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WO2015053455A1 - 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트 - Google Patents

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 sfts 진단 방법 및 키트 Download PDF

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Publication number
WO2015053455A1
WO2015053455A1 PCT/KR2014/004344 KR2014004344W WO2015053455A1 WO 2015053455 A1 WO2015053455 A1 WO 2015053455A1 KR 2014004344 W KR2014004344 W KR 2014004344W WO 2015053455 A1 WO2015053455 A1 WO 2015053455A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
virus
sfts
antigen
seq
kit
Prior art date
Application number
PCT/KR2014/004344
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
오명돈
김계형
이종윤
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Publication of WO2015053455A1 publication Critical patent/WO2015053455A1/ko

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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N33/56983—Viruses
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    • C12N2760/12211—Phlebovirus, e.g. Rift Valley fever virus
    • C12N2760/12222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses

Definitions

  • the present application relates to the diagnosis of diseases using viruses.
  • SFTS Severe fever with thrombocytopenia syndrome
  • SFTS Severe fever with thrombocytopenia syndrome
  • SFTS is a serious disease with symptoms such as high fever, vomiting, diarrhea, thrombocytopenia, leukopenia, and multiple organ failure (6-30%). Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364: 1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3).
  • SFTS is caused by the SFTS virus (HB29 strain) belonging to the field virus (Bunyavirus) and was first reported in China in 2011 (Yu XJ et al. Ibid ).
  • SFTS virus is mediated by Haemaphysalis longicornis , which is widely known in Korea (Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl) Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76).
  • Seroconversion and viremia of the SFTS virus have been found in breeding animals such as goats, sheep, cattle, pigs, and dogs, and these animals are thought to act as intermediate mediators in areas where the SFTS virus has spread (Zhao L et al. Emerg Infect). Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).
  • Chinese Laid-Open Patent Publication No. 102618669 relates to the entire sequence of SFTS virus and its use, and discloses the entire sequence of SFTS virus identified in China.
  • Chinese Laid-Open Patent Publication No. 102070704 discloses a SFTS virus amplification and detection kit using SFTS virus.
  • the present application is to provide methods, kits and vaccine compositions for diagnosing or detecting severe febrile thrombocytopenia virus.
  • the present application is directed to a severe condition in which L (Large), M (Medium) and S (Small) fragments have negative stranded RNA sequences that are inversely complementary to the DNA sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • SFTS Febrile thrombocytopenia syndrome
  • the present disclosure also provides DNA molecules derived from SFTS of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3 from the Severe Thrombocytopenic Syndrome (SFTS) virus and each thymidine (T) in the sequence possessed by the DNA molecule.
  • SFTS Severe Thrombocytopenic Syndrome
  • T thymidine
  • the present disclosure also provides a polypeptide encoded by said RNA or DNA.
  • the sequence of the polypeptide is SEQ ID NO: 4 (polypeptide encoded by L segment), SEQ ID NO: 5 (polypeptide encoded by M segment) and SEQ ID NO: 6 (L segment Polypeptide).
  • the present disclosure also provides a vector comprising the DNA sequence.
  • the present disclosure provides prokaryotic or eukaryotic cells comprising the vector.
  • RNA or DNA derived from the SFTS virus according to the present invention can be usefully used for the production of primers, probes, etc. for the detection of SFTS virus or vector development for the production of RNA virus.
  • the present invention also provides a method of forming an antigen-antibody complex comprising contacting a sample of a virus comprising a viral antigen according to the present invention with a sample; And detecting the antigen-antibody complex, and provides a method for detecting severe febrile thrombocytopenia syndrome virus antibody or SFTS infection in vitro.
  • the sample used in the method according to the present invention may be used one or more of whole blood, plasma or serum.
  • the method according to the invention can be used for quantitative or qualitative detection or diagnosis.
  • the antigen-antibody complex detection may be detected through radioimmunoassay, Western blot, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence assay, and in one embodiment, the ELISA is a double antigen sandwich method.
  • the antigen can be carried out using nucleocapsid protein of severe thrombocytopenia syndrome having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 as an antigen.
  • the antigen may be labeled with a label selected from the group consisting of radioactive material, enzyme and fluorescent material.
  • the present invention also provides a kit for detecting or diagnosing a severe febrile thrombocytopenia syndrome virus antibody or a diagnostic kit for a severe febrile thrombocytopenia syndrome virus infection, the kit comprising a virus sample comprising a viral antigen according to the present application and a reagent for detecting the antigen-antibody complex. It provides a kit comprising a.
  • the reagent for detecting an antigen-antibody complex includes a reagent for radioimmunoassay, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence assay.
  • the present disclosure also provides immunogenic compositions for severe thrombocytopenic syndrome (SFTS) virus, comprising all or part of the virus according to the present application.
  • SFTS severe thrombocytopenic syndrome
  • Such compositions may further comprise an adjuvant.
  • the SFTS virus according to the present application is a virus having a genotype different from the SFTS virus previously identified in China. SFTS virus was first discovered worldwide in China in 2011, and has not been developed yet. It can be used for diagnosis or vaccine development.
