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WO2013162050A1 - ラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

ラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法 Download PDF

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WO2013162050A1
WO2013162050A1 PCT/JP2013/062685 JP2013062685W WO2013162050A1 WO 2013162050 A1 WO2013162050 A1 WO 2013162050A1 JP 2013062685 W JP2013062685 W JP 2013062685W WO 2013162050 A1 WO2013162050 A1 WO 2013162050A1
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WO
WIPO (PCT)
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fusion protein
hlf
lactoferrin
variant
hinge
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/062685
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English (en)
French (fr)
Inventor
佐藤敦
加賀谷伸治
Original Assignee
株式会社Ｎｒｌファーマ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to ES13780579.2T priority patent/ES2671631T3/es
Priority to CA2871468A priority patent/CA2871468C/en
Priority to JP2014512737A priority patent/JP5855239B2/ja
Priority to BR112014026162A priority patent/BR112014026162A2/pt
Priority to EP13780579.2A priority patent/EP2842969B1/en
Priority to CN201380021309.2A priority patent/CN104245739B/zh
Priority to US14/395,826 priority patent/US9809641B2/en
Publication of WO2013162050A1 publication Critical patent/WO2013162050A1/ja
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention relates to a lactoferrin fusion protein having improved properties, its use, a production method thereof, and the like.
  • Lactoferrin is a glycoprotein having a molecular weight of about 80,000, which is mainly present in mammalian milk and is also found in neutrophils, tears, saliva, nasal discharge, bile, semen and the like. Lactoferrin belongs to the transferrin family because it binds iron.
  • the physiological activities of lactoferrin include antibacterial action, iron metabolism regulation action, cell proliferation activation action, hematopoiesis action, anti-inflammatory action, antioxidant action, phagocytosis action, antiviral action, bifidobacteria growth promotion action, anticancer
  • the action, the cancer metastasis inhibitory action, the translocation inhibitory action, etc. are known.
  • lactoferrin has a lipid metabolism improving action, an analgesic / anti-stress action, and an anti-aging action.
  • lactoferrin is a multifunctional physiologically active protein that exhibits a variety of functions, and is expected to be used for uses such as pharmaceuticals and foods to restore or enhance health. It is already on the market.
  • Lactoferrin when taken orally, is hydrolyzed by pepsin, an acidic protease present in gastric juice, and is decomposed into peptides, so that lactoferrin molecules can hardly reach the intestinal tract.
  • the lactoferrin receptor exists in the small intestinal mucosa in the digestive tract, and it has recently been clarified that lactoferrin is taken into the body from the intestine and expresses biological activity. Therefore, in order to exert the biological activity of lactoferrin, it is important to allow lactoferrin to reach the intestine without being hydrolyzed by pepsin in the gastric juice.
  • IgG antibodies are known to have a long blood half-life because their degradation is suppressed by a recycling mechanism via a neonatal Fc receptor (hereinafter referred to as “FcRn”) in vivo.
  • FcRn neonatal Fc receptor
  • antibody drugs are considered to have fewer side effects than conventional synthetic compounds because their targets are limited to specific proteins, peptides, etc., and their mechanism of action is limited.
  • fusion proteins have a reduced biological activity compared to unfused proteins due to the active site being affected by the fusion.
  • TPOR-binding pseudopeptides are not inferior in the amount of TPOR binding compared to endogenous TPO, but tended to have slightly lower biological activity in in vitro tests.
  • the blood half-life of IFN- ⁇ is greatly increased, but the physiological activity of IFN- ⁇ is decreased. There is a drawback that it will. Therefore, the conditions for producing a fusion protein with desirable characteristics must be fully studied for each protein.
  • JP 2007-105044 A Japanese Patent No. 4234438 Special table 2011-523351 gazette Special table 2004-521655 gazette US Pat. No. 5,723,125
  • the present invention provides a lactoferrin fusion protein with high clinical usefulness, a method for producing the same, and the like that reduces antigenicity, imparts protease resistance, enables oral, tissue and organ administration, and prolongs the life span of the body. With the goal. Furthermore, the present invention provides a lactoferrin fusion protein that retains the biological activity of natural lactoferrin, has a significantly extended body life, and has a clinical utility superior to that of natural lactoferrin and recombinant lactoferrin, and a method for producing the same. With the goal.
