JP2023111889A - ３－ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】３－ヒドロキシイソ吉草酸（3-hydroxy 3-methylbutyric acid；HMB）の製造法を提供する。【解決手段】α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）の活性が増大するように改変されたHMB生産能を有する細菌を利用して、炭素源またはHMB前駆体から目的物質を製造する。【選択図】なし

Description

本発明は、細菌を用いた３－ヒドロキシイソ吉草酸（3-hydroxy 3-methylbutyric acid；HMB）の製造方法に関するものである。

HMBは、必須アミノ酸であるロイシンの代謝中間体の一つであり、例えば、筋肉量の増
大または減少抑制を目的としたサプリメントに使用されている。

HMBは、主に、化学合成により製造されている。また、CoAを介して生物工学的にHMBを
製造する方法が報告されている（非特許文献１）。

α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）は、α－ケトイソカプロン酸（KICA）のHMBへの変換を触媒する活性を有するタンパク質
として知られている。KICD活性は、広い基質特異性を有する４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase；HPD）が有する活性の一つとして知られている。

また、Ｌ－アミノ酸デアミナーゼ（L-amino acid deaminase）および４－ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase）を発現す
るEscherichia coli菌体を利用してＬ－ロイシンからHMBを製造する方法が報告されてい
る（非特許文献２）。

しかしながら、KICDを利用した発酵法によりHMBを製造する方法は知られていない。

IY Lee and JPN Rosazza, Enzyme analyses demonstrate that beta-methylbutyric acid is converted to beta-hydroxy-beta-methylbutyric acid via the leucine catabolic pathway by galactomyces reessii, Arch Microbiol. 1998 Mar;169(3):257-62. Ruichen Gao and Zhimin Li, Biosynthesis of 3-Hydroxy-3-Methylbutyrate from l-Leucine by Whole-Cell Catalysis, J Agric Food Chem. 2021 Mar 31;69(12):3712-3719.

本発明は、新規なHMBの製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）を導入した細菌を利用してHMBを生産できることを見出し、本発明を完成
させた。

すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
３－ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法であって、
３－ヒドロキシイソ吉草酸生産能を有する細菌を利用して３－ヒドロキシイソ吉草酸を
製造する工程
を含み、
前記細菌が、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、方法。
［２］
前記製造が、炭素源を含有する培地で前記細菌を培養し、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該培地中に生成蓄積させる工程を含む、前記方法。
［３］
前記製造が、前記細菌を利用して３－ヒドロキシイソ吉草酸の前駆体を３－ヒドロキシイソ吉草酸に変換する工程を含む、前記方法。
［４］
前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記細菌を培養し、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該培地中に生成蓄積させる工程を含む、前記方法。
［５］
前記変換が、前記細菌の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該反応液中に生成蓄積させる工程を含む、前記方法。
［６］
前記菌体が、前記細菌の培養液、該培養液から回収した菌体、それらの処理物、またはそれらの組み合わせの形態で用いられる、前記方法。
［７］
前記前駆体が、ロイシンである、前記方法。
［８］
前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が増大した、前記方法。
［９］
α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼをコードする異種遺伝子の導入により、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が増大した、前記方法。
［１０］
前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、配列番号６、８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列からなる場合を除く、前記方法。
［１１］
前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、フィルミクテス（Firmicutes）門に属する細菌またはゲンマティモナス（Gemmatimonadetes）門に属する細菌に由来するα－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼである、前記方法。
［１２］
前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記方法：
（ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
［１３］
前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、配列番号４に示すアミノ酸配列において、３５７位のグリシン残基における他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である、前記方法。
［１４］
前記他のアミノ酸残基が、アラニン残基である、前記方法。
［１５］
前記細菌が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌またはコリネ型細菌である、前記方法。
［１６］
前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌である、前記方法。
［１７］
前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、前記方法。
［１８］
前記細菌が、さらに、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、前記方法。
［１９］
前記細菌が、さらに、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、および／またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、前記方法。
［２０］
さらに、３－ヒドロキシイソ吉草酸を回収する工程を含む、前記方法。
［２１］
変異型α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼであって、
配列番号４に示すアミノ酸配列において、３５７位のグリシン残基における他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有する、変異α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ。
［２２］
前記他のアミノ酸残基が、アラニン残基である、前記変異α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ。

本発明によれば、HMBを効率よく製造することができる。例えば、KICDを利用したHMBの製造方法は、CoAを介して生物工学的にHMBを製造する方法よりもエネルギー的に有利であり得る。よって、一態様において、本発明によれば、CoAを介して生物工学的にHMBを製造する方法よりも効率的にHMBを製造することができる可能性がある。

8種類のKICD遺伝子がコードするKICDの系統樹解析の結果を示す図。パネル（A）：系統樹。パネル（B）：Gemmatirosa kalamazoonesis 由来KICD（J421_3703_KICD）に対する各KICDのアミノ酸配列同一性。パネル（C）：Bacillus thuringiensis serovar由来KICD（BTK_01190_KICD）に対する各KICDのアミノ酸配列同一性。 ロイシンからのHMB生産の結果を示す図。パネル（a）：HMB蓄積量。パネル（b）：生育。パネル（c）：サンプルと導入プラスミドの対応。 発酵によるHMB生産の結果を示す図。

以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書に記載の方法は、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）またはそれを有する細菌を利用した３－ヒドロキシイソ吉草酸（3-hydroxy 3-methylbutyric acid；HMB）の製造方法である。

本明細書に記載の方法は、一態様において、HMBの製造方法であって、HMB生産能を有する細菌を利用してHMBを製造する工程を含み、前記細菌が、KICDの活性が増大するように
改変されている、方法であってよい。HMBは、具体的には、例えば、上記細菌を利用して
、炭素源および／またはHMB前駆体から製造することができる。

また、本明細書に記載の方法は、一態様において、HMBの製造方法であって、KICDを利
用してHMB前駆体からHMBを製造する工程を含む方法であってよい。

＜１＞細菌
本明細書に記載の細菌は、KICDの活性が増大するように改変された、HMB生産能を有す
る細菌である。

＜１－１＞HMB生産能を有する細菌
「HMB生産能を有する細菌」とは、HMBを生産することができる細菌を意味してよい。

「HMB生産能を有する細菌」とは、同細菌が発酵法に用いられる場合にあっては、HMBを発酵により生産することができる細菌を意味してよい。すなわち、「HMB生産能を有する
細菌」とは、例えば、HMBを炭素源から生産することができる細菌を意味してよい。「HMB生産能を有する細菌」とは、具体的には、例えば、培地（例えば、炭素源を含有する培地）で培養したときに、HMBを生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる細
菌を意味してよい。

「HMB生産能を有する細菌」とは、同細菌が生物変換法に用いられる場合にあっては、HMBを生物変換により生産することができる細菌を意味してよい。すなわち、「HMB生産能
を有する細菌」とは、例えば、HMBをHMB前駆体（例えば、ロイシン）から生産することができる細菌を意味してよい。「HMB生産能を有する細菌」とは、具体的には、例えば、培
地（例えば、HMB前駆体を含有する培地）で培養したときに、HMBを生産し、回収できる程度に培地中に蓄積することができる細菌を意味してよい。また、「HMB生産能を有する細
菌」とは、具体的には、例えば、反応液中でHMB前駆体に作用させたときに、HMBを生産し、回収できる程度に反応液中に蓄積することができる細菌を意味してよい。

HMB生産能を有する細菌は、例えば、0.01 mM以上、0.03 mM以上、0.05 mM以上、0.1 mM以上、0.3 mM以上、0.5 mM以上、または1 mM以上の量のHMBを培地または反応液に蓄積す
ることができてよい。

HMBは、フリー体、塩、またはそれらの組み合わせ（例えば混合物）として得られてよ
い。すなわち、「HMB」とは、特記しない限り、フリー体のHMB、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせ（例えば混合物）を意味してよい。「フリー体」とは、塩を形成していない形態を意味する。HMBの塩としては、アンモニウム塩；ナトリウム塩やカリウム塩
等のアルカリ金属との塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属との塩が挙げられる。HMB
の塩としては、１種の塩を選択してもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて選択してもよい。

本明細書に記載の細菌またはそれを構築するための親株として用いられる細菌は特に制限されない。

細菌としては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。

腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。

エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株
；エシェリヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。

エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。

パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091
）、SC17(0)株（VKPM B-9246）、及びSC17sucA株（FERM BP-8646）が挙げられる。なお、エンテロバクター属細菌やエルビニア属細菌には、パントエア属に再分類されたものもある（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989); Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。例えば、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 337-345 (1989)）。パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も包含されてよい。

エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。

なお、腸内細菌科に属する細菌は、近年、包括的な比較ゲノム解析により複数の科に再分類されている（Adelou M. et al., Genome-based phylogeny and taxonomy of the ‘Enterobacteriales’: proposal for Enterobacterales ord. nov. divided into the families Enterobacteriaceae, Erwiniaceae fam. nov., Pectobacteriaceae fam. nov., Yersiniaceae fam. nov., Hafniaceae fam. nov., Morganellaceae fam. nov., and Budviciaceae fam. nov., Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2016, 66:5575-5599）。しかし、本明細書においては、従来腸内細菌科に分類されていた細菌は、腸内細菌科に属する細菌として取り扱うものとする。

コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・クレナタム（Corynebacterium crenatum）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium
flavum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）

コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium crenatum AS1.542
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060, ATCC 13869, FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium efficiens (Corynebacterium thermoaminogenes) AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020
Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354

なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。

酵母は出芽酵母であってもよく、分裂酵母であってもよい。酵母は、一倍体の酵母であってもよく、二倍体またはそれ以上の倍数性の酵母であってもよい。酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロマイセス属、ピチア・シフェリイ（Pichia ciferrii）、ピチア・シドウィオラム（Pichia sydowiorum）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）等のピヒア属（ウィッカーハモマイセス（Wickerhamomyces）属ともいう）、キャンディダ・ユティリス（Candida utilis）等のキャンディダ属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンゼヌラ属、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロマイセス属に
属する酵母が挙げられる。

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所P.O.
Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of Americaまたはatcc.org）より分譲
を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番
号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。

細菌は、本来的にHMB生産能を有するものであってもよく、HMB生産能を有するように改変されたものであってもよい。HMB生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にHMB生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のHMB生産能を増強すること
により、取得できる。

HMB生産能を付与または増強する方法は、特に制限されない。

HMBは、HMBの生合成に関与する酵素の作用により生成し得る。HMBの生合成に関与する
酵素を、「HMB生合成酵素」ともいう。よって、細菌は、HMB生合成酵素を有していてよい。言い換えると、細菌は、HMB生合成酵素をコードする遺伝子を有していてよい。HMB生合成酵素をコードする遺伝子を、「HMB生合成遺伝子」ともいう。細菌は、本来的にHMB生合成遺伝子を有するものであってもよく、HMB生合成遺伝子が導入されたものであってもよ
い。遺伝子を導入する手法については本明細書に記載する。

また、HMB生合成酵素の活性の増大により、細菌のHMB生産能を向上させることができる。すなわち、HMB生産能を付与または増強するための方法としては、HMB生合成酵素の活性を増大させる方法が挙げられる。すなわち、細菌は、HMB生合成酵素の活性が増大するよ
うに改変されていてよい。１種のHMB生合成酵素の活性が増大してもよく、２種またはそ
れ以上のHMB生合成酵素の活性が増大してもよい。タンパク質（酵素等）の活性を増大さ
せる手法については本明細書に記載する。タンパク質（酵素等）の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させることにより、増大させることができる。

