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WO2014154173A1 - 一种抗血管新生化合物 - Google Patents

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WO2014154173A1
WO2014154173A1 PCT/CN2014/074306 CN2014074306W WO2014154173A1 WO 2014154173 A1 WO2014154173 A1 WO 2014154173A1 CN 2014074306 W CN2014074306 W CN 2014074306W WO 2014154173 A1 WO2014154173 A1 WO 2014154173A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
fluorenyl
group
mmol
etoac
Prior art date
Application number
PCT/CN2014/074306
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English (en)
French (fr)
Inventor
侯睿
罗红蓉
Original Assignee
广州康睿生物医药科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 广州康睿生物医药科技有限公司 filed Critical 广州康睿生物医药科技有限公司
Publication of WO2014154173A1 publication Critical patent/WO2014154173A1/zh

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    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound and use.
  • Angiogenesis is the process of sprouting new blood vessels from existing blood vessels. This process is associated with vascular endothelial cell migration and proliferation. Angiogenesis is associated with a variety of major human diseases, such as malignant tumors. It has been found that ocular neovascular diseases, including age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, etc., are common features of these diseases in the abnormal proliferation of ocular neovascularization (Jin Xiao, et al. , Research progress in the application and mechanism of anti-VEGF drugs in ophthalmic diseases, Chinese and Foreign Medical, 2012).
  • AMD age-related macular degeneration
  • neovascular glaucoma etc.
  • macular degeneration is mainly dry and wet.
  • AMD wet macular degeneration
  • Wetness quickly loses sight and is more severe than dryness.
  • photodynamic therapy has improved the therapeutic effect, it is still not ideal.
  • Lucentis vascular endothelial factor antagonist
  • Lucentis is a recombinant of a human VEGF subtype monoclonal antibody fragment that reduces neovascularization.
  • the drug was approved by the US FDA for the treatment of wet macular degeneration, and its efficacy was good.
  • this type of anti-VEGF drug has therapeutic effects on diabetic retinopathy and neovascular glaucoma.
  • Lucentis is an antibody drug, the price is extremely high, and it cannot be popularized all over the world. Therefore, the study of small-molecule angiogenesis inhibitors with good efficacy and low cost is the focus of fierce competition in the international pharmaceutical industry today.
  • the present invention provides a compound of formula A and a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof:
  • r 7 is selected from hydrogen or dC 6 fluorenyl; ⁇ is selected from hydrogen or dC 6 fluorenyl; ⁇ . Selected from H, amino, hydroxy, decyl, dC 6 fluorenyl or
  • r 9 is selected from the group consisting of H, amino, hydroxy, decyl, (Cr u r 12 ) nNr 13 r 14 , (C_r u r 12 ) n0r 15 , (Cr u r 12 ) precedeC (0) Er 13
  • heterocyclic or substituted heterocyclic ring contains 1 or 2 heteroatoms selected from N, 0 or S, the substituents of which are 0, 1, or 2, each independently selected from an oxo group, C1-C6 ⁇ , C1-C6 halogenated fluorenyl, C1-C6 decyloxy, C1-C6 halodecyloxy, C 1-C 6 decanoyl, C1-C6 decylamino, C3-C7 cyclodecyl, halogen, Hydroxy, amino, carbonyl, aminocarbonyl, C1-C6 amidinocarbonyl, C1-C4 acyl, C1-C6 methoxycarbonyl, C1-C6 sulfonyl, aminos
  • Ar 2 is selected from phenyl, naphthyl, monocyclic or bicyclic heteroaryl, bicyclic or tricyclic heterocyclic groups wherein each heteroaryl or heterocyclic group has 1, 2, 3 or 4 selected from N a hetero atom of 0 or S; the phenyl, naphthyl, heteroaryl or heterocyclic group is an unsubstituted or substituted phenyl, naphthyl, heteroaryl or heterocyclic group having a substituent 1, 2, or 3, independently selected from C1-C8 fluorenyl, C1-C8 halogenated fluorenyl, hydroxy C1-C 6 fluorenyl, C1-C8 decyloxy, C1-C8 halogenated decyloxy , halogen, hydroxy, amino, amino C-C6 fluorenyl, C1-C6 decylamino, phenyl, C3-C 7 cyclodecyl, spiro C3-
  • ⁇ , r 12 and P r ls are the same or different and are each independently selected from hydrogen or C1-C4 fluorenyl; r 13 , r 14 , r 15 , r 16 and r 17 are independently selected from hydrogen, C1-C6 fluorenyl , a C1-C6 acyl group, a phenyl group and a heterocyclic ring, or a substituted C1-C6 fluorenyl group, a C1-C6 acyl group, a phenyl group and a heterocyclic ring having a substituent of 0, 1 or 2, each independently selected from C1- C4 decyloxy, C1-C4 fluorenyl, halogen, hydroxy, amino, C1-C6 amidoxime
  • Ri is selected from H, amino, hydroxy or decyl
  • R 3 is selected from H or C 1-6 fluorenyl
  • R 4 , R 5 , R 6 are each independently selected from H, halogen, C1-6 fluorenyl or halogen-substituted fluorenyl
  • R 7 is selected from H, C1-6 Sulfhydryl or halogen
  • R 2 and R 3 together with the carbon atom to which they are bonded form a substituted or unsubstituted five- or six-membered ring having from 1 to 2 heteroatoms, said hetero atom being N, 0 or S, the substituent of which is C1 -6 ⁇ base.
  • X and Y are different; selected from H or amino;
  • R 3 is selected from H or C 1-2 fluorenyl;
  • R 5 , Re are each independently selected from halogen, C 1-2 fluorenyl or halogen substituted fluorenyl;
  • R 7 is selected from H or halogen;
  • R 2 and R 3 together with the carbon atom to which they are bonded constitute a substituted or unsubstituted five- or six-membered ring containing one N, and the substituent is a fluorenyl group of C1-3.
  • R 2 is selected from an amino group or -(CH 2 ) n HR 8 ; or R 2 , a carbon atom to which it is bonded, constitutes a substituted or unsubstituted five- or six-membered ring containing one N, a substituent It is a thiol group of C1-3.
  • W3 is selected from C or a hetero atom, the hetero atom is preferably N; and R10 is a halogen.
  • halogen is F or Cl.
  • the compound is:
  • the present invention also provides the use of the above compound and a pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof for the preparation of an angiogenesis inhibitor.
  • angiogenesis inhibitor is a vascular endothelial growth factor receptor 2 inhibitor.
  • the inhibitor is a drug that is resistant to ocular angiogenesis.
  • the drug is a choroidal neovascularization inhibitor.
  • the medicament is a medicament for treating or preventing wet macular degeneration, diabetic retinopathy or neovascular glaucoma.
  • the invention also provides the use of the above compounds, and pharmaceutically acceptable salts or prodrugs thereof, in the manufacture of a VEGFR2, PDGFR-P or/and KIT inhibitor.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition which is an ophthalmic preparation containing the above compound and a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • other agents known to have similar therapeutic uses may be included in the formulation.
  • the ophthalmic preparation is an eye drop, an eye ointment or an ophthalmic injection.
  • Salts of the compounds of the invention can be prepared by methods known in the art. Treatment with an acid, or with a suitable anion exchanger, can form a salt with the above compounds.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound of the present invention may be an organic or inorganic acid addition salt having a basic nitrogen atom from the above compound.
  • suitable inorganic acids include, but are not limited to, hydrohalic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid.
  • suitable organic acids include, but are not limited to, carboxylic acids, phosphoric acids, sulfonic acids or aminocarboxylic acids such as acetic acid, propionic acid, caprylic acid, capric acid, dodecanoic acid, glycolic acid, lactic acid, fumaric acid, Succinic acid, adipic acid, pimelic acid, suberic acid, azelaic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, amino acid, such as glutamic acid or aspartic acid, maleic acid, hydroxy acid, methyl mala Acid, cyclohexyl carboxylic acid, adamant carboxylic acid, benzoic acid, salicylic acid, 4 aminosalicylic acid, phthalic acid, phenylacetic acid, mandelic acid, cinnamic acid, formazan or acetophenone sulfonic acid , 2 - hydroxyethanesulfonic acid, acetam-1,2-disulfonic
  • a pharmaceutically unacceptable salt such as picrate or perchlorate.
  • it can only be a pharmaceutically acceptable salt or free compound, in the form of a suitable pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutically acceptable prodrug of the present invention refers to a compound obtained by chemically modifying the compound to release an active ingredient by enzymatic or non-enzymatic conversion in vivo to exert a pharmacological effect.
  • the above-mentioned compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is also isotopically labeled, and the isotopically labeled compound means the same as the compound listed herein, but one or more of the atoms are Another atomic substitution, the atomic mass or mass of the atom is different from the atomic mass or mass number that is common in nature.
  • Isotopes which may be introduced into the compound include hydrogen, carbon, nitrogen, oxygen, sulfur, i.e., 2 H, 3 H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 0, 18 0, 35 S.
  • Compounds containing the above isotopes and I or other atomic isotopes and stereoisomers thereof, as well as pharmaceutically acceptable salts of the compounds, stereoisomers, are intended to be encompassed within the scope of the invention.
  • the key intermediates and compounds in the present invention are isolated and purified by the separation and purification methods commonly used in organic chemistry and examples of the methods include filtration, extraction, drying, spin drying, and various types of chromatography. Alternatively, the intermediate can be subjected to the next reaction without purification.
  • one or more compounds of the invention may be used in combination with one another.
  • the compounds of the invention may be used in combination with any other active agent for the preparation of a medicament or pharmaceutical composition for modulating cellular function or treating a disease. If a group of compounds is used, these compounds can be administered to the subject simultaneously, separately or sequentially.
  • the compounds of the present invention have a good anti-angiogenic effect, and it is preliminarily believed that such compounds are active by inhibiting VEGFR2 (i.e., KDR).
  • VEGFR2 i.e., KDR
  • Such compounds can be used for the treatment of diseases caused by abnormalities of protein kinases such as neovascularization and VEGFR2, such as wet macular degeneration, malignant tumors and the like.
  • Figure 3 is a graph of the results of the drug group, in which the zebrafish vascular development site is partially inhibited by the compound of the present invention.
  • Figure 4 is a graph of the results of the drug group, in which the zebrafish vascular development site is completely inhibited by the compound of the present invention.
  • Figure 5 Inhibition of VEGFR2 by the compound of the present invention in vitro
  • Fig. 6 Inhibition of choroidal neovascularization of the compound of the present invention KDR4, wherein: A: negative control, B: KDR4 Fig. 7 Inhibition of choroidal neovascularization of the compound V01 of the present invention, wherein: A: negative control, B: V01
  • FIG. 23 Effect of compound V01 on ocular neovascularization and hemorrhage in mice, A: right eye V01 treatment, B: left eye PBS control
  • Step 1 Mix Mic acid (75. 3 g, 0.522 mol) and triethyl orthoformate (92 mL, 0.55 mol), heat to 55 ° C for 90 minutes, then cool to 45 ° C.
  • PE thin layer chromatography
  • Step 2 Compound 2 (155. 9 g, 0.441 mol) was heated to 100 ° C in a Dowtherm A heat pipe (1 L) and then slowly added to the flask to which the Dowtherm A heat pipe was attached ( 500mL, preheated to 210 °C) while keeping the temperature above 207 ° C. The reaction was stirred at 210 ° C for one hour and then cooled to room temperature. The collected precipitate was filtered, washed with diethyl ether and acetone, and dried to give brown solid compound 3 (67 g, yield: 61%).
  • Step 9 Mixing the compound 9 (0.4 g, 2. llmmol), 3-trifluoromethyl aniline
  • step 1
  • step 1
  • step 1
  • step 1
  • NaOEt (2.38 g, 0.035 mol) was added to the mixture of the compound 37 (3.0 g, 0.01 mol) and formazan acetate (3.24 g, 0.03 mol) in ethanol (50 mL).
  • the reaction mixture was stirred at 90 ° C overnight and then evaporated to remove most of the solvent.
  • the residue was diluted with H20, acidified to pH 6 with 2N EtOAc, and then extracted with DCM. The organic phase was washed with EtOAc (EtOAc m.
  • Phosphorus oxychloride (P°C13, 174 mg, 1.26 mmol) was added to a DCM stirred with compound 30 (100 mg, 0.42 mmol) and N,N-dimethylaniline (0.28 mL) under nitrogen at 0 °C. (4 mL), after the addition was completed, the reaction mixture was poured into ice water, basified by the addition of solid sodium carbonate, and then extracted with DCM. The organic phase was washed with brine, dried N3 ⁇ 4S0 4 and concentrated to give the crude product, which was purified by preparative TLC to give the pure compound 31 (60 mg, 55.6%) , as a white solid.
  • Step 4 Compound 4 (1.1 g, 3.15 mmol), 4-methyl-5-(trifluoromethyl)benzene 1,2 -diamine (0.6 g, 3.15 mmol) and carbodiimide (1.2) Grams, 6.30 mmol) of THF (50 mL).
  • the reaction mixture was diluted with EA and the precipitate was filtered. The filtrate was evaporated to give a crude material, which was purified eluted from EtOAc (EtOAc: EtOAc (EtOAc)
  • Step 6 In a stirred solution of Compound 6 (60 mg, 0.1445 mmol per day) in DCM (5 mL), TEA (30) Mg, 0.289 mmol) Wo P MSCL (25 mg, 0.2168 mmol) under nitrogen at 0 °C. After the completion of the dropwise addition, the reaction was completed. The mixture was diluted with EtOAc EtOAc EtOAc m.
