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WO2014065245A1 - 弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソーム - Google Patents

弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソーム Download PDF

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Publication number
WO2014065245A1
WO2014065245A1 PCT/JP2013/078497 JP2013078497W WO2014065245A1 WO 2014065245 A1 WO2014065245 A1 WO 2014065245A1 JP 2013078497 W JP2013078497 W JP 2013078497W WO 2014065245 A1 WO2014065245 A1 WO 2014065245A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
liposome
peptide compound
peptide
acid block
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/078497
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
健太朗 小暮
進 濱
Original Assignee
大鵬薬品工業株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大鵬薬品工業株式会社 filed Critical 大鵬薬品工業株式会社
Priority to US14/430,723 priority Critical patent/US9526791B2/en
Priority to CN201380055158.2A priority patent/CN104755490B/zh
Priority to KR1020157013081A priority patent/KR101678327B1/ko
Priority to JP2014543288A priority patent/JP5931212B2/ja
Priority to ES13848530.5T priority patent/ES2627056T3/es
Priority to EP13848530.5A priority patent/EP2910564B1/en
Publication of WO2014065245A1 publication Critical patent/WO2014065245A1/ja

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis

Definitions

  • the tumor tissue is a special environment having a low pH (around pH 6.5) as compared with physiological conditions (around pH 7.4), but the tumor tissue is specific to respond to such a weak pH change.
  • Drug delivery carriers that act on are still in development. So far, in view of the EPR effect (Enhanced Permeation and Retention Effect), a hydrophilic polymer such as polyethylene glycol (PEG) has been modified on the surface of liposomes and used as a carrier for anticancer agents. (For example, Patent Document 1).
  • PEG-modified carrier has a rate-determining drug release after delivery to the tumor tissue, and cannot efficiently release the drug within the tumor tissue.
  • the peptide-liposome complex described in Patent Document 2 has a positive charge due to the presence of a basic amino acid (lysine or arginine) in the N-terminal region, and the charge does not change depending on pH. Sufficient blood retention cannot be expected.
  • a basic amino acid lysine or arginine
  • Non-Patent Document 1 uses a His segment as a pH-responsive region, and the neutral His is positively charged when the external environment pH is greatly reduced from 7.4 to 5.0. Although it is a technique for collapsing micelles by increasing the electrostatic repulsion force, His alone is not sufficiently protonated at a weak acidity of pH 6.5, and it is difficult to cause charge reversal. Therefore, drug release with micelle disintegration at pH 6.5 cannot be expected.
  • Non-Patent Document 2 is a pH-responsive micelle in which dimethylmaleic acid chemically bonded to a block polymer terminal lysine segment is eliminated by lowering the pH, thereby converting the surface charge from minus to plus.
  • dimethylmaleic acid chemically bonded to a block polymer terminal lysine segment is eliminated by lowering the pH, thereby converting the surface charge from minus to plus.
  • a positively charged lysine residue is exposed, and even if the pH rises, it does not return.
  • JP 2004-10482 A JP-T-2004-523531
  • An object of the present invention is to provide a peptide compound for producing a drug delivery carrier capable of releasing a target substance in a weakly acidic pH environment such as cancer tissue.
  • the present invention provides the following peptide compounds (1) to (10), liposomes having the peptide compounds, and substance introduction agents using the liposomes.
  • a peptide compound composed of a hydrophilic amino acid block and a hydrophobic amino acid block [1] The total number of amino acids of the peptide compound is 24 to 36, [2] the total number of amino acids of the hydrophilic amino acid block is 4 to 10, and the average hydrophobicity is ⁇ 3.0 to ⁇ 1.0, [3] The total number of amino acids in the hydrophobic amino acid block is 20 to 32, has one or more His, and the average hydrophobicity is 1.0 to 2.5.
  • Peptide compound is a peptide compound composed of a hydrophilic amino acid block and a hydrophobic amino acid block, [1] The total number of amino acids of the peptide compound is 24 to 36, [2] the total number of amino acids of the hydrophilic amino acid block is 4 to 10, and the average hydrophobicity is ⁇ 3.0 to ⁇ 1.0, [3
  • the peptide according to (1) wherein the average hydrophobicity of the hydrophilic amino acid block is ⁇ 2.0 to ⁇ 1.5; the average hydrophobicity of the hydrophobic amino acid block is 1.5 to 2.0.
  • the hydrophilic amino acid block is composed of an amino acid having a hydrophobicity of ⁇ 3.0 or less and an amino acid having a hydrophobicity of 0 to ⁇ 1.0; the hydrophobic amino acid block is His
  • the amino acid constituting the hydrophilic amino acid block is an amino acid composed of His or Glu and Gly, and the amino acid constituting the hydrophobic amino acid block is His, Leu, Ala, Met, Cys, Phe, Val and Ile.
  • the peptide sequence in the hydrophilic amino acid block has 0 to 5 His and the peptide sequence in the hydrophobic amino acid block has 1 to 8 His, (1) to (4) A peptide compound in any of the above.
  • the hydrophilic amino acid block is represented by the following formula (I) (AA 1 ) (AA 2 ) (AA 3 ) (AA 4 ) (I) (Wherein any two of AA 1 , AA 2 , AA 3 and AA 4 are His or Glu, and the remaining two are Gly); the hydrophobic amino acid block is represented by the following formula (II 5-8 units represented by), the amino acid sequence of each unit may be the same or different, (AA 5 ) (AA 6 ) (AA 7 ) (AA 8 ) (II) (In the formula, AA 5 , AA 6 , AA 7 and AA 8 are the same or different and represent His, Leu or Ala, provided that at least one of the units of the formula (II) is one or two His.
  • a liposome comprising the peptide compound according to any one of (1) to (6) and a lipid.
  • the liposome according to (7) comprising 1 to 10 mol% of the peptide compound according to any one of (1) to (6) with respect to the total lipid amount in the liposome.
  • a pharmaceutical composition comprising the liposome according to any one of (7) to (10).
  • An antitumor agent comprising the liposome according to any one of (7) to (10).
  • a method for preventing or treating cancer comprising the step of administering to a mammal an effective amount for preventing or treating the cancer of the liposome according to any one of (7) to (10).
  • the liposome according to any one of (7) to (10) for use in the prevention or treatment of cancer.
  • a liposome capable of being released in a weakly acidic cellular environment around pH 6.5 without releasing a low-molecular target substance encapsulated therein under physiological conditions around pH 7.4 is provided. it can.
  • the liposome of the present invention can act by releasing a target substance in such a weak acidic region, an excellent drug delivery system can be provided.
  • the liposome of the present invention can retain the encapsulated target substance under physiological conditions of pH 7.4, and can respond sensitively even to weak acidity (pH 6.5), so that it reaches the tumor by the EPR effect. After that, under the weakly acidic conditions in the tumor surrounding environment, the electrostatic repulsion of the hydrophilic block and / or the decrease of the hydrophobic interaction of the hydrophobic block is induced to release the encapsulated target substance. Has usefulness.
  • the result of HPLC of the peptide compound 1 (sequence number 1) obtained in Example 1 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of the peptide compound 1 (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 1 is shown.
  • the result of HPLC of the peptide compound 2 (sequence number 2) obtained in Example 2 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of the peptide compound 2 (SEQ ID NO: 2) obtained in Example 2 is shown.
  • the result of HPLC of the peptide compound 3 (sequence number 3) obtained in Example 3 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of the peptide compound 3 (SEQ ID NO: 3) obtained in Example 3 is shown.
  • the result of the HPLC of the comparative compound 1 (sequence number 4) obtained in the comparative example 1 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of Comparative Compound 1 (SEQ ID NO: 4) obtained in Comparative Example 1 is shown.
  • the result of the HPLC of the comparative compound 2 (sequence number 5) obtained in the comparative example 2 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of Comparative Compound 2 (SEQ ID NO: 5) obtained in Comparative Example 2 is shown.
  • the result of HPLC of the comparison compound 3 (sequence number 6) obtained in the comparative example 3 is shown.
  • the result of MALDI-TOF-MS of Comparative Compound 3 (SEQ ID NO: 6) obtained in Comparative Example 3 is shown.
  • FIG. 2 shows CD spectra of peptide compound 1 alone and peptide-introduced liposomes. The antitumor effect of doxorubicin (Dox) simple substance and Dox encapsulated liposome in Test Example 5 is shown.
  • the liposome of the present invention is composed of a peptide compound and a liposome-forming component.
  • the peptide compound of the present invention is composed of a hydrophilic amino acid block and a hydrophobic amino acid block, and the total number of amino acids is 24 to 36, preferably 24 to 32, and more preferably 24 to 28.
  • the total number of amino acids in the hydrophilic amino acid block is 4 to 10, preferably 4 to 8.
  • the total number of amino acids in the hydrophobic amino acid block is 20 to 32, preferably 20 to 24. is there.
  • the peptide compound of the present invention is one in which one hydrophilic amino acid block and one hydrophobic amino acid block are linked by a peptide bond, and any amino acid block may be on the N-terminal side. It is preferably on the N-terminal side.
  • the peptide compound of the present invention has at least one His in the hydrophobic amino acid block, but it is essential from the viewpoint of responsiveness to weak acid that amino acids having a hydrophobicity of -3.0 or less containing His are not adjacent to each other. It is. Further, those having 1 to 13 His in the sequence of the peptide compound are preferable.
  • the hydrophilic amino acid block and the hydrophobic amino acid block constituting the peptide compound of the present invention have a specific average hydrophobicity.
  • the hydrophobicity of the amino acid used in the present invention is, for example, J.P. Mol. Biol. , (1982) 157, 105-132, and each amino acid constituting a living body exhibits a specific hydrophobicity (see Table 1).
  • the average hydrophobicity is described in, for example, Molecular Medicine 4: 240-257, 1998, and is obtained by dividing the total hydrophobicity of amino acids for each block below by the number of amino acids.
  • the hydrophilic amino acid block is composed of amino acids having a hydrophobicity of 0 or less, and the hydrophobic amino acid block is composed of His and amino acids exceeding 0. Therefore, the boundary between the hydrophilic amino acid block and the hydrophobic amino acid block is determined by the hydrophobicity of amino acids other than His. When His is present at the boundary, it is included in the hydrophilic amino acid block.
  • the hydrophilic amino acid block constituting the peptide compound of the present invention is an amino acid combination having an average hydrophobicity of ⁇ 3.0 to ⁇ 1.0, preferably ⁇ 2.0 to ⁇ 1.5. Any of these may be used, and those composed of an amino acid having a hydrophobicity of ⁇ 3.0 or less and an amino acid having a hydrophobicity of 0 to ⁇ 1.0 are preferred, and those composed of His or Glu and Gly are preferred. More preferably, those composed of His and Gly are more preferable. Further, those having 0 to 5 His in the peptide sequence in the hydrophilic amino acid block are preferable. More specifically, a hydrophilic amino acid block represented by the following formula (I) is particularly preferable.
  • the hydrophobic amino acid block constituting the peptide compound of the present invention may be any amino acid combination having an average hydrophobicity of 1.0 to 2.5, preferably 1.5 to 2.0. , His and those composed of amino acids with a hydrophobicity exceeding 0 are preferable, and those composed of His and any amino acid selected from Leu, Ala, Met, Cys, Phe, Val, or Ile are more preferable.
  • His and those composed of Leu or Ala, which are amino acids that easily adopt an ⁇ -helix structure, are particularly preferable. Further, those having 1 to 8 His in the peptide sequence in the hydrophobic amino acid block are preferable. More specifically, a hydrophobic amino acid block that includes 5 to 8 units represented by the following formula (II) and whose amino acid sequences may be the same or different is particularly preferable.
  • Particularly preferred peptide compounds of the present invention include His-Gly-His-Gly-Leu-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Leu-Leu-Ala-His-Ala-Ala-Leu-Ala-His.
  • the peptide compound of the present invention must be composed of the hydrophilic amino acid block and the hydrophobic amino acid block as described above.
  • Peptide compounds consisting only of hydrophobic amino acid blocks are incorporated into the hydrophobic part of the liposome and protons cannot enter the liposome, so the peptide compound does not respond even if the surrounding environment is acidic, and the structure of the liposome does not change. There seems to be nothing.
