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WO2015115849A1 - 배양배지의 최적화를 통한 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법 - Google Patents

배양배지의 최적화를 통한 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법 Download PDF

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Publication number
WO2015115849A1
WO2015115849A1 PCT/KR2015/000997 KR2015000997W WO2015115849A1 WO 2015115849 A1 WO2015115849 A1 WO 2015115849A1 KR 2015000997 W KR2015000997 W KR 2015000997W WO 2015115849 A1 WO2015115849 A1 WO 2015115849A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
culture
asparagine
osmotic pressure
recombinant protein
galactosylation
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/000997
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
정준
송원석
이준억
김연철
Original Assignee
주식회사 엘지생명과학
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 엘지생명과학 filed Critical 주식회사 엘지생명과학
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Priority to MX2016009848A priority patent/MX380800B/es
Priority to US15/115,519 priority patent/US20170166941A1/en
Priority to AU2015211514A priority patent/AU2015211514B2/en
Priority to CA2943667A priority patent/CA2943667C/en
Priority to JP2016549133A priority patent/JP6797458B2/ja
Priority to CN201580006724.XA priority patent/CN106029871A/zh
Priority to RU2016132368A priority patent/RU2642285C1/ru
Priority to TR2016/10497T priority patent/TR201610497T1/tr
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Priority to AU2018214037A priority patent/AU2018214037B2/en

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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N2500/30—Organic components
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    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention comprises the step of increasing the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cells expressing the desired recombinant protein, galactosylation is controlled, the method for producing a desired recombinant protein or the desired recombinant A method of regulating galactoselation of proteins; A method for producing a recombinant protein of interest, or a method for producing a recombinant protein of interest, comprising the step of supplementing the animal cell culture with asparagine during the culturing of the animal cell expressing the recombinant protein of interest, or controlling the galactose of the recombinant protein of interest.
  • a method for producing a recombinant protein of interest, or a recombinant protein of interest, wherein galactosylation is controlled including increasing the osmotic pressure of the animal cell culture solution and supplementing asparagine during the culturing of the animal cell expressing the recombinant protein of interest.
  • Antibodies are proteins that can bind to antigens to interfere with or remove antigens. As the therapeutic antibody market has been found to have great potential, research is being actively conducted for efficient expression and mass production of antibodies. have. One of the important points in the production of such antibodies is the homogeneity of the antibody populations produced. In particular, the glycoform profile of monoclonal antibodies is important for monoclonal antibody production. However, various variables during cell culture can affect the glycosylation profile of monoclonal antibodies produced. Accordingly, there has been a demand for the development of a method capable of constantly controlling the glycosylation of the prepared antibody population and the content of isomeric antibodies.
  • galactosylation of antibodies is one of the most important. This galactosylation is known to affect the process of complement dependent cytotoxicity (CDC), one of the largest mechanisms of action (MOA) of monoclonal antibodies.
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • MOA mechanisms of action
  • the galactosylation is performed by using galactose as a structural unit of glycosylation chain reaction, followed by N-acetylglucosamine sugar through galactosyltransferase.
  • the present inventors have made diligent efforts to develop a method capable of effectively controlling galactosylation of recombinant proteins produced in the culture of animal cells producing recombinant proteins. It was confirmed that the galactosylation of the recombinant protein produced can be effectively produced by increasing the osmotic pressure of the animal cell culture solution or supplementing asparagine at a specific culture point. In addition, when supplementing asparagine at the same time as the osmotic pressure of the animal cell culture increases, it was confirmed that galactosylation can be controlled without decreasing the content of the acid isomer antibody according to the osmotic pressure, the present invention was completed.
  • One object of the present invention is to increase the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cells expressing the desired recombinant protein, galactosylation is controlled, the method for producing a recombinant protein of interest To provide.
  • Still another object of the present invention is to provide a method of controlling galactosylation of a recombinant protein of interest, the method comprising increasing the osmotic pressure of the animal cell culture during the culturing of the animal cell expressing the recombinant protein of interest.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a desired recombinant protein, the galactosylation is controlled, comprising the step of replenishing the asparagine to the animal cell culture medium during the culture of the animal cells expressing the desired recombinant protein will be.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for regulating galactosylation of a recombinant protein of interest, comprising the step of supplementing the animal cell culture with asparagine during the culturing of the animal cell expressing the recombinant protein of interest. .
  • Another object of the present invention is to increase the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cells expressing the desired recombinant protein, and supplementing asparagine, the galactosylation of the controlled recombinant protein of the desired It is to provide a manufacturing method.
  • Another object of the present invention is to increase the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cells expressing the recombinant protein of interest, comprising the step of supplementing asparagine, regulating the galactose of the desired recombinant protein To provide a way.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant protein of interest prepared by the above method.
  • the method of the present invention has the advantage of effectively controlling the galactose content of the desired recombinant protein to the desired range.
  • the method of the present invention using both osmotic pressure increase and asparagine addition has the effect of controlling the content of not only galactose but also acid isomeric antibodies, and thus can be effectively used for the preparation of a desired antibody population.
  • 1 depicts expression vectors of adalimumab biosimilars.
  • Figure 2 shows the injection time of the aqueous sodium chloride solution during the fed-batch culture.
  • Figure 3 shows the injection time of asparagine during the fed-batch culture.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object comprises the step of increasing the osmotic pressure of the animal cell culture medium of the culture process of animal cells expressing the recombinant protein of interest, galactosylation is controlled, the desired recombinant protein It is a manufacturing method.
  • the method is a method for producing a recombinant protein of interest, the galactosylation is controlled, comprising the step of raising the osmotic pressure of the animal cell culture in a specific culture day during the culture of animal cells expressing the recombinant protein of interest. .
  • the culture may be a fed-batch culture, but is not limited thereto.
  • fed-batch culture refers to continuous or discontinuous feeding of feeding medium to the culture at any time during the cell growth phase or antibody production phase after incubation with the basal medium or production medium. Means ongoing cell culture.
  • cell culture medium or “culture medium” means a nutrient solution for the maintenance, growth, proliferation or expansion of cells in an artificial in vitro environment outside of a multicellular organism or tissue.
  • Cell culture media can be optimized for specific cell cultures, such as basal culture media formulated to support cell growth, or cell culture production media formulated to promote monoclonal antibody production, with high concentrations of nutrients. There is a concentrated medium.
  • nutrients and media components refer to components constituting the cell culture medium, and are used interchangeably herein.
  • basal culture medium or “basal medium” refers to a medium capable of supporting minimal growth of cells.
  • the basal medium supplies standard inorganic salts such as zinc, iron, magnesium, calcium and potassium, as well as trace elements, vitamins, energy sources, buffer systems and amino acids.
  • Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Basal Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12 medium are included in, but are not limited to, basal medium.
  • cell culture production medium or “production medium” refers to a medium used for the purpose of maximizing expression of monoclonal antibodies in a bioreactor.
  • the production medium may be the same as or different from the base medium, and if it is different, it may be produced by concentrating the base medium itself or adding specific ingredients to the base medium.
  • feeding medium and “additional culture medium” may be a specific nutrient or a medium composed of a plurality of nutrients, all of which may be concentrated products of the base medium. According to the cells to be cultured, various components and concentrations of the feeding medium can be prepared.
  • the cell growth phase means a time when the cell growth rapidly progresses after inoculation.
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells are known to increase the number of cells most actively in the temperature range of 35 ⁇ 37 °C, pH is 7.0 ⁇ 7.3.
  • the cell growth stage culture parameter was a temperature of 36.5 ° C., a pH of 7.1 or 7.0.
  • the term "inoculation” refers to injecting medium and injecting cells into the injected medium to start cell culture.
  • the medium may be pre-injected before the cell is injected or may be injected into the cell reactor simultaneously with the cell.
  • cells can be injected after pre-injecting the medium and maintaining the temperature and oxygen saturation in a predetermined setting range.
  • antibody producer refers to the time when a change in the culture process is applied to maximize the production of monoclonal antibodies. Changes in the process to maximize production include changing the medium or lowering the temperature or dissolved oxygen.
  • the degree of change in galactosylation of the recombinant protein produced in the animal cell expressing the recombinant protein may vary according to the osmotic pressure increase time. That is, when the osmotic pressure is gradually increased during the culture period, the degree of galactosylation is not significantly different from that of the group that does not increase the osmotic pressure, whereas the G0F content is greatly increased when the osmotic pressure is increased at a specific culture point during the culture period. It was confirmed that the galactose may be controlled, specifically, galactose may be inhibited or reduced.
  • the step of increasing the osmotic pressure in the present invention is preferably performed during the main culture process of animal cells expressing the desired recombinant protein, but is not limited thereto.
  • main culture refers to a culture step in which the actual production of monoclonal antibodies is made. As a final step in the culture process, which begins with a single vial of cells, purification of the produced monoclonal antibody is continued when the main culture is completed. It can be distinguished from the term seed culture for the purpose of stepwise increasing the culture volume prior to the main culture.