  • the fourth step 7-methoxyquinoline-4-carboxylic acid (2.0 g, 9.84 mmol) and DIPEA (3.82 g, 29.52 mmol) were dissolved in DMF. The reaction mixture was then cooled to 0 ° C and HATU (4.49 g, 11.81 mmol) and 3-(trifluoromethyl)aniline (1.74 g, 10.82 mmol). The mixture was covered with argon and then stirred at room temperature overnight. The mixture was diluted with water and extracted with EtOAc EtOAc. The organic layer was washed with EtOAc EtOAc (EtOAc m. Rate: 79.6%) is a pale yellow solid.
  • Step 7 tert-Butylmethyl((6-(4-(3-(trifluoromethyl)phenylcarbamoyl)quinolin-7-yloxy)pyrimidin-4-yl)methyl)carbamic acid
  • a mixture of butyl ester (25 mg, 0.045 mmol) and TFA (0.25 mL) was stirred at 0 ° C for half an hour.
  • Step 4 7-methoxyquinolin-4-carboxylic acid (406 mg, 2 mmol) and DIPEA (775 mg, 6 mmol) dissolved in In DMF (5mL).
  • Step 6 N-(4-Fluoro-3-(trifluoromethyl)phenyl)-7-hydroxyquinoline-4-carboxamide (30 mg, 0.086 mmol), tert-butyl (6-chloropyrimidine) -4-yl) tert-butyl methyl(methyl)carbamate (26.5 mg, 0.103 mmol) and PK 2 CO 3
  • Step 1 Heat a mixture of diethyl oxalate (70 ml) to 120 ° C, add compound 1 (50 g, 0.4 mol), and The mixture was heated to 180 ° C for 5 minutes. The mixture was refrigerated overnight, and a white solid was collected by filtration and dried to yield Compound 2 (75.0 g, yield: 59.11%).
  • Step 5 Add BBr 3 (10 mL, 4N in DCM) to a solution of compound 5 (0.4 g, 1.12 mmol) in EtOAc (10 mL). 1/1) The reaction was completed. Then, ice was added to the reaction, and the undissolved material was removed by filtration. The filtrate was separated and extracted with DCM. The organic phase was washed with brine, dried over Na 2SO 4 and concentrated to give a crude product. Purification, a pure compound of Compound 6 (100 mg, yield: 26.02%) was obtained from TLC.
  • EtOAc EtOAc
  • Step 1 Diethyl oxalate (70 ml) was heated to 120 ° C, compound 1 (50 g, 0.4 mol) was added, and the mixture was heated to 180 ° C for 5 minutes. After cooling, the mixture was placed in a refrigerator overnight, 50 ml of water was added, and a white precipitate formed. The solid was collected and dried to give 2 (75.0 g, yield: 59.11%) as a white powder.
  • Step 2 Compound 2 (25 g, 0.11 mol) was dissolved in boiling xylene (1 L). P2S5 (9.5 g, 0.0385 mol) was slowly added and refluxed until the reaction was completed (about 5 hours) and reflux was continued.
  • Step 6 To a solution of compound 6 (64 mg, 0.189 mmol) in DMF (10 ml), K2CO3 (78 mg, 0.567 mmol) and tert-butyl(6-chloropyrimidin-4-yl)methyl (methyl) tert-butyl (6-chloropyrimidin-4-yl)methyl (methyl) carbamate, 53 mg, 0.208 mmol.
  • the reaction mixture was washed with water and extracted with EtOAc.
  • the organic phase was washed with EtOAc (3 mL).
  • Step 1 A mixture of diethyl oxalate (70 ml) was heated to 120 ° C, compound 1 (50 g, 0.4 mol) was added, and the mixture was heated to 180 ° C for 5 minutes. The mixture was refrigerated overnight to form a white precipitate. The solid was collected by filtration and dried to give 2 (75.0 g, yield: 59.11%) of compound as a white powder.
  • the zebrafish (Daniorerio) is a teleost fish of the genus Danio (Cyprinidae).
  • the similarity between the gene and the human gene is as high as 85%, and the female can lay 200 to 300 eggs at a time.
  • the fertilization and embryo development process are carried out in vitro, and the formation can be formed within 24 hours, and the embryo is transparent and easy to observe. Changes in organ tissue. Many characteristics make it one of the five fish experimental animals recognized by the International Organization for Standardization. At present, zebrafish have been widely used in human disease research, and there are many studies on cardiovascular systems.
  • This experiment uses an zebrafish that is commonly used as a screening compound for the effects of angiogenesis as an animal model. After the birth, the zebrafish embryos are selected, placed in a culture dish and placed in an incubator for 3-5 days. The compound of the present invention is directly added to the zebrafish at different concentrations (1 ⁇ , 10 ⁇ , 30 ⁇ , ⁇ ) after birth. In the culture solution. The development of spinal vascular tubes was examined 24 hours later and photographed with a fluorescence microscope. 130B was Pazopanib, and as a positive control, DMS0 was used as a negative control.
  • test results are shown in Figures 1-4, Table la, lb.
  • AI vascular inhibition rate
  • the activity of the compound DKR4 is significantly better than that of KDR3, KDR6, KDR8 and KDR8A, and the activities of the compounds V01 and V03 are significantly better than those of KDR4.
  • the compounds KDR4, V01 and V3 of the present invention can inhibit VEGFR2, and the compounds V01 and V3 are better than KDR4.
  • Test Example 3 Inhibition of choroidal neovascularization by the compound of the present invention
  • the mouse was c57/BL and was experimentally performed using a laser-induced choroidal neovascularization (CNV) animal model.
  • CNV laser-induced choroidal neovascularization
  • This model is currently the most widely used animal model used to study the effects of drugs on CNV.
  • CNV formation induced by laser retinal photocoagulation in C57/W6 mice (4 laser spots per retina) using a 532 laser.
  • KDR4 a concentration of 150 uM in the right eye
  • V01 concentration of luM in the right eye.
  • Both mice were injected with the same volume of PBS as the control.
  • the animals were sacrificed and eyeballs were taken 5 days after the injection.
  • the compounds KDR4 (150 uM) and V01 (luM) can significantly inhibit choroidal neovascularization and effectively treat or alleviate wet macular degeneration.
  • Test Example 4 Effect of the compound of the present invention on kinase
  • Protein kinases also known as protein phosphakinase 0 , are enzymes that catalyze the phosphorylation of proteins. It can transfer the ⁇ -phosphate on adenosine triphosphate (ATP) to the hydroxyl group of certain serine, threonine or tyrosine residues on the amino acid residue of the protein molecule, thereby changing the conformation and activity of the protein and enzyme. . Phosphorylation of proteins is an important part of many signaling pathways. Most important life processes in cells are inseparable from protein phosphorylation.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Protein kinases are classified into five classes: protein serine/threonine kinase, protein tyrosine kinase, protein histidine kinase, protein tryptophan kinase, and protein aspartyl/glutamyl kinase. Protein kinases play an important role in the regulation and maintenance of cellular processes, and abnormalities in kinase activity have been observed in many disease states, including: malignant tumors, immune diseases, cardiovascular diseases, diabetes, infectious diseases, joints. Inflammation and other immune disorders, nervous systems such as Alzheimer's disease, Alzheimer's disease AD, etc., have been found to be associated with more than 400 human diseases and protein kinases.
  • VEGFR vascular endothelial growth factor receptor
  • VEGFR VEGFR2 receptor tyrosine kinases
  • VEGFR VEGFR2 receptor tyrosine kinases
  • PDGFR platelet-derived growth factor receptor
  • PDGFR a and PDGFR ⁇ receptor tyrosine kinases
  • colony-stimulating factor 1 receptor the stem cell growth factor receptor KIT, etc.
  • KIT stem cell growth factor receptor
  • Compound V01 was dissolved in 100% DMS0 and diluted to 3 series concentrations, and DMS0 was maintained at 1% in the final test. The highest concentration tested was 50 uM. Staurosporine, an activity inhibitor of non-selective protein kinase, was used as a reference with a maximum concentration of 1 uM. The results are shown in Table 3 and Figure 22.
  • Table 3 shows the inhibitory activity against KDR
  • V01 22 kinase activity inhibition assays were tested at a test concentration of 5 mM, repeated twice, at the ATP Km test. V01 was first dissolved in 100% DMS0 at a concentration of 100 times the final test concentration, and all final tests had a DMS0 of 1%. Staurosporine, an inhibitor of non-selective protein kinase activity, was used as a control with a maximum concentration of 10 mM.
  • V01 5000 30 SYK 1.74 -2.88 -0.57 4.62 0.000225 From the test results, V01 inhibits protein kinase KDR by up to 100%, and also inhibits other two tumor-associated protein kinases, among them, PDGFR- ⁇ The inhibition rate was 52.7%, and the KIT inhibition rate was 68%, but most of the other protein kinase inhibitory activities of V01 were less than 5%. It can be seen that the compounds of the present invention have high specificity and high inhibition of KDR compared with the previously developed small molecule kinase inhibitors, and two proteins closely related to tumors, PDGFR- ⁇ and KIT. Kinase also has a certain inhibitory effect, which indicates that compound V01 has potential therapeutic activity against various tumors associated with abnormal activation of KDR, PDGFR- ⁇ and KIT, and age-related wet macular degeneration.
  • VEGFR2 i.e., KDR
  • Such compounds can be used for the treatment of diseases caused by abnormalities of protein kinases such as neovascularization, VEGFR2, PDGFR- ⁇ , and KIT, such as wet macular degeneration and malignant tumors.

