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WO2014134750A1 - 2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用 Download PDF

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Publication number
WO2014134750A1
WO2014134750A1 PCT/CN2013/000242 CN2013000242W WO2014134750A1 WO 2014134750 A1 WO2014134750 A1 WO 2014134750A1 CN 2013000242 W CN2013000242 W CN 2013000242W WO 2014134750 A1 WO2014134750 A1 WO 2014134750A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
hydroxymethyl
amino
formula
propyl
Prior art date
Application number
PCT/CN2013/000242
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
王升启
杨静
李爱星
伯晓晨
韩明明
张京玉
李康
齐向云
Original Assignee
中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 filed Critical 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
Priority to CN201380068392.9A priority Critical patent/CN104936959B/zh
Priority to PCT/CN2013/000242 priority patent/WO2014134750A1/zh
Publication of WO2014134750A1 publication Critical patent/WO2014134750A1/zh

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems
    • C07D473/02—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6
    • C07D473/16—Heterocyclic compounds containing purine ring systems with oxygen, sulphur, or nitrogen atoms directly attached in positions 2 and 6 two nitrogen atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to 6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropylindole derivatives and processes for their preparation and use.
  • the cell cycle is a fundamental feature of cell life activities.
  • a complete cell cycle is regulated by a variety of proteases, which can lead to excessive cell proliferation and tumors.
  • Cyclin-dependent kinases (CDKs) are the core of cell cycle regulation.
  • the binding of CDKs to the corresponding cyclins is a necessary condition for the initiation and progression of various molecular events in the cell cycle.
  • Drugs targeting cyclin-dependent kinases (CDKs) block the cell cycle and control cell proliferation for anti-tumor purposes.
  • CDKs cyclin-dependent kinases
  • CDKs rely on binding to cyclins to perform key functions in cell cycle progression; have potential therapeutic effects in proliferative disorders, especially for cancer cells. effect.
  • 2,6,9-trisubstituted guanidine is a selective ATP antagonist of CDKs, one of the small molecule compounds that can specifically inhibit CDK, is a treatment for cancer, neurodegenerative diseases, glomerulonephritis and viral Potential drugs for diseases such as infection.
  • Enterovirus 71 belongs to the Picomaradae Enterovirus and belongs to human enterovirus A. EV71 can cause a wide range of outbreaks, which can be accompanied by severe central nervous system complications or fatal pulmonary edema, and the infection is more serious.
  • EV71 is the latest virus found in the current enterovirus population, which is highly infectious and has a high morbidity, especially in the nervous system.
  • Other polioviruses are highly infectious and has a high morbidity, especially in the nervous system.
  • Enterovirus type 71 (English name: Human enterovirus 71). Referred to as EV71.
  • Coxsackieviruses were first isolated.
  • HFMD hand-foot and mouth disease
  • Human Enterovirus 71 was first isolated from sputum specimens of infants with central nervous system disorders in California in 1969. Humans are the only source of enterovirus infection, and the population is generally susceptible to enterovirus EV71, and immunity can be obtained after infection. Because of the lack of cross-protection of antibodies in different disease prototypes, the population can be repeatedly infected.
  • enterovirus infection has vaccines other than poliovirus, and there are no special treatment drugs for other enterovirus infections. Therefore, clinical treatment of uncomplicated patients can only adopt supportive therapy, but only patients with complications can only be symptomatic. Treatment, take some treatment to reduce intracranial pressure, cooling, and adjuvant antiviral. So far, the anti-EV71 virus treatment has only broad-spectrum antiviral drugs such as ribavirin, but the antiviral effect is general. Therefore, effective methods for preventing and controlling the EV71 virus have become a top priority. Based on the above analysis, the study of new anti-EV71 virus-infected drugs with high specificity and low toxicity has important practical significance for the treatment and prevention of EV71 virus infection and its related diseases.
  • (R)-6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropylindole is a cyclin-dependent Selective inhibitors of CDC2/cyclin B, CDK2/cyclinA, CDK2/cyclin E, and CDK5/p35 in the cyclin-depend kinases (CDKs) family.
  • the object of the present invention is to provide a 2,6,9-trisubstituted indole-6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropylindole derivative and A pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 2 is a hydrogen atom and is selected from any one of the group consisting of: (RM1-hydroxymethyl)propyl, (SMi-hydroxymethyl)propyl, (RM1-hydroxymethyl)ethyl, (SM1-hydroxymethyl)ethyl, 2-hydroxyethyl, 2-hydroxypropyl, 2-aminoethyl, 6-hydroxyhexyl, 1-hydroxymethyl-2-hydroxyethyl, 2-hydroxy- 1-methyl-1-(hydroxymethyl)ethyl, 2,3-dihydroxypropyl, 1-(hydroxymethyl)ethylphenethyl and [(hydroxymethyl)ethyl-2-methyl ] propyl; or 3 ⁇ 4 and both are hydroxyethyl or isopropylhydroxy.
  • R 3 is selected from any one of the following groups: a benzylamino group, a substituted benzylamino group, a decylamino group, and a 2-thienylmethylamino group; any position on the benzene ring in the substituted benzylamino group is any of the following One group is substituted: fluorine atom, chlorine atom, methoxy group, methyl group, ethyl group, isopropyl group and trifluoromethyl group.
  • the compound represented by the above formula I may be specifically selected from any one of the following:
  • Compound 65 6-[(3-Methylanilino)]-2-(2-hydroxyethylamino)-9-ethylindole; Compound 66 6-[(4-isopropylanilino)]-2- (2-hydroxyethylamino)-9-ethylhydrazine; Compound 67 6-[(N-methylanilino)]-2-(2-hydroxyethylamino)-9-ethylanthracene; Compound 68 6 - [(3,4-Dimethoxybenzyl)amino]-2-(2-hydroxyethylamino)-9-ethylhydrazine.
  • the pharmaceutically acceptable salt of the compound of the above formula I is a salt of a compound of the formula I with a suitable acid or base.
  • the acid is: a mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid; an organic carboxylic acid such as unsubstituted or substituted
  • alkanecarboxylic acids such as: saturated or unsaturated dicarboxylic acids, specifically oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, Phthalic acid or tetraphthalic acid, hydroxycarboxylic acid, specifically ascorbic acid, glycolic acid, lactic acid, malic acid, tartaric acid or citric acid; amino acid, such as aspartic acid or glutamic acid; benzoic acid; or organic sulfonic acid For example, (C1-C4) mercaptosulfonic acid or arylsulfonic acid, which is unsubstituted or substituted (e.g., halogenated), specifically methanesulfonic acid or p-toluenesulfonic acid.
  • alkanecarboxylic acids such as: saturated or unsaturated dicarboxylic acids, specifically oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, Phthalic acid
  • the compound of the formula I provided by the present invention is prepared by substituting 2,6-dichloropurine as a raw material for the 2, 6, and 9 positions.
  • the chemical reaction flow chart of the preparation method is shown in FIG.
  • the specific preparation method includes the following steps:
  • R 3 in Formula II has the same definition as Formula I, and Formula I has the same formula I.
  • R 3 H may specifically be: benzylamine, a substituted benzylamine, furfuryl amine, or 2-thienyl methylamino.
  • the substituted benzylamine includes 3-fluorobenzylamine, 4-fluorobenzylamine, 2-fluorobenzylamine, 2-methoxybenzylamine, 3-methoxybenzylamine, 2-chlorobenzylamine, 4-methyl Oxybenzylamine, 3,4-difluorobenzylamine, 3,4-dimethoxybenzylamine, and the like.
  • X represents halogen (such as chlorine, bromine, iodine), and X may specifically be: methyl iodide, ethyl bromide, bromopropane, bromocyclopropane, bromocyclopropane, Bromobutyl hydrazine, benzyl chloride or 4-bromobutyronitrile.
  • halogen such as chlorine, bromine, iodine
  • Ri and R 2 in the NH R2 is the same as the formula I, NHR, and R 2 may specifically be: (R)-aminobutanol, (S)-aminobutanol, (R)-aminopropanol, diethanolamine, 2-hydroxypropylamine, ethylenediamine, diisopropanolamine, aminohexanol, L-prolinol, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol, 3-amino-1,2-propanediol, D-Benzenol or 2-amino-1, 3-propanediol.
  • the reaction described in the above step 1) is carried out in a butanol (BuOH) solvent.
  • the reaction temperature of the reaction was 80 110. C, specifically 90 ° C.
  • the reaction described in the above step 2) is carried out in a dimethyl sulfoxide (DMSO) solvent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the reaction also requires the addition of a base as an acid binding agent, and the base may specifically be potassium carbonate, sodium carbonate or the like.
  • the reaction described in the above step 3) is carried out in an inert atmosphere.
  • the reaction temperature of the reaction is 140 170 'C, specifically 160 ⁇ ; and the reaction time is 5 h - 8 h.
  • Another object of the invention is to provide the use of a compound of formula I.
  • the use of the compound of formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof provided by the present invention includes the following aspects: First, it can be used for the preparation of a preventive and/or therapeutic EV7K enterovirus 71 virus (Human enterovirus 71) infection.
  • the drug can be used to prepare eukaryotic tumor cell proliferation inhibitors; third, it can be used to prepare drugs for preventing and/or treating tumors; and fourth, it can be used for preparing cyclin-dependent kinase (CDKs) inhibitors.
  • CDKs cyclin-dependent kinase
  • the eukaryotic organism is a mammal; the tumor cell is a cancer cell; the cancer cell is a liver cancer cell, a swollen cancer cell, a breast cancer cell, a cervical cancer cell or a laryngeal cancer cell; and the liver cancer cell is a human liver cancer cell HepG -2 or human liver cancer cell PLC/PRF/5, the lung cancer cell is specifically human lung cancer cell A549, and the breast cancer cell is specifically human breast cancer cell MCF-7 or human breast duct cancer cell BT-474, the cervical cancer cell Specifically, it is human cervical cancer cell Hela, and the laryngeal cancer cell is specifically human laryngeal carcinoma epithelial cell Hep-2.