  • the step of increasing the osmotic pressure may be carried out at a specific culture point of the main culture process of the animal cells, specifically, to be carried out on any one of the culture day 1 to 10 days of the main culture based on the day 0 of the main culture. It may be, more specifically, one day, 4 days, 7 days and 10 days of the culture on the basis of the day 0 starting the main culture may be performed, more specifically, the day 0 starting the main culture It may be performed on the 4th or 7th basis, but is not limited thereto.
  • the step of increasing the osmotic pressure may be performed in a single step of the culture process of the animal cells expressing the desired recombinant protein.
  • the step of increasing the osmotic pressure is not particularly limited, but may be performed so that the final osmotic pressure in the culture medium is 460 to 500 mOsm / kg, more specifically, the increase in the osmotic pressure is the final osmotic pressure in the culture medium 460 to It may be performed to be 480 mOsm / kg, but is not limited thereto.
  • the final osmotic pressure in the culture medium refers to the osmotic pressure appearing at the end of the culture, but is not particularly limited thereto.
  • the step of increasing the osmotic pressure may be 400 to 440mOsm / kg, more specifically 430 to 440 mOm / kg osmotic pressure in the culture medium, but is not limited thereto.
  • the osmotic pressure increase target in the culture medium refers to the degree of osmotic pressure to be increased at the time of performing the step of increasing the osmotic pressure, but is not particularly limited thereto.
  • the osmotic pressure increase may be performed by one or more methods selected from the group consisting of a method of supplementing sodium chloride or potassium chloride to the culture medium of the animal cells and a method of adding glucose to the culture medium, more specifically to supplement the culture medium with sodium chloride It may be carried out in a method, but is not limited thereto.
  • the method of replenishing the sodium chloride in the culture solution may be performed by adding 4M aqueous sodium chloride solution to the culture solution on a specific day during the fed-batch culture to increase the osmotic pressure to a certain level. This is not restrictive.
  • the osmotic pressure in the culture medium, and further increase in the cell through the addition of aqueous sodium chloride solution the activity of beta-galactosidase may be increased, thereby inhibiting galactosylation of monoclonal antibodies.
  • culture refers to a liquid containing cells contained in a shaker flask or bioreactor in culture.
  • the culture and the culture medium may be used interchangeably.
  • the culture medium and the culture medium can be classified according to the presence or absence of animal cells.
  • the recombinant protein may be an antibody, preferably a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibody refers to an antibody that can be produced by a single antibody-forming cell and recognizes one antigenic determinant.
  • the antibody of the present invention is not limited thereto, but may preferably include all therapeutic antibodies commonly used in the art, and specifically may be adalimumab.
  • the antibody is a concept including both the full-length antibody and the antibody fragments
  • the type of the antibody fragment includes all Fv, Fab, Fab ', F (ab') 2 , Fd and the like.
  • the Fv includes both double disulfide Fv (dsFv) and short chain Fv (scFv) forms.
  • Fd means the heavy chain portion included in the Fab fragment.
  • Animal cells expressing the recombinant protein of interest include without limitation natural or transformed cells expressing the recombinant protein.
  • Animal cells expressing the recombinant protein of interest may be an animal cell capable of expressing a recombinant protein that is the target of galactose content control, for example, Chinese hamster ovary cell line (CHO) or mouse myeloma cell line (NSO), but is not limited thereto. no.
  • optimization of the culture parameters, concentration of the basic culture medium, feeding of the optimized additional culture medium may be included.
  • the galactose range of the desired monoclonal antibody is set, the galactose of the monoclonal antibody expressed by the cell line is analyzed, and then the method of controlling the galactose of the monoclonal antibody described above according to the degree of change in galactose is required. Can be.
  • examples of modifications that can be made in incubator operation for the production of monoclonal antibodies with controlled galactose are optimization of culture parameters such as dissolved oxygen (DO), acidity (pH), culture temperature, Agitation, etc. .
  • DO dissolved oxygen
  • pH acidity
  • culture temperature Agitation
  • the temperature was incubated at 36.5 ° C., dissolved oxygen at 30%, and acidity of 7.0.
  • the temperature was 30 ° C., dissolved oxygen was 30%, and the acidity was 7.0.
  • the galactose of the monoclonal antibody can be regulated when the culture in the antibody production apparatus is performed at 28 ° C., dissolved oxygen at 20%, and acidity at 6.9.
  • the basic culture medium for the control of galactose.
  • a culture medium free of animal-derived proteins can be used, and the basal medium developed for fed-batch culture can be optimized to alter the galactosylation of monoclonal antibodies.
  • additional culture media can be optimized for the control of galactose.
  • concentration of the additional culture medium by optimizing the concentration of the metal components added to the additional culture medium to reduce the galactosylation.
  • Galactosylation of the recombinant protein of interest prepared by the above method can be measured by N-glycan profile analysis using a Q-TOF or UPLC instrument.
  • the information provided by the N-glycan profile analysis varies with G0F content, Galactosylation Index (GI), non-glycosylated heavy chain (NGHC), percent afucosylation, and high mannose contents. The main mention of changes in the G0F content.
  • the methods of the present invention may be for preparing antibody populations with reduced galactosylation. That is, after analyzing the galactosylation of the monoclonal antibody expressed by the cell line retained, it is a method that can be applied to prepare an antibody population having a lower level of galactose than the analyzed value.
  • antibody population refers to an antibody group including antibodies that may vary in sugar chain content, and for the purposes of the present invention, the antibody population comprises galactosylated antibodies in a desired ratio. Means a group of regulated antibodies.
  • Another aspect of the present invention is a method of controlling galactoselation of a desired recombinant protein comprising the step of increasing the osmotic pressure of the animal cell culture in the course of culturing the animal cells expressing the desired recombinant protein.
  • the method may include increasing the osmotic pressure of the animal cell culture on a specific culture day during the culture of the animal cells expressing the desired recombinant protein, as described above.
  • Another aspect of the invention is a method for producing a desired recombinant protein, the galactosylation is controlled, comprising the step of supplementing the animal cell culture with asparagine during the culture of the animal cells expressing the recombinant protein of interest.
  • the asparagine may be added in the form of a culture medium containing asparagine concentrate or asparagine.
  • the supplementation of the asparagine can be carried out multiple times at a specific culture point of the culture process of the animal cells expressing the desired recombinant protein.
  • the supplementation of the asparagine can be performed for 4 days to 10 days of culture on the basis of 0 days of the start of the main culture, and specifically, all 4 days, 7 days and 10 days of culture on the 0 day of the start of the culture. Gradually increasing the concentration of asparagine in the culture.
  • the supplementation of asparagine may be performed so that the final concentration of asparagine in the culture medium of the animal cells is 27.6 to 33.6 mM.
  • asparagine may be supplemented so that the final concentration of asparagine in the culture medium of the animal cells is 33.6 mM, for example, asparagine may be supplemented so that the concentration of asparagine in the culture medium of the animal cells is additionally increased by 6 to 18 mM.
  • asparagine concentrations of 6mM, 12mM and 18mM may be sequentially added to the asparagine concentrations in the culture medium of the animal cells, but not limited thereto.
  • this method When applied to animal cells, this method induces the production of ammonium ions (NH 4 + ), thereby increasing the concentration of ammonium ions in the cells, thereby increasing the pH of the trans Golgi body, thereby reducing the activity of beta-galactosyltransferase. It may fall off and inhibit the galactose of monoclonal antibodies.
  • ammonium ions NH 4 +
  • the galactose range of the desired monoclonal antibody is set, the galactose of the monoclonal antibody expressed by the cell line is analyzed, and then the method of controlling the galactose of the monoclonal antibody described above according to the degree of change in galactose is required. Can be.
  • Another aspect of the present invention is a method of controlling galactose of a desired recombinant protein, comprising the step of supplementing the animal cell culture with asparagine during the culture of the animal cells expressing the desired recombinant protein.
  • Another aspect of the present invention comprises the step of increasing the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cells expressing the recombinant protein of interest, and supplementing asparagine, galactosylation is controlled, the desired recombinant protein It is a manufacturing method.
  • the recombinant protein of interest when asparagine is added while increasing the osmotic pressure of the animal cell culture medium during the culturing of the animal cell expressing the monoclonal antibody, the recombinant protein of interest, at the same time the galactose decreases due to the increase in the osmotic pressure, and decreases as the osmotic pressure increases. It was confirmed that the content of acidic isomer antibody can be increased by the addition of asparagine.
  • the increase in osmotic pressure and supplementation of asparagine can be performed simultaneously or sequentially.
  • the osmotic pressure in the culture solution is increased by supplementation with sodium chloride, and asparagine is supplemented, or asparagine is supplemented, and the osmotic pressure in the culture solution is increased by the addition of sodium chloride, or asparagine supplementation is performed.
  • the osmotic pressure increase in the culture may be applied simultaneously.
  • the increase in the osmotic pressure may be performed by applying the method described above.
  • the osmotic pressure increase may be performed so that the final osmotic pressure in the culture medium is 460 to 500 mOsm / kg, and the supplementation of asparagine may supplement the asparagine so that the final concentration of asparagine in the culture medium of the animal cells is 27.6 to 33.6 mM. have.
  • the recombinant protein may be an antibody, specifically a monoclonal antibody, and the content of acidic isomeric antibodies of the antibody population prepared by the method simultaneously with the control of the galactose of the desired recombinant antibody through the method of the present invention as described above. Can be adjusted. That is, it is possible to increase the content of acidic isomeric antibodies, which can decrease with increasing osmotic pressure, as the addition of asparagine, with increasing osmotic pressure.