  • Figure 1 is a result of observing the cytopathic effect observed in Vero cells by optical microscope, 200 times.
  • Figure 3 is a transmission electron micrograph of Vero cells (arrows) infected with SFTS virus according to the present application, the scale bar is 500nm.
  • Figure 4 is a phylogenetic analysis of the RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) gene of SFTS virus according to the present invention compared to the virus isolated and identified in China and China. The analysis was performed using the neighbor-joining method, and the location of separation, year of separation, and GenBank access number were recorded. The length of the branch represents the evolution distance and the scale bar represents the 2.0% sequence distance.
  • RdRP RNA-dependent RNA polymerase
  • FIG. 5 is a photograph of a microscope at 400-fold magnification of an immunofluorescence assay for detecting a virus antibody present in a serum sample of a patient using a virus cultured according to an example of the present application.
  • the present application is based on the identification of new severe febrile thrombocytopenia syndrome virus.
  • virus that causes thrombocytopenia with fever which is a virus of a genotype different from the virus isolated in China (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011).
  • the present application provides that L (Large), M (Medium) and S (Small) fragments have minus strand RNA sequences that are inversely complementary to the DNA sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • Severe febrile thrombocytopenia syndrome (SFTS) virus has minus strand RNA sequences that are inversely complementary to the DNA sequences represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • Severe febrile thrombocytopenia syndrome (SFTS) virus Severe febrile thrombocytopenia syndrome
  • the SFTS virus herein is a negative single stranded RNA virus belonging to the genus Bunyaviridae and phlebovirus.
  • the genome is large (L).
  • Medium (M). It consists of small (S) segments and contains RNA dependent RNA polymerase (RdRp), glycoprotein precursor (M), glycoprotein N (Gn), glycoprotein C (Gc), nucleocapsid protein (NP) and non-structural protein (NSs). Encode six proteins.
  • Negative or antisense strands are proteins or genes encoded as antisense, and after the sense or plus strand RNA generation for expression of the gene into the protein, translation is performed therefrom. Protein is produced.
  • RNA having a reverse complementary sequence to DNA corresponding to plus or sense strand RNA represented by SEQ ID NOS: 1-3.
  • SEQ ID NOS: 1-3 RNA having a reverse complementary sequence to DNA corresponding to plus or sense strand RNA
  • Viruses identified and separated herein have a genotype different from those previously identified, and may be useful for detecting SFTS virus and diagnosing SFTS virus infection using the same.
  • the present disclosure provides a method of forming an antigen-antibody complex by contacting a viral sample comprising a viral antigen according to the present application with a biological sample or a sample; And an in vitro severe thrombocytopenic syndrome virus antibody detection method comprising the step of detecting the antigen-antibody complex.
  • Viral antigens herein refer to all or part of a virus capable of generating an immune response against the viral antigen, wherein the inactivated whole virus, split virus, modified virus, virus-derived protein, viral derived glycoprotein, Viral derived surface proteins include, but are not limited to.
  • a biological sample or sample refers to a substance or mixture of substances that includes one or more components capable of detecting a virus, and refers to cells, tissues or fluids derived from an organism, in particular human, such as whole blood, urine, plasma, and serum. Including but not limited to. It also includes cells or tissues derived directly from an organism as well as cultured in vitro. Various samples may be used for detection of the virus according to the present disclosure, but are not limited thereto. In one embodiment, whole blood, serum and / or plasma may be used. In other embodiments, tissue / cell or in vitro cell cultures obtained from organisms that have or are suspected of developing SFTS or are susceptible to SFTS virus infection or susceptible to infection may be used, but are not limited thereto. It also includes fractions or derivatives of the blood, cells or tissues. When using a cell or tissue, the cell itself or a fusion of the cell or tissue may be used.
  • Detection herein includes quantitative and / or qualitative analysis, including the detection of presence, absence, and detection of virus titer. Such methods are known in the art, and those skilled in the art will appreciate You will be able to choose the appropriate method.
  • Antigen-antibody complex detection in the methods according to the invention can be carried out through a variety of known methods, including, for example, radioimmunoassay, Western blot, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence.
  • radioimmunoassay Western blot
  • Enzyme linked immunosorbent assay ELISA
  • immunofluorescence immunofluorescence
  • immunoassays such as direct ELISA, indirect ELISA, dual antigen sandwich ELISA, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (RIISA) including competitive ELISA, and Radio Immuno Assay (RIA) are used.
  • RIISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • RIA Radio Immuno Assay
  • a label capable of direct or indirect detection may be labeled with a radioactive substance such as 3 H or 125 I, a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, hapten, biotin, digoxygenin, or the like, or the action of a substrate.
  • a radioactive substance such as 3 H or 125 I
  • a fluorescent substance such as 3 H or 125 I
  • a chemiluminescent substance such as 3 H or 125 I
  • hapten such as biotin, digoxygenin, or the like
  • a double antigen sandwich ELISA is used.
  • an antibody is immobilized on a solid substrate, and then an antibody is bound thereto, and the antibody is bound to an antigen labeled with a fluorescent substance or biotin, and the antibody is detected.