  • peptide compounds consisting only of hydrophilic amino acid blocks cannot be incorporated into liposomes.
  • the C-terminal of the peptide compound of the present invention may have a C-terminal protecting group.
  • the C-terminal protecting group includes a group that forms an amide with the carbon atom of the C-terminal carboxyl, or a group that forms an ester with the oxygen atom of the carboxyl.
  • Examples of the group that forms an ester include alkyl groups, in particular, linear or branched alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms (C 1 -C 5 alkyl groups), such as methyl group, ethyl group, and propyl group.
  • Groups that form amides include amine functional groups such as amino groups, or alkylamino functional groups such as mono C 1 -C 5 alkylamino groups such as methylamino, ethylamino, dimethylamino, diethylamino, methylethylamino, and the like, and A di-C 1 -C 5 alkylamino group is included, preferably an amide-forming group, and more preferably an amino group.
  • the peptide compound of the present invention can be produced by a known peptide synthesis method, particularly a liquid phase synthesis method or a solid phase synthesis method. It can also be synthesized by a method in which DNA encoding the peptide compound of the present invention is introduced into a host cell by gene recombination technology and expressed. For example, in the solid phase synthesis method, the carboxyl group of an N-protected amino acid in which the amino group of the amino acid corresponding to the C-terminus is protected with a urethane-type protecting group such as a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group is converted to an amino group.
  • a urethane-type protecting group such as a 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) group
  • the insoluble resin having an amino group is not particularly limited, but is preferably an Fmoc-NH-SAL resin (4- (2 ′, 4′-dimethoxyphenyl-Fmoc-aminoethyl) phenoxy linker resin), and directly by cleavage.
  • the object can be given.
  • the protected amino acid used for the synthesis of the peptide compound of the present invention can be obtained by protecting the functional group with a known protecting group by a known method, and a commercially available protected amino acid can also be used.
  • the protecting group known ones can be used. For example, methoxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, tert-butoxycarbonyl group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, 4-methoxybenzyloxycarbonyl group, 2 2,2-trichloroethyloxycarbonyl group, formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group and the like can be used.
  • a known method such as, for example, the DIPCDI (diisopropylcarbodiimide) -HOBt (1-hydroxybenzotriazole) method can be used.
  • This condensation reaction can be carried out in a known solvent, and examples thereof include organic solvents such as dimethylformamide.
  • the elimination reagent for the protecting group of the amino group is not limited, and the protecting group such as the Fmoc group can be cleaved by a known reagent such as piperidine / dimethylformamide.
  • Deprotection of the urethane-type protecting group can be carried out using catalytic reduction, trifluoroacetic acid or the like. Other protecting groups can also be deprotected by known methods.
  • the degree of progress of the condensation reaction at each stage of the synthesis can be confirmed by a known method such as a ninhydrin reaction method. As described above, a protected peptide having a desired amino acid sequence can be obtained.
  • the resin and the protecting group can be removed simultaneously by treatment with TMSBr (trimethylsilyl bromide), TFA (trifluoroacetic acid) or the like.
  • TMSBr trimethylsilyl bromide
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the C-terminus of the peptide compound can be obtained as COOH or CONH 2 depending on the type of resin used.
  • the peptide compound of the present invention thus obtained is isolated and purified by known means such as extraction, recrystallization, various chromatography (gel filtration, ion exchange, distribution, adsorption), electrophoresis, countercurrent distribution, etc.
  • the method by reverse phase high performance liquid chromatography is preferred.
  • the liposome of the present invention is a closed vesicle having a lipid bilayer structure
  • it may be a multilamellar liposome (MLV), an SUV (small unilamellar vesicle), an LUV (large uniaxial molecular vesicle), or a GUV (giant unimolecular vesicle).
  • MUV multilamellar liposome
  • SUV small unilamellar vesicle
  • LUV large uniaxial molecular vesicle
  • GUV giant unimolecular vesicle
  • the type of lipid constituting the lipid bilayer is not particularly limited, and specific examples thereof include phosphatidylcholine (for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine).
  • phosphatidylcholine for example, dioleoylphosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dimyristoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine.
  • phosphatidylglycerol eg, dioleoylphosphatidylglycerol, dilauroylphosphatidylglycerol, dimyristoylphosphatidylglycerol, dipalmitoylphosphatidylglycerol, distearoylphosphatidylglycerol (DSPG)
  • phosphatidylethanolamine eg, Dioleoylphosphatidylethanolamine, dilauro Phosphatidylethanolamine, dimyristoylphosphatidylethanolamine, dipalmitoylphosphatidylethanolamine, distearoylphosphatidiethanolamine
  • phospholipids such as phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidic acid, cardiolipin, etc .; sphingomyelin, ganglioside, etc.
  • the phospholipid may be egg yolk, soybean or other natural lipid derived from animals and plants (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), synthetic lipid or semi-synthetic lipid. These lipids can be used alone or in admixture of two or more.
  • lipid bilayers for example, cholesterol, cholesterol succinic acid, lanosterol, dihydrolanosterol, desmosterol, dihydrocholesterol to physically or chemically stabilize the lipid bilayer and to regulate the fluidity of the membrane
  • Sterols derived from animals such as stigmasterol, sitosterol, campesterol, sterols derived from plants such as brassicasterol; Sterols derived from microorganisms such as timosterol and ergosterol; Sugars such as glycerol and sucrose; Triolein 1 type, or 2 or more types can be contained among glycerol fatty acid esters, such as trioctanoin.
  • the content is not particularly limited, but is preferably 5 to 40% (molar ratio) with respect to the total amount of lipid constituting the lipid bilayer, and is preferably 10 to 30% (molar ratio). Further preferred.
  • Antibiotics such as tocopherol, propyl gallate, ascorbyl palmitate, butylated hydroxytoluene, etc .; charged substances that impart a positive charge such as stearylamine and oleylamine; negative charges such as dicetyl phosphate Charged substances; membrane proteins such as membrane surface proteins and membrane integral proteins can be contained, and the content can be appropriately adjusted.
  • the liposome of the present invention preferably contains a cationic lipid (cationic liposome).
  • cationic liposome examples include DODAC (dioctadecyldimethylammonium chloride), DOTMA (N- (2,3-dioleoyloxy) propyl-N, N, N-trimethylaluminium), DDAB (didedeoxylamidium-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dimethyl-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-dibromo-ammonium)).
  • DODAC dioctadecyldimethylammonium chloride
  • DOTMA N- (2,3-dioleoy
  • DOTMA and DSTAP have a quaternary amine and are always positively charged, while DODAP has a tertiary amine and has no charge at physiological pH.
  • DODAP has a tertiary amine and has no charge at physiological pH.
  • the liposome of the present invention preferably contains an auxiliary lipid.
  • the co-lipid for example, EPC (egg phosphatidylcholine), DLPC (dilinoleoylphosphatidylcholine), DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC (dipalmitoylphosphatidylcholine), DSPC (distearoylphosphatidylcholine), POPC (palmitoyloleoylphosphatidylcholine), DOPC (dioleoylphosphatidylcholine), DOPE (dioleoylphosphatidylethanolamine), SOPE ( stearyloylylphosphatidyl holine), and the like.
  • EPC egg phosphatidylcholine
  • DLPC diilinoleoylphosphatidylcholine
  • DMPC diimyristoylphosphatidylcholine
  • DPPC dipal
  • the liposome of the present invention has the peptide compound of the present invention as a constituent component.
  • the peptide compound of the present invention is used, it is preferably added at a ratio of about 1 to 10 mol% when the lipid constituting the liposome is 100 mol%.
  • the liposome of the present invention can be modified with a hydrophilic polymer.
  • hydrophilic polymers examples include polyalkylene glycols (polyalkylene glycol copolymers such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, polybutylene glycol, or block copolymers of polyethylene glycol and polypropylene glycol), dextran, pullulan, ficoll, and polyvinyl alcohol.
  • polyalkylene glycol polyethylene glycol, Polypropylene glycol, polybutylene glycol, or block copolymer of polyethylene glycol and polypropylene glycol Copolymers of polyalkylene glycols such as coalescence
  • PEG polyethylene glycol
  • PEG examples include DSPE (distaylyl phospholipidephthalamine) -PEG2000, DMPE (dimyristyl phosphatidylethylenolene) -PEG2000, DSG (distaylylethyl ceryl PEG-2000-PEG, PEG2000, DMG (dimyristolyl PEG) Of these, stearyl PEG2000 or C8 ceramide-PEG2000 is preferred.
  • the length of PEG can be appropriately selected within a molecular weight range of about 500 to 10,000. Those skilled in the art can select the molecular weight of other hydrophilic polymers as appropriate.
  • liposomes are PEG-modified, stearyl-modified PEG (STR-PEG), C8 ceramide-PEG, and cholesterol-PEG are used for stable storage without impairing the functional expression of the target substance (eg, nucleic acid drugs such as siRNA).
  • the target substance eg, nucleic acid drugs such as siRNA
  • DSPE-PEG, DSG-PEG, C16 ceramide-PEG and the like are preferably used in order to improve blood stability.
  • the hydrophilic polymer is preferably modified at a ratio of about 1 to 15 mol% when the lipid constituting the liposome is 100 mol%.
  • the liposome of the present invention can be prepared using a known method such as a hydration method, an ultrasonic treatment method, an ethanol injection method, an ether injection method, a reverse phase evaporation method, or a freezing / thawing method.
  • Lipids which are constituents of the lipid bilayer, are dissolved in an organic solvent, and then the organic solvent is removed by evaporation to obtain a lipid membrane.
  • the lipid membrane is hydrated and stirred or sonicated to produce liposomes.
  • this invention peptide compound can be introduce
  • auxiliary lipid (EtOH solution) / cationic lipid (EtOH solution) can be changed as appropriate.
  • Preferred liposomes of the present invention include liposomes having a composition of EPC / DOTAP / present peptide compound, EPC / present peptide compound, or EPC / DSPG / present peptide compound, preferably EPC / DOTAP / present peptide A liposome having the composition of the compound.
  • the zeta potential of the liposome of the present invention is about ⁇ 50 to +50 mV, preferably about ⁇ 40 to +40 mV, more preferably about ⁇ 30 to +30 mV at a pH near neutrality (for example, pH 7 or 7.4).
  • the zeta potential can be measured using a zeta sizer.
  • the average particle diameter of the liposome of the present invention is not particularly limited, but is, for example, a particle diameter of 30 to 1000 nm, preferably 50 to 500 nm, more preferably 60 to 200 nm.
  • the average particle diameter can be measured by, for example, a dynamic light scattering method, a static light scattering method, an electron microscope observation method, an atomic force microscope observation method, or the like.
  • the target substance to be delivered into the cell can be encapsulated inside the liposome of the present invention.
  • the target substance When the target substance is water-soluble, it is possible to encapsulate the target substance in the aqueous phase inside the liposome by adding the target substance to an aqueous solvent used when hydrating the lipid membrane in the production of liposomes. it can.
  • the target substance When the target substance is fat-soluble, the target substance can be encapsulated in the lipid bilayer of the liposome by adding the target substance to an organic solvent used in the production of the liposome.
  • “encapsulation” includes a target substance inside hollow particles such as liposomes.
  • the biological species to which the target substance is delivered is not particularly limited as long as it is a vertebrate, but is preferably a mammal.
  • mammals include humans, monkeys, cows, sheep, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • the liposome of the present invention can be used in the state of a dispersion, for example.
  • a dispersion solvent for example, a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, and acetate buffer can be used.
  • additives such as sugars, polyhydric alcohols, water-soluble polymers, nonionic surfactants, antioxidants, pH regulators, hydration accelerators may be added to the dispersion.
  • the liposome of the present invention can also be used in a state where the dispersion is dried (for example, freeze-dried, spray-dried, etc.).
  • the dried liposome can be made into a dispersion by adding a buffer solution such as physiological saline, phosphate buffer, citrate buffer, or acetate buffer.
  • the liposome of the present invention can be used both in vitro and in vivo.
  • examples of the administration route include intravenous injection, infusion and the like, and the dosage and administration frequency depend on the type and amount of the target substance enclosed in the liposome of the present invention. It can be adjusted accordingly.
