val-Gly By culturing in this way, a culture containing ⁇ -Glu-Val-Gly can be obtained. Generation of ⁇ -Glu-Val-Gly can be confirmed by a known technique used for detection or identification of a compound as described above. ⁇ -Glu-Val-Gly can be appropriately recovered from the culture. As described above, ⁇ -Glu-Val-Gly can be recovered by a known method used for separation and purification of compounds. In the case where L-amino acid accumulates in the microbial cells, for example, the microbial cells are crushed with ultrasonic waves, and the microbial cells are removed from the supernatant obtained by centrifugation to obtain ⁇ - Glu-Val-Gly can be recovered.
  • the yeast when the microorganism is yeast and ⁇ -Glu-Val-Gly accumulates in the microbial cells, the yeast can be used, for example, for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Val-Gly. That is, the present invention provides a method for producing a yeast extract containing ⁇ -Glu-Abu, which comprises preparing a yeast extract using the same yeast as a raw material. Preparation of yeast extract from yeast may be carried out in the same manner as normal yeast extract preparation.
  • the yeast extract may be one obtained by treating a yeast cell extracted with hot water, or one obtained by digesting a yeast cell.
  • the obtained yeast extract may be concentrated as needed, and may be dried and made into a powder form.
  • Example 1 Detection of ⁇ -Glu-Val synthesis activity of cell-free extract of Cochlear Rosea (AJ3132) (1) Preparation of cell-free extract Medium 1 (0.5%) was used for cultivation of Cochlear Rosea (AJ3132). (W / v) glucose, 1% (w / v) yeast extract, 1% (w / v) polypeptone, 0.5% (w / v) NaCl, (pH 7.0)) were used. Cochlear rosea (AJ3132) was cultured overnight at 30 ° C. in medium 1 containing 1.5% (w / v) agar.
  • the obtained bacterial cells were inoculated into 18 ml of medium 1, dispensed in 3 ml portions into test tubes, and cultured overnight at 30 ° C. and 120 reciprocations / minute.
  • the cells were collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), washed with physiological saline, and 4 ml of bacterial cell suspension was prepared using physiological saline.
  • a multi-bead shocker MB701CAJ (S) type manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.
  • Bead diameter: 0.1 mm, 2,700 rpm, ON / OFF 1 minute / 1 minute, 6 minutes in total
  • Centrifugation (12,000 g, 10 minutes).
  • the centrifuged supernatant was ultrafiltered with Amicon Ultra filter unit-3,000NMWL (Merck Millipore).
  • the filter non-permeate was collected and diluted with physiological saline to a total volume of 4 ml to obtain a cell-free extract.
  • Quantitative conditions for ⁇ -Glu-Val are as follows.
  • Phenomenex Synergi 4 ⁇ Hydro-RP 80A particle size 4 microns, inner diameter 4.6 mm, length 250 mm
  • liquid A 50 mM sodium dihydrogen phosphate (pH 2.5, pH adjusted with phosphoric acid)
  • liquid B mixture of liquid A and acetonitrile 1: 1 (v / v)
  • the column temperature is 40 ° C
  • the UV detection wavelength is 210 nm
  • the eluent gradient is 0-5% for B solution, 0-5% for B solution, 5% for B solution for 5-15 minutes, and 5% for B solution for 15-30 minutes.
  • 80%, 30 to 30.1 minutes were set as B solution 80 to 0%, and 30.1 to 50 minutes were set as B solution 0%.
  • Example 2 Purification of ⁇ -Glu-Val synthase derived from Cochlear Rosea (AJ3132)
  • ⁇ -Glu-Val synthesizing activity was measured in the reaction solution 1 described in Example 1 using an enzyme solution (cell-free).
  • An appropriate amount of the extract or active fraction) was added and measured in the same procedure as in Example 1 (the same applies to the following examples unless otherwise specified).
  • the enzyme activity for producing 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val per minute under these conditions was defined as 1 U of ⁇ -Glu-Val synthesis activity.
  • Cochlear rosea (AJ3132) was cultured overnight at 30 ° C. in medium 1 containing 1.5% (w / v) agar.
  • the obtained microbial cells were inoculated into 4 L of medium 1 and dispensed 100 ml at a time into a 500 ml Sakaguchi flask and cultured at 30 ° C. and 110 reciprocations / min for 16 hours.
  • the cells were collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), washed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and a 600 ml cell suspension was prepared using the same buffer.
  • the cell suspension was crushed using a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) and then centrifuged (400 g, 1 minute), and the resulting supernatant was further centrifuged (29,100 g, 20 minutes). The obtained supernatant was subjected to ultracentrifugation (274,000 g, 30 minutes), and 410 ml of the supernatant was collected and used as a cell-free extract (total protein: 1665 mg, total activity (total ⁇ -Glu-Val synthesis activity) ): 6.9U).
  • the purified enzyme was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining solution.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • Example 3 Determination of partial amino acid sequence of ⁇ -Glu-Val synthase derived from cochlear rosea (AJ3132) and base sequence of gene encoding the enzyme
  • the purified enzyme obtained in Example 2 was subjected to SDS-polyacrylamide gel. After electrophoresis, it was transferred to a PVDF membrane and subjected to a protein sequencer to determine the 10-residue N-terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
  • the purified enzyme obtained in Example 2 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, digested with trypsin, and the fragment separated by reverse phase HPLC was subjected to a protein sequencer. 2) was determined.
  • genomic DNA of Cochlear Rosea was prepared using Nextera XT (made by Illumina) and sequenced by Miseq (made by Illumina) according to the accompanying protocol.
  • Nextera XT made by Illumina
  • Miseq made by Illumina
  • Example 4 Expression of Cochlear Rosea (AJ3132) -derived ⁇ -Glu-Val synthase by Escherichia coli (1) Construction of Koklia Rosea (AJ3132) -derived ⁇ -Glu-Val synthase-expressing strain An expression plasmid pET-KrogshA for the gene (ORF region of SEQ ID NO: 3) encoding the found Cochlear rosea (AJ3132) -derived ⁇ -Glu-Val synthase was constructed by the following procedure. Since the start codon of the same gene was gtg, the start codon was replaced with atg in the construction of pET-KrogshA.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution, and LB agar medium (1.0% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) yeast extract, 1.0% (w / v) containing 100 mg / L of Amp. ) NaCl, 1.5% (w / v) agar), and then cultured at 30 ° C. overnight.
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the base sequence is confirmed using 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and the plasmid with the desired structure is named pET-KrogshA It was.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the obtained pET-KrogshA to obtain a transformant having pET-KrogshA.
  • This transformant was named Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-KrogshA.
  • the cells were collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), then washed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and a cell suspension was prepared using the same buffer.
  • the bacterial cell suspension was subjected to ultrasonic disruption to disrupt the bacterial cells, centrifuged (29,100 g, 20 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the resulting cell-free extract was applied to a HiLoad 16/10 Q Sepharose High Performance column (manufactured by GE Healthcare) equilibrated in advance with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0). The enzyme was eluted with a linear concentration gradient to obtain the active fraction.
  • the obtained active fraction was mixed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing an equal amount of 2.4 M ammonium sulfate, gently stirred at 4 ° C for 3 hours, and then centrifuged (12,000 g, 5 minutes) To obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was applied to two HiTrap Phenyl High Performance 5ml columns (manufactured by GE Healthcare) that had been equilibrated with 20mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 1.2M ammonium sulfate in advance.
  • the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 0M ammonium sulfate to obtain an active fraction.
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 15% (w / v) glycerol.
  • the enzyme solution after dialysis was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis, and the gel was stained with a CBB staining solution. As a result, a uniform band was detected at a molecular weight of about 40,000.
  • reaction solution 2 100 mmol / L Tris-HCl buffer, 10 mmol / L Glu, 10 mmol / L Val, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L magnesium sulfate, pH 9.0
  • the reaction was carried out at 30 ° C. for 30 minutes.
  • ⁇ -Glu-Val was quantified in the same procedure as in Example 1.
  • the enzymatic activity for producing 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val per minute under these conditions was defined as 1 ⁇ U ⁇ -Glu-Val synthesis activity.
  • the enzyme solution after dialysis had ⁇ -Glu-Val synthesis activity, and the specific activity was 0.883 U / mg.
  • Example 5 Expression of ⁇ -Glu-Val synthase (KrhGSHA) derived from Koclear lysophylla DC2201 strain by Escherichia coli (1) Construction of ⁇ -Glu-Val synthetase expressing strain derived from Koclear lysophylla DC2201 An expression plasmid pQE-KrhgshA for the KrhgshA gene (SEQ ID NO: 7) encoding the ⁇ -Glu-Val synthase of the DC2201 strain (ATCC 9341) was constructed by the following procedure.
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the nucleotide sequence is confirmed using 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and the plasmid having the desired structure is named pQE-KrhgshA. It was. In addition, the transformant having this plasmid was named Escherichia coli JM109 / pQE-KrhgshA.
  • the nucleotide sequence of the KrhgshA gene and the amino acid sequence of KrhGSHA encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 10, respectively. According to pQE-KrhgshA, KrhGSHA is expressed in a form in which a His tag is added to the N-terminus.
  • the cells were collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes) and then washed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • a cell suspension was prepared using eluent A (20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 300 mM NaCl, 10 mM imidazole). The cells were crushed and centrifuged (29,100 g, 20 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent A in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was mixed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing an equal amount of 2.4 M ammonium sulfate, gently stirred at 4 ° C for 3 hours, and then centrifuged (12,000 g, 5 minutes) To obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was applied to a HiTrap Phenyl High Performance 1ml column (GE Healthcare) equilibrated with 20mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 1.2M ammonium sulfate in advance.
  • the enzyme was eluted with a concentration gradient to obtain an active fraction.
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 15% (w / v) glycerol.
  • the enzyme solution after dialysis was used in the subsequent experiments as purified KrhGSHA.
  • Example 6 Expression of ⁇ -Glu-Val synthase (MluGSHA) derived from Micrococcus luteus NCTC2665 by Escherichia coli (1) Construction of ⁇ -Glu-Val synthase expressing strain derived from Micrococcus luteus NCTC2665 Micro An expression plasmid pQE-MlugshA for the MulgshA gene (SEQ ID NO: 11) encoding the ⁇ -Glu-Val synthase of the Coccus luteus NCTC2665 strain (ATCC 15307) was constructed by the following procedure.
  • the target DNA of about 1.2 kb was excised by agarose gel electrophoresis, and pQE30 previously digested with BamHI / HindIII and a ligation convenience kit (manufactured by Nippon Gene) Connected.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 mg / L Amp, and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a plasmid was extracted from the colonies of the grown transformant according to a known method, and the nucleotide sequence was confirmed using 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the base sequence is confirmed using 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and the plasmid having the desired structure is identified as pQE-MlugshA, The transformant having the plasmid was named Escherichia coli JM109 / pQE-MlugshA.
  • the nucleotide sequence of the MlugshA gene and the amino acid sequence of MluGSHA encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 16, respectively. According to pQE-MlugshA, MluGSHA is expressed in a form in which a His tag is added to the N-terminus.
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent A in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was mixed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing an equal amount of 2.4 M ammonium sulfate, gently stirred at 4 ° C for 3 hours, and then centrifuged (12,000 g, 5 minutes) To obtain a supernatant.
  • the obtained supernatant was applied to a HiTrap Phenyl High Performance 1ml column (GE Healthcare) equilibrated with 20mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 1.2M ammonium sulfate in advance.
  • the enzyme was eluted with a concentration gradient to obtain an active fraction.
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 15% (w / v) glycerol.
  • the enzyme solution after dialysis was used as purified MluGSHA in subsequent experiments.
  • Example 7 Expression of ⁇ -Glu-Val synthase (CglGSHA) derived from Corynebacterium glutamicum K051 by Escherichia coli (1) ⁇ -Glu-Val synthetase expressing strain derived from Corynebacterium glutamicum K051 Construction An expression plasmid pET-CglgshA for the CglgshA gene (SEQ ID NO: 17) encoding ⁇ -Glu-Val synthase of Corynebacterium glutamicum K051 strain (ATCC 13032) was constructed by the following procedure.
  • the ORF region of SEQ ID NO: 17 contains an XhoI recognition site. Therefore, a full-length ORF region in which the XhoI recognition site was deleted (ctcgag at positions 145 to 150 in SEQ ID NO: 17 was replaced with ctggag) was obtained by a two-step PCR reaction.
  • the genomic DNA of Corynebacterium glutamicum K051 was used as a template, and KOD-plus- (Toyobo) was used as a polymerase, following the manufacturer's protocol for 30 seconds at 98 ° C and 1 at 67 ° C.
