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WO2014040891A2 - Verfahren zur diagnose eines molekularen phänotyps eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden erkrankung leidenden patienten - Google Patents

Verfahren zur diagnose eines molekularen phänotyps eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden erkrankung leidenden patienten Download PDF

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WO2014040891A2
WO2014040891A2 PCT/EP2013/068317 EP2013068317W WO2014040891A2 WO 2014040891 A2 WO2014040891 A2 WO 2014040891A2 EP 2013068317 W EP2013068317 W EP 2013068317W WO 2014040891 A2 WO2014040891 A2 WO 2014040891A2
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WO
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Prior art keywords
gata
tbet
gene expression
patient
molecular phenotype
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/068317
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English (en)
French (fr)
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WO2014040891A3 (de
Inventor
Joachim BILLE
Agnieszka TUROWSKA
Original Assignee
Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg filed Critical Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg
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Priority to JP2015531519A priority patent/JP6401163B2/ja
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Priority to AU2013314510A priority patent/AU2013314510A1/en
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Priority to CA2888860A priority patent/CA2888860C/en
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Publication of WO2014040891A3 publication Critical patent/WO2014040891A3/de
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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Definitions

  • the invention relates to a method and a kit for diagnosing a molecular phenotype of a patient suffering from a disease associated with chronic inflammation, and to a medicament for treating such a patient.
  • Chronic inflammations represent an increasing medical problem area of high socioeconomic importance. These include, in particular, the following disease groups: autoimmune diseases and diseases of the rheumatic type (manifestations of, inter alia, skin, lung, kidney, vascular system, nervous system, connective tissue, musculoskeletal system, endocrine system), allergic immediate type reactions and Asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), atherosclerosis, psoriasis and contact dermatitis, and chronic organ rejection and bone marrow transplant rejection. Many of these diseases have been showing an increasing prevalence in the past few decades, not only in the industrialized nations, but also worldwide. Over 20% of the population in Europe, North America, Japan and Australia suffer from allergic diseases and asthma.
  • autoimmune diseases and diseases of the rheumatic type manifestations of, inter alia, skin, lung, kidney, vascular system, nervous system, connective tissue, musculoskeletal system, endocrine system
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • COPD
  • Chronic obstructive pulmonary disease is currently the fifth most common Cause of death worldwide and will be the third leading cause of death by 2020, according to WHO calculations.
  • Atherosclerosis with its associated diseases of heart attack, stroke and peripheral arterial disease, occupies a leading position worldwide in morbidity and mortality statistics.
  • Psoriasis and contact dermatitis together with atopic dermatitis are the most common chronic skin inflammatory diseases.
  • innate and acquired immunity Components of innate and acquired immunity are sustainably involved in initiation, maintenance, and destruction and remodeling processes. Under the influence of innate immunity (important components: antigen-presenting cells with their diverse populations and the complement system) there is activation and differentiation of the cells of the adaptive immune system (important components: T and B lymphocytes). The T cells take over central functions in the further course by differentiating into highly specialized effectors.
  • effector mechanisms include in particular the following functions: antibody production, control of the functionality of effector cells of the immune system (such as neutrophil, basophil, eosinophilic granulocytes), feedback on functions of the innate immune system, influence on functionality of non-hematopoietic cells such.
  • effector cells of the immune system such as neutrophil, basophil, eosinophilic granulocytes
  • feedback on functions of the innate immune system influence on functionality of non-hematopoietic cells
  • non-hematopoietic cells such as epithelium, endothelium, connective tissue, bone and cartilage and especially neuronal cells.
  • T-cells take over central functions in the course of the disease, an understanding of their specialization is crucial.
  • a complex signal transduction cascade is involved in the differentiation of na ⁇ ve CD4 + cells into Th1 and Th2 cells, respectively.
  • Th1 cells produce interferon- ⁇ (INFy), interleukin 2 (IL-2) and tumor necrosis factor- ⁇ , whereas Th2 cells secrete IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13.
  • IFNy interferon- ⁇
  • IL-2 interleukin 2
  • Th2 cells secrete IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13.
  • Bacterial and viral infections induce an immune response that is dominated by Th1 cells.
  • Th2 cells regulate IgE production against parasites. There is an equilibrium between Th1 and Th2 cells. Disruption of this balance causes disease, an exaggerated Th1 cell response is associated with autoimmune disease, while allergic disease is based on an enhanced Th2 cell response.
  • Th1 cytokines in the pathogenesis of autoimmune diseases such. Autoimmune uveitis, experimental allergic encephalomyelitis, type 1 diabetes mellitus, or Crohn's disease, while Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-13, and IL-9, respectively) are involved in the development of chronic inflammatory airways diseases such as , As respiratory eosinophilia, asthma, mucus hypersecretion and respiratory hyperresponsiveness are involved. The basis of these diseases are pathophysiological changes during the production of characteristic cytokines by antigen-specific Th cells. In the animal model, Th2 cell subpopulations in the lungs and respiratory tract cause the characteristic symptoms of bronchial asthma. Among others, two transcription factors are involved in the development of autoimmune diseases and chronic inflammatory reactions: the Th1-cell-specific transcription factor Tbet and the Th2-cell-specific transcription factor GATA-3.
  • the Th1 cell-specific transcription factor Tbet is mainly responsible for the differentiation of na ⁇ ve CD4 + T cells into Th1 cells. Its expression is controlled via the T cell receptor (TCR) signal transduction pathways and via INFy receptor / STAT1. Tbet transactivates the endogenous INFy gene and induces INFy production. The in vivo function of Tbet is confirmed in knockout mice (Tbet - / -). In Tbet deficient mice, the amount of Th2 cytokines is increased.
  • Tbet in mucosal T cells in the development of inflammatory bowel disease.
  • the transcription factor Tbet specifically induces the development of Th1 cells and controls INFy production in these cells.
  • the inhibition of Tbet shifts the balance between Th1 and Th2 cells in favor of Th2 cells.
  • Th2 cells play an essential role in the development of allergic diseases, in particular various asthma diseases.
  • the required differentiation of ThO cells to Th2 cells is dependent on the transcription factor GATA-3.
  • GATA-3 is a member of the GATA family of transcription factors.
  • the Th2 cell-specific transcription factor GATA-3 is mainly responsible for the differentiation of naive CD4 + T cells into Th2 cells.
  • Th2 cell differentiation is mainly controlled by two signaling pathways, the T cell receptor (TCR) and the IL-4 receptor pathway: signals relayed by the TCR activate both the Th2 cell-specific transcription factors c-Maf and GATA-3 as well the transcription factors NFAT and AP-1.
  • TCR T cell receptor
  • IL-4 receptor pathway signals relayed by the TCR activate both the Th2 cell-specific transcription factors c-Maf and GATA-3 as well the transcription factors NFAT and AP-1.
  • Activation of the IL-4 receptor results in the binding of STAT6 to the cytoplasmic domain of the IL-4 receptor, where it is phosphorylated by Jak1 and Jak3 kinases.
  • GATA-3 is a zinc finger transcription factor that is expressed only in mature Th2 cells, not in Th1 cells.
  • Th2 cells produce cytokines such as IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 and GM-CSF.
  • the polarization to Th2 inhibits Th1 differentiation by suppression of Tbet and vice versa.
  • the expression of GATA-3 is not limited to T cells. Expression of GATA-3 could also be detected in eosinophils and basophils, mast cells and epithelial cells.
  • GATA-3 plays a central role in the immunopathogenesis of chronic inflammatory diseases, especially allergic asthma.
  • the subgroup "Th2 high” of the asthma patients has among others an increased expression of the POSTN gene, which codes for the protein periostin, as well as the genes for IL-13 and IL-5.
  • the "Th2 low” group of asthma patients tested showed low POSTN gene expression, comparable to a control group of healthy individuals.
  • a classification was made according to the serum periostin level, which serves as a replacement marker (surrogate marker) for the Th2 cytokine IL-13, which is difficult to detect in blood or respiratory samples.
  • This exploits the fact that IL-13, inter alia, induces the expression of the periostin-encoding gene POSTN in epithelial cells in vitro (Woodruff et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA., 104 (40): 15858-63.)
  • Genome-wide profiling identifies epithelial cell associated with asthma and with treatment response to corticosteroids.).
  • WO 2009/124090 A1 a certain classification of asthma patients has also been proposed, the gene expression of a large number of candidate genes, such as POSTN, CLCA1 and SERPINB2, being used. Since these genes are known to be upregulated by the Th2 cytokines IL-4 or IL-13, the cluster was also referred to as the "IL-4 / IL-13 signature.”
  • IL-4 / IL-13 signature the cluster was also referred to as the "IL-4 / IL-13 signature.”
  • biomarker for reliable and clinically feasible molecular phenotyping of a patient suffering from chronic inflammation, suffering human patients in the groups "Th2-high” or “Th2-low” or “Th1 -high” or “Th1 -low” is suitable. Furthermore, the patient classified in this way should have one specific to them Subgroup particularly effective therapeutic agent to be treatable.
  • the biomarker is intended to allow an individual prediction of the effectiveness of a therapeutic agent in relation to a patient, in particular an asthma patient.
  • said object is achieved by a method for diagnosing a molecular phenotype of a human patient suffering from a disease associated with chronic inflammation, wherein the molecular phenotype is selected from the group consisting of the subgroups "Th2 high”, “Th2 low “,” Th1 high “and” Th1 low “and the gene expression of GATA-3 and / or Tbet in a biological isolate of the patient is measured and used for the assignment to a molecular phenotype of the disease.
  • the more detailed classification of a human patient suffering from a disease associated with chronic inflammation is carried out by measuring the gene expression of the transcription factor GATA-3 and / or the transcription factor Tbet.
  • the development of autoimmune diseases and chronic inflammatory reactions involves the Th1 cell-specific transcription factor Tbet and the Th2 cell-specific transcription factor GATA-3.
  • Polarization to Th2 inhibits Th1 differentiation by suppression of Tbet and vice versa.
  • GATA-3 and / or Tbet it can be assigned to a molecular phenotype, ie to a subgroup of the disease associated with chronic inflammation.
  • said molecular phenotyping can be carried out without difficulty in everyday clinical life with high significance.
  • the transcription factors GATA-3 and Tbet are the key molecules in the development of Th1- and Th2-dependent chronic inflammatory diseases. Therefore, the direct measurement of protein or mRNA expression represents a best possible patient stratification approach, since no intervening mechanisms may possibly falsify the outcome.
  • the level of expression of GATA-3 and / or Tbet is determined by the amount of protein or mRNA.
  • the amount of protein can be determined quantitatively with the help of an immunoassay.
  • the immunoassay is preferably an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test, a radioimmunoassay (RIA), an electrochemiluminescence (ECL) immunoassay, a CLIA (chemoluminescence-linked immunosorbent assay), a FLIA (fluorescence-linked immunosorbent assay) or a multiplex assay.
  • any other suitable assay for quantitative detection of the protein amount of GATA-3 and / or Tbet may optionally be selected.
  • the level of expression of GATA-3 and / or Tbet may be via mass spectrometric methods, chromatographic methods such as gas chromatography, liquid-based methods using solid-phase separation such as HPLC, or micro- and nanofluidic methods.
  • the method may include the steps of determining the expression of GATA-3 or Tbet using an ELISA assay:
  • the second specific antibody can be labeled, for example, with biotin and a separate addition of a streptavidin-coupled enzyme can be made.
  • the second specific antibody may also be coupled directly to an enzyme. If appropriate, a third antibody directed against the second specific antibody coupled with an enzyme may also be used.
  • the enzyme is preferably a peroxidase or alkaline phosphatase and is reacted with a suitable substrate suitable for colorimetry or chemiluminescence and the like.
  • a suitable substrate suitable for colorimetry or chemiluminescence and the like.
  • the mRNA amount of GATA-3 and / or Tbet according to a further aspect of the present invention, in addition to or in alternative to said detection of Protein amount can be determined.
  • a PCR particularly preferably a qPCR, or a micro-array chip is suitable. It is known to the person skilled in the art how to select GATA-3 and Tbet specific probes or primers for the named detection methods.
  • the biological isolate was recovered from whole blood, urine, sputum, bronchoalveolar lavage (BAL), biopsy, brush swab, cerebrospinal fluid, tracheal secretion, seminal fluid, ascites fluid, saliva, punctate or lymphatic fluid according to a preferred embodiment of the method.
  • BAL bronchoalveolar lavage
  • the person skilled in the art knows the routine methods for obtaining a suitable biological isolate.
  • GATA-3 and Tbet are proteins that act as transcription factors in the nucleus of T helper cells of the subtypes Th1 and Th2.
  • cells which produce GATA-3 and Tbet In order to determine the concentration of these two nuclear proteins in a given volume of a biological isolate, such as in a given volume of whole blood or the like, cells which produce GATA-3 and Tbet must first be isolated and then lysed. Direct detection of these proteins from human serum or plasma is hardly possible because they are not present in detectable concentration there. An analysis of GATA-3 and Tbet may therefore be carried out in four stages:
  • the method according to the invention irrespective of whether the expression level of GATA-3 and / or Tbet is determined via the protein or mRNA quantity, also comprises one or more of the following steps:
  • an assignment of the patient to a molecular phenotype of the subgroup "Th2 high” occurs when at least one of the following conditions is met:
  • the subgroup "Th2 high” is thus characterized either by a high absolute GATA-3 gene expression compared to a defined reference value, whereby the reference value-in the case of the measurement of the protein quantity-can be a corresponding value of the GATA-3 protein content in a healthy person's isolate
  • absolute reference values may also be used: in the case of measurement of the mRNA quantity, a reference value may be a corresponding value of the quantity of GATA-3 mRNA in a healthy person's isolate, but it may also be absolute reference values, such as copies / ml, are used.
  • an assignment of the patient to the mentioned molecular phenotype of the subgroup "Th2 high” is carried out according to an advantageous embodiment of the method according to the invention, when alternatively or in addition to increased GATA-3 gene expression, the ratio of GATA-3: Tbet gene expression in the biological isolate higher than a defined
  • the reference value can be a corresponding value of the ratio of GATA-3: Tbet gene expression in a healthy person's isolate.
  • the determination of the ratio of GATA-3: Tbet gene expression increases the certainty of the statement since, in addition to the GATA As the two transcription factors counteract in their expression, as described in the introduction, the inclusion of Tbet represents an internal control for the measurement of GATA-3 gene expression.
  • the method according to the invention for the assignment of the patient to the molecular phenotype of the subgroup "Th2 high” comprises the steps:
  • a further determination of further parameters for the safe classification into the subgroup "Th2 high” takes place, for example, the serum IgE level and the number of eosinophilic granulocytes can be measured.
  • An assignment to the subgroup "Th2 high” occurs when, in addition, the serum IgE level is higher than 100 IU / ml and / or the number of eosinophilic granulocytes is 0.14x10 9 cells per liter or higher.
  • the concentration of nitrogen monoxide in the exhaled air so a determination of the FeNO value, carried out.
  • a further advantageous embodiment of the method according to the invention relates to an assignment of the patient to a molecular phenotype of the subgroup "Th2 low" if at least one of the following conditions is met:
  • the subgroup "Th2 low” is thus characterized either by a low absolute GATA-3 gene expression compared to a defined reference value, whereby the reference value-in the case of the measurement of the protein amount-can be a corresponding value of the GATA-3 protein content in a healthy person's isolate It should be noted here that in a patient of the subgroup "Th2 low” with a disease associated with chronic inflammation, absolute GATA-3 gene expression will regularly be higher than in an isolate of a healthy patient. However, absolute GATA-3 gene expression may also be lower than in a healthy one.