  • the degree of galactosylation of the desired antibody population can be regulated, and at the same time, the content of the acid isomer antibody of the desired antibody population can be controlled.
  • the acid isomer is a kind of isomeric antibody.
  • An isomer antibody means an antibody in which some amino acids of the main active antibody are modified by deamine or oxidation, and include acid isomers and basic isomers. Examples thereof include isomers in which asparagine is deamined in amino acids to be aspartate, and isomers in which methionine is oxidized to be methionine sulfate.
  • glutamate when glutamate is present at the N-terminus of the heavy chain, the glutamate forms an pentagonal ring structure and includes an isomeric antibody modified with pyruglutamate.
  • the monoclonal antibody to which the osmotic pressure or asparagine addition to the culture solution is applied is an adalimumab biosimilar antibody
  • adalimumab is a therapeutic agent for rheumatoid arthritis and Crohn's disease developed by abbott.
  • PCUCBin developed by the company is one of the vectors mentioned in the Republic of Korea patent (new fusion promoter and recombinant vector comprising the same, registration number 10-1038126).
  • the culture medium used in the present invention is three kinds of basal culture medium, production medium (main culture medium), additional culture medium (feeding medium).
  • Basic culture medium is a medium used for the purpose of subculture.
  • the production medium is a medium used for cultivation (main culture) performed for full-scale antibody production after subculture, and may be prepared by reinforcing a specific component or adding a new component in the basic culture medium.
  • a 1.4-fold enriched basal culture medium was used as a production medium.
  • the additional culture medium is a culture medium added for the purpose of promoting cell growth and increasing the amount of antibody expression during the culture.
  • 3.3-fold enhanced basal culture medium was used as additional culture medium.
  • the basal culture medium, production medium, and additional culture medium are all modified medium in Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), and the media components are shown in Table 1.
  • the method for producing an antibody used in the present invention is an animal cell culture through a bioreactor.
  • the animal cell culture is a process of growing an animal cell in a culture medium and expressing the antibody through a special measure (eg, lowering the temperature).
  • the culture method may be a batch culture, fed-batch culture, continuous culture, medium exchange culture, etc., but the culture method of the adalimumab biosimilar cell line used in the present invention is a fed-batch culture.
  • Fed-batch cultivation is a culture method in which the culture medium is incubated with a production medium and additional culture medium is added one or more times on a specific day of culture.
  • the fed-batch culture method used in the example is commonly added 4 times the additional culture medium in an amount corresponding to 5% of the current culture volume of the production medium on days 1, 4, 7, and 10 of the culture.
  • the fed-batch cultivation was carried out in a real 30 mL scale using a 250 mL shaker flask. Feeding strategy of fed-batch culture and the additional time point of the aqueous sodium chloride solution was as shown in FIG.
  • the osmotic pressure was artificially raised to 430 mOms / kg by feeding an aqueous solution of 4M sodium chloride (NaCl) to the culture starting with an osmotic pressure of 320 mOsm / kg to a final osmotic pressure of 450 mOms / kg.
  • the additional culture medium is subjected to the first feeding on the first day of culture, and additional feeding is performed every three days, and then fed four times, divided into one or four times (gradual increase in osmotic pressure during the culture period).
  • additional feeding is performed every three days, and then fed four times, divided into one or four times (gradual increase in osmotic pressure during the culture period).
  • NaCl sodium chloride
  • Example 1.2 change in monoclonal antibody galactose according to the difference in osmotic pressure range
  • Example 1.1 showed that the galactosylation of monoclonal antibodies can vary depending on the time of raising the osmotic pressure of the culture. G0F maximally increased when aqueous sodium chloride solution was fed during the second feeding (day 4 of culture) and the third feeding (day 7 of culture) of the additional feeding medium. In addition, a second shaker flask fed-batch culture was conducted to investigate the effect of the difference in the osmotic pressure rise of the culture on the galactose of the monoclonal antibody.
  • the initial osmotic pressure was 320 mOsm / kg, depending on the goal of increasing the osmotic pressure, different amounts of 4 M sodium chloride (NaCl) aqueous solution were added to the culture on the 4th or 7th day of culture, similar to the primary shaker flask culture. After that, the expression level and galactose expression of the monoclonal antibody were analyzed.
  • NaCl sodium chloride
  • the galactosylation of monoclonal antibodies was varied. Increasing the osmotic pressure of the culture to more than 480 mOsm / kg during the cultivation of the G0F content rather decreased. That is, there was an appropriate range of osmotic pressure to increase the G0F content of the monoclonal antibody (raised to 400 ⁇ 480 mOsm / kg during the progress of the culture).
  • the fed-batch cultivation was carried out in a real 30 mL scale using a 250 mL shaker flask. Feeding strategy and feeding time of asparagine of fed-batch culture was as shown in FIG. Asparagine concentrated solution was prepared at 200 mM. Additional culture medium was injected at 1, 4, 7 and 10 days, and the addition of asparagine concentrated solution was performed per feeding from the second feeding point (4 days in culture) (total 3 times). After culturing, the expression level and galactose expression of monoclonal antibody were analyzed.
  • Example 2.2 Feeding of additional culture medium containing excess asparagine
  • bioreactor fed-batch cultures were included in additional culture medium without making asparagine concentrate separately.
  • Asparagine was added at a dose of 6 mM per feeding, and an additional culture medium containing 120 mM asparagine was prepared and then fed. After incubating the actual 1 L in a 1.4 L bioreactor, the expression level and galactose were analyzed.
  • the G0F content was increased by 10.2% in batches with additional culture medium supplemented with asparagine. Considering that the NH 4 + concentration of the culture medium added with asparagine increased by 9.9 mM, it can be seen that the decrease in the galactosylation of the monoclonal antibody was due to the NH 4 + concentration change in the culture. Osmotic pressure was increased by 58 mOsm / kg in the culture of asparagine.
  • fed-batch cultivation was carried out by simultaneously applying an osmotic pressure increase or an osmotic pressure increase and an asparagine addition on an actual 1 L scale.
  • the osmotic pressure of the culture was increased to 423 mOsm / kg in consideration of the increase in the osmotic pressure by adding asparagine (adding 120 mM asparagine to the additional culture medium). After culturing, the expression level and galactose expression of monoclonal antibody were analyzed.
  • the method of artificially increasing the osmotic pressure, adding asparagine, and artificially increasing the osmotic pressure can be applied.
  • the acid isomer antibody in the charge profile as well as the G0F content control In order to increase the specific gravity, the strategy of applying osmotic pressure and adding asparagine at the same time seems useful.

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Abstract

본 발명은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법, 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법 및 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 갈락토오스화가 조절된 목적하는 재조합 단백질에 관한 것이다.

Description

배양배지의 최적화를 통한 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법
본 발명은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법; 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법; 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법 또는 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법; 및 상기 방법으로 제조된, 갈락토오스화가 조절된 목적하는 재조합 단백질에 관한 것이다.
항체는 항원과 결합하여 항원의 작용을 방해하거나, 항원을 제거할 수 있는 단백질로서, 치료용 항체 시장이 상당한 잠재력을 지닌 것으로 밝혀짐에 따라 항체의 효율적인 발현과 대량생산을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 항체의 생산에 있어서 중요한 점 중 하나는, 제조된 항체 집단의 균질성이다. 특히, 단일클론항체 생산에 있어 일정하고 재현가능한 단일클론항체의 당 프로파일(glycoform profile)이 중요하다. 그러나, 세포 배양 과정 중 다양한 변수들이 생산되는 단일클론항체의 당화 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. 이에, 제조된 항체 집단의 당화, 및 이성질 항체의 함량 등을 일정하게 조절할 수 있는 방법의 개발이 요구되어 왔다.
단클론 항체의 상업 생산과정 중 중요한 과제 중 하나는 배치마다 생산된 단클론항체의 품질을 일관되게 유지하는 것이다. 단클론항체 생산 공정 중 체크해야 할 품질은 수없이 다양하지만 항체의 갈락토오스화는 그 중에서도 가장 중요한 것들 중 하나라고 볼 수 있다. 이 갈락토오스화는 단클론항체의 가장 큰 활동기작(MOA)중의 하나인 CDC(complement dependent cytotoxicity) 과정에 영향을 준다고 알려져 있기 때문이다. 상기 갈락토실화는 갈락토오스(Galactose)를 글리코실화 연쇄 반응의 구성 단위로 이용하며, 이를 갈락토실 전이효소(galactosyltransferase)를 통해 N-아세틸 글루코사민 (N-acetylglucosamine) 당 다음에 붙임으로써 이루어진다. 이러한 갈락토실화를 조절하기 위한 방법으로 망간 또는 갈락토오스를 배양액에 부가하는 방법 등이 제안된 바 있으나(미국공개특허 제2012-0276631호), 항체의 갈락토실화를 조절하는 방법의 개발이 여전히 요구된다.