  • Proteins encoded by SFTS can be used, for example, nucleocapsid proteins having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 can be used, in particular the SFTS virus according to the present invention can be used with the SFTS virus of the HB29 strain. It can be usefully used for differential detection.
  • Immuno Electrophoresis can be used. Reagents or materials used in these methods are known and are for example antigen-antibody reactions, substrates that specifically bind antigens, nucleic acid or peptide aptamers, reactions with receptors or ligands or cofactors that interact with the complex. Can be detected or a mass spectrometer can be used.
  • Reagents or materials that specifically interact with or bind to the antigen-antibody complexes of the present disclosure may be used in chip mode or with nanoparticles.
  • the immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984 and the like.
  • the viral antigen may be labeled directly or indirectly in the form of a sandwich with a label selected from the group consisting of radioactive material, enzyme and fluorescent material.
  • a label selected from the group consisting of radioactive material, enzyme and fluorescent material.
  • the direct labeling method serum samples used in arrays and the like are labeled with a fluorescent label such as Cy3 or Cy5.
  • a sandwich an unlabeled serum sample is first detected by reacting with an array to which a detection reagent is attached, followed by binding to a target protein with a labeled detection antibody.
  • the sensitivity and specificity can be increased, and thus the detection can be performed up to pg / mL level.
  • radioactive materials, coloring materials, magnetic particles and high-density electron particles may be used as the labeling material.
  • Fluorescence luminosity can be used with scanning confocal microscopy, for example Affymetrix, Inc. Or Agilent Technologies, Inc.
  • the invention also relates to an in vitro severe thrombocytopenic syndrome virus antibody detection kit, the kit comprising a virus sample comprising the viral antigen according to the invention and a reagent for detecting said antigen-antibody complex.
  • the reagent for detecting an antigen-antibody complex included in the kit according to the present invention is a reagent used for radioimmunoassay, Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or immunofluorescence assay, and the above-mentioned reference is made.
  • the detection reagent may be directly or indirectly labeled in a sandwich form for detection of an immune response.
  • a sandwich an unlabeled serum sample is first detected by reacting with an array to which a detection reagent is attached, followed by binding to a target protein with a labeled detection antibody.
  • the sensitivity and specificity can be increased, and thus the detection can be performed up to pg / mL level.
  • radioactive materials, coloring materials, magnetic particles and high-density electron particles may be used as the labeling material. Fluorescence luminosity can be used with scanning confocal microscopy, for example Affymetrix, Inc. Or Agilent Technologies, Inc.
  • Kits herein may further include one or more additional ingredients required for binding assays, and may further include, for example, binding buffers, reagents for sample preparation, blood sampling syringes or negative and / or positive controls. .
  • the kit of the present disclosure which may include the various detection reagents, may be provided for ELISA analysis, dip stick rapid kit analysis, microarray, gene amplification, or immunoassay according to an assay.
  • the detection reagent may be selected according to the analysis mode.
  • an ELISA or dipstick rapid kit in which a viral antigen according to the invention can be provided attached to a substrate, for example a surface of a well or glass slide or a nitrocellulose in a multiwell plate.
  • a substrate for example a surface of a well or glass slide or a nitrocellulose in a multiwell plate.
  • POCT point of care testing
  • Viruses according to the invention can be developed into vaccines through appropriate treatment.
  • the present application relates to an immunogenic composition for severe thrombocytopenic syndrome (SFTS) virus, which comprises all or part of a virus according to the present application.
  • SFTS severe thrombocytopenic syndrome
  • Viruses according to the invention for the preparation of immunogenic compositions are included attenuated or inactivated, methods for which are known (see Stanley A et al., Vaccine, 5 th Edition, Elsevier Inc. 2008).
  • the virus according to the present application may be administered prophylactically to adults or children who are primarily concerned with SFTS virus infection.
  • Immunogenic compositions according to the invention can be prepared using known methods. Those skilled in the art will be able to employ a variety of materials known for the preparation of the compositions in the preparation of immunogenic compositions according to the present disclosure. See, eg, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.
  • the virus according to the present disclosure can be formulated using MEME (Minimum Essential Medium Eagle's Salt) containing 7.5% lactose and 2.5% human serum albumin or MEME comprising 10% sorbitol.
  • the virus can also be used diluted with physiologically acceptable, sterile physiological saline.
  • the virus according to the present invention may be a 0.1 to 1.0 ml sterile liquid solution containing 10 2 to 10 7 infectious units (or plaque-forming units or tissue culture infectious doses). It may be formulated and administered by intramuscular, subcutaneous or intradermal route.
  • composition according to the present application may be administered in a booster once a month or several months after initial prime administration, and will be readily determined by those skilled in the art.
  • compositions according to the present disclosure may also further comprise an adjuvant.
  • adjuvant is used to improve the immunogenicity of the virus according to the present application, including but not limited to liposomes, synthetic adjuvants such as QS21, muramyl dipeptide, monophosphoryl lipid A, or polyphosphazine no.