HMBは、例えば、炭素源および／またはHMB前駆体から、生成し得る。HMBは、具体的に
は、例えば、炭素源および／またはHMB前駆体から、α－ケトイソカプロン酸（α-ketoisocaproic acid；KICA）を経由して生成し得る。KICAのHMBへの変換は、KICDにより触媒され得る。よって、HMB生合成酵素としては、KICDに加えて、炭素源および／またはHMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵素が挙げられる。炭素源および／またはHMB前駆体のKICA
への変換を触媒する酵素としては、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）、イソプロピルマレートシンターゼ（isopropylmalate synthase）、イソプロピルマレートイソメラーゼ（isopropylmalate isomerase）、３－イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain-amino-acid aminotransferase）が挙げられる。acetohydroxy acid synthase、acetohydroxy acid isomeroreductase、dihydroxy acid dehydratase、isopropylmalate synthase、isopropylmalate isomerase、および3-isopropylmalate dehydrogenaseは、Ｌ－ロイシン生合成経路の一部を触媒し得る。acetohydroxy acid synthase、acetohydroxy acid isomeroreductase、dihydroxy acid dehydratase、isopropylmalate synthase、isopropylmalate isomerase、および3-isopropylmalate dehydrogenaseは、いずれも、炭素源のKICAへの変換を触媒する酵素の一例であり得る。よって、acetohydroxy acid synthase、acetohydroxy acid isomeroreductase、dihydroxy acid dehydratase、isopropylmalate synthase、isopropylmalate isomerase、および／または3-isopropylmalate dehydrogenaseの活性の増強は、特に、発酵法によりHMBを製造する場合に有用であり得る。branched-chain-amino-acid aminotransferaseは、ロイシンのKICAへの変換を触媒し得る。branched-chain-amino-acid aminotransferaseは、HMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵素の一例であり得る。よって、branched-chain-amino-acid aminotransferaseの活性の増強は、特に、生物変換法（具体的にはロイシンをHMB前駆体とする生物変換法）によりHMBを製造する場合に有用であり得る。

「アセトヒドロキシ酸シンターゼ（acetohydroxy acid synthase）」とは、ピルビン酸をα－アセト乳酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC
2.2.1.6等）。同活性を、「acetohydroxy acid synthase活性」ともいう。acetohydroxy
acid synthase活性は、具体的には、２分子のピルビン酸からα－アセト乳酸とCO₂を生
成する反応を触媒する活性であってよい。acetohydroxy acid synthaseをコードする遺伝子を、「acetohydroxy acid synthase遺伝子」ともいう。acetohydroxy acid synthaseとしては、ilvGM遺伝子、ilvBN遺伝子、およびilvIH遺伝子にそれぞれコードされるIlvGMタ
ンパク質、IlvBNタンパク質、およびIlvIHタンパク質が挙げられる。ilvGM遺伝子は、そ
れぞれ、acetohydroxy acid synthaseの大サブユニットおよび小サブユニットをコードし得る。acetohydroxy acid synthaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。acetohydroxy acid synthaseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのIlvGMタンパク質が挙げられる。

「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ（acetohydroxy acid isomeroreductase）」とは、α－アセト乳酸をα，β－ジヒドロキシイソ吉草酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.1.1.86等）。同活性を、「acetohydroxy acid isomeroreductase活性」ともいう。acetohydroxy acid isomeroreductase活性は、具
体的には、電子供与体の存在下でα－アセト乳酸を還元してα，β－ジヒドロキシイソ吉草酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。acetohydroxy acid isomeroreductaseをコードする遺伝子を、「acetohydroxy acid isomeroreductase遺伝子」ともいう。acetohydroxy acid isomeroreductaseとしては、ilvC遺伝子にコードされるIlvCタンパク質が挙げられる。acetohydroxy acid isomeroreductaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。acetohydroxy acid isomeroreductaseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのIlvCタンパク質が挙げられる。

「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（dihydroxy acid dehydratase）」とは、α，β－ジヒドロキシイソ吉草酸をα－ケトイソ吉草酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 4.2.1.9等）。同活性を、「dihydroxy acid dehydratase活性」ともいう。dihydroxy acid dehydratase活性は、具体的には、α，β－ジヒドロキシイソ吉草酸を脱水してα－ケトイソ吉草酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。dihydroxy acid dehydrataseをコードする遺伝子を、「dihydroxy acid dehydratase遺伝子」ともいう。dihydroxy acid dehydrataseとしては、ilvE遺伝子にコードされるIlvEタンパク質が挙げられる。dihydroxy acid dehydrataseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。dihydroxy acid dehydrataseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのIlvEタンパク質が挙げられる。

「イソプロピルマレートシンターゼ（isopropylmalate synthase）」とは、α－ケトイソ吉草酸をα－イソプロピルリンゴ酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 2.3.3.13等）。同活性を、「isopropylmalate synthase活性」とも
いう。isopropylmalate synthase活性は、具体的には、α－ケトイソ吉草酸とアセチルCoAからα－イソプロピルリンゴ酸とCoAを生成する反応を触媒する活性であってよい。isopropylmalate synthaseをコードする遺伝子を、「isopropylmalate synthase遺伝子」ともいう。isopropylmalate synthaseとしては、leuA遺伝子にコードされるLeuAタンパク質が挙げられる。isopropylmalate synthaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。isopropylmalate synthaseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのLeuAタンパク質が挙げられる。

「イソプロピルマレートイソメラーゼ（isopropylmalate isomerase）」とは、α－イ
ソプロピルリンゴ酸をβ－イソプロピルリンゴ酸に変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 4.2.1.33等）。同活性を、「isopropylmalate isomerase活性」ともいう。isopropylmalate isomeraseをコードする遺伝子を、「isopropylmalate
isomerase遺伝子」ともいう。isopropylmalate isomeraseとしては、leuCD遺伝子にコードされるLeuCDタンパク質が挙げられる。leuCD遺伝子は、それぞれ、isopropylmalate isomeraseの大サブユニットおよび小サブユニットをコードし得る。isopropylmalate isomeraseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物の
ものが挙げられる。isopropylmalate isomeraseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのLeuCDタンパク質が挙げられる。

「３－イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ（3-isopropylmalate dehydrogenase）
」とは、β－イソプロピルリンゴ酸をKICAに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 1.1.1.85等）。同活性を、「3-isopropylmalate dehydrogenase活性」ともいう。3-isopropylmalate dehydrogenase活性は、具体的には、電子受容体の
存在下でβ－イソプロピルリンゴ酸を酸化的に脱炭酸してKICAを生成する反応を触媒する活性であってよい。電子受容体としては、NAD+が挙げられる。3-isopropylmalate dehydrogenaseをコードする遺伝子を、「3-isopropylmalate dehydrogenase遺伝子」ともいう。3-isopropylmalate dehydrogenaseとしては、leuB遺伝子にコードされるLeuBタンパク質
が挙げられる。3-isopropylmalate dehydrogenaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。3-isopropylmalate dehydrogenaseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのLeuBタンパク質が挙げられる。

「分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（branched-chain-amino-acid aminotransferase）」とは、ロイシンをKICAに変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質を意味してよい（EC 2.6.1.42等）。同活性を、「branched-chain-amino-acid aminotransferase活性」ともいう。branched-chain-amino-acid aminotransferase活性は、具体的には
、ロイシンとα－ケトグルタル酸からKICAとグルタミン酸を生成する反応を触媒する活性であってよい。branched-chain-amino-acid aminotransferaseをコードする遺伝子を、「isopropylmalate synthase遺伝子」ともいう。branched-chain-amino-acid aminotransferaseとしては、ilvE遺伝子にコードされるIlvEタンパク質が挙げられる。branched-chain-amino-acid aminotransferaseとしては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の細菌やコリネ型細菌等の各種生物のものが挙げられる。branched-chain-amino-acid aminotransferaseとして、具体的には、E. coli K-12 MG1655株等のE. coliのIlvEタンパク質が挙げられる。E. coliのilvE遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするIlvEタンパク質の
アミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。

HMB生合成酵素の活性は、例えば、酵素を基質とインキュベートし、酵素および基質依
存的な産物の生成を測定することにより、測定できる。具体的には、branched-chain-amino-acid aminotransferase活性は、例えば、酵素を基質（すなわち、ロイシンとα－ケトグルタル酸）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（すなわち、KICAとグルタミン酸）の生成を測定することにより、測定できる。

HMB生産能を有する細菌の育種に使用される遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、例
えば、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を有していてよい。また、HMB生産能を有する細菌の育種に使用さ
れる遺伝子およびタンパク質は、それぞれ、上記例示した遺伝子およびタンパク質等の公知の遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントであってもよい。具体的には、例えば、HMB生産能を有する細菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されている限り、
公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子およびタンパク質の保存的バリアントについては、後述するKICD遺伝子およびKICDの保存的バリアントに関する記載を準用できる。

＜１－２＞KICDの活性の増大
本明細書に記載の細菌は、KICDの活性が増大するように改変されている。本明細書に記載の細菌は、具体的には、非改変株と比較してKICDの活性が増大するように改変されてい
る。本明細書に記載の細菌は、HMB生産能を有する細菌を、KICDの活性が増大するように
改変することにより取得できる。また、本明細書に記載の細菌は、KICDの活性が増大するように細菌を改変した後に、HMB生産能を付与または増強することによっても取得できる
。なお、本明細書に記載の細菌は、KICDの活性が増大するように改変されたことにより、HMB生産能を獲得したものであってもよい。KICDの活性は、例えば、KICD遺伝子の発現を
上昇させることにより増大させることができる。KICD遺伝子の発現は、例えば、KICD遺伝子のコピー数を高めることにより、またはKICD遺伝子の発現調節配列を改変することにより、上昇させることができる。KICD遺伝子の発現は、具体的には、例えば、KICD遺伝子を導入することにより、上昇させることができる。導入するKICD遺伝子は、例えば、異種KICD遺伝子（すなわちKICDをコードする異種遺伝子）であってよい。「異種KICD遺伝子」とは、同遺伝子が導入される細菌とは異なる種の生物に由来するKICD遺伝子を意味する。

KICDの活性が増大するように細菌を改変することによって、細菌のHMB生産能を向上さ
せることができ、すなわち同細菌によるHMB生産を増大させることができる。「HMB生産の増大」としては、培地または反応液におけるHMBの蓄積量の向上（すなわち増大）が挙げ
られる。

「α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）」とは、α－ケトイソカプロン酸（KICA）のHMBへの変換を触媒する活性を有するタン
パク質を意味してよい（EC 1.13.11.27等）。同活性を、「α－ケトイソカプロン酸ジオ
キシゲナーゼ活性（KICD活性）」ともいう。KICD活性は、具体的には、KICAを酸化してHMBを生成する反応を触媒する活性であってよい。KICD活性は、より具体的には、酸素分子
の存在下でKICAを酸化してHMBと二酸化炭素HMBを生成する反応を触媒する活性であってよい。KICDをコードする遺伝子を、「KICD遺伝子」ともいう。