이러한 배경 하에 본 발명자들은 재조합 단백질을 생산하는 동물세포의 배양 과정에서 제조된 재조합 단백질의 갈락토실화를 효과적으로 조절할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양과정 중 특정 배양시점에 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키거나, 아스파라진을 보충하는 경우, 생산되는 재조합 단백질의 갈락토실화를 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다. 또한, 동물세포 배양액의 삼투압 상승과 동시에 아스파라진을 보충하는 경우, 삼투압 상승에 따른 산성 이성질 항체의 함량 감소 없이 갈락토실화를 조절할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 목적하는 재조합 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법은 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스 함량을 원하는 범위로 효과적으로 조절할 수 있는 이점을 가진다. 또한, 삼투압 증가와 아스파라진 첨가를 모두 이용하는 본 발명의 방법은 갈락토오스뿐만 아니라 산성 이성질 항체의 함량 역시 조절할 수 있는 효과를 지니므로, 목적하는 항체 집단의 제조에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 아달리무맙 바이오시밀러의 발현 벡터를 도시한 것이다.
도 2은 유가식 배양 기간 중 염화나트륨 수용액의 주입시점을 도시한 것이다.
도 3는 유가식 배양 기간 중 아스파라진의 주입시점을 도시한 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법이다.
구체적으로, 상기 방법은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 특정 배양일에서 상승시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법이다.
본 발명에서, 상기 배양은 유가식 배양(fed-batch culture)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "유가식 배양(fed-batch culture)"은 기본 배지 또는 생산배지로 배양을 시작한 후 세포 성장기 또는 항체 생산기의 임의의 시간에 배양물에 피딩 배지를 연속적 또는 불연속적으로 공급하면서 진행하는 세포 배양을 의미한다.
본 발명에서 "세포 배양 배지" 또는 "배양 배지" 는 다세포 유기체 또는 조직의 외측인 인공적인 시험관 내 환경에서 세포의 유지, 성장, 증식 또는 팽창을 위한 영양소 용액을 의미한다. 세포 배양 배지는 특정 세포 배양용으로 최적화될 수 있으며, 그 예로는 세포 성장의 지지를 위해 조제된 기본 배양 배지, 또는 단클론항체 생산을 촉진하도록 조제된 세포 배양 생산 배지, 영양소들을 고농도로 농축시켜 만든 농축 배지가 있다. 영양소, 배지 성분이란 용어들은 세포 배양 배지를 구성하는 구성성분을 의미하는 것으로, 본 명세서에서 호환 사용되고 있다.
구체적으로, "기본 배양 배지" 또는 "기본 배지"란 용어는 최소한의 세포의 성장을 지지할 수 있는 배지를 의미한다. 기본 배지는 표준 무기 염, 예컨대 아연, 철, 마그네슘, 칼슘 및 칼륨뿐만 아니라, 미량원소, 비타민, 에너지원, 완충 (Buffer) 시스템 및 아미노산을 공급한다. 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM), 기본 배지 이글(BME), RPMI 1640, F-10, F-12 배지가 기본 배지에 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다.
또한 구체적으로, "세포 배양 생산 배지" 또는 "생산 배지"란 용어는 생물반응기에서 단클론항체의 발현을 극대화할 목적으로 사용되는 배지를 말한다. 생산배지는 기본배지와 동일하거나 달라질 수 있고, 만약 달라질 경우 기본배지 자체를 농축하거나 기본배지에 특정 성분들을 추가하는 방법으로 제작할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "피딩(feeding) 배지" 및 "추가 배양배지"란 용어는 특정 영양소 또는 복수의 영양소로 구성된 배지로서 전부 기본배지의 농축 산물일 수 있다. 배양하는 세포에 따라 피딩 배지의 구성성분과 농도를 다양하게 제작할 수 있다.
상기 배양 과정에 있어, 세포 성장기는 접종 후 세포성장이 급격하게 진행되는 시기를 의미한다. 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 경우 온도는 35 ~ 37℃, pH는 7.0 ~ 7.3 범위에서 가장 활발하게 세포수가 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 세포 성장기 배양 파라미터는 36.5℃의 온도, 7.1 또는 7.0의 pH이었다.
상기 "접종"이란 용어는 세포 배양을 시작하기 위해 배지를 주입하고 주입된 배지에 세포를 주입하는 것을 의미한다. 여기서 배지는 세포를 주입하기 전에 미리 주입하거나 세포와 동시에 세포반응기에 주입할 수 있다. 대규모의 동물세포 배양에서는 통상적으로 배지를 미리 주입하고 온도와 산소 포화도를 일정 설정범위로 유지시킨 후 세포를 주입할 수 있다.
상기 "항체 생산기" 란 용어는 단클론항체의 생산을 극대화하기 위해 배양 프로세스의 변화를 적용하는 시기를 말한다. 여기서 생산을 극대화하기 위한 프로세스의 변화에는 온도나 용존산소를 낮추거나 하는 배지를 교환하는 작업이 모두 포함된다.
본 발명에서는, 삼투압 상승 시점에 따라 재조합 단백질을 발현하는 동물세포에서 생산되는 재조합 단백질의 갈락토오스화의 변화 정도가 달라질 수 있음을 확인하였다. 즉, 배양기간 동안 점차 삼투압을 상승시킨 경우, 삼투압을 상승시키지 않은 군과 갈락토오스화 정도가 크게 차이가 나지 않는 반면, 배양 기간 중 특정 배양시점에서 삼투압을 상승시킨 경우에는 G0F 함량이 크게 상승하는 결과를 나타내어, 갈락토오스화를 조절, 구체적으로 갈락토오스화를 억제 또는 감소할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명에서 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 본배양 과정 중에 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 사용된 "본배양"이란 용어는 단클론항체의 실제 생산이 이루어지는 배양단계를 말한다. 세포 한 바이알로 시작된 배양 과정의 마지막 단계로, 본배양이 종료되면 생산된 단클론항체의 정제과정이 이어지게 된다. 본배양 이전의 배양 부피를 단계적으로 증가시킬 목적의 씨드(seed) 배양이란 용어와 구별될 수 있다.
상기 삼투압을 상승시키는 단계는 동물세포의 본 배양 과정 중 특정 배양시점에서 수행할 수 있으며, 구체적으로는 본배양 시작 0일을 기준으로 본배양 1일부터 10일 중 어느 하나의 배양일에 수행하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로는 본배양 시작 0일을 기준으로 1일, 4일 7일 및 10일 중 어느 하나의 배양일에 수행하는 것일 수 있으며, 보다 더 구체적으로는 본배양 시작 0일을 기준으로 4일 또는 7일에 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 단회(單回)로 수행하는 것일 수 있다.
또한, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 배양액 내의 최종 삼투압이 460 내지 500 mOsm/kg가 되도록 수행되는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 삼투압의 상승은 배양액 내의 최종 삼투압이 460 내지 480 mOsm/kg가 되도록 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액 내의 최종 삼투압은 배양 종료 시점에 나타나는 삼투압을 말하는 것이나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 배양액 내의 삼투압 상승 목표가 400 내지 440mOsm/kg, 보다 구체적으로는 430 내지 440 mOm/kg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액 내의 삼투압 상승 목표는 삼투압을 상승시키는 단계를 수행하는 시점에 상승시키고자 하는 삼투압의 정도를 말하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 삼투압 상승은 상기 동물세포의 배양액에 염화나트륨 또는 염화칼륨을 보충하는 방법 및 글루코스를 배양액에 첨가하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 방법으로 수행될 수 있으며, 보다 구체적으로 염화나트륨을 배양액에 보충하는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 염화나트륨을 배양액에 보충하는 방법은, 유가식 배양 진행 중 특정일에 4M 염화나트륨 수용액을 배양액에 추가하여 삼투압을 일정 수준까지 상승시키는 방법으로 수행될 수 있으나. 이에 제한되지 않는다. 염화나트륨 수용액 추가를 통해 배양액, 더 나아가서 세포 내의 삼투압이 상승할 경우 베타-갈락토시다제의 활성이 증가하여 단클론항체의 갈락토오스화가 억제될 수 있다.
본 발명에서 "배양물" 또는 "배양액"이란 용어는 배양 진행중인 쉐이커 플라스크 또는 생물반응기 안에 담긴, 세포가 들어있는 액체를 말한다. 상기 배양물 및 배양액은 서로 호환하여 사용할 수 있다. 또한, 동물 세포의 존재 유무에 따라 배양액과 배양 배지를 구분할 수 있다.
본 발명에서 상기 재조합 단백질은 항체일 수 있으며, 바람직하게는 단클론항체이다.
본 명세서에 사용된 "단클론항체(monoclonal antibody)"란 용어는 단일 항체 형성세포가 생성할 수 있는 항체를 말하며, 1개의 항원 결정기를 인식한다.
본 발명의 항체는 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 치료용 항체를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 아달리무맙일 수 있다.
또한, 상기 항체는 전장항체 및 항체 단편의 형태를 모두 포함하는 개념으로, 상기 항체 단편의 종류로는 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fd 등을 모두 포함한다. 상기 Fv는 이중디설파이드 Fv(dsFv) 및 단쇄 Fv(scFv) 형태를 모두 포함한다. Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다.