  • the tumor is cancer, and the cancer is specifically at least one of the following: liver cancer, lung cancer, breast cancer, cervical cancer, and laryngeal cancer.
  • the present invention demonstrates, by in vitro cell assay, a compound of formula I (ie, a small molecule selective inhibitor of CDKs 6-(amino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropyl Anthraquinone derivatives can effectively inhibit the growth of a variety of tumor cells and can be developed into anti-tumor drugs.
  • a compound of formula I ie, a small molecule selective inhibitor of CDKs 6-(amino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropyl
  • Anthraquinone derivatives can effectively inhibit the growth of a variety of tumor cells and can be developed into anti-tumor drugs.
  • Preferred compounds having antitumor effects among the compounds of the formula I may be the above compounds 4, 5, 6, 25, 26, 27, 46, 48, 49, 52, 53 and 54.
  • Compound 52 Compound 53 Compound 4 Compound 26 Compound 27
  • the present invention demonstrates, by animal experiments, a compound of formula I (i.e., CDKs small molecule selective inhibitor 6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl) The amino]amino]-9-isopropyl hydrazine derivative has a remarkable anti-EV71 virus action in vivo and can be developed into a drug for treating and preventing EV71 (Human enterovirus 71) infection.
  • the amino]amino]-9-isopropyl hydrazine derivative has a remarkable anti-EV71 virus action in vivo and can be developed into a drug for treating and preventing EV71 (Human enterovirus 71) infection.
  • Preferred compounds of formula I are compounds having anti-EV71 viral activity:
  • the medicament for preventing and/or treating EV71 virus infection and the medicament for preventing and/or treating tumors prepared by using the compound of the formula I as an active ingredient are also within the scope of the present invention.
  • the drug can be introduced into the body such as muscle, intradermal, subcutaneous, intravenous, mucosal tissue by injection, jetting, nasal drops, eye drops, infiltration, absorption, physical or chemical mediated methods; or mixed or wrapped by other substances. Import the body.
  • One or more pharmaceutically acceptable carriers may also be added to the above drugs as needed.
  • the carrier includes conventional diluents, excipients, fillers, binders, wetting agents, disintegrating agents, absorption enhancers, surfactants, adsorption carriers, lubricants and the like in the pharmaceutical field.
  • the medicament prepared by using the compound of the formula I or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient can be prepared into various forms such as an injection, a suspension, a powder, a tablet, a granule, and the like.
  • the above various dosage forms of the drug can be prepared according to a conventional method in the pharmaceutical field.
  • the medicament provided by the invention includes pharmacokinetics, pharmacokinetics, mode of administration, route of administration, age of recipient, body weight, liver and kidney function state, nature, degree of treatment and treatment time limit of the specific drug according to different situations. Etc., administered at a suitable dose.
  • Figure 1 is a flow chart showing the chemical reaction of the compound of the formula I of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the inhibitory activity of the compound of Formula I on cyclin-dependent kinase.
  • Figure 3 is a graph showing the effect of compounds 4, 5, 25, 26 on the survival rate of mice infected with EV71 virus.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of compounds 48, 49, 52, 53 on the survival rate of EV71 virus-infected mice.
  • Figure 5 is a graph showing the effect of Compound 27 on the survival rate of EV71 virus-infected mice.
  • Figure 6 is a graph showing the effect of compounds 4, 5, 25, 26 on the body weight of mice infected with EV71 virus.
  • Figure 7 is a graph showing the effect of compounds 48, 49, 52, 53 on the body weight of mice infected with EV71 virus.
  • Figure 8 is a graph showing the effect of Compound 27 on the body weight of mice infected with EV71 virus.
  • 2,6-Dichloroindole (10 g, 52.91 mmol) and n-butanol (150 ml) were added to a 250 ml one-necked flask, and the mixture was heated to 90 ° C to dissolve it, and triethylamine (14 ml, 100.44 mmol) was added. 6.7 ml, 61.36 mmol), after reacting for 10 min, a white solid precipitated, and after the reaction was continued for 3 hours, the heating was stopped. After cooling to 5-10 ° C, filter.
  • the structure confirmation data is as follows: CCH 3 ), 3.52 (m,
  • 2,6-Dichloroindole (10 g, 52.91 mmol) and n-butanol (150 ml) were added to a 250 ml one-necked flask, and heated to 90 ° C to dissolve.
  • Triethylamine 14 ml, 100.44 mmol
  • the benzylamine (7 ml, 61.36 mmol) was reacted for 10 min, and then a white solid was precipitated. After the reaction was continued for 3 hours, the heating was stopped. After cooling to 5-10 ° C, filter.
  • the structure confirmation data is as follows:
  • the HepG2 cell culture medium was a DMEM (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum. A maintenance solution containing 2% fetal calf serum was used before the addition of the derivative. 6-(Benzyl)- 2 ⁇ [[i-(hydroxymethyl)propyl]nitro] -9 ⁇ isopropyl hydrazine derivative was dissolved in DMSO to 20 mM, and diluted to lmM with PBS. Store at -20 °C for later use.
  • DMEM fetal bovine serum
  • Hepatoma cells HepG2 were cultured in a medium containing 10% fetal bovine serum (GIBCO) at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. The cells were observed to have good growth state. After culturing to logarithmic growth phase, the cells were seeded at 8000-10000 cells/well into 96-well cell culture plates, and 75-80% of the cells were overfilled the next day.
  • the compound of formula I i.e., 6-(nitroxymethylmethyl)propyl]amino] ⁇ 9-isopropylindole derivative
  • DMEM fetal bovine serum
  • the compounds of formula I were separately added to a 96-well plate at a concentration gradient of 10 and 20 ⁇ M, three replicate wells were set for each sequence, and a tumor cell control group was established, and cultured at 37 ° C for 2 days. The effect of the compound of formula I on cell morphology was observed under the microscope.
  • the degree of cytopathic effect (expressed as OD450) was measured on a microplate reader (BIO-RAD product, model: 680) using the Cell Counting Kit-8 (DoJinDo product) method, and the tumor inhibition rate of the drug was calculated by the following formula: (OD Tumor cell-OD assay) / OD tumor cell X 100. The test was repeated twice and the average was calculated.
  • Example 7 examines the normal cytotoxic effects of the primary screening compounds 4, 5, 6, 25, 26, 27, 46, 48, 49, 52, 53, 54 on BHK-21 and its CC 5 o
  • the BHK-21 cell culture medium is a DMEM (GIBCO) culture medium containing 7% fetal calf serum. A maintenance solution containing 0.7% fetal bovine serum was used before the addition of the derivative. 6 benzylidene) ⁇ 2 ⁇ [[1-(hydroxymethyl)propyl]nitro]-9-isopropylindole derivative was dissolved in DMSO to 20 mM, and diluted to lmM with DMEM (GIBCO) medium. Store at -20 °C after use.
  • DMEM DMEM
  • BHK-21 cells were plated in a 96-well cell culture plate, which was 75 to 80% over the next day. Replace 75-80% of BHK-21 cells with maintenance solution containing 0.7% fetal bovine serum.
  • the 6 benzylidene) ⁇ 2 ⁇ [[1-(hydroxymethyl)propyl]amino] 9 isopropyl hydrazine derivatives were respectively set up with five concentration gradients of 20, 40, 80, 160, 320 ⁇ , each concentration was established.
  • Three duplicate wells were established, and BHK-21 cells without drug were established as a negative control group. The cells were cultured at 37 °C for 2 days, and 6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl] was observed under the microscope.
  • Example 8 Investigating the growth inhibitory effects of compounds 4, 5, 6, 25, 26, 27, 46, 48, 49, 52, 53, 54 on various tumor cells and their half-inhibitory concentration IC 5 o
  • the A549 cell culture medium is a F12K (GIBCO) culture medium containing 10% fetal bovine serum.
  • HepG2, MCF-7, Hela, PLC/PRF/5 cell culture medium is DMEM (GIBCO) medium containing 10% fetal bovine serum.
  • the BT-474 cell culture medium was a RPMI 1640 (GIBCO) culture medium containing 10% fetal bovine serum.
  • the HCT-116 cell culture medium was a MCCOY' 5A (GIBCO) medium containing 10% fetal calf serum.
  • Hep-2 The cell culture medium was a MEM (GIBCO) culture medium containing 10% fetal bovine serum.
  • a maintenance solution of the corresponding 2% fetal calf serum was used before the addition of the derivative.
  • Tumor cells were cultured in a medium containing 10% fetal calf serum (GIBCO) at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. The cells were observed to have good growth state. After culturing to logarithmic growth phase, the cells were seeded at 8000-10000 cells/well into 96-well cell culture plates, and 75-80% of the cells were overfilled the next day. Dilute 6 amino groups of -24[1 hydroxymethyl)propyl]amino]-isopropyl hydrazine derivative to 200 ⁇ M in DMEM.
  • GEBCO fetal calf serum
  • the 6-(benzylidyl)-2-[[i(hydroxymethyl)propyl])yl]-9-isopropylindole derivatives were set to 2.5, 5, 10, 20, 40 ⁇ five concentration gradients.
  • the cells were placed in a 96-well plate, and three replicate wells were set in each sequence, and a tumor cell control group was established, and cultured at 37 ° C for 2 days.
  • Roscovitine i.e. (RHK benzyl-based 2-[[1-(hydroxymethyl)propyl)]] isopropyl] oxime
  • IC 5Q and its therapeutic index TI in the above 7 tumor cells are shown in Table 10. .