  • PCR was performed for 30 cycles under the condition of min, and the ORF region of about 1.2 kb was divided into an upstream part and a downstream part and amplified.
  • primers a combination of primers of SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 was used for amplification of the upstream portion, and a combination of primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 was used for amplification of the downstream portion.
  • the obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target DNA fragment of about 160b and about 1.0 kb was excised.
  • the second step PCR was performed under the same PCR conditions as the first step PCR, and the ORF region of about 1.2 kb lacking the XhoI recognition site Full length was amplified.
  • the combination of the primer of sequence number 18 and sequence number 21 was used.
  • the target DNA of about 1.2 kb was excised by agarose gel electrophoresis, and then digested with NdeI / XhoI in advance and ligation convenience kit (Nippon Gene)
  • the product was connected using Escherichia coli JM109 strain was transformed with the reaction solution, applied to an LB agar medium containing 100 mg / L Amp, and cultured at 30 ° C. overnight.
  • a plasmid is extracted from the grown colonies of the transformant according to a known method, the base sequence is confirmed using 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), and the plasmid with the desired structure is named pET-CglgshA It was.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the obtained pET-CglgshA to obtain a transformant having pET-CglgshA.
  • This transformant was named Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-CglgshA.
  • the nucleotide sequence of the CglgshA gene and the amino acid sequence encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 22, respectively.
  • CglGSHA is expressed in a form in which a His tag is added to the C-terminus.
  • Bacteria are collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), then washed with 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and a cell suspension is prepared using 300 mM NaCl and eluent A. did.
  • the bacterial cell suspension was subjected to ultrasonic disruption to disrupt the bacterial cells, centrifuged (29,100 g, 20 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent A in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 15% (w / v) glycerol.
  • the enzyme solution after dialysis was used in the subsequent experiments as purified CglGSHA.
  • Example 8 Purification of GSH1 derived from C-terminal His-tagged recombinant Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ScGSH1) GSH1 gene (ScGSH1 gene encoding Saccharomyces cerevisiae S288C strain (ATCC 26108)) (ScGSH1 gene; SEQ ID NO: The expression plasmid pET-ScGSH1 of 23) was constructed by the method described in JP 2012-85637 A. Subsequently, Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with pET-ScGSH1 to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-ScGSH1.
  • ScGSH1 The base sequence of the ScGSH1 gene and the amino acid sequence of ScGSH1 encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24, respectively. According to pET-ScGSH1, ScGSH1 is expressed in a form in which a His tag is added to the C-terminus.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-ScGSH1 was cultured overnight at 30 ° C. on an LB agar medium containing 100 mg / L Amp.
  • the obtained cells were inoculated into 50 ml of LB medium and cultured in a 500 ml Sakaguchi flask at 37 ° C. and 110 reciprocations / min for 16 hours.
  • 2 ml was inoculated into a Sakaguchi flask containing 100 ml of LB medium.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent C in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was dialyzed against Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl and 15% (w / v) glycerol.
  • the enzyme solution after dialysis was used in the subsequent experiments as purified ScGSH1.
  • Example 9 Purification of GSHA derived from N-terminal His-tagged recombinant Escherichia coli K-12 W3110 strain (EcGSHA) gshA gene encoding glutamic acid-cysteine ligase of Escherichia coli K-12 W3110 strain (ATCC 27325) An expression plasmid pQE-EcgshA of (EcgshA gene; SEQ ID NO: 25) was constructed by the method described in JP 2012-85637 A.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with pQE-EcgshA to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) / pQE-EcgshA.
  • the nucleotide sequence of the EcgshA gene and the amino acid sequence of EcGSHA encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26, respectively.
  • EcGSHA is expressed in a form in which a His tag is added to the N-terminus.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) / pQE-EcgshA was cultured in the same manner as in JP 2012-85637. Bacteria are collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), then washed with eluent C (300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM imidazole), and eluent C is used. A cell suspension was prepared. The bacterial cell suspension was subjected to ultrasonic disruption to disrupt the bacterial cells, centrifuged (29,100 g, 20 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • eluent C 300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7.6) containing 10 mM imidazole
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent C in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.6).
  • the enzyme solution after dialysis was used as purified EcGSHA in subsequent experiments.
  • GSHB GSHB
  • Escherichia coli K-12 W3110 strain gshB gene encoding glutathione synthetase of Escherichia coli K-12 W3110 strain (ATCC 27325) The expression plasmid pET-EcgshB of EcgshB gene; SEQ ID NO: 27 was constructed by the method described in JP 2012-85637 A. Subsequently, Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with pET-EcgshB to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-EcgshB.
  • EcgshB The nucleotide sequence of the EcgshB gene and the amino acid sequence of EcGSHB encoded thereby are shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28, respectively. According to pET-EcgshB, EcgshB is expressed in a form in which a His tag is added to the C-terminus.
  • This strain was cultured in the same manner as in JP 2012-85637.
  • the cells were collected by centrifugation (12,000 g, 5 minutes), washed with eluent C, and then a cell suspension was prepared using eluent C.
  • the bacterial cell suspension was subjected to ultrasonic disruption to disrupt the bacterial cells, centrifuged (29,100 g, 20 minutes), and the resulting supernatant was used as a cell-free extract.
  • the obtained cell-free extract was applied to a HisTALON 5 ml column (Clontech) equilibrated with eluent C in advance, and the enzyme was eluted with a linear concentration gradient of 10-150 mM imidazole to obtain an active fraction. .
  • the obtained active fraction was dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.6).
  • the enzyme solution after dialysis was used as purified EcGSHB in subsequent experiments.
  • ⁇ Measurement of ⁇ -Glu-Val synthesis activity ⁇ Measurement of ⁇ -Glu-Val synthesis activity> Appropriate amount of each purified GSHA in the reaction solution 2 described in Example 4 (100 mmol / L Tris-HCl buffer, 10 mmol / L Glu, 10 mmol / L Val, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L magnesium sulfate, pH 9.0) The mixture was added and reacted at 30 ° C. for 30 minutes. After the reaction, ⁇ -Glu-Val was quantified in the same procedure as in Example 1. In Example 11, the enzyme activity for producing 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Val per minute under the present conditions was defined as 1 U of ⁇ -Glu-Val synthesis activity.
  • ⁇ Measurement of ⁇ -Glu-Gly synthetic activity Appropriate amounts of each purified GSHA were added to reaction solution 3 (100 mmol / L Tris-HCl buffer, 10 mmol / L Glu, 10 mmol / L Gly, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L magnesium sulfate, pH 9.0) at 30 ° C. The reaction was performed for 30 minutes. After completion of the reaction, ⁇ -Glu-Gly was quantified by HPLC. In Example 11, the enzymatic activity for producing 1 ⁇ mol of ⁇ -Glu-Gly per minute under these conditions was defined as 1 U of ⁇ -Glu-Gly synthetic activity.
  • Quantitative conditions for ⁇ -Glu-Gly are as follows.
  • Inertsil® ODS-3 particle size: 5 microns, inner diameter: 4.6 mm, length: 250 mm
  • a liquid (30 mM potassium dihydrogen phosphate, 10 mM sodium octane sulfonate (pH 2.0, pH adjusted with phosphoric acid)) and B liquid (acetonitrile) were 85:15 (v / v).
  • a mixed solution mixed at a ratio was used.
  • the column temperature was 40 ° C. and the UV detection wavelength was 210 nm.
  • Example 12 Production of ⁇ -glutamyl tripeptide from amino acids using each purified GSHA and purified EcGSHB
  • Each purified GSHA (ScGSH1, EcGSHA, KroGSHA, KrhGSHA, MluGSHA, CglGSHA) obtained in Examples 4 to 9
  • ⁇ -glutamyl tripeptide such as ⁇ -Glu-Val-Gly (CAS 38837-70-6, also called Gluvalicine) from amino acids was examined.
  • the structural formula of ⁇ -Glu-Val-Gly is shown in the following formula (I).
  • Reaction solution 4 (50 mmol / L Tris-HCl buffer, 100 mmol / L Glu, 100 mmol / L Val, 100 mmol / L Gly, 10 mmol / L ATP, 10 mmol / L magnesium sulfate, 240 mmol / L phosphoenolpyruvate, 20000 U /
  • Each purified GSHA and purified EcGSHB were added to L pyruvate kinase, pH 8.5), and the reaction was carried out at 30 ° C.
  • reaction mixture 4 was 0.2 g / l for purified EcGSHA, 0.1 g / l for purified KroGSHA and purified MluGSHA, 1 g / l for purified KrhGSHA and purified CglGSHA, and 0.4 g / l for purified GSHB. Added to.
  • ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Val-Gly were determined in the same manner as in the determination of ⁇ -Glu-Val in Example 1, and the same as the determination of ⁇ -Glu-Gly in Example 11.
  • ⁇ -Glu-Gly and ⁇ -Glu-Gly-Gly were analyzed by the method described above, and the production amounts of these components were calculated. The results are shown in Table 3.
  • ⁇ -Glu-Val synthase of the present invention catalyzes a ⁇ -Glu-Val production reaction using Val selectively as a substrate. Therefore, according to the present invention, using the ⁇ -Glu-Val synthase of the present invention, ⁇ -Glu-Val can be efficiently produced using Glu and Val as raw materials, and ⁇ -Glu-Val and ⁇ -Glu-Val-Gly can be produced using Gly as a raw material. Further, according to the present invention, ⁇ -Glu-Val-Gly can be efficiently produced using Glu, Val, and Gly as raw materials, using the ⁇ -Glu-Val synthase of the present invention.