KICD遺伝子およびKICDとしては、細菌、古細菌、真核生物等の各種生物のものが挙げられる。KICD遺伝子およびKICDとしては、特に、細菌のものが挙げられる。細菌としては、フィルミクテス（Firmicutes）門に属する細菌やゲンマティモナス（Gemmatimonadetes）門に属する細菌が挙げられる。Firmicutes門に属する細菌としては、バチルス（Bacillaceae）科に属する細菌が挙げられる。Bacillaceae科に属する細菌としては、バチルス（Bacillus）属細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス
・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・ベルエゼンシス（Bacillus velezensis）が挙げら
れる。バチルス属細菌としては、特に、Bacillus thuringiensisが挙げられる。Gemmatimonadetes門に属する細菌としては、ゲンマティモナス（Gemmatimonadaceae）科に属する
細菌が挙げられる。Gemmatimonadaceae科に属する細菌としては、ゲンマティローザ（Gemmatirosa）属細菌やゲンマティモナス（Gemmatimonas）属細菌が挙げられる。Gemmatirosa属細菌としては、ゲンマティローザ・カラマゾーネシス（Gemmatirosa kalamazoonesis
）が挙げられる。Gemmatimonas属細菌としては、ゲンマティモナス・オーランティアカ（Gemmatimonas aurantiaca）やゲンマティモナス・フォトトロフィカ（Gemmatimonas phototrophica）が挙げられる。細菌としては、特に、Bacillus thuringiensisやGemmatirosa
kalamazoonesisが挙げられる。すなわち、KICD遺伝子およびKICDは、例えば、上記例示
したような生物に由来するものであってよい。各種生物由来のKICD遺伝子の塩基配列およびそれらにコードされるKICDのアミノ酸配列は、例えば、NCBI等の公開データベースや特許文献等の技術文献から取得できる。E. coliでの発現用にコドン最適化したBacillus thuringiensisのKICD遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするKICDのアミノ酸配列
を、それぞれ配列番号１および２に示す。E. coliでの発現用にコドン最適化したGemmatirosa kalamazoonesisのKICD遺伝子の塩基配列、および同遺伝子がコードするKICDのアミ
ノ酸配列を、それぞれ配列番号３および４に示す。すなわち、KICD遺伝子は、例えば、上記例示したKICD遺伝子の塩基配列（例えば、配列番号１または３に示す塩基配列）を有する遺伝子であってよい。また、KICDは、例えば、上記例示したKICDのアミノ酸配列（例えば、配列番号２または４に示すアミノ酸配列）を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。

一態様において、KICDからは、配列番号６、８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列を有するKICDが除外されてもよい。また、別の態様において、KICDからは、配列番号６、８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列からなるKICDが除外されてもよい。

KICD遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したKICD遺伝子（例えば、配列番号１または３に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、KICDは、元の機能が維持されている限り、上記例示したKICD（例えば、配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「KICD遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したKICD遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「KICD」という用語は、それぞれ、上記例示したKICDに加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。また、由来する生物種で特定されるKICD遺伝子およびKICDは、いずれも、特記しない限り、当該生物種が実際に有するものに限られず、それらの保存的バリアント（これは、当該生物種が実際に有していてもよく、有していなくてもよい）を包含してよい。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したKICD遺伝子やKICDのホモログや人為的な改変体が挙げられる。

「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（例えば活性または性質）に対応する機能（例えば活性または性質）を有することを意味する。すなわち、遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることを意味してよい。すなわち、KICD遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがKICDをコードすることを意味してよい。また、KICDについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがKICD活性を有することを意味してよい。

KICD活性は、例えば、酸素分子の存在下で酵素を基質（すなわち、KICA）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（すなわち、HMB）の生成を測定することにより、
測定できる。

以下、保存的バリアントについて例示する。

KICD遺伝子のホモログまたはKICDのホモログは、例えば、上記例示したKICD遺伝子の塩基配列または上記例示したKICDのアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索
やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、KICD遺
伝子のホモログは、例えば、各種生物の染色体を鋳型にして、これら公知のKICD遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取
得することができる。

KICD遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、配列番号２または４に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸
性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln
、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。

また、KICD遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、好まし
くは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

また、KICD遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、配列番号１または３に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子（例えばDNA）であってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイ
ブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いDNA同士、例えば、55%以上、60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%
以上、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーシ
ョンの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。

上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作
製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる
ことができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリ
ダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。

また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、KICD遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、KICD遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示したKICD遺伝子のバリアントであってもよい。例えば、発現抑制遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。

なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味する。また、塩基配列間の「同一性」とは、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味する。

なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、任意の遺伝子およびタンパク質にも準用できる。

KICDとしては、本明細書に記載の「特定の変異」を有するKICDも挙げられる。すなわち、本明細書に記載の細菌は、「特定の変異」を有するKICDの活性が増大するように改変されていてもよい。

「特定の変異」を有するKICDを「変異型KICD」ともいう。また、変異型KICDをコードする遺伝子を、「変異型KICD遺伝子」ともいう。

「特定の変異」を有しないKICDを「野生型KICD」ともいう。また、野生型KICDをコードする遺伝子を、「野生型KICD遺伝子」ともいう。なお、ここでいう「野生型」とは、「野生型」のKICDを「変異型」のKICDと区別するための便宜上の記載であり、「特定の変異」を有しない限り、天然に得られるものには限定されない。「KICDが「特定の変異」を有しない」とは、KICDが「特定の変異」として選択された変異を有しないことを意味してよい。野生型KICDは、「特定の変異」として選択された変異を有しない限り、「特定の変異」として選択されなかった変異を有していてもよく、いなくてもよい。

ある野生型KICDとある変異型KICDが「特定の変異」の有無以外は同一である場合、当該ある野生型KICDを「ある変異型KICDに対応する野生型KICD」ともいい、当該変異型KICDを「ある野生型KICDに対応する変異型KICD」ともいう。

野生型KICDは、「特定の変異」を有しないKICDである点を除いて、上記のKICDに関する記載を援用できる。したがって、例えば、野生型KICDは、上記例示されたKICDであってもよく、「特定の変異」を有しない限り、上記例示されたKICDのバリアントであってもよい。野生型KICDは、特に、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのバリアントであってよい。また、野生型KICD遺伝子も同様に、コードするKICDが「特定の変異」を有しないKICDである点を除いて、上記のKICD遺伝子に関する記載を援用できる。したがって、例えば、野生型KICD遺伝子は、上記例示されたKICD遺伝子であってもよく、コードするKICDが「特定の変異」を有しない限り、上記例示されたKICD遺伝子のバリアントであってもよい。野生型KICD遺伝子は、特に、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子またはそのバリアントであってよい。

以下、変異型KICDについて説明する。

変異型KICDは、KICD活性を有する。

変異型KICDは、野生型KICDのアミノ酸配列において、「特定の変異」を有する。

すなわち、変異型KICDは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、変異型KICDは、例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列において、「特定の変異」を有し、当該「特定の変異」以外の箇所にさらに１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、KICD活性を有するタンパク質であってよい。

また、言い換えると、変異型KICDは、「特定の変異」を有する以外は、野生型KICDと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。すなわち、変異型KICDは、例えば、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、変異型KICDは、例えば、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を有し、且つ、KICD活性を有するタンパク質であってよい。また、変異型KICDは、例えば、「特定の変異」を有する以外は、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましく
は97%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、KICD活性を有するタンパク質であってよい。

変異型KICDは、上記例示したような変異型KICDのアミノ酸配列に加えて、他のアミノ酸配列を含んでいてもよい。当該他のアミノ酸配列を、「付加配列」ともいう。すなわち、変異型KICDは、付加配列との融合タンパク質であってもよい。また、変異型KICDは、例えば、付加配列を含む形態で（すなわち付加配列との融合タンパク質として）発現し、且つ、最終的には当該付加配列の一部または全部を失っていてもよい。「変異型KICDが付加配列を含む」または「変異型KICDが付加配列との融合タンパク質である」とは、特記しない限り、最終的に得られる変異型KICDが付加配列を含むことを意味する。一方、「変異型KICDが付加配列を含む形態で発現する」または「変異型KICDが発現時に付加配列を含む」とは、特記しない限り、変異型KICDが少なくとも発現時に付加配列を含むことを意味し、最終的に得られる変異型KICDが付加配列を含むことを必ずしも意味しない。また、言い換えると、変異型KICD遺伝子は、上記例示したような変異型KICD遺伝子の塩基配列に加えて、付加配列をコードする塩基配列を含んでいてもよい。野生型KICDおよび野生型KICD遺伝子についても同様である。付加配列は、変異型KICDがα－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有する限り、特に制限されない。付加配列は、その利用目的等の諸条件に応じて適宜選択できる。付加配列としては、例えば、本明細書に記載の細菌における変異型KICDの発現または後述する変異型KICDの製造のために有用または許容可能なものを選択できる。付加配列としては、例えば、ペプチドタグ、シグナルペプチド（シグナル配列ともいう）、プロテアーゼの認識配列が挙げられる。付加配列は、例えば、変異型KICDのＮ末端、若しくはＣ末端、またはその両方に連結されてよい。付加配列としては、１種のアミノ酸配列を用いてもよく、２種またはそれ以上のアミノ酸配列を組み合わせて用いてもよい。

ペプチドタグとして、具体的には、Hisタグ、FLAGタグ、GSTタグ、Mycタグ、MBP（maltose binding protein）、CBP（cellulose binding protein）、TRX（Thioredoxin）、GFP（green fluorescent protein）、HRP（horseradish peroxidase）、ALP（Alkaline Phosphatase）、抗体のFc領域が挙げられる。Hisタグとしては、6xHisタグが挙げられる。ペ
プチドタグは、例えば、発現した変異型KICDの検出や精製に利用できる。

シグナルペプチドは、変異型KICDを発現させる宿主で機能するものであれば、特に制限されない。シグナルペプチドとしては、Sec系分泌経路で認識されるシグナルペプチドやTat系分泌経路で認識されるシグナルペプチドが挙げられる。Sec系分泌経路で認識される
シグナルペプチドとして、具体的には、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドが挙げられる。コリネ型細菌の細胞表層タンパク質のシグナルペプチドとして、具体的には、C. glutamicumのPS1シグナル配列やPS2（CspB）シグナル配列（特表平6-502548）、C. stationisのSlpA（CspA）シグナル配列（特開平10-108675）が挙げられる。Tat
系分泌経路で認識されるシグナルペプチドとして、具体的には、E. coliのTorAシグナル
配列、E. coliのSufIシグナル配列、Bacillus subtilisのPhoDシグナル配列、Bacillus subtilisのLipAシグナル配列、Arthrobacter globiformisのIMDシグナル配列が挙げられる（WO2013/118544）。シグナルペプチドは、例えば、変異型KICDの分泌生産に利用できる
。シグナルペプチドを利用して変異型KICDを分泌生産する場合、分泌時にシグナルペプチドが切断され、シグナルペプチドを有しない変異型KICDが菌体外に分泌され得る。すなわち、典型的には、最終的に得られる変異型KICDはシグナルペプチドを有しなくてよい。

プロテアーゼの認識配列として、具体的には、Factor Xaプロテアーゼの認識配列やproTEVプロテアーゼの認識配列が挙げられる。プロテアーゼの認識配列は、例えば、発現し
た変異型KICDの切断に利用できる。具体的には、例えば、変異型KICDをペプチドタグとの融合タンパク質として発現させる場合、変異型KICDとペプチドタグの連結部にプロテアーゼの認識配列を導入することにより、発現した変異型KICDからプロテアーゼを利用してペプチドタグを切断し、ペプチドタグを有しない変異型KICDを得ることができる。