  • the inventors of the present invention have made strenuous efforts to create a lactoferrin having a higher-order structure comparable to that of a natural product and maintaining a long half-life without sacrificing physiological activity.
  • the lactoferrin protein fused with the Fc region has a half-life of 5. It was found that the increase was significantly 4 times.
  • no change in the three-dimensional structure of lactoferrin itself due to fusion with the Fc region was observed in the fusion protein, and the three-dimensional structure was also at least 30 ° C. or higher in terms of thermal stability.
  • the result is quite unexpected that it is maintained at 65 ° C. or higher and the biological activity is not impaired at all. Further, the produced lactoferrin fusion protein has the resistance to protease and is most important. The present invention was completed by obtaining the result that the biologically active iron chelating ability was also preserved.
  • LF lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin
  • Y is a protein or peptide containing an FcRn-binding region
  • s is a sequence of 0 to 10 arbitrary amino acids
  • n is an integer of 1 to 10
  • [7] The fusion protein according to any one of [1] to [6], or a variant thereof, wherein the fusion protein has improved chymotrypsin resistance compared to natural or recombinant lactoferrin.
  • [8] A nucleic acid molecule encoding the fusion protein according to any one of [1] to [7] or a variant thereof;
  • An expression vector comprising the nucleic acid molecule according to [8]; [10] A host cell comprising the expression vector according to [9]; [11] A non-human transgenic animal comprising the nucleic acid molecule according to [8]; [12] A genetically modified plant comprising the nucleic acid molecule according to [8]; [13] A therapeutic agent for a disease ameliorated by lactoferrin, comprising the fusion protein according to any one of [1] to [7] or a variant thereof; [14] A pharmaceutical composition comprising the fusion protein according to any one of [1] to [7] or a variant thereof and a
  • the fusion protein of the present invention or a variant thereof retains the iron binding ability of lactoferrin, and therefore, at least the importance of lactoferrin based on the iron binding ability Biological activity is retained.
  • fusion protein since it has a long life in the body and has resistance to proteases, it can exhibit biological activity for a long time in the body.
  • the fusion protein makes it difficult to undergo digestive degradation by pepsin in the stomach, it can reach the intestine sufficiently without further pharmaceutical treatment for further enterolysis.
  • the fusion protein of the present invention is advantageous in terms of production control and quality control by being produced by gene recombination, and is particularly suitable for use as a pharmaceutical ingredient. That is, lactoferrin can be made more useful as a pharmaceutical ingredient by a fusion protein or the like and a method for producing the fusion protein or the like according to the present invention. Since lactoferrin is very safe and has various biological activities, the present invention can be applied more advantageously as a therapeutic or prophylactic agent for diseases or symptoms for which there is no effective therapeutic agent.
  • lifestyle diseases arteriosclerosis, hypercholesterolemia, hyperlipidemia, hypertension, diabetes, fatty liver, etc.
  • cancer carcinogenesis prevention, secondary prevention of cancer, suppression of metastasis, enhanced action of anticancer drugs, etc.
  • Autoimmune diseases dry eyes and dry mice caused by Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, malignant rheumatoid arthritis, collagen disease, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, systemic lupus erythematosus, etc.
  • neuropsychiatric disorders disementia, Alzheimer) Disease, Parkinson's disease, Tencan, depression, Hikikomori, schizophrenia, various stress diseases, climacteric disorders, etc.
  • pain relief morphine and other opioid enhancing effects, cancer pain, neuropathic pain, postherpetic pain, Fibromyalgia, postoperative pain, glossodynia, menstrual pain, toothache, joint pain, menopause, etc.
  • the fusion protein of the present invention or the pharmaceutical composition containing the same can be used for various infectious diseases and inflammation based thereon, for example, gastric mucosa of Helicobacter pylori Infection, periodontal disease, alveolar pus effusion, bad breath, oral candidiasis, stomatitis, stomatitis, rhinitis, esophagitis, cholecystitis, urinary tract infection, vaginal infection, athlete's foot, acne, herpes virus infection, elderly It can be applied to pneumonia, postoperative infections, etc., and has the effect of enhancing the action of antibiotics.
  • lactoferrin also has an effect of bringing about immune tolerance
  • the fusion protein of the present invention or the pharmaceutical composition containing the same is also applied to allergic diseases such as hay fever, atopic dermatitis, seborrhea and urticaria. Is possible.