상기 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포는 상기 재조합 단백질을 발현하는 천연형 또는 형질전환 세포를 제한없이 포함한다. 본 발명의 목적상 갈락토오스 함량 조절의 대상이 되는 재조합 단백질을 발현할 수 있는 동물세포일 수 있으며, 예를 들어 중국 햄스터 난소 세포주(CHO)이거나 마우스 골수종 세포주(NSO)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 단클론항체의 갈락토오스화를 조절하기 위해서, 배양 파라미터의 최적화와 기본 배양배지의 농축, 최적화된 추가 배양배지의 피딩 단계가 포함될 수 있다.
즉, 원하는 단클론항체의 갈락토오스화 범위를 설정하고, 보유한 세포주가 발현하는 단클론항체의 갈락토오스화를 분석한 후 갈락토오스화의 변경 요구 정도에 따라 위에 명시된 단클론 항체의 갈락토오스화를 조절하는 방법을 함께 적용할 수 있다.
구체적으로, 조절된 갈락토오스화를 가진 단일클론항체의 생산을 위한 배양기 운용에 있어서 구현할 수 있는 변경의 예로는 용존 산소(DO), 산성화도 (pH), 배양 온도, Agitation 등의 배양 파라미터의 최적화이다. 구체적으로, 세포 성장기에서 온도는 36.5℃, 용존 산소는 30%, 산성화도는 7.0으로 배양하고, 항체 생산기에서 온도는 30℃, 용존 산소는 30%, 산성화도는 7.0을 적용하여 배양한 기존의 방법에서, 항체생산기에서의 온도를 28℃로, 용존 산소를 20%로, 산성화도를 6.9로 변경하여 배양하였을 때 단클론 항체의 갈락토오스화의 조절이 가능함을 확인하였다.
또한, 갈락토오스화의 조절을 위하여 기본 배양배지를 농축하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 동물 유래 단백질이 없는 배양배지를 사용하고, 유가식 배양용으로 개발된 기본 배지를 단클론항체의 갈락토오스화를 변화시키기 위해 최적화할 수 있다. 구체적으로, 기본 배양배지를 농축, 구체적으로 0.8배 또는 1.4배 농축한 배지를 본배양에서 사용시 단클론항체의 갈락토오스화의 조절이 가능하였다.
또한, 갈락토오스화의 조절을 위하여 추가 배양배지를 최적화할 수 있다. 본 발명에서는 추가 배양배지의 농도 조절, 추가 배양배지에 첨가되는 금속 성분들의 농도를 최적화하여 갈락토오스화를 감소시켰다.
상기 방법을 통해 제조한 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화는 Q-TOF나 UPLC 기기를 사용한 N-글리칸 프로파일(N-glycan profile) 분석으로 측정할 수 있다. N-글리칸 프로파일 분석으로 제공되는 정보는 G0F 함량, GI (Galactosylation Index), NGHC(non-glycosylated Heavy Chain), 비푸코실화(afucosylation) 퍼센트, 만노스 함량 (High mannose contents)으로 다양하나, 본 발명에서는 G0F 함량의 변화를 주로 언급하였다.
또한, 본 발명의 방법은 갈락토오스화가 감소된 항체 집단을 제조하기 위한 것일 수 있다. 즉, 보유한 세포주가 발현하는 단클론항체의 갈락토오스화를 분석한 후, 분석된 값에 비하여 낮은 수준의 갈락토오스화를 가지는 항체 집단을 제조하고자 하는 경우에 적용될 수 있는 방법이다.
본 발명에서 용어, "항체 집단"은 당쇄 함량이 다양할 수 있는 항체들을 포함하는 항체 군을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 항체 집단은 갈락토실화 항체를 목적하는 비율로 포함하는, 갈락토오스화가 조절된 항체 군을 의미한다.
본 발명의 또 하나의 양태는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법이다.
상기 방법 및 각 용어에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
구체적으로 상기 방법은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 특정 배양일에 상승시키는 단계를 포함할 수 있으며, 구체적인 내용에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 하나의 양태는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법이다.
상기 기술된 용어에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 경우, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 아스파라진은 아스파라진 농축액 또는 아스파라진을 포함하는 배양배지의 형태로 첨가될 수 있다.
또한, 상기 아스파라진의 보충은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 특정 배양시점에 다회로 수행될 수 있다. 여기서, 상기 아스파라진의 보충은 본배양 시작 0일을 기준으로 배양 4일부터 10일 동안 수행할 수 있으며, 구체적으로는 본배양 시작 0일 기준으로 배양 4일, 7일 및 10일에 모두 수행하여 점차적으로 배양액 내의 아스파라진의 농도를 상승시킬 수 있다.
아스파라진을 단회로 보충하게 되는 경우, 배양액 내의 NH4 + 농도가 급격히 높아져 세포 성장이 지연되고 결국엔 최종 단백질 발현량의 감소를 가져오는 단점이 있으나, 본원발명에 따라 아스파라진을 피딩 시 나눠 첨가하게 되는 경우, 이러한 단점 없이 갈락토오스화를 조절하면서 목적하는 양의 단백질 생산을 달성할 수 있는 이점이 있다.
상기 아스파라진의 보충은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 27.6 내지 33.6 mM가 되도록 수행할 수 있다.
구체적으로, 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 33.6 mM가 되도록 아스파라진을 보충할 수 있으며, 그 예로 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 농도가 추가적으로 6 내지 18mM 증가되도록 아스파라진을 보충할 수 있으며, 보다 구체적인 예로 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 농도를 6mM, 12mM 및 18mM씩 순차적으로 추가함으로써 아스파라진을 3회 보충할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이러한 방법을 동물 세포에 적용하게 되면, 암모늄 이온(NH4 +) 생성을 유도하여 세포 내 암모늄 이온 농도가 증가하게 되고, 이에 따라 트랜스 골지체의 pH가 증가하여 베타-갈락토실트랜스퍼라제의 활성이 떨어지게 되어 단클론항체의 갈락토오스화가 저해될 수 있다.
또한, 앞서 기술한 바와 마찬가지로 단클론항체의 갈락토오스화를 조절하기 위해서, 배양 파라미터의 최적화와 기본 배양배지의 농축, 최적화된 추가 배양배지의 피딩 단계가 포함될 수 있다.
즉, 원하는 단클론항체의 갈락토오스화 범위를 설정하고, 보유한 세포주가 발현하는 단클론항체의 갈락토오스화를 분석한 후 갈락토오스화의 변경 요구 정도에 따라 위에 명시된 단클론 항체의 갈락토오스화를 조절하는 방법을 함께 적용할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법이다.
상기 방법 및 각 용어에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 또 하나의 양태는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법이다.
상기 기술된 용어에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서는 목적하는 재조합 단백질인 단클론항체를 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키면서 아스파라진을 첨가하는 경우, 삼투압 상승에 따른 갈락토오스화의 감소와 동시에, 삼투압 상승에 따라 감소할 수 있는 산성 이성질 항체의 함량이 아스파라진의 첨가에 의해 증가함을 확인하였다.
상기 방법에서, 상기 삼투압의 상승 및 아스파라진의 보충은 동시 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 예컨대, 배양액 내의 삼투압을, 염화나트륨을 보충하는 방법 등으로 상승시키고, 아스파라진을 보충하거나, 아스파라진을 보충한 다음, 배양액 내의 삼투압을 염화나트륨의 첨가 등의 방법으로 상승시키거나, 아스파라진의 보충과 배양액 내의 삼투압 상승을 동시에 적용할 수 있다.
여기서, 삼투압의 상승에 대해서는 앞서 설명한 방법을 적용하여 수행할 수 있다.
상기 삼투압 상승은 배양액 내의 최종 삼투압이 460 내지 500 mOsm/kg가 되도록 수행될 수 있으며, 상기 아스파라진의 보충은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 27.6 내지 33.6mM가 되도록 아스파라진을 보충할 수 있다.
또한, 상기 재조합 단백질은 항체, 구체적으로 단클론항체일 수 있으며, 상기와 같은 본 발명의 방법을 통하여 목적하는 재조합 항체의 갈락토오스화의 조절과 동시에 상기 방법으로 제조된 항체 집단의 산성 이성질 항체의 함량을 조절할 수 있다. 즉, 삼투압 상승에 따라 갈락토오스화를 감소시키고 그와 동시에, 삼투압 상승에 따라 감소할 수 있는 산성 이성질 항체의 함량을 아스파라진의 첨가로서 증가시킬 수 있다.
따라서, 상기와 같은 방법을 이용하면 목적하는 항체 집단의 갈락토오스화 정도를 조절할 수 있음과 동시에 목적하는 항체 집단의 산성 이성질 항체의 함량 역시 조절할 수 있는 이점을 가진다.
상기 산성 이성질 항체는 이성질 항체의 일종이다. 이성질 항체란 주활성 항체의 일부 아미노산이 탈아민이나 산화에 의해 변형된 항체를 의미하며, 산성 이성질 항체 및 염기성 이성질 항체의 종류를 포함한다. 그 예로, 아미노산 중 아스파라긴(asparagine)이 탈아민되어 아스파테이트(aspartate)가 된 이성질 항체, 아미노산 중 메치오닌(methionine)이 산화되어 메치오닌셀페이트(methionine sulfate)가 된 이성질 항체 등이 있다. 또한, 중쇄의 N 말단에 글루타메이트(glutamate)가 존재하는 경우, 상기 글루타메이트가 오각형 링 구조를 형성하여 파이루글루타메이트(pyruglutamate)로 변형된 이성질 항체를 포함한다.