変異型KICD遺伝子は、上記のような変異型KICDをコードする限り、特に制限されない。なお、本発明において、「遺伝子」という用語は、目的のタンパク質をコードする限り、DNAに限られず、任意のポリヌクレオチドを包含してよい。すなわち、「変異型KICD遺伝
子」とは、変異型KICDをコードする任意のポリヌクレオチドを意味してよい。変異型KICD遺伝子は、DNAであってもよく、RNAであってもよく、その組み合わせであってもよい。変異型KICD遺伝子は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。変異型KICD遺伝子は、一本鎖DNAであってもよく、一本鎖RNAであってもよい。変異型KICD遺伝子は、二本鎖DNAであってもよく、二本鎖RNAであってもよく、DNA鎖とRNA鎖からなるハイブリッド鎖であってもよい。変異型KICD遺伝子は、単一のポリヌクレオチド鎖中に、DNA残基とRNA残基の両方を含んでいてもよい。変異型KICD遺伝子がRNAを含む場合、上記例示した塩基配列等
のDNAに関する記載は、RNAに合わせて適宜読み替えてよい。変異型KICD遺伝子の態様は、その利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。

変異型KICD遺伝子は、例えば、野生型KICD遺伝子を、コードされるKICDが「特定の変異」を有するよう改変することにより取得できる。改変の元になる野生型KICD遺伝子は、例えば、野生型KICD遺伝子を有する生物からのクローニングにより、または、化学合成により、取得できる。また、変異型KICD遺伝子は、野生型KICD遺伝子を介さずに取得することもできる。変異型KICD遺伝子は、例えば、化学合成により直接取得してもよい。取得した変異型KICD遺伝子は、そのまま、あるいはさらに改変して利用してもよい。例えば、或る態様の変異型KICD遺伝子を改変することにより別の態様の変異型KICD遺伝子を取得してもよい。

遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的
変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位にアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlic
h, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙
げられる。

以下、「特定の変異」について説明する。

「特定の変異」とは、HMBの生産に有用な変異を意味する。「特定の変異」とは、具体
的には、野生型KICDに導入した際に、HMBの生産に適した性質を野生型KICDに付与する変
異を意味してよい。そのような性質としては、具体的には、例えば、KICD活性の向上であってもよい。

「特定の変異」としては、配列番号４に示すアミノ酸配列における357位のグリシン（Gly:G）残基における変異が挙げられる。

また、任意の野生型KICDにおいては、「特定の変異」としては、「配列番号４に示すアミノ酸配列における357位のグリシン残基」に相当するアミノ酸残基における変異が挙げ
られる。

上記各変異は、アミノ酸残基の置換であってよい。上記各変異において、改変後のアミノ酸残基は、改変前のアミノ酸残基以外のいずれかのアミノ酸残基であってもよい。「改変前のアミノ酸残基以外のいずれかのアミノ酸残基」を、「他のアミノ酸残基」ともいう。他のアミノ酸残基として、具体的には、アラニン（Ala:A）残基が挙げられる。

よって、「特定の変異」としては、具体的には、配列番号４に示すアミノ酸配列における357位のグリシン残基がアラニン残基に置換される変異が挙げられる。

また、任意の野生型KICDにおいては、「特定の変異」としては、具体的には、「配列番号４に示すアミノ酸配列における357位のグリシン残基」に相当するアミノ酸残基（アラ
ニン残基を除く）がアラニン残基に置換される変異が挙げられる。

上記各変異で言及されるアミノ酸残基の位置は、改変されるアミノ酸残基を特定するための便宜上の記載であり、野生型KICDにおける絶対的な位置を示す必要はない。すなわち、上記各変異におけるアミノ酸残基の位置は、配列番号４に示すアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものであって、アミノ酸残基の欠失、挿入、または付加等によってその絶対的な位置は前後することがある。例えば、配列番号４に示すアミノ酸配列において、Ｘ位よりもＮ末端側の位置で１アミノ酸残基が欠失した、または挿入された場合、元のＸ位のアミノ酸残基は、それぞれ、Ｎ末端から数えてＸ－１番目またはＸ＋１番目のアミノ酸残基となるが、「配列番号４に示すアミノ酸配列のＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」とみなされる。また、上記各変異で言及される改変前のアミノ酸残基は、改変されるアミノ酸残基を特定するための便宜上の記載であり、野生型KICDにおいて保存されている必要はない。すなわち、野生型KICDが配列番号４に示すアミノ酸配列を有しない場合、上記各変異で言及される改変前のアミノ酸残基は保存されていないことがある。すなわち、上記各変異には、上記各変異で言及される改変前のアミノ酸残基が保存されていない場合に当該アミノ酸残基が他のアミノ酸残基（例えば、上記各変異で言及される改変後のアミノ酸残基）に置換される変異も包含されてよい。例えば、「357位のグリシン残基
における変異」には、357位のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が保存されている（
すなわち、グリシン（Gly:G）残基である）場合に当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基
に置換する変異に限られず、357位のグリシン残基に相当するアミノ酸残基が保存されて
いない（すなわち、グリシン（Gly:G）残基でない）場合に当該アミノ酸残基を他のアミ
ノ酸残基に置換する変異も包含されてよい。改変前および改変後のアミノ酸残基は、互いに同一とならないように選択される。

任意のKICDのアミノ酸配列において、どのアミノ酸残基が「配列番号４に示すアミノ酸配列におけるＸ位のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基」であるかは、当該任意のKICDのアミノ酸配列と配列番号４に示すアミノ酸配列とのアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。

＜１－３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、KICD等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。

「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味してよい。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株に対して増大することを意味してよい。「タンパク質の細胞当たりの活性」とは、同タンパク質の活性の細胞当たりの平均値を意味してよい。非改変株を、「非改変細菌」または「非改変細菌の株」ともいう。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味してよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、各細菌種の基準株（type strain）が挙げられる。また、非改変株として、具体的には、細菌
の説明において例示した菌株も挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、基準株（すなわち、本明細書に記載の細菌が属する種の基準株）と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13869株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、C. glutamicum ATCC 13032株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、E. coli K-12 MG1655株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タン
パク質の活性は、E. coli JM109株と比較して増大してもよい。また、別の態様において
、タンパク質の活性は、P. ananatis AJ13355株と比較して増大してもよい。なお、「タ
ンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（mRNA量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。「タンパク質の細胞当たりの分子数」とは、同タンパク質の分子数の細胞当たりの平均値を意味してよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。

タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる
程度に生産されていてよい。

タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味してよい。「遺伝子の細胞当たりの発現量」とは、同遺伝子の発現量の細胞当たりの平均値を意味してよい。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（mRNA量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。

遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。

遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレー
ション（Red-driven integration）法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状DNAを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トラ
ンスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、HMBの生産
に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することも
できる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。

また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むDNA断片を、宿主で機能するベクターと連
結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むDNA断片は、例
えば、標的遺伝子を有する生物のゲノムDNAを鋳型とするPCRにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであってよい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有していてよい。また、ベクターは、挿入され
た遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバ
イオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア
社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社）、pET系ベク
ター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pCold TF DNA（TaKaRa）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベ
クターとして、具体的には、例えば、pHM1519（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐
性遺伝子を有するプラスミド；pCRY30（特開平3-210184）；pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE、およびpCRY3KX（特開平2-72876、米国特許5,185,262号）；pCRY2およ
びpCRY3（特開平1-191686）；pAJ655、pAJ611、およびpAJ1844（特開昭58-192900）；pCG1（特開昭57-134500）；pCG2（特開昭58-35197）；pCG4およびpCG11（特開昭57-183799）；pPK4（米国特許6,090,597号）；pVK4（特開平No. 9-322774）；pVK7（特開平10-215883）；pVK9（WO2007/046389）；pVS7（WO2013/069634）；pVC7（特開平9-070291）が挙げられる。また、コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pVC7H2等の、pVC7のバリアントも挙げられる（WO2018/179834）。

遺伝子を導入する場合、遺伝子は、宿主により発現可能であればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターを意味してよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、本明細書に記載するようなより強力なプロモーターを利用してもよい。

遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、およびtrpAターミネーターが挙げられる。

各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。

また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する」場合、例えば、２またはそれ以上のタンパク質（例えば、酵素）をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一のタンパク質複合体（例えば、酵素複合体）を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、またはそれらの組み合わせを導入してよい。

導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得
した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に
目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer, W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あ
るいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。

なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それらのサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをそれぞれコードする遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が標的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、遺伝子の発現に影響する部位の総称であってよい。発現調節配列としては、例えば、プロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域が挙げられる。発現調節配列は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節配列の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うこ
とができる。

遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味してよい。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、msrAプロモーター、Bifidobacterium由来のPm1プロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌で利用できるより強力なプロモーターとしては、例えば、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl. Microbiol. Biotechn
ol., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tuf（EF-Tu）プロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）、P2プロモーター（US2018-0334693A）、P3プロモーター（US2018-0334693A）、F1プロモーター（WO2018/179834）、lacプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモータ
ー（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）が挙
げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinら
の論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、mRNAの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味してよい。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる（Olins P. O. et al, Gene,
1988, 73, 227-235）。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（5’-UTR）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入
、あるいは欠失がmRNAの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、DNAの目的部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法
により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示され
ている。

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。

上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の脱感作（desensitization to feedback inhibition）も包含されてよい。すなわち、タンパク質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が脱感作されるよう遺伝子またはタンパク質を宿主において変異させることにより、タンパク質の活性を増大させることができる。なお、「フィードバック阻害の脱感作」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含されてよい。また、「フィードバック阻害が脱感作されている」（すなわちフィー
ドバック阻害が低減又は解除されている）ことを「フィードバック阻害に耐性」ともいう。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ－メチル－Ｎ'－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメ
タンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、
ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。

形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 1970, 53, 159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞
からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E., 1977. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス
・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、
組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S. and Choen, S. N., 1979. Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978. Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。

タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。

遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙
げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５
倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001
））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．２倍以上、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。

上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質の活性増強や任意の
遺伝子の発現増強に利用できる。

＜２＞細菌を利用したHMBの製造方法
HMBは、本明細書に記載の細菌を利用して製造することができる。すなわち、HMBの製造方法は、本明細書に記載の細菌を利用してHMBを製造する工程を含む方法であってよい。
同方法においては、本明細書に記載の細菌を利用してHMBを製造する工程を、「HMB製造工程」ともいう。

＜２－１＞発酵法
HMBは、例えば、本明細書に記載の細菌を利用した発酵により製造することができる。
すなわち、HMBの製造方法の一態様は、細菌を利用した発酵によりHMBを製造する方法であってよい。この態様を、「発酵法」ともいう。また、細菌を利用した発酵によりHMBを製
造する工程を、「発酵工程」ともいう。すなわち、HMB製造工程は、例えば、発酵工程を
含んでいてよい。また、HMB製造工程は、例えば、発酵工程により実施されてよい。

発酵工程は、細菌を培養することにより実施できる。具体的には、発酵工程において、HMBは、炭素源から製造することができる。すなわち、発酵工程は、例えば、細菌を培地
（例えば、炭素源を含有する培地）で培養し、HMBを該培地中に生成蓄積する工程であっ
てよい。すなわち、発酵法は、細菌を培地（例えば、炭素源を含有する培地）で培養し、HMBを該培地中に生成蓄積することを含む、HMBを製造する方法であってよい。また、言い換えると、発酵工程は、例えば、細菌を利用して炭素源からHMBを製造する工程であって
よい。

使用する培地は、細菌が増殖でき、HMBが生産される限り、特に制限されない。培地と
しては、例えば、細菌や酵母等の細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分等の培地成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

炭素源は、細菌が資化でき、HMBが生産される限り、特に制限されない。炭素源として
、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉の加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、クエン酸、コハク酸、グルコン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、特に、植物由来原料を用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、精製物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の五炭糖、グルコース等の六炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して五炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して六炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、細菌にグルコース等の六炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、六炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。