  • a pharmaceutical carrier can be blended as necessary, and various administration forms can be adopted depending on the purpose of prevention or treatment.
  • a pharmaceutical carrier for example, an injection can be employed.
  • Various dosage forms can be produced by conventional pharmaceutical methods known to those skilled in the art.
  • pH regulators, buffers, stabilizers, tonicity agents, etc. can be added to the target substance, and subcutaneous, intramuscular and intravenous injections are produced by conventional methods. be able to.
  • pH adjuster and buffer examples include sodium citrate, sodium acetate, sodium phosphate and the like.
  • stabilizer examples include sodium pyrosulfite, EDTA, thioglycolic acid, thiolactic acid and the like.
  • isotonic agents include sodium chloride, glucose, D-mannitol, glycerin and the like.
  • the liposome of the present invention can be safely administered without any weight loss or liver damage.
  • the substance introduction agent of the present invention can be used either in vitro or in vivo to deliver a target substance to a weakly acidic pH site.
  • the weakly acidic pH site include an inflammatory site, a tumor site, an infection site, and the like, and a tumor site is particularly preferable.
  • the type of the target substance to be encapsulated is not particularly limited.
  • drugs drugs, nucleic acids, peptides (bioactive peptides such as oxytocin, bradykinin, thyrotropin releasing factor, enkephalin, peptide hormones, etc.), proteins (enzymes, interleukins, etc.) And one or more selected from the group consisting of sugars or complexes thereof, and can be appropriately selected depending on the purpose of diagnosis, treatment, etc. .
  • the “nucleic acid” includes analogs or derivatives thereof (for example, siRNA, peptide nucleic acid (PNA), phosphorothioate DNA, etc.) in addition to DNA or RNA. Further, the nucleic acid may be either single-stranded or double-stranded, and may be either linear or circular.
  • the liposome of the present invention it is possible to enclose a plurality of types of target substances having different molecular weights in the same liposome and make a difference in the release site.
  • a low molecular weight substance having a molecular weight of 700 or less releases specifically at weakly acidic pH, but a high molecular weight substance of 700 or more does not release in a weakly acidic pH environment, but is released after being taken into tumor cells. It is possible to apply.
  • the target substance is contained in an amount of 0.1 to 60 parts by mass, preferably 1 to 40 parts by mass with respect to 100 parts by mass of the total lipid and peptide constituting the liposome.
  • any drug can be used as long as it is a drug used in a tissue having a weakly acidic environment (pH 6.5), for example, an anticancer drug.
  • an anticancer drug Specifically, tegafur, doxorubicin, daunorubicin, cisplatin, oxaliplatin, carboplatin, paclitaxel, irinotecan, SN-38, actinomycin D, vincristine, vinblastine, methotrexate, azathioprine, fluorouracil, mitomycin C, docetaxel C, docetaxel, Cyclophosphamide, capecitabine, epirubicin, gemcitabine, mitoxantrone, leucovorin, vinorelbine, trastuzumab, etoposide, estramustine, prednisone, interferon alpha, interleukin-2, bleomycin, ifosfamide, mesna, altret
  • Anti-inflammatory agents include non-steroidal anti-inflammatory agents (eg, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, indomethacin, aspirin, diclofenac, piroxicam, acetaminophen, celecoxib, rofecoxib, etc.), steroidal anti-inflammatory agents (eg, hydrocortisone, prednisolone) Dexamethasone, betamethasone, etc.).
  • non-steroidal anti-inflammatory agents eg, ibuprofen, ketoprofen, naproxen, indomethacin, aspirin, diclofenac, piroxicam, acetaminophen, celecoxib, rofecoxib, etc.
  • steroidal anti-inflammatory agents eg, hydrocortisone, prednisolone
  • the target substance is a nucleic acid
  • mdRNA partial double-stranded RNA
  • ndsRNA nicked dsRNA
  • gdsRNA gapped dsRNA
  • siRNA siRNA
  • miRNA microRNA
  • shRNA hairpin RNA
  • shRNA short interference oligonucleotide
  • substituted short interference oligonucleotide substituted short interference oligonucleotide
  • chemically modified dsRNA post-transcriptional gene silencing RNA
  • ptgsRNA post-transcriptional gene silencing RNA
  • the double-stranded RNA (dsRNA) is preferably exemplified.
  • the target substance can be used alone or in admixture of two or more.
  • two or more siRNAs can be used in combination.
  • the double stranded RNA is at the 3 ′ end of the double stranded RNA, such as an overhang containing deoxyribonucleotides or two deoxyribonucleotides (eg, thymidine, adenine). It may contain 1 to 4 nucleotide overhangs at one or both ends. Double stranded RNA may have blunt ends at one or both ends. In some embodiments, the 5 'ends of the first and second strands are phosphorylated.
  • the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise a ribonucleotide or deoxyribonucleotide that is chemically modified in the sugar, base, or backbone of the nucleic acid.
  • the 3'-terminal nucleotide overhang may comprise one or more universal base ribonucleotides.
  • the 3 'terminal nucleotide overhang may comprise one or more acyclic nucleotides.
  • the dsRNA is 5 ′ phosphate (Martinez et al., Cell. 110: 563-574, 2002; and Schwartz et al., Molec. Cell. 10: 537-). 568, 2002) or a terminal phosphate group such as 5 ', 3' diphosphate.
  • Double-stranded RNA consists of 2′-deoxy, 2′-O-methyl, 2′-O-methoxyethyl, 2′-O-2-methoxyethyl, halogen, 2′-fluoro, 2′-O-allyl, Or it may further comprise 2 ′ sugar substitutions such as any combination thereof.
  • the double stranded RNA is alkyl, abasic, deoxyabasic, glyceryl, dinucleotide, acyclic nucleotide, on one or both ends of the first strand or one or more second strands, It further includes an end cap substituent such as an inverted deoxynucleotide moiety, or any combination thereof.
  • the double stranded RNA is independently phosphorothioate, chiral phosphorothioate, phosphorodithioate, phosphate triester, aminoalkylphosphate triester, methylphosphonate, alkylphosphonate, 3′- Alkylene phosphonates, 5'-alkylene phosphonates, chiral phosphonates, phosphonoacetates, thiophosphonoacetates, phosphinates, phosphoramidates, 3'-aminophosphoramidates, aminoalkyl phosphoramidates, At least one modified internucleoside linkage, such as thionophosphoramidate, thionoalkylphosphonate, thionoalkylphosphate triester, selenophosphate, boranophosphate linkage, or any combination thereof. Further may be included.
  • Double-stranded RNA is 5-methylcytosine; 5-hydroxymethylcytosine; xanthine; hypoxanthine; 2-aminoadenine; 6-methyl, 2-propyl, or other alkyl derivatives of adenine and guanine; 8-substituted Adenine and guanine (8-aza, 8-halo, 8-amino, 8-thiol, 8-thioalkyl, 8-hydroxyl, etc.); 7-methyl, 7-deaza, and 3-deazaadenine and guanine; 2-thiouracil; 2 2-thiocytosine; 5-methyl, 5-propynyl, 5-halo (such as 5-bromo or 5-fluoro), 5-trifluoromethyl, or other 5-substituted uracil and cytosine; and 6- Substitution or modification (chemical modification) by using nucleic acid analogs such as azouracil Including) can be.
  • RNA such as double-stranded RNA (dsRNA) can be chemically modified.
  • Non-limiting examples of such chemical modifications include internucleotide phosphorothioate linkages, 2′-deoxyribonucleotides, 2′-O-methylribonucleotides, 2′-deoxy-2′-fluororibonucleotides, “acyclic” "Incorporation of nucleotides, 5'-C-methyl nucleotides, and glyceryl and / or reverse deoxyabasic residues at the termini. These chemical modifications can maintain RNAi activity in the cell.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing the liposome.
  • the diseases targeted by the pharmaceutical composition of the present invention for prevention and treatment can be selected according to the type of the target substance and are not particularly limited.
  • Examples of the pharmaceutical composition of the present invention include antitumor agents. .
  • Example 1 Synthesis of HGHGLALLAHALLAHAALAHAALA (SEQ ID NO: 1, Peptide Compound 1) Starting from Fmoc-Ala-HMP Resin, an amino acid, a condensing agent (HBTU / HOBt), and a reaction accelerator (DIEA) were each resin on a 0.1 mM scale.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 was synthesized by the Fmoc solid phase synthesis method using 4 equivalents (HBTU: MW 379.2, HOBt, Anhydrous: MW 135.1, DIEA: MW 129.2).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • 125 ml TFA, 0.25 ml H 2 O, 0.375 g phenol, 0.125 ml ethanedithiol and 0.25 ml thioanisole was added to the synthesized resin, and the mixture was ice-cooled for 15 minutes.
  • the reaction was carried out at room temperature for 2 hours, and the peptide was excised from the resin and precipitated with diethyl ether to obtain a crude peptide.
  • Purification work was performed by HPLC and lyophilized. The purity test was performed by HPLC and MALDI-TOF-MS. Analysis was carried out under the following HPLC conditions to obtain the target peptide compound 1 (SEQ ID NO: 1) as a single peak.
  • Example 2 Synthesis of GHHGALLALLHALAAAALHAAALA (peptide compound 2) Peptide compound 2 (SEQ ID NO: 2) was obtained by the same method as in Example 1. Calculated molecular weight: 2320.7, measured value: 230.004. The results of HPLC and MALDI-TOF-MS are shown in FIG. The average hydrophobicity is shown in Table 3 described later.
  • Example 3 Synthesis of EGEGLALLAHALLAHALALAHAALA (peptide compound 3) Peptide compound 3 (SEQ ID NO: 3) was obtained by the same method as in Example 1. Calculated molecular weight: 2304.6, measured value: 2305.14. The results of HPLC and MALDI-TOF-MS are shown in FIG. The average hydrophobicity is shown in Table 3 described later.
  • Comparative Example 1 Synthesis of HHGGLLLHHHAAAAAALLLAAAAA (Comparative Compound 1) Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 to obtain Comparative Compound 1 (SEQ ID NO: 4). Calculated molecular weight: 2320.7, measured value: 2320.65. The results of HPLC and MALDI-TOF-MS are shown in FIG. The average hydrophobicity is shown in Table 3 described later.
  • Comparative Example 3 Synthesis of HGHGLALLAHALLAHAAAAL (Comparative Compound 3) Synthesis was performed in the same manner as in Example 1 to obtain Comparative Compound 3 (SEQ ID NO: 6). Calculated molecular weight: 1928.2, found: 1929.58. The results of HPLC and MALDI-TOF-MS are shown in FIG. The average hydrophobicity is shown in Table 3 described later.
  • liposome 1 composed of EPC / DOTAP / peptide compound 1 (lipid concentration 10 mM).
  • Test Example 1 Measurement of Encapsulated Drug Leakage under Different pH Conditions (1) After preparing a peptide-containing lipid thin film by the same method as in Example 4, a 30 mM solution of calcein (Mw 622.55) was added. Calcein-encapsulated liposome 1 was prepared in the same manner. Unencapsulated calcein was removed by gel filtration (Sephadex G50).
  • the liposomes were diluted and suspended with a buffer having a different pH, incubated at 37 ° C. for 10 minutes, and then leaked using a plate reader (infinite M200, TECAN).
  • the fluorescence ( ⁇ ex: 488 nm, ⁇ em: 517 nm) of the calcein thus prepared was measured.
  • the fluorescence of calcein leaked when 1% Triton-X100 was mixed with the liposome was defined as the complete leakage amount.
  • the leakage rate was calculated by the following formula. The results are shown in FIG.
  • Leakage rate (%) (F sample ⁇ F pH 7.4 ) / (F triton ⁇ F pH 7.4 ) ⁇ 100
  • F sample fluorescence of calcein leaked from liposome under each pH
  • F pH 7.4 fluorescence of calcein leaked from liposome at pH 7.4
  • F triton fluorescence of calcein when 1% Triton-X100 was mixed with the liposome No leakage was observed at pH 7.4, but about 100% of calcein leakage was observed at pH 6.5.