이러한 이성질 항체의 분석은 크로마토그래피 등을 이용하여 수행할 수 있으며, 본 발명에서는 양이온 교환 수지 크로마토그래피 분석으로 수행하였다. 단클론항체의 자체 특성에 따라서 산성(acidic), 주 활성(main), 염기성(basic) 이성질체 함량이 매우 다양하다. 단클론항체를 발현하는 세포주의 배양조건(배양 파라미터, 생산배지 등)에 따라 단클론항체의 전하 이성질 항체 함량이 달라질 수 있다. 따라서, 상기 방법을 통하면 원하는 갈락토오스 함량 조절과 동시에 산성 이성질 항체의 함량을 원하는 범위로 조절할 수 있는 이점을 지닌다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 삼투압 인위적 상승으로 인한 갈락토오스화의 조절
유가식 배양 진행 중 배양액의 삼투압을 상승시키는 방법은 다양하다. 과량의 글루코스를 배양액에 첨가하는 방법, 염화 칼륨 또는 염화나트륨 수용액을 배양액에 첨가하는 방법 등이 있다. 본 발명에서는 삼투압 상승을 위한 대표적인 방법으로 4M 염화나트륨 수용액을 배양액에 첨가하는 방법을 적용하였다.
제조방법 및 배지 조성에 대한 설명
본 발명에서 배양액에 대한 삼투압 상승이나 아스파라진 추가를 적용한 단클론 항체는 아달리무맙 바이오시밀러 항체로, 아달리무맙은 abbott에서 개발한 류마티스 관절염, 크론병의 치료제이다. US 6,090,382의 아달리무맙 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 시퀀스를 참조하여 아달리무맙 바이오시밀러 DNA를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭, 생성한 후 자사에서 개발한 벡터인 pGL3 CUCBin의 프로모터를 이용하여 pCB-Am2.77_v5.4 (도 1)를 제작하고, 이를 CHO-DXB11 세포주에 형질전환하여 아달리무맙 바이오시밀러 발현 세포주를 제작하였다. 자사가 개발한 pCUCBin 은 대한민국특허 (새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터, 등록번호 10-1038126)에서 언급된 벡터 중 하나이다.
본 발명에서 사용한 배양 배지는 기본 배양 배지, 생산 배지(본 배양 배지), 추가 배양 배지(피딩 배지) 세 종류이다.
기본 배양 배지는 계대배양을 목적으로 사용되는 배지이다. 생산 배지는 계대배양 후 본격적인 항체생산을 위해 수행되는 배양(본 배양)에 사용되는 배지로 기본 배양 배지에서 특정성분을 강화하거나 새로운 성분을 추가하여 제작할 수 있다. 본 발명에서는 1.4배 강화한 기본 배양 배지를 생산 배지로 사용하였다. 추가 배양 배지는 배양 진행 중 세포성장 촉진 및 항체 발현량 증가 목적으로 추가되는 배양 배지이다. 본 발명에서는 3.3배 강화한 기본 배양 배지를 추가 배양 배지로 사용하였다. 기본 배양 배지, 생산 배지, 추가 배양 배지 모두 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 에서 변형된 배지로서 배지 구성 성분은 표 1과 같다.
표 1 기본 배양 배지 구성 성분
구 분 성 분
IMDM modified medium Merck 100131
Buffer HEPES
Buffer Sodium bicarbonate
Carbon source Glucose
Nitriogen source Glutamine
Etc Sodium chloride
Growth hormone Insulin
Etc MTX
Vitamin L-ascorbic acid
Vitamin Biotin
Vitamin Choline chloride
Vitamin Folic acid
Peptone Sheff CHO plus pf acf (Kerry)
Metal Boric acid
Metal Cobalt Chloride Hexahydrate
Metal Copper Sulfate Pentahydrate
Metal Ferric Citrate
Metal Magnesium chloride anhydrous
Metal Manganese sulfate monohydrate
Metal Potassium nitrate
Metal Sodium selenite pentahydrate
Metal Zinc sulfate heptahydrate
본 발명에서 사용한 항체의 제조방법은 생물 반응기를 통한 동물세포 배양으로 동물세포 배양은 동물세포를 배양 배지에서 성장시키고 특별한 조치(예, 온도를 낮춤)를 통해 항체를 발현하게 하는 과정이다. 배양 방법은 회분식 배양, 유가식 배양, 연속식 배양, 배지 교환식 배양 등 다양하나, 본 발명에서 사용된 아달리무맙 바이오시밀러 세포주의 배양방식은 유가식 배양이다. 유가식 배양은 생산 배지로 배양을 진행하다 배양 특정일에 추가 배양 배지를 1회 또는 2회 이상 추가하면서 진행되는 배양 방식이다.
실시예에서 사용된 유가식 배양방법은 공통적으로 배양 1, 4, 7, 10일 차에 생산 배지의 현재 배양액 볼륨의 5%에 해당하는 양의 추가 배양 배지를 4회에 걸쳐 추가하는 것이다.
실시예 1.1 : 삼투압 상승시점에 따른 갈락토오스화의 변화
250 mL 쉐이커 플라스크를 사용하여 실제 30 mL 규모로 유가식 배양을 진행하였다. 유가식 배양의 피딩 전략과 염화나트륨 수용액의 추가 시점은 도 2와 같았다. 삼투압 320 mOsm/kg로 시작한 배양물에 4M 염화나트륨 (NaCl) 수용액을 피딩하여 인위적으로 삼투압을 430 mOms/kg까지 상승시켜 최종 삼투압이 450 mOms/kg이 되게 하였다. 추가 배양배지를 배양 1일째 1차 피딩을 실시하고, 매 3일 경과 후 추가 피딩을 실시하여 총 4회 피딩을 실시하는데, 이 중 한번 또는 4회에 나누어서 (배양기간 동안 점차 삼투압 상승시킴) 4 M 염화나트륨 (NaCl) 수용액을 첨가하여 배양물의 삼투압을 상승시키고 배양을 진행한 후, 단클론항체의 발현량과 갈락토오스화를 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2 삼투압 상승 시점에 따른 항체 품질의 변화
배양 조건 항체 발현량(mg/L) G0F(%)* Acidic(%) 최종 삼투압(mOsm/kg)
배양기간 동안 점차 삼투압 상승시킴 1392.0 60.4 20.1 453.0
1차 피딩시 (배양 1일) 삼투압 상승시킴 1215.5 66.1 17.6 445.0
2차 피딩시 (배양 4일) 삼투압 상승시킴 1268.3 68.8 16.7 451.0
3차 피딩시 (배양 7일) 삼투압 상승시킴 1438.7 67.1 16.4 451.0
4차 피딩시 (배양 10일) 삼투압 상승시킴 1580.1 66.2 17.4 454.0
삼투압 상승시키지 않음 1771.8 63.5 18.5 364.0
*G0F(%) = G0F/(G0F+G1F+G2F)
그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 4M 염화나트륨 (NaCl) 수용액을 피딩하는 시점에 따라 단클론항체의 갈락토오스화에 차이가 있었다. 쉐이커 플라스크 배양의 경우 배양 프로세스 중 용존산소 (DO)와 산성화도 (pH)를 직접적으로 조절하기 쉽지 않아 실험 조건간 G0F의 차이가 크지 않을 수 있다. 하지만 생물반응기 배양에서는 용존산소와 산성화도를 직접적으로 조절할 수 있어 G0F 차이가 극대화 될 수 있다.
실시예 1.2 : 삼투압 상승범위의 차이에 따른 단클론항체 갈락토오스화 변화
실시예 1.1은 배양물의 삼투압을 상승시키는 시점에 따라 단클론항체의 갈락토오스화가 달라질 수 있음을 보여주었다. 추가 피딩배지의 2차 피딩 (배양 4일)과 3차 피딩 (배양 7일) 시에 염화나트륨 수용액을 피딩하였을 때 G0F가 최대로 증가하였다. 부가적으로, 배양물의 삼투압 상승 수준의 차이가 단클론항체의 갈락토오스화에 미치는 영향을 알아보기 위해 2차 쉐이커 플라스크 유가식 배양을 진행하였다. 배양 초기의 삼투압은 320 mOsm/kg으로, 삼투압 상승 목표에 따라 다른 양의 4 M 염화나트륨(NaCl) 수용액을 1차 쉐이커 플라스크 배양과 유사하게 배양 4일 또는 7일에 배양액에 추가하고 배양을 진행한 후, 단클론항체의 발현량과 갈락토오스화를 분석하였다.