  • the GATA-3 gene expression is not as high as for the Subgroup "Th2 high” is described, meaning that the patient is assigned to the subgroup "Th2 low” if his GATA-3 protein content is only moderately elevated, if at all, compared with a healthy person isolate.
  • fixed reference values can also be used.
  • a corresponding value of the amount of GATA-3 mRNA in the isolate of a healthy person can be used as the reference value, whereby the patient is assigned to the subgroup "Th2 low” if its amount of GATA-3 mRNA is lower than in a corresponding sample of a healthy or at least not significantly increased, but again fixed reference values can be used.
  • an assignment of the patient to the said molecular phenotype of the subgroup "Th2 low” is carried out according to an advantageous embodiment of the method according to the invention, when alternatively or additionally to the reduced GATA-3 gene expression, the ratio of GATA-3: Tbet gene expression in the biological isolate is lower than a defined one
  • the reference value used may be a corresponding value of the ratio of GATA-3: Tbet gene expression in a healthy person's isolate.
  • the determination of the ratio of GATA-3: Tbet gene expression also increases the reliability of the statement, since in addition to the GTA-3 gene expression as an additional parameter that determines Tbet gene expression Since the two transcription factors counteract in their expression as described above, the inclusion of Tbet is, in some respects, an internal control for the measurement of GATA-3 gene expression.
  • the method according to the invention for assigning the patient to the molecular phenotype of the subgroup "Th2 low” comprises the steps:
  • further parameters can be determined for the safe classification into the subgroup "Th2 low.”
  • the serum IgE level and the number of eosinophilic granulocytes can be measured. Assignment to the subgroup "Th2 low” occurs when, in addition, the serum IgE level is lower than 100 IU / ml and / or the number of eosinophilic granulocytes is below 0.14x10 9 cells per liter Concentration of nitric oxide in the exhaled air, so a determination of the FeNO value to be performed.
  • the patient is assigned to a molecular phenotype of the subgroup "Th1 high" if at least one of the following conditions is met:
  • the Tbet gene expression in the biological isolate is higher than a defined one
  • the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression in the biological isolate is higher than a defined reference value.
  • the subgroup "Th1 high” is thus characterized either by a high absolute Tbet gene expression compared to a defined reference value, whereby a corresponding value of the Tbet protein content in the isolate of a healthy person can be used as reference value - in the case of the measurement of the protein quantity of the patient to the subgroup "Th1 high” occurs when its Tbet protein content is increased.
  • fixed reference values can also be used.
  • a corresponding value of the Tbet mRNA amount in the isolate of a healthy person can be used as the reference value, whereby the patient is assigned to the subgroup "Th1 high" if its tbet mRNA amount is increased however, fixed reference values can also be used in turn.
  • an assignment of the patient to the said molecular phenotype of the subgroup "Th1 high” is carried out according to an advantageous embodiment of the method according to the invention, if alternatively or in addition to increased Tbet gene expression, the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression in the biological isolate is higher than a defined reference value
  • the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression in the isolate of a healthy person can be used as a reference value.
  • the determination of the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression also increases the reliability of the statement, as in addition to the Tbet gene expression as an additional parameter the GATA-3 gene expression is detected and the inclusion of GATA-3 constitutes an internal control for the measurement of Tbet gene expression.
  • the method according to the invention for assigning the patient to the molecular phenotype of the subgroup "Th1 high” comprises the steps:
  • a further aspect of the present invention relates to a method which allows an assignment of the patient to a molecular phenotype of a subgroup "Th1 low" if at least one of the following conditions is met:
  • the subgroup "Th1 low” is thus characterized either by a low absolute Tbet gene expression compared to a defined reference value, whereby the reference value - in the case of the measurement of the protein quantity - can be a corresponding value of the Tbet protein content in a healthy person's isolate Note that in a patient of the subgroup "Th1 low” with a disease associated with chronic inflammation, absolute Tbet gene expression may still be higher than in a healthy patient isolate. However, absolute Tbet gene expression may be lower than that of a healthy individual.
  • Tbet gene expression is not as high as described for the subgroup "Th1 high.” Assignment of the patient to the "Th1 low” subgroup thus occurs when its Tbet protein content, if any, is not significantly increased over a healthy subject isolate is.
  • fixed reference values can also be used.
  • a corresponding value of the tbet mRNA amount in the isolate of a healthy person with an assignment of the patient to the subgroup "Th1 low” occurs when its Tbet mRNA level is lower than in a corresponding sample of a healthy or at least not significantly increased, but fixed reference values can be used again Low "takes place according to an advantageous embodiment of the method according to the invention, when alternatively or additionally to the reduced Tbet gene expression, the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression in the biological isolate is lower than a defined reference value. In this case, a corresponding value of the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression in the isolate of a healthy person can be used as the reference value.
  • the determination of the ratio of Tbet: GATA-3 gene expression also increases the certainty of the statement, as in addition to the Tbet gene expression as an additional parameter GATA-3 gene expression is detected and the inclusion of GATA-3 in some respects an internal control for the Represents measurement of Tbet gene expression.
  • the method according to the invention for assigning the patient to the molecular phenotype of the subgroup "Th1 low” comprises the steps:
  • further parameters for reliable classification into the subgroups "Th1 high” and “Th1 low” can be determined. For example, the number of eosinophilic granulocytes or serum IgE levels can be measured. Assignment to the subgroup “Th1 high” is made when the serum IgE level is lower than 100 IU / ml and / or the number of eosinophilic granulocytes is below 0.14x10 9 cells per liter, otherwise it will be assigned to the subgroup " Th1 low ". Alternatively, if necessary, the concentration of nitrogen monoxide in the exhaled air, so a determination of the FeNO value, carried out.
  • normalization of the concentrations of GATA-3 and Tbet can be performed. Differences in sample preparation may arise, for example, from different cell numbers being lysed, from different lysis efficiencies of the individual samples or from different content of the different cell types within the cell preparations. Standardization possibilities according to the invention include: normalization to the total protein content of the cell lysate, normalization to the cell number that has been lysed or normalization to the concentration of specific marker proteins that are found specifically in specific cell types.
  • the patients with diagnosed molecular phenotype of the subgroup "Th2 high” may be classified in the subgroup “Th1 low” at the same time.
  • Patients with a diagnosed molecular phenotype of the subgroup “Th1 high” may also be classified in the subgroup “Th2 low” at the same time. This is due to the fact that the polarization to Th2 inhibits Th1 differentiation by suppression of Tbet and vice versa.
  • diseases are diagnosed or treated, which are associated with chronic inflammation, such.
  • Autoimmune diseases diseases of the rheumatic type (manifestations of, inter alia, skin, lung, kidney, vascular system, nervous system, connective tissue, musculoskeletal system, endocrine system), allergic immediate-type reactions and asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), arteriosclerosis, psoriasis and contact dermatitis, as well as chronic rejection reactions Organ and bone marrow transplantation.
  • Tumor diseases can also be diagnosed or treated according to the invention, as far as GATA-3 or Tbet are involved in the development and / or are deregulated as a consequence.
  • the chronic inflammatory disease is either Th2-related, such as allergic bronchial asthma, rhinoconjunctivitis, allergic sinusitis, atopic dermatitis, food allergies, pemphigus, ulcerative colitis, parasitic diseases, or Th1-related, such as psoriasis, allergic contact dermatitis, Crohn's disease, COPD, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, type 1 diabetes mellitus or MS.
  • Th2-related such as allergic bronchial asthma, rhinoconjunctivitis, allergic sinusitis, atopic dermatitis, food allergies, pemphigus, ulcerative colitis, parasitic diseases
  • Th1-related such as psoriasis, allergic contact dermatitis, Crohn's disease, COPD, rheumatoid arthritis, autoimmune diseases, type 1 diabetes mellitus or MS.
  • a medicament for the treatment of diseases associated with chronic inflammation of a human patient having a molecular phenotype wherein the molecular phenotype has been determined according to a method according to one or more embodiments of said diagnostic method according to the invention.
  • the identified molecular phenotype includes in particular the groups "Th1 low", “Th1 high”, “Th2 low” or "Th2 high”.
  • said drug contains a GATA-3 or Tbet specific ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid, in particular a GATA-3 or Tbet specific DNAzyme.
  • a general DNAzyme model represents the "10-23" model (Sontoro et al., 1997) DNAzymes of the 10-23 model - also referred to as "10-23 DNAzymes" - have a catalytic domain of 15 nucleotides, which is flanked by two substrate binding domains.
  • the catalytic domain preferably has the sequence ggctagctacaacga (SEQ ID No. 154).
  • the length of the substrate binding domains is variable, they are either the same or different lengths. In a preferred embodiment, the length of the substrate binding domains is between 6 and 14 nucleotides, most preferably at least nine nucleotides each.
  • Such DNAzymes include the general sequence nnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (SEQ ID NO 155). Particularly preferred are substrate binding domains which bind mRNA encoding the proteins GATA-3 and Tbet. The indicated catalytic central domain ggctagctacaacga is merely a preferred embodiment.
  • the substrate binding domains are fully complementary to the region flanking the cleavage site however, the DNAzyme of the 10-23 type does not necessarily cleave the target mRNA to purine-pyrimidine sequence sequences
  • the DNAzymes preferably comprise the in vivo active DNAzyme against GATA-3 and Tbet according to WO 2005/033314 A2, the content of which is explained in the disclosure of the present invention.
  • a drug for the specific inhibition of GATA-3 expression in vivo contains in particular at least one DNAzyme selected from the group consisting of DNAzymes having a sequence according to one of the sequences SEQ ID NO 1 to SEQ ID NO 70.
  • a DNAzyme preferably binds to an mRNA, that for a human GATA-3 gene with a gene sequence selected from the sequences SEQ ID NO 151 (human GATA-3 from database no .: XM_043124), SEQ ID NO 152 (human GATA-3 from database no .: X58072) and SEQ ID NO 153 (human GATA-3, sequenced from plasmid pCR2.1).
  • a drug for specifically inhibiting GATA-3 expression in vivo preferably contains the DNAzyme hgd40 having the sequence 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID NO 40).
  • a medicament for the specific inhibition of Tbet expression in vivo contains in particular at least one DNAzyme selected from the group consisting of DNAzymes having a sequence according to one of the sequences SEQ ID NO 71 to SEQ ID NO 148.
  • a DNAzyme preferably binds to an mRNA which is suitable for a human Tbet gene with a gene sequence selected from the sequences SEQ ID NO 149 (human Tbet from database No .: NM_013351) and SEQ ID NO 150 (human Tbet, sequenced from pBluescript-SK) encoded.
  • a drug for specifically inhibiting Tbet expression in vivo preferably contains the DNAzyme td69 with the sequence 5'-GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT (SEQ ID NO 139) or td70 with the sequence 5'-TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT (SEQ ID NO 140).
  • the drug may contain a suitable siRNA for specific inhibition of GATA-3 or Tbet expression.
  • the pharmaceutical composition preferably has a formulation comprising said specific ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid molecules to the patient in the form of a pharmaceutically acceptable composition, either orally, rectally, parenterally, intravenously, intramuscularly or subcutaneously, intracisternally, intravaginally, intraperitoneally, intrathecally, can be administered intravascularly, locally (powder, ointment or drops) or in spray form.
  • Dosage forms for topical administration of the drug of this invention include ointments, powders, sprays or inhalants.
  • the active component is administered under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and possible P reserve! g., buffers or propellants, as needed.
  • the medicine can be used to treat all disease groups associated with chronic inflammation.
  • patients with a molecular phenotype of the subgroup "Th2 high” are treated with a GATA-3-specific DNAzyme. specific DNAzyme.
  • the treatment of a patient with the molecular phenotype of the subgroup "Th2 low” with a Tbet-specific DNAzyme and the treatment of a patient with the molecular phenotype of the subgroup "Th1 low” with a GATA-3 DNAzyme are treated with a GATA-3-specific DNAzyme.
  • a drug of the present invention having a GATA-3 specific DNAzyme is preferably for the treatment of a patient having a molecular phenotype of the subgroup "Th2 high", and a drug having a Tbet specific DNAzyme is preferably for the treatment of a patient having a molecular phenotype of the subgroup "Th1 high ".
  • a particular advantage of the drug according to one embodiment mentioned above for the specific therapy of a subgroup of patients diagnosed according to the invention - namely "Th2 high", “Th2 low”, “Th1 high” or “Th1 low” - is that with the help of the specific Drug, in particular a DNAzyme and / or a siRNA, a functional inactivation of just the coding ribonucleic acid molecules of transcription factors whose differential expression has previously been determined and which are involved in the development of chronic inflammatory reactions and autoimmune diseases.
  • the medicament according to the invention has a high specificity. It causes a cell-specific intervention and is specific to compartments and organs.
  • Dosage forms of the pharmaceutical compositions of the invention include pharmaceutically acceptable compositions containing modifications and prodrugs, provided that they do not cause excessive toxicity, irritation, or allergic reactions to the patient, based on reliable medical judgment.
  • prodrug refers to compounds that are transformed to enhance uptake, such as by hydrolysis in the blood.
  • a suitable multiple emulsion comprises an outer water phase W1, an oil phase O dispersed in the outer water phase W1 and an inner water phase W2 dispersed in the oil phase O, wherein in the inner water phase W2 at least one electrolyte selected from the group of the alkali metal and alkaline earth halides and sulfates and at least one specific ribonucleic acid or deoxyribonucleic acid molecule, preferably a GATA-3 or Tbet-specific DNAzyme, wherein the outer water phase W1 contains a hydrophilic emulsifier which is a polymer of ethylene oxide and propylene oxide, and the oily phase O.
  • nucleic acid molecules in particular, can be protected particularly effectively against undesired degradation.
  • the type of dosage is determined by the attending physician according to the clinical factors. It is known to those skilled in the art that the type of dosage depends on various factors such as height, weight, body surface, age, sex or the general health of the patient, but also on the specific agent, the duration and method of administration and of other medications that may be administered in parallel. In this case, according to a particularly advantageous embodiment, the amount of the active ingredient of the drug can be adapted to the measured expression level.
  • kits for diagnosing a molecular phenotype of a A disease associated with chronic inflammation in human subjects suffering from chronic inflammation wherein the kit contains at least one specific component for quantitatively determining the protein or mRNA level of GATA-3 and / or Tbet in a biological isolate of the patient.
  • the diagnostic kit of the invention may be readily presented in the form of a ready-to-use "kit” comprising antibody or antigen adsorbed to a surface of a carrier and a preparation of human IgG antibodies, e.g. in the case of a human, a preparation of anti-human IgG antibodies which are labeled to be detected by a cascade of biotin-streptavidin-peroxidase or alkaline phosphatase-type reactions.
  • the diagnostic kit includes, in addition to a carrier, buffers and reagents, e.g. Reagents required to detect the reaction, e.g. Streptavidin coupled with a marker that gives a color reaction.
  • reagents e.g. Reagents required to detect the reaction, e.g. Streptavidin coupled with a marker that gives a color reaction.
  • the kit additionally comprises a standard sample of GATA-3 and / or T-Bet for calibrating the kit, using a standard sample to detect the protein or mRNA level of GATA-3 and / or Tbet.
  • a specific antibody against GATA-3 and / or Tbet is contained for the quantitative determination of the protein amount.
  • further components for carrying out an immunoassay in particular an ELISA, may be contained.
  • the further component for performing the ELISA is selected from the group consisting of lysis buffer for cell disruption, a microtiter plate, protein quantity standards for GATA-3 and / or Tbet, secondary antibodies and a coupled enzyme for reacting a substrate for detection.