培地中の炭素源の濃度は、細菌が増殖でき、HMBが生産される限り、特に制限されない
。培地中の炭素源の濃度は、例えば、HMBの生産が阻害されない範囲で可能な限り高くし
てよい。培地中の炭素源の初発濃度は、例えば、5～30w/v%、または10～20w/v%であって
よい。また、適宜、炭素源を培地に供給してもよい。例えば、発酵の進行に伴う炭素源の減少または枯渇に応じて、炭素源を培地に供給してもよい。最終的にHMBが生産される限
り炭素源は一時的に枯渇してもよいが、培養は、炭素源が枯渇しないように、あるいは炭素源が枯渇した状態が継続しないように、実施するのが好ましい場合がある。

窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。

リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。

硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。

その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

また、生育にアミノ酸等の栄養素を要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地は、好ましくは、そのような栄養素を含有していてよい。また、培地は、HMBの生産に
利用され得る成分を含有していてよい。発酵法においてHMBの生産に利用され得る成分と
しては、酸素が挙げられる。酸素は、例えば、好気条件で培養を実施することにより、培地に供給できる。

培養条件は、細菌が増殖でき、HMBが生産される限り、特に制限されない。培養は、例
えば、細菌や酵母等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、例えば、細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。HMBは、少なくとも本培養の期間に生産されればよい。培養開始
時に培地に含有される細菌の量は特に制限されない。例えば、OD660＝4～100の種培養液
を、培養開始時に、本培養用の培地に対して0.1質量％～100質量％、または1質量％～50
質量％、植菌してよい。

培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（co
ntinuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。連続培養としては、灌流培養（perfusion culture）やケモスタット培養（chemostat culture）が挙げられる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」または「基礎培地」ともいう。また、流加培養において培養系（例えば、発酵槽）に供給される培地を、「流加培地（feed
medium）」ともいう。また、連続培養（これは灌流培養に限られない）において培養系
（例えば、発酵槽）に供給される培地を、「灌流培地（perfusion medium）」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地または灌流培地を供給することを、単に、「培地供給」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、種培養と本培養の培養形態は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよく、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。

炭素源等の各種成分は、初発培地、流加培地、灌流培地、またはそれらの組み合わせに含有されていてよい。すなわち、培養の過程において、炭素源等の各種成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、培地に供給してもよい。これらの成分は、いずれも、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地または灌流培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地または灌流培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地または灌流培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加培地または灌流培地の供給が間欠的に実施される場合、流加培地または灌流培地の組成は、各回で同一であってもよく、そうでなくてもよい。

培養は、例えば、好気条件で実施してよい。「好気条件」とは、培地中の溶存酸素濃度が、0.33 ppm以上、または1.5 ppm以上である条件を意味してよい。酸素濃度は、具体的
には、例えば、飽和酸素濃度に対し、1～50％、または5％程度に制御されてよい。培養は、例えば、通気培養または振盪培養で行うことができる。培地のpHは、例えば、pH 3～10、またはpH 4.0～9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することがで
きる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20～45℃、または25℃～37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間～120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素
源が消費されるまで、あるいは細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。

このような条件下で細菌を培養することにより、培地中にHMBが蓄積する。

HMBが生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認す
ることができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、UPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが
挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。これらの手法は、培地中に存在する各種成分の濃度を決定するためにも用いることができる。

生成したHMBは、適宜回収することができる。すなわち、発酵法は、さらに、HMBを回収する工程を含んでいてよい。同工程を、「回収工程」ともいう。回収工程は、培養液から、具体的には培地から、HMBを回収する工程であってよい。HMBの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、抽出法、蒸留法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、用いることができる。

また、HMBが培地中に析出する場合は、例えば、遠心分離または濾過により回収するこ
とができる。また、培地中に析出したHMBは、培地中に溶解しているHMBを晶析した後に、併せて単離してもよい。

尚、回収されるHMBは、HMB以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の他の成分を含んでいてもよい。回収されたHMBの純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。

＜２－２＞生物変換法
HMBは、例えば、本明細書に記載の細菌を利用した生物変換により製造することもでき
る。すなわち、HMBの製造方法の別の態様は、細菌を利用した生物変換によりHMBを製造する方法であってよい。この態様を、「生物変換法」ともいう。また、細菌を利用した生物変換によりHMBを製造する工程を、「生物変換工程」ともいう。すなわち、HMB製造工程は、例えば、生物変換工程を含んでいてよい。また、HMB製造工程は、例えば、生物変換工
程により実施されてよい。

具体的には、生物変換工程において、HMBは、HMB前駆体から製造することができる。より具体的には、生物変換工程において、HMBは、細菌を利用してHMB前駆体をHMBに変換す
ることにより製造することができる。すなわち、生物変換工程は、細菌を利用してHMB前
駆体をHMBに変換する工程であってよい。

「HMB前駆体」とは、細菌を利用した生物変換によりHMBへと変換できる化合物を意味してよい。HMB前駆体としては、ロイシンが挙げられる。ロイシンは、Ｌ体、Ｄ体、または
それらの組み合わせ（例えば混合物）であってよい。ロイシンは、特に、Ｌ体であってよい。HMB前駆体を、単に、「前駆体」ともいう。前駆体としては、１種の前駆体を用いて
もよく、２種またはそれ以上の前駆体を組み合わせて用いてもよい。前駆体が塩の形態を取り得る化合物である場合、前駆体は、フリー体として用いてもよく、塩として用いてもよく、それらの組み合わせ（例えば混合物）として用いてもよい。すなわち、「前駆体」とは、特記しない限り、フリー体の前駆体、もしくはその塩、またはそれらの組み合わせ（例えば混合物）を意味してよい。前駆体の塩としては、カルボキシル基等の酸性基に対する塩として、アンモニウム塩；ナトリウム塩やカリウム塩等のアルカリ金属との塩；カルシウム塩等のアルカリ土類金属との塩が挙げられる。前駆体の塩としては、アミノ基等の塩基性基に対する塩として、塩酸塩や硫酸塩等の無機酸との塩が挙げられる。前駆体の塩としては、１種の塩を用いてもよく、２種またはそれ以上の塩を組み合わせて用いてもよい。

前駆体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。前駆体の製造方法は特に制限されず、例えば、公知の方法を利用できる。前駆体は、例えば、化学合成法、酵素法、生物変換法、発酵法、抽出法、またはそれらの組み合わせにより製造することができる。例えば、Ｌ－ロイシンは、Ｌ－ロイシン生産能を有する細菌を利用した発酵法により製造することができる。製造された前駆体は、そのまま、あるいは、適宜、濃縮、希釈、乾燥、溶解、分画、除菌、抽出、精製等の処理に供してから、生物変換法に利用できる。すなわち、前駆体としては、例えば、所望の程度に精製された精製品を用いてもよく、前駆体を含有する素材を用いてもよい。前駆体を含有する素材は、細菌が前駆体を利用できる限り特に制限されない。前駆体を含有する素材として、具体的には、前駆体を含有する培養液、該培養液から分離した上清、それらの濃縮物（例えば、濃縮液）、希釈物（例えば、希釈液）、乾燥物等の処理物が挙げられる。

一態様において、生物変換工程は、HMB生産能を有する細菌を培養することにより実施
できる。この態様を、「生物変換法の第１の態様」ともいう。すなわち、生物変換工程は、例えば、HMB前駆体を含有する培地で細菌を培養し、HMB前駆体をHMBに変換する工程で
あってよい。生物変換工程は、具体的には、HMB前駆体を含有する培地で細菌を培養し、HMBを該培地中に生成蓄積する工程であってもよい。

使用する培地は、HMB前駆体を含有し、細菌が増殖でき、HMBが生産される限り、特に制限されない。培養条件は、細菌が増殖でき、HMBが生産される限り、特に制限されない。
生物変換法の第１の態様における培養については、同態様においては培地がHMB前駆体を
含有すること以外は、発酵法における培養についての記載（例えば、培地や培養条件についての記載）を準用できる。また、培地は、HMBの生産に利用され得る成分を含有してい
てよい。生物変換法においてHMBの生産に利用され得る成分としては、酸素やα－ケトグ
ルタル酸が挙げられる。なお、典型的には、α－ケトグルタル酸は、本明細書に記載の細菌により生成または再生され得る。

前駆体は、培養の全期間において培地に含有されていてもよく、培養の一部の期間にのみ培地に含有されていてもよい。すなわち、「前駆体を含有する培地で細菌を培養する」とは、前駆体が培養の全期間において培地に含有されていることを要しない。例えば、前駆体は、培養開始時から培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。前駆体が培養開始時に培地に含有されていない場合は、培養開始後に培地に前駆体を供給する。供給のタイミングは、培養時間等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、細菌が十分に生育してから培地に前駆体を供給してもよい。また、いずれの場合にも、適宜、培地に前駆体を追加で供給してよい。例えば、HMBの生成に伴う前駆体の減少または枯渇に応じて培地に
前駆体を追加で供給してもよい。前駆体を培地に供給する手段は特に制限されない。例えば、前駆体を含有する流加培地または灌流培地を培地に供給することにより、前駆体を培地に供給することができる。また、例えば、HMB生産能を有する細菌と前駆体生産能を有
する細菌を共培養することにより、前駆体生産能を有する細菌に前駆体を培地中に生成させ、以て前駆体を培地に供給することもできる。「或る成分を培地に供給する」という場合の「成分」には、培地中で生成または再生するものも包含されてよい。これらの供給手段は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用してよい。培地中の前駆体濃度は、細菌が前駆体をHMBの原料として利用できる限り、特に制限されない。培地中の前駆体濃度は
、フリー体の重量に換算して、例えば、0.1 g/L以上、1 g/L以上、2 g/L以上、5 g/L以上、10 g/L以上、または15 g/L以上であってもよく、200 g/L以下、100 g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。前駆体は、培養の全期間において上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、そうでなくてもよい。前駆体は、例えば、培養開始時に上記例示した濃度で培地に含有されていてもよく、培養開始後に上記例示した濃度となるように培地に供給されてもよい。培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、HMBは、少なくとも本培養の期間に生産されればよい。
よって、前駆体は、少なくとも本培養の期間に、すなわち本培養の全期間または本培養の一部の期間に、培地に含有されていればよい。すなわち、前駆体は、種培養の期間には培地に含有されていてもよく、いなくてもよい。このような場合、培養についての記載（例えば、「培養期間（培養の期間）」や「培養開始」）は、本培養についてのものとして読み替えることができる。

別の態様において、生物変換工程は、HMB生産能を有する細菌の菌体を利用することに
より実施できる。この態様を、「生物変換法の第２の態様」ともいう。すなわち、生物変換工程は、例えば、細菌の菌体を利用して反応液中のHMB前駆体をHMBに変換する工程であってよい。生物変換工程は、具体的には、細菌の菌体を反応液中のHMB前駆体に作用させ
、HMBを該反応液中に生成蓄積する工程であってもよい。そのような菌体を利用して実施
する生物変換工程を、「変換反応」ともいう。

細菌の菌体は、細菌を培養することにより得られる。菌体を取得するための培養法は、細菌が増殖できる限り、特に制限されない。菌体を取得するための培養時には、前駆体は、培地に含有されていてもよく、含有されていなくてもよい。また、菌体を取得するための培養時には、HMBは、培地に生産されてもよく、されなくてもよい。生物変換法の第２
の態様における菌体を取得するための培養については、発酵法における培養についての記載（例えば、培地や培養条件についての記載）を準用できる。