  • the TI value is greater than roscovitine:
  • TI values greater than roscovitine:27 in 4 cells Hela, HepG2, MCF-7, PLC/PRF/5)
  • TK ⁇ H7 Anti-phospho Cdc7 T376 Monoclonal Antibody TK-H7
  • the reaction well was sealed with sealing paper, and after incubation for 30 min at 25 ,, the liquid in the well was removed, the plate was washed 5 times, and the kit of ⁇ .1 was added.
  • HRP-conjugated anti-mouse IgG HRP-conjugated Anti-mouse IgG
  • seal the reaction well with sealing tape > 25 V freshly incubated for 30 min, remove the liquid in the well, wash the plate 5 times, add ⁇ color
  • the inhibition rate of the drug to the kinase was calculated by the following formula: (OD solvent control - OD test) / OD solvent control xl 00.
  • the animal model was SPF grade 7-day-old ICR suckling rat, and the EV71 strain was the international standard strain BrCr strain.
  • the positive control drug was IFNa-2a.
  • mice 12 litters of SPF-class 7-day-old ICR suckling mice were ordered and weighed and grouped before the start of the experiment. The mice were each set up with 6-(benzylidene)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]nitro]isopropyl hydrazine derivatives 4, 5, 25, 26, 27, 48, 49, 52 53 groups, the dose was 4mg/kg/d, and the normal saline control group, EV71 virus infection control group and IFNa-2 a positive drug control group were established.
  • mice that had been grouped, first disinfected with iodophor at one side of the mouse, then disinfected with 75% alcohol, and then injected with the corresponding dose of saline, virus or drug according to body weight.
  • the normal saline control group was injected with five days of normal saline; the virus group was injected with the virus on the first day, and the same dose was administered to the normal saline for the next four days; IFNa- 2a positive drug control group and 6-(benzylidene)-2-
  • a certain amount of EV71 virus was injected according to the body weight, and the drug was injected 1 hour later, and the drug was continuously administered for four days. After 2 weeks of continuous observation, the body weight was weighed daily and the survival rate was calculated.
  • RESULTS The EV71 virus-infected control group began to die at 6 days after virus infection, and the survival rate decreased to 20% on the 14th day after infection. 6 Benzylamino 2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]isopropyl
  • the ruthenium-based derivative 4 administration group showed no significant effect, while the derivatives 5, 25, 26, 48, 49, 52, 53, 27 groups showed significant protective effects, and the survival rate on the 14th day after infection. 80%, 100%, 80%, 83,3%, 911%, 81.8%, 100% and 100%, respectively, are above 50% ( Figures 3, 4, 5).
  • the present invention obtains a series of modifications of the groups 2, 6, and 9 in 6-(benzylamino)-2-[[1-(hydroxymethyl)propyl]amino]-9-isopropyl hydrazine. Derivatives. And it has been proved by in vitro and in vivo experiments that it can effectively inhibit the activity of CDK1 and inhibit the growth of various tumor cells, and has a significant anti-EV71 virus effect, which can prevent and/or treat EV71 (intestinal virus type 71) virus ( Human enterovirus 71) Infects and anti-tumor provides new and effective drugs.

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Abstract

提供式I所示的2,6,9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用，其中R1、R2、R3和R4如说明书中所定义。体外细胞试验证明所述化合物能有效抑制多种肿瘤细胞的生长，可发展为抗肿瘤药物；动物实验证明所述化合物在体内具有显著的抗EV71病毒作用，可发展为治疗和预防EV71病毒感染的药物。

Description

2 ,6, 9-三取代嘌呤衍生物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及 6- (苄氨基） -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物及其制 备方法与应用。
背景技术
癌症是世界范围内引起死亡的主要原因，其发病率还在不断上升。每年有 1270 万人会发现自己患有癌症， 有 760万人因此死亡。美国癌症学会负责人约翰 ·塞弗 林说，如今全球 8名死者中就有 1人死于癌症。据 WHO报告预计，在全球范围内， 新增癌症病例和癌症患者死亡率也将会以每年 1 %的速度递增， 而在中国、 俄罗斯 和印度这些国家增长速度会更快。 报告说： "全球癌症患者在上世纪最后 30年里 翻了一番， 估计这一数字在 2020年前将再翻一番， 2030年前将增至上世纪最后 30 年的 3倍。 "这意味着到 2030年， 全球将新增 2700万癌症病例， 死于癌症的人数 将达到 1700万人。 美国临床肿瘤学协会主席道格拉斯 ·布雷尼在一份声明中写道: "很多人没有意识到， 在一些贫困国家， 由癌症导致的死亡人数已经超过了死于艾 滋病、 疟疾和结核病的人数总量。
在中国， 每年有 160万癌症患者。 世界卫生组织预测癌症将是 21世纪的人类 的 "头号杀手" 。 癌症治疗的方法主要可分为三个大类： 外科手术切除、 局部放 射治疗（放疗）和使用药物的化学治疗（化疗） 。 癌症的化学治疗近年来有飞速发 展， 新抗癌药不断出现。 以前， 临床治疗中使用的药物有垸化剂、 代谢抑制剂、 植 物的生物碱等抗癌剂、 抗生素、 免疫促进剂、 免疫调节剂等多种， 但是这些药物治 疗还不能说是很成熟。
细胞周期是细胞生命活动的基本特征。一个完整的细胞周期受多种蛋白酶的调 控，调控失调会导致细胞过度增殖，从而引发肿瘤。细胞周期依赖性蛋白激酶（ cyclin- dependent kinases, CDKs )是细胞周期调控机制的核心， CDKs与相应的细胞周期素 ( cyclin)结合是细胞周期各类分子事件的启动和进行的必要条件。 以细胞周期蛋白 依赖性激酶 (CDKs)为靶点的药物可以阻断细胞周期， 控制细胞增殖， 从而达到抗肿 瘤的目的。 研究发现细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs)依赖与细胞周期蛋白的结 合来执行细胞周期有序进行中的关键功能； 在增殖紊乱方面有潜在的治疗作用的， 尤其对癌细胞有相当好的治疗效果。当缺乏细胞周期蛋白质或 CDK抑制物存在时， 它们即失去活性， 细胞增殖停滞， 甚至死亡。 2,6,9-三取代嘌呤是 CDKs的选择性 ATP拮抗剂， 是可以专一性抑制 CDK的小分子化合物中的一种， 是治疗癌症、 神 经退行性疾病、 血管球性肾炎和病毒性感染等疾病的潜在药物。 肠道病毒 71型 （EV71 )属于小 RNA病毒科（Picomaradae)肠道病毒属 (Enterovirus) 的成员， 归属于人类肠道病毒 A。 EV71可导致大范围的暴发流行， 可伴有严重的中枢神经系统并发症或致死性肺水肿， 其感染危害比较严重。
EV71为目前肠病毒群中最晚发现的病毒， 其感染性强且致病率高， 尤其是神 经系统方面的并发症。 其它同属于肠病毒群之病毒尚包括小儿麻痹病毒
(Polioviruses; 具 3种型别） 、 柯萨奇病毒 （Coxsackieviruses; A型具有 23 种型 别、 B型具有 6种型别） 、 伊科病毒 （Echoviruses; 具 31 种型别）及肠病毒