  • lactoferrin has a strong antioxidative stress action based on iron chelating action
  • the fusion protein of the present invention or a pharmaceutical composition containing the same has anti-inflammatory properties such as Wilson's disease and fulminant hepatitis. It can also be applied to aging / rejuvenation, age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, mucosal epithelial cell keratinization suppression, and rejuvenation.
  • the fusion protein of the present invention is taken into a cell via at least one receptor selected from the group consisting of a lactoferrin receptor, an IgG receptor and an albumin receptor, it can be expected that side effects are low.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for preparing pBSIILfAL / Bam by inserting a synthetic oligonucleotide containing a BamHI site into a vector pBSIILfAL containing a full-length human lactoferrin (hLF) cDNA.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structure of a vector pTeuIgG having the human IgG1 Fc region hinge, CH2, and CH3 genomic sequences and the insertion of hLF cDNA into this vector.
  • FIG. 3 shows the structure of vector pmIgG having the CH2 and CH3 cDNA sequences of the human IgG1 Fc region and the insertion of hLF cDNA into this vector.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a method for preparing pBSIILfAL / Bam by inserting a synthetic oligonucleotide containing a BamHI site into a vector pBSIILf
  • FIG. 4 shows an outline of a method for preparing the vector pOpti-VEC-MCS by inserting the region from the T7 primer binding site to the T3 primer binding site of the vector pBluescript II (Stratagene) into the expression vector pOpti-VEC for DG44 cells.
  • FIG. FIG. 5 is a diagram showing an outline of a method for producing a hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) expression vector and a hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc) expression vector.
  • FIG. 6 is a view showing the expression level when the DG44 cells are induced to express the hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc).
  • FIG. 7 is a view showing the expression level when the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc is induced to induce expression in DG44 cells.
  • FIG. 8 shows the purification of hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc).
  • FIG. 9 shows the purification of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 10 is a diagram showing the concentration of hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) by ammonium sulfate precipitation.
  • FIG. 11 is a diagram showing the concentration of hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc by ammonium sulfate precipitation.
  • FIG. 12 shows the homology of the secondary structures of hLF, hinge-deficient and hinged hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel A represents the CD spectrum of hLF.
  • FIG. 12 shows the homology of the secondary structures of hLF, hinge-deficient and hinged hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel B represents the CD spectrum of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 12 shows the homology of the secondary structures of hLF, hinge-deficient and hinged hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel C represents the CD spectrum of the hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc).
  • FIG. 13 is a diagram showing the thermal stability of hLF, hinge-deficient and hinged hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel A represents the CD spectrum of hLF.
  • FIG. 13 is a diagram showing the thermal stability of hLF, hinge-deficient and hinged hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel B represents the CD spectrum of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 13 is a diagram showing the thermal stability of hLF, hinge-deficient and hinge-added hLF / hIgGFc fusion proteins.
  • Panel C represents the CD spectrum of the hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc).
  • FIG. 14 is a diagram showing degradation of a hinged hLF / hIgGFc fusion protein.
  • FIG. 15-A is a diagram showing a degradation product of a hinged hLF / hIgGFc fusion protein after 3 weeks at 37 ° C.
  • FIG. 15-B is a schematic diagram of a hinge-added hLF / hIgGFc fusion protein and a diagram illustrating its degradation site.
  • FIG. 16 is a diagram showing the blood stability of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 17-A shows the amino acid sequence of the human lactoferrin (hLF) / human IgG Fc fusion protein encoded by the expression vector pOptiVEC / hLF-dFc (SEQ ID NO: 5 in the sequence listing).
  • Double lines indicate spacer amino acids, italics indicate amino acids in the hinge region, underlined bold characters indicate amino acids of the CH2 domain, and bold characters indicate amino acid sequences of the CH3 domain.
  • FIG. 17-B shows the amino acid sequence of the hLF / hIgGFc fusion protein encoded by the expression vector pOptiVEC / hLF-mFc (SEQ ID NO: 6 in the sequence listing). Double lines represent spacer amino acids, underlined bold letters represent CH2 domain amino acids, and bold letters represent CH3 domain amino acid sequences.
  • FIG. 18 shows the stability of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc in serum solution.