  • a further specific antibody against GATA-3 or Tbet from the kit is preferably included.
  • the kit may contain a sequence-specific probe and / or primers for the GATA-3 and / or Tbet genes for the quantitative determination of the amount of mRNA.
  • cells can be isolated by technologies based on the binding of specific antibodies. Magnetic beads available from Miltenyi (Macs system), Dynal (DynaBeads) or BD-Bioscience (iMAG) are used here. Alternatively, this is done via a tent purification using fluorescence-labeled antibodies to cell sorters, for example from Cytomation (MOFLO) or BD-Bioscience (FACS). Vantage).
  • the purity of the target cells is preferably at least 80%, more preferably at least 95%, and most preferably at least 99%.
  • RNA isolation Methods for isolating the RNA are e.g. in Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001), New York and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), New York ,
  • kits silica technology
  • RNeasy Kit from Qiagen company to use for RNA isolation.
  • GATA-3 and Tbet are proteins that act as so-called transcription factors in the nucleus of T-helper cells of subtypes Th1 and Th2.
  • cells which produce GATA-3 and Tbet In order to determine the concentration of these two nuclear proteins in a given volume of a biological isolate, especially in a given volume of whole blood, cells which produce GATA-3 and Tbet must first be isolated and then lysed. Direct detection of these proteins from human serum or plasma is not possible since they are not present at detectable levels there. An analysis of GATA-3 and Tbet therefore takes place in 4 stages:
  • the affinity purification of the Th1 / Th2 cell types by antibodies against specific surface markers can also be carried out as a 1-stage process without prior enrichment of the leukocytes,
  • the isolation of leucocytes by Ficoll density gradient centrifugation from whole blood is sufficient to carry out a quantification of the proteins GATA-3 and Tbet,
  • a bead-based affinity purification of the Th1 / Th2 cell types by antibodies against specific surface markers in a deep well plate in 96-well format can be used,
  • a bead-based affinity purification of the leucocytes by antibodies against specific surface markers for example in a deep well plate in 96-well format, can be used
  • hypoosmolar lysis of the erythrocytes can be carried out to obtain a leukocyte preparation or
  • the protein digestion can also be done directly from whole blood.
  • detergent-containing buffers could be:
  • High ionic e.g., SDS or cholate and derivatives thereof
  • nonionic e.g., Triton or Tween-20
  • ionic and nonionic detergents eg Ripa buffer with 50 mM Tris ⁇ HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% sodium deoxycholate and 0.1% SDS.
  • FIG. 1 The effect of various detergents on the release of GATA-3 from stimulated Jurkat cells is shown in FIG.
  • the concentration of the two transcription factors GATA-3 and Tbet can in principle be determined by various methods. For the purposes of the present invention, inter alia:
  • CLIA chemoluminescence-linked immunosorbent assay
  • FIG. 2a and 2b show results of quantification of Tbet and GATA-3 by chromogenic sandwich ELISA.
  • Cells were recovered from whole blood by Ficoll density gradient centrifugation. The cells (stimulated human mononuclear cells) were lysed with a Ripa buffer. The lysate was assayed for the concentration of GATA-3 and Tbet using two ELISA prototype methods. The concentration of the two proteins was shown in relation to the total protein concentration of the cell lysates (normalization to protein content). The results according to FIG.
  • Th1 cells have a higher content of Tbet (about 160 ng / ml analyte / mg protein) than Th2 cells (about 56 ng / ml analyte / mg protein) and this fact clearly from the result of the ELISA test:
  • the Tbet content in the Th1 cells is thus more than two times higher, namely about a factor of three, than in Th2 cells.
  • the content of GATA-3 in Th2 cells (about 10 ng / ml analyte / mg protein) is higher than in Th1 cells (about 6 ng / ml analyte / mg protein).
  • the GATA-3 content is therefore more than 1.5-fold higher in the Th2 cells - namely around the factor 1, 7 - than in Th1 cells.
  • the quantitative ratio of Tbet: GATA-3 in Th1 cells differs substantially from the corresponding ratio in Th2 cells.
  • the ratio of Tbet: GATA-3 here in Th1 cells is about 27, ie more than 20, whereas the corresponding ratio in Th2 cells is about 6, that is less than 10.
  • GATA-3 and Tbet The quantitative determination of GATA-3 and Tbet is carried out in each case by means of a sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • the wells of a 96 well microtiter plate are coated with specific antibodies against GATA-3.
  • GATA-3 binds to the antibodies on the 96-well plate.
  • peroxidase-labeled streptavidin is added.
  • substrate is added.
  • the color development is terminated after a defined time by adding a stop solution.
  • the intensity of color development is quantified by a microtiter plate reader. The quantification of the samples is carried out by comparison with the entrained standards known protein concentration.
  • FIG. 3 shows a corresponding standard curve of a GATA-3 ELISAS.
  • the steps relate in detail to:
  • the detection of the Tbet protein is carried out according to the following test principle:
  • the quantitative determination of Tbet is carried out by means of a sandwich ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • the wells of a 96 well microtiter plate are coated with specific antibodies against Tbet. After addition of the sample or standard Tbet binds to the antibodies on the 96-well plate. After a washing step to remove unbound substances, a second specific antibody is added against Tbet. After a further washing step to remove the unbound substances, a peroxidase-labeled antibody is added against the Tbet-specific antibody. After a final washing step to remove unbound substances, substrate is added.
  • the color development is terminated after a defined time by adding a stop solution. The intensity of color development is quantified by a microtiter plate reader. The quantification of the samples is carried out by comparison with the entrained standards known protein concentration.
  • FIG. 4 shows a corresponding standard curve of a Tbet E
  • the steps in detail relate to:
  • Possibilities of standardization according to the invention include:
  • FIG. 5 shows a normalized determination of Tbet in lysates of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Lysis of PBMCs of healthy subjects and patients suffering from allergic diseases, such as allergic bronchial asthma, rhinoconjunctivitis, allergic sinusitis, atopic dermatitis, Food allergies. The concentration of Tbet was normalized to the cell number in the lysates. The disease is dependent on Th2 cells and, consequently, a lower concentration of Tbet (about 12 ng / ml / 1 million cells) was found in the allergy sufferers compared to healthy samples (about 27 ng / ml / 1 million cells).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the Tbet concentration was thus reduced slightly more than a factor of 2 in the allergy sufferer compared to a healthy subject.
  • An assignment of the patients to the molecular phenotype "Th1 -low" is thus simply possible here, since the Tbet gene expression in the biological isolate is lower than a defined reference value, here the Tbet gene expression of healthy samples.
  • Example 4 for sample preparation Th1 / Th2 cells by means of magnetic beads, which are coated with cell-specific antibodies, enriched. Subsequently, the detection of GATA-3 according to the instructions of Example 2.
  • Embodiment 5 In a modification of Examples 2 and 3, according to Example 4 for sample preparation, leucocytes are enriched by size exclusion filtration. Subsequently, the detection of GATA-3 according to the instructions of Example 2.
  • a GATA-3-specific DNAzyme shows therapeutic effects in the mouse model of OVA-induced allergic airway inflammation of the "Th2-high” phenotype.
  • mice were sensitized by intraperitoneal injection with the model allergen ovalbumin (OVA) in the presence of the adjuvant AI (OH) 3 on days 0, 14 and 21 Days 24-26, the mice inhaled a 1% OVA aerosol to induce a Th2-dominated lung allergic inflammatory response
  • OVA ovalbumin
  • the GATA-3 specific DNAzyme hgd40 SEQ ID NO 40 was resolved in PBS, administered intranasally.
  • the Balb / c mouse strain is characterized by preferentially generating strong Th2 responses. This is reinforced by the use of AL (OH) 3 as an adjuvant that clearly supports the development of Th2-dominated immune responses.
  • the mouse model described is correspondingly characterized by massive infiltration of eosinophils and Th2 cells into the respiratory tract along with hyperplasia of the mucus-forming goblet cells with increased mucus production and formation of respiratory hyperresponsiveness.
  • Immunologically in addition to allergen-specific Th2 cells, characterized by the production of the typical cytokines IL-4, IL-5 and IL-13, also OVA-specific antibodies of the immunoglobulin classes IgE and IgG1 (in the mouse both Th2-dependent) can be detected. All of these parameters are typical clinical features of a "Th2-high" phenotype (Wenzel et al., Am J Respir Crit Care Med.
  • eosinophilic granulocytes represent approximately 60-70% of all leukocytes in the bronchoalveolar lavage (BAL) in the mouse model, while already 3-5% These cells in the sputum of patients indicate a Th2-dominated phenotype.
  • a GATA-3 specific DNAzyme shows significant therapeutic effects in the chronic mouse model of Th2-dominated allergic airway inflammation

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Abstract

Chronische Entzündungen stellen einen zunehmenden medizinischen Problemkreis von hoher sozioökonomischen Bedeutung dar. Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung leidenden Patienten sowie ein Arzneimittel zur Behandlung eines solchen Patienten. Dazu wird die Genexpression von GATA-3 und/oder Tbet in einem biologischen Isolat des Patienten gemessen und für die Zuordnung zu einem molekularen Phänotyp der Erkrankung genutzt.

Description

Verfahren zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden
Erkrankung leidenden Patienten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung leidenden Patienten sowie ein Arzneimittel zur Behandlung eines solchen Patienten.
Chronische Entzündungen stellen einen zunehmenden medizinischen Problemkreis von hoher sozioökonomischen Bedeutung dar. Hierzu zählen insbesondere folgende Erkrankungsgruppen: Autoimmunerkrankungen und Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (Manifestationen an u. a. Haut, Lunge, Niere, Gefäßsystem, Nervensystem, Bindegewebe, Bewegungsapparat, endokrinem System), Allergische Soforttypreaktionen und Asthma, Chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (COPD), Arteriosklerose, Psoriasis und Kontaktekzem und Chronische Abstoßungsreaktionen nach Organ- und Knochenmarkstransplantation. Viele dieser Erkrankungen zeigen in den letzten Dekaden eine ansteigende Prävalenz nicht nur in den Industrienationen, sondern zum Teil weltweit. So leiden in Europa, Nordamerika, Japan und Australien mittlerweile über 20% der Bevölkerung an allergischen Erkrankungen und Asthma. Chronischobstruktive Lungenerkrankungen sind zurzeit die fünfthäufigste Todesursache weltweit und werden nach Berechnungen der WHO im Jahre 2020 die dritthäufigste Todesursache darstellen. Arteriosklerose mit den Folgeerkrankungen Herzinfarkt, Schlaganfall und peripherer arterielle Verschlusskrankheit nehmen in der Morbiditäts- und Mortalitätsstatistik weltweit eine führende Position ein. Psoriasis und Kontaktekzem sind zusammen mit der Neurodermitis die häufigsten chronischen Entzündungserkrankungen an der Haut überhaupt.
Aufgrund von bis heute nur unzureichend verstandenen Wechselwirkungen zwischen Umweltfaktoren und einer genetischen Disposition kommt es zu nachhaltigen Fehlregulationen des Immunsystems. Hierbei lassen sich für diese unterschiedlichen Erkrankungen folgende gemeinsame Prinzipien feststellen:
(A) Es kommt zur Entwicklung einer überschießenden Immunantwort gegen normalerweise für den Menschen harmlose Antigene. Diese Antigene können Bestandteile der Umwelt sein (z. B. Allergene, wie Pollen, Tierhaare, Nahrungsmittel, Milben, chemische Substanzen wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Reinigungsmittel). In diesen Fällen entwickelt sich bei den Patienten eine allergische Reaktion. Im Falle von z. B. Aktiv- und Passivrauchern kommt es zu chronisch-obstruktiven Lungenerkrankungen (COPD). Andererseits kann das Immunsystem aber auch gegen Komponenten des eigenen Organismus reagieren, diese als fremd erkennen und eine Entzündungsreaktion dagegen in Gang setzen. In diesen Fällen entwickelt sich eine Autoimmunerkrankung. In jedem Falle werden harmlose, nicht-toxische Antigene fälschlicherweise als fremd bzw. gefährlich erkannt und eine unangemessene Entzündungsreaktion in Gang gesetzt. (B) Die Erkrankungen verlaufen in Phasen zu denen die Initiation, Progression, also Fortschreiten der Entzündungsreaktion, und die damit assoziierte Destruktion und der Umbau mit Verlust von Organ-Funktionalität (sogenanntes Remodeling) zählen.
(C) Die Erkrankungen zeigen Patienten-spezifische sub-phänotypische Aus- prägungsmerkmale.
(D) An der Initiation, Aufrechterhaltung und den Destruktions- und Umbauprozessen sind Komponenten der angeborenen und erworbenen Immunität nachhaltig beteiligt. Unter dem Einfluss der angeborenen Immunität (wichtige Komponenten: Antigen- präsentierende Zellen mit ihren diversen Populationen und das Komplementsystem) kommt es zu Aktivierung und Differenzierung der Zellen des adaptiven Immunsystems (wichtige Komponenten: T-und B-Lymphozyten). Die T-Zellen übernehmen zentrale Funktionen im weiteren Verlauf indem sie in hoch-spezialisierte Effektoren differenzieren.
Hierbei aktivieren und erwerben sie bestimmte Effektormechanismen, zu denen insbesondere folgende Funktionen zählen: Antikörperproduktion, Kontrolle der Funktionalität von Effektorzellen des Immunsystems (wie z. B. neutrophile-, basophile-, eosinophile Granulozyten), Rückkopplung auf Funktionen des angeborenen Immunsystems, Beeinflussung der Funktionalität von nicht-hämatopoetischen Zellen wie z. B. Epithel, Endothel, Bindegewebe, Knochen und Knorpel und vor allem neuronale Zellen. Hier kommt es zu einer besonderen Wechselwirkung zwischen Immun- und Nervensystem, aus dem sich das Konzept der Neuro-immunologischen Interaktion bei chronischen Entzündungen entwickelt hat.
Da die bereits angesprochenen T-Zellen zentrale Funktionen im Krankheitsverlauf übernehmen ist ein Verständnis ihrer Spezialisierung entscheidend. Eine komplexe Signaltransduktionskaskade ist an der Differenzierung von naiven CD4+ Zellen zu Th1 - bzw. Th2-Zellen beteiligt.
Die Stimulation über den T-Zellrezeptor durch den entsprechenden Peptid-MHC-Komplex induziert die klonale Expansion und programmierte Differenzierung von CD4+ T- Lymphozten zu T-Helfer (Th) 1 - oder Th2-Zellen. Die Unterscheidung dieser beiden Subtypen erfolgt aufgrund ihrer Zytokin-Profile. Th1 -Zellen produzieren lnterferon-γ (INFy), Interleukin 2 (IL-2) und Tumor-Nekrose-Faktor-α, wohingegen Th2-Zellen IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13 sezernieren. Bakterielle und virale Infektionen induzieren eine Immunantwort, die von Th1 -Zellen dominiert wird. Auf der anderen Seite regulieren Th2-Zellen die IgE Produktion gegen Parasiten. Dabei besteht zwischen Th1 -und Th2-Zellen ein Gleichgewicht. Die Zerstörung dieses Gleichgewichtes verursacht Krankheiten, so ist eine überschießende Th1 - Zellenantwort assoziiert mit Autoimmunerkrankungen, während allergischen Erkrankungen eine verstärkte Th2-Zellantwort zugrunde liegt.