  • Example 3 After preparing a peptide-containing lipid thin film in the same manner as in Example 4, a 15 mM solution of calcein (Mw 622.55) and a 1 mg / ml solution of Texas Red labeled dextran (Mw 3,000) were added. A two-component encapsulated liposome 1 was prepared in the same manner as in Example 4. Unencapsulated calcein and dextran were removed by dialysis using a dialysis membrane (fractionated molecular weight: 14,000). The amount of leakage of the encapsulated Texas Red labeled dextran and calcein from the liposome was measured in the same manner as described above. The results are shown in FIG.
  • the liposome of the present invention can be leaked from a low molecular weight compound in a pH-dependent manner, and when a compound having a different molecular weight is encapsulated, the compound can be leaked stepwise according to the molecular weight.
  • Test Example 2 Peptide of peptide alone and peptide-introduced liposome at different pH conditions (presentation of necessity of pH responsiveness and membrane structure base)
  • the peptide compound 1 alone obtained in Example 1 and the peptide-introduced liposomes obtained in accordance with Example 4 were suspended in PBS ( ⁇ ) of different pH, and J-720WI (JASCO) CD (Circular Dichroism) spectrum was measured using a product manufactured by Co., Ltd. The results are shown in FIG.
  • ⁇ -helix means an ⁇ -helix structure
  • random coil structure means a state where no clear secondary structure is taken.
  • Example 5 Preparation of Liposomes with Different Lipid Composition
  • An anionic liposome 3 in which EPC / DSPG / peptide compound 1 1/1/5 mol% was prepared according to the same method as in Example 4.
  • Test Example 3 Measurement of Encapsulated Drug Leakage in Various Liposomes Calcein was encapsulated in the liposome 1 obtained in Example 4 and the liposomes 2 and 3 obtained in Example 5, respectively, and pH was measured in the same manner as in Test Example 1. Responsiveness was examined. As a result, no leakage of calcein was observed in any liposome at pH 7.4, but cationic liposome 1 was the best at pH 6.5, and anionic liposome 3 and neutral liposome 2 leaked in this order. Decreased. That is, it was suggested that it is most preferable to mount the peptide compound on the cationic liposome in order for the liposome to be responsive at a weak low pH.
  • Example 6 In accordance with the method described in Example 4, liposome 2 into which peptide compound 2 obtained in Example 2 was introduced was prepared, and calcein-encapsulated liposome 2 was prepared by the same preparation method as in Test Example 1.
  • Example 7 In accordance with the method described in Example 4, liposome 3 into which peptide compound 3 obtained in Example 3 was introduced was prepared, and calcein-encapsulated liposome 3 was prepared by the same preparation method as in Test Example 1.
  • Comparative Example 4 In accordance with the method described in Example 4, comparative liposome 1 into which comparative compound 1 obtained in Comparative Example 1 was introduced was prepared, and calcein-encapsulated comparative liposome 1 was prepared by the same preparation method as in Test Example 1.
  • Comparative Example 5 In accordance with the method described in Example 4, comparative liposome 2 into which comparative compound 2 obtained in comparative example 2 was introduced was prepared, and calcein-encapsulated comparative liposome 2 was prepared by the same preparation method as in test example 1.
  • Comparative Example 6 In accordance with the method described in Example 4, comparative liposome 3 into which comparative compound 3 obtained in Comparative Example 3 was introduced was prepared, and calcein-encapsulated comparative liposome 3 was prepared by the same preparation method as in Test Example 1.
  • Test Example 4 Average Hydrophobicity and Encapsulated Drug Leakage Rate of Peptide-Introduced Liposomes For each calcein-encapsulated liposome obtained in Examples 4, 6, and 7 and Comparative Examples 4 to 6, the pH was adjusted to 7 by the same method as in Test Example 1. The leak rate of calcein at .4 and pH 6.5 was calculated. The results are shown in Table 3.
  • liposome into which the comparative compound 2 having a changed average hydrophobicity was introduced the leakage of the encapsulated drug was remarkably lowered even when the pH was changed from 7.4 to 6.5, and the pH responsiveness was insufficient.
  • liposomes were prepared by introducing Comparative Compound 3 with 4 residues reduced relative to Peptide Compound 1, but significantly aggregated at pH 6.5 or lower. Attempts were made to encapsulate calcein, but even at pH 7.4, the same fluorescence intensity was observed as when treated with Triton. It was suggested that the drug cannot be encapsulated.
  • EPC egg yolk phosphatidylcholine
  • DOTAP dioleoyltetraammoniumpropane
  • the solution was dispensed into a test tube, and the ethanol solution of peptide compound 1 obtained in Example 1 was added in an amount of 5 mol% of the total lipid amount, and further the ethanol solution of polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine (PEG-DSPE) was totaled.
  • PEG-DSPE polyethylene glycol-distearoylphosphatidylethanolamine
  • a lipid thin film was prepared by adding 5 mol% of the lipid amount and further mixing an equal amount of chloroform with nitrogen gas blown to dryness. Next, 250 mM ammonium sulfate (pH 8.5) was added and fully hydrated at room temperature for 10 minutes. After hydration, the test tube was sonicated using a water tank type ultrasonic device to prepare liposome 4 composed of EPC / DOTAP / PEG-DSPE / peptide compound 1 (lipid concentration 10 mM). The prepared liposome 4 was subjected to gel filtration using a Sephadex G-50 column equilibrated with 10% sucrose (pH 8.5), and the lipid concentration in the collected fraction was quantified using Phospholipid Test Wako.
  • a Dox solution (2 mg / ml) was added to the liposome 4 and incubated at 65 ° C. for 1 hour, and then unencapsulated Dox was removed by gel filtration using a Sephadex G-50 column.
  • the amount of Dox encapsulated in liposome 4 was solubilized by Triton-X treatment, and then quantified by measuring the absorbance at 490 nm using a plate reader (infinite M200, TECAN).
  • a tumor-bearing hairless mouse formed by transplanting B16-F1 cells subcutaneously was grown to 100 mm 3 in a Dox solution or Dox-encapsulated liposome. 4 was administered via the tail vein 5 days, 8 days, 12 days after transplantation at a Dox concentration of 0.5 mg / kg per administration.

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Abstract

　本発明が解決すべき課題は、弱酸性ｐＨ環境中で目的物質を放出し得る薬物送達キャリアを作製するためのペプチド化合物を提供することである。本発明は、親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックから構成されるペプチド化合物であって、〔１〕ペプチド化合物の総アミノ酸数は２４～３６であり、〔２〕親水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が４～１０で、平均疎水性度が－３．０～－１．０であり、〔３〕疎水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が２０～３２で、Ｈｉｓを１個以上有し、平均疎水性度が１．０～２．５である、ペプチド化合物を提供する。

Description

弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソーム
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１２年１０月２２日に出願された、日本国特許出願第２０１２－２３３０１１号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
本発明は、弱酸性ｐＨ応答性ペプチド及び該ペプチドを含むリポソームに関する。
　癌の化学療法において、特異性の向上を目的としたＤＤＳの開発が試みられているが、腫瘍環境に着目したものはほとんどない。即ち、腫瘍組織は生理的条件下（ｐＨ７．４付近）に比べ低ｐＨ（ｐＨ６．５付近）という特殊な環境であるが、このような微弱なｐＨの変化に応答するように腫瘍組織特異的に作用する薬物送達キャリアは未だ開発途上にある。これまでにも、ＥＰＲ効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　Ｅｆｆｅｃｔ）を期待して、親水性高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がリポソームなどの表面に修飾され、抗がん剤などのキャリアとして用いられている（例えば、特許文献１）。しかし、ＰＥＧ修飾キャリアは腫瘍組織へ送達後の薬物放出が律速であり、腫瘍組織内で効率的に薬物を放出することができない。特許文献２に記載のペプチド－リポソーム複合体は、Ｎ末端領域に塩基性アミノ酸（リジンもしくはアルギニン）が存在することで正電荷を有しており、ｐＨに依存して電荷が変化することはなく、十分な血中滞留性は期待できない。