(Enteroviruses 68〜72型） 。 肠道病毒 71型 （英文名为： Human enterovirus 71 ) 。 简称 EV71。 1957年， 新西兰首次爆发大规模疫情并报道。 1958年， 首次分离出柯 萨奇病毒 (Coxsackieviruses)。 1959年，有了手足口病 (hand - foot and mouth disease; HFMD) 的命名。 人类肠病毒 71型 1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾 病的婴儿粪便标本中分离出来的。 人是肠道病毒唯一的传染来源， 人群对肠道病毒 EV71普遍易感， 感染后可获得免疫力。 由于不同病原型别感染后抗体缺乏交叉保 护力， 因此， 人群可反复感染发病。 而且， 该病易于传播， 容易发生流行， 预防控 制难度大。 20世纪 70年代中期， 保加利亚、 匈牙利等国家相继暴发以中枢神经系 统疾病为主要临床特征的 EV71型手足口病流行， 并导致较高的病死率和致残率。 1997年以来， EV71感染为主的手足口病在马来西亚、 中国台湾、 新加坡等地大规 模暴发流行。 1998年中国台湾发生迄今最大的一次主要为 EV71型手足口病流行， 共报告 129106例手足口病或疱疹性咽峡炎病例， 其中重症患 1405例， 死亡 78例。 中国内地自 1981年在上海始见本病， 此后北京、 河北、 天津、 福建、 吉林、 山东、 湖北及广东等十几个省市均有 EV71型手足口病的发生和流行。近年来， EV71的流 行在亚太地区呈上升趋势， 其中最令人关注的是该地区的 EV71感染出现越来越严 重的中枢神经系统症状。但其产生中枢神经系统症状的机制、 病毒结构特征与毒力 的关系目前还不明确， 且缺乏有效预防其感染的药物。 2008年 3月 10日至 5月 31 日短短时间内安徽阜阳共报告手足口病 7470例， 共发现 111例重症病例， 其中死 亡 23例， 病死率 0.31 %。
目前肠病毒感染除了小儿麻痹病毒有疫苗外， 其余肠病毒感染并无特殊治疗药 物， 故临床上对无并发症患者之治疗只能采取支持性疗法， 而对有并发症的患者也 只能对症治疗，采取一些降低颅压、降温、辅助抗病毒等的治疗。 目前为止抗 EV71 病毒的治疗药物仅利巴韦林等广谱抗病毒药物， 但抗病毒疗效一般。 所以， 有效的 预防和控制 EV71病毒的方法已成当务之急。 根据以上分析， 研究特异性高、 毒副 作用小的新型抗 EV71病毒感染的药物对治疗与预防 EV71病毒感染及其相关性疾 病具有重要现实意义。
(R)-6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤是细胞周期蛋白依赖激 酶 (cyclin-depend kinases, CDKs)家族中 CDC2/cyclin B、 CDK2/cyclinA、 CDK2/cyclin E、CDK5/p35的选择性抑制剂。近年来，对 (R) 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9- 异丙基嘌呤生物化学特性及细胞生物学效应的研究发现， 其能够通过选择性地替代 CDK与 ATP结合部位的 C2、 N6、 N9位上的腺嘌呤结合， 从而阻滞哺乳类动物细 胞周期 G1— S和 G2— M转换， 使细胞在 G2期积累， 最终导致死亡。 在体外细胞 试验中对多种肿瘤细胞有生长抑制作用。 2009年， Cyclacel公司已完成 (R)-6- (苄氨 基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤抗肿瘤的二期随机临床试验。 在抗病毒 研究方面， 目前，还没有关于 (R)-6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤 抗 EV71等引起手足口病病毒感染的报道。
发明公开
本发明的目的是提供一种 2,6,9-三取代嘌呤 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨 基] -9-异丙基嘌呤衍生物及其药学上可接受的盐。
本发明所提供的衍生物的结构 I所示：
Figure imgf000004_0001
(式 I)
其中， R2为氢原子且 选自下述基团中的任意一种： (RM1-羟甲基)丙基、 (SMi- 羟甲基)丙基、 （RM1-羟甲基)乙基、 （SM1-羟甲基)乙基、 2-羟基乙基、 2-羟基丙基、 2-胺基乙基、 6-羟基己基、 1-羟甲基 -2-羟基乙基、 2-羟基 -1-甲基 -1-(羟甲基)乙基、 2， 3-二羟基丙基、 1- (羟甲基)乙基苯乙基和 [(羟甲基)乙基 -2-甲基]丙基； 或 ¾和 均为羟乙基或异丙羟基。
R3选自下述基团中的任意一种： 苄氨基、取代的苄氨基、糠氨基和 2-噻吩基甲 胺基； 所述取代的苄氨基中苯环上的任意位置被下述任意一个基团取代： 氟原子、 氯原子、 甲氧基、 甲基、 乙基、 异丙基和三氟甲基。
选自下述基团中的任意一种： 甲基、 乙基、 丙基、环丙基、环丙甲基、 丁基、 苄基、 丁腈基。
上述式 I所示的化合物具体可选自下述任意一种：
化合物 01 (S) -6- (苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-甲基嘌呤； 化合物 02 (R) -6- (苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-甲基嘌呤； 化合物 03 6- (苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-甲基嘌呤；
化合物 04 (S) -6- (苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 05 (R) -6- (苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 06 苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤;
化合物 07 苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丙基嘌呤； 化合物 08 苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丙基嘌呤； 化合物 09 基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-丙基嘌呤；
化合物 10 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-环丙甲基基嘌呤; 化合物 11 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-环丙甲基嘌呤； 化合物 12 ,基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-环丙甲基嘌呤；
化合物 13 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丁基嘌呤； 化合物 14 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丁基嘌呤； 化合物 15 ,基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-丁基嘌呤；
化合物 16 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-苄基嘌呤
化合物 17 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-苄基嘌呤
化合物 18 基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-苄基嘌呤；
化合物 19 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丁腈基嘌呤； 化合物 20 苄氨基) "2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-丁腈基嘌呤； 化合物 21 基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-丁腈基嘌呤；
化合物 22 :3-氟苄氨基) _2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9- -甲基嘌呤; 化合物 23
Figure imgf000005_0001
3-氟苄氨基) _2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9- -甲基嘌呤; 化合物 24 3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-甲基嘌呤；
化合物 25 3-氟苄氨基) _2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9- -乙基嘌呤; 化合物 26 3-氟苄氨基) _2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9- -乙基嘌呤; 化合物 27 3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 28 3-氟苄氨基) _2[[( -羟甲基)丙基]氨基] -9- -丙基嘌呤; 化合物 29
Figure imgf000005_0002
:3-氟苄氨基) _2[[( -羟甲基)丙基]氨基] -9- -丙基嘌呤; 化合物 30 3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-丙基嘌呤;
化合物 31 3-氟苄氨基) _2[[( -羟甲基)丙基]氨基] -9-环丙甲基基嘌 化合物 32 _6-(3-氟苄氨基) -2[[( -羟甲基)丙基]氨基] -9-环丙甲基嘌呤; 化合物 33 3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基 )-9-环丙甲基嘌呤；
化合物 34 _6-(3-氟苄氨基) -2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9-丁基嘌呤； 化合物 35 6_(3-氟苄氨基) -2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9-丁基嘌呤； 化合物 36 3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基 )-9-丁基嘌呤；
化合物 37 _6-(3-氟苄氨基) -2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤； 化合物 38 6_(3-氟苄氨基) -2[[( 羟甲基)丙基]氨基] -9-苄基嘌呤； 化合物 39 6- (3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-苄基嘌呤；
化合物 40 (S) -6- (4-氟苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 41 (R) -6- (4-氟苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 42 6- (4-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 43 (S) -6- (4-氟苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 44 6- (4-氟苄氨基) -2- [ (6-羟基己基)氨基] -9-乙基嘌呤；