Es ist bekannt, dass Th1 -Zytokine in die Pathogenese von Autoimmunerkrankungen wie z. B. Autoimmunuveitis, experimentelle allergische Enzephalomyelitis, Typ 1 Diabetes mellitus oder Morbus Crohn involviert sind, während Th2-Zytokine (IL-4, IL-5, IL-13 bzw. IL-9) an der Entstehung von chronisch entzündlichen Atemwegserkrankungen, wie z. B. Atemwegseosinophilie, Asthma, Mukus-Hypersekretion und Atemwegs-Hyperreagibilität beteiligt sind. Grundlage dieser Erkrankungen sind pathophysiologische Veränderungen während der Produktion von charakteristischen Zytokinen durch antigenspezifische Th- Zellen. Th2-Zell-Subpopulationen in der Lunge und den Atemwegen rufen im Tiermodell die charakteristischen Symptome des Asthma bronchiale hervor. An der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und chronischer Entzündungsreaktionen sind u.a. zwei Transkriptionsfaktoren beteiligt: der Th1 -Zell-spezifische Transkriptionsfaktor Tbet und der Th2-Zell-spezifische Transkriptionsfaktor GATA-3.
Der Th1 -Zell-spezifische Transkriptionsfaktor Tbet ist vor allem für die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1 -Zellen verantwortlich. Seine Expression wird über die Signaltransduktionswege des T-Zell Rezeptors (TZR) und über INFy-Rezeptor/STAT1 kontrolliert. Tbet transaktiviert das endogene INFy-Gen und induziert die INFy Produktion. Die in vivo Funktion von Tbet wird in Knock-Out- Mäusen (Tbet-/-) bestätigt. In Tbet defizienten Mäuse ist die Menge an Th2-Zytokinen erhöht.
Bekannt ist die Funktion von Tbet in mucosalen T-Zellen bei der Entstehung von entzündlichen Darmerkrankungen. Der Transkriptionsfaktor Tbet induziert spezifisch die Entwicklung von Th1 -Zellen und kontrolliert die INFy-Produktion in diesen Zellen. Durch die Inhibition von Tbet wird die Balance zwischen Th1 -und Th2-Zellen zugunsten von Th2-Zellen verschoben.
Viele entzündliche Erkrankungen hingegen, wie beispielsweise das allergische Asthma, sind assoziiert mit einer Aktivierung von Th2-Zellen. Th2-Zellen spielen eine wesentliche Funktion bei der Entwicklung allergischer Erkrankungen, insbesondere verschiedener Asthmaerkrankungen. Die dazu erforderliche Differenzierung von ThO-Zellen zu Th2- Zellen ist abhängig von dem Transkriptionsfaktor GATA-3. GATA-3 ist ein Mitglied der GATA-Familie der Transkriptionsfaktoren.
Der Th2-Zell-spezifische Transkriptionsfaktor GATA-3 ist vor allem für die Differenzierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th2-Zellen verantwortlich. Die Th2-Zelldifferenzierung wird dabei hauptsächlich durch zwei Signalübertragungswege, den T-Zell Rezeptor- (TZR) und den IL-4 Rezeptor-Weg, gesteuert: Vom TZR weitergeleitete Signale aktivieren sowohl die Th2 zellspezifischen Transkriptionsfaktoren c-Maf und GATA-3 als auch die Transkriptionsfaktoren NFAT und AP-1 . Die Aktivierung des IL-4 Rezeptors führt zur Bindung von STAT6 an die zytoplasmatische Domäne des IL-4 Rezeptors, wo er von Jak1 - und Jak3-Kinasen phosphoryliert wird. Die Phosphorylierung ihrerseits führt zur Dimerisierung und Translokation von STAT6 in den Nukleus, wo STAT6 die Transkription von GATA-3 und anderen Genen aktiviert. GATA-3 ist ein Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der ausschließlich in reifen Th2-Zellen exprimiert wird, nicht in Th1 -Zellen. Th2-Zellen produzieren Zytokine wie beispielsweise IL-4, IL-5, IL-6, IL-13 und GM-CSF. Die Polarisierung zu Th2 inhibiert eine Th1 -Differenzierung durch Suppression von Tbet und umgekehrt. Die Expression von GATA-3 ist jedoch nicht auf T-Zellen beschränkt. Eine Expression von GATA-3 konnte auch in eosinophilen und basophilen Granulocyten, Mastzellen und Epithelzellen nachgewiesen werden. GATA-3 spielt eine zentrale Rolle in der Immunpathogenese von chronischen Entzündungserkrankungen, insbesondere von allergischem Asthma.
Etablierte Präparate zur Behandlung von chronischen Entzündungserkrankungen sind u.a. Kortikosteroide, Anti-Leukotriene, Immunsuppressiva und Anti-lgE monoklonale Antikörper. Asthmapatienten sprechen jedoch unterschiedlich gut auf diese Therapeutika an. Lange Zeit blieb ungeklärt, worauf diese Unterschiede in der Wirksamkeit zurückzuführen sind. In Konsequenz musste am Patienten die passende Therapie im Einzelfall mehr oder weniger nach dem Prinzip„Versuch und Irrtum" eingestellt werden. Erst kürzlich konnte jedoch festgestellt werden, dass sich beispielsweise an Asthma leidende Patienten in Untergruppen weiter aufteilen lassen (Woodruff et al., 2009, T- helper Type 2-driven Inflammation Defines Major Subphenotypes of Asthma, Am J Respir Cht Care Med, Vol 180, 388-395). So wurde gezeigt, dass es unter Asthmapatienten wenigstens zwei Untergruppen gibt, die mit„Th2 high" und„Th2 low" bezeichnet wurden. Die Untergruppe „Th2 high" der Asthmapatienten besitzt dabei u.a. eine erhöhte Expression des Gens POSTN, welches für das Protein Periostin kodiert, sowie der Gene für IL-13 und IL-5. Die Gruppe „Th2 low" der getesteten Asthmapatienten zeigt eine niedrige POSTN-Genexpression, vergleichbar zu einer Kontrollgruppe gesunder Personen. Diese unterschiedlichen molekularen Phänotypen könnten eine Ursache für die unterschiedliche Wirksamkeit gängiger Therapeutika sein. So konnte für die Untergruppe „Th2 high" ein verbessertes Ansprechverhalten auf eine Behandlung mit Kortikosteroiden festgestellt werden.
Es konnte weiterhin gefunden werden, dass zwei Gruppen von Asthmapatienten, nämlich „Th2 high" und„Th2 low", unterschiedlich gut auf eine Therapie mit einem humanisierten monoklonalen Antikörper gegen IL-13 ansprechen (Corren et al., 201 1 , Lebrikizumab Treatment in Adults with Asthma, The new england journal of medicine, 10.1056/NEJMoa1 106469). Dabei erfolgte zunächst eine empirische Eingruppierung von Asthmapatienten in die Gruppe„Th2-high", wenn die Werte für Serum-lgE höher als 100 IU/ml und die Zahl der eosinophilen Granulocyten bei 0,14x109 Zellen pro Liter oder höher waren. Bei entsprechenden Werten jeweils darunter erfolgte eine Eingruppierung in die Gruppe „Th2-low". Alternativ erfolgte eine Klassifizierung nach dem Serum-Periostin- Spiegel, welcher als Ersatzmarker (Surrogatmarker) für das in Blut- oder Atemwegsproben schwierig nachweisbare Th2-Zytokin IL-13 dient. Dabei wird die Tatsache ausgenutzt, dass IL-13 u.a. die Expression des Periostin kodierenden Gens POSTN in Epithelzellen in vitro induziert (Woodruff et al., 2007, Proc Natl Acad Sei USA., 104(40) :15858-63. Genome-wide profiling identifies epithelial cell genes associated with asthma and with treatment response to corticosteroids.). Patienten mit einem Serum- Periostin-Spiegel über dem Durchschnitt wurden nach Corren et al., 201 1 , in eine Gruppe „Periostin-high" eingeordnet. Für die genannten Untergruppen„Th2-high" und„Periostin- high" konnte tendenziell ein besseres Ansprechverhalten auf eine Behandlung mit Anti-IL- 13-Antikörper beschrieben werden.
Nach der WO 2009/124090 A1 wurde ebenfalls eine gewisse Klassifikation von Asthmapatienten vorgeschlagen, wobei die Genexpression einer Vielzahl von Kandidatengenen, wie beispielsweise POSTN, CLCA1 und SERPINB2, herangezogen wurde. Da diese Gene bekanntermaßen durch die Th2-Zytokine IL-4 oder IL-13 hochreguliert werden, wurde das Cluster auch als„IL-4/IL-13-Signatur" bezeichnet. Neben der Messung des Serum-Periostin-Spiegels sowie der entsprechenden mRNA Menge wurde dabei eine Bestimmung der Werte für Serum-lgE und der Zahl der eosinophilen Granulocyten beschrieben.
Ein Nachteil der Patientenstratifizierung auf Grundlage dieser Genexpression, vor allem von POSTN, ist, dass neben einer „IL-4/IL-13-Signatur" auch das Zytokin IL-5 eine bedeutende Rolle in der Genese von Asthma spielt. Darüber hinaus ist die Rolle des Proteins Periostin in der Immunkaskade und damit der Krankheitsentstehung unbekannt.
Es stellte sich somit die Aufgabe, einen Biomarker aufzufinden, der zur zuverlässigen und gleichzeitig klinisch praktikablen molekularen Phänotypisierung von einem an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten in die Gruppen „Th2-high" oder„Th2-low" bzw. „Th1 -high" oder„Th1 -low" geeignet ist. Weiterhin sollte der auf diese Weise klassifizierte Patient mit einem spezifisch für diese Untergruppe besonders wirksamen Therapeutikum behandelbar sein. Der Biomarker soll dazu eine individuelle Vorhersage über die Wirksamkeit eines Therapeutikums in Bezug auf einen Patienten, insbesondere einen Asthmapatienten, ermöglichen. Die genannte Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten gelöst, wobei der molekulare Phänotyp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Untergruppen„Th2 high",„Th2 low", „Th1 high" und„Th1 low" und die Genexpression von GATA-3 und/oder Tbet in einem biologischen Isolat des Patienten gemessen und für die Zuordnung zu einem molekularen Phänotyp der Erkrankung genutzt wird. Die nähere Klassifizierung eines an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten erfolgt dabei durch Messung der Genexpression des Transkriptionsfaktors GATA-3 und/oder des Transkriptionsfaktors Tbet. Wie oben bereits einleitend ausgeführt, sind an der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungsreaktionen der Th1 -Zell-spezifische Transkriptionsfaktor Tbet und der Th2-Zell-spezifische Transkriptionsfaktor GATA-3 beteiligt. Die Polarisierung zu Th2 inhibiert eine Th1 - Differenzierung durch Suppression von Tbet und umgekehrt. Je nach Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet kann eine Zuordnung zu einem molekularen Phänotyp, also zu einer Untergruppe der mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung, erfolgen. Mit dem erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren kann die genannte molekulare Phänotypisierung ohne Schwierigkeiten im klinischen Alltag mit hoher Aussagekraft vorgenommen werden. Die Transkriptionsfaktoren GATA-3 und Tbet sind die zentralen Schlüsselmoleküle bei der Entstehung von Th1 - bzw. Th2-abhängigen chronischen Entzündungserkrankungen. Deswegen stellt die direkte Messung der Protein- bzw. mRNA-Expression einen bestmöglichen Patientenstratifizierungsansatz dar, da keine zwischengeschalteten Mechanismen das Ergebnis möglicherweise verfälschen können.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet über die Protein- oder die mRNA-Menge bestimmt. Dabei kann die Protein-Menge mit Hilfe eines Immunassays quantitativ bestimmt werden. Der Immunassay ist vorzugsweise ein Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay (ELISA)-Test, ein Radioimmunassay (RIA), ein Elektrochemilumineszenz (ECL)-Immunassay, ein CLIA (chemoluminescence-linked Immunosorbent assay), ein FLIA (fluorescence-linked Immunosorbent assay) oder ein Multiplex-Assay.
Die genannten Assays bieten, neben hoher Sensibilität und Spezifität, alle den Vorteil einer möglichen Automatisierung und sind somit für den klinischen Alltag besonders gut geeignet. Selbstverständlich kann im Sinne der vorliegenden Erfindung gegebenenfalls jeder andere geeignete Test zur quantitativen Erfassung der Protein-Menge von GATA-3 und/oder Tbet auswählt werden. Weiterhin kann das Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet über massenspektrometrische Verfahren, chromatographische Verfahren, wie Gaschromatographie, flüssigkeitsbasierende Verfahren mit Festphasentrennung, wie HPLC, oder mikro- und nanofluidische Verfahren erfolgen.
Das Verfahren kann gegebenenfalls zur Ermittlung der Expression von GATA-3 oder Tbet mit Hilfe eines ELISA-Tests folgende Schritte umfassen:
- Herstellung eines Lysats durch Zellaufschluss;
- Zugabe des Lysats in eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte, die mit einem ersten GATA-3- oder Tbet-spezifischen Antikörper beschichtet ist;
- Waschen der Mikrotiterplatte;
- Zugabe eines zweiten GATA-3- oder Tbet-spezifischen Antikörpers in die Vertiefung der Mikrotiterplatte;
- Waschen der Mikrotiterplatte;
Detektion und Quantifizierung des GATA-3 oder Tbet Proteins.
Zum Zweck der Detektion kann der zweite spezifische Antikörper beispielsweise mit Biotin markiert sein und eine separate Zugabe eines an Streptavidin gekoppelten Enzyms erfolgen. Der zweite spezifische Antikörper kann aber auch direkt mit einem Enzym gekoppelt sein. Wenn es zweckmäßig ist, kann auch ein gegen den zweiten spezifischen Antikörper gerichteter dritter Antikörper, der mit einem Enzym gekoppelt ist, verwendet werden.
Das Enzym ist vorzugsweise eine Peroxidase oder alkalische Phosphatase und wird mit einem geeigneten Substrat umgesetzt, das zur Colorimetrie oder Chemilumineszenz und ähnlichem geeignet ist. Die mRNA-Menge von GATA-3 und/oder Tbet kann nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung zusätzlich oder in Alternative zur genannten Erfassung der Protein-Menge bestimmt werden. Dazu ist bevorzugt eine PCR, besonders bevorzugt eine qPCR, oder ein Micro-Array-Chip geeignet. Dem Fachmann ist bekannt, wie GATA-3 und Tbet spezifische Sonden bzw. Primer für die genannten Nachweismethoden auszuwählen sind.
Das biologische Isolat wurde gemäß einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens aus Vollblut, Urin, Sputum, einer broncho-alveolären Lavage (BAL), einer Biopsie, einem Bürstenabstrich, Liquor, Trachealsekret, Seminalflüssigkeit, Ascitesflüssigkeit, Speichel, Punkttat oder Lymphflüssigkeit gewonnen. Der Fachmann kennt die Routinemethoden zur Gewinnung von geeignetem biologischem Isolat.
GATA-3 und Tbet sind Proteine, die als Transkriptionsfaktoren ihre Wirkung im Zellkern von T-Helferzellen des Subtyps Th1 und Th2 entfalten. Um die Konzentration dieser beiden nukleären Proteine in einem bestimmten Volumen eines biologischen Isolats, wie in einem bestimmten Volumen an Vollblut oder ähnlichem, zu bestimmen, müssen Zellen, welche GATA-3 und Tbet bilden, zunächst isoliert und danach lysiert werden. Ein direkter Nachweis dieser Proteine aus menschlichem Serum oder Plasma ist kaum möglich, da sie dort nicht in detektierbarer Konzentration vorhanden sind. Eine Analyse von GATA-3 und Tbet erfolgt daher gegebenenfalls in vier Stufen:
- Abtrennung und Isolierung der GATA-3/Tbet exprimierenden Zellen von den übrigen zellulären Bestandteilen des Vollblutes
- Aufschluss der Zellen und Freisetzung der intrazellulären/nukleären Proteine
- Messung der Konzentration von GATA-3 und Tbet und
- Normierung der gefundenen Konzentrationen von GATA-3 und Tbet.
