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WO2015018647A1 - Verfahren und vorrichtung zum aufbereiten einer zielzellen und begleitzellen enthaltenden probe biologischen materials zum extrahieren von nukleinsäuren der zielzellen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum aufbereiten einer zielzellen und begleitzellen enthaltenden probe biologischen materials zum extrahieren von nukleinsäuren der zielzellen Download PDF

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Publication number
WO2015018647A1
WO2015018647A1 PCT/EP2014/065883 EP2014065883W WO2015018647A1 WO 2015018647 A1 WO2015018647 A1 WO 2015018647A1 EP 2014065883 W EP2014065883 W EP 2014065883W WO 2015018647 A1 WO2015018647 A1 WO 2015018647A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
cells
target cells
nucleic acids
companion
Prior art date
Application number
PCT/EP2014/065883
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Bernd Faltin
Franz Laermer
Sebastian Berning
Christian Dorrer
Original Assignee
Robert Bosch Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch Gmbh filed Critical Robert Bosch Gmbh
Priority to EP14744516.7A priority Critical patent/EP3030654A1/de
Priority to US14/910,543 priority patent/US20160186167A1/en
Priority to CN201480044615.2A priority patent/CN105431537A/zh
Publication of WO2015018647A1 publication Critical patent/WO2015018647A1/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D39/00—Filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D39/02—Loose filtering material, e.g. loose fibres
    • B01D39/06—Inorganic material, e.g. asbestos fibres, glass beads or fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells
  • the present invention particularly relates to the field of microfluidic systems
  • RNA pathogenic DNA or RNA obtained.
  • a sample of blood is understood to mean the sample, but in principle other liquid or liquefied patient samples, for. Urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, a flushed swab or a liquefied tissue sample, in particular if these are blood or traces of
  • Contain blood A disease in which this is relevant, z. B. a sepsis.
  • US 2010/0285578 A1 discloses devices and methods for recovering nucleic acids from biological samples.
  • a preparation of a biological sample in particular for the selective recovery of pathogenic nucleic acids from a sample can be realized, which also contains non-pathogenic nucleic acids, for example from blood cells.
  • Embodiments of the present invention include, for example, a concept for thermal pretreatment of a sample and / or a concept for preparing a sample by means of a membrane, microchannel structure or the like.
  • a combination of a thermal pretreatment, in which accompanying cells are selectively lysed, with an enzymatic digestion and a separation by means of filtration is provided with the aim of obtaining target cell nucleic acids purified from a sample also containing accompanying cells.
  • a separation of leukocytes, z. B. with human DNA from a blood sample conceivable to be examined for the presence of pathogens.
  • embodiments of the present invention are advantageous in systems or laboratory routines used in molecular diagnostics, or for microfluidic lab-on-chip molecular systems
  • embodiments of the present invention enable target cell nucleic acids contained in a sample, e.g. B. pathogenic DNA, from a background to companion nucleic acids, eg. B. human DNA, reliably separate. This avoids that the companion cell nucleic acids interfere with subsequent amplification and detection steps, and a sensitivity of detection or diagnosis is thus improved.
  • a thermal pretreatment of a sample can by particular
  • Sample are also avoided in view of that a critical with respect to the gelling temperature and time also from properties of the sample such.
  • B. depends on the hematocrit.
  • enzymatic digestion can prevent the sample from clogging a filter. This makes it possible to process even large quantities of samples. Filtration allows this, only a few pathogens, eg. B. 10 to 1000, from a relatively large volume of blood, z. B. 1 to 10 milliliters to accumulate. This can increase an effective concentration of target cell nucleic acids and a
  • Embodiments of the present invention are particularly well suited for automation, especially in a microfluidic system. This can facilitate implementation and reduce the risk of contamination.
  • Separation of the accompanying cells according to the invention offers the advantage over chemical selective lysis of the accompanying cells that a number of required reagents and working steps can be minimized. As a result, a time required for sample preparation can be shortened. It also exists in terms of the purification of target cell nucleic acids, an advantage in that embodiments of the present invention in a simple manner in a microfluidic system, for. As a lab-on-chip system (LOC) for molecular diagnostics, can be integrated. Also, an achievable separation efficiency of target cell nucleic acids with respect to companion nucleic acids can be increased and a number of required filters or
  • LOC lab-on-chip system
  • the filtration can in particular
  • a method for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells for extracting nucleic acids of the target cells comprises the following steps:
  • the target cells may be pathogenic cells or pathogens, eg. As viruses or microorganisms, such as. As bacteria or fungi, comprising DNA and / or RNA as nucleic acids.
  • pathogenic cells or pathogens eg. As viruses or microorganisms, such as. As bacteria or fungi, comprising DNA and / or RNA as nucleic acids.
  • nucleic acids DNA and / or RNA.
  • the companion cells may include human cells, for example, blood cells or the like.
  • the sample may in particular be understood as a blood sample, or other liquid or liquefied patient samples, e.g. As urine, stool, sputum, cerebrospinal fluid, lavage, rinsed smears or liquefied tissue samples, understood, especially if they contain blood or traces of blood.
  • the nucleic acids contained in the target cell lysate can be purified and be fed to a subsequent analysis, by the presence of certain pathogens or genes, eg. B. resistance genes, can be checked.
  • This subsequent analysis may, for. B. by sequencing, polymerase chain reaction (PCR, polymerase chain reaction), real-time PCR or real-time PCR and / or detection or hybridization carried out on a microarray.
  • Purification of the target cell nucleic acids from the sample may be performed after lysing the target cells by subsequent adsorption of the target cell nucleic acids to a solid phase, e.g. As a silica filter or microparticles or so-called beads done.
  • a solid phase e.g. As a silica filter or microparticles or so-called beads done.
  • mechanical methods e.g. B. by means of ultrasound or microspheres or beads.
  • the aim of purification is to concentrate the target cell nucleic acids in a concentrated form
  • human blood samples may additionally contain large amounts of human DNA companion cells.
  • One way to separate the target cells from the companion cells may be to first locate the companion cells, e.g.
  • blood cells contained in the sample can be selectively disrupted or lysed and separated from the target cells. in the
  • target cells can be lysed and the target cell nucleic acids can be purified.
  • Embodiments of the present invention make it possible to separate the target cell nucleic acids from the background in the sample from companion cell nucleic acids.
  • the step of accumulating may include a substep of tempering the sample to a lysis temperature
  • the step of accumulating may include a substep of tempering the sample to a lysis temperature
  • Lysetemperatur be suitably selected that the accompanying cells contained in the sample are destroyed or pre-damaged, with the target cells contained in the sample remain intact.
  • the target cells can be retained by means of an accumulation filter.
  • Such an embodiment offers the advantage that a particularly effective and reliable accumulation of the target cells can be achieved.
  • the thermal treatment can be used selectively due to different cell wall properties. Due to the lysing, clogging in the filtration can be prevented.
  • Tempering can be performed.
  • a viscosity of the sample can be lowered.
  • temperature-resistant enzymes can be used in the partial step of lysing and digestion, e.g. Nucleases, proteinases or lysozyme.
  • the companion cells may be separated from the sample.
  • a separating device which may have a filter, a membrane, microstructures or the like.
  • the separation is here due to the different sizes of target and companion cells, i. the companion cells are withheld if they are larger than the target cells.
  • This can further reduce the number of companion cells that are in the filtrate, and thus the amount of unwanted nucleic acids.
  • the sample for separating the target cells may be rinsed several times via a separator.
  • the target cells are retained on the filter because of their size.
  • the target cells can thereby be separated from accompanying lysed lysed or predated accompanying cells.
  • Separator between rinses be cleaned by the accompanying cells.
  • the cleaning may be performed by rinsing water or a buffer in the reverse direction with respect to a filtration direction via the separating device.
  • Such an embodiment offers the advantage that a structure is simplified and only one separation device is needed. By cleaning or washing the separating device, wherein the accompanying cells can be removed from the separating device, a flow resistance at the
  • Separator be reduced so that a subsequent filtration easier and faster, d. H. at lower pressures and higher flow rates. Furthermore, it can also be prevented that escorting cells detach from the separation device and reach the filtrate. Thus, the achievable separation efficiency is increased.
  • the step of accumulating may include a substep of diluting the sample.
  • the sample can be diluted with water or an aqueous buffer.
  • Embodiment offers the advantage that a viscosity of the sample is reduced, whereby a processability of the sample is improved. If the step of accumulating comprises the sub-step of tempering the sample, the sub-step of dilution may be carried out before or after the sub-step of tempering. In this way, on the one hand, gelling during the thermal treatment can be avoided even more reliably or can on the other hand, by osmotic shock also accompanying cells, which were pre-damaged during the thermal treatment, are effectively further lysed.
  • the target cells in the step of disrupting the target cells, can be analyzed by means of a lysis buffer and additionally or alternatively by means of
  • Ultrasonic coupling be unlocked.
  • Such an embodiment offers the advantage that fewer reagents are needed, e.g. An additional lysis buffer can be saved for the digestion of the target cells. Ultrasound-induced pressure waves and cavitation cause the cell walls of the target cells to be destroyed particularly safely and quickly.
  • An apparatus for processing a sample of biological material containing target cells and companion cells for extracting nucleic acids of the target cells comprises: means for accumulating the target cells of the sample by separating the target cells or the companion cells from the sample; means for disrupting the target cells by chemical and / or physical lysis to produce a target cell lysate containing the nucleic acids of the target cells; and means for purifying the nucleic acids from the target cell lysate to extract the nucleic acids of the target cells.
  • the aforesaid apparatus for processing can be advantageously used in connection with an embodiment of the method for processing in order to prepare a sample of biological material containing target cells and companion cells, in order to be able to extract nucleic acids of the target cells.
  • the apparatus is designed to implement or to implement the steps of the method for processing in corresponding devices.
  • the object underlying the invention can be solved quickly and efficiently.
  • the device may be formed as a microfluidic system, in particular for a so-called chip laboratory or
  • the means for accumulating may comprise tempering means for tempering the sample to a lysis temperature for unlocking or pre-damaging the accompanying cells.
  • the device may accumulate
  • Temperature control means for controlling the temperature of the sample to a Lysetemperatur for unlocking or VorJOdigen the accompanying cells, a storage chamber for a buffer solution for lysing the open-ended in the step of tempering or pre-damaged accompanying cells by chemical or enzymatic lysis and an accumulation filter for separating the target cells from the sample.
  • the temperature control means may comprise a heating device or a heating device and a cooling device. Also, the
  • Tempering be formed to heat and / or to cool.
  • Such an embodiment offers the advantage that a particularly effective and reliable selection of the target cells is achieved.
  • the thermal treatment can be used selectively due to different cell wall properties. Due to the lysis, clogging in the filtration can be prevented.
  • the temperature control the
  • Selection temperature can be set accurately. If the temperature control means also have a cooling device, the sample can be adjusted to a second defined temperature level, eg. B. room temperature, are brought so that a duration of the thermal pretreatment can be adjusted very accurately and also a gelation of the sample can be avoided particularly safe.
  • a second defined temperature level eg. B. room temperature
  • the temperature control means may be thermally coupled to a sample chamber or a sample channel arranged between a sample chamber and a digestion chamber.
  • the accumulation filter of the accumulation means may also be usable by the means for unlocking and additionally or alternatively the means for purifying.
  • Such an embodiment offers the advantage that a filter is saved when the target cells on the Accumulation filter be lysed and the accumulation filter is also used for DNA purification.
  • a lysis buffer used for digestion can be set so that target cell nucleic acids released on digestion bind directly to the accumulation filter.
  • Accumulation filter can be given without the lysis buffer from
  • Binding buffer in the accumulation filter can be done diffusively.
  • the at least one separating device may have a separating filter, a filter membrane, a filter channel with a plurality of integrated columns or posts and additionally or alternatively a section provided with filter pores.
  • the at least one separating device has sieve-like microstructures which are formed in channels and chambers of a microfluidic system and can be produced, in particular, in the same production step as other structures of the microfluidic system, this simplifies the manufacture of the
  • a membrane having a defined pore size can also be molded directly in a bottom of a microfluidic channel or a chamber by means of such a method.