  • SEQ ID NO: 1 N-terminal amino acid sequence of KroGSHA protein of cochlear rosea (AJ3132)
  • SEQ ID NO: 2 Internal amino acid sequence of KroGSHA protein of cochlear rosea (AJ3132)
  • SEQ ID NO: 3 Base of KrogshA gene of cochlear rosea (AJ3132)
  • SEQ ID NOs: 4 Base of KrogshA gene of cochlear rosea (AJ3132) SEQ ID NOs: 4, 5: Primer SEQ ID NO: 6: Amino acid sequence of KroGSHA protein of Cochlear Rosea (AJ3132)
  • SEQ ID NO: 7 Nucleotide sequence of KrhgshA gene of Cochlear Rhizophylla DC2201 strain
  • SEQ ID NO: 8 9: Primer SEQ ID NO: 10: Amino acid sequence of KrhGSHA protein of Koklia lysophila DC2201 strain
  • SEQ ID NO: 11 Nucleotide sequence of Mlug

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Abstract

γ-Glu-Valを生成するのに好適なγ-Glu-Val合成酵素、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。コクリア・ロゼア（AJ3132）のγ-Glu-Val合成酵素等の、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上であるγ-Glu-Val合成酵素を利用して、Glu、Val、及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する。

Description

γ－グルタミルバリン合成酵素、及び、γ－グルタミルバリルグリシンの製造法
　本発明は、γ－グルタミルバリン合成酵素（γ-Glu-Val合成酵素）、及びそれを用いたγ－グルタミルバリルグリシンの製造法に関する。γ－グルタミルバリルグリシンは、食品及び医薬品等の分野で有用である。
　γ－グルタミルバリルグリシン（L-γ-glutamyl-L-valyl-glycine；以下、「γ-Glu-Val-Gly」ともいう。）のようなある種のペプチドは、カルシウム受容体活性化作用を有している（特許文献１）。このようなカルシウム受容体活性化作用を有するペプチドは、飲食品にコク味を付与できること（特許文献２）、低脂肪食品の呈味、特に脂肪様濃厚感及び滑らかさ、を改善できること（特許文献３）、及び、甘味物質のボディー感を改善し、甘味物質特有の苦味を改善できること（特許文献４）が知られている。
　また、前記のようなペプチドは、下痢（特許文献５）、糖尿病（特許文献６）の予防又は治療効果、及び、消化管の重炭酸分泌促進効果（特許文献７）を有することが知られている。
　一般に、γ－グルタミルトリペプチドの製造法としては、化学合成法および酵素法が知られている。化学合成法としては、N-保護グルタミン酸無水物を利用して、ジペプチドから選択的にγ－グルタミルトリペプチドを得る方法が知られている（特許文献８）。酵素法としては、グルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）およびグルタチオン合成酵素（GSHB）を利用する方法が知られている（特許文献９、１０）。また、酵素法としては、γ－グルタミルトランスフェラーゼを利用し、Val-Glyをγ－グルタミル化してγ-Glu-Val-Glyを生成する方法も知られている（特許文献１１）。
　グルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）は、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.2）として知られている。GSHAは、通常、酵素反応にMg2+やMn2+等の２価の金属イオンを要求する。
　エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のGSHAは、Mg2+またはMn2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ－グルタミルジペプチドを生成するが、補因子となる金属イオンの種類が基質特異性に影響することが知られている（非特許文献１）。具体的には、Mg2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 251 mol/mg/hr, Km = 17.6 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 59 mol/mg/hr, Km = 27.1 mMであると報告されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mg2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.15と算出できる。一方、Mn2+を補因子とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は、Vmax = 39 mol/mg/hr, Km = 1.7 mMであるのに対して、γ-Glu-Val生成活性は、Vmax = 95 mol/mg/hr, Km = 21 mMであると示されている。すなわち、Vmax/Kmを活性の指標として比較すれば、Mn2+を補因子とした場合のγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.20と算出できる。また、エシェリヒア・コリ由来GSHAの基質特異性に関しては、他の活性測定例も挙げることができる（非特許文献２）。同文献では、Mg2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質として反応を行い、γ-Glu-Gly生成活性を100%とした場合には、γ-Glu-Val生成活性は52%程度であると報告されている。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.52と算出できる。このように、エシェリヒア・コリのGSHAのγ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.15～0.5程度であると言える。
　また、グラム陰性細菌の１種であるプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）由来のGSHAは、Mg2+またはMn2+を補因子とし、Gluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ-グルタミルジペプチドを生成することが知られている（非特許文献３）。プロテウス・ミラビリス由来のGSHAについて、γ-Glu-Cys生成活性を100%とした場合には、γ-Glu-Gly生成活性は14.5%、γ-Glu-Val生成活性は7.2%であると報告されている。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.50と算出できる。
　また、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）由来のγ-glutamylcysteine synthetase-glutatione synthetase（γ-GCS-GS）は、Mg2+の存在下でGluと各種のアミノ酸およびATPを基質としてγ－グルタミルジペプチドを生成することが知られている。ストレプトコッカス・アガラクチア由来のγ-GCS-GSについて、γ-Glu-Gly生成活性を100%とした場合に、γ-Glu-Val生成活性は21%程度であると報告されている（非特許文献２）。すなわち、これら相対活性に基づいて比較をすれば、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率は0.21と算出できる。
　また、ミクロコッカス・グルタミカス（Micrococcus glutamicus）の培養液を各種カラムにかけペプチド等を分離し、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Val、γ-Glu-Leuを単離したと報告されている（非特許文献５）。しかしながら、これらγ－グルタミルジペプチドの生合成経路については報告されていない。
　このように、γ-Glu-Val生成についての知見はいくつかあるものの、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率が約0.5よりも大きいγ-Glu-Val生成活性を有するタンパク質についての報告例は見当たらない。
WO2007/055388 WO2007/055393 WO2008/139945 WO2008/139946 WO2008/139947 WO2009/107660 WO2009/119554 特開平08-119916 WO2013/054447 特開2012-85637 WO2013/051685
Brenda S. Kelly et al., J. Biol. Chem., 277, 50-58, 2002 Kino, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 352, 351-359, 2007 Kumagai, H. et al., Agric. Biol. Chem., 46, 1301-1309, 1982 Ronald A. Vitali et al., J. Biol. Chem., 240, 2508‐2511, 1965
　グルタミン酸－システインリガーゼ（GSHA）は、生体内において、グルタチオンの前駆体であるγ-Glu-Cysを生成する役割を担っている。GSHAは、Cys以外にも種々のアミノ酸を基質として利用し得るが、通常、Cysと比較して、分岐鎖アミノ酸の1種であるValを基質とする活性が相対的に低い。そのため、GSHAおよびグルタチオン合成酵素（GSHB）を利用し、Glu、Val、Glyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する場合、γ-Glu-Val-Glyの収量が低いという問題がある。そこで、本発明は、γ-Glu-Valを生成するのに好適なγ-Glu-Val生成活性を有するタンパク質（γ-Glu-Val合成酵素）、及びそれを用いたγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、γ-Glu-Gly生成活性に対するγ-Glu-Val生成活性の比率が高いγ-Glu-Val生成活性を有するタンパク質（γ-Glu-Val合成酵素）を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下のとおり例示できる。
［１］
　下記工程（Ａ）を含む、γ-Glu-Valおよび／またはその塩の製造法：
（Ａ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程：
（ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［２］
　下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ａ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程；および
（Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程：
（ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［３］
　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程：
（ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［４］
　前記タンパク質におけるγ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、前記方法。
［５］
　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
（Ｃ）γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上であるγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
［６］
　前記タンパク質が、精製酵素である、前記方法。
［７］
　前記タンパク質が、固定化酵素である、前記方法。
［８］
　前記タンパク質が、該タンパク質を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［９］
　前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１０］
　前記タンパク質およびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、前記方法。
［１１］
　前記微生物が、γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記方法。
［１２］
　前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記方法。
［１３］
　前記工程がATPの存在下で実施される、前記方法。
［１４］
　下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質：
（ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［１５］
　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、前記タンパク質。
［１６］
　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
［１７］
　前記タンパク質をコードする遺伝子。
［１８］
　前記遺伝子を搭載するベクター。
［１９］
　前記遺伝子または前記ベクターを有する微生物。
［２０］
　γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、前記微生物。
［２１］
　グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、前記微生物。
［２２］
　エシェリヒア・コリである、前記微生物。
γ-Glu-Gly合成活性に対するγ-Glu-Val合成活性の比率（B）/（A）と、反応開始１時間後におけるγ-Glu-Glyとγ-Glu-Gly-Glyの和に対するγ-Glu-Valとγ-Glu-Val-Glyの和の比率（D）/（C）との相関図。
　以下、本発明を詳細に説明する。尚、本明細書において、アミノ酸は特記しない限りＬ－体である。
＜１＞γ－グルタミルバリン合成酵素（γ-Glu-Val合成酵素）
　本発明において、「γ－グルタミルバリン合成酵素（γ-glutamylvaline synthethase）（γ-Glu-Val合成酵素（γ-Glu-Val synthethase））」とは、GluとValとATPを基質として、γ-Glu-ValとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。同活性を、「γ－グルタミルバリン合成酵素活性」または「γ-Glu-Val生成（合成）活性」ともいう。
　また、本発明において、GluとGlyとATPを基質として、γ-Glu-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルグリシン合成酵素（γ-glutamylglycine synthethase）活性」または「γ-Glu-Gly生成（合成）活性」ともいう。
　また、本発明において、GluとCysとATPを基質として、γ-Glu-CysとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルシステイン合成酵素（γ-glutamylcysteine synthetase）活性」ともいう。
　本発明において、γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、γ－グルタミルバリン以外のγ－グルタミルジペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルシステイン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。また、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性を有さないのが好ましい。
　γ－グルタミルバリン合成酵素においては、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率が高いのが好ましい。γ－グルタミルバリン合成酵素においては、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率は、例えば、２．０以上、５．０以上、１０以上、１５以上、または２０以上であってよい。また、γ－グルタミルバリン合成酵素においては、γ－グルタミルグリシン合成酵素活性（比活性）に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）の比率は、例えば、１００以下、または５０以下であってよい。
　比活性の比率は、実施例１１に記載の条件でγ－グルタミルグリシン合成酵素活性およびγ－グルタミルグリシン合成酵素活性を測定し、算出できる。具体的な活性測定条件は以下の通りである。γ－グルタミルバリン合成酵素のγ－グルタミルバリン合成酵素活性は、反応液（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、10mmol/L Glu、10mmol/L Val、10mmol/L ATP、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH9.0）に適切な量のγ－グルタミルバリン合成酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Val量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルバリン合成酵素活性とする。同様に、γ－グルタミルバリン合成酵素のγ－グルタミルグリシン合成酵素活性は、反応液（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、10mmol/L Glu、10mmol/L Gly、10mmol/L ATP、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH9.0）に適切な量のγ－グルタミルバリン合成酵素を添加し、30℃で30分間反応を行い、生成したγ-Glu-Gly量に基づいて測定することができる。本発明においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルグリシン合成酵素活性とする。
　また、特に、γ－グルタミルバリン合成酵素活性（比活性）が高いγ－グルタミルグリシン合成酵素を利用することにより、GluおよびValを原料としてγ－グルタミルバリンを効率的に生産できると期待される。
　γ－グルタミルバリン合成酵素としては、例えば、コクリア（Kocuria）属細菌、ミクロコッカス（Micrococcus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌のγ－グルタミルバリン合成酵素が挙げられる。コクリア属細菌としては、コクリア・ロゼア（Kocuria rosea）やコクリア・リゾフィラ（Kocuria rhizophila）が挙げられる。ミクロコッカス属細菌としては、ミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）が挙げられる。コリネバクテリウム属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が挙げられる。すなわち、γ－グルタミルバリン合成酵素は、例えば、このような細菌に由来するタンパク質であってよい。
　コクリア・ロゼア（AJ3132）のγ－グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号６および３に示す。コクリア・リゾフィラDC2201株（ATCC 9341）のγ－グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号１０および７に示す。ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株（ATCC 15307）のγ－グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号１６および１１に示す。コリネバクテリウム・グルタミカムK051株（ATCC 13032）のγ－グルタミルバリン合成酵素のアミノ酸配列、およびそれをコードする遺伝子の塩基配列を、それぞれ、配列番号２２および１７に示す。すなわち、γ－グルタミルバリン合成酵素は、例えば、配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、γ－グルタミルバリン合成酵素は、例えば、配列番号３、７、１１、または１７に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」場合および当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合を包含する。
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、元の機能が維持されている限り、上記例示したγ－グルタミルバリン合成酵素（例えば、配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。同様に、γ－グルタミルバリン合成酵素をコードする遺伝子（「γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子」ともいう）は、元の機能が維持されている限り、上記例示したγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子（例えば、配列番号３、７、１１、または１７に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。なお、このような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したγ－グルタミルバリン合成酵素やそれをコードする遺伝子のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