化合物 45 6- (苄氨基) 2- [ (6-羟基己基]氨基] -9-乙基嘌呤；
化合物 46 6- (3-氟苄氨基) -2- [N， N-二羟乙基氨基 ] -9-乙基嘌呤；
化合物 47 6- (3-氟苄氨基) -2- [ [1- (羟甲基）乙基苯乙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 48 6- (3-氟苄氨基) -2 [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] _9_乙基 呤；
化合物 49 6- (3-氟苄氨基) -2 [ [2， 3-二羟基丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 50 6- (3-氟苄氨基) -2 [ [ [ (羟甲基）乙基 -2-甲基]丙基]氨基] -9-乙基嘌 化合物 51 6- (3-氟苄氨基) -2 [ [ (1-羟甲基) -2-羟基乙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 52 6- (苄氨基) -2 [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌 化合物 53 6- (苄氨基) -2- [ (2， 3-二羟基丙基)氨基] -9-乙基嘌呤；
化合物 54 6- (苄氨基) -2- [N, N-二羟乙基氨基] -9-乙基嘌呤；
化合物 55 6- [ (2-氯苄基)氨基] -2- [ (2-羟乙基)氨基 -9-乙基嘌呤； 化合物 56 6- [ (2-甲氧基苄基)氨基] -2- [ (2-羟乙基)氨基 -9-乙基嘌呤； 化合物 57 6- [ (3-甲氧基苄基)氨基] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 58 6- [ (4-三氟甲基苄基)氨基] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 59 6- [ (3， 5-二氟苄基)氨基] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 60 6-呋喃基甲胺基 -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 61 6- (2-噻吩基甲氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 62 6- [ (3-氟苄胺基] -2- (2-羟丙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 63 6- [ (3-氟苄胺基) ] -2- (2-胺乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 64 6- [ (3-氟苄胺基) ] -2-二 (2-羟丙基氨基) -9-乙基嘌呤；
化合物 65 6- [ ( 3-甲基苯胺基) ] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 66 6- [ (4-异丙基苯胺基 ) ] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 67 6- [ (N-甲基苯胺基) ] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤； 化合物 68 6- [ (3， 4-二甲氧基苄基)氨基] -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤。 上述式 I所示的化合物药学上可接受的盐为式 I所示的化合物与合适的酸或碱 形成的盐。 所述酸为： 无机酸， 如盐酸、 硫酸或磷酸； 有机羧酸， 如未取代或取代
(如被卤代） 的 1至 4个碳原子链烷羧酸， 例如： 饱和或不饱和的二元羧酸， 具体 为草酸、 丙二酸、 丁二酸、 马来酸、 富马酸、 邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸， 羟基羧 酸， 具体为抗坏血酸、 羟基乙酸、 乳酸、 苹果酸、 酒石酸或柠檬酸； 氨基酸， 例如 天冬氨酸或谷氨酸； 苯甲酸； 或有机磺酸，如未取代或取代（如被卤代）的（C1 -C4) 垸基磺酸或芳基磺酸， 具体为甲磺酸或对甲苯磺酸。
本发明提供的式 I所示化合物是以 2,6-二氯嘌呤为原料， 对其 2、 6、 9位进行 取代制备得到的。 其制备方法的化学反应流程图如图 1所示。
具体制备方法包括下述歩骤：
1 ) 使 2，6-二氯嘌呤与 R3H进行反应， 得到式 II所示的化合物；
2 ) 使式 II所示的化合物与 X迸行反应， 得到式 III所示的化合物；
3 ) 使式 III所示 H R2进行反 式 I所示的化合物；
Figure imgf000007_0001
(式 II ) (式 ΙΠ)
其中， 式 II中 R3的定义同式 I， 式 ΙΠ中 的定义同式 I。
所述 R3H中 R3的定义同式 I， R3H具体可为： 苄胺、 取代的苄胺、 糠胺或 2- 噻吩基甲胺基。 所述取代的苄胺包括 3-氟苄胺、 4-氟苄胺、 2-氟苄胺、 2-甲氧基苄 胺、 3-甲氧基苄胺、 2-氯苄胺、 4-甲氧基苄胺、 3,4-二氟苄胺、 3， 4-二甲氧基苄胺等。
所述 X中 的定义同式 I, X代表卤素 （如氯、 溴、 碘） ， X具体可为： 碘甲烷、 溴乙烷、 溴丙烷、 溴代环丙垸、溴代环丙甲垸、 溴丁垸、氯苄或 4-溴丁腈。
所述 NH R2中 Ri、 R2的定义同式 I， NHR,R2具体可为： （R)-氨基丁醇、 (S)- 氨基丁醇、 （R)-氨基丙醇、 二乙醇胺、 2-羟基丙胺、 乙二胺、 二异丙醇胺、 氨基己 醇、 L-缬氨醇、 2-氨基 -2-甲基 -1， 3-丙二醇、 3-氨基 -1,2-丙二醇、 D-苯甘氨醇或 2- 氨基 -1， 3-丙二醇。
上述歩骤 1 ) 中所述反应在丁醇（BuOH )溶剂中进行。 所述反应的反应温度为 80 110。C， 具体可 90°C。
上述歩骤 2 ) 中所述反应在二甲基亚砜 （DMSO ) 溶剂中进行。 所述反应还需 加入碱作为缚酸剂， 所述碱具体可为碳酸钾、 碳酸钠等。
上述步骤 3 )中所述反应在惰性气氛中进行。所述反应的反应温度为 140 170'C， 具体可为 160Ό ; 所述反应时间为 5h- 8h。
上述步骤 3 )中所述反应原配料比 n (化合物 NH R2 )： n (化合物 III) =4 : 1-8 : 1。
替换页 （细则第 26条) 本发明的另一个目的是提供式 I所示化合物的应用。
本发明所提供的式 I所示化合物或其药学上可接受的盐的应用包括下述方面： 其一，可用于制备预防和 /或治疗 EV7K肠道病毒 71型）病毒 （Human enterovirus 71) 感染的药物； 可用于制备真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂； 其三， 可用于制备 预防和 /或治疗肿瘤的药物； 其四， 可用于制备细胞周期蛋白依赖性激酶 （CDKs ) 抑制剂。
所述真核生物为哺乳动物； 所述肿瘤细胞为癌细胞； 所述癌细胞为肝癌细胞、 肿癌细胞、 乳腺癌细胞、 宫颈癌细胞或喉癌细胞； 所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞 HepG-2或人肝癌细胞 PLC/PRF/5 , 所述肺癌细胞具体为人肺癌细胞 A549， 所述乳腺 癌细胞具体为人乳腺癌细胞 MCF-7或人乳腺导管癌细胞 BT-474, 所述宫颈癌细胞具 体为人宫颈癌细胞 Hela, 所述喉癌细胞具体为人喉癌上皮细胞 Hep-2。
所述肿瘤为癌， 所述癌具体为下述至少一种： 肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌和 喉癌。
本发明通过体外细胞试验证明， 式 I所示化合物（即 CDKs小分子选择性抑制 剂 6- ( 氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物） 能有效抑制多种肿瘤 细胞的生长， 可发展成为抗肿瘤的药物。
式 I所示化合物中优选的具有抗肿瘤作用的化合物可为上述化合物 4， 5， 6， 25 , 26, 27， 46， 48， 49, 52 , 53 , 54。
最优选的具有抗肿瘤作用的化合物如下式所示. -
Figure imgf000008_0001
化合物 52 化合物 53 化合物 4 化合物 26 化合物 27 本发明通过动物实验证明， 式 I所示化合物 （即 CDKs小分子选择性抑制剂 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物） 在体内具有显著的抗 EV71病毒作用， 可发展成为治疗和预防 EV71 (肠道病毒 71型） 病毒 （Human enterovirus 71 )感染的药物。
式 I所示化合物屮优选的具有抗 EV71病毒活性的化合物为：
化合物 05 (R) -6- (苄氨基） -2- [ [ (1-羟甲基）丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 25 (S) -6- (3-氟苄氨基） -2- [ [ (1 -羟甲基）丙基]氨基] -9 乙基嘌呤； 化合物 26 (R) -6- (3 氟苄氨基) -2 [ [ (1 -羟甲基）丙基]氨基] 9 乙基嘌呤； 化合物 27 6— (3-氟苄氨基） -2- (2 羟乙基氨基) 9-乙基嘌呤；
替换页 （细则第 26条) 化合物 48 6- (3-氟苄氨基) -2- [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] _9_乙 基嘌呤；
化合物 49 6- (3-氟苄氨基) -2- [ [2， 3-二羟基丙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 化合物 52 6- (苄氨基) -2- [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌 呤；
化合物 53 6- (苄氨基) -2- [ [2， 3-二羟基丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
以式 I所示化合物为活性成分制备的预防和 /或治疗 EV71病毒感染的药物以及 预防和 /或治疗肿瘤的药物也均属于本发明的保护范围。
所述药物可通过注射、 喷射、 滴鼻、 滴眼、 渗透、 吸收、 物理或化学介导的方 法导入机体如肌肉、 皮内、 皮下、 静脉、 粘膜组织； 或是被其他物质混合或包裹后 导入机体。
需要的时候， 在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。 所述 载体包括药学领域常规的稀释剂、 赋形剂、 填充剂、 粘合剂、 湿润剂、 崩解剂、 吸 收促进剂、 表面活性剂、 吸附载体、 润滑剂等。
以式 I化合物或其药学上可接受的盐为活性成分制备的药物可以制成注射液、 悬浮剂、 粉剂、 片剂、 颗粒剂等多种形式。 上述各种剂型的药物均可以按照药学领 域的常规方法制备。
本发明提供的药物， 依不同情况包括特定药物的药物动力学、 药代动力学、 给 药模式、 给药途径、 受者的年龄、 体重、 肝肾功能状态、 疾病的性质、 程度及治疗 时限等， 以适宜的剂量给药。
附图说明
图 1为制备本发明式 I所示化合物的化学反应流程图。