  • genes encoding cytokines with adjuvant activity such as GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12 or IL-13, can be inserted into the viral genome. It may also be introduced with other genes for enhancing immunogenicity, or with other genes for inducing cellular or humoral immunity.
  • the condition of patients who isolate the virus is as follows.
  • the virus was isolated from a 63-year-old female patient living in Chuncheon, Gangwon-do, South Korea.
  • the patient was reported to have been bitten by insects two weeks before the fever, and a month prior to the outbreak, no foreign travel or contact with livestock was confirmed.
  • Diarrhea was followed six times a day from the 3rd day of onset, and on the 4th day, platelet and leukocyte reduction was observed. On the 10th day of onset he died of a number of organ failures.
  • Blood was collected at an anticoagulant state on day 8 of the patient and stored at -70 ° C. After 7 months, the blood was infected with Vero cells cultured in a monolayer (African Green Monkey Kidney, Korea Cell Line Bank KCLB No. 10081), and then cultured in RPMI1640 medium containing 2% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2. It was. After 13 days, the culture was recovered and subjected to genetic analysis. In addition, the recovered medium was inoculated into DH82 cells (canine malignant histiocytosis macrophage, ATCC CRL-10389), and then cultured for 5 days, followed by cytopathic effect observed in cells infected with virus by optical inverted microscope. Was observed.
  • Vero cells cultured in a monolayer (African Green Monkey Kidney, Korea Cell Line Bank KCLB No. 10081), and then cultured in RPMI1640 medium containing 2% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2. It was. After 13 days
  • Cytopathic effect observed in Vero cells is shown as deformation or destruction of normal cells, the cells fall out of the culture flask (Fig. 1). Cytopathic effects observed in DH82 cells resulted in virus-derived cells becoming larger than normal cells, transformed into cells containing a number of vacuoles, and extending pseudopods (FIG. 2).
  • Vero cells infected with SFTS virus were fixed according to the previously disclosed method (Popov VL et al. J Med Microbiol 1995; 43: 411-21). After fixation, sections were made to a thickness of 65 nm using ultramicrotome (RMC MT-XL), stained with saturated 4% uranyl acetate and 4% red citrate, and then transmission electron microscope (HITACHI-7100, Hitachi High-Technologies, Japan) at 75 kV. The results are described in FIG.
  • HQ116417 the genotype showing the most similar nucleotide sequence among the nucleotide sequences of the LTS fragment and the common nucleotide sequence of the SFTS virus previously published in GenBank for the entire sequencing of the SFTS virus.
  • a primer was designed using the base sequence of (Yu XJ et al., N Engl J Med 364; 16: 1523-1532.).
  • RT-PCR was performed on each of the L, M and S fragments, and the PCR products were analyzed by direct sequencing. The end portion of each fragment was polyadenylation of the 3 'end of the cRNA, amplified cDNA end using a rapid amplification method, and then the base sequence was determined by direct sequencing.
  • the cDNA sequences of L, M and S analyzed are represented by the sequences of SEQ ID NOs: 1, 2 and 3, respectively, which are described in GenBank in Accession Nos. Deposited as KF358691, KF358692 and KF358693.
  • Another patient diagnosed with severe febrile thrombocytopenia syndrome was diagnosed by immunofluorescence, using the cultured virus as an antigen.
  • patient serum was mixed 1: 3 in 3% bovine serum albumin to prepare a serum 1: 4 dilution solution, and serially diluted to prepare a 1:32 dilution solution.
  • Diluted serum was dispensed in the order of 1: 4, 1: 8, 1:16, 1:32 in a slide coated with acetone-fixed virus, and finally, bovine serum albumin was dispensed as a negative control. It was. Immunofluorescence slides were reacted for 30 minutes in a 37 °C thermostat and then washed three times for 5 minutes with phosphate buffered saline.

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Abstract

각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 + 가닥 RNA 서열에 상응하는 - 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스 및 이를 이용한 항원-항체 복합체 검출을 통한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법 및 키트를 개시한다. 본원에 따른 SFTS 바이러스는 기존에 동전된 바이러스는 다른 유전형의 바이러스로 신종전염병으로 현재까지 전세계적으로 백신개발이 되지 않은 SFTS에 대한 진단법, 백신개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

중증열성혈소판감소증후군 바이러스 및 이를 이용한 SFTS 진단 방법 및 키트
본원은 바이러스를 이용한 질환의 진단에 관한 것이다.
중증열성혈소판감소증후군 (Severe fever with thrombocytopenia syndrome (SFTS))는 고열, 구토, 설사, 혈소판감소, 백혈구감소 및 다발성 장기부전과 같은 증상을 동반하며, 치사율이 6-30%에 이르는 심각한 질환이다 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011; 364:1523-32; Ding F et al Clin Infect Dis 2013; 56: 1682-3). SFTS는 분야바이러스 (Bunyavirus)에 속하는 SFTS 바이러스 (HB29 스트레인)에 의해 야기되며 2011년에 중국에서 최초로 보고되었다 (Yu XJ et al. ibid).