Gemäß einer vorteilhaften Weiterentwicklung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren, unabhängig davon, ob das Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet über die Protein- oder die mRNA-Menge bestimmt wird, auch einen oder mehrere der folgenden Schritte:
(i) Isolierung von Leukocyten, vorzugsweise mittels Ficoll-Gradientenzentrifugation;
(ii) Anreicherung von Leukocyten, vorzugsweise mittels Größenausschluss-Filtration; oder
(iii) Anreicherung von Th1 /Th2 Zellen, insbesondere CD4+-T-Zellen mit Hilfe zellspezifischer Antikörper, welche vorzugsweise an magnetische Beads gekoppelt sind. Die genannten Schritte (i) - (iii) werden vor dem Zellaufschluss durchgeführt und ermöglichen jeweils eine Erhöhung der Empfindlichkeit sowie der Aussagekraft des Diagnoseverfahrens, da insbesondere in den Leukocyten die Gene GATA-3 und Tbet differenziell exprimiert werden.
Nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th2 high", wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert.
Die Untergruppe „Th2 high" ist also entweder durch eine hohe absolute GATA-3 Genexpression gegenüber einem definierten Referenzwert gekennzeichnet. Dabei kann als Referenzwert - im Falle der Messung der Proteinmenge - ein entsprechender Wert des GATA-3 Proteingehalts im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Es können aber auch absolute Referenzwerte herangezogen werden. Im Falle der Messung der mRNA-Menge kann als Referenzwert ein entsprechender Wert der GATA-3 mRNA- Menge im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Es können aber auch wiederum absolute Referenzwerte, wie beispielsweise Kopien/ml, herangezogen werden.
Eine Zuordnung des Patienten zu dem genannten molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 high" erfolgt nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn alternativ oder zusätzlich zur erhöhten GATA-3 Genexpression das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat höher als ein definierter Referenzwert ist. Dabei kann als Referenzwert ein entsprechender Wert des Verhältnisses von GATA-3 : Tbet Genexpression im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Die Bestimmung des Verhältnisses von GATA-3 : Tbet Genexpression erhöht die Sicherheit der Aussage, da dabei neben der GATA-3 Genexpression als zusätzlicher Parameter die Tbet Genexpression festgestellt wird. Da die beiden Transkriptionsfaktoren sich in ihrer Expression, wie einleitend beschrieben, gegenläufig regulieren, stellt die Einbeziehung von Tbet eine interne Kontrolle für die Messung der GATA-3 Genexpression dar. Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Zuordnung des Patienten zu dem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th2 high" die Schritte:
Freisetzung von Proteinen oder RNA aus Zellen eines biologischen Isolats des Patienten;
Ermittlung des Expressionsniveaus der Proteine oder der mRNA für GATA-3 und/oder Tbet;
Einordnung des Patienten in eine die Untergruppe„Th2 high", wenn mindestens eine der vorstehend unter a) oder b) genannten Bedingungen zutrifft.
Alternativ findet zusätzlich zur genannten Bestimmung der GATA-3 und/oder Tbet Genexpression noch eine Bestimmung weiterer Parameter zur sicheren Einordnung in die Untergruppe„Th2 high" statt. So kann beispielsweise der Serum-lgE-Spiegel und die Zahl der eosinophilen Granulocyten gemessen werden. Eine Zuordnung zur Untergruppe „Th2 high" erfolgt dann, wenn weiterhin der Serum-lgE-Spiegel höher als 100 lU/ml und/oder die Zahl der eosinophilen Granulocyten bei 0,14x109 Zellen pro Liter oder höher liegt. Alternativ kann bei Bedarf auch noch die Konzentration an Stickstoffmonoxid in der ausgeatmeten Luft, also eine Bestimmung des FeNO-Werts, durchgeführt werden. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 low", wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert.
Die Untergruppe „Th2 low" ist also entweder durch eine niedrige absolute GATA-3 Genexpression gegenüber einem definierten Referenzwert gekennzeichnet. Dabei kann als Referenzwert - im Falle der Messung der Proteinmenge - ein entsprechender Wert des GATA-3 Proteingehalts im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Hier ist zu beachten, dass bei einem Patienten der Untergruppe „Th2 low" mit einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung die absolute GATA-3 Genexpression regelmäßig dennoch höher sein wird als in einem Isolat eines gesunden Patienten. Die absolute GATA-3 Genexpression kann jedoch auch niedriger als bei einem Gesunden sein. Jedenfalls ist die GATA-3 Genexpression aber nicht so hoch wie für die Untergruppe „Th2 high" beschrieben. Eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe „Th2 low" erfolgt somit, wenn dessen GATA-3 Proteingehalt gegenüber einem Isolat einer gesunden Person, wenn überhaupt, nur moderat erhöht ist. Es können aber auch feste Referenzwerte herangezogen werden. Im Falle der Messung der mRNA-Menge kann als Referenzwert ein entsprechender Wert der GATA-3 mRNA-Menge im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden, wobei eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe„Th2 low" erfolgt, wenn dessen GATA-3 mRNA-Menge geringer als in einer entsprechenden Probe eines Gesunden oder jedenfalls nicht wesentlich erhöht ist. Es können aber auch wiederum feste Referenzwerte herangezogen werden.
Eine Zuordnung des Patienten zu dem genannten molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 low" erfolgt nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn alternativ oder zusätzlich zur verminderten GATA-3 Genexpression das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat niedriger als ein definierter Referenzwert ist. Dabei kann als Referenzwert ein entsprechender Wert des Verhältnisses von GATA-3 : Tbet Genexpression im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Die Bestimmung des Verhältnisses von GATA-3 : Tbet Genexpression erhöht auch hier die Sicherheit der Aussage, da dabei neben der GATA-3 Genexpression als zusätzlicher Parameter die Tbet Genexpression festgestellt wird. Da die beiden Transkriptionsfaktoren sich in ihrer Expression, wie einleitend beschrieben, gegenläufig regulieren, stellt die Einbeziehung von Tbet in gewisser Hinsicht eine interne Kontrolle für die Messung der GATA-3 Genexpression dar.
Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Zuordnung des Patienten zu dem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th2 low" die Schritte:
Freisetzung von Proteinen oder RNA aus Zellen eines biologischen Isolats des Patienten;
Ermittlung des Expressionsniveaus der Proteine oder der mRNA für GATA-3 und/oder Tbet;
Einordnung des Patienten in eine die Untergruppe„Th2 low", wenn mindestens eine der vorstehend unter a) oder b) genannten Bedingungen zutrifft.
Alternativ können zusätzlich zur genannten Bestimmung der GATA-3 und/oder Tbet Genexpression wiederum noch weitere Parameter zur sicheren Einordnung in die Untergruppe„Th2 low" bestimmt werden. So kann beispielsweise der Serum-lgE-Spiegel und die Zahl der eosinophilen Granulocyten gemessen werden. Eine Zuordnung zur Untergruppe„Th2 low" erfolgt dann, wenn weiterhin der Serum-lgE-Spiegel niedriger als 100 IU/ml und/oder die Zahl der eosinophilen Granulocyten unter 0,14x109 Zellen pro Liter liegt. Alternativ kann bei Bedarf auch noch die Konzentration an Stickstoffmonoxid in der ausgeatmeten Luft, also eine Bestimmung des FeNO-Werts, durchgeführt werden.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform erfolgt eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th1 high", wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter
Referenzwert,
b) das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert. Die Untergruppe „Th1 high" ist also entweder durch eine hohe absolute Tbet Genexpression gegenüber einem definierten Referenzwert gekennzeichnet. Dabei kann als Referenzwert - im Falle der Messung der Proteinmenge - ein entsprechender Wert des Tbet Proteingehalts im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden, wobei eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe „Th1 high" erfolgt, wenn dessen Tbet Proteingehalt erhöht ist. Es können aber auch feste Referenzwerte herangezogen werden. Im Falle der Messung der mRNA-Menge kann als Referenzwert ein entsprechender Wert der Tbet mRNA-Menge im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden, wobei eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe„Th1 high" erfolgt, wenn dessen Tbet mRNA-Menge erhöht ist. Es können aber auch wiederum feste Referenzwerte herangezogen werden.
Eine Zuordnung des Patienten zu dem genannten molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 high" erfolgt nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn alternativ oder zusätzlich zur erhöhten Tbet Genexpression das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat höher als ein definierter Referenzwert ist. Dabei kann als Referenzwert ein entsprechender Wert des Verhältnisses von Tbet : GATA-3 Genexpression im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Die Bestimmung des Verhältnisses von Tbet : GATA-3 Genexpression erhöht auch hier die Sicherheit der Aussage, da dabei neben der Tbet Genexpression als zusätzlicher Parameter die GATA-3 Genexpression festgestellt wird und die Einbeziehung von GATA-3 eine interne Kontrolle für die Messung der Tbet Genexpression darstellt.
Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Zuordnung des Patienten zu dem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th1 high" die Schritte:
Freisetzung von Proteinen oder RNA aus Zellen eines biologischen Isolats des Patienten;
Ermittlung des Expressionsniveaus der Proteine oder der mRNA für Tbet und/oder GATA-3;
Einordnung des Patienten in eine die Untergruppe„Th1 high", wenn mindestens eine der vorstehend unter a) oder b) genannten Bedingungen zutrifft.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, das eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp einer Untergruppe„Th1 low" ermöglicht, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert.
Die Untergruppe „Th1 low" ist also entweder durch eine niedrige absolute Tbet Genexpression gegenüber einem definierten Referenzwert gekennzeichnet. Dabei kann als Referenzwert - im Falle der Messung der Proteinmenge - ein entsprechender Wert des Tbet Proteingehalts im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Hier ist zu beachten, dass bei einem Patienten der Untergruppe „Th1 low" mit einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung die absolute Tbet Genexpression dennoch höher sein kann als in einem Isolat eines gesunden Patienten. Die absolute Tbet Genexpression kann jedoch auch niedriger als bei einem Gesunden sein. Jedenfalls ist die Tbet Genexpression aber nicht so hoch wie für die Untergruppe „Th1 high" beschrieben. Eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe„Th1 low" erfolgt somit, wenn dessen Tbet Proteingehalt gegenüber einem Isolat einer gesunden Person, wenn überhaupt, jedoch nicht wesentlich erhöht ist. Es können aber auch feste Referenzwerte herangezogen werden. Im Falle der Messung der mRNA-Menge kann als Referenzwert ein entsprechender Wert der Tbet mRNA-Menge im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden, wobei eine Zuordnung des Patienten zur Untergruppe „Th1 low" erfolgt, wenn dessen Tbet mRNA-Menge geringer als in einer entsprechenden Probe eines Gesunden oder jedenfalls nicht wesentlich erhöht ist. Es können aber auch wiederum feste Referenzwerte herangezogen werden. Eine Zuordnung des Patienten zu dem genannten molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 low" erfolgt nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, wenn alternativ oder zusätzlich zur verminderten Tbet Genexpression das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat niedriger als ein definierter Referenzwert ist. Dabei kann als Referenzwert ein entsprechender Wert des Verhältnisses von Tbet : GATA-3 Genexpression im Isolat einer gesunden Person herangezogen werden. Die Bestimmung des Verhältnisses von Tbet : GATA-3 Genexpression erhöht auch hier die Sicherheit der Aussage, da dabei neben der Tbet Genexpression als zusätzlicher Parameter die GATA-3 Genexpression festgestellt wird und die Einbeziehung von GATA-3 in gewisser Hinsicht eine interne Kontrolle für die Messung der Tbet Genexpression darstellt.
Nach einer vorteilhaften Weiterentwicklung umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Zuordnung des Patienten zu dem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th1 low" die Schritte:
- Freisetzung von Proteinen oder RNA aus Zellen eines biologischen Isolats des Patienten;
Ermittlung des Expressionsniveaus der Proteine oder der mRNA für Tbet und/oder GATA-3;
Einordnung des Patienten in eine die Untergruppe„Th1 low", wenn mindestens eine der vorstehend unter a) oder b) genannten Bedingungen zutrifft.
Alternativ können zusätzlich zur genannten Bestimmung der GATA-3 und/oder Tbet Genexpression noch weitere Parameter zur sicheren Einordnung in die Untergruppe„Th1 high" und„Th1 low" bestimmt werden. So kann beispielsweise die Zahl der eosinophilen Granulocyten oder der Serum IgE-Spiegel gemessen werden. Eine Zuordnung zur Untergruppe„Th1 high" erfolgt dann, wenn der Serum-lgE-Spiegel niedriger als 100 lU/ml und/oder die Zahl der eosinophilen Granulocyten unter 0,14x109 Zellen pro Liter liegt. Anderenfalls erfolgt eine Zuordnung zu der Untergruppe„Th1 low". Alternativ kann bei Bedarf auch noch die Konzentration an Stickstoffmonoxid in der ausgeatmeten Luft, also eine Bestimmung des FeNO-Werts, durchgeführt werden. Um Unterschiede in der Probenvorbereitung zu berücksichtigen, kann eine Normierung der Konzentrationen von GATA-3 und Tbet durchgeführt werden. Unterschiede in der Probenvorbereitung können z.B. entstehen durch unterschiedliche Zellzahlen, die lysiert werden, durch unterschiedliche Lyseeffizienzen der einzelnen Proben oder durch unterschiedlichen Gehalt an den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Zellpräparationen. Möglichkeiten der Normierung sind erfindungsgemäß unter anderem: Normierung auf den Gesamt-Proteingehalt des Zelllysates, Normierung auf die Zellzahl, die lysiert wurde oder Normierung auf die Konzentration spezifischer Markerproteine, die spezifisch in bestimmten Zelltypen gefunden werden.
Die Patienten mit diagnostiziertem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 high" können unter Umständen gleichzeitig in die Untergruppe„Th1 low" eingeordnet werden. Auch können Patienten mit diagnostiziertem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th1 high" unter Umständen gleichzeitig in die Untergruppe „Th2 low" eingeordnet werden. Dies ist auf die oben dargestellte Tatsache zurückzuführen, dass die Polarisierung zu Th2 eine Th1 -Differenzierung durch Suppression von Tbet inhibiert und umgekehrt.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Erkrankungen diagnostiziert bzw. therapiert, die mit chronischen Entzündungen einhergehen, wie z.B. Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises (Manifestationen an u. a. Haut, Lunge, Niere, Gefäßsystem, Nervensystem, Bindegewebe, Bewegungsapparat, Endokrinem System), Allergische Soforttypreaktionen und Asthma, Chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (COPD), Arteriosklerose, Psoriasis und Kontaktekzem sowie chronische Abstoßungsreaktionen nach Organ- und Knochenmarkstransplantation. Auch Tumorerkrankungen können erfindungsgemäß diagnostiziert bzw. therapiert werden, soweit GATA-3 oder Tbet an der Entstehung beteiligt und/oder als Folgeerscheinung dereguliert sind.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die chronische Entzündungserkrankung entweder Th2-bedingt, wie beispielsweise allergisches Asthma Bronchiale, Rhinokonjunktivitis, allergische Sinusitis, atopische Dermatitis, Nahrungsmittelallergien, Pemphigus, Ulcerative Colitis, parasitäre Erkrankungen, oder Th1 -bedingt, wie beispielsweise Psoriasis, allergisches Kontaktekzem, Morbus Crohn, COPD, Rheumatoide Arthritis, Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes mellitus oder MS. Die oben genannte Aufgabe wird weiterhin erfindungsgemäß durch ein Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, die mit chronischen Entzündungen einhergehen, eines humanen Patienten mit einem molekularen Phänotyp gelöst, wobei der molekulare Phänotyp gemäß einem Verfahren nach einer oder mehreren Ausführungsformen des genannten erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens ermittelt wurde. Der identifizierte molekulare Phänotyp umfasst dabei insbesondere die Gruppen „Th1 low", „Th1 high", „Th2 low" oder„Th2 high".