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Abstract

本发明提供了一种抗血管新生的新化合物及其制备方法和用途。本发明化合物具有良好的抗血管新生作用，初步认为该类化合物是通过抑制VEGFR2（即KDR）产生活性的。该类化合物可用于对新生血管、VEGFR2、PDGFR-β、KIT等蛋白激酶异常所致疾病的治疗，如湿性黄斑变性、恶性肿瘤等。

Description

说明书
一种抗血管新生化合物 技术领域
本发明涉及一种新化合物和用途。
背景技术
血管新生 （angiogenesis), 是从已有血管发芽生成新血管的过程。 这一过程与血管内皮 细胞迁移和增殖相关。 血管新生与多种人类重大疾病有关， 如恶性肿瘤。 目前发现， 眼部血管 新生性疾病， 包括年龄相关性黄斑变性 (AMD)、 糖尿病视网膜病变、 新生血管性青光眼等， 这类 疾病的共同特点都在于眼部新生血管的异常增生（金晓， 等， 抗 VEGF药物在眼科疾病中的应用 及机制研究进展， 中外医疗， 2012年）。
其中， 黄斑变性主要有干性和湿性两种， 湿性黄斑变性 (AMD)的特点是， 脉络膜的新生血 管进入视网膜下以及继而发生的出血、 渗出及水肿等病理变化。 湿性迅速丧失视力， 较干性更 为严重。 目前， 在湿性黄斑变性的治疗方面已有较好的进展。 早期的激光烧烁止血被血管内皮 因子拮抗剂所代替， 但因后者效果不佳， 很快被光动力疗法所取代。 光动力疗法虽然提高了疗 效， 但仍不理想。 近年又出现了新的血管内皮因子拮抗剂 Lucentis (雷珠单抗）， 是一种人源 性 VEGF亚型单克隆抗体片段的重组体， 可减少新生血管生成。 2006年， 该药物被美国 FDA批 准用于治疗湿性黄斑变性，疗效良好； 同时， 目前也发现该类抗 VEGF药物对糖尿病视网膜病变、 新生血管性青光眼有治疗作用。但由于 Lucentis为抗体药，价格极高，它还不能在全世界普及。 因此， 研究疗效良好、 价格低廉的小分子新生血管抑制剂药物是当今国际制药界激烈竞争的焦 点。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种新化合物， 及其制备方法和用途。
本发明提供了如式 A所示的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物：
Figure imgf000003_0001
式 A
其中， Z。 为 0 或 S; X为 C， Y为 N; ; Z2分别独立选自 N或 -CRS ;
r7 选自氢或 d-C6垸基； ^选自氢或 d-C6垸基； Γι。选自 H、 氨基、 羟基、 巯基、 d-C6垸基或-
(CH2) m Hri, 其中， =l-5， ϋ为 H或 C1-3的垸基；
r9 选自 H、 氨基、 羟基、 巯基、 （C-rur12) nNr13r14、 （C_rur12) n0r15、 (C-rur12)„C (0) Er13
(C-rnrJ ^ W mrn; 或 rs和 ^与它们所连接的原子一起形成饱和的 4_7元杂环或取代杂环， 其 中， 杂环或取代杂环含有 1或 2个选自 N， 0或 S的杂原子， 其取代基为 0， 1， 或 2个， 分别 独立地选自氧代基团， C1-C6垸基， C1-C6卤代垸基， C1-C6垸氧基， C1-C6卤代垸氧基， C 1-C 6垸酰基、 C1-C6垸胺基、 C3-C7环垸基、 卤素， 羟基， 氨基， 羰基， 氨基羰基， C1-C6氨垸基 羰基， C1-C4酰基， C1-C6垸氧基羰基， C1-C6磺酰基， 氨基磺酰基；
Ar2选自苯基， 萘基， 单环或二环杂芳基， 二环或三环杂环基，其中每个杂芳基或杂环基有 1， 2, 3或 4个选自 N， 0或 S的杂原子； 所述的苯基， 萘基， 杂芳基或杂环基团是未取代或取代的苯 基， 萘基， 杂芳基或杂环基团， 其取代基为 1， 2， 或 3个， 分别独立地选自 C1-C8垸基， C1-C8 卤代垸基， 羟基 C1-C 6垸基， C1-C8垸氧基， C1-C8卤代垸氧基， 卤素， 羟基， 氨基， 氨基 C-C6 垸基， C1-C6垸基氨基， 苯基， C3-C 7环垸基， 螺环的 C3-C7环垸基， 氨基磺酰基， C1-C6 垸基氨基磺酰基；
m 为 0， 1， 或 2; n为 0， 1， 2， 或 3; E 为空、 氧或 _Nrls;
Γπ, r12禾 P rls 是相同或不同的， 分别独立选自氢或 C1-C4垸基； r13， r14， r15， r16和 r17独立选 自氢， C1-C6垸基， C1-C6酰基， 苯基和杂环， 或取代的 C1-C6垸基， C1-C6酰基， 苯基和杂环， 其取代基为为 0、 1或 2个，分别独立选自 C1-C4垸氧基， C1-C4垸基、卤素、羟基、氨基、 C1-C6 氨焼基 °
进一步地， 所述化合物结构式如下：
Figure imgf000004_0001
式 I
其中， X为 C， Y为 N;
Ri选自 H、 氨基、 羟基或巯基； R2选自 H、 氨基、 羟基、 巯基或- (CH2) nNHR8， 其中， n=l-5， 为11或 C1-3的垸基； R3选自 H或 C1-6垸基； R4、 R5、 R6分别独立选自 H、 卤素、 C1-6的垸基或卤素取代垸基； R7选自 H、 C1-6的垸基或卤素；
或者， R2、R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含 1-2个杂原子的五元或六元环， 所述杂原子为 N、 0或 S， 其取代基为 C1-6的垸基。
进一步地， X、 Y不相同； 选自 H或氨基； R2选自 H、 氨基或- (CH2) nNHR8， 其中， n=l-3， 1 8为11或 C1-2的垸基； R3选自 H或 C1-2垸基； 、 R5、 Re分别独立选自卤素、 C1-2 的垸基或卤素取代垸基； R7选自 H或卤素；
或者， R2、 R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含 1个 N的五元或六元环， 取 代基为 C1-3的垸基。
更进一步地， R2选自氨基或- (CH2) n HR8 ; 或者， R2、 与其相连的碳原子共同构成取 代或非取代的含 1个 N的五元或六元环， 取代基为 C1-3的垸基。
进一步， 所述化合物结构式如下：
Figure imgf000005_0001
式 II 式 III
化合物为式 II时， Wl、 W2分别独立选自 C或杂原子， n=l或 2; R9为 H、 C1-C4垸基 或卤素； R10为卤素 ； 其中， n=l时， Wl、 W2不同时为 C; 优选地， n=l时， Wl、 W2同时 为杂原子， 杂原子优选为 N; n=2时， Wl、 W2同时为 C;
化合物为式 III时， W3选自 C或杂原子， 杂原子优选为 N; R10为卤素。
更进一步地， 所述卤素为 F或 Cl。
优选地， 所述化合物为：
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
KDR8A KDR8B KDR4
本发明还提供了上述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备血管新生抑制剂中 的用途。
进一步地， 所述血管新生抑制剂为血管内皮生长因子受体 2抑制剂。
更进一步地， 所述抑制剂是抗眼部血管新生的药物。
进一步地， 所述药物是脉络膜新生血管抑制剂。
更进一步地， 所述药物是治疗或预防湿性黄斑变性、 糖尿病视网膜病变或新生血管性青光 眼的药物。
本发明还提供了上述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备 VEGFR2、PDGFR- P或 /和 KIT抑制剂类药物中的用途。 本发明还提供了一种药物组合物， 它是含有上述化合物及其药学上可接受的盐的眼用制 剂。除了本发明提供的上述化合物以外，制剂中还可以包含其他已知具有相似治疗用途的药物。
进一步地， 所述眼用制剂为滴眼剂、 眼膏剂或眼用注射液。
在本领域中已知的方法可制备本发明化合物的盐。 用酸处理， 或与合适的阴离子交换剂， 与上述化合物可成盐。 本发明的化合物的药学上可接受的盐， 可以从上述化合物具有碱性氮原 子的有机或无机酸加成盐。
优选地， 合适的无机酸包括但不限于， 氢卤酸， 如盐酸， 硫酸， 或者磷酸。
优选地， 合适的有机酸包括， 但不限于， 羧酸， 磷酸， 磺酸或氨基羧酸， 例如乙酸， 丙酸， 辛酸， 癸酸， 十二垸酸， 羟基乙酸， 乳酸， 富马酸， 琥珀酸， 己二酸， 庚二酸， 辛二酸， 壬二 酸， 苹果酸， 酒石酸， 柠檬酸， 氨基酸， 如谷氨酸或天冬氨酸， 马来酸， 羟基酸， 甲基马来酸， 环己垸羧酸， 金刚垸羧酸， 苯甲酸酸， 水杨酸， 4氨基水杨酸， 邻苯二甲酸， 苯乙酸， 扁桃酸， 肉桂酸， 甲垸或乙垸磺酸磺酸， 2 - 羟基乙磺酸， 乙焼 -1,2 - 二磺酸， 苯磺酸， 2 - 萘磺酸， 1,5 - 萘二磺酸， 2 - 甲基苯磺酸， 对甲基苯磺酸， 乙基硫酸， 十二垸基硫酸的酸， N环己基氨基乙酸， N-甲基 -N-乙基 -N-丙基 -氨基磺酸， 或其它有机酸， 如抗坏血酸。
另外，它也可以药学上不可接受的盐用于分离或纯化中，例如苦味酸盐或高氯酸盐。但是， 用于治疗用途的， 只能是药学上可接受的盐或游离化合物， 以适用的药物制剂的形式。
本发明所述药学上可接受的前体药物， 是指所述化合物经过化学结构修饰后得到的在体内 经酶或非酶的转化释放出活性成分而发挥药效的化合物。 本发明的一种实施方式中， 还包括了 同位素标记的上述化合物或其药学上可接受的盐， 所述同位素标记化合物是指与本文中所列化 合物相同， 但是其中的一个或多个原子被另一个原子取代， 该原子的原子质量或质量数不同于 自然界中常见的原子质量或质量数。可以引入化合物中的同位素包括氢、碳、氮、氧、硫， 即 2 H, 3 H、 13 C、 14 C、 15 N、 17 0、 18 0、 35 S。 含有上述同位素和 I或其它原子同位素的化合 物及其立体异构体， 以及该化合物、 立体异构体的可药用的盐均应包含在本发明范围之内。
本发明中的关键中间体和化合物进行分离和纯化， 所使用的方式是有机化学中常用的分离 和纯化方法且所述方法的实例包括过滤、 萃取、 干燥、 旋干和各种类型的色谱。 可选择地， 可 以使中间体不经纯化即进行下一步反应。
在某些实施方式中， 本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用。 也可选择将本发明的 化合物与任何其它的活性试剂结合使用， 用于制备调控细胞功能或治疗疾病的药物或药物组合 物。 如果使用的是一组化合物， 则可将这些化合物同时、 分别或有序地对受试对象进行。
本发明化合物具有良好的抗血管新生作用， 初步认为该类化合物是通过抑制 VEGFR2 (即 KDR) 产生活性的。 该类化合物可用于对新生血管、 VEGFR2等蛋白激酶异常所致疾病的治疗， 如湿性黄斑变性、 恶性肿瘤等。
附图说明
图 1 本发明化合物对斑马鱼血管发育的抑制作用
图 2 阴性对照结果图， 其中， 斑马鱼血管发育正常
图 3 药物组结果图， 其中， 斑马鱼血管发育部位被本发明化合物部分抑制
图 4 药物组结果图， 其中， 斑马鱼血管发育部位被本发明化合物完全抑制 图 5 本发明化合物对 VEGFR2体外抑制作用
图 6 本发明化合物 KDR4脉络膜新生血管的抑制作用， 其中， A :阴性对照， B : KDR4 图 7 本发明化合物 V01脉络膜新生血管的抑制作用， 其中， A :阴性对照， B : V01
图 8 化合物 V01的核磁图
图 9 化合物 V3的质谱图
图 10 化合物 V4的质谱图
图 11 化合物 V5的质谱图
图 12 化合物 V5的核磁图
图 13 化合物 V6的质谱图
图 14 化合物 KDR3的质谱图
图 15 KDR4化合物质谱图
图 16 KDR6的质谱图
图 17 KDR6A的质谱图
图 18 KDR8的质谱图
图 19 KDR8A的核磁图
图 20 KDR8A的质谱图
图 21 KDR8B的质谱图
图 22 化合物 V01的剂量效应曲线
图 23 化合物 V01对小鼠眼部新生血管和出血的影响， A: 右眼 V01 处理， B : 左眼 PBS对照 具体实施方式
实施例 1 本发明中间体的制备
Figure imgf000007_0001
步骤如下：
第 1步： 混和米氏酸（75. 3 g、 0. 522mol)和原甲酸三乙酯（92mL， 0. 55mol)， 加热至 55°C， 维持 90分钟，然后冷却到 45 °C。 化合物 1 (92 g、 0. 5mol)溶于甲醇 (200mL)， 并加入到反应混合物中 反应 45分钟，同时保持反应混合物的温度低于 50 V ,然后在室温下搅拌过夜，薄层色谱 (PE / EA = 3 : 1)监控至反应完成。 反应混合物被冷却到 0°C，沉淀物过滤， 干燥后得到白色固体纯化合物 2 (155. 9 g，产量：96%)。
第 2步： 化合物 2 (155. 9 g、 0. 441mol)在 Dowtherm A热导管中 （1. 1 L)被加热到 100°C，然后 慢慢添加到连接有 Dowtherm A热导管的烧瓶中 （500mL，预热到 210 °C)中，同时保持温度高于 207°C。 反应物在 210°C下搅拌反应一个小时，然后冷却到室温。 过滤收集的沉淀，用乙醚、 丙酮 洗后， 干燥后得到棕色的固体纯化合物 3(67 g、 产量 :61%)。
第 3步： 在室温下， 伴随搅拌并往三氯氧磷 P°C13 (35 mL)中添加化合物 3 (10 g、 0.0398mol)。 添加后，反应混合物回流搅拌 3个小时， 薄层色谱（二氯甲垸 DCM /甲醇 = 10:1)跟踪反应完成， 再将反应混合物注入冰水，碳酸钠碱化调 pH= 8，然后以乙酸乙酯萃取， 收集有机相， 用盐水洗 漆，以 Na2S04干燥后，粗产物再由硅胶柱色谱 （石油醚 PE / 乙酸乙酯 EA =20： 1， 1:1)， 得到淡 黄色固体纯化合物 4 (6.0 g，产量： 56%)。
第 4步： 将化合物 4(10.0 g，37mmol)、 锌粉（0· 36 g、 5· 55讓 ol)、 Zn (CN) 2 (2.69 g、 22.9 Zn), dppf (8.82 g、 15.9mmol)和 Pd2 (dba) 3 (7.8 g、 8.51mmol)混合于 DMA (50 mL) 中， 80 °C 搅拌过夜。 薄层色谱 (PE / EA = 5:1)跟踪至几乎所有的化合物 4被消耗。 将反应混合物冷却到 室温后倒入水中， 过滤， 滤液以乙酸乙酯提取， 收集有机相， 用盐水洗涤， 在 Na2S04上干燥浓 缩获得粗产物， 硅胶柱色谱纯化 (PE/ EA = 50:1, 10:1)获得淡黄色固体纯化合物 5(6.0 g，产 量： 62.3%)。