　「元の機能が維持されている」とは、遺伝子やタンパク質のバリアントが、元の遺伝子やタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。すなわち、「元の機能が維持されている」とは、γ－グルタミルバリン合成酵素にあっては、タンパク質のバリアントが、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有することをいう。また、「元の機能が維持されている」とは、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子にあっては、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質（すなわちγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質）をコードすることをいう。
　γ－グルタミルバリン合成酵素のホモログとしては、例えば、上記アミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから取得されるタンパク質が挙げられる。また、上記γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子のホモログは、例えば、各種微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）において、１若しくは数個の位置での１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。なお上記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。
　上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、タンパク質が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
　また、γ－グルタミルバリン合成酵素は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　また、γ－グルタミルバリン合成酵素は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号３、７、１１、または１７に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAにコードされるタンパク質であってもよい。そのようなプローブは、例えば、上記塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1％ SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。また、例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1％ SDSが挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、上記のようなγ－グルタミルバリン合成酵素の内、そのアミノ酸配列またはそれをコードする遺伝子の塩基配列が本発明の出願時に公知であるものを除いたものであってもよい。
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。「他のペプチド」は、γ－グルタミルバリン合成酵素がγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有する限り、特に制限されない。「他のペプチド」は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。「他のペプチド」としては、ペプチドタグ、シグナルペプチド、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。「他のペプチド」は、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素のＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。「他のペプチド」としては、１種のペプチドを用いてもよく、２種またはそれ以上のペプチドを組み合わせて用いてもよい。
　ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペプチドタグは、例えば、発現したγ－グルタミルバリン合成酵素の検出や精製に利用できる。
　シグナルペプチドは、γ－グルタミルバリン合成酵素を発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが挙げられる。Tat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。シグナルペプチドは、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素の分泌生産に利用できる。シグナルペプチドを利用してγ－グルタミルバリン合成酵素を分泌生産する場合、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有さないγ－グルタミルバリン合成酵素が菌体外に分泌され得る。
　プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現したγ－グルタミルバリン合成酵素の切断に利用できる。具体的には、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素をペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、γ－グルタミルバリン合成酵素とペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現したγ－グルタミルバリン合成酵素からプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有さないγ－グルタミルバリン合成酵素を得ることができる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、上記例示したγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子またはその保存的バリアントの塩基配列において、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。具体的には、例えば、開始コドンがATG以外である場合に、開始コドンをATGに改変することができる。
　なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、ＤＮＡに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子」とは、γ－グルタミルバリン合成酵素をコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、その組み合わせであってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、一本鎖ＤＮＡであってもよく、一本鎖ＲＮＡであってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、二本鎖ＤＮＡであってもよく、二本鎖ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、ＤＮＡ残基とＲＮＡ残基の両方を含んでいてもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子がＲＮＡを含む場合、上記例示した塩基配列等のＤＮＡに関する記載は、ＲＮＡに合わせて適宜読み替えてよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。
＜２＞γ－グルタミルバリン合成酵素の製造
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主にγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を、γ－グルタミルバリン合成酵素を有する宿主ともいう。また、γ－グルタミルバリン合成酵素は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主は、本来的にγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するものであってもよく、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。
　本来的にγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主としては、上記のような各γ－グルタミルバリン合成酵素が由来する細菌、例えば、コクリア・ロゼア（AJ3132）、コクリア・リゾフィラDC2201株（ATCC 9341）、ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株（ATCC 15307）、コリネバクテリウム・グルタミカムK051株（ATCC 13032）、が挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有するように改変された宿主としては、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子が導入された宿主が挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を導入する宿主は、機能するγ－グルタミルバリン合成酵素を発現できるものであれば特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌、放線菌、酵母、真菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、細菌や酵母等の微生物が挙げられる。より好ましい宿主としては、細菌が挙げられる。細菌としては、グラム陰性細菌やグラム陽性細菌が挙げられる。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、エンテロバクター（Enterobacter）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌等の腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌が挙げられる。グラム陽性細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌等のコリネ型細菌が挙げられる。宿主としては、中でも、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）を好適に用いることができる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する生物からのクローニングにより取得できる。クローニングには、同遺伝子を含むゲノムDNAやcDNA等の核酸を利用できる。また、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、化学合成によっても取得できる（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。
　また、取得したγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を適宜改変してそのバリアントを取得することもできる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を宿主に導入する手法は特に制限されない。宿主において、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、当該宿主で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。宿主において、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。宿主は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を１コピーのみ有していてもよく、２またはそれ以上のコピーで有していてもよい。宿主は、１種類のγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子のみを有していてもよく、２またはそれ以上の種類のγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有していてもよい。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターは、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のプロモーターよりも強力なプロモーターであってもよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において機能する強力なプロモーターとしては、例えば、T7プロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌において機能する強力なプロモーターとしては、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（（EF-Tu））プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、プロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得し利用してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第００／１８９３５号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
　また、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、例えば、同遺伝子を含むベクターを用いて宿主に導入することができる。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を含むベクターを、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターまたは組み換えベクターともいう。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターは、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片を宿主で機能するベクターと連結することにより、構築することができる。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同ベクターが導入された形質転換体が得られる、すなわち、同遺伝子を宿主に導入することができる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、ベクターは、形質転換体を選択するために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。発現ベクターの構築の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子をそのままベクターに組み込んでもよく、γ－グルタミルバリン合成酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してからベクターに組み込んでもよく、ベクター上にもともと備わっているプロモーターの下流にγ－グルタミルバリン合成酵素のコード領域を組み込んでもよい。
　各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８　遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
　また、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、例えば、宿主の染色体上へ導入することができる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、本発明の実施に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。染色体への遺伝子の導入の際には、例えば、固有のプロモーター領域を含むγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子をそのまま染色体に組み込んでもよく、γ－グルタミルバリン合成酵素のコード領域を上記のようなプロモーターの下流に結合してから染色体に組み込んでもよく、染色体上にもともと存在するプロモーターの下流にγ－グルタミルバリン合成酵素のコード領域を組み込んでもよい。
　染色体上に遺伝子が導入されたことは、例えば、同遺伝子の全部又は一部と相補的な塩基配列を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、または同遺伝子の塩基配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCRによって確認できる。
　形質転換法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。形質転換法としては、例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）などが挙げられる。また、形質転換法としては、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。また、形質転換法としては、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791号公報）を利用することもできる。
　また、本来的にγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現が増大するよう改変してもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の発現を増大させる手法としては、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子のコピー数を増加させることやγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の転写効率を向上させることが挙げられる。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子のコピー数の増加は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を宿主に導入することにより達成できる。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の導入は、上述したように実施できる。なお、導入されるγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子は、同種由来であってもよく、異種由来であってもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の転写効率の向上は、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。より強力なプロモーターとしては上述したような強力なプロモーターが挙げられる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主は、γ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。γ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質としては、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）が挙げられる。GGTの活性が低下することにより、γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyの分解を抑制することが出来る。GGTの活性は、GGTをコードするggt遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。一例として、エシェリヒア・コリのggt遺伝子の塩基配列及び同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２９及び３０に示す。
　以下、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
　「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株と比較して減少することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が含まれる。
　遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１～２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515 (1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839 (1991)）。
　また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
　染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
　また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
　なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
　タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
　遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT－PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
　遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を培養することにより、γ－グルタミルバリン合成酵素を発現させることができる。その際、必要に応じて、遺伝子の発現誘導を行う。宿主の培養条件や遺伝子の発現誘導の条件は、マーカーの種類、プロモーターの種類、および宿主の種類等の諸条件に応じて適宜選択すればよい。培養に用いる培地は、宿主が増殖でき、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素を発現できるものであれば特に制限されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。
　炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロース、糖蜜、でんぷんの加水分解物等の糖類、グリセロール、エタノール等のアルコール類、フマル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類が挙げられる。
　窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水が挙げられる。
　イオウ源としては、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、次亜硫酸塩、チオ硫酸塩等の無機硫黄化合物が挙げられる、
　無機イオンとしては、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、カリウムイオン、鉄イオン、リン酸イオンが挙げられる。
　その他の有機成分としては、有機微量栄養源が挙げられる。有機微量栄養源としては、ビタミンB1などの要求物質や、それらを含む酵母エキス等が挙げられる。
　培養温度は、例えば、20℃～45℃、好ましくは24℃～45℃であってよい。培養は、通気培養が好ましい。その際の酸素濃度は、例えば、飽和濃度に対して5～50%に、好ましくは10%程度に調節してよい。培養中のpHは、5～9が好ましい。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、例えば炭酸カルシウム、アンモニアガス、アンモニア水等、を使用することができる。
　上記のような条件下で、好ましくは10時間～120時間程度培養することにより、γ－グルタミルバリン合成酵素を含む培養物が得られる。γ－グルタミルバリン合成酵素は、例えば、宿主の菌体内に蓄積し得る。「菌体」は、宿主の種類に応じて、適宜「細胞」と読み替えてよい。尚、使用する宿主及びγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の設計によっては、ペリプラズムにγ－グルタミルバリン合成酵素を蓄積させることや、菌体外にγ－グルタミルバリン合成酵素を分泌生産させることも可能である。
　γ－グルタミルバリン合成酵素は、菌体等に含まれたまま使用してもよく、適宜、菌体等から分離精製し粗酵素画分又は精製酵素として使用してもよい。
　すなわち、例えば、宿主の菌体内にγ－グルタミルバリン合成酵素が蓄積する場合、適宜、菌体を破砕、溶解、または抽出等し、γ－グルタミルバリン合成酵素を回収することができる。菌体は、遠心分離等により培養物から回収することができる。細胞の破砕、溶解、または抽出等は、公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、例えば、超音波破砕法、ダイノミル法、ビーズ破砕、フレンチプレス破砕、リゾチーム処理が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。また、例えば、培地にγ－グルタミルバリン合成酵素が蓄積する場合、遠心分離等により培養上清を取得し、培養上清からγ－グルタミルバリン合成酵素を回収することができる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素の精製は、酵素の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えば、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点沈殿が挙げられる。これらの方法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素の精製は、所望の程度に行うことができる。例えば、GGT等のγ－グルタミルペプチドの分解に関与する成分がγ－グルタミルバリン合成酵素と共存している場合には、そのような成分を除去するのが好ましい。
　精製されたγ－グルタミルバリン合成酵素は、本発明の方法における「γ－グルタミルバリン合成酵素」として利用できる。γ－グルタミルバリン合成酵素は、遊離の状態で利用されてもよいし、樹脂等の固相に固定化された固定化酵素の状態で利用されてもよい。
　また、精製されたγ－グルタミルバリン合成酵素に限られず、γ－グルタミルバリン合成酵素を含有する任意の画分を本発明の方法における「γ－グルタミルバリン合成酵素」として利用してもよい。γ－グルタミルバリン合成酵素を含有する画分は、γ－グルタミルバリン合成酵素がGluおよびValに作用できるように含有される限り特に制限されない。そのような画分としては、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主（γ－グルタミルバリン合成酵素を有する宿主）の培養物、同培養物から回収した菌体（培養菌体）、同菌体の破砕物、同菌体の溶解物、同菌体の抽出物（無細胞抽出液）、同菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体等の菌体処理物、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、いずれも、単独で利用されてもよいし、精製されたγ－グルタミルバリン合成酵素と共に利用されてもよい。
＜３＞グルタチオン合成酵素およびその製造
　「グルタチオン合成酵素（glutathione synthase）」は、通常、γ-Glu-CysとGlyとATPを基質として、グルタチオン（γ-Glu-Cys-Gly）とADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を有する酵素（EC 6.3.2.3）として知られている。本発明において、同活性を、「グルタチオン合成酵素活性」ともいう。
　また、本発明において、γ-Glu-ValとGlyとATPを基質として、γ-Glu-Val-GlyとADPとリン酸を生成する反応を触媒する活性を、「γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素（gamma-Glutamylvalylglycine synthethase）活性」または「γ-Glu-Val-Gly生成（合成）活性」ともいう。
　本発明において、グルタチオン合成酵素としては、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するものを用いる。すなわち、本発明において、「グルタチオン合成酵素」とは、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有するタンパク質をいう。
　本発明において、グルタチオン合成酵素は、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、γ－グルタミルバリルグリシン以外のγ－グルタミルトリペプチドを生成する活性を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、例えば、グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素活性を有していてもよく、有していなくてもよい。
　グルタチオン合成酵素のγ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性は、例えば、反応液組成を12.5 mMγ-Glu-Val、12.5 mM Gly、12.5 mM ATP、12.5 mM MgS04、2 mMジチオスレイトール、100 mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0)、反応温度37℃、反応時間1分～50時間として、適切な量のグルタチオン合成酵素を用いて測定することができる。本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Val-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性とする。
　グルタチオン合成酵素としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のgshB遺伝子によりコードされるGshBタンパク質やサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のGSH2遺伝子によりコードされるGsh2タンパク質が挙げられる。また、グルタチオン合成酵素としては、WO2013/054447に記載の変異型グルタチオン合成酵素も挙げられる。エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のgshB遺伝子の塩基配列は、GenBank accession NC_000913.3としてNCBIデータベースに登録されているゲノム配列中の3,089,900～3,090,850位の配列に相当する。MG1655株（エシェリヒア・コリK-12 W3110株においても同一）のgshB遺伝子の塩基配列を配列番号２７に示す。また、同遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２８に示す。すなわち、グルタチオン合成酵素は、例えば、配列番号２７に示す塩基配列を有する遺伝子にコードされるタンパク質であってよい。また、グルタチオン合成酵素は、例えば、配列番号２８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。グルタチオン合成酵素は、γ－グルタミルバリルグリシン合成酵素活性を有する限り、上記グルタチオン合成酵素のバリアントであってもよい。バリアントについては、上述したγ－グルタミルバリン合成酵素のバリアントに関する記載を準用できる。グルタチオン合成酵素は、他のペプチドとの融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質については、上述したγ－グルタミルバリン合成酵素における融合タンパク質に関する記載を準用できる。
　グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子（「グルタチオン合成酵素遺伝子」ともいう）を有する宿主にグルタチオン合成酵素遺伝子を発現させることにより製造できる。なお、グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を、グルタチオン合成酵素を有する宿主ともいう。グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主は、本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有するものであってもよく、グルタチオン合成酵素遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主としては、上記gshB遺伝子を有するエシェリヒア・コリや上記GSH2遺伝子を有するサッカロマイセス・セレビシエ等の微生物が挙げられる。グルタチオン合成酵素遺伝子を有するように改変された宿主としては、グルタチオン合成酵素遺伝子が導入された宿主が挙げられる。また、本来的にグルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を、グルタチオン合成酵素遺伝子の発現が増大するよう改変してもよい。グルタチオン合成酵素遺伝子の導入等の宿主の改変については、上述したγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の導入等の宿主の改変に関する記載を準用できる。グルタチオン合成酵素遺伝子を発現するための宿主は、γ－グルタミルトランスフェラーゼ（GGT）等のγ－グルタミルペプチドの分解に関与するタンパク質の活性が低下するように改変されていてもよい。また、グルタチオン合成酵素は、グルタチオン合成酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させることによっても製造できる。
　グルタチオン合成酵素遺伝子を有する宿主を利用したグルタチオン合成酵素の製造については、上述したγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する宿主を利用したγ－グルタミルバリン合成酵素の製造に関する記載を準用できる。製造されたグルタチオン合成酵素（精製されたグルタチオン合成酵素やグルタチオン合成酵素を含有する画分）は、本発明の方法における「グルタチオン合成酵素」として利用できる。なお、グルタチオン合成酵素は、単独で製造してもよく、γ－グルタミルバリン合成酵素とまとめて製造してもよい。例えば、グルタチオン合成酵素遺伝子とγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子の両方を有する宿主にそれらの遺伝子を発現させることにより、グルタチオン合成酵素とγ－グルタミルバリン合成酵素をまとめて製造することができる。
＜４＞γ－グルタミルバリルグリシン（γ-Glu-Val-Gly）の製造法
　本発明は、γ－グルタミルバリン合成酵素を利用したγ-Glu-Valの製造法やγ－グルタミルバリン合成酵素を利用したγ-Glu-Val-Glyの製造法を提供する。これらの方法を総称して、「本発明の方法」ともいう。
＜４－１＞酵素法
　本発明は、γ－グルタミルバリン合成酵素を利用してγ-Glu-Val-Glyを酵素的に製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）」ともいう。
　本発明においては、γ－グルタミルバリン合成酵素を利用することにより、GluとValとを反応させ、γ-Glu-Valを生成することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）γ－グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、反応液から回収することができる。
　さらに、生成したγ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造することができる。γ-Glu-Valを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造する方法としては、グルタチオン合成酵素を利用する方法が知られている（特開2012-85637）。具体的には、グルタチオン合成酵素を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の一態様（「第１の態様」ともいう）は、（Ａ）γ－グルタミルバリン合成酵素をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　第１の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。反応開始時にγ－グルタミルバリン合成酵素、グルタチオン合成酵素、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることで、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始することができる。また、グルタチオン合成酵素および／またはGlyが反応系に共存していない条件下で工程（Ａ）を開始し、工程（Ａ）の進行中または完了後にグルタチオン合成酵素および／またはGlyを反応系に共存させることで、工程（Ｂ）を開始することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを用いて工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
　なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（酵素法）の工程（Ａ）は、例えば、第１の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
　また、本発明においては、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を利用することにより、GluとValとGlyとを反応させ、γ-Glu-Val-Glyを生成することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（酵素法）の別の態様（「第２の態様」ともいう）は、（Ｃ）γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。第２の態様においては、γ－グルタミルバリン合成酵素、グルタチオン合成酵素、Glu、Val、およびGlyを反応系に共存させることにより、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyにまとめて作用させ、γ-Glu-Val-Glyを製造することができる。
　本発明の方法において、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を総称して「酵素」ともいう。Glu、Val、およびGlyを総称して「アミノ酸」ともいう。γ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyを総称して「ペプチド」ともいう。Glu、Val、Gly、およびγ-Glu-Valを総称して「基質」ともいう。「基質」には、特記しない限り、さらにATPを含めてよい。酵素とそれに対応する基質との反応を「酵素反応」ともいう。
　本発明の方法に用いられる各酵素の態様は上述した通りである。すなわち、各酵素としては、例えば、精製された酵素、酵素を含有する任意の画分、またはそれらの組み合わせを用いることができる。各酵素としては、１種の酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上の酵素を組み合わせて用いてもよい。
　アミノ酸としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。アミノ酸の製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。アミノ酸は、例えば、化学合成、酵素反応、またはその組み合わせにより製造することができる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養し、培養物から当該アミノ酸を回収することにより、製造することができる。アミノ酸の生産能を有する微生物としては、例えば、後述するようなアミノ酸生産菌を利用できる。また、アミノ酸は、例えば、当該アミノ酸を含有する農水畜産物から回収することにより、製造することができる。アミノ酸としては、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、当該アミノ酸を含有する素材を用いてもよい。アミノ酸を含有する素材は、酵素が当該アミノ酸に作用できる態様で当該アミノ酸を含有する限り特に制限されない。アミノ酸を含有する素材として、具体的には、例えば、当該アミノ酸の生産能を有する微生物を培養して得られた培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、それらの濃縮物（濃縮液）や濃縮乾燥物等の処理物が挙げられる。
　本発明の方法において、アミノ酸およびペプチドは、いずれも、特記しない限り、フリー体、もしくはその塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、「アミノ酸」という用語は、特記しない限り、フリー体のアミノ酸、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。また、「ペプチド」という用語は、特記しない限り、フリー体のペプチド、もしくはその塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩は、化学的に許容されるものであれば特に制限されない。また、製造されるγ-Glu-Val-Glyを経口用途（例えば飲食品への添加用途）に用いる場合、γ-Glu-Val-Glyの塩は、化学的に許容される可食性のものであれば特に制限されない。「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、カルボキシル基等の酸性基に対しては、アンモニウム塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アルミニウム塩、亜鉛塩、トリエチルアミン、エタノールアミン、モルホリン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン等の有機アミンとの塩、アルギニン、リジン等の塩基性アミン酸との塩を挙げることができる。また、「化学的に許容される可食性の塩」として、具体的には、例えば、塩基性基に対しては、塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、臭化水素酸等の無機酸との塩、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、コハク酸、タンニン酸、酪酸、ヒベンズ酸、パモ酸、エナント酸、デカン酸、テオクル酸、サリチル酸、乳酸、シュウ酸、マンデル酸、リンゴ酸等の有機カルボン酸との塩、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸等の有機スルホン酸との塩を挙げることができる。塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。
　酵素反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、反応容器内の反応液中で、酵素と基質を混合することにより、酵素反応を実施できる。酵素反応は、静置で実施してもよく、撹拌下で実施してもよい。カラム式の場合は、固定化菌体又は固定化酵素を充填したカラムに基質を含有する反応液を通液することにより、酵素反応を実施できる。反応液としては、必要な成分を含有する、水や緩衝液等を用いることができる。反応液は、例えば、酵素、基質、ATP、２価の金属イオンを含有していてよい。酵素反応に用いられる成分の組み合わせは、実施する工程の種類およびその実施態様（複数の工程を同時に実施するか等）に応じて適宜選択することができる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素は、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系（反応液）は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、粉末あるいは水溶液等の任意の形態で、反応液に添加することができる。また、ATPは、例えば、ATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPを生成または再生する方法としては、コリネバクテリウム属細菌を利用して炭素源からATPを供給させる方法（Hori, H et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48(6): 693-698 (1997)）、酵母菌体とグルコースを利用してATPを再生する方法（Yamamoto, S et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69(4): 784-789 (2005)）、ホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（C. Aug'e and Ch. Gautheron, Tetrahedron Lett. 29：789-790 (1988)）、ポリリン酸とポリリン酸キナーゼを利用してATPを再生する方法（Murata, K et al., Agric. Biol. Chem. 52(6): 1471-1477 (1988)）等が知られている。