　非特許文献１は、ｐＨ応答性領域としてＨｉｓセグメントを用いており、外部環境ｐＨが７．４から５．０にまで大幅に低下することによって中性であったＨｉｓがプラスに荷電し、その静電的反発力の増大によってミセルを崩壊させる技術であるが、Ｈｉｓ単独ではｐＨ６．５という微弱酸性では十分にプロトン化されないため、電荷反転を生じさせることは困難である。従って、ｐＨ６．５においてミセルの崩壊を伴う薬物放出は期待できない。
　非特許文献２は、ブロックポリマー末端リジンセグメントに化学的に結合させたジメチルマレイン酸が、ｐＨ低下によって脱離し、それによって表面荷電がマイナスからプラスに転換するｐＨ応答性のミセルである。非特許文献２のペプチドは、いったんジメチルマレイン酸が脱離したら、プラス電荷のリジン残基が露出した状態になり、ｐＨが上昇したとしても元に戻ることはない。
特開２００４－１０４８１号公報 特表２００４－５２３５３１号公報
ＡＩＣｈＥ　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｖｏｌ．５６，　Ｎｏ．７，　２０１０，　ｐｐ．１９２２－１９３１ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　３７６　（２００９）　１３４－１４０
　本発明は、癌組織のような弱酸性ｐＨ環境中で目的物質を放出し得る薬物送達キャリアを作製するためのペプチド化合物を提供することを目的とする。
　本発明は、下記（１）～（１０）のペプチド化合物、該ペプチド化合物を有するリポソーム、及び該リポソームを用いた物質導入剤を提供する。
（１）親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックから構成されるペプチド化合物であって、
〔１〕ペプチド化合物の総アミノ酸数は２４～３６であり、〔２〕親水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が４～１０で、平均疎水性度が－３．０～－１．０であり、〔３〕疎水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が２０～３２で、Ｈｉｓを１個以上有し、平均疎水性度が１．０～２．５である、
ペプチド化合物。
（２）親水性アミノ酸ブロックの平均疎水性度が－２．０～－１．５であり；疎水性アミノ酸ブロックの平均疎水性度が１．５～２．０である（１）記載のペプチド化合物。
（３）親水性アミノ酸ブロックが、疎水性度が－３．０以下であるアミノ酸と疎水性度が０～－１．０であるアミノ酸で構成されたものであり；疎水性アミノ酸ブロックが、Ｈｉｓと疎水性度が０を超えるアミノ酸で構成されたものである、（１）又は（２）に記載のペプチド化合物。
（４）親水性アミノ酸ブロックを構成するアミノ酸がＨｉｓ又はＧｌｕとＧｌｙで構成されるアミノ酸であり、疎水性アミノ酸ブロックを構成するアミノ酸がＨｉｓと、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される任意のアミノ酸である（１）～（３）のいずれかに記載のペプチド化合物。
（５）親水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを０～５個有し、疎水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを１～８個有することを特徴とする（１）～（４）記載のいずれかにペプチド化合物。
（６）親水性アミノ酸ブロックが、下記式（Ｉ）
　（ＡＡ１）（ＡＡ２）（ＡＡ３）（ＡＡ４）　　　　（Ｉ）
（式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４は、いずれか２つがＨｉｓ又はＧｌｕであり、残りの２つがＧｌｙである。）で表され；疎水性アミノ酸ブロックが、下記式（II）で表されるユニットを５～８個含み、各ユニットのアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい、
　（ＡＡ５）（ＡＡ６）（ＡＡ７）（ＡＡ８）　　　　（II）
（式中、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７及びＡＡ８は、同一又は異なって、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ又はＡｌａを示す。ただし、式（II）のユニットの少なくとも１つは、Ｈｉｓを１個又は２個含む。）
（１）～（５）のいずれかに記載のペプチド化合物。
（７）　（１）～（６）のいずれかに記載のペプチド化合物と脂質を有することを特徴とするリポソーム。
（８）リポソーム中の総脂質量に対して、（１）～（６）のいずれかに記載のペプチド化合物を１～１０モル％含むことを特徴とする（７）記載のリポソーム。
（９）リポソームがカチオン性リポソームである、（８）に記載のリポソーム。
（１０）目的物質をリポソームに封入してなる、（７）～（９）のいずれかに記載のリポソーム。
（１１）（７）～（１０）のいずれかに記載のリポソームを含む医薬組成物。
（１２）（７）～（１０）のいずれかに記載のリポソームを含む抗腫瘍剤。
（１３）哺乳動物に対して（７）～（１０）のいずれかに記載のリポソームの癌に対する予防又は治療有効量を投与する工程を含む、癌の予防又は治療方法。
（１４）癌の予防又は治療剤を製造するための（７）～（１０）のいずれかに記載のリポソームの使用。
（１５）癌の予防又は治療に使用するための（７）～（１０）のいずれかに記載のリポソーム。
　本発明によれば、ｐＨ７．４付近の生理条件下では内部に封入された低分子の目的物質を放出せず、ｐＨ６．５付近の弱酸性の細胞環境で放出可能なリポソームを提供することができる。
　本発明のリポソームは、このような弱い酸性領域で目的物質を放出して作用させることができるため、優れた薬物送達システムを提供することができる。
　本発明のリポソームは、ｐＨ７．４の生理的条件では内封された目的物質を保持することが可能であるとともに、微弱酸性（ｐＨ６．５）でも敏感に応答できるため、ＥＰＲ効果によって腫瘍に到達した後に、腫瘍周辺環境の微弱酸性条件下で親水性ブロックの静電的反発及び/又は疎水性ブロックの疎水性相互作用の低下が誘導されることにより内封された目的物質を放出するという高い有用性を有している。
実施例１で得たペプチド化合物１（配列番号１）のＨＰＬＣの結果を示す。 実施例１で得たペプチド化合物１（配列番号１）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 実施例２で得たペプチド化合物２（配列番号２）のＨＰＬＣの結果を示す。 実施例２で得たペプチド化合物２（配列番号２）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 実施例３で得たペプチド化合物３（配列番号３）のＨＰＬＣの結果を示す。 実施例３で得たペプチド化合物３（配列番号３）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 比較例１で得た比較化合物１（配列番号４）のＨＰＬＣの結果を示す。 比較例１で得た比較化合物１（配列番号４）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 比較例２で得た比較化合物２（配列番号５）のＨＰＬＣの結果を示す。 比較例２で得た比較化合物２（配列番号５）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 比較例３で得た比較化合物３（配列番号６）のＨＰＬＣの結果を示す。 比較例３で得た比較化合物３（配列番号６）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を示す。 カルセイン封入リポソーム１について、異なるｐＨ条件における内封薬物漏出率の測定結果を示す。 Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストラン封入リポソーム１について、異なるｐＨ条件における内封薬物漏出率の測定結果を示す。 カルセイン及びＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストラン封入リポソーム１について、異なるｐＨ条件における内封薬物漏出率の測定結果を示す。 ペプチド化合物１単体およびペプチド導入リポソームのＣＤスペクトルを示す。 試験例５におけるドキソルビシン(Dox)単体及びDox封入リポソームの抗腫瘍効果を示す。
　本発明のリポソームは、ペプチド化合物とリポソーム形成成分から構成される。
　本発明ペプチド化合物は、親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックから構成され、その総アミノ酸数としては、２４～３６個、好ましくは２４～３２個、より好ましくは２４～２８個である。親水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数としては、４～１０個で、好ましくは４～８個であり、疎水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数としては、２０～３２個で、好ましくは２０～２４個である。
　本発明ペプチド化合物は、１つの親水性アミノ酸ブロックと１つの疎水性アミノ酸ブロックがペプチド結合で結合されたものであり、いずれのアミノ酸ブロックがＮ末端側であってもよいが、親水性アミノ酸ブロックがＮ末端側にあるのが好ましい。
　また、本発明ペプチド化合物は、その疎水性アミノ酸ブロックにはＨｉｓを１以上有するが、Ｈｉｓを含む疎水性度－３．０以下のアミノ酸同士は隣接しないことが弱酸性に対する応答性の観点から必須である。また、ペプチド化合物の配列中にＨｉｓを１～１３個有するものが好ましい。
　本発明のペプチド化合物を構成する親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックは特有の平均疎水性度を有する。ここで、本発明で用いられるアミノ酸の疎水性度（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｉｎｄｅｘ）とは、例えばＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８２）１５７，１０５－１３２に記載のものであり、生体を構成する各アミノ酸は特有の疎水性度を示す（表１参照）。また、平均疎水性度は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　４：２４０－２５７，１９９８に記載のものであり、下記ブロックごとのアミノ酸の疎水性度の総和をアミノ酸数で除したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明の好ましい実施形態において、親水性アミノ酸ブロックは疎水性度が０以下のアミノ酸から構成され、疎水性アミノ酸ブロックはＨｉｓ及び０を超えるアミノ酸から構成される。従って、親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックの境界は、Ｈｉｓ以外のアミノ酸の疎水性度により決定される。Ｈｉｓが境界に存在する場合には、親水性アミノ酸ブロックに含まれることとなる。
　本発明ペプチド化合物を構成する親水性アミノ酸ブロックとしては、平均疎水性度が－３．０～－１．０、好ましくは－２．０～－１．５となるようなアミノ酸の組合せであればいずれでもよいが、疎水性度が－３．０以下であるアミノ酸と疎水性度が０～－１．０であるアミノ酸で構成されたものが好ましく、Ｈｉｓ又はＧｌｕとＧｌｙで構成されたものがより好ましく、ＨｉｓとＧｌｙで構成されたものが更に好ましい。また、親水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを０～５個有するものが好ましい。より具体的には、下記式（Ｉ）で表される親水性アミノ酸ブロックが特に好ましい。
　（ＡＡ１）（ＡＡ２）（ＡＡ３）（ＡＡ４）　　　　（Ｉ）
［式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４は、いずれか２つがＨｉｓ又はＧｌｕであり、残りの２つがＧｌｙである（特に好ましくは、いずれか２つがＨｉｓであり、残りの２つがＧｌｙである）。］
　本発明ペプチド化合物を構成する疎水性アミノ酸ブロックとしては、平均疎水性度が１．０～２．５、好ましくは１．５～２．０となるようなアミノ酸の組合せであればいずれでもよいが、Ｈｉｓと疎水性度が０を超えるアミノ酸で構成されたものが好ましく、Ｈｉｓと、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ又はＩｌｅから選択される任意のアミノ酸で構成されたものがより好ましく、Ｈｉｓと、α－ｈｅｌｉｘ構造を取りやすいアミノ酸であるＬｅｕ又はＡｌａで構成されたものが特に好ましい。また、疎水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを１～８個有するものが好ましい。より具体的には、下記式（II）で表されるユニットを５～８個含み、各ユニットのアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい、である疎水性アミノ酸ブロックが特に好ましい。
　（ＡＡ５）（ＡＡ６）（ＡＡ７）（ＡＡ８）　　　　（II）
［式中、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７及びＡＡ８は、同一又は異なって、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ又はＡｌａを示す。ただし、各ユニット間あるいはユニット内の２つのＨｉｓは隣接しない。］
　本発明ペプチド化合物の特に好ましいものとしては、Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ（配列番号１）、Ｇｌｙ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ（配列番号２）、Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ（配列番号３）が挙げられる。
　本発明ペプチド化合物は上記のような親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックから構成されることが必須である。疎水性アミノ酸ブロックのみからなるペプチド化合物では、リポソームの疎水性部に取り込まれリポソーム内部にプロトンが侵入できないため、周囲の環境が酸性に傾いてもペプチド化合物は応答せず、リポソームの構造変化は起こらないものと思われる。また、親水性アミノ酸ブロックのみからなるペプチド化合物では、リポソームに組み入れることができない。
　また、本発明ペプチド化合物のＣ末端にはＣ末端保護基を有していてもよい。Ｃ末端保護基としては、Ｃ末端カルボキシルの炭素原子でアミドを形成する基、又はカルボキシルの酸素原子でエステルを形成する基が含まれる。エステルを形成する基としてはアルキル基、特に炭素数１～５の直鎖又は分枝鎖アルキル基（Ｃ１～Ｃ５アルキル基）、例えば、メチル基、エチル基及びプロピル基などが含まれ、アミドを形成する基としてはアミノ基のようなアミン官能基、又はアルキルアミノ官能基、例えば、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のモノＣ１～Ｃ５アルキルアミノ基及びジＣ１～Ｃ５アルキルアミノ基が含まれ、好ましくはアミドを形成する基であり、より好ましくはアミノ基である。
　本発明ペプチド化合物は、公知のペプチド合成法、特に液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。また、本発明ペプチド化合物をコードするＤＮＡを遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入し、発現させる方法によっても合成することができる。例えば、固相合成法では、Ｃ末端に対応するアミノ酸のアミノ基を９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基などのウレタン型保護基で保護したＮ－保護アミノ酸のカルボキシル基を、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、アミノ基の保護基を除去し、Ｎ末端方向に順次保護アミノ酸を縮合させ、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱保護させて、本発明のペプチド化合物を得ることができる。前記のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、特に限定されないが、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ樹脂（４－（２’，４’－ジメトキシフェニル－Ｆｍｏｃ－アミノエチル）フェノキシリンカー樹脂）が好ましく、開裂によって直接目的物を与えることができる。本発明のペプチド化合物の合成に用いる保護アミノ酸は、官能基を公知の方法により公知の保護基で保護することにより得ることができ、市販の保護アミノ酸を使用することもできる。保護基としては公知のものが使用でき、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、４－メトキシベンジルオキシカルボニル基、２，２，２－トリクロロエチルオキシカルボニル基、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基等を使用できる。保護アミノ酸を調製する場合には、例えば、ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）－ＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）法等のような公知の方法を用いることができる。本縮合反応は公知の溶媒中で行うことができ、例えば、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒が例示される。アミノ基の保護基の脱離試薬としては限定されず、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等の公知の試薬によって、Ｆｍｏｃ基等の保護基を切断することができる。ウレタン型保護基の脱保護は、接触還元、トリフルオロ酢酸などを用いて行うことができる。他の保護基も公知の方法により脱保護できる。合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、例えばニンヒドリン反応法のような公知の方法によって確認することができる。上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチドを得ることができる。不溶性樹脂としてＦｍｏｃ－ＮＨ－ＳＡＬ樹脂を用いた場合、ＴＭＳＢｒ（トリメチルシリルブロミド）やＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）等で処理することにより、樹脂及び保護基を同時に脱離させることができる。なお、ペプチド化合物のＣ末端は使用する樹脂の種類により、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２として得ることができる。