图 2为式 I所示化合物对细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制活性图。
图 3为化合物 4、 5、 25、 26对 EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。
图 4为化合物 48、 49、 52、 53对 EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。
图 5为化合物 27对 EV71病毒感染小鼠存活率的影响图。
图 6为化合物 4、 5、 25、 26对 EV71病毒感染小鼠体重的影响图。
图 7为化合物 48、 49、 52、 53对 EV71病毒感染小鼠体重的影响图。
图 8为化合物 27对 EV71病毒感染小鼠体重的影响图。
实施发明的最佳方式
下面结合具体实施案例对本发明作进一步的阐述， 但本发明不限于以下实施案 例， 所述方法如无特别说明均为常规方法。 所述材料如无特别说明均能从公开商业 途径获得。 实施例 1 6- (苄氨基) -2-[[2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基)乙基]氨基] -9-乙基嘌呤（化合物 52) 的合成
在 250ml单口瓶中加入 2,6-二氯嘌呤（10g， 52.91mmol) ， 正丁醇（150ml)， 加热至 90°C使其溶解，加入三乙胺（14ml， 100.44mmol)，苄胺（6.7ml， 61.36mmol)， 反应 lOmin后， 析出白色固体， 继续反应 3小时后， 停止加热。 冷却至 5-10°C后， 过滤。 先用 100ml水洗涤， 除去三乙胺盐酸盐， 再用 30mlx3的乙醇洗涤， 除去正 丁醇和水， 真空或常压干燥， 得白色固体 (化合物 3a， 即 2-氯 -6- (苄氨基)嘌呤) 14g。
在 250ml单口瓶中，加入化合物 3a ( 10g， 36.01mmol)，加入二甲基亚砜 100ml, 加热至 25°C， 加入碳酸钾（10g， 72.36mmol) ， 溴乙垸 (5.5ml, 73.69mmol) ， 反 应 3小时后，加入 200ml水，析出白色或类白色固体。搅拌 30min后，过滤，用 100ml 水洗涤。将产品用 90-100ml乙醇加热沸腾重结晶，得到鳞片状无色晶体 (化合物 4a， 即 2-氯 -6- (苄氨基) -9-乙基嘌呤) 8.8g。
在带有三通活塞 50ml单口瓶中， 加入化合物 4a (2.8g, 9.8mmol)， 2-氨基 -2- 甲基 -1， 3-丙二醇（7.8ml， 81.51mmol) ， 氮气保护， 反应温度升至 170°C， 反应 8 小时后停止加热，冷却至室温后，加入 50ml水，析出白色固体，搅拌 30min，过滤。 用 50ml乙酸乙酯溶解产品， 加无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩， 过硅胶柱 (流动相 乙 酯： 甲醇 =20:l,v/V)， 得化合物 A即 6- (苄氨基) -2-[[2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基)乙基] 氨基] -9-乙基嘌呤。
结构确证数据如下： 1HNMR(CDCl3):61.31(s, 3H, CCH3), 1.47(t， 3H, CH2CH3), 3.72(d, 2H,CH20H), 3.93(d, 2H, HOCH2), 4.06(q， 2H, CH2CH3), 4.75(bs， 2H, CH2)， 6.24(bs， 1H)， 7.32(m,5H, Hpheilyi), 7.46(s， 1H， H-8)。 实施例 2 6- (苄氨基) -2-[(2,3-二羟基丙基)氨基] -9-乙基嘌呤 (化合物 53)的合成
在带有三通活塞 50ml单口瓶中， 加入实施例 1中制备的化合物 4a (2.8g， 9.8mmol)， 2,3-二羟基丙胺（3.8ml， 49.00mmol)，氮气保护，反应温度升至 160°C， 反应 5小时后停止加热，冷却至室温后，加入 50ml水，析出白色固体，搅拌 30min， 过滤。 用 50ml乙酸乙酯溶解产品， 加无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩， 结晶， 得化 合物 B即 6- (苄氨基) -2-[(2,3-二羟基丙基)氨基] -9-乙基嘌呤。
结构确证数据如下：
Figure imgf000010_0001
CCH3), 3.52(m,
4H,(CH20H)2), 3.89(m， 1H， CHNH), 4.00(q， 2H, CH2CH3), 4.60(bs， 4H， phenyl-CH2 ,OH), 5.79(bs， 1H)， 7.32(m,5H, Hphenyi)， 7.45(s， 1H， H-8)。 实施例 3 (S)- 6- (苄氨基) -2- [卜 (羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤 (化合物 4) 的合成 在带有三通活塞 50ml单口瓶中， 加入实施例 1中制备的化合物 4a (2.8g， 9.8mmol) ， D-2-氨基丁醇（7.5ml， 81.51mmol) ， 在搅拌条件下， 氮气保护， 反应 温度升至 160°C， 反应 6小时后停止加热， 冷却至室温后， 加入 50ml水， 析出白色 固体， 搅拌 30min， 过滤。 用 50ml乙酸乙酯溶解产品， 加无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩至 10ml， 结晶,得白色固体。
结构确证数据如下： 1HNMR(CDCl3):61.03(t, 3H, CH2CH3), 1.47(t， 3H, CH2CH3), 1.58(m， 2H, CH2(CH2)CH3), 3.64(m， 1H,CHNH), 3.81(m, 1H， HOCH), 3.88(m， 1H， HOCH), 4.08(q， J=7.2, 2H, CH2CH3), 4.76(bs， 2H, CH2), 4.91(bs， 1H)， 6.00(bs， 1H)， 7.30(m， 5H， Hphe„yi).7.45(s, 1H， H-8) 实施例 4 (R)-6-[(3-氟苄基)氨基] -2-[[l- (羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤 (化合物 26) 的合成
在 250ml单口瓶中加入 2,6-二氯嘌呤（10g， 52.91mmol) ， 正丁醇（150ml) ， 加热至 90°C使其溶解，加入三乙胺（ 14ml, 100.44mmol)， 3-氟苄胺（7ml， 61.36mmol), 反应 lOmin后， 析出白色固体， 继续反应 3小时后， 停止加热。 冷却至 5-10°C后， 过滤。 先用 100ml水洗涤， 除去三乙胺盐酸盐， 再用 30mlx3的乙醇洗涤， 除去正 丁醇和水， 真空或常压干燥。 得白色固体 (化合物 3b， 即 2-氯 -6-(3-氟苄氨基) -嘌 呤) 14g， 收率 95.89%。
在 250ml单口瓶中，加入化合物 3b ( 10g， 36.01mmol)，加入二甲基亚砜 100ml, 加热至 25°C， 加入碳酸钾（10g， 72.36mmol) ， 溴乙垸 (5.5ml, 73.69mmol) ， 反 应 3小时后，加入 200ml水，析出白色或类白色固体。搅拌 30min后，过滤，用 100ml 水洗涤。将产品用 90-100ml乙醇加热沸腾重结晶，得到鳞片状无色晶体 (化合物 4b， 即 2-氯 -6-(3-氟苄氨基) -9-乙基嘌呤) 8.8g， 产率 88%。
在带有三通活塞 50ml单口瓶中， 加入化合物 4b (3.0g, 9.8mmol) ， L-2-氨基 丁醇（7.5ml， 81.51mmol) ， 在搅拌条件下， 氮气保护， 反应温度升至 160°C， 反 应 6小时后停止加热， 冷却至室温后， 加入 50ml水， 析出白色固体， 搅拌 30min， 过滤。用 50ml乙酸乙酯溶解产品， 加无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩至 10ml， 结晶， 得白色固体。
结构确证数据如下： 1HNMR(CDCl3):61.01(t, 3H, CH2CH3), 1.47(t， 3H, CH2CH3), 1.56(m， 2H, C¾C¾)， 3.62(m, CHNH), 3.82(m, 1H, HOCH), 3.88(m， 1H, HOCH), 4.07(q， J=7.2, 2H, CH2CH3), 4.76(bs， 2H, CH2)， 4.91(bs， 1H)， 6.00(bs， 1H)， 6.96(td， J尸 8.4， J2=2.0, 1H， Hphenyl), 7.07(d， J=9.6， 1H， Hphenyl), 7.13(d， J=7.6， 1H， Hphenyl), 7.28(m， lH).7.45(s, 1H， H-8)。 实施例 5 (R)-6-[(3-氟苄基)氨基] -2-[[(2-羟基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤 (化合物 27)的 合成
在带有三通活塞 50ml单口瓶中， 加入实施例 4制备的化合物 4b ( 3.0g，
9.8mmol) ， 乙醇胺（3.0ml,49.00mmol) ， 在搅拌条件下， 氮气保护， 反应温度升 至 160°C， 反应 5小时后停止加热， 冷却至室温后， 加入 50ml水， 析出白色固体， 搅拌 30min， 过滤。用 50ml乙酸乙酯溶解产品， 加无水硫酸钠干燥， 过滤， 浓缩至 10ml, 结晶， 得白色固体。
结构确证数据如下：
lH-NMR(CDCl3): 1.34(t,3H,CH2CH3),3.30(m,2H,CH2NH),3.48(m,lH,HOCH2),4.00(q, 2H,CH2CH3),4.64(bs,2H,CH2),6.23(bs,lH),7.02(t,lH,Hphenyl),7.16(d,lH,Hphenyl),7.1 9(d,lH,Hphenyl),7.32(m,lH,Hphenyl),7.45(s,lH,H-8), 7.92(bs,lH). 实施例 6式 I化合物在体外对肿瘤细胞的生长抑制作用的活性初筛
材料与方法
1.肿瘤细胞和药物配置
HepG2细胞培养液为含 10%胎牛血清的 DMEM (GIBCO)培养液。 加入衍生 物作用前使用含 2%胎牛血清的维持液。 6- (苄氣基) -2~[[i-(羟甲基)丙基]氮基] -9~异 丙基嘌呤衍生物用 DMSO溶解为 20mM，再用 PBS稀释到 lmM，分装后储存在 -20 °C备用。
2.式 I化合物对肝癌细胞 HepG2的生长抑制作用
肝癌细胞 HepG2在含 10%胎牛血清的培养基 (GIBCO)中， 于 37°C、 5% C02培 养箱中培养。 观察细胞生长状态良好， 培养至对数生长期后， 以 8000~10000个细 胞 /孔将细胞接种至 96孔细胞培养板中， 次日 75~80%长满。 用 DMEM稀释式 I化 合物 (即 6- ( 氮基 羟甲基)丙基]氨基 ]~9-异丙基嘌呤衍生物)至 200μΜ。将长 满 75~80%细胞的含 10%胎牛血清的 DMEM培养基 (GIBCO)的 96孔板换成含 2%胎 牛血清的维持液备用。 把式 I化合物分别设立 10、 20μΜ两个浓度梯度加入 96孔 板内， 每个序列设三个复孔， 并设立肿瘤细胞对照组， 37°C培养 2d。镜下观察式 I 化合物对细胞形态的影响。 利用 Cell Counting Kit-8( DoJinDo产品)方法在酶标仪 (BIO-RAD产品， 型号： Model 680)上测定细胞病变程度（以 OD450表示） ， 并 以如下公式计算药物的肿瘤抑制率： （OD肿瘤细胞 -OD试验) / OD肿瘤细胞 X 100。 重复试验二次， 计算平均值。