　また、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素は、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系（反応液）は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。好ましい２価の金属イオンとしては、Ｍｇ2+やＭｎ2+が挙げられる。２価の金属イオンの濃度は、例えば、１～２００ｍＭであってよい。
　反応条件（反応液のpH、反応温度、反応時間、基質や酵素等の各種成分の濃度等）は、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り特に制限されない。
　反応液のpHは、例えば、通常6.0～10.0、好ましくは6.5～9.0であってよい。
　反応温度は、例えば、通常15～50℃、好ましくは15～45℃、より好ましくは20～40℃であってよい。
　反応時間は、第１の態様の工程（Ａ）および工程（Ｂ）のそれぞれについて、例えば、5分～200時間であってよい。反応時間は、第２の態様の工程（Ｃ）について、例えば、5分～200時間であってよい。反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。
　反応液中の各基質の濃度は、例えば、通常0.1～2000ｍM、好ましくは1～2000ｍM、より好ましくは10～1000ｍMであってよい。
　反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ａ）については、例えば、通常、Glu：Val：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第１の態様の工程（Ｂ）については、例えば、通常、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝1：1：1であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよい。すなわち、例えば、γ-Glu-Val：Gly：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10であってよい。反応液中の各基質のモル比は、第２の態様の工程（Ｃ）については、例えば、通常、Glu：Val：Gly：ATP＝1：1：1：2であってよく、任意の基質の比率を0.1～10に変化させてもよく、ATPの比率を0.2～20に変化させてもよい。すなわち、例えば、Glu：Val：Gly：ATP＝0.1～10：0.1～10：0.1～10：0.2～20であってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様における各基質のモル比については、適宜、第２の態様における各基質のモル比を参考にしてもよい。
　酵素の使用量は、例えば、酵素活性に基づいて設定することができる。γ－グルタミルバリン合成酵素の使用量は、GluおよびValの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。グルタチオン合成酵素の使用量は、第１の態様の工程（Ｂ）については、γ-Glu-ValおよびGlyの合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。グルタチオン合成酵素の使用量は、第２の態様の工程（Ｃ）については、Gluの半量、Valの半量、およびGlyの全量の合計量1 mmolに対して、例えば、γ-Glu-Val-Gly生成活性に換算して、通常0.01～1000 U、好ましくは0.1～500 U、より好ましくは0.1～100 Uであってよい。なお、第１の態様において工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施する場合、第１の態様におけるグルタチオン合成酵素の使用量については、適宜、第２の態様におけるグルタチオン合成酵素の使用量を参考にしてもよい。
　いずれの態様においても、酵素反応の過程において、基質、酵素、および／またはその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応条件は、酵素反応の開始から終了まで均一であってもよく、酵素反応の過程において変化してもよい。「反応条件が酵素反応の過程において変化する」とは、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することを含む。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で酵素反応を実施する場合に、反応温度や酵素濃度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることをいう。
　このようにして酵素反応を実施することにより、γ-Glu-Val-Glyを含有する反応液が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、反応液から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶液からの結晶化、再結晶が挙げられる。これらの手法は、１種を単独で用いてもよく、２種またはそれ以上を適宜組み合わせて用いてもよい。回収されるγ-Glu-Val-Glyは、γ-Glu-Val-Gly以外の成分、例えばγ-Glu-Val-Glyの製造に用いられた成分や水分等、を含んでいてもよい。γ-Glu-Val-Glyは、所望の程度に精製されていてよい。γ-Glu-Val-Glyは、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上の純度に精製されてよい。また、γ-Glu-Valの回収も、γ-Glu-Val-Glyの回収と同様に行うことができる。
＜４－２＞発酵法
　本発明は、γ－グルタミルバリン合成酵素を利用してγ-Glu-Val-Glyを発酵により製造する方法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）」ともいう。
　本発明においては、γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を利用することにより、GluとValからγ-Glu-Valを発酵生産することができる。すなわち、本発明は、（Ａ）γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法を提供する。同方法を、「本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）」ともいう。生成したγ-Glu-Valは、適宜、培養物から回収することができる。
　さらに、グルタチオン合成酵素を有する微生物を利用することにより、γ-Glu-ValとGlyからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の一態様（「第３の態様」ともいう）は、（Ａ）γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGluおよびValからγ-Glu-Valを生成する工程、および（Ｂ）グルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することにより工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、それぞれ別個に実施してもよく、一部または全部の期間において同時に実施してもよい。すなわち、例えば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に開始してもよく、工程（Ａ）の進行中または完了後に工程（Ｂ）を開始してもよい。また、第３の態様において、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物と、それとは別個の、グルタチオン合成酵素を有する微生物を用いて実施してもよく、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する単一の微生物を用いて実施してもよい。例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する微生物を利用し、Glu、Val、およびGlyが利用可能な状態で培養を実施すれば、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に実施することができる。また、工程（Ａ）で生成したγ-Glu-Valを回収し、回収したγ-Glu-Valを培地に添加して工程（Ｂ）を実施してもよい。γ-Glu-Valは、適宜、精製、希釈、濃縮、乾燥、溶解等の処理に供してから、工程（Ｂ）に用いてもよい。
　なお、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の工程（Ａ）は、例えば、第３の態様の工程（Ａ）を単独で実施するのと同様の態様で実施できる。
　また、本発明においては、γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素の両方を有する微生物を利用することにより、GluとValとGlyとからγ-Glu-Val-Glyを発酵生産することができる。すなわち、本発明のγ-Glu-Val-Glyの製造法（発酵法）の別の態様（「第４の態様」ともいう）は、（Ｃ）γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物を培地で培養することによりGlu、Val、およびGlyからγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法である。
　発酵法において、酵素、アミノ酸、ペプチド、基質、酵素反応等の用語は、酵素法と同様の意味で使用する。また、γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物、グルタチオン合成酵素を有する微生物、およびγ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物を総称して「微生物」ともいう。
　基質となる各アミノ酸の供給方法は、酵素反応に当該アミノ酸を利用できる限り特に制限されない。各アミノ酸は、例えば、各工程で用いられる微生物により生合成されてもよく、培地に添加されてもよく、その組み合わせであってもよい。すなわち、例えば、Glu、Val、およびGlyの全てが微生物により生合成されてもよく、Glu、Val、およびGlyの全てが培地に添加されてもよい。また、例えば、Glu、Val、およびGlyの内、１種または２種のアミノ酸が微生物により生合成され、他のアミノ酸が培地に添加されてもよい。Glu、Val、およびGlyのいずれも、微生物により生合成され、且つ、培地に添加されてもよい。
　すなわち、本発明のγ-Glu-Valの製造法（発酵法）の一態様は、例えば、（Ａ１）γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよく、（Ａ２）γ－グルタミルバリン合成酵素を有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程、を含むγ-Glu-Valの製造法であってもよい。
　また、第３の態様の一態様は、例えば、（Ａ１）と（Ａ２）のいずれか、および、（Ｂ１）と（Ｂ２）のいずれかを含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい：
（Ａ１）γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物をGluおよびValを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ａ２）γ－グルタミルバリン合成酵素を有し、且つ、GluおよびValの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Valを生成する工程；
（Ｂ１）グルタチオン合成酵素を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程；
（Ｂ２）グルタチオン合成酵素を有し、且つ、Glyの生産能を有する微生物を工程（Ａ１）または（Ａ２）で生成したγ-Glu-Valを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
　また、第４の態様の一態様は、例えば、（Ｃ１）γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物をGlu、Val、およびGlyを含有する培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよく、（Ｃ２）γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有し、且つ、Glu、Val、およびGlyの生産能を有する微生物を培地で培養することによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程、を含むγ-Glu-Val-Glyの製造法であってもよい。
　γ－グルタミルバリン合成酵素を有する微生物としては、上述したようなγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。グルタチオン合成酵素を有する微生物としては、上述したようなグルタチオン合成酵素遺伝子を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素を有する微生物としては、上述したようなγ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子とグルタチオン合成酵素遺伝子の両方を有する微生物を、そのまま、あるいは適宜改変して用いることができる。
　アミノ酸の生産能を有する微生物は、本来的にアミノ酸の生産能を有するものであってもよく、アミノ酸の生産能を有するように改変されたものであってもよい。アミノ酸の生産能を有する微生物は、微生物にアミノ酸生産能を付与することにより、または、微生物のアミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。γ－グルタミルバリン合成酵素遺伝子および／またはグルタチオン合成酵素遺伝子の導入等の酵素生産能の付与または増強と、アミノ酸生産能の付与または増強とは、いずれを先に実施してもよい。すなわち、γ－グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有し、且つ、アミノ酸の生産能を有する微生物は、γ－グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有する微生物を、アミノ酸生産能を有するように改変することにより取得してもよく、アミノ酸生産能を有する微生物を、γ－グルタミルバリン合成酵素および／またはグルタチオン合成酵素を有するように改変することにより取得してもよい。Ｌ－アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７～１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、Ｌ－アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、Ｌ－アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。また、Ｌ－アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のＬ－アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のＬ－アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。
　Ｌ－グルタミン酸生産菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム）ATCC13869株より取得されたodhA欠損株に、V197M変異を有するmviN遺伝子を導入した組換え株（特開2010-161970）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来gltA（クエン酸シンターゼ）遺伝子を導入したパントエア・アグロメランスAJ13355株（特許第4285582号）、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換されたグルタミンシンセターゼを有するエシェリヒア属細菌（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）などが例示できる。Ｌ－バリン生産菌としては、エシェリヒア・コリVL1970株（米国特許第5658766号）、エシェリヒア属に属し、生育のためにリポ酸を要求する変異および／またはH+-ATPaseを欠損する変異を有するエシェリヒア属細菌、および、これらの性質に加えて、少なくともilvG、ilvM、ilvE、およびilvDの各遺伝子を発現し、且つ、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片が細胞内に導入されたエシェリヒア属細菌（WO96/06926）などが例示できる。すなわち、例えば、これらの改変を微生物に導入することにより、アミノ酸生産能を付与または増強できる。
　また、微生物は、培地中に添加されたアミノ酸を取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、その利用態様に応じて、生成したγ-Glu-Valを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよく、培地中に添加されたγ-Glu-Valを取り込む能力が向上するよう改変されていてもよい。また、微生物は、生成したγ-Glu-Val-Glyを菌体外に排出する能力が向上するよう改変されていてもよい。
　培養条件は、微生物が増殖でき、γ-Glu-Val-Glyが生成する限り、特に制限されない。培養条件については、上述したγ－グルタミルバリン合成酵素の製造法における培養条件の記載を参照できる。
　γ－グルタミルバリン合成酵素およびグルタチオン合成酵素は、いずれも、酵素反応にATPを利用する。よって、反応系には、ATPを適宜供給する。すなわち、反応系は、ATPを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、ATPの存在下で実施することができる。ATPの供給方法は、酵素反応にATPを利用できる限り特に制限されない。ATPは、例えば、各工程で用いられる微生物により生成されてもよく、上述したようなATPを生成または再生する方法により反応系に供給されてもよい。ATPの供給には、例えば、通常のエネルギー代謝によるATP再生系が強化された微生物やポリリン酸キナーゼの作用でATPを再生する能力を有する微生物を培養液中に共存させる方法等の共培養系（特公平7-16431、特公平6-69386）が好適に利用できる。
　また、例えば、γ－グルタミルバリン合成酵素は、通常、酵素反応に２価の金属イオンを要求する。よって、反応系は、２価の金属イオンを含有していてよい。前記工程（Ａ）～（Ｃ）は、いずれも、２価の金属イオンの存在下で実施することができる。
　アミノ酸を含有する培地を用いる場合、アミノ酸は、培養開始時から培地に含まれていてもよく、培養途中の任意の時点で培地に添加されてもよい。添加のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜変更できるが、一例としては、培養終了時の好ましくは０～５０時間前、より好ましくは０．１～２４時間前、特に好ましくは０．５～６時間前であってよい。アミノ酸は、１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。培地中の各アミノ酸の濃度は、例えば、通常0.1～2000ｍM、好ましくは1～2000ｍM、より好ましくは10～1000ｍMであってよい。また、培地中の各基質のモル比については、酵素法における反応液中の各基質のモル比に関する記載を準用してもよい。
　このようにして培養を行うことにより、γ-Glu-Val-Glyを含む培養物が得られる。γ-Glu-Val-Glyが生成したことは、上述したように、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。γ-Glu-Val-Glyは、適宜、培養物から回収することができる。γ-Glu-Val-Glyの回収は、上述したように、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。なお、菌体内にＬ－アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってγ-Glu-Val-Glyを回収することができる。
　また、微生物が酵母であり、γ-Glu-Val-Glyが菌体内に蓄積する場合、同酵母は、例えば、γ-Glu-Val-Glyを含有する酵母エキスの製造に利用できる。すなわち、本発明は、同酵母を原料として用いて酵母エキスを調製することを含む、γ-Glu-Abuを含有する酵母エキスの製造法を提供する。酵母からの酵母エキスの調製は、通常の酵母エキスの調製と同様にして行えばよい。酵母エキスは、酵母菌体を熱水抽出したものを処理したものでもよいし、酵母菌体を消化したものを処理したものでもよい。また、必要に応じて、得られた酵母エキスを濃縮してもよいし、乾燥し粉末の形態にしてもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
〔実施例１〕コクリア・ロゼア（AJ3132）無細胞抽出液のγ-Glu-Val合成活性の検出
（１）無細胞抽出液の調製
　コクリア・ロゼア（AJ3132）の培養には、培地１（0.5%（w/v）グルコース、1%（w/v）酵母エキス、1%（w/v）ポリペプトン、0.5%（w/v）NaCl、（pH7.0））を用いた。コクリア・ロゼア（AJ3132）を、1.5％（w/v）寒天を含む培地１で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を18mlの培地１に接種し、試験管に3mlずつ分注し、30℃、120往復/分で終夜培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌し、生理食塩水で洗浄し、生理食塩水を用いて4mlの菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液をマルチビーズショッカーMB701CAJ（S）型（安井器械社製）を用いて破砕（ビーズ径：0.1mm、2,700rpm、ON/OFF＝1分/1分、計6分）後、遠心分離（12,000ｇ、10分）した。遠心上清をアミコンウルトラ　フィルターユニット－3,000NMWL（メルクミリポア社製）で限外濾過した。フィルター非透過液を回収し、全量4mlとなるように生理食塩水で希釈し、無細胞抽出液とした。
（２）γ-Glu-Val合成活性の検出