SFTS 바이러스는 작은소참진드기(Haemaphysalis longicornis)를 매개체로 하는 것으로, 상기 진드기는 한국에도 널리 퍼져 있는 것으로 알려져 있다 (Chae JS et al. J Vet Sci 2008; 9: 285-93; Kim CM et al. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 5766-76).
SFTS 바이러스의 혈청전환 및 바이러스혈증이 염소, 양, 소, 돼지 및 개와 같은 사육동물에서 발견되었으며, 이러한 동물도 SFTS 바이러스가 퍼진 지역에서 중간 매개체로 작용하는 것으로 생각된다 (Zhao L et al. Emerg Infect Dis 2013; 18: 963-5; Niu G et al. Emerg Infect Dis 2013; 19: 756-63).
중국 공개 특허 공보 제102618669호는 SFTS 바이러스의 전체 서열 및 그 용도에 관한 것으로, 중국에서 동정된 SFTS 바이러스의 전체 서열을 개시하고 있다.
중국 공개 특허 공보 제102070704호는 SFTS 바이러스를 이용한 SFTS 바이러스 증폭 및 검출 키트를 개시하고 있다.
신종 SFTS 바이러스의 동정 및 이를 이용한 바이러스 검출 방법 및 백신 개발이 요구되고 있다.
본원은 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 진단 또는 검출 방법, 키트 및 백신 조성물을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 마이너스 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스를 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스 유래의 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 SFTS 유래의 DNA 분자 및 상기 DNA 분자가 갖는 서열에서 각 티미딘 (Thymidine, T)이 우라실 (Uracil, U)로 치환된 SFTS 유래의 RNA 분자를 제공하며, 상기 RNA 분자는 플러스 가닥 RNA 즉 cRNA에 해당된다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 상기 RNA 또는 DNA에 의해서 코딩되는 폴리펩타이드를 제공한다. 본원에 따른 일 구현예에서 상기 폴리펩타이드의 서열은 서열번호 4 (L segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드), 서열번호 5 (M segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드) 및 서열번호 6 (L segment에 의해 코딩되는 폴리펩타이드)로 표시된다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 상기 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에서 본원은 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵세포를 제공한다.
본원에 따른 SFTS 바이러스 유래의 RNA 또는 DNA는 SFTS 바이러스의 검출을 위한 프라이머, 프로브 등의 제작 또는 RNA 바이러스의 생산을 위한 벡터 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료를 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 SFTS 감염여부 진단 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법에 사용되는 검체는 전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상이 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법은 정량적 또는 정성적 검출 또는 진단에 사용될 수 있다. 본원에 따른 방법에서 상기 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 검출될 수 있으며, 일 구현예에서 ELISA는 이중항원 샌드위치 방식으로, 상기 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군의 뉴클레오캡시드 단백질을 항원으로 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 표지될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 진단 또는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단 키트로, 상기 키트는 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함하는, 키트를 제공한다. 본원에 따른 키트에서 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용 시약을 포함한다.
또 다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 바이러스의 전부 또는 일부를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 아주번트를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 따른 SFTS 바이러스는 기존에 중국에서 동정된 SFTS 바이러스와 다른 유전형을 가진 바이러스이다. SFTS 바이러스는 2011년 중국에서 처음으로 전세계적으로 발견된 바이러스이며, 아직까지 백신개발이 되지 않은 바이러스로, 이에 대한 진단법이나 백신개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 베로세포에서 관찰되는 세포변병효과를 광학 현미경, 200배로 관찰한 결과이다.
도 2는 DH82 세포에서 관찰되는 세포병변 효과를 광학 현미경, 400배로 관찰한 결과이다.
도 3은 본원에 따른 SFTS 바이러스로 감염된 Vero 세포 (화살표)의 투과전자현미경 사진으로, 스케일바는 500nm이다.
도 4는 본원에 따른 SFTS 바이러스의 RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) 유전자를 본 및 중국에서 분리 동정된 바이러스와 비교한 계통발생분석 결과이다. 분석은 neighbor-joining 방법을 이용하여 수행되었으며, 분리장소, 분리년도 및 GenBank 접근번호를 기재하였다. 브랜치의 길이는 진화 거리를 나타내며, 스케일바는 2.0% 서열 거리를 나타낸다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따라 배양된 바이러스를 항원으로 이용하여 환자의 혈청시료에 존재하는 바이러스 항체를 검출한 면역형광 분석의 현미경, 400배 배율로 관찰한 사진이다.
본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본원은 신종 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 규명을 기반으로 한 것이다. 본원에서는 발열을 동반한 혈소판 감소증의 원인 바이러스를 분리하고 유전자를 분석한 것으로, 이는 중국에서 분리된 바이러스 (Yu XJ et al., N. Engl. J. Med. 2011) 와 상이한 유전자형의 바이러스이다.
따라서 한 양태에서 본원은 L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 마이너스 가닥 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 관한 것이다.