Nach einer bevorzugten Ausführungsform enthält das genannte Arzneimittel eine für GATA-3 oder Tbet spezifische Ribonukleinsäure oder Desoxyribonukleinsäure, insbesondere ein für GATA-3 oder Tbet spezifisches DNAzym.
Ein generelles DNAzym-Modell stellt das „10-23"-Modell dar (Sontoro et al., 1997). DNAzyme des 10-23-Modells - auch als „10-23 DNAzyme" bezeichnet - besitzen eine katalytische Domäne von 15 Nukleotiden, welche von zwei Substratbindungsdomänen flankiert wird. Die katalytische Domäne besitzt dabei vorzugsweise die Sequenz ggctagctacaacga (SEQ ID No. 154). Die Länge der Substratbindungsdomänen ist variabel, sie sind entweder gleich oder unterschiedlich lang. In einer bevorzugten Ausführung, beträgt die Länge der Substratbindungsdomänen zwischen 6 und 14 Nukleotide, ganz besonders bevorzugt jeweils mindestens neun Nukleotide. Solche DNAzyme umfassen die allgemeine Sequenz nnnnnnnnnggctagctacaacgannnnnnnnn (SEQ ID NO 155). Besonders bevorzugt sind dabei Substratbindungsdomänen, die mRNA, kodierend für die Proteine GATA-3 und Tbet, binden. Die angegebene katalytische zentrale Domäne ggctagctacaacga ist lediglich eine bevorzugte Ausführungsform. Dem Fachmann ist bekannt, dass „10-23 DNAzyme" mit vergleichbarer biologischer Aktivität mit abgewandelter katalytischer Domäne erhalten werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Substratbindungsdomänen vollständig komplementär zu der Region, die die Spaltstelle flankiert. Um die Ziel RNA zu binden und sie zu spalten, muss das DNAzym jedoch nicht unbedingt vollständig komplementär sein. DNAzyme des 10-23 Typs spalten die Ziel mRNA an Purin-Pyrimidin Abfolge-Sequenzen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen die DNAzyme vorzugsweise die in vivo aktiven DNAzyme gegen GATA-3 und Tbet gemäß der WO 2005/033314 A2, deren Inhalt zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Erfindung erklärt wird.
Ein Arzneimittel zur spezifischen Inhibition der GATA-3 Expression in vivo enthält insbesondere mindestens ein DNAzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNAzymen mit einer Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 70. Ein solches DNAzym bindet bevorzugt an eine mRNA, die für ein humanes GATA-3 Gen mit einer Gen-Sequenz ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO 151 (humanes GATA-3 aus Datenbank Nr.: XM_043124), SEQ ID NO 152 (humanes GATA-3 aus Datenbank Nr.: X58072) und SEQ ID NO 153 (humanes GATA-3, sequenziert aus Plasmid pCR2.1 ) kodiert.
Ein Arzneimittel zur spezifischen Inhibition der GATA-3 Expression in vivo enthält vorzugsweise das DNAzym hgd40 mit der Sequenz 5'-GTGGATGGAggctagctacaacgaGTCTTGGAG (SEQ ID NO 40).
Ein Arzneimittel zur spezifischen Inhibition der Tbet Expression in vivo enthält insbesondere mindestens ein DNAzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNAzymen mit einer Sequenz gemäß einer der Sequenzen SEQ ID NO 71 bis SEQ ID NO 148. Ein solches DNAzym bindet bevorzugt an eine mRNA, die für ein humanes Tbet Gen mit einer Gen-Sequenz ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID NO 149 (humanes Tbet aus Datenbank Nr.: NM_013351 ) und SEQ ID NO 150 (humanes Tbet, sequenziert aus pBluescript-SK) kodiert. Ein Arzneimittel zur spezifischen Inhibition der Tbet Expression in vivo enthält vorzugsweise das DNAzym td69 mit der Sequenz 5'-GGCAATGAAggctagctacaacgaTGGGTTTCT (SEQ ID NO 139) oder td70 mit der Sequenz 5'-TCACGGCAAggctagctacaacgaGAACTGGGT (SEQ ID NO 140). Alternativ zu den DNAzymen kann das Arzneimittel zur spezifischen Inhibition der GATA- 3 oder Tbet Expression eine geeignete siRNA enthalten.
Das Arzneimittel besitzt vorzugsweise eine Formulierung, die die genannten spezifischen Ribonukleinsäure- oder Desoxyribonukleinsäure-Moleküle den Patienten in Form einer pharmazeutisch akzeptablen Komposition entweder oral, rektal, parenteral, intravenös, intramuskulär oder subkutan, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, intrathekal, intravasculär, lokal (Puder, Salbe oder Tropfen) oder in Sprayform verabreicht werden kann. Dosierungsformen für die örtliche Administration des Arzneimittels dieser Erfindung schließen Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel ein. Die aktive Komponente wird unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen P reservat! ven, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt.
Das Arzneimittel kann zur Therapie gegen sämtliche Erkrankungsgruppen, die mit chronischen Entzündungen einhergehen, angewendet werden. Nach einer besonders bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt die Behandlung von Patienten mit einem molekularen Phänotyp der Untergruppe„Th2 high" mit einem GATA-3 spezifischen DNAzym. Die Therapie eines Patienten mit einem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 high" erfolgt mit einem Tbet-spezifischen DNAzym. Weiterhin kann die Behandlung eines Patienten mit dem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 low" mit einem Tbet-spezifischen DNAzym und die Behandlung eines Patienten mit dem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 low" mit einem GATA-3 DNAzym erfolgen.
Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel mit einem GATA-3 spezifischen DNAzym ist somit vorzugsweise für die Behandlung eines Patienten mit molekularem Phänotyp der Untergruppe „Th2 high" vorgesehen und ein Arzneimittel mit einem Tbet spezifischen DNAzym ist vorzugsweise für die Behandlung eines Patienten mit molekularem Phänotyp der Untergruppe„Th1 high" vorgesehen. Erfindungsgemäß besteht ein besonderer Vorteil des Arzneimittels nach einer oben genannten Ausführungsform zur spezifischen Therapie einer erfindungsgemäß diagnostizierten Untergruppe an Patienten - nämlich „Th2 high", „Th2 low", „Th1 high" oder„Th1 low" - darin, dass mit Hilfe des spezifischen Arzneimittels, insbesondere eines DNAzyms und/oder einer siRNA, eine funktionelle Inaktivierung von gerade den kodierenden Ribonukleinsäure-Molekülen von Transkriptionsfaktoren erfolgt, deren differenzielle Expression vorher festgestellt wurde und die an der Entstehung der chronischen Entzündungsreaktionen und Autoimmunerkrankungen beteiligt sind. Diese Strategie unterscheidet sich deutlich gegenüber konventionellen Vorgehensweisen und auch gegenüber dem genannten Ansatz nach Corren et al., 201 1 , da dort einerseits beispielsweise die Menge an Periostin (Surrogatmarker) gemessen wird, dann aber eine Therapie gegen ein anderes Target, wie beispielsweise gegen IL-13 mit Hilfe eines Anti- IL-13 Antikörpers, vorgeschlagen wurde. Das erfindungsgemäße Arzneimittel hingegen weist eine hohe Spezifität auf. Es bewirkt eine Zell-spezifische Intervention und ist spezifisch für Kompartimente und Organe. Darreichungsformen der erfindungsgemäßen Arzneimittels umfassen pharmazeutisch akzeptable Kompositionen, die Modifikationen und "Prodrugs" beinhalten, sofern sie nach zuverlässiger medizinischer Beurteilung keine übermäßige Toxizität, Irritationen oder allergische Reaktionen am Patienten auslösen. Der Terminus "Prodrug" bezieht sich auf Verbindungen, die zur Verbesserung der Aufnahme transformiert werden, wie beispielsweise durch Hydrolyse im Blut.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auch in der Form einer multiplen Emulsion zur Applikation der genannten spezifischen Nukleinsäuremoleküle eingesetzt werden. Eine geeignete multiple Emulsion umfasst dazu eine äußere Wasserphase W1 , eine in der äußeren Wasserphase W1 dispergierte Ölphase O und eine in der Ölphase O dispergierte innere Wasserphase W2, wobei in der inneren Wasserphase W2 wenigstens ein Elektrolyt ausgewählt aus der Gruppe der Alkali- und Erdalkalihalogenide und -sulfate und wenigstens ein spezifisches Ribonukleinsäure- oder Desoxyribonukleinsäure-Molekül, vorzugsweise ein für GATA-3 oder Tbet spezifisches DNAzym, vorgesehen ist, wobei die äußere Wasserphase W1 einen hydrophilen Emulgator enthält, der ein Polymer von Ethylenoxid und Propylenoxid ist, und die Ölphase O von Triacylglyceriden gebildet ist und einen lipophilen Emulgator aus der Gruppe der Dimethicone aufweist. Mit Hilfe einer solchen multiplen Emulsion können insbesondere Nukleinsäuremoleküle besonders wirkungsvoll vor unerwünschtem Abbau geschützt werden.
Die Art der Dosierung wird vom behandelnden Arzt entsprechend den klinischen Faktoren bestimmt. Es ist dem Fachmann bekannt, dass die Art der Dosierung von verschiedenen Faktoren wie z.B. Körpergröße, Gewicht, Körperoberfläche, Alter, Geschlecht oder der allgemeinen Gesundheit des Patienten abhängig ist, aber auch von dem speziell zu verabreichenden Mittel, der Dauer und Art der Verabreichung und von anderen Medikamenten, die möglicherweise parallel verabreicht werden. Dabei kann nach einer besonders vorteilhaften Ausführungsform, die Menge des wirksamen Bestandteils des Arzneimittels an das gemessene Expressionsniveau angepasst werden. So kann bei erfolgter Einordnung in die Untergruppe„Th2 high" und einer festgestellten sehr hohen GATA-3 Genexpression eine erhöhte Dosis des wirksamen Bestandteils, insbesondere eines für GATA-3 spezifischen DNAzyms, verabreicht werden. Entsprechend kann bei erfolgter Einordnung in die Untergruppe„Th1 high" und einer festgestellten sehr hohen Tbet Genexpression eine erhöhte Dosis des wirksamen Bestandteils, insbesondere eines für Tbet spezifischen DNAzyms, verabreicht werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten, wobei das Kit mindestens eine spezifische Komponente zur quantitativen Bestimmung der Protein oder mRNA-Menge von GATA-3 und/oder Tbet in einem biologischen Isolat des Patienten enthält.
Der erfindungsgemäße Kit zur Diagnose kann leicht in Form eines gebrauchsfertigen "Kits" dargeboten werden, welcher Antikörper oder Antigen, das an eine Oberfläche eines Trägers adsorbiert ist, umfasst und eine Zubereitung von humanen IgG-Antikörpern, die z.B. im Falle eines Menschen, eine Zubereitung von anti-human IgG-Antikörpern, die so markiert sind, dass sie durch eine Kaskade von Reaktionen des Typs Biotin-Streptavidin- Peroxidase oder -Alkalische Phosphatase nachgewiesen werden.
Alternativ umfasst der Kit zur Diagnose neben einen Träger auch Puffer und Reagenzien z.B. Reagenzien, die für den Nachweis der Reaktion erforderlich sind wie z.B. Streptavidin, das mit einem Marker gekoppelt ist, der eine Farbreaktion ergibt.
Alternativ umfasst der Kit zusätzlich eine Standardprobe von GATA-3 und/oder T-Bet zum Kalibrieren des Kits, wobei zum Nachweis der Protein oder mRNA-Menge von GATA-3 und/oder Tbet eine Standardprobe eingesetzt wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist für die quantitative Bestimmung der Protein- Menge ein jeweils spezifischer Antikörper gegen GATA-3 und/oder Tbet enthalten. Gegebenenfalls können gemäß einer Abwandlung weitere Komponenten zur Ausführung eines Immunoassays, insbesondere eines ELISAS, enthalten sein.
Die weitere Komponente zur Durchführung des ELISAS ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lysepuffer zum Zellaufschluss, einer Mikrotiterplatte, Protein- Mengenstandards für GATA-3 und/oder Tbet, sekundäre Antikörper und ein gekoppeltes Enzym zur Umsetzung eines Substrats zur Detektion. Bevorzugt ist neben einem ersten spezifischen Antikörper gegen GATA-3- und/oder Tbet ein weiterer spezifischer Antikörper gegen GATA-3- oder Tbet vom Kit umfasst. Das Kit kann für die quantitative Bestimmung der mRNA-Menge eine jeweils sequenzspezifische Sonde und /oder Primer für die GATA-3 und/oder Tbet Gene enthalten.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen: den Einfluss von verschiedenen Detergenzien auf die Freisetzung von GATA-3 aus stimulierten Jurkat-Zellen,
zeigen Ergebnisse einer Quantifizierung von Tbet und GATA-3 mittels chromogenem Sandwich-ELISA,
eine Standardkurve eines GATA-3 ELISAS zur Quantifizierung von Proben eine Standardkurve eines Tbet ELISAS zur Quantifizierung von Proben, eine normierte Bestimmung von Tbet in Lysaten humaner peripherer mononukleärer Zellen (PBMC) von gesunden Probanden und Allergikern, eine signifikante Verbesserung der allergischen Atemwegsentzündung nach viertägiger Behandlung mit dem GATA-3-spezifischen DNAzym hgd40 (SEQ ID NO 40) im Vergleich zu unbehandelten Mäusen, den Einfluss des GATA-3-spezifischen DNAzyms hgd40 (SEQ ID NO 40) auf die Anzahl der in der chronischen Entzündung auftretenden Neutrophilen, die Anzahl der Eosinophilen in der BAL und die Freisetzung von IL-5 nach achtwöchiger Behandlung und
den Einfluss des GATA-3-spezifischen DNAzyms hgd40 (SEQ ID NO 40) auf die peribronchiale/perivaskuläre Inflammation und Goblet-zell Hyperplasie im Lungengewebe.
Material und Methoden:
Zellen können zum Beispiel mittels Technologien isoliert werden, die auf der Bindung spezifischer Antikörper basieren. Hier werden Magnetic Beads, erhältlich von den Firmen Miltenyi (Macs-System), Dynal (DynaBeads) oder BD-Bioscience (iMAG) angewendet. Alternativ erfolgt dies über eine Zeltreinigung mittels Fluoreszenz-markierter Antikörper an Zellsortern beispielsweise der Firma Cytomation (MOFLO) oder BD-Bioscience (FACS- Vantage). Die Reinheit der Zielzellen ist bevorzugt bei mindestens 80%, stärker bevorzugt bei mindestens 95% und am meisten bevorzugt bei mindestens 99%.
Verfahren zur Isolierung der RNA sind z.B. in Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory (2001 ), New York und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998), New York, beschrieben. Außerdem ist es dem Durchschnittsfachmann möglich, kommerziell verfügbare Kits (Silika-Technologie) z.B. das RNeasy Kit von der Firma Qiagen, zur RNA Isolierung zu verwenden. Weiterhin ist es bevorzugt, direkt mRNA aus den Zielzellen durch Verwendung kommerzieller Kits beispielsweise der Firmen Qiagen (Oligotex mRNA Kit), Promega (PolyATract mRNA Isolation System) oder Miltenyi (mRNAdirect) zu reinigen.