  • the separation device and a return channel between a sample chamber and a digestion chamber can be connected in parallel.
  • a washing device or rinsing device for cleaning the separating device can be provided by filtered-out accompanying zones.
  • the separation devices may be the same or different. Such an embodiment offers the advantage that a separation efficiency can be further increased by the multiple filtration.
  • FIG. 1 is a flowchart of a method for rendering according to an embodiment of the present invention.
  • FIGS 2 to 15 apparatus for processing according to embodiments of the present invention.
  • FIG. 1 shows a flow diagram of a method 100 for processing a target cell and biological cell sample containing target cells for extracting nucleic acids of the target cells according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • the method 100 for processing is in
  • the method 100 includes a step of accumulating the target cells of the sample by separating the target cells or companion cells from the sample. Also, the method 100 includes a step 120 of disrupting the target cells by chemical and additionally or alternatively by physical lysis to produce a target cell lysate containing the nucleic acids of the target cells. Further, the method 100 includes a step 130 of purifying the nucleic acids from the target cell lysate to extract the nucleic acids of the target cells. According to one embodiment, the step 1 10 of accumulating comprises a sub-step of tempering the sample to a lysis temperature for opening the companion cells, a substep of lysing the companion cells by chemical or enzymatic lysis and the digestion of the
  • the sub-step of lysing and digestion is carried out before, during or after the tempering sub-step, wherein a viscosity of the sample is lowered in the sub-step of lysing and digestion.
  • step 1 10 of accumulation by at least one filtration the companion cells are separated from the sample.
  • step 1 10 of accumulating the sample is rinsed to separate the companion cells via a plurality of serially connected separators.
  • the sample for separating the companion cells is rinsed several times via a separating device.
  • accumulating step 1 10 includes a substep of diluting the sample.
  • the target cells are determined by means of a lysis buffer and additionally or alternatively by means of
  • FIG. 2 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is designed as a microfluidic system or part of a microfluidic system.
  • a sample chamber 210, a tempering device in the form of a heater 220, a storage chamber 230 for a first buffer, a filter 240, a are shown by the device 200 Waste chamber 250, a lye buffer storage chamber 260 and a
  • the heater 220 is disposed adjacent to the sample chamber 210. In this case, the heater 220 is thermally coupled to the sample chamber 210.
  • Pantry 230 is connected to sample chamber 210 by fluid communication.
  • the filter 240 is disposed between the sample chamber 210 on the one hand and the waste chamber 250 and the collection chamber 270 on the other hand.
  • the sample chamber 210 is connected by means of a fluid connection via the filter 240 with the waste chamber 250 and the collection chamber 270.
  • the lysis buffer storage chamber 260 is fluidly connected to fluid communication between the sample chamber 210 and the filter 240.
  • the sample chamber 210 has a z. B. by means of plugs, lids or adhesive film resealable opening for introducing the sample.
  • the heater 220 is, for example, a Peltier heater or film heater.
  • the waste chamber 250 serves to receive filtrate.
  • the collection chamber 270 serves to receive lysate.
  • FIG. 2 shows a topology of the device 100 and a
  • Microfluidic system in which a thermal treatment of the sample is performed stationary in the sample chamber 210. Operation of the device 200 will be discussed below.
  • FIG. 3 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is similar to the device of FIG. Shown here are the device 200, the sample chamber 210, the heater 220, the first buffer storage chamber 230, the filter 240, the waste chamber 250, the lysis buffer storage chamber 260, the collection chamber 270, a microchannel 315, and a cooler 320.
  • the microchannel 315 is arranged.
  • the sample chamber 210 is connected to the storage chamber 230 via a fluid connection via the microchannel 315.
  • the heater 220 and the cooler 320 form the tempering device.
  • the heater 220 and the radiator 320 are disposed adjacent to the microchannel 315.
  • the heater 220 and the radiator 320 are thermally coupled to the microchannel 315.
  • the storage chamber 230 is in this case arranged between the microchannel 315 and the filter 240.
  • the filter 240 is disposed between the storage chamber 230 on the one hand and the waste chamber 250 and the collection chamber 270 on the other hand.
  • the lysis buffer storage chamber 260 is connected to the storage chamber 230 by fluid communication.
  • FIG. 3 shows a topology of the apparatus 200 for performing a thermal treatment in flow mode.
  • the sample from the sample chamber 210 through the temperature-controllable microchannel 315 in the
  • the temperature-controllable microchannel 315 can be heated by the heater 220 and, if necessary, cooled by the cooler 320, z. B. a Peltier cooler.
  • the cooler 320 as the second thermally active element, the heated sample is, prior to mixing with the first buffer, at a defined temperature level, e.g. B.
  • FIG. 4 shows a device 200 for processing a target cell
  • the apparatus 200 is similar to the apparatus of Fig. 3, wherein in Fig. 4, the apparatus 200 is shown in a design as a multi-layer structure in a sectional view, wherein the chambers of the apparatus 200 are omitted in the illustration.
  • the heater 200, the filter 240, the microchannel 315, a further microchannel 415, a first structured polymer layer 481, a polymer film 482, a second structured polymer layer 483 and a polymeric cover film 484 are shown here by the device 200.
  • the structured polymer layers 481 and 483 are made of, for example, thermoplastic polymers, e.g. As PP, PC, PE, PS, COP, COC, etc., formed.
  • the polymer film 482 is for example made of thermoplastic Formed polymers, thermoplastic elastomers, elastomers or the like.
  • the lidding film 484 comprises, for example, a thermoplastic film, adhesive film or the like.
  • the further microchannel 415 extends between the temperature-controllable
  • Microchannel 315 and filter 240 represent the multilayer structure of the device 200 according to the embodiment of the present invention illustrated in FIG.
  • Such a design has the advantage that it is inexpensive to produce and by means of the polymer film 482 also active elements such as valves can be realized.
  • an advantage of this embodiment of the present invention is that the temperature-controllable microchannel 315 is separated from the heater 220 only by the thin cover foil 484. As a result, a temperature in the temperature-controllable microchannel 315 can be set particularly precisely. Operation of the apparatus 200 will be discussed in greater detail below.
  • FIG. 5 shows a device 200 for processing a target cell
  • the device 200 is similar to the device of FIG. Shown here by the device 200 are the heater 220, the filter 240, the
  • Microchannel 315 the first patterned polymer layer 481, the polymeric
  • Lid foil 484, another heater 520, a heatable amplification chamber 570 and, for example, two rotary valves 590 are used as a heatable amplification chamber 570 and, for example, two rotary valves 590.
  • first patterned polymer layer 481 and the polymeric lidding film 484 represent the multilayer structure of the device 200 according to the embodiment of the present invention shown in FIG. 5.
  • Rotary valves 590 are disposed between the microchannel 315 and the filter 240 and configured to release or block fluid communication therebetween.
  • a second of the rotary valves 590 is disposed between the filter 240 and the amplification chamber 570 and configured to be a
  • Heater 520 is disposed adjacent to the amplification chamber 570 and with the same thermally coupled.
  • the filter 240 is disposed between the two rotary valves 590.
  • an embodiment of the device 200 is shown as a multi-layer structure with only two layers. Such an embodiment has the advantage that the device 200 can be produced particularly inexpensively.
  • such an embodiment has the additional amplification chamber 570 which can be heated by means of the further heater 520, in which, after a purification of the target cell nucleic acids, an amplification thereof can be carried out by means of PCR.
  • step 1 10 of accumulating the actual thermal pretreatment of the sample is carried out according to an embodiment in a first sub-step.
  • the sample is heated, for example, to a
  • the temperature is adjusted so that the accompanying cells contained in the sample, for example blood cells such as leukocytes, are destroyed or damaged and the nucleic acids contained in the accompanying cells, ie human DNA, are at least partially released, the target cells contained in the sample , z. B.
  • Pathogens stay intact. Such selective lysis of the companion cells is possible because the target cells as pathogens have a more robust cell wall and are thus more stable to thermal stresses.
  • the heating of the sample can, for. B. stationary in one of the sample chamber 210 or in
  • step 1 10 of the accumulation then takes place in a second sub-step
  • first buffer containing enzymes, e.g. Proteases, DNAsen and lysozyme, from the storage chamber 230.
  • This first buffer causes a digestion or a comminution of the resulting in the first sub-step or released damaged cells, cell debris, proteins and DNA strands of the companion cells. This digestion is essential for one
  • the resulting liquid in this step is called digested lysate.
  • step 1 10 of the accumulation is then carried out in a third sub-step filtration, wherein the digested lysate is filtered through the filter 240, z. B. a sterile, tissue or silica filter is passed. Still intact cellular components, especially the target cells, are retained on the filter 240 due to their size and thus accumulated.
  • the sample prior to the first substep of step 1 to accumulate, is diluted with an aqueous buffer, e.g. In a ratio between 10: 1 and 1:10. This has the advantage that the aqueous buffer, e.g. In a ratio between 10: 1 and 1:10.
  • Viscosity of the sample is reduced and gelling during the thermal treatment is more reliably avoided. If necessary, the dilution with the aqueous buffer can also be carried out after the first partial step of the accumulation step. This has the advantage that, as a result of the osmotic shock triggered by this, also accompanying cells which were only previously damaged in the first partial step are effectively lysed.
  • additional components are added to accumulate in the second substep of step 1 10, e.g. As detergents, such as. As saponins, SDS or the like, chaotropic salts or basic components, such as. B. NaOH.
  • As detergents such as. As saponins, SDS or the like
  • chaotropic salts or basic components, such as. B. NaOH.
  • the target cells are preceded by the
  • wash down with the lysis buffer from the filter 240 e.g. B. by a buffer, z. B. an aqueous buffer, is flushed in the opposite direction through the filter 240.
  • the filter 240 will retransmit the target cells to the filter 240 in step 120 of digestion.
  • the lysis buffer may be set so that released target cell nucleic acids directly bind to the filter 240 in step 120 of digestion.
  • a binding buffer may be placed on the filter 240 without displacing the lysis buffer from the filter 240. The mixing of lysis buffer and binding buffer in the filter 240 then takes place diffusively.
  • Digesting the digested lysate also heated or sonicated. A thermal load or caused by the ultrasound
  • step 120 of digestion the target cells are lysed. This creates a second lysate.
  • the lysis or digestion is carried out by adding the
  • Lysis buffer from the lysis buffer storage chamber 260 on the filter 240.
  • This lysis buffer can, for. B. contain enzymes, for. As proteinase K, proteases and Lysozyme. These enzymes cause destruction of the cell wall of the target cells and thus release of the target cell nucleic acids.
  • the cell wall of the target cells can also be destroyed in other ways, eg. B. by the addition of chemical reagents, eg. As chaotropic salts, detergents such. As saponins, SDS or the like, ß-mercaptoethanol or basic
  • the target cell nucleic acids are purified from the second lysate, e.g. B. by adsorption on a solid phase.
  • step 130 of purification is followed by analysis of the target cell nucleic acids.
  • the purpose of this analysis may be z. B. be to detect a presence of certain pathogens and resistance genes.
  • the target cell nucleic acids are first selectively amplified, z. B. by means of a PCR.
  • the addition of a PCR the addition of a PCR
  • the PCR master mix typically contains a buffer solution, nucleotides, polymerase, primers, magnesium chloride and optionally bovine serum albumin (BSA). Thereafter, z. B. a detection of the amplified target cell nucleic acids by hybridization on a microarray.
  • BSA bovine serum albumin
  • the method 100 can be particularly defined and reproducibly performed in a microfluidic system, since the temperatures, the volumes and, when performing the method in
  • the flow rates can be set very precisely. Furthermore, a risk of contamination of the sample from the outside or the environment by the sample can be minimized, as the method 100 in the
  • Device 200 is performed as a closed system.
  • FIG. 6 shows a device 200 for processing a target cell
  • a sample chamber is shown by the device 200 210, a filter 240, a lysate and wash buffer collection chamber 250, a lysis buffer storage chamber 260, a collection eluate chamber 270, by way of example only, three membranes 620
  • a separation filter a filtrate lysis chamber 630, a binding buffer reservoir 662, a wash buffer reservoir 664, and a
  • Elution buffer storage chamber 666 the device 200 is designed as a microfluidic system or part of a microfluidic system. The processing is done using only three examples
  • Membranes 620 for triple filtration of the sample.