菌体は、培養液（具体的には培地）に含有されたまま変換反応に用いてもよく、培養液（具体的には培地）から回収して変換反応に用いてもよい。また、菌体は、適宜処理に供してから変換反応に用いてもよい。すなわち、菌体としては、細菌の培養液、該培養液から回収した菌体、それらの処理物が挙げられる。すなわち、菌体は、例えば、細菌の培養液、該培養液から回収した菌体、それらの処理物、またはそれらの組み合わせの形態で用いられてよい。また、言い換えると、菌体としては、細菌の培養液に含有される菌体、該培養液から回収した菌体、それらの処理物に含有される菌体が挙げられる。すなわち、菌体は、例えば、細菌の培養液に含有される菌体、該培養液から回収した菌体、それらの処理物に含有される菌体、またはそれらの組み合わせの形態で用いられてよい。処理物としては、菌体（例えば、培養物に含有される菌体や、培養物から回収した菌体）を処理に供したものが挙げられる。これらの態様の菌体は、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用してよい。

菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過が挙げられる。また、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用してよい。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。

菌体の処理としては、例えば、希釈、濃縮、アクリルアミドやカラギーナン等の担体への固定化処理、凍結融解処理、膜の透過性を高める処理が挙げられる。膜の透過性は、例えば、界面活性剤または有機溶媒を利用して高めることができる。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用してよい。

変換反応に用いられる菌体は、HMB生産能を有していれば特に制限されない。菌体は、
代謝活性が維持されているのが好ましい。「代謝活性が維持されている」とは、菌体が炭素源を資化してHMBの生産に利用され得る成分を生成または再生する能力を有しているこ
とを意味してよい。生物変換法においてHMBの生産に利用され得る成分であって菌体によ
り生成または再生され得るものとしては、α－ケトグルタル酸が挙げられる。菌体は、生育する能力を有していてもよく、有していなくてもよい。

変換反応は、適切な反応液中で実施することができる。変換反応は、具体的には、菌体と前駆体とを適切な反応液中で共存させることにより実施することができる。変換反応は、バッチ式で実施してもよく、カラム式で実施してもよい。バッチ式の場合は、例えば、反応容器内の反応液中で、細菌の菌体と前駆体とを混合することにより、変換反応を実施できる。変換反応は、静置して実施してもよく、撹拌や振盪して実施してもよい。カラム式の場合は、例えば、固定化菌体を充填したカラムに前駆体を含有する反応液を通液することにより、変換反応を実施できる。反応液としては、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）が挙げられる。

反応液は、前駆体に加えて、前駆体以外の成分を必要に応じて含有してよい。前駆体以
外の成分としては、HMBの生産に利用され得る成分、金属イオン、緩衝剤、界面活性剤、
有機溶媒、炭素源、リン酸源、その他各種培地成分が挙げられる。生物変換法においてHMBの生産に利用され得る成分としては、酸素やα－ケトグルタル酸が挙げられる。なお、
典型的には、α－ケトグルタル酸は、菌体により生成または再生され得る。反応液は、例えば、培地であってもよい。すなわち、生物変換法の第２の態様における反応液については、生物変換法の第１の態様における培地についての記載を準用できる。反応液に含有される成分の種類や濃度は、用いる前駆体の種類や、用いる菌体の態様等の諸条件に応じて適宜設定してよい。

変換反応の条件（溶存酸素濃度、反応液のpH、反応温度、反応時間、各種成分の濃度等）は、HMBが生成する限り特に制限されない。変換反応は、例えば、静止菌体等の細菌菌
体を利用した物質変換に用いられる通常の条件で行うことができる。変換反応の条件は、使用する細菌の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。変換反応は、例えば、好気条件で実施してよい。「好気条件」とは、反応液中の溶存酸素濃度が、0.33 ppm以上、または1.5 ppm以上である条件を意味してよい。酸素濃度は、具体的には、例えば、飽和酸素
濃度に対し、1～50％、または5％程度に制御されてよい。反応液のpHは、例えば、通常6.0～10.0、または6.5～9.0であってよい。反応温度は、例えば、通常15～50℃、15～45℃
、または20～40℃であってよい。反応時間は、例えば、5分～200時間であってよい。カラム法の場合、反応液の通液速度は、例えば、反応時間が上記例示した反応時間の範囲となるような速度であってよい。また、変換反応は、例えば、細菌や酵母等の細菌の培養に用いられる通常の条件等の培養条件で行うこともできる。変換反応においては、菌体は、生育してもよく、しなくてもよい。すなわち、生物変換法の第２の態様における変換反応については、同態様においては菌体が生育してもしなくてもよいこと以外は、生物変換法の第１の態様における培養についての記載を準用できる。そのような場合、菌体を取得するための培養条件と、変換反応の条件は、同一であってもよく、なくてもよい。反応液中の前駆体の濃度は、フリー体の重量に換算して、例えば、0.1 g/L以上、1 g/L以上、2 g/L
以上、5 g/L以上、10 g/L以上、または15 g/L以上であってもよく、200 g/L以下、100 g/L以下、50 g/L以下、または20 g/L以下であってもよく、それらの組み合わせであっても
よい。反応液中の菌体の濃度は、例えば、600nmにおける光学密度（OD）に換算して、1以上であってもよく、300以下であってもよく、それらの組み合わせであってもよい。

変換反応の過程において、菌体、前駆体、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで、反応液に供給してもよい。例えば、HMBの生成に伴う前駆体の減少また
は枯渇に応じて反応液に前駆体を追加で供給してもよい。これらの成分は、１回または複数回供給されてもよく、連続的に供給されてもよい。

前駆体等の各種成分を反応液に供給する手段は特に制限されない。これらの成分は、いずれも、反応液に直接添加することにより、反応液に供給することができる。また、例えば、本明細書に記載の細菌と前駆体生産能を有する細菌を共培養することにより、前駆体生産能を有する細菌に前駆体を反応液中に生成させ、以て前駆体を反応液に供給することもできる。「或る成分を反応液に供給する」という場合の「成分」には、反応液中で生成または再生するものも包含されてよい。

また、反応条件は、変換反応の開始から終了まで均一であってもよく、変換反応の過程において変化してもよい。「反応条件が変換反応の過程において変化する」ことには、反応条件が時間的に変化することに限られず、反応条件が空間的に変化することも包含されてよい。「反応条件が空間的に変化する」とは、例えば、カラム式で変換反応を実施する場合に、反応温度や菌体密度等の反応条件が流路上の位置に応じて異なっていることを意味してよい。

このようにして生物変換工程を実施することにより、HMBを含有する培養液（具体的に
は培地）または反応液が得られる。HMBが生成したことの確認やHMBの回収は、いずれも、上述した発酵法と同様に実施することができる。すなわち、生物変換法は、さらに、回収工程（例えば、培養液（具体的には培地）または反応液からHMBを回収する工程）を含ん
でいてよい。尚、回収されるHMBは、HMB以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、反応液成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の他の成分を含んでいてもよい。回収されたHMBの純
度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。

＜３＞酵素を利用したHMBの製造方法
HMBは、KICDを利用してHMB前駆体から製造することができる。すなわち、HMBの製造方
法は、KICDを利用してHMB前駆体からHMBを製造する工程を含む方法であってよい。同方法を、「酵素法」ともいう。同方法においては、KICDを利用してHMB前駆体からHMBを製造する工程を、「HMB製造工程」ともいう。

HMB製造工程においては、KICDに加えて、必要により他の酵素が利用される。他の酵素
としては、HMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵素が挙げられる。HMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵素としては、branched-chain-amino-acid aminotransferaseが挙げられる。branched-chain-amino-acid aminotransferaseは、特に、ロイシンをHMB前駆体とす
る酵素法によりHMBを製造する場合に有用であり得る。

すなわち、製造工程は、具体的には、例えば、HMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵
素およびKICDを利用してHMB前駆体からHMBを製造する工程であってよい。製造工程は、より具体的には、例えば、branched-chain-amino-acid aminotransferaseおよびKICDを利用してロイシンからHMBを製造する工程であってよい。製造工程は、例えば、branched-chain-amino-acid aminotransferase等のHMB前駆体のKICAへの変換を触媒する酵素を利用してロイシンをKICAに変換する工程と、KICDを利用してKICAをHMBに変換する工程を含んでい
てもよい。

HMB前駆体および各酵素（例えば、KICDやbranched-chain-amino-acid aminotransferase）については上述の通りである。

以下、一例として、KICDの製造について記載するが、当該記載はbranched-chain-amino-acid aminotransferase等の他の酵素の製造にも準用できる。

KICDは、KICD遺伝子を有する宿主にKICD遺伝子を発現させることにより製造することができる。また、KICDは、無細胞タンパク質合成系を利用して製造することができる。

KICD遺伝子を有する宿主を、「KICDを有する宿主」ともいう。KICD遺伝子を有する宿主は、本来的にKICD遺伝子を有するものであってもよく、KICD遺伝子を有するように改変されたものであってもよい。本来的にKICD遺伝子を有する宿主としては、上記例示したKICDが由来する生物が挙げられる。KICD遺伝子を有するように改変された宿主としては、KICD遺伝子が導入された宿主が挙げられる。また、本来的にKICD遺伝子を有する宿主を、KICD遺伝子の発現が増大するように改変してもよい。KICD遺伝子の発現に利用する宿主は、機能するKICDを発現できる限り、特に制限されない。宿主としては、例えば、細菌や酵母（真菌）等の細菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞が挙げられる。

KICD遺伝子は、KICD遺伝子を有する宿主を培養することにより発現させることができる。培養方法は、KICD遺伝子を有する宿主が増殖してKICDを発現できる限り、特に制限されない。KICD遺伝子を有する宿主の培養については、発酵法の培養に関する記載を準用でき
る。必要により、KICD遺伝子の発現を誘導できる。培養により、KICDを含有する培養液が得られる。KICDは、宿主細胞および／または培地中に蓄積し得る。

宿主細胞や培地中に存在するKICDは、そのまま酵素反応に用いてもよく、そこから精製して酵素反応に用いてもよい。精製は、所望の程度に実施することができる。すなわち、KICDとしては、精製されたKICDを用いてもよく、KICDを含有する画分を用いてもよい。そのような画分は、KICDが基質に作用できるように含有される限り、特に制限されない。そのような画分としては、KICD遺伝子を有する宿主（すなわちKICDを有する宿主）の培養液、同培養物から回収した菌体、同菌体の処理物（例えば、菌体破砕物、菌体溶解物、菌体抽出物、アクリルアミドやカラギーナン等で固定化した固定化菌体）、同培養物から回収した培養上清、それらの部分精製物（すなわち粗精製物）、それらの組み合わせが挙げられる。これらの画分は、単独で、あるいは精製されたKICDと組み合わせて、利用できる。

HMB製造工程は、適切な反応液中で実施することができる。各酵素は、同時に反応液に
供給されてもよく、そうでなくてもよい。各酵素の反応液への供給態様は、HMB前駆体のHMBへの変換が成立する限り、特に制限されない。変換反応は、例えば、KICDおよび必要により他の酵素とHMB前駆体とを適切な反応液中で共存させることにより実施することがで
きる。また、変換反応は、例えば、KICDおよび必要により他の酵素と対応する基質とを順に適切な反応液中で共存させることにより実施することができる。例えば、branched-chain-amino-acid aminotransferaseおよびKICDを利用してロイシンからHMBを製造する場合
、KICDに対応する基質はKICAであってよく、他の酵素（この場合はbranched-chain-amino-acid aminotransferase）に対応する基質はロイシンであってよい。HMB製造工程の実施
条件は、HMBが生成する限り、特に制限されない。HMB製造工程は、例えば、酵素や細菌菌体（例えば、静止菌体）を利用した物質変換に用いられる通常の条件で実施することができる。酵素法におけるHMB製造工程については、例えば、生物変換法の第２の態様におけ
る変換反応に関する記載を準用できる。