Ausführungsbeispiele Ausführungsbeispiel 1
GATA-3 und Tbet sind Proteine, die als so genannte Transkriptionsfaktoren ihre Wirkung im Zellkern von T-Helferzellen des Subtyps Th1 und Th2 entfalten. Um die Konzentration dieser beiden nuklearen Proteine in einem bestimmten Volumen eines biologischen Isolats, insbesondere in einem bestimmten Volumen an Vollblut, zu bestimmen, müssen Zellen, welche GATA-3 und Tbet bilden, zunächst isoliert und danach lysiert werden. Ein direkter Nachweis dieser Proteine aus menschlichem Serum oder Plasma ist nicht möglich, da sie dort nicht in detektierbarer Konzentration vorhanden sind. Eine Analyse von GATA-3 und Tbet erfolgt daher in 4 Stufen:
Abtrennung und Isolierung der GATA-3/Tbet exprimierenden Zellen von den übrigen zellulären Bestandteilen des Vollblutes
Aufschluss der Zellen und Freisetzung der intrazellulären/nukleären Proteine Messung der Konzentration von GATA-3 und Tbet
- Normierung der gefundenen Konzentrationen von GATA-3 und Tbet Abtrennung und Isolierung der GATA-3/Tbet exprimierenden Zellen von den übrigen zellulären Bestandteilen des Vollblutes
Dies ist durch verschiedene Verfahren unterschiedlicher Komplexität durchführbar, insbesondere sind folgende Schritte zur Abtrennung und Isolierung im Sinne der vorliegenden Erfindung:
eine Isolierung von Leukozyten aus Vollblut mittels Ficoll-Dichtegradienten- Zentrifugation mit anschließender Affinitätsreinigung der Th1 /Th2 Zelltypen durch Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker,
gegebenenfalls kann die Affinitätsreinigung der Th1 /Th2 Zelltypen durch Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker auch als 1 -stufiges Verfahren ohne vorherige Anreicherung der Leukozyten durchgeführt werden,
gegebenenfalls reicht auch die Isolierung von Leukozyten durch Ficoll- Dichtegradienten-Zentrifugation aus Vollblut aus, um eine Quantifizierung der Proteine GATA-3 und Tbet durchzuführen,
- gegebenenfalls kann anstelle der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation auch eine bead-basierende Affinitätsreinigung der Th1 /Th2 Zelltypen durch Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker in einer Deep-Well Platte im 96-well Format eingesetzt werden,
- bei Bedarf kann anstelle der Ficoll-Dichtegradienten-Zentrifugation auch eine bead-basierende Affinitätsreinigung der Leukozyten durch Antikörper gegen spezifische Oberflächenmarker, beispielsweise in einer Deep-Well Platte im 96- well Format, eingesetzt werden
- gegebenenfalls kann zur Gewinnung einer Leukozytenpräparation eine hypoosmolare Lyse der Erythrozyten erfolgen oder
- gegebenenfalls kann der Proteinaufschluss auch direkt aus Vollblut erfolgen.
Der Aufschluss der Zellen und die Freisetzung der intrazellulären/nuklearen Proteine
Dies kann durch unterschiedliche Verfahren und Prinzipien erreicht werden, insbesondere sind folgende Verfahrensschritte im Sinne der vorliegenden Erfindung:
Zerstörung zellulärer Membranen durch Lysepuffer mit unterschiedlichen
Wirkprinzipien:
a) Hypotone Puffer, die ein Platzen der Zellen bewirken b) Detergenzhaltige Puffer, welche die Zellmembran zerstören und dadurch intrazelluläre Proteine freisetzen
c) Puffer hoher lonenstärke bzw. osmotisch aktive Puffer, welche den Zellen Wasser entziehen und dadurch die Zellintegrität zerstören
- Physikalische Verfahren wie Erhitzen, Schockgefrieren oder Ultraschall
Mechanische Verfahren wie Homogenisieren oder Mörsern.
Beispiele für detergenzhaltige Puffer könnten sein:
Puffersysteme mit hoher Konzentration an ionischen (z.B. SDS oder Cholat und dessen Derivate) oder nicht-ionischen (z.B Triton oder Tween-20) Detergenzien
Gemische aus ionischen und nicht-ionischen Detergenzien (z.B. Ripa-Puffer mit 50 mM Tris ■ HCl (pH 7,5), 150 mM NaCI, 1 % NP40, 0,5 % Natriumdeoxycholat und 0,1 % SDS)
kommerziell erhältliche Lysepuffer mit unbekannter Zusammensetzung (z.B. M- PER)
Der Einfluss von verschiedenen Detergenzien auf die Freisetzung von GATA-3 aus stimulierten Jurkat-Zellen ist in Fig. 1 dargestellt. Die Lyse von Jurkatzellen (humane T- Zell-Linie) durch verschiedene Lysepuffer und Quantifizierung von GATA-3 mittels ELISA ergab dabei eine besonders hohe Freisetzung von GATA-3 Protein bei Verwendung des RIPA Puffers (1 % RIPA). Es wurden etwa 50 ng/ml GATA-3 nachgewiesen.
Messung der Konzentration von GATA-3 und Tbet
Die Konzentration der beiden Transkriptionsfaktoren GATA-3 und Tbet kann prinzipiell mit verschiedenen Verfahren bestimmt werden. Im Sinne der vorliegenden Erfindung sind unter anderem:
- ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
CLIA (chemoluminescence-linked Immunosorbent assay)
FLIA (fluorescence-linked Immunosorbent assay)
Massenspektrometrische Verfahren
- Chromatographische Verfahren (z.B. Gaschromatographie)
- Flüssigkeitsbasierende Verfahren mit Festphasentrennung (z.B. HPLC)
Mikro- und Nanofluidische Verfahren Die Fig. 2a und Fig. 2b zeigen Ergebnisse einer Quantifizierung von Tbet und GATA-3 mittels chromogenem Sandwich-ELISA. Die Zellen wurden durch Ficoll-Dichtegradienten- Zentrifugation aus Vollblut gewonnen. Die Zellen (stimulierte humane mononukleäre Zellen) wurden mit einem Ripa-Puffer lysiert. Das Lysat wurde mit zwei ELISA- Prototypverfahren hinsichtlich der Konzentration von GATA-3 und Tbet untersucht. Die Konzentration der beiden Proteine wurde in Bezug zur Gesamt-Proteinkonzentration der Zelllysate dargestellt (Normierung auf Proteingehalt). Die Ergebnisse gemäß Fig. 2a zeigen, dass Th1 -Zellen einen höheren Gehalt an Tbet (ca. 160 ng/ml Analyt/mg Protein) haben als Th2-Zellen (ca. 56 ng/ml Analyt/mg Protein) und sich dieser Umstand eindeutig aus dem Ergebnis des ELISA-Tests ablesen lässt:
Figure imgf000028_0001
Der Tbet-Gehalt in den Th1 -Zellen ist also hier mehr als zweifach, nämlich etwa um den Faktor drei, höher als in Th2-Zellen. Gemäß Fig. 2b ist der Gehalt an GATA-3 in Th2-Zellen (ca. 10 ng/ml Analyt/mg Protein) höher ist als in Th1 -Zellen (ca. 6 ng/ml Analyt/mg Protein). Der GATA-3-Gehalt ist in den Th2-Zellen also hier mehr als 1 ,5-fach - nämlich etwa um den Faktor 1 ,7 - höher als in Th1 -Zellen.
Weiterhin kann man hier aus den Fig. 2a und 2b erkennen, dass sich bei Normierung auf den Proteingehalt das Mengenverhältnis von Tbet : GATA-3 in Th1 -Zellen wesentlich von dem entsprechenden Verhältnis in Th2-Zellen unterscheidet. So beträgt das Mengenverhältnis von Tbet : GATA-3 hier in Th1 -Zellen etwa 27, also mehr als 20, wohingegen das entsprechende Mengenverhältnis in Th2-Zellen ca. 6 beträgt, also weniger als 10.
Die quantitative Bestimmung von GATA-3 und Tbet erfolgt jeweils mittels eines Sandwich- ELISA (Enzyme-Iinked Immuno Sorbent Assay).
Ausführungsbeispiel 2 - GATA-3 ELISA:
Die wells einer 96 well Mikrotiterplatte sind dazu mit spezifischen Antikörpern gegen GATA-3 beschichtet. Nach Zugabe der Probe bzw. eines Standards bindet GATA-3 an die Antikörper auf der 96-well Platte. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen erfolgt die Zugabe eines zweiten, spezifischen biotinylierten Antikörpers gegen GATA-3. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen wird Peroxidase-markiertes Streptavidin zugegeben. Nach einem letzten Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen wird Substrat zugegeben. Die Farbentwicklung wird nach einer definierten Zeit durch Zugabe einer Stopplösung beendet. Die Intensität der Farbentwicklung wird durch ein Mikrotiter- Plattenlesegerät quantifiziert. Die Quantifizierung der Proben erfolgt durch einen Vergleich mit den mitgeführten Standards bekannter Proteinkonzentration. Figur 3 zeigt eine entsprechende Standardkurve eines GATA-3 ELISAS.
Nach dem Ausführungsbeispiel für die Durchführung des GATA-3 ELISA betreffen die Schritte im Einzelnen:
Anzahl der benötigten wells in einen Rahmen der 96-well Platte einsetzen
Zugabe von 50 μΙ/well Assay Buffer
Zugabe von 100 μΙ/well Standard / Kontrolle /Probe Inkubation für 60 Minuten auf dem Schüttler
Alle wells 4 x mit je 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
Zugabe von 100 μΙ/well biotinyliertem anti-GATA-3 Antikörper
Inkubation für 60 Minuten auf dem Schüttler
- Alle wells 4 x mit 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
- Zugabe von 10Ομ/well Peroxidase-markiertem Streptavidin
Inkubation für 30 Minuten auf dem Schüttler
Alle wells 4 x mit 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
- Zugabe von 100 μΙ/well Substrat
- Inkubation für 30 Minuten
- Stopp der Reaktion durch Zugabe von 100 μΙ Stopplösung
Messung der Optischen Dichte bei 450 nm mit einem Mikrotiter-Plattenlesegerät
Ausführungsbeispiel 3 - Tbet ELISA:
Der Nachweis des Tbet Proteins wird nach folgendem Testprinzip ausgeführt: Die quantitative Bestimmung von Tbet erfolgt mittels eines Sandwich-ELISA (Enzyme-Iinked Immuno Sorbent Assay). Die wells einer 96 well Mikrotiterplatte werden dazu mit spezifischen Antikörpern gegen Tbet beschichtet. Nach Zugabe der Probe bzw. des Standards bindet Tbet an die Antikörper auf der 96-well Platte. Nach einem Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen erfolgt die Zugabe eines zweiten spezifischen Antikörpers gegen Tbet. Nach einem weiteren Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen wird ein Peroxidase-markierter Antikörper gegen den Tbet-spezifischen Antikörper zugegeben. Nach einem letzten Waschschritt zur Entfernung der nicht gebundenen Substanzen wird Substrat zugegeben. Die Farbentwicklung wird nach einer definierten Zeit durch Zugabe einer Stopplösung beendet. Die Intensität der Farbentwicklung wird durch ein Mikrotiter-Plattenlesegerät quantifiziert. Die Quantifizierung der Proben erfolgt durch einen Vergleich mit den mitgeführten Standards bekannter Proteinkonzentration. Figur 4 zeigt eine entsprechende Standardkurve eines Tbet ELISAS.
Nach einem Ausführungsbeispiel für die Durchführung des Tbet ELISA betreffen die Schritte im Einzelnen:
Anzahl der benötigten wells in einen Rahmen der 96-well Platte einsetzen
- Zugabe von 50 μΙ/well Assay Buffer
- Zugabe von 100 μΙ/well Standard / Kontrolle /Probe Inkubation für 60 Minuten auf dem Schüttler
Alle wells 4 x mit je 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
- Zugabe von 100 μΙ/well anti-Tbet Antikörper
Inkubation für 60 Minuten auf dem Schüttler
- Alle wells 4 x mit 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
- Zugabe von Ι ΟΟμ/well Peroxidase-markiertem anti-Tbet-spezifischer Antiköper Inkubation für 30 Minuten auf dem Schüttler
Alle wells 4 x mit 400 μΙ/well Waschpuffer waschen
- Zugabe von 100 μΙ/well Substrat
- Inkubation für 30 Minuten
- Stopp der Reaktion durch Zugabe von 100 μΙ Stopplösung
Messung der Optischen Dichte bei 450 nm mit einem Mikrotiter-Plattenlesegerät
Normierung der Konzentrationen von GATA-3 und Tbet
Um Unterschiede in der Probenvorbereitung zu berücksichtigen, kann eine Normierung der Konzentrationen von GATA-3 und Tbet durchgeführt werden. Unterschiede in der Probenvorbereitung können z.B. entstehen durch:
unterschiedliche Zellzahlen, die lysiert werden
unterschiedliche Lyseeffizienzen der einzelnen Proben oder
unterschiedlichen Gehalt an den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Zellpräparationen.
Möglichkeiten der Normierung sind erfindungsgemäß unter anderem:
Normierung auf den Gesamt-Proteingehalt des Zelllysates (siehe unter „Messung der Konzentration von GATA-3 und Tbet")
Normierung auf die Zellzahl, die lysiert wurde (siehe Fig. 5) oder
- Normierung auf die Konzentration spezifischer Markerproteine, die spezifisch in bestimmten Zelltypen gefunden werden.
Fig. 5. zeigt eine normierte Bestimmung von Tbet in Lysaten humaner peripherer mononukleärer Zellen (PBMC). Dabei erfolgte eine Lyse von PBMCs von gesunden Probanden und an allergischen Erkrankungen leidenden Patienten, wie z.B. allergisches Asthma Bronchiale, Rhinokonjunktivitis, allergische Sinusitis, atopische Dermatitis, Nahrungsmittelallergien. Die Konzentration von Tbet wurde auf die Zellzahl in den Lysaten normiert. Die Erkrankung ist Th2 Zellen abhängig und folgerichtig konnte bei den Allergikern eine geringere Konzentration an Tbet (ca. 12 ng/ml/1 Mio Zellen) im Vergleich zu gesunden Probenden (ca. 27 ng/ml/1 Mio Zellen) ermittelt werden. Die Tbet Konzentration war somit beim Allergiker etwas mehr als um den Faktor 2 im Vergleich zu einem gesunden Probanden vermindert. Eine Zuordnung der Patienten zum molekularen Phänotyp „Th1 -low" ist hier somit einfach möglich, da die Tbet Genexpression im biologischen Isolat niedriger ist als ein definierter Referenzwert, hier die Tbet Genexpression von gesunden Probenden.
Ausführungsbeispiel 4
In Abwandlung von Beispiel 2 und 3 wird nach Beispiel 4 zur Probenvorbereitung Th1 /Th2 Zellen mittels magnetischer beads, die mit zellspezifischen Antikörpern beschichtet sind, angereichert. Anschließend erfolgte der Nachweis von GATA-3 gemäß der Vorschrift nach Beispiel 2.
Ausführungsbeispiel 5 In Abwandlung von Beispiel 2 und 3 werden nach Beispiel 4 zur Probenvorbereitung Leukozyten mittels Größenausschluss-Filtration angereichert. Anschließend erfolgte der Nachweis von GATA-3 gemäß der Vorschrift nach Beispiel 2.