  • the sample chamber 210 is connected to the lysis chamber 630 via a fluid connection via the three membranes 620.
  • the lysis buffer storage chamber 260 and the binding buffer storage chamber 662 are connected to the lysis chamber 630 by fluid communication.
  • the filter 240 is disposed between the lysis chamber 630 on the one hand and the lysate and wash buffer collection chamber 250 and the eluate collection chamber 270 on the other hand.
  • the lysis chamber 630 is in this case arranged between the membranes 620 on the one hand and the filter 240 on the other hand.
  • the wash buffer reservoir 664 and the elution buffer reservoir 666 are fluidly connected to fluid communication between the lysis chamber 630 and the filter 240. Operation of the device 200 will be discussed below.
  • FIG. 7 shows a device 200 for processing a target cell
  • FIG. 7 corresponds to the device of FIG. 6, with the exception that only one diaphragm 620 is provided and additionally a return line 725 is arranged between the lysis chamber 630 and the sample chamber 210.
  • the return line 725 is used to pump the sample repeatedly in a circle across the membrane 620. This has the advantage that only one membrane 620 is needed. Operation of the device 200 will be discussed below.
  • FIG. 8 shows a device 200 for processing a target cell and
  • the apparatus 200 in FIG. 8 corresponds to the apparatus of FIG. 7, except that in addition a plurality of microvalves 890 for
  • Liquid control, a pump 895 and a slightly different from the device of FIG. 7 interconnection of chambers are provided.
  • the sample is in this case pumped several times from the sample chamber 210 by means of the pump 895 via the membrane 620 into the lysis chamber 630 and then back into the sample chamber 2. Lysis or digestion takes place in the
  • FIG. 9 shows a device 200 for processing a target cell
  • FIG. 9 Biological material sample containing accompanying cells for extracting nucleic acids of the target cells according to an embodiment of the present invention.
  • the apparatus 200 in FIG. 9 corresponds to the apparatus of FIG. 7, except that in addition a waste chamber 950 has another
  • Wash buffer storage chamber 964 are shown. The further wash buffer
  • Reservoir 964 is fluidly connected to fluid communication between sample chamber 210 and membrane 620.
  • the waste chamber 950 is fluidly connected to fluid communication between the membrane 620 and the lysis chamber 630. In this case, after each filtration from the further washing buffer storage chamber 964, a washing buffer in the opposite direction over the
  • Membrane 620 pumped into the waste chamber 950.
  • the membrane 620 is thereby regenerated, d. H. the accumulated companion cells are washed away. Operation of the device 200 will be discussed below. 10 shows a device 200 for processing a target cell and
  • FIG. 10 Biological material sample containing accompanying cells for extracting nucleic acids of the target cells according to an embodiment of the present invention.
  • the apparatus 200 in FIG. 10 corresponds to the apparatus of FIG. 9 except that additional microvalves 890 and a pump 1095 with reversible pumping direction are shown.
  • additional microvalves 890 and a pump 1095 with reversible pumping direction are shown.
  • Such a configuration makes it possible to use the pump 1095, whose pumping direction is invertible, the membrane 620 between filtration steps to wash. Operation of the device 200 will be discussed below.
  • Fig. 1 1 shows a device 200 for processing a target cells
  • the device 200 is similar to the device of FIG. 4 or FIG. 8 or FIG. 10, wherein in FIG. 11 the device 200 in an embodiment as a multilayer structure is shown in a sectional view. In this case, the device 200 shows the microchannel 315 as the supply channel, the first one
  • the membrane 620 is arranged between the microchannel 315 and the discharge channel 11.5.
  • the valve 890 has the web 1 191, the chamber 1 192, in which the intermediate layer 482 is deflectable, and the control channel 1 193.
  • the first structured polymer layer 481 has z. B. a thickness of 0.1 to 25 millimeters.
  • the intermediate layer 482 has z. B. on a thickness of 0.01 to 1 millimeter.
  • the second structured polymer layer 483 has z. B. a thickness of 0.1 to 25 millimeters.
  • the cover layer 484 has z. B. on a thickness of 0.01 to 1 millimeter.
  • Fig. 12 shows an apparatus 200 for processing a target cell and
  • Biological material sample containing accompanying cells for extracting nucleic acids of the target cells according to an embodiment of the present invention.
  • the device 200 of the device of FIG. 1 1 with the exception that the device 200 in Fig. 12 instead of the membrane 620 a filter channel 1220 or micro-channel with post structures or posts to
  • Filtering the accompanying cells has.
  • FIG. 13 shows a section of the first structured polymer layer 481 of the device from FIG. 12. It can be seen that the filter channel 1220 or
  • Microchannel with post structures or posts 1325 in the first structured Polymer layer 481 is formed.
  • the post structures or posts 1325 have z. B. a cylindrical shape.
  • a width of the filter channel 1220 is between 100 micrometers and 10 millimeters, and typically 1 millimeter.
  • a length of the filter channel 1220 is between 1 millimeter and 25 millimeters, and typically 5 millimeters.
  • Filter channel 1220 is, for example, between 50 micrometers and 5 millimeters, and typically 500 micrometers.
  • a width of the individual posts 1325 is between 50 micrometers and 1 millimeter, and typically 200 micrometers.
  • a distance between the individual posts 1325 is, for example, between 5 microns and 20 microns, and typically at
  • Fig. 14 shows an apparatus 200 for processing a target cell
  • Biological material sample containing accompanying cells for extracting nucleic acids of the target cells according to an embodiment of the present invention. 12, except that the device 200 in FIG. 14 has a microsieve 1420 embodied in the second structured polymer layer 483 instead of the filter channel microchannel with post structures in the first patterned polymer layer 481.
  • the microsieve 1420 is configured to filter out the companion cells.
  • FIG. 15 shows a section of the second structured polymer layer 483 of the device from FIG. 14.
  • the discharge channel 1 1 15 and the microsieve 1420 are formed, which forms a
  • a diameter of the individual pores 1525 is, for example, between 5 microns and 25 microns and
  • step 1 10 of accumulating the sample in particular a
  • Blood sample with a volume between 100 microliter and 10 milliliters, over the Passed membrane 620 or the microstructures 1220 or 1420 and the resulting filtrate is collected.
  • a sieve-like membrane 620 is used for this purpose, for. B. with a thickness between 100 and 1000
  • the sample can z. B. by means of a pump 895, 1095 or by pumping by means of a syringe, a syringe pump, a peristaltic pump or a diaphragm pump or by applying an overpressure, z. Between 100 millibar and 2 bar, e.g. 500 millibar, be passed over the membrane 620. Alternatively, the sample can also be centrifugally displaced over the
  • Membrane 620 are routed. In step 1 10 of accumulation, the accompanying cells contained in the sample are retained by the membrane 620 or the microstructures 1220 or 1420 due to their size. Other
  • Components of the sample and the target cells because of their smaller size, can pass through the membrane 620 or the microstructures 1220 or 1420 and are contained in the filtrate.
  • step 120 of the digestion the cells contained in the filtrate, in particular the target cells, are disrupted or lysed.
  • This lysis buffer can, for. B. contain enzymes, for. As proteinase K, proteases and lysozyme. These enzymes cause destruction of the cell wall of the target cells and thus release of the target cell nucleic acids.
  • the cell wall of the target cells can also be destroyed in other ways, eg. B. by the addition of chemical reagents, eg. As chaotropic salts, detergents such. As saponins, SDS or the like or basic components such. B. NaOH.
  • chemical reagents eg. As chaotropic salts, detergents such. As saponins, SDS or the like or basic components such. B. NaOH.
  • lysate contains the target cell nucleic acids, eg. B. pathogenic DNA.
  • step 130 of the purification the target cell nucleic acids contained in the lysate are purified. This can be z. B. by adsorption on a solid
  • Phase, z. B. a filter, for. As a silica filter, or beads, z. As silica beads happen.
  • the following procedure is performed. There is a mixing of the lysate with a binding buffer, z. Ethanol, and rinsing the mixture through filter 240.
  • the binding buffer adjusts the chemical conditions so that the target cells
  • Nucleic acids adsorb on the filter 240. This is followed by rinsing a Wash buffer, z. An ethanol-containing wash buffer, via the filter 240. This results in cell debris and proteins from the filter 240
  • the purification step 130 is typically followed by further steps to analyze the target cell nucleic acids contained in the lysate.
  • the aim of these analyzes is z. B. to detect the presence of certain pathogens and resistance genes.
  • the target cell nucleic acids are first selectively amplified, z. B. by means of a polymerase
  • step 1 10 of accumulating the sample is rinsed across multiple membranes 620, e.g. B. two to five membranes
  • the multiple filtering increases the separation efficiency. This reduces the number of companion cells that are in the filtrate and thus the amount of companion cell nucleic acids.
  • step 1 10 of accumulating instead of using multiple membranes 620 for multiple filtration, the sample or filtrate is also rinsed several times over the same membrane 620, e.g. B. twice to five times.
  • This has the advantage that the structure is simplified and only one membrane 620 is needed.
  • step 1 10 of accumulating if only one membrane 620 is used for the multiple filtration, the membrane 620 is advantageously washed between filtration operations to remove the accumulated companion cells from the membrane 620.
  • This has the Advantage that a flow resistance of the membrane 620 increased by the accumulation of the accompanying cells on the membrane 620 is again reduced by the washing down of the accompanying cells between the filtration steps, so that the subsequent filtration can be carried out more easily and faster, ie at lower pressures and higher flow rates.
  • the washing can z. Example by flushing water or a buffer in the opposite direction through the filter 620.
  • the lysis is additionally or alternatively carried out by means of ultrasound. Ultrasonic pressure waves and cavitation cause the cell walls of the target cells to be destroyed particularly safely and quickly. If necessary, this can also be dispensed with the addition of a lysis buffer.
  • sieve-like microstructures 1325, 1525 are introduced into channels and / or chambers of the microfluidic system for step 1 10 of accumulation instead of membrane 620 or filter membrane.
  • the staggered posts 1325 may be between 5 and 50 micrometers in diameter, spaced at a distance between 5 and 15 picometers in the filter channel 1220.
  • Methods are molded directly in the bottom of a microfluidic channel or a chamber.
  • the method 100 is particularly defined and reproducible in a microfluidic system can be performed, since the type of flow of the membrane 620 or the microstructures 1220 and 1420, the flow rates and pressures can be accurately adjusted. Furthermore, a risk of contamination of the sample from the outside or the environment by the sample can be minimized, since the method 100 is performed in the device 200 as a closed system. Also, when performed in a microfluidic system, the process 100 can be automated, even if multiple filtration makes the setup complicated, many components are needed, and many operations are performed.

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Abstract

Es wird ein Verfahren (100) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen vorgeschlagen. Das Verfahren (100) weist einen Schritt (110) des Akkumulierens der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe auf. Auch weist das Verfahren(100) einen Schritt (120) des Aufschließens der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse auf, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren (100) einen Schritt (130) des Aufreinigens der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat auf, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.

Description

Beschreibung
Titel
Verfahren und Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum
Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine Vorrichtung zum
Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere das Gebiet mikrofluidischer Systeme,
beispielsweise für sogenannte Chiplabors bzw. Westentaschenlabors (Lab-On-A-
Chip).