본원에서 SFTS 바이러스는 마이너스 단일가닥 RNA 바이러스로 Bunyaviridae과, phlebovirus 속에 속한다. 직경 80~100nm의 구형 바이러스로 작은소참진드기를 매개체로 하며, 유전체는 large(L). Medium(M). small(S) 세그먼트로 구성되어 있으며, RNA dependent RNA polymerase(RdRp), glycoprotein precursor(M), glycoprotein N(Gn), glycoprotein C(Gc), nucleocapsid protein(NP) 및 non-structural protein(NSs)의 6개의 단백질을 코딩한다.
마이너스 또는 안티센스 가닥 (바이러스 단백질을 코딩하는 센스 또는 플러스 가닥에 대한 안티센스)은 단백질 또는 유전자가 안티센스로서 코딩되며, 유전자의 단백질로의 발현을 위해 센스 또는 플러스 가닥 RNA 생성 후, 이로부터 번역을 수행하여 단백질이 생성된다.
본원에서 규명된 SFTS 바이러스의 유전체는 따라서 서열번호 1 내지 3으로 표시되는, 플러스 또는 센스 가닥 RNA에 대응하는 DNA에 역 상보적 (reverse complementary) 서열을 갖는 RNA이다. 예를 들면 서열번호 1 내지 3으로 표시되는 cDNA 서열의 상보적 서열을 5'-3' 방향으로 판독한 후, 티미딘을 우라실로 치환하면 수득할 수 있다.
본원에서 분리 동정된 바이러스는 기존에 동정된 바이러스와 상이한 유전자 형을 갖는 것으로, SFTS 바이러스의 검출 및 이를 이용한 SFTS 바이러스 감염여부 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
이러한 측면에서 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 상기 바이러스 시료를 생물학적 시료 또는 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 인비트로 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법에 관한 것이다.
본원에서 바이러스 항원은 상기 바이러스 항원에 대하여 면역반응을 발생시킬 수 있는 바이러스의 전부 또는 그 일부를 일컫는 것으로, 불활성화된 전체 바이러스, 스플리트 바이러스, 변형된 바이러스, 바이러스유래 단백질, 바이러스유래 당단백질, 바이러스유래 표면 단백질을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에서 생물학적 시료 또는 검체란 바이러스의 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 바이러스의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 SFTS가 발생한 또는 발생이 의심되거나 또는 SFTS 바이러스 감염 또는 감염이 의심되는 생물체에서 수득한 조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 바이러스 양 (titer)의 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본원에 따른 방법에서 항원-항체 복합체 검출은 공지된 다양한 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 포함한다.
일 구현예에서는 직접 ELISA, 간접 ELISA, 이중항원 샌드위치 ELISA, 경쟁적 ELISA를 포함하는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) 및 RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 면역분석법이 사용된다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 이중항원 샌드위치 ELISA가 사용된다. 이중항원 샌드위치 방식은 항원을 고상 기질에 고정시킨 후 여기에 항체를 결합하고, 상기 항체를 다시 형광물질 또는 바이오틴 등으로 표지된 항원과 결합시켜, 항체를 검출하는 방법으로, 항원으로는 본원에 따른 SFTS가 코딩하는 단백질 (재조합 단백질 포함)이 사용될 수 있으며, 예를 들면 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오캡시드 단백질이 사용될 수 있으며, 이는 특히, 본원에 따른 SFTS 바이러스를 HB29 스트레인의 SFTS 바이러스와 차별적으로 검출하는데, 유용하게 사용될 수 있다.
기타 다른 면역 반응 기반의 방법이 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 항체 및/또는 항원을 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 항원에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 복합체와 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 항원-항체 복합체와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 감염 여부를 진단할 수 있다.
본원에 따른 방법에서 바이러스 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다.
형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 인비트로 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 본원에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함한다.
본원에 따른 키트에 포함되는 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용에 사용되는 시약으로, 이에 대하여는 앞서 기술한 바를 참조한다.
또한 상술한 바와 같이 면역 반응의 검출을 위해 검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3 또는 Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.
본원의 키트는 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.
상기 다양한 검출시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.
일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 바이러스 항원이 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point Of Care Testing) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이러스 항원이 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료와 접촉시, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 바이러스 항원과 결합시 발색하는 방식으로 검출하는 것이다.
본원에 따른 바이러스는 적절한 처리를 통해 백신으로 개발될 수 있다. 이러한 측면에서 본원은 본원에 따른 바이러스의 전부 또는 일부를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물에 관한 것이다.
면역원성 조성물의 제조를 위해 본원에 따른 바이러스는 약독화 또는 불활성화되어 포함되며, 이에 대한 방법은 공지된 바와 같다 (Stanley A et al., Vaccine, 5th Edition, Elsevier Inc. 2008 참조).
본원에 따른 바이러스는 일차적으로 SFTS 바이러스 감염의 우려가 있는 성인 또는 어린이에게 예방차원에서 투여될 수 있다.
본원에 따른 면역원성 조성물은 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 당업자라면 공지된, 조성물의 제조에 사용되는 다양한 물질을 본원에 따른 면역원성 조성물의 제조에 채용할 수 있을 것이다. 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, Pa.을 참조할 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 바이러스를 7.5% 락토스 및 2.5% 인간 혈청 알부민을 포함하는 MEME (Minimum Essential Medium Eagle's Salt) 또는 10% 솔비톨을 포함하는 MEME를 이용하여 제형화 할 수 있다. 또한 바이러스는 생리적으로 허용가능한, 멸균된 생리적 식염수로 희석하여 사용될 수 있다.