第 5步：混合化合物 5 (6.0 g、 23.08mmol)、氢氧化钠（10 g、 250mmol)在乙二醇（70mL)和水（10mL) 在回流蒸熘器搅拌 3小时。 薄层色谱 (DCM/甲醇 = 10:1)跟踪至反应完成。 将反应混合物冷却到 室温，加入柠檬酸水溶液并酸化到 pH = 4， 过滤，沉淀干燥后得到淡黄色固体纯化合物 6 (6.0 g， 产量： 93· 2%)。
第 6 步： 搅拌混和化合物 6(6.0 g、 21.5mmol)于甲醇（lOOmL)中， 在 0°C逐滴添加 S0C12 (4.7mL, 64.5mmol)。 添加后，反应混合物在室温下搅拌 1个小时，然后加热回流过夜。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1)跟踪至反应完成。 将反应混合物蒸发除去大部分溶剂， 残留物注入冰水，添 加固体碳酸钠调节 pH= 8， 并用乙酸乙酯提取， 收集有机相， 用盐水洗涤后， 在 Na2S04上干燥， 浓缩获得褐黄色固体化合物 7 (3.9 g，产量 :61.9%)。
第 7步： 混和化合物 7(3.9 g、 13.3mmol)和 10% Pd / C(1.0 g)在甲醇（150mL)中， 在室温下 H2气中搅拌 2小时。 薄层色谱 (PE / EA = 2:1)跟踪至反应完成。 将反应混合物过滤， 滤液浓 缩后得到棕色的固体化合物 8 (2.6 g，产量 :96.3%)。
第 8步： 搅拌混和化合物 8 (0.5 g、 2.46mmol)于甲醇（5mL)中， 室温下添加 2N NaOH (2.5 mL, 5 mmol。 添加后，反应混合物在室温下搅拌夜。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1)指示反应完成。 将反 应混合物蒸发， 残留物用水稀释，并用乙酸乙酯提取， 弃去乙酸乙酯层， 水相添加柠檬酸水溶液 并调节 pH = 2， 过滤， 沉淀干燥后得到纯化合物 9 (0.4 g，产量 :86%)。
第 9 步 ： 混 和 化 合 物 9(0.4 g 、 2. llmmol) 、 3- 三 氟 甲 基 苯 胺
(375mg， 2.32mmol),HATU (960mg, 2.53mmol)和 DIPEA(820mg， 6.33mmol)在 DMF(5mL)室温下于 N2 中搅拌过夜。 薄层色谱 (DCM/甲醇 = 10:1)显示反应完成。 将反应混合物用水稀释后乙酸乙酯提 取， 收集有机相， 用盐水洗涤，在 Na2S04上干燥浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化后获得 黄色的固体纯化合物 10 (0.4 g，产量： 57%)。
实施例 2 化合物 V01 (本发明中亦可记为 V01) 的制备
步骤 1:
Figure imgf000009_0001
化合物 11 A (20 g、 0.15 mol) 、 DMAP (1.9 g、 15.4讓 ol)和（BoC) 20 (75 g， 0.34 mol)， 在四氢呋喃（750mL)中混合， 反应混合物在室温搅拌过夜。 薄层色谱 (PE / EA = 3:1)显示反应 完成。 将反应混合物浓缩后悬浮于 PE EA(10: 1， 200mL)，过滤后得到白色固体纯化合物 11 (50 g， 100%)。
步骤 2:
Figure imgf000009_0002
混合化合物 10 (50mg, 0.15讓 ol)禾 P Cs2C03 (150mg, 0.45讓 ol)于 DMSO(lmL)中，在 N2中室温 搅拌半个小时，然后加入化合物 ll(60mg)。 由此产生的反应混合物搅拌半个小时， 用薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1)检测至反应完成。 将反应混合物加水稀释后， 用 EA提取， 收集有机相， 用 盐水洗涤，以 Na2S04干燥后， 色谱纯化后制备黄色的固体纯化合物 12 (30mg, 32%)。
室温下 N2中搅拌混合化合物 12 (20mg, 0.032mmol)和 TFA (0. lmL) 半个小时。薄层色谱（DCM /甲醇 =10:1)显示至反应完成。 将反应混合物由 Na2C03碱化后， 用 DCM提取， 收集有机相， 用 盐水洗涤，以 Na2S04上干燥， 浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合 物 V01 (4.5 mg, 33%)， 结构鉴定参见图 8。
实施例 3 化合物 V3 (本发明中亦可记为 V03) 的制备
步骤 1:
Figure imgf000009_0003
搅拌混和化合物 13(5· 0 g， 45mmol)和吡啶（200mL) ， 65°C下将（Boc) 20 (14.7 g, 67.5 mmol) 滴加到上述混合物中。 添加后，在 85 °C搅拌反应 4小时。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1)跟踪至 反应完成后， 将反应混合物冷却到 0°C， 加入浓 HCl(lOOmL)和 H20(50mL) ， EA提取后， 收集有 机相， 用 NaHC03水溶液洗涤， 以 Na2S04干燥后， 得到黄色的油状物，将其悬浮于 Et20， 过滤， 获得白色固体化合物 14(4.3 g，产量 :45.2%)。
搅拌混和化合物 14(2.4 g、 11.4mmol)和 N，N二甲基苯胺（6.6 mL)于 DCM (84 mL)中， 0°C N2中， 滴加 P0C13 (3. 2 mL, 34. 2 mmol)。 添加后，反应混合物在室温下搅拌 2小时。 薄层色谱 (PE / EA = 2 : 1)跟踪至反应完成后， 将反应混合物注入冰水。 有机相用盐水洗，在 Na2S04 上 干燥浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化， 获得白色固体纯化合物 15 (1. 8 g 70%)。
在 THF (1 mL)中搅拌混和化合物 15 (100 mg, 0. 47 mmol) 和 DMAP (12 mg, 0. 09 mmol) 室温下加入 （B0C) 20 (124 mg, 0. 57 mmol) , 然后室温下搅拌过夜。 薄层色谱 (PE / EA = 2 : 1) 表明反应完成后， 将反应混合物用水稀释， EA提取， 收集有机相， 用盐水洗，在 Na2S04上干燥 浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化， 获得白色固体纯化合物 16 (70 mg, 44. 8%)。
室温下， 在 N2中 DMS0 (1 mL)中搅拌混和化合物 10 (50 mg, 0. 15 mmol)和 Cs2C03 (150 mg, 0. 45 mmol)半小时， 然后加入化合物 16 (60 mg, 0. 18 mmol)， 再搅拌半小时。 薄层色谱（PE / EA = 2 : 1) 表明反应完成后， 将反应混合物用水稀释， EA提取， 收集有机相， 用盐水洗，在 Na2S04 上干燥浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化， 获得黄色固体纯化合物 17 (50 mg 53. 3%) 步骤 2:
Figure imgf000010_0001
室温下， 在 N2中 DMS0 (1 mL)中搅拌混和化合物 17 (50 mg, 0. 08 mmol)禾 P TFA (0. 2 mL) 半小时。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10 : 1) 表明反应完成后， 这个反应混合物由 Na2C03碱化后， 用 DCM提取。 有机相是用盐洗，在 Na2S04上干燥浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化后获得黄 色的固体纯化合物 V3 (15 mg, 44%) , 其结构鉴定数据参见图 9
实施例 3化合物 V4 (本发明中亦可记为 V04) 的制备
步骤 1 :
Figure imgf000010_0002
搅拌混和化合物 18 (50 g 0. 47 mol)于 DCM (600 mL)中， 加入 TEA (94g 0. 93 mol) 然后在 0°C N2中， 滴加溴乙酸乙酯（94 g 0. 56 mol)。 反应混合物在室温下搅拌过夜。 薄层 色谱 (PE/EA = 1 : 1)表明反应完成后， 反应混合物用盐水洗，在 Na2S04 上干燥浓缩后获得粗产 物， 由硅胶柱色谱纯化 （用 PE/EA =20:1 to 10:1 to 5:1洗脱）， 获得黄色油状纯化合物 19 (46 g， 51%)。
95°C下， 在甲苯（800mL)搅拌混和化合物 19 (38 g， 196.65 mmol) 和 TEA (29.9 g， 295 mmol) ， 逐滴加入 4-溴丁酸乙酯 （72.9 g， 373.65 mmol). 加完后回流加热过夜。 薄层色谱 (PE/EA=5:1)表明反应完成后， 反应混合物浓缩， 由硅胶柱色谱纯化 （用 PE/EA = 20:1 to 5: 洗脱）， 获得黄色油状纯化合物 20 (32 g， yield: 53%)。
在甲苯（800mL)中搅拌混和化合物 20 (32 g, 104.3 mmol) , 0°C下， 加入 t- BuOK (51.2 g, 456.3 mmol)。添加后，反应混合物在室温下反应 1小时。薄层色谱 (PE/EA=5： 1)表明反应完成后， 添加 2NHC1调节 pH = 6， 然后 EA提取， 收集有机相， 用盐水洗，在 Na2S04上干燥浓缩后获得 粗产物 21 (17 g， yield: 62.5%)， 为暗黄色油，可直接用于下一步反应， 不需进一步纯化。
Me0Na((ll g， 161.65 mmol)溶于甲醇（280 mL)， 反应混合物被冷却到 5°C， 再加入乙酸甲 脒（3.0 g， 29.15 mmol)。 搅拌反应混合物半个小时，再加入化合物 21 (17 g、 65. Immol)。 将反 应混合物 40 °C搅拌过夜。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1)表明反应完成后， 将反应混合物冷却到 室温， 蒸发除去大部分的溶剂。 残留物水处理和 EA提取， 有机相用盐水洗， 在 Na2S04上干燥 浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化获得淡黄色固体纯化合物 22 (2.5 g，产量：16%)。
在压力为 0.5 MPa ¾ 中， 搅拌过夜混和化合物 22 (2.5 g， 10.4 mmol)， 10% Pd/C (0.5 g) 和（B°C)20 (2.7 g， 12.4 mmol) 于 Me OH (40 mL)中。 薄层色谱（DCM /甲醇 = 10:1)表明反应完 成后， 将反应混合物过滤浓缩得到黄色固体纯化合物 23 (2.6 g， 100%)。
在 1，2-DCE (64 mL)中混和化合物 23 (1.6 g， 6.3 mmol), PPh3 (3.33g, 12.6 mmol) 和 CC14 (2.93 g， 18.9 mmol), 70°C加热 1小时。 薄层色谱 (DCM /甲醇 = 10:1) 表明反应完成后， 将反应混合物浓缩后， 由硅胶柱色谱纯化获得淡黄色固体纯化合物 24 (1.38 g， 81%) 。
室温 N2中， 在 DMS0 (2 mL)中搅拌混和化合物 10(100 mg, 0.3 mmol) 禾 P Cs2C03 (300 mg, 0.9 mmol)半个小时， 再加入化合物 24 (97 mg, 0.36 mmol)。 反应混合物搅拌混合半小时。 薄 层色谱 (DCM/Me0H=10:l)表明反应完成后， 反应物用水稀释， 然后 EA提取。 有机相用盐水洗， 在 Na2S04 上干燥浓缩后获得粗产物， 将反应混合物浓缩后由硅胶柱色谱纯化获得黄色固体纯 化合物 25 (21 mg, 12.4%)。
Figure imgf000011_0001
室温 N2中， 中搅拌混和化合物 25 (21 mg, 0.037 mmol)和 TFA (0.2 mL)半个小时。 薄层 色谱 (DCM/Me0H= 10:1) 表明反应完成。 将反应混合物由 Na2C03碱化后， 用 DCM提取。 有机相 用盐水洗， 在 Na2S04 上干燥浓缩后获得粗产物， 由硅胶柱色谱纯化后获得黄色的固体纯化合 物 V4(10 mg， 57.9%)， 其结构鉴定数据参见图 10。 实施例 4化合物 V5 (本发明中亦可记为 V05) 的制备
步骤 1:
Figure imgf000012_0001
(S) -1-苯基乙胺 （10 g， 8.26mmol) 和乙基乙酰丙酸 （11· 9 g， 8.26mmol) 的 1， 2-DCE (200mL) 溶液中， 分批加入 NaBH(0Ac)3 (35 g， 16.52 mmol)。 加完后， 将反应混合物在室温 下搅拌 4小时。 然后将反应混合物加入 NaHC03水溶液碱化， 并以 DCM萃取， 分离有机相， 并用 饱和食盐水洗涤， 在 Na2S04上干燥， 并浓缩得到粗的化合物 34 (20.5 g， 收率： 100%)， 可 不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
在 1， 2-DCE (200 mL) 中搅拌混和化合物 34(20.5 g， 82 mmol)和乙醛酸乙酯 ( (33 mL, 165 mmol, 50%的甲苯溶液）， NaBH(0Ac)3 (35 g， 165 mmol), 在室温下搅拌 4小时。 然后将反应 混合物用 NaHC03水溶液碱化， 并以 DCM萃取。分离有机相并用饱和食盐水洗涤， 在 Na2S04干燥 并浓缩得到粗的化合物 35 (26 g， 100%), 可不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
化合物 35(26 g， 78 mmol)和 t-Bu0K (22 g， 156 mmol)在甲苯 （600mL) 中的混合， 搅拌 回流过夜。然后将反应混合物用 NaHC03水溶液碱化并以 DCM萃取。有机相用盐水洗涤，在 Na2S04 干燥并浓缩， 得到粗化合物 36。