  • FIG. 19 shows uptake of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc into small intestinal epithelial cells.
  • FIG. 20 is an electrophoresis photograph showing the resistance to chymotrypsin of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 21 is a diagram showing chymotrypsin resistance of the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc.
  • FIG. 22 shows that the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc forms a homodimer in solution.
  • the fusion protein of the present invention is a biologically active fusion protein of a protein or peptide containing an FcRn binding region and lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin.
  • the protein or peptide to be bound to lactoferrin or a lactoferrin biologically active fragment or peptide in the fusion protein of the present invention is generally a protein or peptide containing a sequence known to bind to FcRn and is suitable for living organisms. It may be possible or pharmacologically inactive.
  • blood component proteins IgG or albumin are known to bind to FcRn.
  • IgG immunoglobulin G
  • IgG heavy chain Fc region in IgG heavy chain
  • Fc region in IgG heavy chain examples include regions including the Fc region CH2 domain and CH3 domain, CH2 domain, albumin, and FcRn binding region of albumin.
  • the amino acid sequences of these proteins and peptides are known, and when used in the present invention, they may be the same as natural sequences or may have mutations.
  • the protein or peptide containing the FcRn binding region used in the present invention is less likely to be degraded from a state fused with lactoferrin.
  • the hinge region forms a disulfide bond to form a dimeric fusion protein, but the hinge region is highly sensitive to proteases. Or those in which the cysteine in the hinge region is substituted with another amino acid or the cysteine position is changed.
  • protease resistance may be increased by a sugar chain by replacing with a hinge region derived from another isotype including a glycosylation site (Patent Document 2), and these are also included in a protein or peptide containing an FcRn binding region. .
  • Patent Document 2 a method of producing a hinge-deficient fusion protein by deleting the hinge region is preferable.
  • this fusion protein does not have a hinge region, binding to the Fc ⁇ receptor involved in the effector function and complement may be reduced, cell damage via the effector function leading to side effects, and elimination of the fusion protein from the blood
  • the activation of the immune response via the effector function leading to is reduced, which is advantageous compared to those having a hinge region (such as a hinge-added fusion protein).
  • Such a protein or peptide containing an FcRn binding region may contain other sequences in addition to the FcRn binding region.
  • a sequence containing a J chain forming a multimer such as IgA or IgM is added. By doing so, the polymer can be further multimerized.
  • lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin used in the fusion protein or the like of the present invention is a recombinant type (including a modified type in which some amino acids are substituted) lactoferrin, It does not matter whether the species from which the sequence is derived, the presence or absence of modification, and the like.
  • lactoferrin may have the same amino acid sequence as natural lactoferrin obtained from humans and various animals (bovine, horse, pig, sheep, goat, camel, etc.) As long as it has activity, some amino acids may be deleted, added or substituted.
  • Biological (activity) regarding the fusion protein of the present invention means the physiological pharmacological activity of lactoferrin unless otherwise specified.
  • the fusion protein of the present invention has an iron chelate (binding) ability equivalent to that of natural lactoferrin (or recombinant lactoferrin having a sequence equivalent to that of nature).
  • the fusion protein of the present invention is , At least 50% or more (for example, about 50% to about 150% or about 50% to about 120%) of iron binding ability, and in a preferred embodiment, the fusion protein of the present invention contains natural lactoferrin (or About 70% to about 100% or more (for example, about 70% to about 150% or about 70% to about 120%), or more than about 90% of recombinant lactoferrin having a sequence equivalent to nature It has iron binding ability.
  • the iron binding capacity may have an error of about ⁇ 20% when measured by the method described in the examples or a method equivalent thereto.
  • the fusion protein of the present invention may further contain an additional amino acid sequence and / or a sugar chain. Between the protein or peptide containing the FcRn-binding region and lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin, any amino acid sequence having an appropriate length as a spacer sequence can be contained.
  • the spacer sequence (s) can be, for example, an arbitrary amino acid sequence of 0 to 10, or 0 to 5.
  • Other additional sequences may provide steric advantages such as spacer sequences, and may have some function as fusion proteins, such as signal peptides and tag sequences used for purification. Those having these may be referred to as variants.
  • the fusion protein of the present invention can be produced by gene recombination.