In der molekularen Diagnostik besteht oftmals eine Notwendigkeit zum Nachweis von pathogener DNA oder RNA in einer Probe. Als pathogene DNA oder RNA wird die aus einem Pathogen, z. B. einem Virus oder einem Mikroorganismus, z. B. einem Bakterium oder Pilz, gewonnene DNA oder RNA bezeichnet. Unter der Probe wird insbesondere eine Blutprobe verstanden, jedoch können prinzipiell auch andere flüssige oder verflüssigte Patientenproben, z. B. Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ein ausgespülter Abstrich oder eine verflüssigte Gewebeprobe, gemeint sein, insbesondere wenn diese Blut oder Spuren von
Blut enthalten. Ein Krankheitsbild, bei dem dies relevant ist, ist z. B. eine Sepsis. Bei einer vermuteten Sepsis besteht beispielsweise Interesse, Pathogene aus Blut nachzuweisen sowie gegebenenfalls Resistenzen gegenüber bestimmten Antibiotika zu bestimmen. Aufgrund der Konzentrationsverhältnisse zwischen Pathogenen und Leukozyten, beispielsweise 10 bis 1000 pro Milliliter gegenüber
106 bis 107 pro Milliliter, befindet sich in diesem Fall ein sehr starker Hintergrund an humaner DNA in der Probe. Kommerziell verfügbare Verfahren zur selektiven Aufreinigung von pathogener DNA z.B. aus Blut setzen beispielsweise chemische Reagenzien ein, um zunächst eine selektive Lyse von humanen Zellen zu erreichen. Anschließend werden die humanen Nukleinsäuren enzymatisch verdaut. Pathogene werden im Anschluss beispielsweise durch Zentrifugation und Dekantieren des Überstands isoliert. Ein derartiges Verfahren wird beispielsweise in der DE102005009479A1 offenbart.
Die US 2010/0285578 A1 offenbart Vorrichtungen und Verfahren zum Gewinnen von Nukleinsäuren aus biologischen Proben.
Offenbarung der Erfindung
Vor diesem Hintergrund werden ein verbessertes Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen und eine verbesserte Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß den Hauptansprüchen vorgestellt. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den jeweiligen Unteransprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.
Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann eine Aufbereitung einer biologischen Probe insbesondere zur selektiven Gewinnung pathogener Nukleinsäuren aus einer Probe realisiert werden, die auch nicht-pathogene Nukleinsäuren enthält, beispielsweise aus Blutzellen. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel hierbei ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe und/oder ein Konzept zur Aufbereitung einer Probe mittels einer Membran, Mikrokanalstruktur oder dergleichen. So ist insbesondere eine Kombination einer thermischen Vorbehandlung, bei der Begleitzellen selektiv lysiert werden, mit einem enzymatischen Verdau sowie einer Abtrennung mittels Filtration vorgesehen mit dem Ziel, aus einer auch Begleitzellen enthaltenden Probe aufgereinigte Zielzellen-Nukleinsäuren zu erhalten. Hierbei ist beispielsweise eine Abtrennung von Leukozyten, z. B. mit humaner DNA, aus einer Blutprobe denkbar, die auf das Vorhandensein von Pathogenen untersucht werden soll. Insbesondere sind Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft in Systemen oder Laborroutinen, die in der molekularen Diagnostik verwendet werden, bzw. für mikrofluidische Lab-on-Chip-Systeme zur molekularen
Diagnostik einsetzbar.
Vorteilhafterweise ermöglichen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in einer Probe enthaltene Zielzellen-Nukleinsäuren, z. B. pathogene DNA, von einem Hintergrund an Begleitzellen-Nukleinsäuren, z. B. humaner DNA, zuverlässig abzutrennen. Dadurch wird vermieden, dass die Begleitzellen- Nukleinsäuren nachfolgende Amplifikations- und Detektionsschritte stört, und eine Sensitivität einer Detektion bzw. Diagnostik wird somit verbessert. Bei einer thermischen Vorbehandlung einer Probe kann durch insbesondere
enzymatischen Verdau zuverlässig vermieden werden, dass die Probe geliert, was beispielsweise eintreten würde, wenn eine Temperatur zu hoch ist und/oder eine Zeitdauer der Vorbehandlung zu lang ist. Hierbei kann das Gelieren der
Probe auch im Hinblick darauf vermieden werden, dass eine bezüglich des Gelierens kritische Temperatur und Zeitdauer auch von Eigenschaften der Probe wie z. B. dem Hämatokrit abhängt. Durch einen beispielsweise enzymatischen Verdau kann vermieden werden, dass die Probe einen Filter verstopft. Dadurch ist es möglich, auch große Probenmengen zu verarbeiten. Eine Filtration ermöglicht es hierbei, nur wenige Pathogene, z. B. 10 bis 1000, aus einem relativ großen Blutvolumen, z. B. 1 bis 10 Milliliter, zu akkumulieren. Dadurch kann eine effektive Konzentration von Zielzellen-Nukleinsäuren erhöht und eine
nachfolgende Amplikation und Detektion erleichtert werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind besonders gut geeignet zur Automatisierung, insbesondere in einem mikrofluidischen System. Hierbei kann eine Durchführung erleichtert und eine Gefahr von Kontaminationen herabgesetzt werden.
Es kann gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung eine
zuverlässige Isolierung und Aufkonzentration von Zielzellen-Nukleinsäuren aus einer Probe erreicht werden. Dadurch kann eine Effizienz nachfolgender Amplifikations- und/oder Detektionsschritte verbessert werden. Eine
erfindungsgemäße Abtrennung der Begleitzellen bietet gegenüber einer chemischen selektiven Lyse der Begleitzellen den Vorteil, dass eine Anzahl benötigter Reagenzien und Arbeitsschritte minimiert werden kann. Dadurch kann auch eine zur Probenaufbereitung benötigte Zeit verkürzt werden. Ferner besteht hinsichtlich der Aufreinigung von Zielzellen-Nukleinsäuren ein Vorteil dahin gehend, dass Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf einfache Weise in ein mikrofluidisches System, z. B. ein Lab-on-Chip-System (LOC) zur molekularen Diagnostik, integriert werden können. Auch kann eine erreichbare Separationseffizienz von Zielzellen-Nukleinsäuren bezüglich Begleitzellen- Nukleinsäuren erhöht werden und kann eine Anzahl benötigter Filter bzw.
Membranen minimiert werden. Die Filtration kann insbesondere auf
Unterschieden typischer Zellgrößen beruhen und ist daher universell einsetzbar. Es ist daher keine Anpassung an spezifische Zielzellen erforderlich, wie es beispielsweise bei Antikörper-basierten Verfahren der Fall ist.
Ein Verfahren zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Schritte auf:
Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe;
Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und
Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
Die Zielzellen können pathogene Zellen bzw. Pathogene, z. B. Viren oder Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien oder Pilze, umfassen, die DNA und/oder RNA als Nukleinsäuren aufweisen. Der Einfachheit halber wird im Folgenden häufig von Nukleinsäuren gesprochen, wobei damit DNA und/oder RNA gemeint ist. Die Begleitzellen können menschliche Zellen, beispielsweise Blutzellen oder dergleichen umfassen. Unter der Probe kann insbesondere eine Blutprobe verstanden werden, oder es können auch andere flüssige oder verflüssigte Patientenproben, z. B. Urin, Stuhl, Sputum, Liquor, Lavage, ausgespülte Abstriche oder verflüssigte Gewebeproben, verstanden werden, insbesondere wenn diese Blut oder Spuren von Blut enthalten. Im Schritt des Aufreinigens können die in dem Zielzellen-Lysat enthaltenen Nukleinsäuren aufgereinigt und einer nachfolgenden Analyse zugeführt werden, durch die ein Vorhandensein bestimmter Pathogene oder Gene, z. B. Resistenzgene, überprüft werden kann. Diese nachfolgende Analyse kann z. B. durch Sequenzierung, Polymerase- Kettenreaktion (PCR, Polymerase chain reaction), Echtzeit-PCR bzw. Real-Time- PCR und/oder Detektion bzw. Hybridisierung auf einem Microarray erfolgen.
Das Aufreinigen der Zielzellen-Nukleinsäuren aus der Probe kann nach dem Aufschließen bzw. Lysieren der Zielzellen durch anschließende Adsorption der Zielzellen-Nukleinsäuren an einer festen Phase, z. B. einem Silikafilter oder Mikropartikeln bzw. sogenannten Beads, erfolgen. Neben chemischen und enzymatischen Methoden zur Lyse gibt es dabei auch mechanische Methoden, z. B. mittels Ultraschall oder Mikrokügelchen bzw. Beads. Ziel des Aufreinigens ist es, die Zielzellen-Nukleinsäuren in aufkonzentrierter Form einer
darauffolgenden Amplifikation und/oder Detektion zur Verfügung zu stellen. Auch bei einem Abtrennen der Zielzellen-Nukleinsäuren von Zelltrümmern und
Proteinen können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhaft zum Einsatz kommen. Insbesondere Humanblutproben können jedoch zusätzlich große Mengen an Begleitzellen mit humaner DNA enthalten. Eine Möglichkeit zur Abtrennung der Zielzellen von den Begleitzellen kann darin bestehen, zunächst die Begleitzellen, z. B. Blutzellen, die in der Probe enthalten sind, selektiv aufzuschließen bzw. zu lysieren und von den Zielzellen abzutrennen. Im
Anschluss können die Zielzellen lysiert werden und können die Zielzellen- Nukleinsäuren aufgereinigt werden. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglichen es, die Zielzellen-Nukleinsäuren vom in der Probe vorhandenen Hintergrund an Begleitzellen-Nukleinsäuren abzutrennen. Diese
Begleitzellen-Nukleinsäuren würden ansonsten eine nachfolgende Amplifikation und Analyse der Zielzellen-Nukleinsäuren stören und es unter Umständen schwierig bis unmöglich machen, das Vorhandensein der Zielzellen zu detektieren. Somit kann verhindert werden, dass die Begleitzellen-Nukleinsäuren in einer nachfolgenden Amplifikation und Analyse zur Bildung von
unerwünschten Nebenprodukten und einer Herabsetzung der Sensitivität führen.
Bei einem entsprechenden Verfahren kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum
Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen und einen Teilschritt des
Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration aufweisen. Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum
Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen, einen Teilschritt des Lysierens der im Teilschritt des Temperierens vorgeschädigten Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des Verdaus von aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren durch Enzyme und einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration aufweisen. Dabei kann die
Lysetemperatur geeignet ausgewählt sein, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen zerstört oder vorgeschädigt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen intakt bleiben. Im Teilschritt des Abtrennens können die Zielzellen mittels eines Akkumulationsfilters zurückgehalten werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Akkumulation der Zielzellen erreicht werden kann. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund des Lysierens kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden.
Dabei kann der Teilschritt des chemischen oder enzymatischen Lysierens und des enzymatischen Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des
Temperierens ausgeführt werden. Hierdurch kann im Teilschritt des Lysierens eine Viskosität der Probe gesenkt werden. Dabei können im Teilschritt des Lysierens und des Verdaus insbesondere temperaturbeständige Enzyme verwendet werden, z.B. Nukleasen, Proteinasen oder Lysozym. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass dadurch bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden werden kann.
Alternativ können im Schritt des Akkumulierens mittels zumindest einmaliger Filtration die Begleitzellen von der Probe abgetrennt werden. Dabei können die
Begleitzellen mittels einer Abtrenneinrichtung zurückgehalten werden, die einen Filter, eine Membran, Mikrostrukturen oder dergleichen aufweisen kann. Die Abtrennung erfolgt hier aufgrund der unterschiedlichen Größe von Ziel- und Begleitzellen, d.h. die Begleitzellen werden zurückgehalten, sofern sie größer als die Zielzellen sind. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die
Begleitzellen frühzeitig im Verfahren aus der Probe entfernt werden können. Dabei kann im Schritt des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der
Begleitzellen über mehrere in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen gespült werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch die mehrfache Filtration eine Abtrennungseffizienz noch vergrößert werden kann.
Dadurch kann die Zahl der Begleitzellen, die sich im Filtrat befinden, und somit die Menge der unerwünschten Nukleinsäuren weiter verringert werden.
Auch kann im Schritt des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Zielzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült werden. Die Zielzellen werden hierbei aufgrund ihrer Größe auf dem Filter zurückgehalten. Insbesondere können die Zielzellen hierdurch von im Teilschritt des Lysierens lysierten oder vorgeschädigten Begleitzellen abgetrennt werden. Hierbei kann die
Abtrenneinrichtung zwischen Spülvorgängen von den Begleitzellen gereinigt werden. Das Reinigen kann erfolgen, indem Wasser oder ein Puffer in bezüglich einer Filtrationsrichtung umgekehrter Richtung über die Abtrenneinrichtung gespült wird. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein Aufbau vereinfacht wird und nur eine Abtrenneinrichtung benötigt wird. Durch das Reinigen bzw. Waschen der Abtrenneinrichtung, wobei die Begleitzellen von der Abtrenneinrichtung entfernt werden können, kann ein Flusswiderstand an der
Abtrenneinrichtung herabgesetzt werden, sodass eine nachfolgende Filtration einfacher und schneller, d. h. bei niedrigeren Drücken und höheren Flussraten, durchgeführt werden kann. Ferner kann dadurch auch verhindert werden, dass sich Begleitzellen von der Abtrenneinrichtung lösen und ins Filtrat gelangen. Somit wird die erreichbare Abtrennungseffizienz erhöht.