取粗化合物 36通过硅胶色谱法 （PE/ EA= 20:1洗脱） 纯化， 得到纯的化合物 37 (3 g)。 在乙醇 (50mL) 中的混合化合物 37 (3.0 g， 0.01 mol) 和甲脒乙酸盐（3.24 g， 0.03 mol) , 混合物中溶液中加入 NaOEt (2.38g, 0.035 mol)。 搅拌该反应混合物于 90 °C过夜， 然后蒸发 以除去大部分的溶剂。 残余物用 H20稀释， 用 2N HC1酸化至 pH为 6， 然后用 DCM萃取。 有机 相用盐水洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过硅胶色谱法纯化， 得到纯的化合 物 38 (1.0 g， 收率： 35.8%)， 为黄色固体。
将化合物 38(L0 g， 10.4 mmol) , 10%的 Pd / C (0· 1 g) 和（B°C)20 (2· 7 g， 12.4 mmol) 混合于 MeOH (40mL) 中， 在压力为 0.5兆帕的氢气中搅拌过夜。 TLC (DCM/甲醇 = 10:1) 表明 反应完成。 将反应混合物过滤， 将滤液浓缩， 得到粗产物， 将其通过硅胶色谱法纯化， 得到纯 的化合物 39 (0.7 g， 产率： 71%)， 为黄色固体。
取化合物 39(0.7 g， 6.3 mmol)和三苯基膦 PPh3 (3.33g, 12.6 mmol)在四氯化碳 (lOmL) 中混合， 于 80°C过夜搅拌。 TLC (DCM/甲醇 = 15:1) 表明反应完成。 将反应混合物浓缩， 并将 残余物通过硅胶色谱法纯化， 得到纯的化合物 40 (0.4 g， 53.4%), 为浅黄色油状物。
在氮气下， 化合物 10(150 mg， 0.45励1)禾口 Cs2C03 (440 mg， 1.35 mmol)于 DMS0 (2ml) 中混合， 在室温下搅拌半小时， 然后加入化合物 40(153 mg， 0.54 mmol)。 将所得的反应混合 物搅拌半小时， TLC (DCM/甲醇 = 10:1) 表明反应完成。 将反应混合物用水稀释并用 EA萃取。 有机相用盐水洗涤， 在 N¾S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过制备的 TLC纯化， 得到纯的 化合物 41 (60mg, 23%), 为黄色固体。
Figure imgf000013_0001
取化合物 41 (60 mg, 0.104 mmol)和 TFA (0.3 mL) 的混合物在氮气下， 室温搅拌半小时。 TLC (DCM/甲醇 = 10:1)表明反应完成。 将反应混合物 NaHC03水溶液碱化并以 DCM萃取。 有机相 用盐水洗涤，在 N¾S04上干燥浓缩，得到粗产物，将其通过制备的 TLC纯化，得到纯化合物 V5 (20 mg, 40.3%)， 为黄色固体， 其结构鉴定数据参见图 11、 12。
例 5化合物 V6 (本发明中亦可记为 V06) 的制备
Figure imgf000013_0002
配备有机械搅拌器和氯化钙管的 3 L的烧瓶中，装入化合物 26 (100 g， 0.716 mol)和乙醇（1.0 L)。 将该混合物搅拌 20分钟， 然后滴加三乙胺（72.5 g， 0.716 mol)。 将所得的混合物搅拌 10分 钟， 然后， 加入丙烯酸乙酯 (61.6 g, 0.716mol)。 将反应混合物在室温下搅拌 17小时。 (B0C)20 (234.5 g, 1.08 mol) 在室温下逐滴加入。 滴加结束后， 将反应混合物在室温下搅拌过夜。 将反 应混合物浓缩以除去大部分 EtOH中。 将残余物溶解在水 （3 L) 中， 并用 Et 2 0 (1 L X3) 萃 取。 合并的有机相用氯化铵 （500LX3) 水溶液和盐水 （500LX3) 洗涤， 无水 Na2S04干燥， 并 浓缩得到粗的化合物 28 (300 g， 92%) , 为黄色油状物， 其用于下一步骤而无需额外的纯化。 钠（27.6g， 0.765mol)加入无水乙醇 （1.5L) 中。 当固体钠完全消失， 将化合物 28 (300 g， 1.04mol)加入热溶液中。 反应混合物回流过夜。 薄层色谱法 （石油醚 /乙酸乙酯= 4:1) 表明起 始原料完全被消耗。 将反应混合物蒸发， 将残余物溶解在水 （1L) 中， 然后柠檬酸水溶液酸化 至 pH为 6。 然后将混合物用 EtOAc (1升 X3) 萃取。 将萃取液合并， 并用盐水 （1LX3) 洗涤， 在 N¾S04干燥并蒸发， 得到化合物 29(169 g， 63.4%)， 为棕色油状物。 该粗产物无需进一步纯 化用于下一步骤。
甲醇钠（2.6 g， 48.58 mmol)溶解于 MeOH (50mL) 中， 并将该溶液冷却至 5°C。 加入醋酸甲 脒（3.0 g， 29.15 mmol), 将反应混合物搅拌半小时。 再加入化合物 29 (5.0 g， 19.43 mmol), 将反应混合物搅拌回流过夜。 TLC (DCM/甲醇 = 10:1) 表明反应完成。 将反应混合物冷却至室 温， 并蒸发以除去大部分溶剂。 将残余物用水处理并用 EA萃取。 有机相用盐水洗涤， 在 N¾S04 干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过硅胶色谱法纯化， 得到纯的化合物 30 (680 mg， 收率： 14.7 ), 为浅黄色固体。
在 0°C氮气下， 三氯氧磷 (P°C13， 174mg, 1.26 mmol)加入到搅拌混合有化合物 30 (100 mg， 0.42 mmol)和 N， N_二甲基苯胺 （0.28mL) 的 DCM (4mL) 中， 加完后， 将反应混合物倾入冰水 中， 通过加入固体碳酸钠碱化， 然后用 DCM萃取。 有机相用盐水洗涤， 在 N¾S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过制备 TLC纯化， 得到纯的化合物 31 (60 mg， 55.6%)， 为白色固体。
在氮气下， 化合物 10 (50 mg， 0.15 mmol)和 Cs2C03 (150 mg， 0.45 mmol) 混合于 DMS0 ( lmL) 中， 混合物在室温下搅拌半小时， 然后加入化合物 31(46 mg， 0.18 mmol)。 将所得的反应混合 物搅拌半小时， TLC (DCM/甲醇 = 10:1) 表明反应完成。 将反应混合物用水稀释并用 EA萃取。 有机相用盐水洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过制备的 TLC纯化， 得到纯的 化合物 32 (13 mg, 15.7%)， 为黄色固体。
步骤 2:
Figure imgf000014_0001
氮气下， 化合物 32 (13 mg, 0.038 mmol)和 TFA (0.1 mL) 的混合物室温下搅拌半小时。 TLC (DCM/甲醇 = 10:1)表明反应完成。 将反应用混合物用 Na2C03水溶液碱化和 DCM萃取。 有机相 用盐水洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过制备 TLC纯化， 得到纯的化合物， V6 (6 mg，收率： 56.3%)， 为黄色固体， 其结构鉴定数据参见图 13。
实施例 6 KDR3的制备方法
Figure imgf000015_0001
第 1步： 将化合物 1 (1.4克， O.Olmmol), 4- (苄氧基甲基） -6- 氯嘧啶 （4.7克， 0.02)和 K 2 CO 3 (4.2克， 0.03摩尔） 在 DMF (50 mL) 中混合， 在 100°C N2下搅拌为 5小时。 TLC (PE/EA = 4:1)表明反应完成。 将反应混合物冷却至室温并用水稀释， 用 EA萃取。 收集有机 相， 用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过柱层析纯化， 得到纯的化合 物 2 (3.0克， 产率： 90%)， 为黄色固体。
步骤 2: 在 N2气氛下， 化合物 2 (1.2克， 3.56毫摩尔）， 水合肼 （0.36克， 7.12毫摩尔） 和 Raney Ni (0.2g) 的 THF (20mL) 中的混合物回流搅拌 1小时。 TLC (PE/EA=2:1)表明反应 完成。 将反应混合物过滤， 过滤浓缩， 得到粗产物， 将其通过柱层析纯化， 得到纯的化合物 3
(0.8克， 产率： 73%)， 为黄色固体。
步骤 3: 在 0°C在氮气下， 将 TCDI (0.78克， 4.4mmol) 和化合物 3 (0.9克， 2.93mmol) 在干 燥的 DCM (lOmL) 中缓慢混合。 加完后， 将反应混合物在室温下搅拌半小时。 TLC (PE/EA = 1:1) 表明反应混合物中完成。 将反应混合物浓缩， 得到粗产物， 将其用闪蒸色谱法纯化， 得 到粗化合物 4 (1.0克， 产率： 100%)， 为灰白色固体。
步骤 4: 将化合物 4 (1.1克， 3.15毫摩尔）， 4- 甲基 -5- (三氟甲基） 苯 1,2 - 二胺 （0.6克， 3.15毫摩尔） 和碳二亚胺 （1.2克， 6.30毫摩尔） 的 THF (50毫升） 在氮气下， 回流下搅拌 2 小时。 TLC (DCM/甲醇 = 10:1)表明， 反应混合物中完成。 与 EA稀释该反应混合物， 并过滤 沉淀物。 将滤液蒸发， 得到粗产物， 将其用柱色谱法 （PE/EA= 10:1至 4:1) 纯化， 得到纯的 化合物 5 (0.8克， 产率： 50%)， 为棕色油状物。
步骤 5: 化合物 5 (0.7克， 1.38毫摩尔）和 TFA (15ml) 中的混合物于 60°C过夜搅拌。 将反应 混合物升温至 70°C， 并在此温度下搅拌 1小时。 TLC (DCM/甲醇 =10:1)表明， 反应混合物中 完成。 将反应混合物冷却至室温并倾入冰水中， 用 2N的 NaOH碱化至 pH为 10， 然后用 EA 萃取。 有机相用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到化合物 6的粗产物 （0.4 g， 收率： 70 ), 为黄色油状物， 其不经进一步纯化直接用于下一个步骤。
步骤 6: 在搅拌着的化合物 6 (60mg， 每日 0.1445mmol) 的 DCM (5ml) 中， 加入 TEA (30 毫克， 0.289mmol) 禾 P MSCL (25毫克， 0.2168mmol) 在 0°C氮气保护下。 滴加结束后， 反应 结束。 将该混合物用 DCM稀释， 用盐水洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到化合物 7的粗产 物， 它不经进一步纯化直接用于下一步骤中。
第 7步： 化合物 7 (60毫克， 0.12毫摩尔） 和 Me H2 (0.6毫升， 1.2毫摩尔， 在 MeOH中的 2N) 的无水 THF (5ml) 中的混合物于室温过夜搅拌。 TLC (DCM /甲醇 = 10:1) 表明， 反应 混合物中完成。 将反应混合物浓缩并纯化残余物， TLC纯化三次， 得到纯 KDR3 (6毫克， 产 率： 12%)， 为白色固体， 其结构鉴定数据参见图 14。
实
Figure imgf000016_0001
第一步： 将化合物 1 (1.0克， 4.5毫摩尔）在 ACN (20毫升）中混合 2 - 氯 -5 - 硝基吡啶 2 - 氯 -5 - 硝基吡啶 （0.8克， 5毫摩尔） 和碳酸铯 （3.3克， 10毫摩尔）， 在室温下搅拌过夜。 TLC (PE/EA= 1:1) 表明反应混合物中完成。 将反应混合物用水稀释， 用 EA萃取。 有机相用盐水 洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过快速色谱纯化， 得到纯的化合物 2 (0.4 克， 收率： 24.5%)， 为黄色固体。
第二步： 向化合物 2 (0.3克， 0.83毫摩尔） 的 THF (5mL) 中的搅拌混合物中加入阮内镍（0.1 克）， 然后加热至回流。 H2N- H2 H20 (1.66毫摩尔） 的 THF (5mL) 中的溶液逐滴加入。 将 所得的反应混合物搅拌 10分钟。 TLC (DCM/甲醇 = 15:1) 表明， 反应混合物中完成。 将反应 混合物过滤， 过滤浓缩， 得到粗产物， 将其通过快速色谱纯化， 得到纯的化合物 3 (0.16克， 产率： 50%)， 为黄色固体。
第三步：在化合物 3 (0.16克， 0.483mmol)的搅拌溶液中，在 0°C氮气保护下，在 DCM (lOmL) 中加入 TCDI(95mg， 0.531mmol)。滴加结束后，将反应混合物在室温下搅拌。过夜。 TLC(DCM/ 甲醇 = 10:1)表明， 反应混合物中完成。 将反应混合物浓缩， 得到粗产物， 将其通过快速色谱纯 化， 得到纯的化合物 4 (50毫克， 产率： 28%) 为灰白色固体。
第四步：将化合物4(50毫克， 0.134mmol)， 4- 甲基 -5 - (三氟甲基） - 苯 -1,2 - 二胺（25.5mg， 0.134毫摩尔） 禾 PEDCI (51米克， 0.268毫摩尔） 在无水 THF (lOmL) 中， 氮气下回流搅拌 1 小时。 TLC ( DCM/ MEOH= 15： 1 )表明， 反应混合物中完成。 稀释反应混合物， 用 EA和过滤 沉淀物， 得到粗产物， 将其由预 TLC纯化， 得到纯的化合物 5 (40毫克， 收率： 56%)， 为白 色固体。
第五步： 化合物 5 (20毫克， 0.038毫摩尔）和三氟乙酸 （0.2毫升） 的混合物， 在室温下搅拌 半小时。 TLC (DCM/甲醇 =5:1)表明反应混合物中完成。 将反应混合物蒸发以除去 TFA， 将 残余物溶解在 THF中， 由固体 K 2 CO 3碱化， 过滤并浓缩滤液， 得到纯化合物 KDR4 ( 10 克， 产率： 62.5%)， 为白色固体， 其结构鉴定数据参见图 15。
实施例 10 KDR6化合 备
Figure imgf000017_0001
第一步： 7-甲氧基喹啉 -4- 醇 （10.0克， 57.1mmol)溶解在 50ml三氯氧磷， 然后将反应混合物 在 120°C加热 3小时。 然后将混合物冷却至室温， 并倒入冰水 （50毫升）。 用 EtOAc萃取该混 合物 （lOOmLx 3)， 将有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥并浓缩， 得到粗产物， 将 其用闪式色谱法 （与 PE/EA=30:1洗脱） 纯化， 得到的产物 （8.5克， 收率： 76.9%)， 为白色 固体。