このようにしてHMB製造工程を実施することにより、HMBを含有する反応液が得られる。HMBが生成したことの確認やHMBの回収は、いずれも、上述した発酵法と同様に実施することができる。すなわち、酵素法は、さらに、回収工程（例えば、反応液からHMBを回収す
る工程）を含んでいてよい。尚、回収されるHMBは、HMB以外に、例えば、酵素、反応液成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の他の成分を含んでいてもよい。回収されたHMBの純
度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。

＜４＞変異型KICD
本発明は、他の態様としては、「特定の変異」を有するKICDを提供する。

上述した通り、「特定の変異」を有するKICDを、「変異型KICD」ともいう。また、変異型KICDをコードする遺伝子を、「変異型KICD遺伝子」ともいう。

「変異型KICD」、「変異型KICD遺伝子」、および「特定の変異」については、上記「＜１－２＞KICDの活性の増大」において詳細に説明された記載を援用できる。

変異型KICDの製造については、上記「KICDの製造」として例示された酵素の製造方法についての記載を援用できる。

以下、非限定的な実施例を参照して、本発明をさらに具体的に説明する。

本実施例では、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ（α-ketoisocaproate dioxygenase；KICD）を異種発現したEscherichia coliを利用して、炭素源またはＬ－ロイシンからの３－ヒドロキシイソ吉草酸（3-hydroxy 3-methylbutyric acid；HMB）の生産を実
施した。

＜１＞材料
本実施例で使用した菌株、プラスミド、および培地は以下の通りである。

＜１－１＞使用菌株
Escherichia coli JM109株
Escherichia coli MG1655-ilvG*MDC-leuA*株

＜１－２＞使用プラスミド
表１の通り。表中、「塩基配列」とは搭載遺伝子の塩基配列を、「アミノ酸配列」とは搭載遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ示す。

＜１－３＞使用培地
＜１－３－１＞Leu変換用MS培地
表２に示す2つの区分をそれぞれ調製し、各々フィルター滅菌もしくは殺菌後に混合し
、Leu変換用MS培地とした。Leu変換用MS培地は、予め乾熱滅菌した炭酸カルシウムを終濃度が30 g/lになるように添加して培養に用いた。

＜１－３－２＞発酵用培地
表３に示すA区とB区をそれぞれ調製し、9:1の割合で混合して得た混合液に、終濃度が30g/Lになるようにグルコースを溶解した後、115℃で15 min殺菌し、発酵用培地とした。

＜２＞KICD発現プラスミドの構築
E. coliのゲノム上にはKICD遺伝子は存在しないため、まずは、E. coliで発現させるるためのKICD候補遺伝子の探索を行った。KICD活性は、広い基質特異性を有する4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase（HPD）が有する活性の一つとして知られている。生体内でのHMB生成活性が報告されているHomo sapience由来HPDとの同一性が高い遺伝子をKEGGのBlast searchで抽出し、表１に示す計8種類のKICD遺伝子を候補とした。これら8種類のKICD
遺伝子がコードするKICDの系統樹解析の結果を図１に示す。

前記8種類のKICD遺伝子をpMW119へ接続した各種KICD発現プラスミド（表１）の製造をGene script社へ依頼し、それらKICD発現プラスミドを取得した。それらKICD発現プラスミド中のKICD遺伝子は、いずれも、E. coliでの発現用にコドン最適化されている。

＜３＞IlvE発現プラスミドpACYC177-P4071-ilvEの構築
プライマー１および２（配列番号１９および２０）を1:1で混合し、サーマルサイクラ
ーで95℃に加熱した後、95℃から25℃まで5℃間隔で各5分間維持して徐冷することでP4071-SD断片を取得した。別途、E. coliMG1655株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー３および４（配列番号２１および２２）を用いてPCRを実施し、Cloning Enhancer処理によっ
てilvE遺伝子断片を増幅した。得られたP4071-SD断片とilvE遺伝子断片と、制限酵素EcoRIとPstIによって切断したpACYC177断片をin-Fusionで連結し、IlvE発現プラスミドpACYC177-P4071-ilvEを得た。

＜４＞プラスミドの導入
ilvE発現プラスミドおよび各KICD発現プラスミドでE. coliJM109株を形質転換し、ilvEおよび各KICDを共発現するE. coli株を得た。また、pACYC177および各KICD発現プラスミ
ドでE. coli JM109株を形質転換し、各KICDを発現するE. coli株を得た。また、pACYC177およびpMW119でE. coli JM109株を形質転換し、対照株を得た。形質転換方法は以下の通
りである。

グリセロールストックから適切な薬剤を含むLB寒天培地にNUNC社製の青エーゼ (品番:254410) 1杯分の菌体を接種し、37℃で1晩培養を行った。プレートから菌体を回収し、4℃に予め冷却しておいた殺菌済みの10%グリセロール1 mlに懸濁し、遠心して集菌した。そ
の後、10%グリセロール1 mlに再度懸濁し、遠心して集菌した。これを2回繰り返した後、10%グリセロール500 μlに懸濁し、80 μlずつ分注し、形質転換プラスミド溶液を添加混合し、形質転換用液とした。この形質転換用液をBioRAD社製のGene Pulser Cuvette (Cat. No. 165-2089) へ入れ、同社製のGene Pulser Xcellでエレクトロポレーションした。
エレクトロポレーションの条件は「Pre-set protocol」の「E. coli-1mm, 1.8kV」とした。エレクトロポレーション後、SOC培地を1 ml添加し、37℃で1hr振とう培養後、各種抗生物質入りのプレートへ塗布して、37℃で1晩培養し、形質転換体を得た。

＜５＞Ｌ－ロイシンからの変換によるHMB生産
取得したE. coli株を用いて、ロイシンからの変換によるHMB生産を実施した。Ｌ－ロイシンはIlvEの作用によりα－ケトイソカプロン酸（α-ketoisocaproic acid；KICA）に変換され得、KICAはKICDの作用によりHMBに変換され得る。IlvEの反応で利用され得るα－
ケトグルタル酸（α-KG）としては、E. coliが代謝物として産生するものを利用した。各E. coli株を太試験管中のLeu変換用MS培地で培養した。24時間培養後の培養液中のHMB蓄
積量を測定した。

結果（N=3）を図２に示す。Bacillus thuringiensis serovar由来KICD（BTK_01190_KICD）またはGemmatirosa kalamazoonesis 由来KICD（J421_3703_KICD）の発現プラスミドをilvE発現プラスミドと組み合わせて導入した株において、対照株と比較して有意に高いHMB蓄積が確認された（図２のパネル（ａ）参照）。これより、前述の2つの遺伝子は、E. coli菌体内で発現し、HMB合成活性を有することが示唆された。また、KICD遺伝子を導入した細菌を利用してＬ－ロイシンからHMBを製造できることが示された。

＜６＞発酵法によるHMB生産
＜６－１＞E. coli HMB生産株MG1655-ilvG*MDC-leuA*/J421_3703_KICDの構築
遺伝子組み換え用リコンビナーゼ搭載プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）でE. coli MG1655株（ATCC 47076）を形質転換し、att-Km-P4071-leuA*断片（後述）をエレクトロポレーションにより導入し、Redドリブ
ンインテグレーション法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci.
U S A. 97:6640-6645 (2000)）によりゲノム上のleuAローカスを同断片で置換し、λフ
ァージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）でカナマイシン耐性遺伝子を除去することで、leuA改変型E. coli株を得た。さらに、pKD46でleuA改変型E. coli株を形質転換し、att-Cm-P4071-ilvG*MDC断片（後述）をエレクトロポレーションにより導入し、Redドリブンインテグレ
ーション法によりゲノム上のppcローカスを同断片で置換し、λファージ由来の切り出し
システムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、leuA改変ilvG*MDC強化型E. coli株MG1655-ilvG*MDC-leuA*を得た。Gemmatirosa kalamazoonesis 由来KICD発現プ
ラスミドpMW119_J421_3703および対照ベクターpMW119でMG1655-ilvG*MDC-leuA*株を形質
転換し、それぞれ、HMB生産株MG1655-ilvG*MDC-leuA*/J421_3703_KICD、および、対照株M
G1655-ilvG*MDC-leuA*/pMW119を構築した。各DNA断片の構築については、下記に示す。

＜６－２＞att-Km-P4071-leuA*断片の構築
pMW118-attL-Km-attR（WO05/010175）とP4071プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）の連結配列を鋳型として、プライマー223および224（配列番号２３および２４）を用いてPCRを実施し、att-Km-P4071断片を
取得した。別途、E. coli MG1655由来LueAの４７９位のグリシン残基をシステイン残基へ置換した改変型LueAをコードするleuA*遺伝子の塩基配列（特開2001-037494)を鋳型とし
て、プライマー229および230（配列番号２５および２６）を用いてPCRを実施し、leuA*断片を取得した。最後に、等量のatt-Km-P4071断片とleuA*断片を鋳型として、プライマー231および232（配列番号２７および２８）を用いてPCRを実施し、att-Km-P4071-leuA*断片を取得した。同断片中のカナマイシン耐性遺伝子（Km）は、宿主ゲノムへの組み込み後にλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）で除去可能である。

＜６－３＞att-Cm-P4071-ilvG*MDC断片の構築
pMW118-attL-Cm-attR（WO05/010175）とP4071プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）の連結配列を鋳型として、プライマー215および216（配列番号２９および３０）を用いてPCRを実施し、att-Cm-P4071断片を
取得した。別途、フレームシフト変異を有さないilvG遺伝子を収容するように改変されたE. coli MG1655由来ilvG遺伝子（US7300776B2）を鋳型として、プライマー217および218
（配列番号３１および３２）を用いてPCRを実施し、ilvG*M断片を取得した。等量のatt-Cm-P4071断片とilvG*M断片を鋳型として、プライマー225および218（配列番号３３および
３２）を用いてPCRを実施し、att-Cm-P4071-ilvG*M断片を取得した。また、E. coli MG1655株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー219および220（配列番号３４および３５）を
用いてPCRを実施し、ilvD断片を取得した。別途E. coli MG1655株株のゲノムDNAを鋳型として、プライマー221および222（配列番号３６および３７）を用いてPCRを実施し、ilvC
断片を取得した。次に、等量のilvD断片とilvC断片を鋳型として、プライマー219および226（配列番号３４および３８）を用いてPCRを実施し、ilvDC断片を取得した。最後に、等量のatt-Cm-P4071-ilvG*M断片とilvDC断片を鋳型として、プライマー284および285（配列番号３９および４０）を用いてPCRを実施し、att-Cm-P4071-ilvG*MDC断片を取得した。同断片中のクロラムフェニコール耐性遺伝子（Cm）は、宿主ゲノムへの組み込み後にλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）で除去可能である。

＜６－４＞発酵法によるHMB生産
ロイシン無添加条件でのグルコースを炭素源とした直接発酵法によるHMB生産を実施し
た。

グリセロールストックから適切な薬剤を含むLB寒天培地にNUNC社製の青エーゼ (品番:254410) 1杯分のHMB生産株または対照株の菌体を接種し、37℃で1晩培養を行った。プレートから回収した菌体を0.9％生理食塩水に懸濁し、菌体液を作製した。15 mlの培養液を300 mlの適切な薬剤を含む発酵用培地(組成は後述する)が入った500 ml容ジャーファーメンター(エイブル社製)に菌体液を接種し、通気量300 ml/分、37℃、pH6.6、800 rpmで120時間通気攪拌培養した。培養後、培養液中に含まれるHMB量を測定した。