  • a lactoferrin gene having a desired amino acid sequence and a protein or peptide gene containing an FcRn binding region are linked by a conventional method to construct an expression vector containing other elements necessary for expression in a desired host cell, This vector can be introduced into a host cell to express the fusion protein, and the expressed fusion protein can be recovered from the cell or medium.
  • the nucleic acid molecule encoding the fusion protein or the like of the present invention can be designed and produced by a known sequence and standard gene manipulation techniques. Genes encoding proteins containing lactoferrin and FcRn binding regions can be cloned from a variety of commonly available genomic or cDNA libraries using known nucleic acid or amino acid sequence-based probes, or polymerase chain reaction (PCR) It can be obtained by synthesis by the method. Desired modifications or mutations may be introduced into these genes.
  • a vector for expressing the fusion protein of the present invention comprises a sequence encoding lactoferrin or a biologically active fragment or peptide of lactoferrin and a protein or peptide including an FcRn binding region (or a protein or peptide including an FcRn binding region)
  • an operably linked state such as a transcriptional promoter, a secretion signal peptide sequence, a transcription terminator, a poly A signal, etc.
  • vectors can be used to transform host cells according to various known techniques.
  • the fusion protein of the present invention can be produced in these animals and plants by producing genetically modified plants and genetically modified animals.
  • the fusion protein of the present invention can be secreted into milk by incorporating a nucleic acid molecule encoding the fusion protein of the present invention into the genome of a non-human animal such as sheep or goat.
  • the useful plant which produces the fusion protein of this invention etc. by incorporating in a plant can also be manufactured (for example, Japanese translations of PCT publication No. 2004-528022).
  • the fusion protein or the like of the present invention can be appropriately used from a host cell medium transformed with the expression vector of the present invention using various chromatographic techniques such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration, ion exchange chromatography, and affinity chromatography. It can be isolated and purified. Particularly preferred purification methods include ion exchange chromatography.
  • Lactoferrin is antibacterial, iron metabolism regulating, cell proliferation activating, hematopoietic, anti-inflammatory, antioxidant, phagocytic, antiviral, bifidobacteria growth promoting, anticancer, cancer It has a wide range of physiological activities including metastasis-inhibiting action, translocation-inhibiting action, lipid metabolism improving action, analgesic action, anti-stress action, etc., and by these actions, lifestyle-related diseases (for example, hypercholesterolemia, Including lipemia), pain management (cancer pain, neuropathic pain, etc.), collagen disease (dry eye and dry mouse due to Sjogren's syndrome, rheumatoid arthritis, etc.), periodontal disease, hepatitis C, etc. Many diseases or conditions can be treated (including ameliorated) and prevented.
  • lifestyle-related diseases for example, hypercholesterolemia, Including lipemia
  • pain management cancer pain, neuropathic pain, etc.
  • collagen disease dry eye and dry mouse
  • the fusion protein of the present invention sufficiently retains the biological activity of lactoferrin, it can be administered alone or in combination with other drugs as a preventive or therapeutic agent for diseases in which lactoferrin is effective.
  • the fusion protein of the present invention is made into a pharmaceutical composition of a desired dosage form by blending various carriers known in the field of pharmaceutics, therapeutically inert bases and / or additives. Can do.
  • the term “medicament or pharmaceutical composition” in the context of the present invention includes not only humans but also animals (ie, veterinary medicine, etc.).
  • Various components and dosage forms that can be contained in such a pharmaceutical composition are well known to those skilled in the art.
  • the effective dose of the therapeutic agent or pharmaceutical composition containing the fusion protein or the like of the present invention varies depending on the type or degree of the disease or symptom to be treated or prevented, the condition of the administration subject, the dosage form, the administration route, etc. It can be appropriately selected based on the amount of lactoferrin. In general, the dose can be significantly lower than the known effective lactoferrin amount (for example, 1/2 to 1/20 amount in terms of lactoferrin amount), and if used at an equivalent dose, the number of administrations can be reduced. Is possible.
  • Example 1 Preparation of the fusion protein of human lactoferrin (hLF) and human IgGFc region including the hinge region and bioactivity evaluation 1.
  • Cloning of Human Lactoferrin (hLF) Gene Human lactoferrin (hLF) cDNA was obtained from a human cDNA library (trade name “Human Leukocyte Marathon-Ready cDNA”, Clontech) by the PCR method.