Gemäß einer Ausführungsform kann der Schritt des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe aufweisen. Hierbei kann die Probe mit Wasser oder einem wässrigen Puffer verdünnt werden. Eine solche
Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine Viskosität der Probe herabgesetzt wird, womit eine Verarbeitbarkeit der Probe verbessert wird. Weist der Schritt des Akkumulierens den Teilschritt des Temperierens der Probe auf, so kann der Teilschritt des Verdünnens vor oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt werden. Auf diese Weise kann einerseits ein Gelieren während der thermischen Behandlung noch zuverlässiger vermieden werden oder können andererseits durch osmotischen Schock auch Begleitzellen, die während der thermischen Behandlung vorgeschädigt wurden, effektiv weiter lysiert werden.
Insbesondere können im Schritt des Aufschließens der Zielzellen die Zielzellen mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ mittels
Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen werden. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass weniger Reagenzien benötigt werden, z.B. kann ein zusätzlicher Lysepuffer für das Aufschließen der Zielzellen eingespart werden. Durch Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.
Eine Vorrichtung zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen weist folgende Merkmale auf: eine Einrichtung zum Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe; eine Einrichtung zum Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und eine Einrichtung zum Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
Die vorstehend genannte Vorrichtung zum Aufbereiten kann in Verbindung mit einer Ausführungsform des Verfahrens zum Aufbereiten vorteilhaft eingesetzt bzw. verwendet werden, um eine Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials aufzubereiten, um Nukleinsäuren der Zielzellen extrahieren zu können. Die Vorrichtung ist ausgebildet, um die Schritte des Verfahrens zum Aufbereiten in entsprechenden Einrichtungen durchzuführen bzw. umzusetzen. Auch durch diese Ausführungsvariante der Erfindung in Form einer Vorrichtung kann die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe schnell und effizient gelöst werden. Die Vorrichtung kann als ein mikrofluidisches System ausgeformt sein, insbesondere für ein sogenanntes Chiplabor bzw.
Westentaschenlabor bzw. Lab-On-A-Chip. Bei einer entsprechenden Vorrichtung kann die Einrichtung zum Akkumulieren Temperiermittel zum Temperieren der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen aufweisen.
Gemäß einer Ausführungsform kann die Einrichtung zum Akkumulieren
Temperiermittel zum Temperieren der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen, eine Vorratskammer für eine Pufferlösung zum Lysieren der im Schritt des Temperierens aufgeschlossenen oder vorgeschädigten Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und einen Akkumulationsfilter zum Abtrennen der Zielzellen von der Probe aufweisen. Hierbei können die Temperiermittel eine Heizeinrichtung oder eine Heizeinrichtung sowie eine Kühleinrichtung aufweisen. Auch können die
Temperiermittel ausgebildet sein, um zu heizen und/oder zu kühlen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass eine besonders effektive und zuverlässige Selektion der Zielzellen erreicht wird. Dabei kann die thermische Behandlung aufgrund unterschiedlicher Zellwandbeschaffenheit gezielt eingesetzt werden. Aufgrund der Lyse kann ein Verstopfen bei der Filtration verhindert werden. Insbesondere kann durch die Temperiermittel die
Selektionstemperatur genau eingestellt werden. Wenn die Temperiermittel auch eine Kühleinrichtung aufweisen, kann die Probe vor der Lyse auf ein zweites definiertes Temperaturniveau, z. B. Raumtemperatur, gebracht werden, sodass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und auch eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann.
Dabei können die Temperiermittel mit einer Probenkammer oder einem zwischen einer Probenkammer und einer Aufschlusskammer angeordneten Probenkanal thermisch gekoppelt sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die thermische Behandlung der Probe anwendungsabhängig auf stationäre
Weise oder in einem Durchflussprinzip erfolgen kann.
Zudem kann der Akkumulationsfilter der Einrichtung zum Akkumulieren auch durch die Einrichtung zum Aufschließen und zusätzlich oder alternativ die Einrichtung zum Aufreinigen nutzbar sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird, wenn die Zielzellen auf dem Akkumulationsfilter lysiert werden und der Akkumulationsfilter auch zur DNA- Aufreinigung genutzt wird. Um dies zu realisieren, kann ein zum Aufschließen verwendeter Lysepuffer so eingestellt sein, dass beim Aufschluss freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Akkumulationsfilter binden. Alternativ kann im Anschluss an den Aufschluss ein Bindepuffer auf den
Akkumulationsfilter gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom
Akkumulationsfilter zu verdrängen. Eine Mischung von Lysepuffer und
Bindepuffer im Akkumulationsfilter kann hierbei diffusiv erfolgen. Alternativ kann die Einrichtung zum Akkumulieren zumindest eine
Abtrenneinrichtung zum Abtrennen der Begleitzellen von der Probe aufweisen. Hierbei kann die zumindest eine Abtrenneinrichtung einen Abtrennfilter, eine Filtermembran, einen Filterkanal mit einer Mehrzahl von integrierten Säulen oder Pfosten und zusätzlich oder alternativ einen mit Filterporen versehenen Abschnitt aufweisen. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die
Begleitzellen frühzeitig im Verfahren zuverlässig aus der Probe entfernt werden können. Weist die zumindest eine Abtrenneinrichtung siebartige Mikrostrukturen auf, die in Kanälen und Kammern eines mikrofluidischen Systems ausgeformt sind und insbesondere im gleichen Herstellungsschritt wie andere Strukturen des mikrofluischen Systems herstellbar sind, vereinfacht sich so eine Fertigung der
Vorrichtung, da separate Schritte zur Integration einer separaten
Abtrenneinrichtung entfallen. Alternativ kann auch eine Membran mit einer definierten Porengröße mittels eines solchen Verfahrens direkt in einem Boden eines mikrofluidschen Kanals oder einer Kammer abgeformt sein.
Auch können die Abtrenneinrichtung und ein Rücklaufkanal zwischen einer Probenkammer und einer Aufschlusskammer parallel geschaltet sein. Hierbei kann auch eine Wascheinrichtung bzw. Spüleinrichtung zum Reinigen der Abtrenneinrichtung von herausgefilterten Begleitzellen vorgesehen sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass die Probe zum Abtrennen der
Begleitzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült werden kann, wodurch eine Abtrennungseffizienz erhöht werden kann. Die Einrichtung zum Reinigen der Abtrenneinrichtung erleichtert durch Senkung des Flusswiderstands an der Abtrenneinrichtung eine Durchführbarkeit der Abtrennung noch weiter. Ferner kann die Einrichtung zum Akkumulieren mehrere zwischen einer
Probenkammer und einer Aufschlusskammer in Reihe geschaltete
Abtrenneinrichtungen zum Abtrennen der Begleitzellen aufweisen. Dabei können die Abtrenneinrichtungen gleichartig oder verschiedenartig sein. Eine solche Ausführungsform bietet den Vorteil, dass durch die mehrfache Filtration eine Abtrennungseffizienz weiter vergrößert werden kann.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens zum Aufbereiten gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung; und
Figuren 2 bis 15 Vorrichtungen zum Aufbereiten gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung.
In der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung werden für die in den verschiedenen Figuren
dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente gleiche oder ähnliche
Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung dieser Elemente verzichtet wird.
Fig. 1 zeigt ein Ablaufdiagramm eines Verfahrens 100 zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren 100 zum Aufbereiten ist in
Verbindung mit einer Vorrichtung, wie der Vorrichtung zum Aufbereiten aus einer der Figuren 2 bis 15 vorteilhaft ausführbar. Das Verfahren 100 weist einen Schritt 1 10 des Akkumulierens der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe auf. Auch weist das Verfahren 100 einen Schritt 120 des Aufschließens der Zielzellen durch chemische und zusätzlich oder alternativ durch physikalische Lyse auf, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen. Ferner weist das Verfahren 100 einen Schritt 130 des Aufreinigens der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen- Lysat auf, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren. Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen der Begleitzellen, einen Teilschritt des Lysierens der Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des Verdaus der aus den
Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren durch Enzyme und einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration auf. Dabei wird gemäß einem Ausführungsbeispiel der Teilschritt des Lysierens und des Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt, wobei im Teilschritt des Lysierens und Verdaus eine Viskosität der Probe gesenkt wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden im Schritt 1 10 des Akkumulierens mittels zumindest einmaliger Filtration die Begleitzellen von der Probe abgetrennt.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Begleitzellen über mehrere in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen gespült. Alternativ wird gemäß einem Ausführungsbeispiel im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Begleitzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung gespült. Dabei wird die
Abtrenneinrichtung zwischen Spülvorgängen von den Begleitzellen gereinigt.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel weist der Schritt 1 10 des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe auf.
Im Schritt des Aufschließens 120 werden gemäß einem Ausführungsbeispiel die Zielzellen mittels eines Lysepuffers und zusätzlich oder alternativ mittels
Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen.
Fig. 2 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei eine Probenkammer 210, eine Temperiereinrichtung in Gestalt eines Heizers 220, eine Vorratskammer 230 für einen ersten Puffer, ein Filter 240, eine Abfallkammer 250, eine Lysepuffer-Vorratskammer 260 und eine
Sammelkammer 270.
Der Heizer 220 ist benachbart zu der Probenkammer 210 angeordnet. Dabei ist der Heizer 220 mit der Probenkammer 210 thermisch gekoppelt. Die
Vorratskammer 230 ist mit der Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung verbunden. Der Filter 240 ist zwischen der Probenkammer 210 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Hierbei ist die Probenkammer 210 mittels einer Fluidverbindung über den Filter 240 mit der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 verbunden. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mit einer Fluidverbindung zwischen der Probenkammer 210 und dem Filter 240 fluidleitfähig verbunden.
Die Probenkammer 210 weist eine z. B. mittels Stopfen, Deckel oder Klebefolie wieder verschließbare Öffnung zum Einbringen der Probe auf. Bei dem Heizer 220 handelt es sich beispielsweise um einen Peltier-Heizer oder Folienheizer. Die Abfallkammer 250 dient zur Aufnahme von Filtrat. Die Sammelkammer 270 dient zur Aufnahme von Lysat.
Somit zeigt Fig. 2 eine Topologie der Vorrichtung 100 bzw. eines
mikrofluidischen Systems, bei dem eine thermische Behandlung der Probe stationär in der Probenkammer 210 durchgeführt wird. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.
Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 2 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei die Probenkammer 210, der Heizer 220, die Vorratskammer 230 für den ersten Puffer, der Filter 240, die Abfallkammer 250, die Lysepuffer-Vorratskammer 260, die Sammelkammer 270, ein Mikrokanal 315 und ein Kühler 320.
Zwischen der Probenkammer 210 und der Vorratskammer 230 ist der Mikrokanal 315 angeordnet. Die Probenkammer 210 ist mittels einer Fluidverbindung über den Mikrokanal 315 mit der Vorratskammer 230 verbunden. Der Heizer 220 und der Kühler 320 bilden die Temperiereinrichtung. Dabei sind der Heizer 220 und der Kühler 320 benachbart zu dem Mikrokanal 315 angeordnet. Der Heizer 220 und der Kühler 320 sind mit dem Mikrokanal 315 thermisch gekoppelt. Die Vorratskammer 230 ist hierbei zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet. Der Filter 240 ist zwischen der Vorratskammer 230 einerseits und der Abfallkammer 250 sowie der Sammelkammer 270 andererseits angeordnet. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 ist mittels einer Fluidverbindung mit der Vorratskammer 230 verbunden.