結果を図３に示す。HMB生産株MG1655-ilvG*MDC-leuA*/J421_3703_KICDにおいて、対照
株と比較して有意に高いHMB蓄積が確認された。これより、Gemmatirosa kalamazoonesis
由来KICD遺伝子は、E. coli菌体内で発現し、HMB合成活性を有することが示唆された。また、KICD遺伝子を導入した細菌を利用して発酵法によりHMBを製造できることが示された
。

＜７＞KICDおよびKICD変異体を用いたHMB生産
＜７－１＞KICD発現プラスミドの構築
Gemmatirosa kalamazoonesis由来KICD（J421_3703_KICD）およびKICDのアミノ酸配列の357位のグリシンがアラニンに変異したKICD変異体（KICD_G357A）の発現プラスミドは、pET22bと連結して構築した（pET22b-KICDおよびpET22b-KICD_G357A）。構築については、GenScript社に製造を依頼した。それらKICD発現プラスミド中のKICD遺伝子は、E. coliで
の発現用にコドン最適化されている。

＜７－２＞Escherichia coli AG18313 attBφ80::T7-RNAP (TcR)株の構築
＜７－２－１＞MG1655 Scr+株（MG1655 edgA::scrKYABR株）の構築
pMH10を有するMG1655株にscrKYABRオペロンを有しているpMS1（特開2001-346578）を導入し、先行知見と同様にMini-mu法を用いてscrKYABRオペロンを染色体上に挿入すること
で、MG1655 Scr+株を構築した。

＜７－２－２＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4株の構築
E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBN4株(US20140335574A1)の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+株にP1トランスダクション（Sambrook et al, “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）により導入し、λファージ由来の切り出しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4株を構築した。

＜７－２－３＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4
E. coli B7 ΔilvIH ΔilvGM ΔilvBN Δpps::cat-P_L-ilvBN4株の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+ PL-ilvBN4株にP1トランスダクションにより導入し、λファージ由来の切
り出しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4株を構築した。

＜７－２－４＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB株の構築
E. coli BW25113 cat-P_L-yddG株(WO2003044192A1)を鋳型として、プライマーtyrB-up1
およびtyrB-up3（配列番号４１および４２）を用いてPCRを実施し、att-cat-PLプロモー
ター断片を取得した。次いで、遺伝子組換え用リコンビナーゼ搭載プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645）を有するE. coli MG1655株（ATCC 47076）にatt-cat-P_Lプロモーター断片をエレクトロポレーションにより導入し、Redドリブンインテグレーション法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）によりゲノム上のtyrB遺伝子のプロモーターを同断片で置換し、MG1655 cat-P_L-tyrB株を構築した。さらにMG1655 cat-P_L-tyrB株の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4株にP1トランスダクシ
ョンにより導入し、λファージ由来の切り出しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB株を構築した。

＜７－２－５＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD株の構築
上記構築したMG1655 cat-P_L-tyrB株を鋳型として、プライマーLeu-attRおよびPL-leu（配列番号４３および４４）を用いてPCRを実施し、att-cat-P_Lプロモーター断片を取得し
た。次いで、遺伝子組み換え用リコンビナーゼ搭載プラスミドpKD46を有するE. coli 55
株（US6403342）にatt-cat-P_Lプロモーター断片をエレクトロポレーションにより導入し
、Redドリブンインテグレーション法によりゲノム上のtyrB遺伝子のプロモーターを同断
片で置換し、E. coli 55 cat-P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD株を構築した。さらにE. coli 55
cat-P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD株の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB株にP1トランスダクションにより導入し、λファージ由来の切り出
しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB cat-P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD株を構築した。

＜７－２－６＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD P_L-ilvBN4DA株の構築
B7 ΔilvIH ΔilvGM cat-P_L-ilvBN4株の染色体DNAの鋳型として、プライマーattR-ilvG5およびilvND（配列番号４５および４６）を用いてPCRを実施し、attR-ilvG5断片を取得
した。次いで、遺伝子組換え用リコンビナーゼ搭載プラスミドpKD46を有するE. coli B7 ΔilvBN ΔilvIH株（US20140335574A1）にattR-ilvG5断片をエレクトロポレーションにより導入し、Redドリブンインテグレーション法によりゲノム上のilvGME遺伝子とilvG遺伝
子のプロモーターを同断片で置換し、B7ΔilvBN ΔilvIH cat-P_L-ilvBN4DA株を構築した
。さらにB7ΔilvBN ΔilvIH cat-P_L-ilvBN4DA株の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD株にP1トランスダクションにより導入し、λファージ由来の切り出しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD P_L-ilvBN4DA株を構築した。

＜７－２－７＞MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD P_L-ilvBN4DA ΔtyrB(AG18313株)の構築
MG1655 ΔtyrB::cat株(US20220213515)の染色体からのDNA断片をMG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD P_L-ilvBN4DA株にP1トランスダクションにより導入し、λファージ由来の切り出しシステムでクロラムフェニコール耐性遺伝子を除去することで、MG1655 Scr+ P_L-ilvBN4 Δpps::P_L-ilvBN4 P_L-tyrB P_L-leuA55(Gly479Cys)BCD P_L-ilvBN4DA ΔtyrB(AG18313株)を構築した。

＜７－２－８＞AG18313 attBφ80::T7-RNAP(TcR)株の構築
染色体上にT7-RNAPを導入するためのプラスミドはpAH162-λattLR-T7Polプラスミドを
用いた。pAR1219プラスミドの制限酵素BamH Iで切断し、T7遺伝子を含むフラグメントを
得た。得られたフラグメントをpAH162-λattL-TcR-λattRのBamH I認識部位中サにクローニングし、反応液をE. coli BW25141株に導入することでpAH162-λattLR-T7Polプラスミ
ドを得た。次にpAH123プラスミドを保有するMG1655株にpAH162-λattLR-T7Polプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、MG1655 attBφ80::T7-RNAP(TcR)株を構築した
。さらに、MG1655 attBφ80::T7-RNAP(TcR)株の染色体からのDNA断片をAG18313株にP1ト
ランスダクションにより導入し、AG18313 attBφ80:: T7-RNAP(TcR)株を構築した。

＜７－３＞HMB生産菌の構築
上記により構築したEscherichia coli AG18313 attBφ80::T7-RNAP(TcR)株をプラスミ
ドpET22b-KICD_G357AあるいはpET22b-KICDで形質転換を行い、HMB生産菌であるAG18313 attBφ80::T7-RNAP (TcR)/pET22b-KICD_G357A株およびAG18313 attBφ80::T7-RNAP (TcR)/pET22b-KICD株を構築した。

＜７－４＞発酵法によるHMB生産
取得したE. coli株を用いて、炭素源からの変換によるHMB生産を実施した。Ｌ－ロイシンはIlvEの作用によりα－ケトイソカプロン酸（α-ketoisocaproic acid；KICA）に変換され、KICAはKICDの作用によりHMBに変換され得る。IlvEの反応で利用され得るα－ケト
グルタル酸（α-KG）としては、E. coliが代謝物として産生するものを利用した。各E. coli株を試験管中のHMB生産培地（表４）を用いて32℃で振とう培養し、72時間後の培養液中のHMB蓄積量を測定した。なお、HMB生産培地は116℃で30分滅菌した。ただし、スクロ
ース、LB培地およびCaCO₃は、以下の通り別々に滅菌した。スクロースは110℃で30分滅菌、LB培地は116℃で30分滅菌、CaCO₃は乾熱滅菌した。培地のpHはKOH水溶液でpH7.0に調整した。Ile, Val, Leu, Phe, Tyr, AmpおよびIPTGは、別途殺菌し添加した。

その結果、AG18313 attBφ80::T7-RNAP(TcR)/pET22b-KICD株（対照株）と比較して、AG18313 attBφ80::T7-RNAP(TcR)/pET22b-KICD_G357A株（KICD変異株）において有意に高いHMB蓄積が確認された（表５）。

＜配列表の説明＞
配列番号１：Bacillus thuringiensisのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号２：Bacillus thuringiensisのKICDのアミノ酸配列
配列番号３：Gemmatirosa kalamazoonesisのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号４：Gemmatirosa kalamazoonesisのKICDのアミノ酸配列
配列番号５：Homo sapienceのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号６：Homo sapienceのKICDのアミノ酸配列
配列番号７：Yarrowia lipolyticaのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号８：Yarrowia lipolyticaのKICDのアミノ酸配列
配列番号９：Aspergillus oryzaeのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号１０：Aspergillus oryzaeのKICDのアミノ酸配列
配列番号１１：Chondrus crispusのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号１２：Chondrus crispusのKICDのアミノ酸配列
配列番号１３：Pantoea ananatisのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号１４：Pantoea ananatisのKICDのアミノ酸配列
配列番号１５：Ferroplasma acidiphilumのKICD遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Ferroplasma acidiphilumのKICDのアミノ酸配列
配列番号１７：Escherichia coliのilvE遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Escherichia coliのIlvEのアミノ酸配列
配列番号１９～４６：プライマー

Claims (22)

1. ３－ヒドロキシイソ吉草酸の製造方法であって、
   ３－ヒドロキシイソ吉草酸生産能を有する細菌を利用して３－ヒドロキシイソ吉草酸を製造する工程
   を含み、
   前記細菌が、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、方法。
2. 前記製造が、炭素源を含有する培地で前記細菌を培養し、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該培地中に生成蓄積させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記製造が、前記細菌を利用して３－ヒドロキシイソ吉草酸の前駆体を３－ヒドロキシイソ吉草酸に変換する工程を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記変換が、前記前駆体を含有する培地で前記細菌を培養し、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該培地中に生成蓄積させる工程を含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記変換が、前記細菌の菌体を反応液中の前記前駆体に作用させ、３－ヒドロキシイソ吉草酸を該反応液中に生成蓄積させる工程を含む、請求項３に記載の方法。
6. 前記菌体が、前記細菌の培養液、該培養液から回収した菌体、それらの処理物、またはそれらの組み合わせの形態で用いられる、請求項５に記載の方法。
7. 前記前駆体が、ロイシンである、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が増大した、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
9. α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼをコードする異種遺伝子の導入により、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼの活性が増大した、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、配列番号６、８、１０、１２、１４、または１６に示すアミノ酸配列からなる場合を除く、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、フィルミクテス（Firmicutes）門に属する細菌またはゲンマティモナス（Gemmatimonadetes）門に属する細菌に由来するα－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法：
    （ａ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
    （ｂ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質；
    （ｃ）配列番号２または４に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミ
    ノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質。
13. 前記α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼが、配列番号４に示すアミノ酸配列において、３５７位のグリシン残基における他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有するタンパク質である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記他のアミノ酸残基が、アラニン残基である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細菌が、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌またはコリネ型細菌である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、パントエア（Pantoea）属細菌、またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細菌が、さらに、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記細菌が、さらに、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、および／またはジヒドロキシ酸デヒドラターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
20. さらに、３－ヒドロキシイソ吉草酸を回収する工程を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
21. 変異型α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼであって、
    配列番号４に示すアミノ酸配列において、３５７位のグリシン残基における他のアミノ酸残基への置換を含むアミノ酸配列を含み、且つ、α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ活性を有する、変異型α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ。
22. 前記他のアミノ酸残基が、アラニン残基である、請求項２１に記載の変異型α－ケトイソカプロン酸ジオキシゲナーゼ。

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