Ausführungsbeispiel 6
Ein GATA-3-spezifisches DNAzym zeigt therapeutische Effekte im Mausmodell der OVA- induzierten allergischen Atemwegsentzündung vom„Th2-high"-Phänotyp.
Um den klinischen Phänotyp„Th2 high" bestmöglich im Mausmodell abzubilden, wurden BALB/c-Mäuse mit dem Modellallergen Ovalbumin (OVA) in Gegenwart des Adjuvanz AI(OH)3 an den Tagen 0, 14 und 21 durch intraperitoneale Injektion sensibilisiert. An den Tagen 24-26 inhalierten die Mäuse ein 1 %iges OVA-Aerosol, um eine Th2-dominierte allergische Entzündungsreaktion in der Lunge hervorzurufen. An den Tagen 23-26 wurde das GATA-3-spezifische DNAzym hgd40 (SEQ ID NO 40), gelöst in PBS, intranasal appliziert. Dabei ist der Balb/c-Mausstamm dadurch charakterisiert, dass er präferentiell starke Th2- Antworten generiert. Dies wird verstärkt durch die Verwendung von AL(OH)3 als Adjuvanz, dass die Ausbildung Th2-domierter Immunantworten deutlich unterstützt. Das beschriebene Mausmodell ist entsprechend gekennzeichnet durch eine massive Infiltration von Eosinophilen und Th2-Zellen in die Atemwege einhergehend mit einer Hyperplasie der mukusbildenden Goblet-Zellen mit verstärkter Mukusproduktion sowie Ausbildung einer Atemwegshyperreagibilität. Immunologisch sind neben allergenspezifischen Th2-Zellen, charakterisiert durch die Produktion der typischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-13, auch OVA-spezifische Antikörper der Immunglobulinklassen IgE und lgG1 (in der Maus beide Th2-abhängig) feststellbar. Alle diese Parameter sind typische klinische Merkmale eines „Th2-high" Phänotyps (Wenzel et al., Am J Respir Crit Care Med. 1999 Sep; 160(3):1001 -8; Woodruff et al., 2009). Dabei ist die Reaktionsstärke hinsichtlich einiger Parameter im Tiermodell sogar noch deutlich stärker ausgeprägt als in der klinischen Situation beim humanen Patienten, so stellen z.B. eosinophile Granulozyten ca. 60-70 % aller Leukozyten in der bronchoalveolären Lavage (BAL) im Mausmodell dar, während bereits 3-5% dieser Zellen im Sputum von Patienten auf einen Th2-dominierten Phänotyp hinweisen.
Gemäß Fig. 6 konnte nach viertägiger Behandlung mit dem GATA-3-spezifischen DNAzym hgd40 (SEQ ID NO 40) im Vergleich zu unbehandelten Mäusen eine signifikante Verbesserung der allergischen Atemwegsentzündung festgestellt werden. Vor allem die Anzahl von Eosinophilen in der BAL wurde erheblich reduziert. Desweiteren konnten die BAL-Konzentrationen der für den Phänotyp„Th2 high" charakteristischen Zytokine IL-5 und IL-13 deutlich reduziert werden.
Ausführungsbeispiel 7
Ein GATA-3-spezifisches DNAzym zeigt signifikante therapeutische Effekte im chronischen Mausmodelleiner Th2-dominierten allergischen Atemwegsentzündung
Um den klinischen Phänotyp „Th2 high" bestmöglich auch in einem chronischen Mausmodell abzubilden, wurden BALB/c-Mäuse mit Ovalbumin (OVA) in Gegenwart des Adjuvanz AI(OH)3 an den Tagen 0, 14 und 21 durch intraperitoneale Injektion sensibilisiert. Mittels zweimal wöchentlicher OVA-Aerosol-Provokationen über einen Zeitraum von 14 Wochen wurde in den Mäusen eine chronische Entzündung der Atemwege hervorgerufen. Während der letzten acht Wochen wurde entweder mit Budesonid oder dem GATA-3-spezifischem DNAzym hdg40 durch intranasale Applikation dreimal pro Woche therapiert (bis Tag 121 ).
Gemäß Fig. 7 und 8 konnte nach achtwöchiger Behandlung mit dem GATA-3- spezifischen DNAzym hgd40 (SEQ ID NO 40) die Anzahl der Eosinophilen in der BAL signifikant reduziert werden und zudem eine Reduzierung der Anzahl der in der chronischen Entzündung auftretenden Neutrophilen festgestellt werden. Einhergehend damit wurden im Lungengewebe eine verminderte peribronchiale/perivaskuläre Inflammation und reduzierte Goblet-zell Hyperplasie festgestellt. Gleichzeitig wurden in restimulierten Lymphzyten der mit hgd40 Behandelten eine verminderte Freisetzung von IL-5 beobachtet. In der Budesonid-Gruppe hingegen konnte keine signifikante Verbesserung der Parameter festgestellt werden.
Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar.
Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten, wobei der molekulare Phänotyp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Untergruppen „Th2 high", „Th2 low", „Th1 high" und „Th1 low" und die Genexpression von GATA-3 und/oder Tbet in einem biologischen Isolat des Patienten gemessen und für die Zuordnung zu einem molekularen Phänotyp der Erkrankung genutzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
das Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet über die Proteinmenge bestimmt wird, wobei die Protein-Menge insbesondere mit Hilfe eines Immunassays, vorzugsweise eines ELISA-Tests, eines Radioimmunassays, eines Elektrochemilumineszenz-Immunassays, eines CLIA (chemoluminescence-linked Immunosorbent assay), eines FLIA (fluorescence-linked Immunosorbent assay) oder eines Multiplex-Assays, quantitativ bestimmt wird; und/oder
- das Expressionsniveau von GATA-3 und/oder Tbet über die mRNA-Menge bestimmt wird, wobei die mRNA-Menge insbesondere mit Hilfe einer PCR oder eines Micro-Array-Chips quantitativ bestimmt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe
„Th2 high" erfolgt, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist: a) die GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th2 low" erfolgt, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert, b) das Verhältnis von GATA-3 : Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 high" erfolgt, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist: a) die Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist höher als ein definierter Referenzwert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zuordnung des Patienten zu einem molekularen Phänotyp der Untergruppe „Th1 low" erfolgt, wenn mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt ist:
a) die Tbet Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert,
b) das Verhältnis von Tbet : GATA-3 Genexpression im biologischen Isolat ist niedriger als ein definierter Referenzwert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung der Genexpression von GATA-3 und/oder Tbet eine Bestimmung des Serum-lgE-Spiegels und/oder der Zahl der eosinophilen Granulocyten erfolgt und/oder der FeNo-Wert ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die mit chronischen Entzündungen einhergehende Erkrankung Th2-bedingt, insbesondere allergisches Asthma Bronchiale, Rhinokonjunktivitis, allergische Sinusitis, atopische Dermatitis, Nahrungsmittelallergien, Pemphigus, Ulcerative Colitis, parasitäre Erkrankungen, oder Th1 -bedingt, insbesondere Psoriasis, allergisches Kontaktekzem, Morbus Crohn, COPD, Rheumatoide Arthritis, Autoimmunerkrankungen, Typ 1 Diabetes mellitus oder MS, ist.
9. Arzneimittel zur Behandlung eines an einer Erkrankung, die mit chronischen Entzündungen einhergeht, leidenden humanen Patienten mit einem molekularen Phänotyp, wobei der molekulare Phänotyp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Untergruppen„Th2 high",„Th2 low",„Th1 high" und„Th1 low" und gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 ermittelt wurde.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass ein für GATA-3 oder Tbet spezifisches DNAzym enthalten ist.
1 1 . Arzneimittel nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel mit einem GATA-3 spezifischen DNAzym für die Behandlung eines Patienten mit molekularem Phänotyp der Untergruppe „Th2 high" vorgesehen ist oder das Arzneimittel mit einem Tbet spezifischen DNAzym für die Behandlung eines Patienten mit molekularem Phänotyp der Untergruppe„Th1 high" vorgesehen ist.
12. Arzneimittel nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel eine multiple Emulsion umfasst, welche eine äußere Wasserphase W1 , eine in der äu ßeren Wasserphase W1 dispergierte Ölphase O und eine in der Ölphase O dispergierte innere Wasserphase W2 aufweist, wobei in der inneren Wasserphase W2 wenigstens ein Elektrolyt ausgewählt aus der Gruppe der Alkali- und Erdalkalihalogenide und -sulfate und wenigstens ein für GATA-3 oder Tbet spezifisches DNAzym vorgesehen ist, wobei die äußere Wasserphase W1 einen hydrophilen Emulgator enthält, der ein Polymer von Ethylenoxid und Propylenoxid ist, und die Ölphase O von Triacylglyceriden gebildet ist und einen lipophilen Emulgator aus der Gruppe der Dimethicone aufweist.
13. Kit zur Diagnose eines molekularen Phänotyps eines an einer mit chronischen Entzündungen einhergehenden Erkrankung leidenden humanen Patienten, wobei das Kit mindestens eine spezifische Komponente zur quantitativen Bestimmung der Protein- und/oder mRNA-Menge von GATA-3 und/oder Tbet in einem biologischen
Isolat des Patienten gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
14. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass für die quantitative Bestimmung der Protein-Menge ein jeweils spezifischer Antikörper gegen GATA-3 und/oder Tbet enthalten ist, wobei vorzugsweise Komponenten zur Ausführung eines Immunassays, insbesondere eines ELISAS, enthalten sind.
15. Kit nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass für die quantitative Bestimmung der mRNA-Menge eine sequenzspezifische Sonde und/oder ein sequenzspezifischer Primer für GATA-3 und/oder Tbet Gene enthalten ist/sind.
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BR112015005583A BR112015005583A2 (pt) 2012-09-14 2013-09-04 método para o diagnóstico de um fenótipo molecular de um paciente que sofre de uma doença associada à inflamação crônica
RU2015112894A RU2672595C2 (ru) 2012-09-14 2013-09-04 Способ диагностики молекулярного фенотипа пациента, страдающего заболеванием, сопровождающимся хроническими воспалениями
AU2013314510A AU2013314510A1 (en) 2012-09-14 2013-09-04 Method for diagnosing a molecular phenotype of a patient suffering from an illness accompanied by chronic inflammation
KR1020157009484A KR102157768B1 (ko) 2012-09-14 2013-09-04 만성 염증을 동반하는 질병을 앓는 환자의 분자 표현형의 진단 방법
CA2888860A CA2888860C (en) 2012-09-14 2013-09-04 Method for diagnosing a molecular phenotype of a patient suffering from an illness accompanied by chronic inflammation
US15/782,595 US10591489B2 (en) 2012-09-14 2017-10-12 Method for diagnosing a molecular phenotype of a patient suffering from an illness accompanied by chronic inflammation
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3093022A1 (de) 2015-05-15 2016-11-16 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Gata-3-inhibitoren zur behandlung von th2-bewirktem asthma
WO2017205506A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Emory University Particles with rna cleaving nucleobase polymers and uses for managing inflammatory disorders
EP3514235A1 (de) * 2018-01-18 2019-07-24 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Zusammensetzung zur behandlung eines an colitis ulcerosa leidenden patienten sowie verwendung der zusammensetzung als arzneimittel

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3501607A1 (de) * 2017-12-22 2019-06-26 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Zusammensetzung zur behandlung eines an einer mit chronischen entzündungen einhergehenden atemwegserkrankung leidenden patienten sowie herstellungsverfahren und verwendung der zusammensetzung
EP3603617A1 (de) * 2018-07-30 2020-02-05 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Aerosolerzeugungseinrichtung zur inhalativen verabreichung einer antisense-molekül-haltigen zusammensetzung

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033314A2 (de) 2003-10-02 2005-04-14 Philipps-Universität Marburg Verfahren zur herstellung eines zell- und/oder gewebe- und/oder krankheitsphasen-spezifischen arzneimittels
WO2009124090A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8853264B2 (en) * 2005-01-07 2014-10-07 Newtree Industry Co., Ltd. Use of lignan compounds for treating or preventing inflammatory disease
US8258150B2 (en) 2006-08-17 2012-09-04 The University Of Chicago Treatment of inflammatory diseases
EP2227232A1 (de) * 2007-12-07 2010-09-15 Fibrogen, Inc. Verfahren zur unterdrückung der differenzierung von t-helfer-zellen
US20120029054A1 (en) * 2009-03-19 2012-02-02 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA Interference Mediated Inhibition of GATA Binding Protein 3 (GATA3) Gene Expression Using Short Intefering Nucleic Acid (siNA)
CN102482667B (zh) * 2009-07-29 2014-04-23 希森美康株式会社 人的产生il-17的辅助性t细胞的检测用标记物及试剂、以及人的产生il-17的辅助性t细胞的检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033314A2 (de) 2003-10-02 2005-04-14 Philipps-Universität Marburg Verfahren zur herstellung eines zell- und/oder gewebe- und/oder krankheitsphasen-spezifischen arzneimittels
WO2009124090A1 (en) 2008-03-31 2009-10-08 Genentech, Inc. Compositions and methods for treating and diagnosing asthma

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUSUBEL ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1998, JOHN WILEY & SONS
CORREN ET AL.: "Lebrikizumab Treatment in Adults with Asthma", THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, 2011
SAMBROOK; RUSSELL: "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
WENZEL ET AL., AM J RESPIR CRIT CARE MED., vol. 160, no. 3, September 1999 (1999-09-01), pages 1001 - 8
WOODRUFF ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 104, no. 40, 2007, pages 15858 - 63
WOODRUFF ET AL.: "T- helper Type 2-driven Inflammation Defines Major Subphenotypes of Asthma", AM J RESPIR CRIT CARE MED, vol. 180, 2009, pages 388 - 395

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3093022A1 (de) 2015-05-15 2016-11-16 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Gata-3-inhibitoren zur behandlung von th2-bewirktem asthma
WO2016184556A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Sterna Biologicals Gmbh & Co.Kg Gata-3 inhibitors for use in the treatment of th2-driven asthma
CN107771082A (zh) * 2015-05-15 2018-03-06 燕鸥生物制剂有限两合公司 用于治疗th2驱动型哮喘的gata‑3抑制剂
US10487325B2 (en) 2015-05-15 2019-11-26 Sterna Biologicals Gmbh & Co. Kg GATA-3 inhibitors for use in the treatment of Th2-driven asthma
RU2720988C2 (ru) * 2015-05-15 2020-05-15 ШТЕРНА БИОЛОГИКАЛС ГМБХ энд КО. КГ ИНГИБИТОРЫ GATA-3 ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ Th2-ИНДУЦИРОВАННОЙ АСТМЫ
AU2016264772B2 (en) * 2015-05-15 2021-09-09 Sterna Biologicals Gmbh GATA-3 inhibitors for use in the treatment of Th2-driven asthma
CN115137827A (zh) * 2015-05-15 2022-10-04 燕鸥生物制剂有限两合公司 Gata-3基于核酸的灭活剂在制备用于治疗患有th2驱动型哮喘的患者的药物中的用途
WO2017205506A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Emory University Particles with rna cleaving nucleobase polymers and uses for managing inflammatory disorders
EP3514235A1 (de) * 2018-01-18 2019-07-24 Sterna Biologicals GmbH & Co. KG Zusammensetzung zur behandlung eines an colitis ulcerosa leidenden patienten sowie verwendung der zusammensetzung als arzneimittel
WO2019141674A1 (de) * 2018-01-18 2019-07-25 Sterna Biologicals Gmbh & Co.Kg Zusammensetzung zur behandlung eines an colitis ulcerosa leidenden patienten sowie verwendung der zusammensetzung als arzneimittel

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