第二步： 4- 氯 -7- 甲氧基喹啉 (5.5G, 28.4mmol), 锌 (276.9mg, 4.26mmol), Zn (CN) 2 (2.07 克， 17.6mmol)， DPPF (6.65克， 12.21mmol), PD2 (DBA) 3 (5.98克， 6.53mmol) 溶解在 lOOmL的 DMAc中， 将混合物用氩气覆盖并加热在 160°C过夜， 然后将混合物冷却至室温， 并 通过硅藻土过滤， 将滤液用 H20处理， 然后用 EA萃取将有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫 酸钠干燥， 并在真空下浓缩。 通过闪式色谱法 （与 PE/EA=10:1洗脱）纯化， 得到产物 7- 甲 氧基喹啉 -4- 甲腈 （4.38克， 收率： 83.7%)， 为棕色固体。
第三步： 7 - 甲氧基喹啉 -4-甲腈 （4.38克， 23.78mmol) 溶解在 30mL的 H20中， 加入氢氧化 钠 （2.38克， 59.45mmol)。 然后将混合物加热至 100°C过夜。 将反应混合物冷却至室温， 并用 EA萃取， 以除去杂质。 将水相酸化， 通过加入 6N盐酸至 pH为 2。 将黄色的沉淀物通过过滤 收集并干燥， 得到 2.5g的 7- 甲氧基喹啉 -4- 羧酸， 产率 52%， 为棕色固体。
第四步： 7- 甲氧基喹啉 -4-羧酸 （2.0克， 9.84mmol) 和 DIPEA (3.82克， 29.52mmol)溶解在 DMF中。然后将反应混合物冷却至 0°C， 加入 HATU (4.49克， 11.81mmol)和 3 - (三氟甲基） 苯胺 （1.74克， 10.82mmol)。 该混合物用氩气覆盖， 然后在室温下搅拌过夜。 该混合物用水稀 释并用 EtOAc (3X50毫升） 萃取。 洗涤有机层， 用盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥， 并在真空 下浓缩， 得到粗产物， 将其通过快速色谱纯化， 与 PE/EA=1:1洗脱， 得到产物（2.5 g， 收率： 79.6%) 为浅黄色固体。
第五步： 7 -甲氧基 -N- (3- (三氟甲基） 苯基） 喹啉 -4 - 甲酰胺 （0.6克， 1.733mmol) 于 DCM (50毫升） 溶液中， 10°C氮气下逐滴加入 BBr3 (1.73mL， 6.93毫摩尔。 加完后， 将反应混合 物在室温下搅拌 100小时。 TLC (DCM/甲醇 = 15:1)表明反应完成。将反应混合物倾入冰 - 水 中并用 DCM萃取。 洗涤有机层， 用盐水洗涤， 无水 Na2S04干燥， 浓缩的产物， 为棕色固体 (0.5克， 产率： 87%)， 将其用于下一步， 无需进一步纯化。 第六步： 将 7 - 羟基 -N- (3- (三氟甲基）苯基）喹啉 -4- 甲酰胺 （50毫克， 0.151mmol)， 叔丁 基（6- 氯嘧啶 -4- 基）甲基（甲基）氨基甲酸叔丁酯（46.6mg， 0.181mmol)和 K 2 CO 3 (41.7mg， 0.302mmol)在 DMSO (2ml)溶液中混合， 在 90°C搅拌过夜。 TLC (PE/EA= 1:2)表明反应 完成。 将反应混合物用水稀释并用 EA萃取。 洗涤有机层， 用盐水洗涤， 无水 Na2S04干燥， 浓缩， 粗品， 这是通过预 -TLC纯化， 得到纯的产物 （25毫克， 产率： 30%)， 为白色固体。 第七步： 叔丁基甲基（（6- (4- (3- (三氟甲基）苯基氨基甲酰基）喹啉 -7-基氧基）嘧啶 -4- 基) 甲基） 氨基甲酸叔丁酯 （25毫克， 0.045mmol) 和 TFA (0.25毫升） 的混合物， 在 0°C下搅拌 半小时。 TLC (DCM /甲醇 = 5:1) 表明反应完成。 蒸发 TFA， 并将残余物通过水溶液碱化。
Na2C03和用 DCM萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将 其通过预 -TLC纯化， 得到纯的化合物 06 (7毫克， 收率： 21%)， 为白色固体， 其结构鉴定数 据参见图 16。
实施例 11 KDR6A化合物制备
Figure imgf000018_0001
第一步： 7- 甲氧基喹啉 -4- 醇 （10.0克， 57.1mmol) 溶解在 50ml三氯氧磷， 然后将反应混合 物在 120°C加热 3小时。 然后将混合物冷却至室温， 并倒入冰水 （50毫升）。 用 EtOAc萃取该 混合物 （lOOmLx 3)， 将有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其用闪式色谱法 （与 PE/EA=30:1洗脱） 纯化， 得到的产物 （8.5克， 收率： 76.9%)， 为白 色固体。
第二步: 4- 氯 -7- 甲氧基喹啉 (5.5G, 28.4mmol), 锌 (276.9mg, 4.26mmol), 锌 (CN) 2 (2.07 克， 17.6mmol)， DPPF (6.65克， 12.21mmol), PD2 (DBA) 3 (5.98克， 6.53mmol) 溶解在 lOOmL的 DMAc中， 将混合物用氩气覆盖并加热在 160oC过夜， 然后将混合物冷却至室温， 并 通过硅藻土过滤， 将滤液用 H20处理， 然后用 EA萃取将有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫 酸钠干燥， 并在真空下浓缩。 通过闪式色谱法 （与 PE/EA=10:1洗脱）纯化， 得到产物 7- 甲 氧基喹啉 -4- 甲腈 （4.38克， 收率： 83.7%)， 为棕色固体。
第三步： 7- 甲氧基喹啉 -4- 甲腈 （4.38克， 23.78mmol) 溶解在 30mL的 H 20中， 加入氢氧 化钠 （2.38克， 59.45mmol)。 然后将混合物加热至 100°C过夜。 将反应混合物冷却至室温， 并 用 EA萃取， 以除去杂质。 将水相酸化， 通过加入 6N盐酸至 pH为 2。 将黄色的沉淀物通过过 滤收集并干燥， 得到 2.5g的 7- 甲氧基喹啉 -4- 羧酸， 产率 52%， 为棕色固体。
第四步： 7 - 甲氧基喹啉 -4 - 羧酸 （406mg， 2毫摩尔） 和 DIPEA (775mg， 6毫摩尔） 溶解在 DMF (5mL) 中。 将反应混合物冷却至 5°C， 然后加入 HATU (912mg， 2.4mmol)禾 P 4 - 氟 -3 - (三氟甲基） 苯胺 （394mg， 2.2毫摩尔）。 该混合物在环境温度下用氩气和覆盖， 过夜。 TLC (PE/EA=1:2)表明反应完成。 将反应混合物用水稀释并用 EA萃取。 洗涤有机层， 用盐水洗 涤， 无水 Na2S04干燥， 并浓缩， 粗产物， 将其由 CCTO纯化， 得到纯的产物 （220毫克， 收 率： 30%)， 为棕色固体。
第五步：在 N- (4 - 氟 -3 - (三氟甲基）苯基） -7 - 甲氧基喹啉 -4 - 甲酰胺（0.2克， 0.549mmol) 的 DCM (10ml)溶液中， 0°C下 N2气氛下搅拌加入 4NBBr3 (0.68毫升， 2.75mmol) 的 DCM 溶液。 加完后， 将反应混合物在室温下搅拌为 20小时。 然后将反应混合物在 -30°C搅拌 4小时。 TLC (DCM/甲醇 =10:1)表明起始原料依然。 将反应混合物倾入冰 - 水中并用 DCM萃取。 将 有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸钠干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其由预 TLC纯化， 得到 的原料 （120毫克）和纯的产物 N- (4- 氟 -3- (三氟甲基基） 苯基） -Ί- 羟基喹啉 -4- 甲酰胺
(60毫克， 78%)， 为白色固体。
第六步：将 N- (4- 氟 -3- (三氟甲基）苯基） -7- 羟基喹啉 -4- 甲酰胺（30毫克， 0.086mmol)， 叔丁基（6- 氯嘧啶 -4- 基） 甲基（甲基）氨基甲酸叔丁酯（ 26.5mg， 0.103mmol)禾 P K 2 CO 3
(23.8mg, 0.172mmol) 在 DMF (lmL) 中， 50°C下搅拌 15小时。 TLC (DCM /甲醇 = 10:1 ) 表明反应完成。将反应混合物用水稀释。 并提取 EA。将有机层用饱和食盐水洗涤， 用无水硫酸 钠干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过预 -TLC纯化， 得到纯的产物（6- (4- (4- 氟 -3 - (三 氟甲基叔丁基） 苯基氨基甲酰基） 喹啉 -7- 基氧基）
嘧啶 -4- 基） 甲基 （甲基） 氨基甲酸叔丁酯 （20毫克， 收率： 41%)， 为黄色固体。
第七步： 甲叔丁酯的混合物 （6- (4- (4- 氟 -3- (三氟甲基） 苯基氨基甲酰基） 喹啉 -7 - 基氧基） 嘧啶 -4 - 基） 甲基 （甲基） 氨基甲酸叔丁酯 （20毫克， 0.035mmol) 和三氟乙酸 (0.3毫升） 在室温下搅拌一小时。 TLC (DCM/MEOH=5:l)表明反应完成。 蒸发 TFA， 并 将残余物由 Na2C03碱化并用 DCM萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过预 -TLC纯化， 得到纯的化合物 06A (5毫克， 收率： 30%)， 为黄色固 体， 其结构鉴定数据参见图 17。
实施例 12 KDR8化合物制备
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KDR08
第 1步： 草酸二乙酯 （70毫升） 的混合物加热到 120°C， 加入化合物 1 (50克， 0.4mol)， 并将 混合物加热到 180°C的， 维持 5分钟。 将混合物冷藏过夜， 过滤收集白色沉淀物， 干燥， 从而 得到白色粉末状的化合物 2 (75.0克， 收率： 59.11%)。
步骤 2: 将化合物 2 (25克， 0.11摩尔）溶解在沸腾的二甲苯（1L)中， 缓慢地加入 P2 S 5 (9.5 克， 0.0385摩尔）， 回流， 直到反应完成 （约 5小时）， 再继续回流。 酰胺 TLC (PE/EA=5/1) 表明该反应完成后， 将反应混合物冷却， 并用 INNaOH萃取， 水相用盐酸酸化， 收集黄色沉淀 物， 然后将其溶解在 EtO Ac中， 用 H20洗涤， 用 Na2S04干燥， 并浓缩， 得到的化合物 3 (19 克， 收率： 70.9%) 为一种红色油状物。
步骤 3: 化合物 3 (30克， 0.142摩尔溶于 1N氢氧化钠 （500mL) 中， 用铁氰化钾 （135克， 0.416mol, 在 340ml水中） 氧化， 通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行， 使温度保持 低于 10°C。 在 1小时后， TLC (DCM/MeOH中 =3/1)表明反应完全。 将反应混合物在与水中 稀释， 酸化 （由 2N的 HC1至 pH为 6)， 然后过滤， 得到的化合物 4 (15 g, 收率： 50.48% )。 步骤 4： 化合物 4 ( 1 克， 4.34 毫摩尔） 在 DMF ( 20mL ) 中搅拌溶解， 加入 1 -methyl-5 -(trifluoromethyl)- 1 H-pyrazol-3 -amine (0.717 g, 4.35 mmol),随后加入在室温氮气中加入 HATU (2.47 g, 6.5 mmol)和 DIEA(U2 g, 8.6 mmol)。在相同的的温度下下搅拌过夜后， TLC (PE I EA= 2/1 ) 表明该反应完成。该反应混合物被倾入水中， 并用 EtOAc萃取。洗涤将有机的相， 用盐水洗涤， 在 Na2S04上干燥并浓缩， 得到粗的的产品， 由硅胶色谱法 （PE/ EA洗脱 = 20/1-5/1) 进行纯 化，， 得到纯的化合物 5 (900毫克， 收率： 75.5%)。
步骤 5： -10°C氮气中,在 化合物 5(0.4 g, 1.12 mmol)的 DCM( 10mL)溶液中,加入 BBr 3(10 mL, 4N in DCM )„ 4小时后， TLC (PE/ EA=1/1) 表明反应完成了。 然后反应中加入冰， 过滤除去未溶解的材料。 分离滤液， 用 DCM萃取。 将有机相用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗的的产品， 这进行纯化， 由 TLC得到纯的化合物 6的化合物 （lOOmg, 收率： 26.02%)。
步骤 6: 化合物 6的溶液（50 mg, 0.146 mmol )的 DMF ( lOmL)溶液中加入 K2C03 (70 mg, 0.500 mmol) 和 tert-butyl (6-chloropyrimidin-4-yl)methyl (methyl) carbamate (41.41 mg, 0.161 mmol)。 将反应混合物在 50°C氮气 下搅拌过夜。 TLC (PE/EA=1/1)表明反应完成。 将反应混合物用水洗涤， 用 EA萃取。 有机相用盐洗涤 4 次， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗的的产品， 由 TLC纯化得到纯化合物 7 (40mg,收率： 48.59% )。 第 7步： 化合物 7 (40 mg, 0.071 mmol)和 TFA (0.4 mL)在氮气下室温混合， 搅拌半小时。 TLC (DCM/甲醇 = 10/1)表明反应完成。 将反应混合物蒸发以除去 TFA。 将残余物碱化， 用 Na2C03 碱化至 pH9， 然后用 DCM萃取。 将有机相用盐水洗涤， 硫酸钠干燥， 浓缩， 得到粗产物， 将 其通过 TLC纯化， 得到纯的化合物 8 (20 mg, 收率： 44%)。 其结构鉴定数据参见图 18。 实施例 13 KDR8A化合物制备
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KDR8A
第 1步： 草酸二乙酯 （70毫升） 加热到 120°C， 加入化合物 1 (50克， 0.4mol)， 并将混合物加 热到 180°C， 加热时间为： 5分钟。 冷却后， 混合物在冰箱中过夜， 加入 50毫升水， 然后形成 白色沉淀物。 收集该固体， 干燥， 得到白色粉末状的化合物的 2 (75.0克， 收率： 59.11%)。 步骤 2: 将化合物 2 (25克， 0.11摩尔） 溶解在沸腾的二甲苯 （1L) 中， 缓慢加入 P2S5 (9.5 克， 0.0385摩尔）， 回流， 直到反应完成 （约 5小时）， 再继续回流。 TLC (PE/EA=5/1)表示 反应完成后， 将反应混合物冷却， 并用 INNaOH萃取， 水相用盐酸酸化， 收集黄色沉淀物， 然 后将其溶解在 EtO Ac中， 用 H20洗涤， 用 Na2S04干燥， 并浓缩， 得到的化合物 3 (19克， 收率： 70.9%)， 为红色油状物。