结果 式 I化合物对肝癌细胞 HepG2生长的抑制结果， 如表 1所示。
表 1
衍生物 抑制率 (％) 衍生物 抑制率 (％) 衍生物 抑制率 (％) 10 20 10 20 10 20 化合物 01 11.1 17.5 化合物 19 0.5 3.8 化合物 37 4.6 10.6 化合物 02 13.9 15.9 化合物 20 2.9 8.6 化合物 38 0.6 21.5 化合物 03 6.5 13.9 化合物 21 12.4 2.1 化合物 39 1.7 12.9 化合物 04 34.5 69.3 化合物 22 0.2 6.1 化合物 40 9.8 19.7 化合物 05 25.1 64.8 化合物 23 8.4 8.5 化合物 41 3.9 3.1 化合物 06 21.7 51 化合物 24 0.1 8.0 化合物 42 19.6 38.3 化合物 07 7.7 18.6 化合物 25 65.6 85.6 化合物 43 2.8 8.1 化合物 08 5.7 8.5 化合物 26 49.5 80.0 化合物 44 0.5 3.7 化合物 09 3.3 7.1 化合物 27 65.7 79.4 化合物 45 11.2 15.1 化合物 10 5.9 5.0 化合物 28 0.03 0.42 化合物 46 0.3 59.7 化合物 11 2.3 8.2 化合物 29 0.03 0.27 化合物 47 0.4 5.9 化合物 12 2.9 6.1 化合物 30 0.02 0.33 化合物 48 25.8 75.6 化合物 13 3.9 14.6 化合物 31 3.6 10.9 化合物 49 5.5 59.7 化合物 14 14.9 11.5 化合物 32 1.6 2.2 化合物 50 2.1 32.3 化合物 15 11.3 3.5 化合物 33 0.17 2.2 化合物 51 10.1 15.5 化合物 16 0.06 0.14 化合物 34 1.3 5.8 化合物 52 27.3 62.1 化合物 17 0.9 3.1 化合物 35 4.5 11.1 化合物 53 25.3 61.2 化合物 18 0.8 5 化合物 36 1.1 2.2 化合物 54 16.1 60.7
Figure imgf000013_0001
结论 化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54对肝癌细胞 HepG2 的增殖抑制率大于 50%， 可能发展成为抗肿瘤药物。 实施例 7考察初筛化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54对 BHK-21 正常细胞毒性作用及其 CC5o
材料与方法
1. BHK-21细胞和药物配置 BHK-21细胞培养液为含 7%胎牛血清的 DMEM (GIBCO) 培养液。 加入衍生 物作用前使用含 0.7%胎牛血清的维持液。 6 苄氮基 )~2~[[1- (羟甲基)丙基]氮基 ]-9-异 丙基嘌呤衍生物用 DMSO溶解为 20mM，再用 DMEM(GIBCO)培养液稀释到 lmM， 分装后储存在 -20°C备用。
2. CK苄氨基 >2-[[1 羟甲基)丙基]氮基 9-异丙基嘌呤衍生物对 BHK-21细胞的毒 性作用检测
将 BHK-21细胞铺 96孔细胞培养板， 次日 75~80%长满。 将长满 75~80%的 BHK-21细胞换成含 0.7%胎牛血清的维持液备用。 把 6 苄氮基 )~2~[[1- (羟甲基)丙 基]氨基 ] 9异丙基嘌呤衍生物分别设立 20、 40、 80、 160、 320μΜ五个浓度梯度， 每个浓度设立三个复孔， 并设立不加药物的 BHK-21细胞做阴性对照组， 37°C培养 2d， 镜下观察 6- (苄氨基) -2-[[1-(羟甲基)丙基]氮基 ^异丙基嘌呤衍生物对细胞形态 的影响。 利用 Cell Counting Kit-8( DoJinDo产品）方法在酶标仪 （BIO-RAD产品， 型号： Model 680) 上测定细胞病变程度 （以 OD45。表示） ， 并计算半数毒性剂量 CC50。
结果 化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54对 BHK-21正常细 胞毒性作用及其 CC5。， 如表 2所示。
表 2
Figure imgf000014_0001
实施例 8 考察化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54对多种肿瘤 细胞的生长抑制作用及其半数抑制浓度 IC5o
材料与方法
1. 肿瘤细胞和药物配置
A549细胞培养液为含 10%胎牛血清的 F12K (GIBCO) 培养液。 HepG2， MCF-7, Hela, PLC/PRF/5细胞培养液为含 10%胎牛血清的 DMEM (GIBCO) 培养液。 BT-474细胞培养液为含 10%胎牛血清的 RPMI1640 (GIBCO) 培养液。 HCT-116细胞培养液为含 10%胎牛血清的 MCCOY' 5A (GIBCO)培养液。 Hep-2 细胞培养液为含 10%胎牛血清的 MEM (GIBCO) 培养液。 加入衍生物作用前使 用相应的 2%胎牛血清的维持液。 6- (节氮基 2-[[1 羟甲基)丙基]氮基] -9-异丙基 嘌呤衍生麴用 DMSO溶解为 20mM，再用 DMEM(GIBCO)培养液稀释到 200μΜ， 分装后储存在 -20°C备用。
2. 6- (苄氨基)- 2-[[1 -(羟甲基)丙基]氮基] -9-异丙基嘌呤衍生物对各种肿瘤细胞的 生长抑制作用及其半数抑制浓度 IC5Q
肿瘤细胞在含 10%胎牛血清的培养基 (GIBCO)中， 于 37°C、 5% C02培养箱中 培养。 观察细胞生长状态良好， 培养至对数生长期后， 以 8000~10000个细胞 /孔将 细胞接种至 96孔细胞培养板中， 次日 75~80%长满。 用 DMEM稀释 6 节氨 基) -24[1 羟甲基)丙基]氨基 ] -异丙基嘌呤衍生物至 200μΜ。 将长满 75~80%细胞 的含 10%胎牛血清的 DMEM培养基 (GIBCO)的 96孔板换成含 2%胎牛血清的维持 液备用。把 6- (苄氟基) -2-[[i (羟甲基)丙基]氣基 ]-9-异丙基嘌吟衍生物分别设立 2.5、 5、 10、 20、 40μΜ五个浓度梯度加入 96孔板内， 每个序列设三个复孔， 并设立肿 瘤细胞对照组， 37°C培养 2d。 镜下观察 6- (苄氨基 羟甲基)丙基]氨基 异 丙基嘌呤衍生 l对细胞形态的影响。利用 Cell Counting Kit-8( DoJinDo产品)方法在 酶标仪（BIO-RAD产品，型号： Model 680)上测定细胞病变程度（以 OD450表示）， 并以如下公式计算药物的肿瘤抑制率： （OD肿瘤细胞 -OD试验） / OD肿瘤细胞 xlOOo重复试验二次，计算平均值。并根据 CC5Q和 IC5Q求得治疗指数 TI=CC5Q/IC5o 结果 化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53, 54在 0-40μΜ范围内可 剂量依赖性的抑制人肝癌细胞 HepG2的生长，其 IC5。及治疗指数 TI值如表 3所示。
表 3
Figure imgf000015_0001
化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 依赖性的抑制人肺癌细胞 Α549的生长， 其 IC5。及治疗指数 TI值如表 4所示。
表 4
化合物 :50 (μΜ) 治疗指数 TI 化合物 IC50 M) 治疗指数 TI 4 14 15.4 46 19.4 6.5
5 18.7 9.4 48 7.5 10.5
6 15.3 12.6 49 9.7 1 1.6
25 6.6 1 1.4 52 14.8 25.2
26 15.6 13.5 53 17 19.2
27 16.4 1 1.4 54 25.5 5.6 化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 剂量依赖性的抑制人乳腺癌细胞 MCF-7的生长， 其 IC5o及治疗指数 TI值如表 5所 示。
Figure imgf000016_0001
化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 依赖性的抑制人宫颈癌细胞 Hela的生长，其 IC5o及治疗指数 TI值如表 6所示。
表 6
Figure imgf000016_0002
化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 剂量依赖性的抑制人肝癌细胞 PLC/PRF/5的生长， 其 IC5。及治疗指数 TI值如表 7 所示。
表 7
化合物 :50 (μΜ) 治疗指数 TI 化合物 IC50 M) 治疗指数 TI 4 29.3 7.3 46 32 3.9
5 23.1 7.6 48 21 3.8
6 48.6 4.0 49 19.7 5.7
25 19.9 3.8 52 29.4 12.7
26 30 7.0 53 25.8 12.7
27 20 9.4 54 34.5 4.1 化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 剂量依赖性的抑制人乳腺导管癌细胞 BT-474的生长，其 IC5o及治疗指数 TI值如表 8所示。
表 8
Figure imgf000017_0002
化合物 4， 5， 6， 25， 26， 27， 46， 48， 49， 52， 53， 54在 0-40μΜ范围内可 剂量依赖性的抑制人喉癌上皮细胞 Hep-2的生长， 其 IC5o及治疗指数 TI值如表 9 所示。
表 9
Figure imgf000017_0003
Roscovitine (即 (RHK苄氣基 2-[[1-(羟甲基)丙基]氮基] 异丙基嘌呤） 对以 上 7种肿瘤细胞中的 IC5Q及其治疗指数 TI如表 10所示。
表 10
Figure imgf000017_0001
IC50 25.6 28.1 49.2 25.6 47.5 14.2 51.1
TI 16.5 15.1 8.6 16.5 8.9 29.8 8.3 结论 7种细胞 (A549, HepG2,MCF-7,BT-474,Hep-2,PLC/PRF/5,Hela)中 TI值大于 roscovitine: 52,26
6种细胞 (A549,Hela,HepG2,MCF-7,Hep-2,PLC/PRF/5) 中 TI值大于 roscovitine:
4
5种细胞 (A549,HepG2,MCF-7,Hep-2,PLC/PRF/5) TI值大于 roscovitine: 53
4种细胞 (Hela,HepG2,MCF-7,PLC/PRF/5)中 TI值大于 roscovitine:27
实施例 9考察化合物 26,27,52,53对细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinases, CDK )的抑制活性
材料与方法
采用 CDK1~细胞周期素 B激酶检漏试剂盒（货号： CY-1164, Abnova公司） 检测 ίΚ苄氨基 )-2~[[1- ( ¾甲基)丙基]氨基] 异丙基嘌呤衍生物 26， 21, 52, 53 对细胞周期蛋白依赖性激酶 (： cyclin-dependent kinases 1, CD 1 )的抑髌作用。从已平 衡至室温的密封袋中取出试验所需板条， 未用的钣条和千燥剂放回铝箔袋内封存于 4Ό。 留空白孔， 将样品分别用激酶缓冲液稀释， 实验设置阴性对照孔、 溶剂对照 孔、 受试药物孔， 实验中每孔; ¾ ΙΟμΙ细胞周期蛋白激酶 CDK1 , ΙΟμΙ样品和 80μ.1 激酶反应缓冲液， 用封板跤纸封住反应孔， 30°C孵育 30min后， ϋ掉孔内液体， 每 孔力洗涤液 350μ1， 静置 30秒后甩尽孔内液体， 在厚迭吸水纸上拍干， 重复上述操 诈冼板 5次， 加 ΙΟΟμΙ试剂盒自带的抗磷酸化 Cdc7 T376单克隆抗体