　0.12mlの反応液１（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、50mmol/L Glu、50mmol/L Val、10mmol/L アデノシン三リン酸（ATP）、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH8.5）に0.08mlの無細胞抽出液を添加して、全量0.2mlで酵素反応を開始した。対照として、反応液1に無細胞抽出液の代わりに生理食塩水を添加した条件で酵素反応を実施した。反応は30℃で17時間実施し、反応終了後にγ-Glu-ValをHPLCで定量した。
　γ-Glu-Valの定量条件は以下の通りである。カラムには、Phenomenex社製Synergi 4μ Hydro-RP 80A（粒子径4ミクロン、内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。溶離液には、Ａ液（50mMリン酸二水素ナトリウム（pH2.5、リン酸によってpH調整））、及び、Ｂ液（Ａ液とアセトニトリルの1:1（v/v）の混合液）を用いた。カラム温度は40℃、UV検出波長は210nmとし、溶離液のグラジエントは、0～5分はＢ液0～5%、5～15分はＢ液5%、15～30分はＢ液5～80%、30～30.1分はＢ液80～0%、30.1～50分はＢ液0%とした。
　結果を表１に示す。コクリア・ロゼア（AJ3132）の無細胞抽出液によるγ-Glu-Valの生成が認められた。すなわち、コクリア・ロゼア（AJ3132）の無細胞抽出液にγ-Glu-Val合成活性が検出された。
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〔実施例２〕コクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素の精製
　実施例２において、γ-Glu-Val合成活性は、実施例１に記載の反応液１に酵素溶液（無細胞抽出液または活性画分）を適量添加し、実施例１と同様の手順で測定した（特記しない限り、以降の実施例についても同じ）。実施例２においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Val合成活性とした。
（１）無細胞抽出液の調製
　コクリア・ロゼア（AJ3132）を、1.5％（w/v）寒天を含む培地１で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を4Lの培地１に接種し、500ml容の坂口フラスコに100mlずつ分注し、30℃、110往復/分で16時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌し、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で洗浄し、同緩衝液を用いて600mlの菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液をマルチビーズショッカー（安井器械社製）を用いて破砕後、遠心分離（400g、1分）し、得られた上清を更に遠心分離（29,100g、20分）した。得られた上清を超遠心分離（274,000g、30分）に供し、上清410mlを回収し、無細胞抽出液とした（総タンパク質量：1665mg、総活性（総γ-Glu-Val合成活性）：6.9U）。
（２）陰イオン交換クロマトグラフィー
　上記（１）にて得られた無細胞抽出液を、予め20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したHiLoad 26/10 Q Sepharose High Performanceカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、0-1M塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。溶出画分の内、γ-Glu-Val合成活性を示した画分を、活性画分として集めた（総タンパク質量：128mg、総活性：3.6U）。
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー
　上記（２）にて得られた活性画分を、等量の2.4M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）と混和し、4℃、3時間緩やかに撹拌した後、遠心分離（12,000g、5分）により上清を得た（総タンパク質量：88mg、総活性：3.5U）。得られた上清を、予め1.2M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡化したHiTrap Phenyl High Performance 5mlカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、1-0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。溶出画分の内、γ-Glu-Val合成活性を示した画分を、活性画分として集めた（総タンパク質量：2.7mg、総活性：1.7U）。
（４）ゲル濾過クロマトグラフィー
　上記（３）にて得られた活性画分を、アミコンウルトラ　フィルターユニット－10,000NMWL（メルクミリポア社製）により濃縮し、予め20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したHiLoad 16/600 Superdex 200pgカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、酵素を溶出した。溶出画分の内、γ-Glu-Val合成活性を示した画分を、活性画分として集めた（総タンパク質量：0.3mg、総活性：0.8U）。
（５）疎水性相互作用クロマトグラフィー
　上記（４）で得られた活性画分を、等量の2.4M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）と混和し、予め1.2M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したRESOURCE PHE 1mlカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、1-0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出した。溶出画分の内、γ-Glu-Val合成活性を示した画分を集め、精製酵素とした。精製酵素をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クーマシーブリリアントブルー（CBB）染色液でゲルを染色した。活性を示す画分と泳動像より、γ-Glu-Val合成酵素に該当する分子量約40,000のバンドを特定した。
〔実施例３〕コクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素の部分アミノ酸配列および同酵素をコードする遺伝子の塩基配列の決定
　実施例２で得られた精製酵素をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、PVDF膜に転写し、プロテインシークエンサーに供し、10残基のN末端アミノ酸配列（配列番号１）を決定した。加えて、実施例２で得られた精製酵素をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、トリプシンにより消化し、逆相HPLCにより分離した断片をプロテインシークエンサーに供し、14残基の内部アミノ酸配列（配列番号２）を決定した。
　次いで、コクリア・ロゼア（AJ3132）のゲノムDNAをNextera XT（イルミナ社製）を用いて調製し、付随のプロトコールに準拠してMiseq（イルミナ社製）にて配列解析したところ、N末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列をそれぞれコードする塩基配列を含むORF領域（配列番号３）が見出された。
〔実施例４〕コクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素のエシェリヒア・コリによる発現
（１）コクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素発現菌株の構築
　実施例３で見出されたコクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素をコードする遺伝子（配列番号３のORF領域）の発現プラスミドpET-KrogshAを以下の手順で構築した。なお、同遺伝子の開始コドンはgtgであったため、pET-KrogshAの構築に際し、開始コドンをatgに置換した。
　初めに、コクリア・ロゼア（AJ3132）のゲノムDNAを鋳型として、ポリメラーゼとしてKOD-plus-（東洋紡社製）を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃で30秒、67℃で1分の条件で30サイクルのPCRを行い、配列番号３のORF領域約1.1kbを増幅した。プライマーとしては、配列番号４および配列番号５のプライマーの組み合わせを使用した。次に、得られたPCR産物をNdeI/HindIIIで消化した後に、アガロースゲル電気泳動にて目的の約1.1kbのDNAを切り出した後、予めNdeI/HindIIIで消化したpET21a（＋）とライゲーションコンビニエンスキット（ニッポンジーン社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地（1.0%（w/v）ペプトン、0.5%（w/v）酵母エキス、1.0%（w/v）NaCl、1.5%（w/v）寒天）に塗布後、30℃で終夜培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3100ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpET-KrogshAと名付けた。得られたpET-KrogshAでエシェリヒア・コリBL21(DE3)を形質転換し、pET-KrogshAを有する形質転換体を得た。この形質転換体を、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-KrogshAと命名した。
（２）エシェリヒア・コリにより発現させたコクリア・ロゼア（AJ3132）由来γ-Glu-Val合成酵素の精製
　エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-KrogshAを、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を200mlのOvernight ExpressTM Instant TB培地（Novagen社製）に接種し、500ml容の坂口フラスコに100mlずつ分注し、37℃、110往復/分で16時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で洗菌し、同緩衝液を用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したHiLoad　16/10 Q Sepharose High Performanceカラム（GEヘルスケア製）にアプライし、0-1M塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、等量の2.4M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）と混和し、4℃、3時間緩やかに撹拌した後、遠心分離（12,000g、5分）により上清を得た。得られた上清を、予め1.2M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡化した2個連結させたHiTrap Phenyl High Performance 5mlカラム（GEヘルスケア製）にアプライし、1-0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、15%（w/v）グリセロールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）に対して透析した。透析後の酵素溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、CBB染色液でゲルを染色したところ、分子量約40,000の位置に均一なバンドを検出した。
　反応液２（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、10mmol/L Glu、10mmol/L Val、10mmol/L ATP、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH9.0）に透析後の酵素溶液を適量添加し、30℃で30分間反応を行った。反応終了後に実施例１と同様の手順でγ-Glu-Valを定量した。実施例４においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Val合成活性とした。透析後の酵素溶液はγ-Glu-Val合成活性を有しており、比活性は0.883U/mgであった。このことから、配列番号３のORF領域をKrogshAと命名し、KrogshAによりコードされるタンパク質をKroGSHA（配列番号６）と命名した。透析後の酵素溶液を、精製KroGSHAとして以降の実験に用いた。
〔実施例５〕コクリア・リゾフィラDC2201株由来γ-Glu-Val合成酵素（KrhGSHA）のエシェリヒア・コリによる発現
（１）コクリア・リゾフィラDC2201株由来γ-Glu-Val合成酵素発現菌株の構築
　コクリア・リゾフィラDC2201株（ATCC 9341）のγ-Glu-Val合成酵素をコードするKrhgshA遺伝子（配列番号７）の発現プラスミドpQE-KrhgshAを以下の手順で構築した。
　コクリア・リゾフィラDC2201株のゲノムDNAを鋳型として、ポリメラーゼとしてKOD-plus-（東洋紡社）を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃で30秒、67℃で1分の条件で30サイクルのPCRを行い、配列番号７のORF領域約1.2kbを増幅した。プライマーとしては、配列番号８および配列番号９のプライマーの組み合わせを使用した。得られたPCR産物をKpnI/HindIIIで消化した後に、アガロースゲル電気泳動にて目的の約1.2kbのDNAを切り出した後、予めKpnI/HindIIIで消化したpQE30とライゲーションコンビニエンスキット（ニッポンジーン社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で終夜培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3100ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpQE-KrhgshAと名付けた。また、本プラスミドを有する形質転換体をエシェリヒア・コリJM109/pQE-KrhgshAと名付けた。KrhgshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるKrhGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および配列番号１０に示す。なお、pQE-KrhgshAによれば、KrhGSHAはN末端にHisタグが付加された形態で発現する。
（２）N末端Hisタグ付加組換え型KrhGSHAの精製
　エシェリヒア・コリJM109/pQE-KrhgshA を、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を500mlのTB培地（Terrific Broth（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第３版、Sambrook, J.ら，Cold SpringHarbor Laboratory Press（2001年））に接種し、500ml容の坂口フラスコに100mlずつ分注し、30℃、110往復/分で16時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で洗菌し、溶離液A（300mM NaCl、10mMイミダゾールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0））を用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Aで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、等量の2.4M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）と混和し、4℃、3時間緩やかに撹拌した後、遠心分離（12,000g、5分）により上清を得た。得られた上清を、予め1.2M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡化したHiTrap Phenyl High Performance 1mlカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、1-0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、15%（w/v）グリセロールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）に対して透析した。透析後の酵素溶液を、精製KrhGSHAとして以降の実験に用いた。
〔実施例６〕ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株由来γ-Glu-Val合成酵素（MluGSHA）のエシェリヒア・コリによる発現
（１）ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株由来γ-Glu-Val合成酵素発現菌株の構築
　ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株（ATCC 15307）のγ-Glu-Val合成酵素をコードするMlugshA遺伝子（配列番号１１）の発現プラスミドpQE-MlugshAを以下の手順で構築した。
　ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株のゲノムDNAを鋳型として、ポリメラーゼとしてKOD-plus-（東洋紡社）を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃で30秒、67℃で1分の条件で30サイクルのPCRを行い、配列番号１１のORF領域約1.2kbを増幅した。プライマーとしては、配列番号１２および配列番号１３のプライマーの組み合わせを使用した。得られたPCR産物をBamHI/HindIIIで消化した後に、アガロースゲル電気泳動にて目的の約1.2kbのDNAを切り出した後、予めBamHI/HindIIIで消化したpQE30とライゲーションコンビニエンスキット（ニッポンジーン社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で終夜培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3100ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行ったところ、MluGSHAのアミノ酸配列の263位のグルタミンをコードする塩基配列cagが終止コドンであるtagに置換されていた。そこで、以下の手順で、得られたプラスミドにtagをcagに置換する変異を導入した。ストラタジーン社の「Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit」を使用し、製造元のプロトコールに従い、得られたプラスミドを鋳型として、配列番号１４、１５の配列で表されるプライマーを用いてPCRを実施した。得られたPCR産物をDpnIで消化した後、該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で終夜培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3100ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpQE-MlugshA、本プラスミドを有する形質転換体をエシェリヒア・コリJM109/pQE-MlugshAと名付けた。MlugshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるMluGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１および配列番号１６に示す。なお、pQE-MlugshAによれば、MluGSHAはN末端にHisタグが付加された形態で発現する。
（２）N末端Hisタグ付加組換え型MluGSHAの精製
　JM109/pQE-MlugshAを、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を500mlのTB培地に接種し、500ml容の坂口フラスコに100mlずつ分注し、30℃、110往復/分で16時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で洗菌し、溶離液Aを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Aで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、等量の2.4M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）と混和し、4℃、3時間緩やかに撹拌した後、遠心分離（12,000g、5分）により上清を得た。得られた上清を、予め1.2M硫酸アンモニウムを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）で平衡化したHiTrap Phenyl High Performance 1mlカラム（GEヘルスケア社製）にアプライし、1-0M硫酸アンモニウムの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、15%（w/v）グリセロールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）に対して透析した。透析後の酵素溶液を、精製MluGSHAとして以降の実験に用いた。
〔実施例７〕コリネバクテリウム・グルタミカムK051株由来γ-Glu-Val合成酵素（CglGSHA）のエシェリヒア・コリによる発現
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムK051株由来γ-Glu-Val合成酵素発現菌株の構築
　コリネバクテリウム・グルタミカムK051株（ATCC 13032）のγ-Glu-Val合成酵素をコードするCglgshA遺伝子（配列番号１７）の発現プラスミドpET-CglgshAを以下の手順で構築した。
　配列番号１７のORF領域にはXhoI認識サイトが含まれている。そこで、2段階のPCR反応により、XhoI認識サイトを欠失（配列番号１７の145位～150位のctcgagをctggagに置換）したORF領域の全長を得た。