본원에 따른 면역원성 조성물은 공지된 다양한 방법을 이용하여 투여될 수 있으며, 투여량도 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 바이러스는 102 내지 107 감염 유니트 (또는 PFU (plaque-forming unit) 또는 조직배양물 감염도즈 (tissue culture infectious dose))를 포함하는 0.1 내지 1.0 ml의 멸균된 액상 용액으로 제형화되어, 근육내, 피하, 진피내 경로로 투여될 수 있다.
또한 본원에 따른 조성물은 일회 투여되거나 또는 초기 프라임 투여 후, 수개월 후에 부스터로 투여될 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있을 것이다.
본원에 따른 조성물은 또한 아주번트를 추가로 포함할 수 있다. 당업자라면 당업계에 공지된 아주번트는 중 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 아주번트는 본원에 따른 바이러스의 면역원성을 향상시키기 위해 사용되는 것으로서, 리포좀, 합성 아주번트 예를 들면 QS21, 뮤라밀 다이펩타이드, 모노포스포릴 리피드 A, 또는 폴리포스파진을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 부가하여 필요한 경우, 아주번트 활성을 갖는 사이토카인 예를 들면 GM-CSF, IL-2, IL-5, IL-12 또는 IL-13을 코딩하는 유전자를 바이러스 유전체에 삽입할 수 있다. 또한 기타 면역원성의 향상을 위한 다른 유전자, 또는 세포성 또는 체액성 면역을 유도를 위한 다른 유전자와 함께 도입될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 바이러스의 분리
바이러스를 분리한 환자의 상태를 요약하면 다음과 같다. 바이러스는 발병 전까지 건강했던 63세의 대한민국 강원도 춘천시에 거주하는 여자 환자에게서 분리하였다. 환자는 발열 2주전에 곤충에게 물린 것으로 보고되었으며, 발병 한달전부터 해외여행이나 가축과의 접촉은 없는 것으로 확인되었다. 발병 3일째부터 하루 6회 설사가 동반되었으며, 4일째, 혈소판 및 백혈구 감소가 관찰 되었다. 발병 10일째 다수의 장기 부전으로 사망하였다.
상기 환자로부터 발병 8일째에 항응고 상태로 혈액을 채취하여 -70℃에 보관하였다. 7개월 후에 상기 혈액을 단층으로 배양된 Vero 세포 (아프리카 녹색 원숭이의 신장 유래, 한국세포주 은행 KCLB No. 10081)에 감염한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 2% FBS를 포함한 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 13일 후에 배양액을 회수하여 유전자 분석을 수행하였다. 또한 상기 회수된 배지를 DH82 세포 (개의 악성 히스티오사이토시스 대식세포 유래, ATCC CRL-10389)에 접종 한 후 5일간 배양하고, 이어 광학도립현미경으로 바이러스에 감염되어 나타난 세포에서 관찰되는 세포병변 효과를 관찰하였다. 베로세포에서 관찰되는 세포변병효과는 정상세포의 변형이나 파괴로 나타나는 것으로, 배양플라스크에서 세포가 떨어져 나오게 된다(도 1). DH82 세포에서 관찰되는 세포병변 효과는 바이러스를 탐식한 세포가 정상세포보다 커지고, 다수의 공포(vacuoles)를 포함한 세포로 변형되게 되며, 위족(pseudopods)이 뻗어나오게 된다(도 2).
실시예 2 바이러스 유전적 분석
바이러스의 형태적 분석을 위해 SFTS 바이러스로 감염된 Vero 세포는 기존에 개시된 방법 (Popov VL et al. J Med Microbiol 1995; 43:411-21)대로 고정하였다. 고정 후 울트라마이크로톰(RMC MT-XL)을 이용하여 65 nm 두께로 절편을 만든 후 포화된 4% 유라닐 아세테이트 및 4% 레드 (lead) 사이트레이트로 염색한 후, 투과전자현미경 (HITACHI-7100, Hitachi High-Technologies, Japan)으로 75 kV에서 관찰하였다. 결과는 도 1에 기재되어 있다.