TK~H7(Anti-phospho Cdc7 T376 Monoclonal Antibody TK-H7), 用封板胶纸封住反应 孔, 25Ό孵育 30min后, 甩掉孔内液体, 洗板 5次, 加入 ΙΟΟμ.1的试剂盒自带 HRP 标记的抗鼠 igG(HRP-conjugated Anti-mouse IgG)， 用封板胶纸封住反应孔 > 25 V 鮮育 30min后， 甩掉孔内液体， 洗板 5次， 加 ] ίθθμΐ显色底物， 用封板胶纸封住反 应孔， 25O l育 5- 15min后， 加 ΙΟΟμΙ终止液， 30min内用酶标纹在 450nm波长 赴检测啜光度。并以如下公式计算药物对激酶的抑制率： （OD溶剂对照 -OD试验) / OD溶剂对照 xl 00。
结果 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物 26， 27， 52， 53 在浓度为 5、 10、 20、 40和 80μΜ时对细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinases 1, CDK1 )的抑制活性见图 2， 经软件计算 52、 53、 26、 27的半数抑制浓度 IC50分别为 13.6、 14.0、 18.7、 35.6μΜ。
结论 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物 26， 27， 52, 53 在浓度为 5、 10和 20μΜ时对细胞周期蛋白依赖性激酶（ cyclin-dependent kinases 1, CDK1 )有抑制活性。 实施例 10 考察 6 苄氣基) 2-[[i 羟甲基)丙基]氣基] ~9异丙基嘌呤衍生物对 EV71 病毒感染小鼠存活率影响及对 EV71病毒感染所致乳小鼠体重的影响
材料与方法
1. ICR乳鼠、 病毒和对照药物
动物模型为 SPF级 7日龄 ICR乳鼠， EV71病毒株为国际标准株 BrCr株。阳性 对照药物为 IFNa-2a。
2. 6 苄氣基) 2-[[i 羟甲基)丙基]氣基 ^异丙基嘌呤衍生物体内抗 EV71病毒活性 检测
订购 SPF级 7日龄 ICR乳鼠 12窝， 实验开始前对其进行称重并分组。 小鼠分 别设立 6-(苄氣基 )-2-[[1- (羟甲基)丙基]氮基] 异丙基嘌呤衍生物 4, 5， 25, 26， 27, 48, 49， 52, 53组， 剂量均为 4mg/kg/d， 同时设立正常生理盐水对照组、 EV71 病毒感染对照组、 IFNa-2a阳性药物对照组。 对已经分组的小鼠进行实验， 先在小 鼠一侧腰窝处用碘伏进行消毒， 然后用 75%的酒精进行消毒， 接着根据体重注射相 应剂量的生理盐水、 病毒或药物。 正常生理盐水对照组连着注射五天生理盐水； 病 毒组第一天注射病毒， 后面四天注射相同剂量是生理盐水； IFNa-2a阳性药物对照 组及 6- (苄氮基) -2-[[1 羟甲基)丙基]氨基 9-异丙基嘌呤各剂量给药组第一天先根 据体重注射一定量 EV71病毒， 1小时后注射药物， 以后连续给四天药物， 给药结 束后持续观察 2周， 每天称量记录体重并计算存活率。
结果 EV71病毒感染对照组在病毒感染 6天时开始出现死亡， 至感染后第 14天， 存活率降低至 20%， 6 苄氨基 2-[[1-( 羟甲基)丙基]氨基] 异丙基嘌呤衍生物 4给 药组未显示出显著疗效， 而衍生物 5 , 25, 26， 48, 49, 52, 53， 27组均显示出显 著的保护作用，在感染后第 14天，存活率分别为 80%, 100%, 80%, 83,3%, 911%, 81.8%, 100%和 100%， 均高于 50% (图 3， 4， 5 ) 。 在体重增加方面， 6 苄氣 基) ~2-[[1- (羟甲基)丙基]氛基 ]~9 -异丙基嘌呤衍生德 5, 25 > 26, 49, 52, 53, 27组 小鼠体重增加显著高于病毒感染对照组 （图 6， 7， 8) 。
结论 6- (苄氮基) -2-[[1 -(羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤衍生物 5, 25 , 26, 27, 48, 49, 52, 53 , 27可以提高 EV71病毒感染小鼠的存活率， 减轻 EV71病毒感染 弓 I起的乳小鼠体重增加缓慢。
工业应用
本发明通过对 6- (苄氨基) -2-[[1- (羟甲基)丙基]氨基] -9-异丙基嘌呤中 2、 6、 9位 基团的修饰，获得了一系列的衍生物。并通过体内外试验证明，其能有效抑制 CDK1 的活性， 并抑制多种肿瘤细胞的生长， 而且具有显著的抗 EV71病毒作用， 可为预 防和 /或治疗 EV71 (肠道病毒 71型） 病毒 （Human enterovirus 71)感染和抗肿瘤提 供新的有效药物。

Claims

权利要求
1、 式 I所示的化合物或其药学上可接受的盐:
Figure imgf000020_0001
(式 I)
其中， R2为氢原子且 ^选自下述基团中的任意一种： (RMi-羟甲基)丙基、 (SMi- 羟甲基)丙基、 （RM1-羟甲基)乙基、 （SM1-羟甲基)乙基、 2-羟基乙基、 2-羟基丙基、 2-胺基乙基、 6-羟基己基、 1-羟甲基 -2-羟基乙基、 2-羟基 -1-甲基 -1-(羟甲基)乙基、 2， 3-二羟基丙基、 1- (羟甲基)乙基苯乙基和 [(羟甲基)乙基 -2-甲基]丙基； 或 ¾和 均为羟乙基或异丙羟基；
R3选自下述基团中的任意一种： 苄氨基、取代的苄氨基、糠胺基和 2-噻吩基甲 胺基； 所述取代的苄氨基中苯环上的任意位置被下述任意一个基团取代： 氟原子、 氯原子、 甲氧基、 甲基、 乙基、 异丙基和三氟甲基；
选自下述基团中的任意一种： 甲基、 乙基、 丙基、环丙基、环丙甲基、 丁基、 苄基、 丁腈基。
2、 根据权利要求 1所述的化合物或其药学上可接受的盐， 其特征在于： 所述 式 I中， 所述 为氢原子且 ¾选自下述基团中的任意一种： （R)-(l-羟甲基)丙基、 (S)-(l-羟甲基)丙基、 2-羟基乙基、 2-羟基 -1-甲基 -1-(羟甲基)乙基、 2， 3-二羟基丙基； 或 和 均为羟乙基；
所述 R3为苄氨基或 3-氟苄氨基； 所述 为乙基。
3、 根据权利要求 1或 2所述的化合物或其药学上可接受的盐， 其特征在于： 所述化合物药学上可接受的盐为所述式 I所示的化合物与酸形成的盐； 所述酸为无 机酸， 有机羧酸， 氨基酸或有机磺酸。
4、 制备权利要求 1中式 I所示化合物的方法， 包括下述步骤：
1 ) 使 2,6-二氯嘌呤与 R3H进行反应， 得到式 II所示的化合物；
2) 使式 II所示的化合物与 X进行反应， 得到式 III所示的化合物；
3) 使式 III所示的 iRs进行反应， I所示的化合物；
Figure imgf000020_0002
(式 Π ) (式 III) 其中， 所述 R3H中 R3的定义同式 I; 所述式 II中 R3的定义同式 I;
所述 X中 的定义同式 I， X代表卤素； 所述式 III中 的定义同式 I； 所述 NHRiRs中 Ri、 R2的定义同式 I。
5、 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于： 步骤 1 ) 中所述反应在丁醇溶剂 中进行； 所述反应的反应温度为 80-110°C ;
步骤 2) 中所述反应在二甲基亚砜溶剂中进行； 所述反应还需加入碱作为缚酸 剂， 所述碱具体为碳酸钾或碳酸钠；
步骤 3) 中所述反应在惰性气氛中进行； 所述反应的反应温度为 140-170°C， 反应时间为 5h-8h;
步骤 3) 中所述 ΝΗ 与式 III所示的化合物的摩尔比为 4 : 1-8 : 1。
6、 权利要求 1-3中任一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和 /或 治疗 EV71病毒感染的药物中的应用。
7、根据权利要求 6所述的应用， 其特征在于： 所述化合物为下述任意一种： 1 ) (R) -6- (苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
2) (S) -6- (3-氟苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
3 ) (R) -6- (3-氟苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
4) 6- (3_氟苄氨基) _2- [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌呤;
5) 6- (3-氟苄氨基) -2- [ [2， 3-二羟基丙基基]氨基] -9-乙基嘌呤；
6) 6- (苄氨基) -2- [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌呤； 7) 6- (苄氨基) -2- [ (2，3-二羟基丙基)氨基] -9-乙基嘌呤。
8 ) 6- (3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤。
8、 一种预防和 /或治疗 EV71病毒感染的药物， 其活性成分为权利要求 1-3中 任一项所述化合物或其药学上可接受的盐。
9、 权利要求 1-3中任一项所述化合物或其药学上可接受的盐在制备下述产品 中的应用： 1 )细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂； 2)真核生物肿瘤细胞增殖抑制剂;
3) 预防和 /或治疗肿瘤的药物。
10、 根据权利要求 9所述的应用， 其特征在于： 所述化合物为下述任意一种： 1 ) (S) -6- (苄氨基) -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
2 ) (R) -6- (3-氟苄氨基 -2- [ [ (1-羟甲基)丙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
3) 6- (3-氟苄氨基) -2- (2-羟乙基氨基) -9-乙基嘌呤；
4) 6- (苄氨基) _2- [ [2-羟基 -1-甲基 -1- (羟甲基）乙基]氨基] -9-乙基嘌呤；
5 ) 6- (苄氨基) -2- [ (2， 3-二羟基丙基)氨基] -9-乙基嘌呤。
11、 根据权利要求 9或 10所述的应用， 其特征在于： 所述真核生物为哺乳动物; 所述肿瘤细胞为癌细胞； 所述癌细胞为肝癌细胞、 肺癌细胞、 乳腺癌细胞、 宫颈癌 细胞或喉癌细胞；所述肝癌细胞具体为人肝癌细胞 HepG-2或人肝癌细胞 PLC/PRF/5， 所述肺癌细胞具体为人肺癌细胞 A549，所述乳腺癌细胞具体为人乳腺癌细胞 MCF-7 或人乳腺导管癌细胞 BT-474， 所述宫颈癌细胞具体为人宫颈癌细胞 Hela， 所述喉癌 细胞具体为人喉癌上皮细胞 Hep-2。
所述肿瘤为癌， 所述癌具体为下述至少一种： 肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌和 喉癌。
12、一种预防和 /或治疗肿瘤的药物， 其活性成分为权利要求 1-3中任一项所述 化合物或其药学上可接受的盐。
13、 根据权利要求 12所述的药物， 其特征在于： 所述肿瘤为癌， 所述癌具体为 下述至少一种： 肝癌、 肺癌、 乳腺癌、 宫颈癌和喉癌。
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