표 3 삼투압 상승 범위 차이에 따른 항체 품질의 변화
배양 조건 삼투압 상승 목표(mOsm/kg) 항체 발현량(mg/L) G0F(%)* Acidic(%) 최종삼투압(mOsm/kg)
삼투압 상승 X X 1136.2 67.4 15.6 365.0
2차 피딩 시 (배양 4일) 삼투압 상승시킴 400 까지 948.9 70.4 15.0 424.0
440 까지 824.1 71.0 14.6 460.0
480 까지 573.7 67.9 14.5 505.0
520 까지 543.8 66.5 13.9 539.0
3차 피딩 시 (배양 7일) 삼투압 상승시킴 400 까지 1053.4 70.5 14.9 416.0
440 까지 927.4 69.5 14.5 454.0
480 까지 851.1 68.5 14.3 497.0
520 까지 775.1 66.9 14.2 533.0
*G0F(%) = G0F/(G0F+G1F+G2F)
배양액의 삼투압 상승 수준에 따라 단클론항체의 갈락토오스화가 다양하게 나타났다. 배양 진행 중 배양물의 삼투압을 480 mOsm/kg이상으로 상승시키면 G0F 함량이 오히려 감소하였다. 즉, 단클론항체의 G0F 함량을 최대로 증가시키기 위한 삼투압의 적정 범위가 존재하였다 (배양진행 중 400 ~ 480 mOsm/kg까지 상승시킴).
실시예 1.3 : 생물 반응기(바이오리액터) 확인 실험
1, 2차 쉐이커 플라스크 배양 결과를 토대로 생물 반응기에서 확인실험을 수행한 결과, 삼투압의 상승조건에 따라 단일클론 항체의 갈락토오스화의 변화를 다시 확인할 수 있었다.
1.4 L생물 반응기에서 실제 1 L 규모로, 2차 피딩 시(배양 4일), 각각 4 M 염화나트륨 수용액을 배양물에 첨가하여 인위적으로 삼투압을 440, 500, 523 mOsm/kg까지 상승시킨 후 배양을 진행하였다.
표 4 생물반응기에서 삼투압 상승 범위 차이에 따른 항체 품질의 변화
2차 피딩시 삼투압 (mOsm/kg) 상승 조건 발현량(mg/L) G0F(%)* Acidic(%) NH4 + 농도(mM) 최종삼투압(mOsm/kg)
상승시키지 않음 1980.6 63.7 26.5 3.6 321
440 까지 상승시킴 1740.2 71.8 18.4 7.7 479
500 까지 상승시킴 1361.6 58.3 18.4 7.3 549
523 까지 상승시킴 1361.7 54.8 19.3 5.6 567
*G0F(%) = G0F/(G0F+G1F+G2F)
2차 피딩 시 배양액의 삼투압을 500 mOsm/kg이상 증가시킬 경우 (최종삼투압 549, 567 mOsm/kg), 오히려 G0F 함량이 감소하였다. 2차 피딩 시 삼투압을 440 mOsm/kg까지 올린 생물 반응기 실험의 경우 G0F의 함량이 71.8 %를 나타내었다.
실시예 2: 아스파라진 첨가를 통한 배양액의 과도한 암모늄 생성
본 출원인의 배양 결과에 따르면 (표 4), 과량의 아스파라진을 배양액에 첨가하면 배양액 내의 암모늄 이온 (NH4 +) 농도가 비약적으로 증가하였다. 과량의 아스파라진 첨가를 통해 간접적으로 배양액 내의 NH4 + 농도를 증가시키는 방법으로 단일클론 항체의 갈락토오스화를 조절할 수 있다.
표 5 배양물에 아스파라진 첨가에 따른 암모늄의 증가
배양 조건 추가한 아스파라진 농도(mM) 최종 암모늄 이온(mM)
아스파라진 첨가 하지 않음. 0 3.4
아스파라진 첨가 18.9 8.1
실시예 2.1 : 아스파라진 농축 용액 첨가하는 유가식 배양
250 mL쉐이커 플라스크를 사용하여 실제 30 mL 규모로 유가식 배양을 진행하였다. 유가식 배양의 피딩 전략과 아스파라진 주입 시점은 도 3과 같았다. 아스파라진 농축 용액은 200 mM로 제조하였다. 추가 배양배지 주입시점은 배양1, 4, 7, 10일 이며, 아스파라진 농축용액의 추가는 2 차 피딩 시점 (배양 4일)부터 피딩 마다 실시하였다(총 3회). 배양을 진행한 후 단클론 항체의 발현량과 갈락토오스화를 분석하였다.
표 6 아스파라진 첨가에 따른 단클론항체 갈락토오스화의 변화
배양 조건 항체 발현량(mg/L) G0F(%)* Acidic(%) 최종 NH4 +(mM)
생산배지 1회 피딩시 추가한 아스파라진 농도 (mM) 추가된 총 아스파라진 농도 (mM)
1 X 0 0 1738.5 56.3 25.9 4.1
1 X 1 3 1705.8 59.9 21.7 5.2
1 X 2 6 1535.2 61.4 19.2 6.7
1 X 4 12 1500.0 64.3 19.3 8.8
1.4 X 0 0 1729.9 60.2 21.1 5.6
1.4 X 1 3 1721.0 61.0 21.3 7.4
1.4 X 2 6 1588.5 61.5 20.1 7.3
1.4 X 4 12 1563.7 61.9 19.3 9.0
*G0F(%) = G0F/(G0F+G1F+G2F)
피딩으로 아스파라진을 배양액에 첨가할수록 G0F함량이 증가되었다. 첨가되는 아스파라진의 농도를 증가시킬수록 배양액 내의 최종 NH4 + 농도는 증가하였다. 1.4X생산배지에 비해 1X 생산배지에서 아스파라진 투입에 대한 G0F 함량 증가폭이 더 컸다. 아스파라진을 배양 초반에 일시에 첨가하게 되면 배양 초반부터 NH4 + 농도가 높아져 세포성장이 지연되고 결국엔 최종 항체 발현량이 낮아지게 되므로, 아스파라진을 피딩 시 나눠서 첨가하는 방식을 채택하였다.
실시예 2.2. : 과량의 아스파라진이 포함된 추가 배양배지의 피딩
쉐이커 플라스크 유가식 배양과 달리, 생물반응기 유가식 배양에서는 아스파라진 농축용액을 따로 만들지 않고 추가 배양배지에 포함시켰다. 아스파라진을 피딩 마다 6 mM 추가 투입을 계획하여, 120 mM 아스파라진이 첨가된 추가 배양배지를 제작한 후 이를 피딩하였다. 1.4 L생물 반응기에서 실제 1 L 규모로 배양을 진행한 후 단클론 항체의 발현량과 갈락토오스화를 분석하였다.
표 7 아스파라진이 과량 첨가된 추가 배양배지를 사용한 생물반응기 실험
배양 조건 항체 발현량(mg/L) G0F(%) Acidic(%) NH4 +(mM) 최종 삼투압(mOsm/kg)
아스파라진 첨가하지 않음 1980.6 63.7 26.5 3.6 321.
2차 피딩 부터 피딩마다 6 mM 아스파라진 첨가(총 18 mM 첨가) 1281.8 73.9 20.6 13.5 379
아스파라진이 과량 첨가된 추가 배양배지를 사용한 배치에서 G0F 함량이 10.2 % 증가되었다. 아스파라진을 과량 첨가한 배양액의 NH4 + 농도가 9.9 mM 증가함을 고려할 때, 단클론항체의 갈락토오스화 감소가 배양액 내의 NH4 + 농도변화 때문임을 알 수 있다. 삼투압은 아스파라진을 과량 첨가한 배양액에서 58 mOsm/kg 증가되었다.
실시예 3: 인위적인 삼투압 상승과 아스파라진 첨가의 조합
유가식 배양 중 삼투압의 인위적 상승 또는 아스파라진 첨가를 적용하여 단클론항체의 G0F 함량을 상승시킬 수 있었다. 단클론항체의 갈락토오스화 및 전하 이성질 항체(charge variants)에 미치는 영향을 알아보기 위해 인위적인 삼투압 상승과 아스파라진 첨가의 조합을 적용하였다.
실시예 3.1 : 삼투압 상승과 아스파라진 첨가를 동시 적용한 생물반응기 실험
1.4 L생물 반응기에서 실제 1 L 규모로 삼투압 인위적 상승 또는 삼투압 상승과 아스파라진 첨가를 동시에 적용하여 유가식 배양을 진행하였다. 삼투압 상승과 아스파라진 첨가를 동시에 적용한 생물배양기의 경우 아스파라진 투입(추가배양배지에 120mM 아스파라진을 추가함)에 의한 삼투압 증가효과를 고려해 배양물의 삼투압을 423 mOsm/kg까지 증가시켰다. 배양을 진행한 후 단클론 항체의 발현량과 갈락토오스화를 분석하였다.
표 8 생물반응기에서 삼투압 상승과 아스파라진 첨가를 동시 적용 갈락토오스화의 변화
배양 조건 항체발현량(mg/L) G0F(%) Acidic (%) NH4 +(mM) 최종 삼투압(mOsm/kg)
삼투압 450까지 상승시킴 1511.6 73.6 20.6 8.80 502.0
삼투압 423까지 상승시킴 + 아스파라진 첨가 1548.1 75.4 23.1 10.5 490.0
삼투압만 적용한 조건과 삼투압과 아스파라진을 조합해서 프로세스에 적용한 두 조건 간 G0F 차이가 크지 않았지만 G0F 함량이 더욱 증가하였다. 아스파라진을 첨가한 배양물의 경우 첨가하지 않은 배양물에 비해 산성 이성질 항체(acidic variant)의 비중이 감소하였지만(표 6, 7) 삼투압과 아스파라진을 조합해서 적용한 결과 산성 이성질 항체가 오히려 증가하였다.