Somit zeigt Fig. 3 eine Topologie der Vorrichtung 200 zur Durchführung einer thermischen Behandlung im Durchflussmodus. Dabei wird die Probe aus der Probenkammer 210 durch den temperierbaren Mikrokanal 315 in die
Vorratskammer 230 gepumpt, in der sich der erste Puffer befindet. Der temperierbare Mikrokanal 315 ist durch den Heizer 220 beheizbar und bei Bedarf durch den Kühler 320 kühlbar, z. B. einen Peltier-Kühler. Mittels des Kühlers 320 als zweitem thermisch aktivem Element ist die erwärmte Probe vor einerm Mischen mit dem ersten Puffer auf ein definiertes Temperaturniveau, z. B.
Raumtemperatur, temperierbar. Dies hat den Vorteil, dass eine Dauer der thermischen Vorbehandlung besonders genau eingestellt werden kann und somit eine Gelierung der Probe besonders sicher vermieden werden kann. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen.
Fig. 4 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 3 ähnlich, wobei in Fig. 4 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer Schnittansicht dargestellt ist, wobei die Kammern der Vorrichtung 200 in der Darstellung weggelassen sind. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der Mikrokanal 315, ein weiterer Mikrokanal 415, eine erste strukturierte Polymerschicht 481 , eine Polymerfolie 482, eine zweite strukturierte Polymerschicht 483 und eine polymere Deckelfolie 484.
Die strukturierten Polymerschichten 481 und 483 sind beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, z. B. PP, PC, PE, PS, COP, COC etc., ausgeformt. Die Polymerfolie 482 ist beispielsweise aus thermoplastischen Polymeren, thermoplastischen Elastomeren, Elastomeren oder dergleichen ausgeformt. Die Deckelfolie 484 weist beispielsweise eine thermoplastische Folie, Klebefolie oder dergleichen auf.
Der weitere Mikrokanal 415 erstreckt sich zwischen dem temperierbaren
Mikrokanal 315 und dem Filter 240. Die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483 und die polymere Deckelfolie 484 repräsentieren den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass sie kostengünstig herstellbar ist und mittels der Polymerfolie 482 auch aktive Elemente wie Ventile realisiert werden können. Weiterhin ist ein Vorteil dieses Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, dass der temperierbare Mikrokanal 315 lediglich durch die dünne Deckelfolie 484 vom Heizer 220 getrennt ist. Dadurch kann eine Temperatur in dem temperierbaren Mikrokanal 315 besonders genau eingestellt werden. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen.
Fig. 5 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 4 ähnlich. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Heizer 220, der Filter 240, der
Mikrokanal 315, die erste strukturierte Polymerschicht 481 , die polymere
Deckelfolie 484, ein weiterer Heizer 520, eine beheizbare Amplifikationskammer 570 und beispielhaft zwei Drehventile 590.
Dabei repräsentieren die erste strukturierte Polymerschicht 481 und die polymere Deckelfolie 484 den Mehrschichtaufbau der Vorrichtung 200 gemäß dem in Fig. 5 dargestellten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Ein erstes der
Drehventile 590 ist zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Filter 240 angeordnet und ausgebildet, um eine Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Ein zweites der Drehventile 590 ist zwischen dem Filter 240 und der Amplifikationskammer 570 angeordnet und ausgebildet, um eine
Fluidverbindung zwischen denselben freizugeben oder zu blockieren. Der weitere
Heizer 520 ist benachbart zu der Amplifikationskammer 570 angeordnet und mit derselben thermisch gekoppelt. Somit ist der Filter 240 zwischen den beiden Drehventilen 590 angeordnet.
Somit ist in Fig. 5 eine Ausführung der Vorrichtung 200 als Mehrschichtaufbau mit lediglich zwei Schichten gezeigt. Eine solche Ausführung hat den Vorteil, dass die Vorrichtung 200 besonders kostengünstig herstellbar ist. Eine
Steuerung der Flüssigkeiten erfolgt hier mittels der Drehventile 590. Weiterhin weist eine solche Ausführung die zusätzliche, mittels des weiteren Heizers 520 beheizbare Amplifikationskammer 570 auf, in der nach einer Aufreinigung der Zielzellen-Nukleinsäuren eine Amplifikation derselben mittels PCR durchgeführt werden kann.
Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 5 ein Konzept zur thermischen Vorbehandlung einer Probe unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß Ausführungsbeispielen der vorliegenden
Erfindung dargelegt.
Im Schritt 1 10 des Akkumulierens wird gemäß einem Ausführungsbeispiel in einem ersten Teilschritt die eigentliche thermische Vorbehandlung der Probe durchgeführt. Dabei erfolgt ein Erhitzen der Probe beispielsweise auf eine
Temperatur bzw. Lysetemperatur zwischen 60 und 90 Grad Celsius,
insbesondere zwischen 65 und 85 Grad Celsius. Die Temperatur ist dabei so abgestimmt, dass die in der Probe enthaltenen Begleitzellen, zum Beispiel Blutzellen wie Leukozyten, zerstört oder vorgeschädigt werden und die in den Begleitzellen enthaltenen Nukleinsäuren, also humane DNA, zumindest zum Teil freigesetzt werden, wobei die in der Probe enthaltenen Zielzellen, z. B.
Pathogene, intakt bleiben. Eine solche selektive Lyse der Begleitzellen ist möglich, da die Zielzellen als Pathogene eine robustere Zellwand besitzen und dadurch gegenüber thermischen Belastungen stabiler sind. Das Erhitzen der Probe kann z. B. stationär in einem der Probenkammer 210 oder im
Durchflussmodus in einer Kapillare, einem Schlauch oder einem Kanal wie dem Mikrokanal 315 erfolgen. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als erstes Lysat bezeichnet. Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem zweiten Teilschritt ein
Mischen des ersten Lysats mit einem ersten Puffer, der Enzyme, z. B. Proteasen, DNAsen und Lysozym, enthält, aus der Vorratskammer 230. Dieser erste Puffer bewirkt einen Verdau bzw. eine Zerkleinerung der im ersten Teilschritt entstandenen bzw. freigesetzten beschädigten Zellen, Zelltrümmer, Proteine und DNA-Stränge der Begleitzellen. Dieser Verdau ist essentiell für einen
nachfolgenden Teilschritt der Filtration, da eine Gelierung des ersten Lysats vermieden, die Viskosität des ersten Lysats herabgesetzt und somit ein
Verstopfen des Filters 240 verhindert wird. Auch ist in der Filtration eine
Abtrennung von noch intakten zellulären Bestandteilen des ersten Lysats einfacher möglich. Die in diesem Teilschritt entstehende Flüssigkeit wird als verdautes Lysat bezeichnet.
Im Schritt 1 10 des Akkumulierens erfolgt dann in einem dritten Teilschritt die Filtration, wobei das verdaute Lysat wird über den Filter 240, z. B. einen Steril-, Gewebe- oder Silikafilter, geleitet wird. Noch intakte zelluläre Bestandteile, insbesondere die Zielzellen, werden aufgrund ihrer Größe auf dem Filter 240 zurückgehalten und somit akkumuliert.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird vor dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren die Probe mit einem wässrigen Puffer verdünnt, z. B. in einem Verhältnis zwischen 10:1 und 1 :10. Dies hat den Vorteil, dass die
Viskosität der Probe herabgesetzt wird und ein Gelieren während der thermischen Behandlung noch zuverlässiger vermieden wird. Bei Bedarf kann die Verdünnung mit dem wässrigen Puffer auch nach dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren erfolgen. Dies hat den Vorteil, durch den hierdurch ausgelösten osmotischen Schock auch Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt nur vorgeschädigt wurden, effektiv lysiert werden.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden in dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren weitere Komponenten hinzugegeben, z. B. Detergenzien, wie z. B. Saponine, SDS oder dergleichen, chaotrope Salze oder basische Komponenten, wie z. B. NaOH. Dies hat den Vorteil, dass auch Begleitzellen, die in dem ersten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nur vorgeschädigt wurden, effizient lysiert werden und deren Nukleinsäuren freigesetzt werden. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der erste Teilschritt des Schrittes 1 10 zum Akkumulieren nach dem zweiten Teilschritt des Schrittes 1 10 zum
Akkumulieren ausgeführt. Dadurch wird bereits während der thermischen Vorbehandlung ein Gelieren der Probe zuverlässig vermieden. In diesem Fall werden temperaturbeständige Enzyme im ersten Puffer verwendet.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel werden die Zielzellen, anstatt dieselben im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 zu lysieren, vor dem
Vermischen mit dem Lysepuffer vom Filter 240 heruntergespült, z. B. indem ein Puffer, z. B. ein wässriger Puffer, in Gegenrichtung über den Filter 240 gespült wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird der Filter 240, falls die Zielzellen im Schritt 120 des Aufschließens auf dem Filter 240 lysiert werden,
vorteilhafterweise auch direkt im Schritt 130 des Aufreinigens genutzt. Dies hat den Vorteil, dass ein Filter eingespart wird. Um dies zu realisieren, kann der Lysepuffer so eingestellt sein, dass im Schritt 120 des Aufschließens freigesetzte Zielzellen-Nukleinsäuren direkt an den Filter 240 binden. Alternativ kann im Anschluss an den Schritt 120 des Aufschließens ein Bindepuffer auf den Filter 240 gegeben werden, ohne den Lysepuffer vom Filter 240 zu verdrängen. Das Mischen von Lysepuffer und Bindepuffer im Filter 240 erfolgt dann diffusiv.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird während des Schrittes 120 des
Aufschließens das verdaute Lysat auch erhitzt oder mit Ultraschall beaufschlagt. Eine thermische Belastung bzw. durch den Ultraschall hervorgerufene
Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass die Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden.
Ein möglicher weiterer Ablauf zum Aufbereiten der Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren der Nukleinsäuren der Zielzellen wird im Folgenden beschrieben.
Im Schritt 120 des Aufschließens werden die Zielzellen lysiert. Dabei entsteht ein zweites Lysat. Die Lyse bzw. der Aufschluss erfolgt durch Zugabe des
Lysepuffers aus der Lysepuffer-Vorratskammer 260 auf den Filter 240. Dieser Lysepuffer kann z. B. Enzyme enthalten, z. B. Proteinase K, Proteasen und Lysozym. Diese Enzyme bewirken eine Zerstörung der Zellwand der Zielzellen und somit eine Freisetzung der Zielzellen-Nukleinsäuren. Die Zellwand der Zielzellen kann auch auf andere Art und Weise zerstört werden, z. B. durch Zugabe von chemischen Reagenzien, z. B. chaotropen Salzen, Detergenzien wie z. B. Saponinen, SDS oder dergleichen, ß-Mercaptoethanol oder basischen
Komponenten wie z. B. NaOH.
Im Schritt 130 des Aufreinigens werden die Zielzellen-Nukleinsäuren aus dem zweiten Lysat heraus aufgereinigt, z. B. durch Adsorption an einer festen Phase.
Typischerweise schließt sich an den Schritt 130 des Aufreinigens eine Analyse der Zielzellen-Nukleinsäuren an. Ziel dieser Analyse kann es z. B. sein, ein Vorhandensein bestimmter Pathogene und Resistenzgene nachzuweisen.
Typischerweise werden hierzu zunächst die Zielzellen-Nukleinsäuren selektiv amplifiziert, z. B. mittels einer PCR. Bei der PCR wird durch Zugabe eines PCR-
Mastermix und durch wiederholtes Anfahren verschiedener Temperaturniveaus eine exponentielle Verstärkung der Nukleinsäuremenge erreicht. Der PCR- Mastermix enthält typischerweise eine Pufferlösung, Nukleotide, Polymerase, Primer, Magnesiumchlorid sowie gegebenenfalls Bovine Serum Albumin (BSA). Danach erfolgt z. B. eine Detektion der amplifizierten Zielzellen-Nukleinsäuren mittels Hybridisierung auf einem Microarray.
Vorteilhaft bei der Realisierung des Konzepts zum Aufbereiten in einem mikrofluidischen System unter Verwendung einer thermischen Vorbehandlung der Probe ist, dass das Verfahren 100 in einem mikrofluidischen System besonders definiert und reproduzierbar durchgeführt werden kann, da die Temperaturen, die Volumina und, bei Durchführung des Verfahrens im
Durchflussmodus, die Flussraten besonders genau eingestellt werden können. Ferner kann eine Gefahr einer Kontamination der Probe von außen bzw. der Umgebung durch die Probe minimiert werden, da das Verfahren 100 in der
Vorrichtung 200 als einem abgeschlossenen System durchgeführt wird.