　このようにして得られた本発明ペプチド化合物は、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着)、電気泳動、向流分配等、公知の手段により単離精製することができ、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が好ましい。
　本発明リポソームは、脂質二重層構造を有する閉鎖小胞である限り、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ　ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。
　本発明のリポソームにおいて、脂質二重層を構成する脂質の種類は特に限定されるものではなく、その具体例としては、ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール（ＤＳＰＧ））、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン等のリン脂質又はこれらの水素添加物；スフィンゴミエリン、ガングリオシド等の糖脂質が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を使用することができる。リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物に由来する天然脂質（例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン等）、合成脂質又は半合成脂質のいずれであってもよい。これらの脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
　脂質二重層には、脂質二重層を物理的又は化学的に安定させたり、膜の流動性を調節したりするために、例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール等の動物由来のステロール；スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール等の植物由来のステロール（フィトステロール）；チモステロール、エルゴステロール等の微生物由来のステロール；グリセロール、シュクロース等の糖類；トリオレイン、トリオクタノイン等のグリセリン脂肪酸エステルのうち、１種又は２種以上を含有させることができる。その含有量は特に限定されるものでないが、脂質二重層を構成する総脂質量に対して５～４０％（モル比）であることが好ましく、１０～３０％（モル比）であることがさらに好ましい。
　脂質二重層には、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤；ステアリルアミン、オレイルアミン等の正荷電を付与する荷電物質；ジセチルホスフェート等の負電荷を付与する荷電物質；膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等の膜タンパク質を含有させることができ、その含有量は適宜調節することができる。
　本発明のリポソームには、カチオン性脂質が含まれること（カチオン性リポソーム）がより好ましい。カチオン性脂質としては、例えば、ＤＯＤＡＣ（ｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＤＡＢ（ｄｉｄｏｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＤＯＴＡＰ（１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｏｘｙ－３－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ　ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（３β－Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）－ｃａｒｂａｍｏｌ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、ＤＭＲＩＥ（１，２－ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＳＰＡ（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｙ－Ｎ－［２（ｓｐｅｒｍｉｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］－Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－１－ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｕｍ　ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）、ＤＳＴＡＰ（１，２－Ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ－３－Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　Ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｄｉｏｌｅｏｙｌ－３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ－ｐｒｏｐａｎｅ）等が挙げられる。好ましいカチオン性脂質はＤＯＴＭＡ、ＤＳＴＡＰ又はＤＯＤＡＰであり、特に好ましくはＤＯＴＡＰが挙げられる。カチオン性脂質は単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
　カチオン性脂質において、ＤＯＴＭＡ及びＤＳＴＡＰは４級アミンを有しており，常に正電荷を帯びているが，ＤＯＤＡＰは３級アミンを有しており，生理的ｐＨにおいて電荷を持たないものである。このようにカチオン性脂質の種類、配合量を変更することで、カチオン性脂質の構造，特徴に幅を持たせることができる。
　本発明のリポソームは、好ましくは、補助脂質（Ｈｅｌｐｅｒ　ｌｉｐｉｄ）が含まれる。補助脂質としては、例えば、ＥＰＣ（ｅｇｇ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＬＰＣ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＭＰＣ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＰＰＣ（ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＳＰＣ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＰＯＰＣ（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＣ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ），ＤＯＰＥ（ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ），ＳＯＰＥ（ｓｔｅａｒｙｌｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）等が挙げられる。これらのうち、ＥＰＣ，ＤＯＰＣ，ＤＯＰＥ，ＳＯＰＥが好ましい。
　本発明のリポソームは、本発明ペプチド化合物を構成成分に有する。本発明ペプチド化合物を用いる際、リポソームを構成する脂質を１００モル％とした場合に１～１０モル％程度の割合で添加するのが好ましい。
　本発明のリポソームは、親水性ポリマーにより修飾することができる。
　親水性ポリマーとしては、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン－無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸交互共重合体、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられ、好ましくはポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、或いはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのブロック共重合体などのポリアルキレングリコールの共重合体）、特に好ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられ、これらの親水性ポリマーによりリポソームを修飾するのが好ましい。ＰＥＧとしては、ＤＳＰＥ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）－ＰＥＧ２０００、ＤＭＰＥ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）－ＰＥＧ２０００、ＤＳＧ（ｄｉｓｔｅａｒｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ（ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）－ＰＥＧ２０００、コレステロールＰＥＧ２０００、ステアリルＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００、Ｃ１６セラミド－ＰＥＧ２０００などが挙げられ、これらのうち、ステアリルＰＥＧ２０００又はＣ８セラミド－ＰＥＧ２０００が好ましい。ＰＥＧの長さは、５００～１００００程度の分子量の範囲で適宜選択することができる。他の親水性ポリマーの分子量も同様に当業者は適宜選択できる。
　例えばリポソームをＰＥＧ修飾する場合、ステアリル化ＰＥＧ（ＳＴＲ－ＰＥＧ）、Ｃ８セラミド－ＰＥＧ、コレステロール－ＰＥＧを使用するのが、目的物質（例えばｓｉＲＮＡ等の核酸医薬）の機能発現を損ねることなく保存安定性に優れたリポソームを得るために好ましく、また、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ、ＤＳＧ－ＰＥＧ、Ｃ１６セラミド－ＰＥＧ等を使用するのが、血中安定性を向上させるために好ましい。親水性ポリマーは、リポソームを修飾する場合、リポソームを構成する脂質を１００モル％とした場合に１～１５モル％程度の割合で修飾するのが好ましい。
　本発明のリポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。
　水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
　脂質二重層の構成成分である脂質と、本発明ペプチド化合物とを有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、本発明ペプチドを有するリポソームを製造することができる。
　また、水和法によるリポソームの別の製造例を以下に示す。
　脂質二重層の構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得、この脂質膜を水和させ、攪拌又は超音波処理することによりリポソームを製造する。次いで、このリポソームの外液に、本発明ペプチド化合物を添加することにより、リポソームに本発明ペプチド化合物を導入することができる。
　例えば、カチオン性脂質として４級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例４と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより、また、カチオン性脂質として３級アミンを用いる場合のリポソームの調製は、後述する実施例４と同様の方法、これに準じた方法又はこれらと常法とを組み合わせることにより製造することができる。
　リポソームの調製にあたり、補助脂質（ＥｔＯＨ溶液）／カチオン性脂質（ＥｔＯＨ溶液）の割合は、適宜変更することができる。
　本発明の好ましいリポソームは、ＥＰＣ／ＤＯＴＡＰ／本発明ペプチド化合物、ＥＰＣ／本発明ペプチド化合物、又はＥＰＣ／ＤＳＰＧ／本発明ペプチド化合物の組成を有するリポソームが挙げられ、好ましくはＥＰＣ／ＤＯＴＡＰ／本発明ペプチド化合物の組成を有するリポソームである。
　本発明のリポソームのゼータ電位は、中性付近のｐＨ（例えばｐＨ７もしくは７．４）で－５０～＋５０ｍＶ程度、好ましくは－４０～＋４０ｍＶ程度、より好ましくは－３０～＋３０ｍＶ程度である。ゼータ電位は、ゼータサイザーを用いて測定することができる。
　本発明のリポソームの平均粒径は、特に限定されるものではないが、例えば、粒子径３０～１０００ｎｍであり、好ましくは、５０～５００ｎｍ、より好ましくは６０～２００ｎｍ、である。平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法、原子間力顕微鏡観察法等により測定することができる。
　本発明のリポソームの内部には、細胞内に送達しようとする目的物質を封入することができる。
　目的物質が水溶性である場合には、リポソームの製造にあたり脂質膜を水和する際に使用される水性溶媒に目的物質を添加することにより、リポソーム内部の水相に目的物質を封入することができる。また、目的物質が脂溶性である場合には、リポソームの製造にあたり使用される有機溶剤に目的物質を添加することにより、リポソームの脂質二重層に目的物質を封入することができる。本明細書において「封入」とは、リポソームのような中空粒子の内部に目的物質を含む。
　目的物質を送達すべき生物種は、脊椎動物であれば特に限定されるものではないが、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。
　本発明のリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
　本発明のリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
　本発明のリポソームは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれにおいても使用することができる。本発明リポソームを医薬組成物として用いる場合には、投与経路として、例えば、静脈注射、点滴等が挙げられ、投与量及び投与頻度は、本発明リポソームに封入された目的物質の種類や量等に応じて適宜調整することができる。
　本発明のリポソームを医薬組成物として用いるにあたっては、必要に応じて薬学的担体を配合することができ、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能である。該形態としては、例えば、注射剤を採用することができる。各種の投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。 
　注射剤を調製する場合は、目的物質にｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤等を添加することができ、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。
　ｐＨ調節剤及び緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としては、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、Ｄ－マンニトール、グリセリン等が挙げられる。
　本発明のリポソームは、また、体重減少、肝障害のいずれも見られず、安全に投与することができる。
　本発明の物質導入剤は、目的物質を弱酸性ｐＨ部位に送達するためにｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏのいずれでも使用することができる。弱酸性ｐＨ部位としては、炎症部位、腫瘍部位、感染部位などが挙げられ、特に腫瘍部位が好ましく例示される。