步骤 3:粗化合物 3(30 g, 0.142 mol )溶解在 IN氢氧化钠（500mL)中，用铁氰化钾（135克， 0.416mol， 在 340ml水中） 氧化， 通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行， 使温度保持低于 10°C。 在 1小时后， TLC (DCM I MeOH中= 3/1) 表明反应完全。 将反应混合物在水中稀释， 由 2N 的 HC1调节至 pH为 6， 然后过滤， 得到的化合物 4 ( 15 g， 收率： 50.48% )
步骤 4: 化合物 4 (1克， 4.78毫摩尔） 在 DMF (40毫升） 溶液中加入 3 - (三氟甲基） 苯胺， 随后加入 HATU (2.73克， 7.17毫摩尔）和 DIEA (1.24克， 9.56毫摩尔）， 在室温氮气下搅拌。 在相同的温度下搅拌过夜后 TLC (PE/EA=2/1) 表明反应完成后， 将反应混合物倾入水中， 并用 EtO Ac萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过 硅胶色谱 （与 PE / EA = 20/1-5/1洗脱） 纯化， 得到纯的化合物 5 (1.68克， 收率： 99.0%)。 步骤 5: -10°C在氮气下，化合物 5 (0.1克， 0.283毫摩尔）的 DCM ( 10mL)溶液中加入 4N BBr3
(0.5mL)。 4小时后， TLC (PE/EA的 =1/1)表明反应完成后， 加入冰， 然后过滤以除去所述 未溶解的材料。滤液用 DCM萃取。 用盐水洗涤有机相， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通 TLC纯化， 得到纯的化合物 6 (64 mg, 收率： 66.65%)。
步骤 6: 化合物 6 (64毫克， 0.189毫摩尔） DMF (10毫升）溶液中， 加入 K 2 CO 3 (78毫克， 0.567 毫摩尔） 和叔丁基 （6 - 氯嘧啶 -4 - 基） 甲基 （甲基） 氨基甲酸叔丁酯 （tert-butyl (6-chloropyrimidin-4-yl)methyl (methyl) carbamate ,53毫克， 0.208毫摩尔）。 将反应混合物在氮气下 50 °C搅拌过夜， TLC (PE/EA=1/1) 表明反应完成。 将反应混合物用水洗涤， EA萃取。 洗涤有 机相， 用盐水洗涤四次， 用 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过预 -TLC纯化， 得到纯 的化合物 7 (20 mg, 收率： 19.68%)。 第 7步： 化合物 7 (20毫克， 0.035毫摩尔） 和 TFA (0.2mL) 的混合物， 在氮气下室温搅拌半 小时。 TLC (DCM/MeOH中 = 10/1) 表明反应完成。 将反应混合物蒸发除去 TFA。 将残余物 由 sNa2C03调节 pH为 9， 然后用 DCM萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并 浓缩，得到粗产物，将其通过预 -TLC纯化，得到纯的化合物 KDR08A(12mg， 收率： 73.07%)， 其结构鉴定数据参见图 19、 22。
实施例 14 KDR8B化合物制备
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第 1步： 草酸二乙酯 （70毫升） 的混合物加热到 120°C， 加入化合物 1 (50克， 0.4mol)， 并将 混合物加热到 180°C， 维持 5分钟。 将混合物后冷藏过夜， 形成白色沉淀物。 收集该固体被通 过过滤中， 并干燥， 从而得到为白色粉末状的化合物的 2 (75.0克， 收率： 59.11%)。
步骤 2: 将化合物 2 (25克， 0.11摩尔）溶解在沸腾的二甲苯（1L)中， 缓慢地加入 P2S5 (9.5 克， 0.0385摩尔）， 回流， 直到将反应物完成 （约 5小时） .TLC (PE/EA= 5/1) 表明反应完 成。 该反应混合物冷却， 并用 IN NaOH的萃取， 水相用盐酸酸化， 收集黄色沉淀物， 然后将 其溶解在 EtOAc中， 用 H20洗涤， 用 Na2S04干燥， 并浓缩， 得到的化合物 3 (19克， 收率： 70.9%) 为红色油状物。
步骤 3: 化合物 3 (30克， 0.142mol) 溶解在 IN氢氧化钠 （500毫升） 中， 用铁氰化钾 （135 克， 0.416mol， 在 340ml水中） 氧化， 通过缓慢加入硫代酰胺到铁氰化物溶液来进行， 使温度 保持低于 10°C。 在 1小时后， TLC (DCM I MeOH中= 3/1) 表明反应完成。 将反应混合物在 水中稀释， 酸化（由 2NHC1至 pH为 6，）， 然后过滤， 得到的化合物 4 (15 g， 收率： 50.48%)。 步骤 4: 化合物 4 (1克， 4.78毫摩尔） 的 DMF (20mL)溶液中， 室温氮气下， 搅拌加入 4 - 氟 -3 - (三氟甲基） 苯胺盐酸盐 （4-flu。ro-3-(triflu。romethyl)aniline Hydrochloride， 1.24克， 5.74毫摩 尔）， 随后加入 HATU (2.73克， 7.17毫摩尔） 和 DIEA (1.85克， 14.34毫摩尔）。 在相同的的 温度下搅拌过夜后， TLC (PE/EA=2/1)表明反应完成。将反应混合物倾入水中， 并用 EtOAc 萃取。 用盐水洗涤有机相， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过硅胶色谱 （与 PE/
EA= 20/1 5/1洗脱） 纯化， 得到纯的化合物 5 (1.3克， 收率： 73.4% 步骤 5: 化合物 5 (0.5克， 1.35毫摩尔） DCM (10mL)溶液中， 在 -10°C氮气下， 加入 4NBBr3 (2.5mL), 反应 4小时后， TLC (PE / EA的= 1/1) 表明反应完成。 反应中加入冰， 然后过 滤以除去未溶解的的材料。 分离滤液， 用 DCM萃取。 盐水洗涤有机相， 用 Na2S04干燥并浓 缩， 得到粗产物， 将其通过预 -TLC纯化， 得到纯的化合物 6 (250 mg， 收率： 51.97%)。
步骤 6: 化合物 6 (70毫克， 0.196毫摩尔） 的 DMF (lOmL) 溶液中， 加入 K 2 CO 3 (81.46 毫克， 0.589 毫摩尔） 和叔丁基 （6 - 氯嘧啶 -4 - 基） 甲基 （甲基） 氨基甲酸叔丁酯 （tert-butyl (6-chloropyrimidin-4-yl)methyl (methyl) carbamate ， 55.70毫克， 0.216毫摩尔）， 将反应混合物在 50°C 氮气下搅拌过夜。 TLC (PE/EA= 1/1) 表明反应完成。 将反应混合物用水洗涤， 与 EA萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤 4次， 在 Na2S04干燥并浓缩， 得到粗产物， 将其通过 TLC纯化， 得 到纯的化合物 7 (40毫克， 39.51%)。
第 7步： 化合物 7 (38毫克， 0.071毫摩尔） 和 TFA (0.4毫升） 的混合物， 在氮气室温下搅拌 半小时。 TLC (DCM/MeOH中 = 10/1)表明反应完成。 将反应混合物蒸发除去 TFA。 将残余物 由 Na2C03调节至 pH为 9， 然后用 DCM萃取。 洗涤有机相， 用盐水洗涤， 用 Na2S04干燥并 浓缩， 得到粗产物， 将其通过 TLC纯化， 得到纯的化合物 KDR8B (15毫克， 47.75%)， 其结 构鉴定数据参见图 21。 以下通过试验例具体说明本发明的有益效果。
试验例 1 斑马鱼血管发育抑制试验
斑马鱼 （Daniorerio) 为鲤科（Cyprinidae)短担尼鱼属 （Danio) 的一种硬骨鱼。 其基因与 人类基因的相似度高达 85%， 雌鱼一次可产卵 200〜300枚， 其受精和胚胎发育过程均在体外 进行， 24小时内就可发育成形， 且胚胎通体透明， 便于观察体内器官组织的变化。 诸多特点使 其成为了是国际标准化组织认可的 5种鱼类实验动物之一。 目前， 斑马鱼在人类疾病研究中得 到广泛应用， 用于心血管系统方面的研究尤为多。
实验方法： 该实验使用通常作为筛查化合物对血管形成作用影响的斑马鱼为动物模型。 将 出生后的斑马鱼胚胎经挑选后， 放于培养皿中并置于培养箱中抚育 3-5天， 本发明化合物在斑 马鱼出生后按不同浓度 （1μΜ， 10μΜ, 30μΜ， ΙΟΟμΜ) 直接加入培养液中。 24小时后检查脊椎血 管的发育情况并用荧光显微镜照相。 130B 为帕唑帕尼 （Pazopanib), 作为阳性对照， DMS0作 为阴性对照。
试验结果参见图 1-4、 表 la,lb。
表 la: KDR系列小分子对 FLK-1转基因斑马鱼血管发育的抑制作用
Figure imgf000023_0001
表 lb KDR系列小分子对 FLK-1转基因斑马鱼血管发育的抑制作用
Figure imgf000024_0001
AI:血管抑制率
由图 1-4可知，本发明化合物 KDR4及 V01-v6均能抑制斑马鱼血管发育，尤其是 V01， v3, v6 , 其药效活性显著。
由表 lb可知， 化合物 DKR4的活性明显优于 KDR3、 KDR6、 KDR8和 KDR8A，化合物 V01， V03 的活性明显优于 KDR4。
试验例 2 本发明化合物的药效实验
1. 对 VEGFR2体外抑制试验
检测本发明化合物抑制 VEG F R2激酶磷酸化的实验方法如下：
1 ) 将培养至 P3-P5 HUVEC细胞转移至 6孔板， 每孔约 2*105细胞
2) 待细胞生长至 70-80%， 加入候选小分子抑制剂 (10ηΜ， Ι ΟΟηΜ οΠ μΜ), 孵育 30min
3) 加入 VEGF 50ng/ml进行刺激， 持续 10min
4) 加入非变性裂解液终止反应、 收集细胞裂解液、 进行蛋白定量
5) SDS-PAGE电泳， 转膜， 将膜切下后用 5%脱脂奶配制的 TTBS缓冲液 (Tris-buffered saline/0.01 % Tween 20)封闭 2小时
6) 洗膜， 用抗磷酸化 VEGFR2抗体 (1 :1000稀释)4°〇封闭过夜
7) 第 2天洗膜后用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗与膜共孵育 1小时
8) 洗膜后用化学发光试剂盒 (Millipore)显色， 照相。
试验结果参见图 5。
由图 5可知， 本发明化合物 KDR4及 V01、 V3均能抑制 VEGFR2 , 其中， 化合物 V01、 V3效 果较 KDR4更好。
试验例 3 本发明化合物对脉络膜新生血管的抑制作用
小鼠为 c57/BL， 采用激光诱导的脉络膜新生血管 （Choroidal Neovascularization, CNV) 动物模型进行实验。 此模型目前也是应用最广的一种被用来研究药物对 CNV形成影响的动物模 型。 采用 532激光在 C57/W6小鼠 （每个视网膜 4个激光点） 行激光视网膜光凝来诱导的 CNV 形成。激光实施后立即进行注射： 一只小鼠右眼注射浓度 150uM的 KDR4 , 另一只小鼠右眼注射 浓度 luM的 V01， 两小鼠左眼注射均注射与药物相同体积的 PBS作为对照。 注射后 5天将动物 处死并获取眼球。 去除眼前节、 玻璃体和视网膜后， 制作脉络膜铺片并行 I sol ectin染色。 采 用 Zei ss荧光显微镜系统进行拍照和 CNV面积的测量。 结果见图 6、 图 7。
根据图 6可知， 化合物 KDR4 ( 150uM)、 V01 ( luM) 均能显著抑制脉络膜新生血管形成， 可 有效治疗或缓解湿性黄斑变性。 试验例 4 本发明化合物对激酶的影响
蛋白激酶 （protein kinases) 又称蛋白质磷酸化酶 (protein phosphakinase) 0 一类催化蛋白质 磷酸化反应的酶。 它能把腺苷三磷酸 （ATP) 上的 γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上某 些丝氨酸、 苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上， 从而改变蛋白质、 酶的构象和活性。 蛋白质的磷酸 化是多种信号传导途径的重要环节， 细胞内大部分重要的生命活过程都离不开蛋白质磷酸化。
蛋白激酶分为 5类： 蛋白丝氨酸 /苏氨酸激酶、 蛋白酪氨酸激酶、 蛋白组氨酸激酶、 蛋白色 氨酸激酶和蛋白天冬氨酰基 /谷氨酰基激酶。蛋白激酶在细胞过程的调节和维持起到了重要作 用， 在许多疾病状态中都观察到了激酶活性异常， 所述疾病状态包括： 恶性肿瘤， 免疫性 疾病、 心血管疾病、 糖尿病、 感染性疾病、 关节炎和其它免疫紊乱、 神经系统如老年性痴 呆症,阿默海茨症 AD等， 现已发现与超过 400种人类疾病与蛋白激酶相关。
其中， VEGFR (血管内皮细胞生长因子受体）家族成员为受体酪氨酸激酶，如 VEGFR VEGFR2等， 该类受体在恶性肿瘤的生长、 转移中以及血管增生性疾病 （如黄斑变性、 肿 瘤） 等疾病的发展过程中有重要影响。
PDGFR (血小板衍生生长因子受体）家族成员为受体酪氨酸激酶， 如 PDGFR a和 PDGFR β以及集落剌激因子 1受体、 干细胞生长因子受体 KIT等， 目前也发现该类激酶与肿瘤的 发生、 发展有密切联系。 如 PDGFR的异常表达已在黑色素瘤、 脑膜瘤、 神经内分泌肿瘤、 卵巢癌、 前列腺癌、 肺癌和胰腺癌中有发现， KIT的异常活化则是许多肿瘤发生、 发展的 直接诱因。
1 ) 抑制剂量效应研究
化合物 V01溶解于 100%DMS0中， 稀释为 3组系列浓度， DMS0在最后测试中均保持 1%。 测 试最高浓度为 50 uM。 用非选择性蛋白激酶的活性抑制剂星形孢菌素 （Staurosporine ) 作为参 照， 最高浓度为 1 uM。 结果见表 3、 图 22。
表 2
Figure imgf000025_0001
表 3对 KDR的抑制活性
Figure imgf000025_0002
2 ) 抑制特异性研究
对化合物 V01， 测试了 22种激酶活性抑制试验， 测试浓度为 5 mM， 重复两次， 在 ATP Km 测试。 V01首先溶于 100% DMS0中，溶解浓度为最终测试浓度的 100倍，所有最终测试时的 DMS0 都为 1%。 非选择性蛋白激酶的活性抑制剂星形孢菌素 （Staurosporine ) 作为对照， 测试时用 最大浓度 10mM.