G0F 함량을 증가시키기 위해 삼투압의 인위적 상승, 아스파라진의 첨가, 삼투압의 인위적 상승과 동시에 아스파라진의 첨가의 방법을 적용할 수 있는데, G0F 함량 조절뿐만 아니라 전하 프로파일(charge profile) 중 산성 이성질 항체의 비중을 늘리려는 경우 삼투압 상승과 아스파라진 첨가를 동시에 적용하는 전략이 유용할 것으로 판단된다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포섭되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (27)

  1. 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 특정 배양일에 증가시키는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양은 유가식 배양(fed-batch culture)인 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 본배양 시작 0일을 기준으로 본배양 1일부터 10일 중 어느 하나의 배양일에 수행되는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 본배양 시작 0일을 기준으로 1일, 4일 7일 및 10일 중 어느 하나의 배양일에 수행되는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 본배양 시작 0일을 기준으로 4일 또는 7일에 수행되는 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 삼투압의 증가는 배양액 내의 최종 삼투압이 460 내지 500 mOsm/kg가 되도록 수행되는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 삼투압 증가는 상기 동물세포의 배양액에 염화나트륨 또는 염화칼륨을 보충하는 방법 및 글루코스를 배양액에 첨가하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1이상의 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체인 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 갈락토오스화가 감소된 항체 집단을 제조하기 위한 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 삼투압을 상승시키는 단계는 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 단회로 수행되는 것인, 방법.
  11. 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 특정 배양일에 상승시키는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법.
  12. 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 아스파라진은 아스파라진 농축액 또는 아스파라진을 포함하는 배양배지의 형태인 것인, 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 아스파라진의 보충은 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 특정 배양시점에 다회로 수행되는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 아스파라진의 보충은 본배양 시작 0일을 기준으로 배양 4일부터 10일 동안 수행되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 아스파라진의 보충은 본배양 시작 0일 기준으로 배양 4일, 7일 및 10일에 수행되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 방법은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 27.6 내지 33.6 mM가 되도록 아스파라진을 보충하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 방법은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 33.6 mM가 되도록 아스파라진을 보충하는 것인 방법.
  19. 제12항 또는 제17항에 있어서, 상기 방법은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 농도가 6mM, 12mM 및 18mM씩 순차적으로 추가되도록 아스파라진을 3회 보충하는 것인, 방법.
  20. 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액에 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 목적하는 재조합 단백질의 갈락토오스화를 조절하는 방법.
  21. 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 동물세포의 배양 과정 중 상기 동물세포 배양액의 삼투압을 상승시키고, 아스파라진을 보충하는 단계를 포함하는, 갈락토오스화(galactosylation)가 조절된, 목적하는 재조합 단백질의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 삼투압의 증가 및 아스파라진의 보충은 동시 또는 순차적으로 수행되는 것인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 삼투압 증가는 상기 동물세포의 배양액에 염화나트륨 또는 염화칼륨을 보충하는 방법 및 글루코스를 배양액에 첨가하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 방법으로 수행되는 것인, 방법.
  24. 제21항에 있어서, 상기 삼투압 증가는 배양액 내의 최종 삼투압이 460 내지 500 mOsm/kg가 되도록 수행되는 것인, 방법.
  25. 제21항에 있어서, 상기 아스파라진의 보충은 동물세포의 배양액 내의 아스파라진 최종 농도가 27.6 내지 33.6 mM가 되도록 아스파라진을 보충하는 것인 방법.
  26. 제21항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 항체인 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 방법은 목적하는 재조합 항체의 갈락토오스화의 조절 및 상기 방법으로 제조된 항체 집단의 산성 이성질 항체의 함량을 조절하기 위한 것인, 방법.
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US15/115,519 US20170166941A1 (en) 2014-01-29 2015-01-29 Method for modulating galactosylation of recombinant protein through optimization of culture medium
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JP2016549133A JP6797458B2 (ja) 2014-01-29 2015-01-29 培養培地の最適化により組換えタンパク質のガラクトシル化を調節する方法
CN201580006724.XA CN106029871A (zh) 2014-01-29 2015-01-29 通过优化培养基调节重组蛋白的半乳糖基化的方法
RU2016132368A RU2642285C1 (ru) 2014-01-29 2015-01-29 Способ получения целевого антитела с модулированным галактозилированием (варианты) и способ модулирования галактозилирования целевого антитела (варианты) путем оптимизации культуральной среды
TR2016/10497T TR201610497T1 (tr) 2014-01-29 2015-01-29 Rekombi̇nant protei̇n galaktosi̇lasyonunu kültür ortaminin opti̇mi̇zasyonu vasitasiyla modüle etme yöntemi̇
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9550826B2 (en) 2013-11-15 2017-01-24 Abbvie Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9683033B2 (en) 2012-04-20 2017-06-20 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9688752B2 (en) 2013-10-18 2017-06-27 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9708400B2 (en) 2012-04-20 2017-07-18 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2908067T3 (es) * 2016-05-10 2022-04-27 Ares Trading Sa Métodos para modular los perfiles de galactosilación proteicos de proteínas recombinantes empleando peracetil galactosa
KR102701102B1 (ko) * 2017-02-17 2024-08-29 론자 리미티드 생물학적 생성물 변이체의 생산 방법
CN119776468A (zh) * 2018-08-10 2025-04-08 豪夫迈·罗氏有限公司 用于调节蛋白糖基化的细胞培养策略
HU231514B1 (hu) * 2018-11-07 2024-07-28 Richter Gedeon Nyrt. Sejttenyészetben előállított rekombináns glikoprotein glikozilációs mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
US20220033487A1 (en) * 2018-12-31 2022-02-03 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of Producing Ustekinumab
WO2023161885A1 (en) * 2022-02-25 2023-08-31 Kashiv Biosciences, Llc A process for improving polypeptide expression in mammalian cell culture
CN115976145B (zh) * 2022-11-28 2023-06-23 广州誉衡生物科技有限公司 一种用于生产pd-1抗体的cho细胞高效灌流补料培养方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
WO2001059089A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Genentech, Inc. Improved galactosylation of recombinant glycoproteins
KR20080048556A (ko) * 2005-09-28 2008-06-02 첼카 게엠베하 개선된 세포 배양 배지
WO2011019619A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Genentech, Inc. Production of proteins in glutamine-free cell culture media
KR101038126B1 (ko) 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
US20120276631A1 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002256005A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-08 Smithkline Beecham Corporation Control of glycoforms in igg
JP2004532642A (ja) * 2001-06-13 2004-10-28 ジェネンテック・インコーポレーテッド 動物細胞の培養方法と動物細胞でのポリペプチド産生
PL1976877T5 (pl) * 2005-11-30 2017-09-29 Abbvie Inc Przeciwciała monoklonalne przeciwko białku amyloidu beta oraz ich zastosowania
EP3026109B1 (en) * 2005-12-08 2022-03-09 Amgen Inc. Improved production of glycoproteins using manganese
US20070190057A1 (en) * 2006-01-23 2007-08-16 Jian Wu Methods for modulating mannose content of recombinant proteins
CN101681396A (zh) * 2007-04-16 2010-03-24 动量制药公司 限定的糖蛋白产品以及相关方法
EP2521787A4 (en) * 2010-01-07 2013-11-13 Reddys Lab Ltd Dr IMPROVED PROTEIN EXPRESSION
CN105331659B (zh) * 2010-04-26 2019-07-16 诺华股份有限公司 改进的细胞培养基
CN102533721A (zh) * 2010-12-24 2012-07-04 北京义翘神州生物技术有限公司 一种通过渗透压突变提高重组蛋白瞬时表达的方法
EP2511293A1 (en) * 2011-04-13 2012-10-17 LEK Pharmaceuticals d.d. A method for controlling the main complex N-glycan structures and the acidic variants and variability in bioprocesses producing recombinant proteins

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
WO2001059089A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Genentech, Inc. Improved galactosylation of recombinant glycoproteins
KR20080048556A (ko) * 2005-09-28 2008-06-02 첼카 게엠베하 개선된 세포 배양 배지
WO2011019619A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Genentech, Inc. Production of proteins in glutamine-free cell culture media
KR101038126B1 (ko) 2010-11-30 2011-05-31 주식회사 엘지생명과학 새로운 융합 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터
US20120276631A1 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GRAMER, MICHAEL J. ET AL.: "Modulation of antibody galactosylation through feeding of uridine, manganese chloride, and galactose", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 108, no. 7, 2011, pages 1591 - 1602, XP002688515 *
See also references of EP3101120A4

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9683033B2 (en) 2012-04-20 2017-06-20 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9708400B2 (en) 2012-04-20 2017-07-18 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
US9957318B2 (en) 2012-04-20 2018-05-01 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9688752B2 (en) 2013-10-18 2017-06-27 Abbvie Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9550826B2 (en) 2013-11-15 2017-01-24 Abbvie Inc. Glycoengineered binding protein compositions

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