　封入される目的物質の種類は特に限定されるものではなく、例えば、薬物、核酸、ペプチド（オキシトシン、ブラジキニン、チロトロビン放出因子、エンケファリン等の生理活性ペプチド、ペプチドホルモンなど）、タンパク質（酵素、インターロイキン等の各種サイトカイン、細胞伝達因子、細胞成長因子、抗体等）、糖又はこれらの複合体よりなる群から選ばれる一種以上が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
　また、本発明のリポソームでは、分子量の相違する複数種の目的物質を同一リポソーム内に封入し、放出部位に差をつけることも可能である。例えば、分子量が７００以下の低分子物質では弱酸性ｐＨ特異的に放出されるが、７００以上の高分子物質では弱酸性ｐＨ環境では放出されず、腫瘍細胞内に取り込まれた後放出されるよう施すことが可能である。
　目的物質は、リポソームを構成する脂質とペプチドの合計１００質量部に対し、０．１～６０質量部、好ましくは１～４０質量部含まれる。
　目的物質が薬物の場合、弱酸性環境（ｐＨ６．５付近）である組織において使用される薬剤であればいずれでもよく、例えば制がん剤が挙げられる。具体的には、制がん剤として、テガフール、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン、オキザリプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、イリノテカン、ＳＮ－３８、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシル、マイトマイシンＣ、ドセタキセル、シクロホスファミド、カペシタビン、エピルビシン、ゲムシタビン、ミトキサントロン、ロイコボリン、ビノレルビン、トラスツズマブ、エトポシド、エストラムスチン、プレドニゾン、インターフェロンα、インターロイキン－２、ブレオマイシン、イホスファミド、メスナ、アルトレタミン、トポテカン、シタラビン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ゲムツズマブ、イダルビシン、ミトキサントロン、トレチノイン、アレムツズマブ、クロランブシル、クラドリビン、イマチニブ、エピルビシン、ダカルバジン、プロカルバジン、メクロレタミン、リツキシマブ、デニロイキンジフチトクス、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アロプリノール、カルムスチン、タモキシフェン、フィルグラスチム、テモゾロマイド、メルファラン、ビノレルビン、アザシチジン、サリドマイド、およびマイトマイシンなどが挙げられる。更には、炎症部位も弱酸性領域であるため、抗炎症剤も目的物質の一つとして挙げることができる。抗炎症剤としては、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、アスピリン、ジクロフェナク、ピロキシカム、アセトアミノフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブなど）、ステロイド系抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンなど）が挙げられる。
　目的物質が核酸の場合、例えば部分二重鎖ＲＮＡ（ｍｄＲＮＡ）、ニックの入ったｄｓＲＮＡ（ｎｄｓＲＮＡ）、ギャップのあるｄｓＲＮＡ（ｇｄｓＲＮＡ）、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、置換された短干渉オリゴヌクレオチド、修飾された短干渉オリゴヌクレオチド、化学修飾されたｄｓＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）からなる群から選ばれるいずれかの二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が好ましく例示される。目的物質は単独で或いは２種以上を混合して用いることができる。例えば２種以上のｓｉＲＮＡを併用することも可能である。
　置換および修飾（化学修飾を含む）の１つの実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、デオキシリボヌクレオチドまたは２つのデオキシリボヌクレオチド（例えばチミジン、アデニン）を含むオーバーハング等、二重鎖ＲＮＡの３’末端の一端または両端に１～４ヌクレオチドのオーバーハングを含み得る。二重鎖ＲＮＡは、一端または両端に平滑末端を有し得る。一部の実施形態において、第１および第２の鎖の５’末端はリン酸化されている。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、核酸の糖、塩基、または骨格において化学的に修飾されたリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の普遍的な塩基リボヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、３’末端のヌクレオチドオーバーハングは、１つ以上の非環式ヌクレオチドを含むことができる。二重鎖ＲＮＡの実施形態のいずれにおいても、ｄｓＲＮＡは、５’リン酸塩（Ｍａｒｔｉｎｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ．１１０：５６３‐５７４，２００２；およびＳｃｈｗａｒｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．１０：５３７‐５６８，２００２を参照）または５’，３’二リン酸塩等の末端リン酸基をさらに含むことができる。
　二重鎖ＲＮＡは、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル、２’－Ｏ－２－メトキシエチル、ハロゲン、２’－フルオロ、２’－Ｏ－アリル、またはこれらの任意の組み合わせ等の２’糖置換をさらに含み得る。さらなる実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、第１の鎖または１つ以上の第２の鎖の一端または両端上に、アルキル、脱塩基、デオキシ脱塩基、グリセリル、ジヌクレオチド、非環式ヌクレオチド、反転したデオキシヌクレオチド部分、またはこれらの任意の組み合わせ等の末端キャップ置換基をさらに含む。
　さらに他の実施形態において、二重鎖ＲＮＡは、独立してホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、メチルホスホン酸塩、アルキルホスホン酸塩、３’－アルキレンホスホン酸塩、５’－アルキレンホスホン酸塩、キラルホスホネート、ホスホノ酢酸塩、チオホスホノ酢酸塩、ホスフィン酸塩、ホスホロアミド酸塩、３’－アミノホスホロアミド酸塩、アミノアルキルホスホロアミド酸塩、チオノホスホロアミド酸塩、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸塩、ボラノリン酸結合、またはこれらの任意の組み合わせ等の、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド間結合をさらに含み得る。
　二重鎖ＲＮＡは、５－メチルシトシン；５－ヒドロキシメチルシトシン；キサンチン；ヒポキサンチン；２－アミノアデニン；６－メチル、２－プロピル、またはアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体；８－置換されたアデニンおよびグアニン（８－アザ、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル等）；７－メチル、７－デアザ、および３－デアザアデニンならびにグアニン；２－チオウラシル；２－チオチミン；２－チオシトシン；５－メチル、５－プロピニル、５－ハロ（５－ブロモまたは５－フルオロ等）、５－トリフルオロメチル、または他の５－置換されたウラシルおよびシトシン；ならびに６－アゾウラシルなどの核酸アナログを使用することで、置換ないし修飾（化学修飾を含む）することができる。
　二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）などのＲＮＡは化学的に修飾され得る。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、２’－デオキシリボヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロリボヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５’－Ｃ－メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび／または逆方向デオキシ無塩基残基の導入が挙げられる。これらの化学修飾は、細胞内におけるＲＮＡｉ活性を維持することができる。
　本発明は、上記リポソームを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物が予防、治療の対象とする疾患は、目的物質の種類に応じて選択でき、特に限定されないが、本発明の医薬組成物としては、例えば、抗腫瘍剤等が挙げられる。
　当該実施形態において、対象となる癌は特に制限はされないが、例えば、頭頚部癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆嚢・胆管癌、胆道癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍、中皮腫、黒色腫等が挙げられる。
　以下、本発明を実施例、試験例により、より詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。
　実施例１　ＨＧＨＧＬＡＬＬＡＨＡＬＬＡＨＡＡＬＡＨＡＡＬＡ（配列番号１、ペプチド化合物１）の合成
　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎをスタートとし、０．１ｍＭスケールで、アミノ酸、縮合剤（ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ）、反応促進剤（ＤＩＥＡ）をそれぞれレジンに対して４当量使用してＦｍｏｃ固相合成法にて配列番号１のペプチドの合成を実施した（ＨＢＴＵ：Ｍ．Ｗ．３７９．２、ＨＯＢｔ，Ａｎｈｙｄｒｏｕｓ：Ｍ．Ｗ．１３５．１、ＤＩＥＡ：Ｍ．Ｗ．１２９．２）。合成後のレジンにＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）カクテル溶液（１２５ｍｌ　ＴＦＡ，　０．２５ｍｌ　Ｈ２Ｏ，０．３７５ｇフェノール，０．１２５ｍｌエタンジチオール及び０．２５ｍｌチオアニソール）を加えて氷冷下１５分、室温２時間反応させてレジンからペプチドを切出しジエチルエーテル沈殿させてクルードペプチドを得た。ＨＰＬＣにて精製作業を実施し、凍結乾燥した。純度の検定はＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにて実施した。下記ＨＰＬＣ条件で分析を実施し、単一ピークとして目的のペプチド化合物１（配列番号１）を得た。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
Ａ　Ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、Ｂ　Ｂｕｆｆｅｒ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル　Ｃｏｌｕｍｎ：ＳｕｎＦｉｒｅ　Ｃ１８　Ｃｏｌｕｍｎ，　５μｍ，　４．６ｘ１５０ｍｍ　Ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ，Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２２０ｎｍ。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｖｏｙａｇｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍを用いた。分子量の計算値：２３２０．７、実測値：２３２１．４０。
ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図１に示す。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　２０２０．７）
　使用したレジン　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジン量　２０８．０ｍｇ（レジン導入量０．４８ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２３２．３ｍｇ。
　実際に取れたクルード量　２２８．６ｍｇ（収率９８．４％）
実施例２　ＧＨＨＧＬＡＬＬＨＡＬＨＬＡＡＡＡＬＨＡＡＡＬＡ（ペプチド化合物２）の合成
　実施例１と同様の手法により合成し、ペプチド化合物２（配列番号２）を得た。分子量の計算値：２３２０．７、実測値：２３２０．０４。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図２に示す。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　２３２０．７）
　使用したレジン　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジンの量　１４０．１ｍｇ（レジン導入量０．７２ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２３４．０ｍｇ
　実際に取れたクルード量　９５．５ｍｇ（収率４０．８％）
実施例３　ＥＧＥＧＬＡＬＬＡＨＡＬＬＡＨＡＡＬＡＨＡＡＬＡ（ペプチド化合物３）の合成
　実施例１と同様の手法により合成し、ペプチド化合物３（配列番号３）を得た。分子量の計算値：２３０４．６、実測値：２３０５．１４。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図３に示す。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　２３０４．６）
　使用したレジン　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジンの量　１７５．６ｍｇ（レジン導入量０．６０ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２４２．７ｍｇ
　実際に取れたクルード量　２４０．１ｍｇ（収率９８．９％）
比較例１　ＨＨＧＧＬＬＬＬＨＨＨＡＡＡＡＡＬＬＬＡＡＡＡＡ（比較化合物１）の合成
　実施例１と同様の手法により合成し、比較化合物１（配列番号４）を得た。分子量の計算値：２３２０．７、実測値：２３２０．６５。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図４に示す。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　２３２０．７）
　使用したレジン　Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジンの量　１７９．８ｍｇ（レジン導入量０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２４２．０ｍｇ
　実際に取れたクルード量　２３３．４ｍｇ（収率９６．４％）
比較例２　ＨＧＨＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＨＡＬＬＡＨＡＡＬＡＨ（比較化合物２）の合成
　実施例１と同様の手法により合成し、比較化合物２（配列番号５）を得た。分子量の計算値：２０４０．１、実測値：２０４０．４９。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図５に示す。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　２０４０．１）
　使用したレジン　Ｈ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｔ（２－Ｃｌ）－Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジンの量　２１７．６ｍｇ（レジン導入量０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２２２．０ｍｇ
　実際に取れたクルード量　１８２．９ｍｇ（収率８２．４％）
比較例３　ＨＧＨＧＬＡＬＬＡＨＡＬＬＡＨＡＡＡＡＬ（比較化合物３）の合成
　実施例１と同様の手法により合成し、比較化合物３（配列番号６）を得た。分子量の計算値：１９２８．２、実測値：１９２９．５８。ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳの結果を図６に示す。なお、平均疎水性度は後述する表３に示した。
　合成スケール　０．１ｍＭスケール（分子量　１９２８．２）
　使用したレジン　Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＨＭＰ　Ｒｅｓｉｎ
　使用したレジンの量　２０８．２ｍｇ（レジン導入量０．５０ｍｍｏｌ／ｇ）
　このレジンを使用してできるペプチドの理論値　２００．７ｍｇ