具体试验方法及试剂如下表所示： 表 4
Figure imgf000026_0001
V01对激酶两次试验平均抑制率如下表:
表 5
%
化合 测试浓度（ n [ATP] 平均抑制 星形孢菌素 物 M ) (Km app) 测试激酶 %抑制率 率 测试差值 IC50
V01 5000 130 AKT2 0.69 0.02 0.355 0.67 0.1 1
V01 5000 10 AURORA-B 22.88 21 .55 22.215 1 .33 0.00149
V01 5000 35 BRAF 1 .97 -5.23 -1 .63 7.2 0.0768
V01 5000 50 CDK2 1.72 1 .36 1 .54 0.36 0.00259
V01 5000 50 CHEK1 6.27 5.58 5.925 0.69 0.000385
V01 5000 DMPK 3 1 2 2 0.06
V01 5000 3 EGFR 3.24 1 .47 2.355 1 .77 0.131
V01 5000 75 FGFR2 18.37 13.83 16.1 4.54 0.00357
V01 5000 10 GSK-3- β 1 .39 0.91 1 .15 0.48 0.0197
V01 5000 12 JAK2 3.85 3.46 3.655 0.39 0.000645
V01 5000 80 KDR 100.75 100.39 100.57 0.36 0.00585 V01 5000 400 KIT 68.04 65.36 66.7 2.68 0.00154
V01 5000 50 MAPK3 2.13 -0.27 0.93 2.4 2.1 1
V01 5000 35 MEK1 6.34 1 .39 3.865 4.95 0.00159
V01 5000 45 MET 0.29 5.13 2.71 -4.84 0.181
V01 5000 130 P38- a 25.18 23.06 24.12 2.12 0.0053
V01 5000 30 PDGFR- β 56.2 49.13 52.665 7.07 0.000254
-1 .545959 -3.259553 -2.402756 1 .7135938
V01 5000 50 PI3KA 706 596 651 91 0.006374886
V01 5000 20 PKC- a 4.1 2.57 3.335 1 .53 0.000269
V01 5000 5 ROCK1 4.74 0.38 2.56 4.36 0.00308
V01 5000 25 SRC 3.42 7.03 5.225 -3.61 0.00694
V01 5000 30 SYK 1 .74 -2.88 -0.57 4.62 0.000225 从试验结果可知， V01对蛋白激酶 KDR的抑制率高达 100%， 对其他两种与肿瘤相关的蛋白 激酶也有一定抑制作用， 其中， PDGFR- β抑制率为 52. 7%， KIT抑制率为 68%， 但 V01对其余 蛋白激酶抑制活性绝大部分小于 5%。 由此可见， 和现有研发的小分子激酶抑制剂相比， 本发明 化合物对 KDR具有高特异性和高效率的抑制作用， 且对 PDGFR- β和 KIT这两种与肿瘤有密切关 联的蛋白激酶也有一定的抑制作用， 这就表明化合物 V01对 KDR、 PDGFR- β和 KIT这三种蛋白 激酶异常活化相关的各种肿瘤及老年湿性黄斑变性等疾病均有潜在治疗活性。
3 )新生血管抑制的研究
共测试了 5只鼠. 在眼角膜中央，用 75 %硝酸银溶液和 25 %硝酸钾棒诱导化学烧伤造模。 化学烧伤之后立即在右眼结膜下注射 0. 2ml 化合物 V01， 然后每天滴 0. 2ml 化合物 V01 2次。
7天后眼角膜拍照比较。
由图 23所示， 化合物 V01能显著减少了新生血管和出血。 综上所述， 本发明化合物具有良好的抗血管新生作用， 初步认为该类化合物是通过抑制 VEGFR2 (即 KDR) 产生活性的。 该类化合物可用于对新生血管、 VEGFR2、 PDGFR- β、 KIT 等蛋 白激酶异常所致疾病的治疗， 如湿性黄斑变性、 恶性肿瘤等。

Claims

权利要求书
1、 如式 A所示的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物:
Figure imgf000028_0001
其中， Z。 为 0 或 S; X为 C， Y为 N; ; Z2分别独立选自 N或 -CRS ;
r7 选自氢或 d-C6垸基； ^选自氢或 d-C6垸基； Γι。选自 H、 氨基、 羟基、 巯基、 d-C6垸基或-
(CH2) m Hri , 其中， =l-5， ϋ为 H或 C1-3的垸基；
r9 选自 H、 氨基、 羟基、 巯基、 （C-rur12) nNr13r14、 （C_rur12) n0r15、 (C-rur12)„C (0) Er13
(C-rnrJ ^ W mrn; 或 rs和 ^与它们所连接的原子一起形成饱和的 4_7元杂环或取代杂环， 其 中， 杂环或取代杂环含有 1或 2个选自 N， 0或 S的杂原子， 其取代基为 0， 1， 或 2个， 分别 独立地选自氧代基团， C1-C6垸基， C1-C6卤代垸基， C1-C6垸氧基， C1-C6卤代垸氧基， C 1-C 6垸酰基、 C1-C6垸胺基、 C3-C7环垸基、 卤素， 羟基， 氨基， 羰基， 氨基羰基， C1-C6氨垸基 羰基， C1-C4酰基， C1-C6垸氧基羰基， C1-C6磺酰基， 氨基磺酰基；
Ar2选自苯基， 萘基， 单环或二环杂芳基， 二环或三环杂环基，其中每个杂芳基或杂环基有 1， 2 , 3或 4个选自 N， 0或 S的杂原子； 所述的苯基， 萘基， 杂芳基或杂环基团是未取代或取代的苯 基， 萘基， 杂芳基或杂环基团， 其取代基为 1， 2， 或 3个， 分别独立地选自 C1-C8垸基， C1-C8 卤代垸基， 羟基 C1-C 6垸基， C1-C8垸氧基， C1-C8卤代垸氧基， 卤素， 羟基， 氨基， 氨基 C-C6 垸基， C1-C6垸基氨基， 苯基， C3-C 7环垸基， 螺环的 C3-C7环垸基， 氨基磺酰基， C1-C6 垸基氨基磺酰基；
m 为 0， 1， 或 2 ; n为 0， 1， 2， 或 3 ; E 为空、 氧或 _Nrls ;
rn, r12禾 P rls 是相同或不同的， 分别独立选自氢或 C1-C4垸基； r13， r14， r15， r16和 r17独立选 自氢， C1-C6垸基， C1-C6酰基， 苯基和杂环， 或取代的 C1-C6垸基， C1-C6酰基， 苯基和杂环， 其取代基为为 0、 1或 2个，分别独立选自 C1-C4垸氧基， C1-C4垸基、卤素、羟基、氨基、 C1-C6 氨焼基 °
2、 根据权利要求 1所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征在于： 所述 化合物结构式如下：
Figure imgf000028_0002
其中， X为 C， Y为 N; Ri选自 H、 氨基、 羟基或巯基； R2选自 H、 氨基、 羟基、 巯基或- ( CH2) nNHR8， 其中， n=l-5， 1 8为11或 C1-3的垸基； R3选自 H或 C1-6垸基； R4、 R5、 R6分别独立选自 H、 卤素、 C1-6的垸基或卤素取代垸基； R7选自 H、 C1-6的垸基或卤素；
或者， R2、R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含 1-2个杂原子的五元或六元环， 所述杂原子为 N、 0或 S， 其取代基为 C1-6的垸基。
3、 根据权利要求 2所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征在于： X、 Y 不相同； Ri选自 H或氨基； R2选自 H、 氨基或- ( CH2) nNHR8， 其中， n=l-3， 1 8为11或 Cl-2 的垸基； R3选自 H或 C1-2垸基； 、 R5、 Re分别独立选自卤素、 C1-2的垸基或卤素取代垸基； R7选自 H或卤素；
或者， R2、 R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含 1个 N的五元或六元环， 取 代基为 C1-3的垸基。
4、 根据权利要求 3所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征在于： R2选 自氨基或- ( CH2) n HR8 ; 或者， R2、 R3与其相连的碳原子共同构成取代或非取代的含 1个 N 的五元或六元环， 取代基为 C1-3的垸基。
5、 根据权利要求 1所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征在于： 所述 化合物结构式如下：
Figure imgf000029_0001
化合物为式 II时， Wl、 W2分别独立选自 C或杂原子， n=l或 2; R9为 H、 C1-C4垸基 或卤素； R10为卤素 ； 其中， n=l时， Wl、 W2不同时为 C; 优选地， n=l时， Wl、 W2同时 为杂原子， 杂原子优选为 N; n=2时， Wl、 W2同时为 C;
化合物为式 III时， W3选自 C或杂原子， 杂原子优选为 N; R10为卤素。
6、 根据权利要求 1~5任意一项所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征 在于： 所述卤素为 F或 Cl。
7、 根据权利要求 1-6任意一项所述的化合物及其药学上可接受的盐或前体药物， 其特征 在于： 所述化合物为：
Figure imgf000029_0002
2
Figure imgf000030_0001
、J
V4 V5 V6
Figure imgf000030_0002
KDR6A KDR3 KDR8
Figure imgf000030_0003
KDR8A KDR8B KDR4
8、 权利要求 1-7任意- -项所述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备血管新生 抑制剂类药物中的用途。
9、 根据权利要求 8所述的用途， 其特征在于： 所述血管新生抑制剂为血管内皮生长因子 受体 2抑制剂。
10、根据权利要求 8或 9所述的用途，其特征在于：所述抑制剂是抗眼部血管新生的药物。
11、 根据权利要求 10所述的用途， 其特征在于： 所述药物是脉络膜新生血管抑制剂。
12、 根据权利要求 10或 11所述的用途， 其特征在于： 所述药物是治疗或预防湿性黄斑变 性、 糖尿病视网膜病变或新生血管性青光眼的药物。
13、 权利要求 1-7任意一项所述化合物及其药学上可接受的盐或前体药物在制备 VEGFR2、 PDGFR- β或 /和 KIT抑制剂类药物中的用途。
14、 一种药物组合物， 其特征在于： 它是含有权利要求 1-7任意一项所述化合物及其药学 上可接受的盐或前体药物的眼用制剂。
3
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