　1段階目のPCRでは、コリネバクテリウム・グルタミカムK051株のゲノムDNAを鋳型として、ポリメラーゼとしてKOD-plus-（東洋紡社）を使用して、製造元のプロトコールに従って98℃で30秒、67℃で1分の条件で30サイクルのPCRを行い、ORF領域約1.2kbを上流部分と下流部分に分けてそれぞれ増幅した。プライマーとしては、上流部分の増幅には配列番号１８および配列番号１９のプライマーの組み合わせを、下流部分の増幅には、配列番号２０および配列番号２１のプライマーの組み合わせを使用した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、目的の約160b、約1.0kbのDNA断片を切り出した。
　1段階目のPCRで得られた2断片を鋳型として用いて、1段階目のPCRと同一のPCR条件で2段階目のPCRを実施し、XhoI認識サイトを欠失したORF領域約1.2kbの全長を増幅した。プライマーとしては、配列番号１８および配列番号２１のプライマーの組み合わせを使用した。得られたPCR産物をNdeI/XhoIで消化した後に、アガロースゲル電気泳動にて目的の約1.2kbのDNAを切り出した後、予めNdeI/XhoIで消化したpET21a（＋）とライゲーションコンビニエンスキット（ニッポンジーン社製）を用いて連結した。該反応液でエシェリヒア・コリJM109株を形質転換し、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地に塗布後、30℃で終夜培養した。生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、3100ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列の確認を行い、目的の構造を持つプラスミドをpET-CglgshAと名付けた。得られたpET-CglgshAでエシェリヒア・コリBL21(DE3)を形質転換し、pET-CglgshAを有する形質転換体を得た。この形質転換体を、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-CglgshAと命名した。CglgshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および配列番号２２に示す。なお、pET-CglgshAによれば、CglGSHAはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
（２）C末端Hisタグ付加組換え型CglGSHAの精製
　エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-CglgshA を、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を100mlのOvernight ExpressTM Instant TB培地（Novagen社製）に接種し、500ml容の坂口フラスコで、30℃、110往復/分で16時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、20mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）で洗菌し、300mM NaCl、溶離液Aを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Aで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、15%（w/v）グリセロールを含む20mMリン酸カリウム緩衝液（pH 6.0）に対して透析した。透析後の酵素溶液を、精製CglGSHAとして以降の実験に用いた。
〔実施例８〕C末端Hisタグ付加組換え型サッカロマイセス・セレビシエS288C株由来GSH1（ScGSH1）の精製
　サッカロマイセス・セレビシエS288C株（ATCC 26108）のグルタミン酸－システインリガーゼをコードするGSH1遺伝子（ScGSH1遺伝子；配列番号２３）の発現プラスミドpET-ScGSH1を特開2012-85637に記載の方法で構築した。続いて、pET-ScGSH1を用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-ScGSH1を得た。ScGSH1遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるScGSH1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および配列番号２４に示す。なお、pET-ScGSH1によれば、ScGSH1はC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
　エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-ScGSH1を、100mg/LのAmpを含むLB寒天培地で、30℃で終夜培養した。得られた菌体を50mlのLB培地に接種し、500ml容の坂口フラスコで、37℃、110往復/分で16時間培養した。得られた培養液のうち2mlを100mlのLB培地が入った坂口フラスコに接種した。37℃、110往復/分で2時間培養後、終濃度が0.5mmol/Lになるようにイソプロピル－β－D－チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加して、さらに30℃で4時間培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、溶離液B（300mM NaCl、10mMイミダゾール、15%（w/v）グリセロールを含む20mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0））で洗菌し、溶離液Bを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Cで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、300mM NaCl、15%（w/v）グリセロールを含むTris-HCl緩衝液（pH8.0）に対して透析した。透析後の酵素溶液を、精製ScGSH1として以降の実験に用いた。
〔実施例９〕N末端Hisタグ付加組換え型エシェリヒア・コリK-12　W3110株由来GSHA（EcGSHA）の精製
　エシェリヒア・コリK-12　W3110株（ATCC 27325）のグルタミン酸－システインリガーゼをコードするgshA遺伝子（EcgshA遺伝子；配列番号２５）の発現プラスミドpQE-EcgshAを特開2012-85637に記載の方法で構築した。続いて、pQE-EcgshAを用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pQE-EcgshAを得た。EcgshA遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるEcGSHAのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２５および配列番号２６に示す。なお、pQE-EcgshAによれば、EcGSHAはN末端にHisタグが付加された形態で発現する。
　エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pQE-EcgshAを特開2012-85637と同様の方法で培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、溶離液C（300mM NaCl、10mMイミダゾールを含む20 mM Tris-HCl（pH7.6））で洗菌し、溶離液Cを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Cで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、20 mM Tris-HCl（pH7.6）に対して透析した。透析後の酵素溶液を精製EcGSHAとして以降の実験に用いた。
〔実施例１０〕C末端Hisタグ付加組換え型エシェリヒア・コリK-12　W3110株由来GSHB（EcGSHB）の精製
　エシェリヒア・コリK-12　W3110株（ATCC 27325）のグルタチオン合成酵素をコードするgshB遺伝子（EcgshB遺伝子；配列番号２７）の発現プラスミドpET-EcgshBを特開2012-85637に記載の方法で構築した。続いて、pET-EcgshBを用いてエシェリヒア・コリBL21(DE3)を形質転換し、エシェリヒア・コリBL21(DE3)/pET-EcgshBを得た。EcgshB遺伝子の塩基配列およびそれによりコードされるEcGSHBのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２７および配列番号２８に示す。なお、pET-EcgshBによれば、EcgshBはC末端にHisタグが付加された形態で発現する。
　本菌株を特開2012-85637と同様の方法で培養した。菌体を遠心分離（12,000g、5分）により集菌した後、溶離液Cで洗菌した後、溶離液Cを用いて菌体懸濁液を調製した。菌体懸濁液を超音波破砕処理に供して菌体を破砕し、遠心分離（29,100ｇ、20分）し、得られた上清を無細胞抽出液とした。
　得られた無細胞抽出液を、予め溶離液Cで平衡化したHisTALON 5mlカラム（クロンテック社製）にアプライし、10-150mMイミダゾールの直線的濃度勾配により酵素を溶出し、活性画分を得た。
　得られた活性画分を、20 mM Tris-HCl（pH7.6）に対して透析した。透析後の酵素溶液を精製EcGSHBとして以降の実験に用いた。
〔実施例１１〕各精製GSHAによるγ－グルタミルジペプチドの生成
　実施例４～９で取得した各精製GSHA（ScGSH1、EcGSHA、KroGSHA、KrhGSHA、MluGSHA、CglGSHA）について、γ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性を測定した。
＜γ-Glu-Val合成活性の測定＞
　実施例４に記載の反応液２（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、10mmol/L Glu、10mmol/L Val、10mmol/L ATP、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH9.0）に各精製GSHAを適量添加し、30℃で30分間反応を行った。反応終了後に実施例１と同様の手順でγ-Glu-Valを定量した。実施例１１においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Valを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Val合成活性とした。
＜γ-Glu-Gly合成活性の測定＞
　反応液３（100mmol/L Tris-HCl緩衝液、10mmol/L Glu、10mmol/L Gly、10mmol/L ATP、10mmol/L硫酸マグネシウム、pH9.0）に各精製GSHAを適量添加し、30℃で30分間反応を行った。反応終了後にγ-Glu-GlyをHPLCにより定量した。実施例１１においては、本条件で1分間に1μmolのγ-Glu-Glyを生成する酵素活性を1 Uのγ-Glu-Gly合成活性とした。
　γ-Glu-Glyの定量条件は以下の通りである。カラムには、ジーエルサイエンス社製Inertsil ODS-3（粒子径5ミクロン、内径4.6mm、長さ250mm）を用いた。溶離液には、Ａ液（30mMリン酸二水素カリウム、10mMオクタンスルホン酸ナトリウム（pH2.0、リン酸によってpH調整））、及び、Ｂ液（アセトニトリル）を85:15（v/v）の比率で混合した混合液を用いた。カラム温度は40℃、UV検出波長は210nmとした。
　以上の方法によりγ-Glu-Val合成活性およびγ-Glu-Gly合成活性の比活性を測定し、（A）γ-Glu-Gly合成活性（比活性）に対する（B）γ-Glu-Val合成活性（比活性）の比率（B）/（A）を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例１２〕各精製GSHAおよび精製EcGSHBを用いたアミノ酸からのγ－グルタミルトリペプチドの生成
　実施例４～９で取得した各精製GSHA（ScGSH1、EcGSHA、KroGSHA、KrhGSHA、MluGSHA、CglGSHA）および実施例１０で取得した精製EcGSHBを用い、アミノ酸からのγ-Glu-Val-Gly（CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ぶ）等のγ－グルタミルトリペプチドの生成を検討した。γ-Glu-Val-Glyの構造式を下記式（Ｉ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　反応液４（50mmol/L Tris-HCl緩衝液、100mmol/L Glu、100mmol/L Val、100mmol/L Gly、10mmol/L ATP、10 mmol/L硫酸マグネシウム、240mmol/Lホスホエノールピルビン酸、20000U/Lピルビン酸キナーゼ、pH8.5）に各精製GSHAおよび精製EcGSHBを添加し、30℃で反応を実施した。この時、各酵素は、精製EcGSHAは0.2g/l、精製KroGSHAおよび精製MluGSHAは0.1g/l、精製KrhGSHAおよび精製CglGSHAは1g/l、精製GSHBは0.4g/lとなるように反応液４に添加した。
　反応開始1時間後、実施例１におけるγ-Glu-Valの定量と同様の方法でγ-Glu-Valおよびγ-Glu-Val-Glyを、実施例１１におけるγ-Glu-Glyの定量と同様の方法でγ-Glu-Glyおよびγ-Glu-Gly-Glyを分析し、これらの成分の生成量を算出した。結果を表３に示す。この結果から、（C）γ-Glu-Glyとγ-Glu-Gly-Glyの和、および、（D）γ-Glu-Valとγ-Glu-Val-Glyの和を算出し、（C）γ-Glu-Glyとγ-Glu-Gly-Glyの和に対する（D）γ-Glu-Valとγ-Glu-Val-Glyの和の比率（D）/（C）を算出した。結果を表４に示す。実施例１１の表２で示したγ-Glu-Gly合成活性に対するγ-Glu-Val合成活性の比率（B）/（A）と、γ-Glu-Glyとγ-Glu-Gly-Glyの和に対するγ-Glu-Valとγ-Glu-Val-Glyの和の比率（D）/（C）との相関図を図１に示す。（B）/（A）と（D）/（C）の間のピアソンの積率相関係数を算出すると0.991であり、よって、（B）/（A）と（D）/（C）の間に正の相関関係が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　反応開始24時間後、上記と同様にγ-Glu-Val-Glyの生成量を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明のγ-Glu-Val合成酵素は、Valを選択的に基質とし、γ-Glu-Val生成反応を触媒する。したがって、本発明によれば、本発明のγ-Glu-Val合成酵素を利用して、Glu及びValを原料としてγ-Glu-Valを効率よく製造することができ、さらにγ-Glu-Val及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを製造することができる。また、本発明によれば、本発明のγ-Glu-Val合成酵素を利用して、Glu、Val、及びGlyを原料としてγ-Glu-Val-Glyを効率よく製造することができる。
＜配列表の説明＞
配列番号１：コクリア・ロゼア（AJ3132）のKroGSHAタンパク質のN末端アミノ酸配列
配列番号２：コクリア・ロゼア（AJ3132）のKroGSHAタンパク質の内部アミノ酸配列
配列番号３：コクリア・ロゼア（AJ3132）のKrogshA遺伝子の塩基配列
配列番号４、５：プライマー
配列番号６：コクリア・ロゼア（AJ3132）のKroGSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７：コクリア・リゾフィラDC2201株のKrhgshA遺伝子の塩基配列
配列番号８、９：プライマー
配列番号１０：コクリア・リゾフィラDC2201株のKrhGSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１：ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株のMlugshA遺伝子の塩基配列
配列番号１２～１５：プライマー
配列番号１６：ミクロコッカス・ルテウスNCTC2665株のMluGSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：コリネバクテリウム・グルタミカムK051株のCglgshA遺伝子の塩基配列
配列番号１８～２１：プライマー
配列番号２２：コリネバクテリウム・グルタミカムK051株のCglGSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：サッカロマイセス・セレビシエS288C株のScGSH1遺伝子の塩基配列
配列番号２４：サッカロマイセス・セレビシエS288C株のScGSH1タンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のEcgshA遺伝子の塩基配列
配列番号２６：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のEcGSHAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のEcgshB遺伝子の塩基配列
配列番号２８：エシェリヒア・コリK-12 W3110株のEcGSHBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のggt遺伝子の塩基配列
配列番号３０：エシェリヒア・コリK-12 MG1655株のGGTのアミノ酸配列

Claims (22)

  1. 　下記工程（Ａ）を含む、γ-Glu-Valおよび／またはその塩の製造法：
    （Ａ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程：
    （ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
  2. 　下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
    （Ａ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質をGluおよびValに作用させることによりγ-Glu-Valを生成する工程；および
    （Ｂ）グルタチオン合成酵素を工程（Ａ）で生成したγ-Glu-ValおよびGlyに作用させることによりγ-Glu-Val-Glyを生成する工程：
    （ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
  3. 　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
    （Ｃ）下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程：
    （ａ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号６、１０、１６、または２２に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
  4. 　前記タンパク質におけるγ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　下記工程（Ｃ）を含む、γ-Glu-Val-Glyおよび／またはその塩の製造法：
    （Ｃ）γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上であるγ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質およびグルタチオン合成酵素を、Glu、Val、およびGlyに作用させることにより、γ-Glu-Val-Glyを生成する工程。
  6. 　前記タンパク質が、精製酵素である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記タンパク質が、固定化酵素である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記タンパク質が、該タンパク質を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　前記グルタチオン合成酵素が、該酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項２～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記タンパク質およびグルタチオン合成酵素が、両酵素を有する微生物の培養物、培養菌体、または該菌体の処理物に含有されるものである、請求項２～５のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記微生物が、γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　前記微生物が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記工程がATPの存在下で実施される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　下記（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のタンパク質：
    （ａ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号６に示すアミノ酸配列に対し９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
  15. 　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、請求項１４に記載のタンパク質。
  16. 　γ－グルタミルグリシン合成酵素活性に対するγ－グルタミルバリン合成酵素活性の比率が２．０以上である、γ－グルタミルバリン合成酵素活性を有するタンパク質。
  17. 　請求項１４～１６のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  18. 　請求項１７に記載の遺伝子を搭載するベクター。
  19. 　請求項１７に記載の遺伝子または請求項１８に記載のベクターを有する微生物。
  20. 　γ－グルタミルトランスフェラーゼの活性が低下するように改変されている、請求項１９に記載の微生物。
  21. 　グルタチオン合成酵素をコードする遺伝子を有する、請求項１９または２０に記載の微生物。
  22. 　エシェリヒア・コリである、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の微生物。
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