　実際に取れたクルード量　１１１．８ｍｇ（収率５５．７％）。
実施例４　カチオン性リポソームの調製及びｐＨ応答性
（１）リポソームの調製は、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）／ジオレオイルテトラアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）＝１／１（ｍｏｌ比）の割合で混合した脂質エタノール溶液を試験管に分注し、実施例１で得られたペプチド化合物１のエタノール溶液を総脂質量の５ｍｏｌ％量を添加し、さらにクロロフォルムを等量混合したものに、窒素ガスを吹き付けて蒸発乾固させることで脂質薄膜を調製した。ｐＨ７．４のｂｕｆｆｅｒを添加し、１０分間室温条件で十分に水和させた。水和後、水槽型超音波装置を用いて試験管を超音波処理することでＥＰＣ／ＤＯＴＡＰ／ペプチド化合物１で構成されたリポソーム１を調製した（脂質濃度１０ｍＭ）。
（２）異なるｐＨの緩衝液で希釈懸濁したリポソーム１の粒子径（ｓｉｚｅ）と表面電位（ζｐｏｔｅｎｔｉａｌ）をマルバーン社製ゼータサイザーナノにより測定した。また、ペプチド化合物を導入していないＥＰＣ／ＤＯＴＡＰ＝１／１（ｍｏｌ比）の参考リポソームについても同様に粒子径と表面電位を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　結果、本発明ペプチド化合物が導入されていない参考リポソームでは、ｐＨ応答性は粒子径と表面電位のいずれにおいても変化は殆ど認められなかった。これに対して、本発明ペプチド化合物を導入したリポソームにおいては、ｐＨ７．４における粒子径は約１００ｎｍであり、ｐＨ６．５において粒子径は増大し、ｐＨ７．４に比べて約２倍となった。また、表面電位は、ｐＨ７．４では－２．０ｍＶであったが、ｐＨ６．５において＋９．８ｍＶへと変化した。これらの結果は、微小なｐＨ変化によりペプチドに含まれるヒスチジンがプロトン化されることにより、粒子径および表面電位が変化することを示唆するものである。ｐＨ７．４から６．５へ低下した際の粒子径の増大は、ヒスチジンがプロトン化されることにより、疎水部における疎水的相互作用の低下と親水部における静電的反発のため、リポソーム構造がルーズになったためであると考えられる。
試験例１　異なるｐＨ条件における内封薬物漏出量の測定
（１）実施例４と同様の方法でペプチド含有脂質薄膜を調製後、カルセイン（Ｍｗ　６２２．５５）３０ｍＭ溶液を添加し、実施例４と同様の方法でカルセイン封入リポソーム１を調製した。未封入のカルセインはゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ５０）により除去した。
　内封カルセインのリポソームからの漏出量を測定するために、当該リポソームを異なるｐＨのｂｕｆｆｅｒで希釈懸濁した後、３７℃で１０分間インキュベートし、プレートリーダー（ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ２００、ＴＥＣＡＮ社）を用いて漏出されたカルセインの蛍光（λｅｘ：４８８ｎｍ、λｅｍ：５１７ｎｍ）を測定した。なお、当該リポソームに１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を混合した場合に漏出されたカルセインの蛍光を完全漏出量とした。漏出率は以下の式により算出した。結果を図７に示す。
漏出率（％）＝（Ｆｓａｍｐｌｅ－ＦｐＨ７．４）／（Ｆｔｒｉｔｏｎ－ＦｐＨ７．４）×１００
　Ｆｓａｍｐｌｅ：各ｐＨ下においてリポソームから漏出したカルセインの蛍光
　ＦｐＨ７．４：ｐＨ７．４におけるリポソームから漏出したカルセインの蛍光
　　　Ｆｔｒｉｔｏｎ：当該リポソームに１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を混合した場合のカルセインの蛍光
　結果、ｐＨ７．４では漏出が全く認められなかったが、ｐＨ６．５において約１００％のカルセインの漏出が認められた。すなわち、微弱ｐＨ変化により、脂質膜に埋め込んだペプチド化合物内の親水性ブロックおよび疎水性ブロックのＨｉｓがプロトン化されることにより、ペプチドと脂質分子との間の反発により、内封カルセインが漏出したと示唆された。
（２）実施例４と同様の方法で、ペプチド含有脂質薄膜を調製後、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストラン（Ｍｗ　３，０００）２ｍｇ／ｍｌ溶液を添加し、実施例４と同様の方法でデキストラン封入リポソーム１を調製した。Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストランのリポソームへの封入率を高めるために、液体窒素で凍結後、３７℃で融解し、この凍結融解を５回繰り返した。未封入のＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストランはゲル濾過（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ－６Ｂ）により除去した。内封Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストランのリポソームからの漏出量は上記と同様にして測定した。結果を図８に示す。
　結果、ｐＨ７．４では漏出が全く認められなかったが、ｐＨ６．５以下においても当該リポソームからのデキストランの漏出は認められなかった。すなわち、当該リポソームは微弱ｐＨ変化により、高分子は漏出させず、低分子化合物を選択的に漏出させることが可能であることが示唆された。
（３）実施例４と同様の方法で、ペプチド含有脂質薄膜を調製後、カルセイン（Ｍｗ　６２２．５５）１５ｍＭ溶液およびＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストラン（Ｍｗ　３，０００）１ｍｇ／ｍｌ溶液を添加し、実施例４と同様の方法で２成分封入リポソーム１を調製した。未封入のカルセインとデキストランは透析膜（分画分子量　１４，０００）を用いて透析により除去した。内封Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ　標識デキストランおよびカルセインのリポソームからの漏出量は上記と同様にして測定した。結果を図９に示す。
　結果、カルセインとデキストランを当該リポソームに共封入した場合、カルセインはｐＨ６．５において約６０％、ｐＨ６．０以下では約８０％漏出された。一方、デキストランは全てのｐＨにおいて漏出は認められなかったことから、上記のように当該リポソームは微弱ｐＨ変化により、低分子化合物を選択的に漏出させることが確認された。
　本発明のリポソームはｐＨ依存性に低分子量の化合物から漏出させることができ、分子量の異なる化合物を封入した場合、分子量に従って段階的に化合物を漏出することができる。
試験例２　異なるｐＨ条件におけるペプチド単体およびペプチド導入リポソームのＣＤｓｐｅｃｔｒｕｍ（ｐＨ応答性および膜構造基盤の必要性の提示）
　実施例１で得られたペプチド化合物１単体及び実施例４に準じて得られたペプチド導入リポソーム（それぞれペプチド濃度にして２０μＭ）を異なるｐＨのＰＢＳ（－）に懸濁し、Ｊ－７２０ＷＩ（日本分光（株）社製）を用いてＣＤ（円偏光二色性）スペクトルを測定した。結果を図１０に示す。
　なお、「α－ｈｅｌｉｘ」はαへリックス構造を意味し、「ランダムコイル構造」は明確な二次構造を取っていない状態を意味する。
　結果、ペプチド化合物１単独の場合、ｐＨ７．４ではα－ｈｅｌｉｘ（１９６ｎｍ付近に正のピーク、２０７と２２２ｎｍ付近に負のピーク）であったが、ｐＨの低下に依存して、順次ランダムコイル型（１９６ｎｍ付近に負のピーク）へ変換された。一方、ペプチド導入リポソームの場合、ｐＨ７．４では同様にα－ｈｅｌｉｘであったが、ｐＨ６．５において、ほぼ完全にランダムコイル型へ変換された。このようにペプチド単独およびペプチド導入リポソームではｐＨ変化に伴う構造変換が異なっていた。これらの結果はペプチドのｐＨ応答性には膜構造基盤が不可欠であることを示唆するものである。
実施例５　脂質組成を変えたリポソームの調製
（１）実施例４と同様の方法に準じて、ＥＰＣ／ペプチド化合物１＝１／５ｍｏｌ％である中性のリポソーム２を調製した。
（２）実施例４と同様の方法に準じて、ＥＰＣ／ＤＳＰＧ／ペプチド化合物１＝１／１／５ｍｏｌ％であるアニオン性のリポソーム３を調製した。
試験例３　各種リポソームにおける内封薬物漏出量の測定
　実施例４で得られたリポソーム１、実施例５で得られたリポソーム２、３にそれぞれカルセインを封入し、試験例１と同様の方法でｐＨ応答性を検討した。結果、いずれのリポソームもｐＨ７．４ではカルセインの漏出は認められなかったが、ｐＨ６．５においてはカチオン性のリポソーム１が最も良好で、アニオン性のリポソーム３、中性のリポソーム２の順番で漏出が低下した。すなわち、当該リポソームが微弱低ｐＨにおいて応答性示すためには、カチオン性リポソームにペプチド化合物を搭載するのが最も好ましいことが示唆された。
実施例６
　実施例４に記載の方法に準じて、実施例２で得られたペプチド化合物２を導入したリポソーム２を作製し、試験例１と同様の調製方法でカルセイン封入リポソーム２を調製した。
実施例７
　実施例４に記載の方法に準じて、実施例３で得られたペプチド化合物３を導入したリポソーム３を作製し、試験例１と同様の調製方法でカルセイン封入リポソーム３を調製した。
比較例４
　実施例４に記載の方法に準じて、比較例１で得られた比較化合物１を導入した比較リポソーム１を作製し、試験例１と同様の調製方法でカルセイン封入比較リポソーム１を調製した。
比較例５
　実施例４に記載の方法に準じて、比較例２で得られた比較化合物２を導入した比較リポソーム２を作製し、試験例１と同様の調製方法でカルセイン封入比較リポソーム２を調製した。
比較例６
　実施例４に記載の方法に準じて、比較例３で得られた比較化合物３を導入した比較リポソーム３を作製し、試験例１と同様の調製方法でカルセイン封入比較リポソーム３を調製した。
試験例４　ペプチド導入リポソームの平均疎水性度と内封薬物漏出率
　実施例４、６、７及び比較例４～６で得られたそれぞれのカルセイン封入リポソームについて、試験例１と同様の方法でｐＨ７．４及びｐＨ６．５におけるカルセインの漏出率を算出した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　結果、本発明ペプチド化合物を導入したリポソームでは、ｐＨ７．４の生理条件下では漏出が全く認められないが、ｐＨ６．５といった弱酸性ｐＨにおいて６０％以上の良好な内封薬物の漏出を認め、特に親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックにＨｉｓを有するペプチド化合物では非常に良好な内封薬物の漏出を認めた。これに対し、構成アミノ酸が同じであっても、ペプチドの疎水性ブロックにおけるヒスチジンが隣接する比較化合物１を導入したリポソーム、ペプチド化合物の親水性ブロックと疎水性ブロックのアミノ酸数を１：１に変えることにより平均疎水性度を変えた比較化合物２を導入したリポソームでは、ｐＨ７．４からｐＨ６．５に変化しても内封薬物の漏出は著しく低下し、ｐＨ応答性は不十分であった。また、ペプチド化合物１に対して４残基減の比較化合物３を導入したリポソームを調製したが、ｐＨ６．５以下で著しく凝集した。また、カルセインの封入を試みたが、ｐＨ　７．４　においても、Ｔｒｉｔｏｎで処理した場合と同程度の蛍光強度が認められたことから、４残基減の配列のペプチドでは、リポソームが不安定であり、薬物を封入することができないことが示唆された。
　試験例５　ドキソルビシン(Dox)封入リポソーム４の抗腫瘍効果
　Dox封入リポソーム４は、卵黄ホスファチジルコリン（EPC）：ジオレオイルテトラアンモニウムプロパン（DOTAP）=1:1(mol比)の割合で混合した脂質エタノール溶液を試験管に分注し、実施例１で得られたペプチド化合物１のエタノール溶液を総脂質量の5mol％量、さらにポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン (PEG-DSPE)のエタノール溶液を総脂質量の5mol％量添加し、さらにクロロフォルムを等量混合したものに、窒素ガスを吹き付けて蒸発乾固させることで脂質薄膜を調製した。次に、250 mM　硫酸アンモニウム（pH8.5）を添加し、10分間室温条件で十分に水和させた。水和後、水槽型超音波装置を用いて試験管を超音波処理することでEPC/DOTAP/PEG-DSPE/ペプチド化合物１で構成されたリポソーム４を調製した（脂質濃度10 mM）。調製したリポソーム４を10% スクロース (pH 8.5)で平衡化したSephadex G-50カラムを用いてゲル濾過を行い、回収したフラクション中の脂質濃度はリン脂質テストワコーを用いて定量した。このリポソーム４にDox溶液（2mg/ml）を添加し、65℃で１時間インキュベートした後、Sephadex G-50カラムを用いてゲル濾過により、未封入のDoxを除去した。リポソーム４に封入された Dox 量はTriton-X処理により可溶化後、プレートリーダー（infinite M200、TECAN社）を用いて、490 nm における吸光度を測定することにより定量した。
　Dox封入リポソーム４の抗腫瘍効果を評価するために、B16-F1細胞を皮下に移植して形成した腫瘍の大きさが100 mm3にまで成長した担ガンヘアレスマウスに、Dox 溶液またはDox封入リポソーム４を１回投与あたりDox濃度0.5mg/kg で移植5、8、12、15日後に尾静脈内投与した。腫瘍体積は、腫瘍の直径および短径を測定し、以下の式により算出した。
（腫瘍体積）=0.5×(長径) ×(短径)2
　また、相対腫瘍体積を、以下の式により算出した。
（相対腫瘍体積）＝（移植8、12、15、または19日後の腫瘍体積）/(移植5日後における腫瘍体積)
　結果を図１１に示す。図１１に示すように、低用量 Dox投与において、Dox封入リポソーム４はDox溶液に比べて、高い腫瘍成長抑制効果を示した。

Claims (15)

  1. 親水性アミノ酸ブロックと疎水性アミノ酸ブロックから構成されるペプチド化合物であって、
    〔１〕ペプチド化合物の総アミノ酸数は２４～３６であり、〔２〕親水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が４～１０で、平均疎水性度が－３．０～－１．０であり、〔３〕疎水性アミノ酸ブロックの総アミノ酸数が２０～３２で、Ｈｉｓを１個以上有し、平均疎水性度が１．０～２．５である、
    ペプチド化合物。
  2. 親水性アミノ酸ブロックの平均疎水性度が－２．０～－１．５であり；疎水性アミノ酸ブロックの平均疎水性度が１．５～２．０である請求項１記載のペプチド化合物。
  3. 親水性アミノ酸ブロックが、疎水性度が－３．０以下であるアミノ酸と疎水性度が０～－１．０であるアミノ酸で構成されたものであり；疎水性アミノ酸ブロックが、Ｈｉｓと疎水性度が０を超えるアミノ酸で構成されたものである、請求項１に記載のペプチド化合物。
  4. 親水性アミノ酸ブロックを構成するアミノ酸がＨｉｓ又はＧｌｕとＧｌｙで構成されるアミノ酸であり、疎水性アミノ酸ブロックを構成するアミノ酸がＨｉｓと、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ及びＩｌｅからなる群から選択される任意のアミノ酸である請求項１に記載のペプチド化合物。
  5. 親水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを０～５個有し、疎水性アミノ酸ブロックにおけるペプチド配列中にＨｉｓを１～８個有することを特徴とする請求項１にペプチド化合物。
  6. 親水性アミノ酸ブロックが、下記式（Ｉ）
    　（ＡＡ１）（ＡＡ２）（ＡＡ３）（ＡＡ４）　　　　（Ｉ）
    （式中、ＡＡ１、ＡＡ２、ＡＡ３及びＡＡ４は、いずれか２つがＨｉｓ又はＧｌｕであり、残りの２つがＧｌｙである。）で表され；疎水性アミノ酸ブロックが、下記式（II）で表されるユニットを５～８個含み、各ユニットのアミノ酸配列は同一であっても異なっていてもよい、
    　（ＡＡ５）（ＡＡ６）（ＡＡ７）（ＡＡ８）　　　　（II）
    （式中、ＡＡ５、ＡＡ６、ＡＡ７及びＡＡ８は、同一又は異なって、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ又はＡｌａを示す。ただし、式（II）のユニットの少なくとも１つは、Ｈｉｓを１個又は２個含む。）
    請求項１に記載のペプチド化合物。
  7. 請求項１～６のいずれかに記載のペプチド化合物と脂質を有することを特徴とするリポソーム。
  8. リポソーム中の総脂質量に対して、請求項１～６のいずれかに記載のペプチド化合物を１～１０モル％含むことを特徴とする請求項７記載のリポソーム。
  9. リポソームがカチオン性リポソームである、請求項８に記載のリポソーム。
  10. 目的物質をリポソームに封入してなる、請求項７に記載のリポソーム。
  11. 請求項７～１０のいずれかに記載のリポソームを含む医薬組成物。
  12. 請求項７～１０のいずれかに記載のリポソームを含む抗腫瘍剤。
  13. 哺乳動物に対して請求項７～１０のいずれかに記載のリポソームの癌に対する予防又は治療有効量を投与する工程を含む、癌の予防又は治療方法。
  14. 癌の予防又は治療剤を製造するための請求項７～１０のいずれかに記載のリポソームの使用。
  15. 癌の予防又は治療に使用するための請求項７～１０のいずれかに記載のリポソーム。
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