Fig. 6 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden
Erfindung. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei eine Probenkammer 210, ein Filter 240, eine Abfallkammer bzw. Auffangkammer 250 für Lysat und Waschpuffer, eine Lysepuffer-Vorratskammer 260, eine Sammelkammer bzw. Eluat-Auffangkammer 270, lediglich beispielhaft drei Membranen 620 als
Abtrennfilter, eine Lysekammer 630 zum Auffangen von Filtrat, eine Bindepuffer- Vorratskammer 662, eine Waschpuffer-Vorratskammer 664 und eine
Elutionspuffer-Vorratskammer 666. Dabei ist die Vorrichtung 200 als ein mikrofluidisches System oder ein Teil eines mikrofluidischen Systems ausgeführt. Das Aufbereiten erfolgt unter Verwendung der lediglich beispielhaft drei
Membranen 620 zur dreifachen Filtration der Probe.
Zwischen der Probenkammer 210 und der Lysekammer 630 sind die drei Membranen 620 in Reihe angeordnet. Die Probenkammer 210 ist mittels einer Fluidverbindung über die drei Membranen 620 mit der Lysekammer 630 verbunden. Die Lysepuffer-Vorratskammer 260 und die Bindepuffer- Vorratskammer 662 sind mittels einer Fluidverbindung mit der Lysekammer 630 verbunden. Der Filter 240 ist zwischen der Lysekammer 630 einerseits und der Auffangkammer 250 für Lysat und Waschpuffer sowie der Eluat-Auffangkammer 270 andererseits angeordnet. Die Lysekammer 630 ist hierbei zwischen den Membranen 620 einerseits und dem Filter 240 andererseits angeordnet.
Die Waschpuffer-Vorratskammer 664 und die Elutionspuffer-Vorratskammer 666 sind fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Lysekammer 630 und dem Filter 240 verbunden. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.
Fig. 7 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die in Fig. 7 gezeigte Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 6 mit der Ausnahme, dass lediglich eine Membran 620 vorgesehen ist und zusätzlich eine Rückführungsleitung 725 zwischen der Lysekammer 630 und der Probenkammer 210 angeordnet ist. Hierbei wird die Rückführungsleitung 725 benutzt, um die Probe im Kreis wiederholt über die Membran 620 zu pumpen. Dies hat den Vorteil, dass nur eine Membran 620 benötigt wird. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen. Fig. 8 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 8 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 7 mit der Ausnahme, dass zusätzlich eine Mehrzahl von Mikroventilen 890 zur
Flüssigkeitssteuerung, eine Pumpe 895 und eine von der Vorrichtung aus Fig. 7 geringfügig abweichende Verschaltung von Kammern vorgesehen sind. Die Probe wird hierbei mehrfach von der Probenkammer 210 mittels der Pumpe 895 über die Membran 620 in die Lysekammer 630 und anschließend zurück in die Probenkammer 2 gepumpt. Eine Lyse bzw. ein Aufschluss erfolgt in der
Probenkammer 210 durch Hinzupumpen von Lysepuffer aus der Lysepuffer- Vorratskammer 260. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten detaillierter eingegangen. Fig. 9 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 9 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 7 mit der Ausnahme, dass zusätzlich eine Abfallkammer 950 eine weitere
Waschpuffer-Vorratskammer 964 gezeigt sind. Die weitere Waschpuffer-
Vorratskammer 964 ist fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Probenkammer 210 und der Membran 620 verbunden. Die Abfallkammer 950 ist fluidleitfähig mit einer Fluidverbindung zwischen der Membran 620 und der Lysekammer 630 verbunden. Hierbei wird nach jeder Filtration aus der weiteren Waschpuffer-Vorratskammer 964 ein Waschpuffer in Gegenrichtung über die
Membran 620 in die Abfallkammer 950 gepumpt. Die Membran 620 wird dadurch regeneriert, d. h. die akkumulierten Begleitzellen werden weggespült. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen. Fig. 10 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 in Fig. 10 entspricht der Vorrichtung aus Fig. 9 mit der Ausnahme, dass zusätzliche Mikroventile 890 und eine Pumpe 1095 mit umkehrbarer Pumprichtung gezeigt sind. Eine solche Konfiguration ermöglicht es, mittels der Pumpe 1095, deren Pumprichtung invertierbar ist, die Membran 620 zwischen Filtrationsschritten zu waschen. Auf einen Betrieb der Vorrichtung 200 wird weiter unten eingegangen.
Fig. 1 1 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Die Vorrichtung 200 ist der Vorrichtung aus Fig. 4 bzw. Fig. 8 bzw. Fig. 10 ähnlich, wobei in Fig. 1 1 die Vorrichtung 200 in einer Ausführung als Mehrschichtaufbau in einer Schnittansicht dargestellt ist. Gezeigt sind von der Vorrichtung 200 hierbei der Mikrokanal 315 als Zuführkanal, die erste
strukturierte Polymerschicht 481 , die Polymerfolie bzw. Zwischenschicht 482, die zweite strukturierte Polymerschicht 483, die polymere Deckelfolie bzw.
Deckelschicht 484, die Membran 620, eines der Ventile 890, ein Abführkanal 1 1 15, ein Steg 1 191 , eine Ventilkammer 1 192 und ein Steuerkanal 1 193.
Die Membran 620 ist zwischen dem Mikrokanal 315 und dem Abführkanal 1 1 15 angeordnet. Das Ventil 890 weist den Steg 1 191 , die Kammer 1 192, in welche die Zwischenschicht 482 auslenkbar ist, und den Steuerkanal 1 193 auf. Die erste strukturierte Polymerschicht 481 weist z. B. eine Dicke von 0,1 bis 25 Millimeter auf. Die Zwischenschicht 482 weist z. B. eine Dicke von 0,01 bis 1 Millimeter auf. Die zweite strukturierte Polymerschicht 483 weist z. B. eine Dicke von 0,1 bis 25 Millimeter auf. Die Deckelschicht 484 weist z. B. eine Dicke von 0,01 bis 1 Millimeter auf. Fig. 12 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 1 1 mit der Ausnahme, dass die Vorrichtung 200 in Fig. 12 anstelle der Membran 620 einen Filterkanal 1220 bzw. Mikrokanal mit Pfosten strukturen bzw. Pfosten zum
Abfiltern der Begleitzellen aufweist. Der Filterkanal 1220 z. B. in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ausgeführt.
Fig. 13 zeigt einen Ausschnitt der ersten strukturierten Polymerschicht 481 der Vorrichtung aus Fig. 12. Es ist erkennbar, dass der Filterkanal 1220 bzw.
Mikrokanal mit Pfostenstrukturen bzw. Pfosten 1325 in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ausgeformt ist. Die Pfostenstrukturen bzw. Pfosten 1325 weisen z. B. eine zylindrische Form auf. Eine Breite des Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 100 Mikrometer und 10 Millimeter und typischerweise bei 1 Millimeter. Eine Länge des Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 1 Millimeter und 25 Millimeter und typischerweise bei 5 Millimeter. Eine Tiefe des
Filterkanals 1220 liegt beispielsweise zwischen 50 Mikrometer und 5 Millimeter und typischerweise bei 500 Mikrometer. Eine Breite der einzelnen Pfosten 1325 liegt beispielsweise zwischen 50 Mikrometer und 1 Millimeter und typischerweise bei 200 Mikrometer. Ein Abstand zwischen den einzelnen Pfosten 1325 liegt beispielsweise zwischen 5 Mikrometer und 20 Mikrometer und typischerweise bei
10 Mikrometer.
Fig. 14 zeigt eine Vorrichtung 200 zum Aufbereiten einer Zielzellen und
Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von Nukleinsäuren der Zielzellen gemäß einem Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung. Dabei entspricht die Vorrichtung 200 der Vorrichtung aus Fig. 12 mit der Ausnahme, dass die Vorrichtung 200 in Fig. 14 anstelle des Filterkanals Mikrokanal mit Pfostenstrukturen bzw. Pfosten in der ersten strukturierten Polymerschicht 481 ein in der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 ausgeführtes Mikrosieb 1420 aufweist. Das Mikrosieb 1420 ist ausgebildet, um die Begleitzellen abzufiltern.
Fig. 15 zeigt einen Ausschnitt der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 der der Vorrichtung aus Fig. 14. In der zweiten strukturierten Polymerschicht 483 sind der Abführkanal 1 1 15 und das Mikrosieb 1420 ausgeformt, das eine
Mehrzahl von Poren 1525 aufweist. Ein Durchmesser der einzelnen Poren 1525 liegt beispielsweise zwischen 5 Mikrometer und 25 Mikrometer und
typischerweise bei 10 Mikrometer. Im Folgenden wird unter Bezugnahme insbesondere auf die Figuren 1 und 6 bis
15 ein Konzept zur Aufbereitung einer Probe mittels einer Membran unter Verwendung des Verfahrens 100 sowie der Vorrichtung 200 gemäß
Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung dargelegt. In dem Schritt 1 10 des Akkumulierens wird die Probe, insbesondere eine
Blutprobe mit einem Volumen zwischen 100 Mikroliter und 10 Milliliter, über die Membran 620 oder die Mikrostrukturen 1220 oder 1420 geleitet und das entstehende Filtrat wird aufgefangen. Beispielsweise wird hierzu eine siebartige Membran 620 verwendet, z. B. mit einer Dicke zwischen 100 und 1000
Mikrometer und einer Porengröße zwischen 5 und 15 Mikrometer, z. B. zwischen 7 und 10 Mikrometer. Die Probe kann z. B. mittels einer Pumpe 895, 1095 bzw. durch Pumpen mittels einer Spritze, einer Spritzenpumpe, einer peristaltischen Pumpe oder einer Membranpumpe oder durch Anlegen eines Überdrucks, z. B. zwischen 100 Millibar und 2 bar, z.B. 500 Millibar, über die Membran 620 geleitet werden. Alternativ kann die Probe auch durch Zentrifugalkräfte über die
Membran 620 geleitet werden. In dem Schritt 1 10 des Akkumulierens werden die in der Probe enthaltenen Begleitzellen aufgrund ihrer Größe von der Membran 620 bzw. den Mikrostrukturen 1220 oder 1420 zurückgehalten. Andere
Bestandteile der Probe und die Zielzellen können aufgrund ihrer kleineren Größe die Membran 620 bzw. die Mikrostrukturen 1220 oder 1420 passieren und sind im Filtrat enthalten.
Im Schritt 120 des Aufschließens werden die im Filtrat enthaltenen Zellen, insbesondere die Zielzellen, aufgeschlossen bzw. lysiert. Dies geschieht z. B. indem dem Filtrat ein Lysepuffer zugegeben wird. Dieser Lysepuffer kann z. B. Enzyme enthalten, z. B. Proteinase K, Proteasen und Lysozym. Diese Enzyme bewirken eine Zerstörung der Zellwand der Zielzellen und somit eine Freisetzung der Zielzellen-Nukleinsäuren. Die Zellwand der Zielzellen kann auch auf andere Art und Weise zerstört werden, z. B. durch Zugabe von chemischen Reagenzien, z. B. chaotropen Salzen, Detergenzien wie z. B. Saponinen, SDS oder dergleichen oder basischen Komponenten wie z. B. NaOH. Die in dem Schritt
120 des Aufschließens entstehende Flüssigkeit wird als Lysat bezeichnet und enthält die Zielzellen-Nukleinsäuren, z. B. pathogene DNA.