유전적 분석은 다음과 같이 수행되었다. 상기 채취한 혈액 및 상기 혈액으로 감염된 Vero 세포로부터 QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 제조자의 방법대로 사용하여 RNA를 추출하였다. 이어 상기 RNA를 이용하여 종전에 기재된 바와 같이 (Liu Y et al. Vector Borne Zoonotic Dis. 2012; 12:156-60) 역전사 PCR(reverse transcript PCR, RT-PCR)을 수행하여 부분적 L 단편을 증폭하였다. RT-PCR 결과, SFTS 바이러스 양성인 것으로 확인되어, PCR 산물을 직접적 염기서열법으로 분석하였다. SFTS 바이러스의 전체 염기서열분석을 위해 종전에 GenBank에 공개되어 있는 SFTS 바이러스의 염기서열 중에서 공통 염기서열 및 L 단편의 염기서열 중에서 가장 유사하였던 염기서열을 보였던 유전형인 AH12형(GenBank Accession no. HQ116417)의 염기서열을 이용하여 프라이머를 고안하였다(Yu XJ et al., N Engl J Med 364;16:1523-1532.). L, M 및 S 단편 각각에 대해 RT-PCR을 수행한 뒤 PCR 산물을 직접적 염기서열법으로 분석하였다. 각 단편의 말단부위는 cRNA의 3' 말단을 폴리아데닐화 한 후, cDNA 말단을 래피드 증폭법을 사용하여 증폭한 뒤, 직접 염기서열법으로 염기서열을 결정하였다. 분석된 L, M 및 S 의 cDNA 서열은 각각 서열번호 1, 2 및 3의 서열로 표시되며, 이는 각각 GenBank에 Accession Nos. KF358691, KF358692 및 KF358693로 기탁되었다.
블라스트 분석 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 결과 SFTS 바이러스 이외에 유사 서열을 존재하지 않는 것으로 나타났다. 상동성 검색 결과 본원에서 규명된 바이러스는 종전에 규명된 SFTS 바이러스와 L, M, 및 S 단편이 각각 5.8%-99.8%, 94.1%-99.9%, 및 94.8%-99.7%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다.
RNA-dependent RNA 폴리머라제 염기서열을 이용하여 neighbor-joining 방법으로 기존에 알려진 중국 및 일본의 SFTS 바이러스와 계통발생학분석을 수행한 결과, 이들 바이러스와 동일하지 않으며, 95.9%-99.9% 서열 관련성을 가지고 있는 것으로 나타났다 (도 2 참조).
실시예 3 배양된 바이러스를 항원으로 이용한 면역형광 분석
배양된 바이러스를 항원으로 이용한, 아래와 같은 면역형광법을 통해 중증열성혈소판감소증후군으로 확진된 다른 환자를 진단하였다.
구체적으로 3% 소혈청알부민(Bovine serum albumin)에 환자 혈청을 1:4로 혼합하여 혈청 1:4 희석용액을 제조하고 연속적으로 희석하여 1:32 희석용액까지 제조하였다. 이어 아세톤으로 고정한 배양된 바이러스가 항원으로 도포되어 있는 슬라이드에 희석혈청을 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 순으로 10 μL씩 분주하고 마지막으로 음성대조군으로 소혈청알부민만을 분주하였다. 면역형광법 슬라이드를 37℃ 항온기에서 30분간 반응한 뒤 인산염완충식염수로 5분간 3회 세척하였다. 상온에서 슬라이드를 건조 후 형광물질 이소치오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)-접합 염소항인감마면역글로불린항체 IgM과 IgG를 각각 분주한 후, 37℃ 항온기에서 30분간 반응 후 인산염완충식염수로 5분씩 3회 세척 후 형광용액으로 반응시킨 뒤 현미경으로 판독하였다. 결과는 도 5에 기재되어 있으며, 이에 나타난 바와 같이, 배양된 바이러스를 항원으로 이용하여 회복기 환자의 혈청에서 면역형광법을 이용한 진단을 시행하였을 때, IgG 항체에 대해 1:160 희석 혈청에서 강한 양성으로 확인되었다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고 문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (14)

  1. L (Large), M (Medium) 및 S (Small) 단편이, 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 DNA 서열에 역 상보적인 RNA 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스.
  2. 제 1 항에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료를 검체와 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 검체는 전혈, 혈장 또는 혈청 중 하나 이상인 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 검출은 정량적 또는 정성적 검출인, 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 검출은 방사상면역분석, 웨스턴블랏, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석을 통해 검출되는 되는 것인, 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 ELISA는 이중항원 샌드위치 방식으로, 상기 항원은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 중증열성혈소판감소증후군의 뉴클레오캡시드 단백질인, 방법.
  7. 제 2 항에 있어서, 상기 항원은 방사능물질, 효소 및 형광물질로 구성되는 군으로부터 선택되는 표지로 표지된 것인, 방법.
  8. 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 항체 검출 또는 진단 또는 중증열성혈소판감소증후군 바이러스 감염 진단 키트로, 상기 키트는 제 1 항에 따른 바이러스 항원을 포함하는 바이러스 시료 및 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약을 포함하는, 키트.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체 검출용 시약은 방사상면역분석, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) 또는 면역형광분석용 시약인, 키트.
  10. 제 1 항에 따른 바이러스의 전부 또는 일부를 포함하는, 중증열성혈소판감소증후군 (SFTS) 바이러스에 대한 면역원성 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 조성물은 아주번트를 추가로 포함하는 것인, 면역원성 조성물.
  12. SFTS 유래의 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 서열로, 상기 서열에서 티미딘이 우라실로 치환된, SFTS 유래의 RNA 분자.
  13. 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나로 표시되는 SFTS 유래의 DNA 분자.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항의 RNA 또는 DNA 분자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드.
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