Im Schritt 130 des Aufreinigens werden die im Lysat enthaltene Zielzellen- Nukleinsäuren aufgereinigt. Dies kann z. B. durch Adsorption an einer festen
Phase, z. B. einem Filter, z. B. einem Silikafilter, oder Beads, z. B. Silikabeads, geschehen. Bei der Aufreinigung auf dem Filter 240 wird beispielsweise folgender Ablauf durchgeführt. Es erfolgt ein Mischen des Lysats mit einem Bindepuffer, z. B. Ethanol, und ein Spülen der Mischung über den Filter 240. Der Bindepuffer stellt die chemischen Bedingungen so ein, dass die Zielzellen-
Nukleinsäuren am Filter 240 adsorbieren. Danach erfolgt ein Spülen eines Waschpuffers, z. B. eines Ethanol enthaltenden Waschpuffers, über den Filter 240. Dies führt dazu, dass Zelltrümmer und Proteine vom Filter 240
heruntergespült werden. Die Zielzellen-Nukleinsäuren bleiben am Filter 240 adsorbiert. Bei Bedarf kann das Spülen mit dem Waschpuffer auch mehrmals wiederholt werden, was die Waschwirkung erhöht. Schließlich erfolgt ein Spülen eines Elutionspuffers, z. B. Wasser, über den Filter 240. Dabei werden die Zielzellen-Nukleinsäuren vom Filter 240 heruntergespült. Die Zielzellen- Nukleinsäuren stehen dann im Elutionspuffer in hoher Konzentration und
Reinheit zur Verfügung.
An den Schritt 130 des Aufreinigens schließen sich typischerweise weitere Schritte zur Analyse der im Lysat enthaltenen Zielzellen-Nukleinsäuren an. Ziel dieser Analysen ist es z. B., das Vorhandensein bestimmter Pathogene und Resistenzgene nachzuweisen. Typischerweise werden hierzu zunächst die Zielzellen-Nukleinsäuren selektiv amplifiziert, z. B. mittels einer Polymerase-
Kettenreaktion. Danach kann z. B. eine Detektion mittels Hybridisierung auf einem Microarray erfolgen.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens die Probe über mehrere Membranen 620 gespült, z. B. zwei bis fünf Membranen
620. Bei den einzelnen Spülvorgängen wird typischerweise eine
Abtrennungseffizienz von unter 80 Prozent, teilweise nur von 40 bis 50 Prozent, erreicht. Durch die mehrfache Filterung wird die Abtrennungseffizienz vergrößert. Dadurch wird die Zahl der Begleitzellen, die sich im Filtrat befinden, und somit die Menge der Begleitzellen-Nukleinsäuren verringert.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens, anstatt mehrere Membranen 620 für die mehrfache Filtration zu verwenden, die Probe bzw. das Filtrat auch mehrfach über dieselbe Membran 620 gespült, z. B. zweimal bis fünfmal. Dies hat den Vorteil, dass der Aufbau vereinfacht wird und nur eine Membran 620 benötigt wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 1 10 des Akkumulierens, falls nur eine Membran 620 für die mehrfache Filtration verwendet wird, die Membran 620 vorteilhafterweise zwischen Filtrationsvorgängen gewaschen, um die akkumulierten Begleitzellen von der Membran 620 zu entfernen. Dies hat den Vorteil, dass ein durch die Akkumulation der Begleitzellen auf der Membran 620 heraufgesetzter Flusswiderstand der Membran 620 durch das Herunterwaschen der Begleitzellen zwischen den Filtrationsschritten wieder herabgesetzt wird, sodass die nachfolgende Filtration einfacher und schneller, d. h. bei niedrigeren Drücken und höheren Flussraten, durchgeführt werden kann. Ferner vorteilhaft dabei ist, dass bei einer großen Menge von Begleitzellen auf der Membran 620 die Gefahr, dass sich Begleitzellen wieder von der Membran 620 lösen und ins Filtrat gelangen, reduziert wird. Hierdurch wird die erreichbare
Abtrennungseffizienz gesteigert. Durch Waschen des Filters 620 wird die Anzahl der Begleitzellen auf der Membran 620 verringert und somit die
Abtrennungseffizienz erhöht. Das Waschen kann z. B. geschehen, indem Wasser oder ein Puffer in Gegenrichtung über den Filter 620 gespült wird.
Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird im Schritt 120 des Aufschließens die Lyse zusätzlich oder alternativ mittels Ultraschall durchgeführt werden. Durch den Ultraschall hervorgerufene Druckwellen und Kavitation führen dazu, dass die Zellwände der Zielzellen besonders sicher und schnell zerstört werden. Bei Bedarf kann hierdurch auch auf die Zugabe eines Lysepuffers verzichtet werden. Gemäß einem Ausführungsbeispiel sind für den Schritt 1 10 des Akkumulierens anstelle der Membran 620 bzw. Filtermembran siebartige Mikrostrukturen 1325, 1525 in Kanäle und/oder Kammern des mikrofluidischen Systems eingebracht. Beispielsweise können das versetzt angeordnete Pfosten 1325 mit einem Durchmesser zwischen 5 und 50 Mikrometer sein, die mit einem Abstand zwischen 5 und 15 Picometer in dem Filterkanal 1220 angeordnet sind. Diese können beispielsweise durch ein Replikationsverfahren wie Heißprägen im gleichen Herstellungsschritt wie die übrigen Strukturen des mikrof luischen Systems hergestellt werden und vereinfachen so eine Fertigung, da separate Schritte zur Integration der Filtermembran 620 entfallen. Alternativ kann auch eine Membran mit der beschriebenen Porengröße mittels eines solchen
Verfahrens direkt im Boden eines mikrofluidschen Kanals oder einer Kammer abgeformt werden.
Vorteilhaft bei der Realisierung des Konzepts zum Aufbereiten in einem mikrofluidischen System unter Verwendung Membran ist, dass das Verfahren 100 in einem mikrofluidischen System besonders definiert und reproduzierbar durchgeführt werden kann, da die Art der Anströmung der Membran 620 bzw. der Mikrostrukturen 1220 und 1420, die Flussraten und Drücke genau eingestellt werden können. Ferner kann eine Gefahr einer Kontamination der Probe von außen bzw. der Umgebung durch die Probe minimiert werden, da das Verfahren 100 in der Vorrichtung 200 als einem abgeschlossenen System durchgeführt wird. Auch kann bei Durchführung in einem mikrofluidischen System das Verfahren 100 automatisiert durchgeführt werden, selbst wenn bei mehrfacher Filtration der Aufbau kompliziert ist, viele Komponenten benötigt werden und viele Arbeitsschritte durchgeführt werden.
Die beschriebenen und in den Figuren gezeigten Ausführungsbeispiele sind nur beispielhaft gewählt. Unterschiedliche Ausführungsbeispiele können vollständig oder in Bezug auf einzelne Merkmale miteinander kombiniert werden. Auch kann ein Ausführungsbeispiel durch Merkmale eines weiteren Ausführungsbeispiels ergänzt werden. Ferner können Verfahrensschritte wiederholt sowie in einer anderen als in der beschriebenen Reihenfolge ausgeführt werden.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren (100) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen
enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von
Nukleinsäuren der Zielzellen, wobei das Verfahren (100) folgende Schritte aufweist:
Akkumulieren (1 10) der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe;
Aufschließen (120) der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und
Aufreinigen (130) der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der Zielzellen zu extrahieren.
2. Verfahren (100) gemäß Anspruch 1 , bei dem der Schritt (1 10) des
Akkumulierens einen Teilschritt des Temperierens der Probe auf eine Lysetemperatur zum Aufschließen und Vorschädigen der Begleitzellen, einen Teilschritt des Lysierens von im Teilschritt des Temperierens vorgeschädigten Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und des enzymatischen Verdaus von aus den Begleitzellen freigesetzten Nukleinsäuren und einen Teilschritt des Abtrennens der Zielzellen von der Probe mittels Filtration aufweist.
3. Verfahren (100) gemäß Anspruch 2, bei dem der Teilschritt des Lysierens und Verdaus vor, während oder nach dem Teilschritt des Temperierens ausgeführt wird, wobei im Teilschritt des Lysierens eine Viskosität der Probe gesenkt wird. Verfahren (100) gemäß Anspruch 1 , bei dem im Schritt (1 10) des
Akkumulierens mittels zumindest einmaliger Filtration die Begleitzellen von der Probe abgetrennt werden.
Verfahren (100) gemäß einem der Ansprüche 1 oder 4, bei dem im Schritt (1 10) des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen der Begleitzellen über mehrere in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen (620; 1220, 1325; 1420, 1525) gespült wird.
Verfahren (100) gemäß einem der Ansprüche 1 , 4 oder 5, bei dem im Schritt (1 10) des Akkumulierens die Probe zum Abtrennen von lysierten
Begleitzellen mehrmals über eine Abtrenneinrichtung (620; 1220, 1325; 1420, 1525) gespült wird, wobei die Abtrenneinrichtung (620; 1220, 1325; 1420, 1525) zwischen Spülvorgängen von den Begleitzellen gereinigt wird.
Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem der Schritt (1 10) des Akkumulierens einen Teilschritt des Verdünnens der Probe aufweist.
Verfahren (100) gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche, bei dem im Schritt (120) des Aufschließens der Zielzellen die Zielzellen mittels eines Lysepuffers und/oder mittels Ultraschalleinkopplung aufgeschlossen werden.
Vorrichtung (200) zum Aufbereiten einer Zielzellen und Begleitzellen enthaltenden Probe biologischen Materials zum Extrahieren von
Nukleinsäuren der Zielzellen, wobei die Vorrichtung (200) folgende
Merkmale aufweist: eine Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620, 630; 725; 950, 964; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Akkumulieren der Zielzellen der Probe durch Abtrennen der Zielzellen oder der Begleitzellen aus der Probe; eine Einrichtung (240, 260; 630, 662) zum Aufschließen der Zielzellen durch chemische und/oder physikalische Lyse, um ein die Nukleinsäuren der Zielzellen enthaltendes Zielzellen-Lysat zu erzeugen; und eine Einrichtung (240, 250, 270; 520, 570; 664, 666) zum Aufreinigen der Nukleinsäuren aus dem Zielzellen-Lysat, um die Nukleinsäuren der
Zielzellen zu extrahieren. 10. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 9, bei der die Einrichtung (210, 220, 230,
240; 315, 320; 620, 630; 725; 950, 964; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Akkumulieren Temperiermittel (220; 320) zum Temperieren der Probe auf eine Selektionstemperatur zum Aufschließen oder Vorschädigen der Begleitzellen, eine Vorratskammer für eine Pufferlösung zum Lysieren von im Schritt des Temperierens aufgeschlossenen oder vorgeschädigten
Begleitzellen durch chemische oder enzymatische Lyse und einen
Akkumulationsfilter (240) zum Abtrennen der Zielzellen von der Probe aufweist. 1 1 . Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 10, bei der die Temperiermittel (220;
320) mit einer Probenkammer (210) oder einem zwischen einer
Probenkammer (210) und einer Aufschlusskammer (230) angeordneten Probenkanal (315) thermisch gekoppelt sind. 12. Vorrichtung (200) gemäß einem der Ansprüche 10 bis 1 1 , bei der der
Akkumulationsfilter (240) der Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620, 630; 725; 950, 964; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Akkumulieren auch durch die Einrichtung (240, 260; 630, 662) zum Aufschließen und/oder die
Einrichtung (240, 250, 270; 520, 570; 664, 666) zum Aufreinigen nutzbar ist.
13. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 9, bei der die Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620, 630; 725; 950, 964; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Akkumulieren zumindest eine Abtrenneinrichtung (620; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Abtrennen der Begleitzellen von der Probe aufweist, wobei die zumindest eine Abtrenneinrichtung (620; 1220, 1325; 1420, 1525) einen
Abtrennfilter, eine Filtermembran (620), einen Filterkanal (1220) mit einer Mehrzahl von integrierten Pfosten (1325) und/oder einen mit Filterporen (1525) versehenen Abschnitt (1420) aufweist. 14. Vorrichtung (200) gemäß Anspruch 13, bei der die Abtrenneinrichtung (620;
1220, 1325; 1420, 1525) und ein Rücklaufkanal (725) zwischen einer Probenkammer (210) und einer Aufschlusskammer (630) parallel geschaltet sind.
15. Vorrichtung (200) gemäß einem der Ansprüche 13 oder 14, bei der die
Einrichtung (210, 220, 230, 240; 315, 320; 620, 630; 725; 950, 964; 1220,
1325; 1420, 1525) zum Akkumulieren mehrere zwischen einer
Probenkammer (210) und einer Aufschlusskammer (630) in Reihe geschaltete Abtrenneinrichtungen (620; 1220, 1325; 1420, 1525) zum Abtrennen der Begleitzellen aufweist.
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