  • S_LFex_XhoI_ATG (SEQ ID NO : 1; 5′- CTCGAG ATGAAACTTGTCCTTCCTCGTC (introduced underlined XhoI site upstream of the start codon ATG) as a forward primer
  • AS_LFex_TAA_XbaI (SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 2; 5 ′ ) HLF cDNA was amplified using TTACTTCCTGAGGATATTCAC (introducing the underlined XbaI site downstream of the stop codon TAA) and using “KOD-plus” (trade name, Toyobo Co., Ltd.) as the DNA synthase.
  • A was added to the obtained DNA fragment and cloned into a “TOPO TA cloning vector” (trade name, Invitrogen). Thereafter, the vector was digested with XhoI and XbaI to excise the DNA fragment of hLF cDNA and cloned into the vector “pBluescript II” (trade name, Stratagene) previously digested with XhoI and XbaI. This vector was named “pBSIILfAL”. The nucleotide sequence of hLF cDNA was confirmed by dideoxy sequencing.
  • pBSIILfAL In pBSIILfAL, the full length of the hLF gene has been cloned in such a way that it is sandwiched between the XhoI and XbaI restriction enzyme sites of the vector.
  • the structure of pBSIILfAL is shown in FIG. 1 (left figure).
  • a vector pBSIILfAL / Bam in which a BamHI site was introduced between EcoRI and XbaI present at the 3 ′ terminal side of the hLF gene was prepared.
  • This sample solution was heated to 70 ° C. and then slowly cooled to room temperature to be annealed to form double-stranded DNA (annealing oligo).
  • PBSIILfAL (10 ng / ⁇ l) completely digested with EcoRI and XbaI was prepared, and the reagents shown in Table 2 below were mixed and ligated at 16 ° C. for 30 minutes.
  • This ligation solution (5 ⁇ l) and competent cell TOP10 (50 ⁇ l) were mixed and incubated on ice for 30 minutes. Thereafter, the competent cell was subjected to heat shock at 42 ° C. for 40 seconds, allowed to stand on ice for 2 minutes, then added with 100 ⁇ l of SOC medium, and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The sample incubated for 1 hour was seeded on an LB agar medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. overnight. The next day, the obtained colonies were cultured overnight in 1.5 ml of LB liquid medium (containing 100 ⁇ g / ml ampicillin) at 37 ° C. and 200 rpm with shaking.
  • LB liquid medium containing 100 ⁇ g / ml ampicillin
  • Plasmid DNA extraction was performed using “QIAprep Spin Miniprep Kit” (trade name, QIAGEN). The ligation between the annealing oligo and pBSIILfAL was confirmed by decoding the nucleotide sequence near the annealing oligo. The produced vector was named pBSIILfAL / Bam (FIG. 1, right).
  • hLF / hIgGFc fusion protein expression vector containing hinge region 2-1 Construction of pTeuIgG / hLF Two fusion proteins (hLF / hIgGFc) of hLF and human IgGFc (hIgGFc) are disulfide (s-s) bonded in the hinge region.
  • An expression vector for expressing a fusion protein with a quantified structure (sometimes referred to as hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc)) in animal cells was constructed.
  • pTeuIgG pTeuIgG / hLF.
  • the expression vector was prepared according to the method described above. PTeuIgG was constructed by introducing genomic DNA sequences corresponding to the hinge, CH2, and CH3 regions of human IgG1 downstream of SR ⁇ , which is a strong expression promoter (Sato, A. et al., Biochem. J. 371). 603-608 (2003)).
  • DHFR-deficient Chinese hamster ovary-derived cells which is a kind of CHO cells, were used for constructing a cell line that stably expresses hLF / hIgGFc fusion protein.
  • DHFR is dihydrofolate reductase and is essential for biosynthesis of nucleic acids.
  • methotrexate methotrexate
  • pOptiVEC (trade name) manufactured by Invitrogen Corporation was used as an expression vector for DG44 cells.
  • hLF / hIgGFc hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc) expression vector
  • hLF hLF / hIgGFc
  • CH3 was cut out as XhoI-NotI fragment from vector pTeuIgG / hLF. It was cloned into the XhoI / NotI site of pOptiVEC-MCS.
  • This vector was named pOptiVEC / hLF-dFc (FIG. 5).
  • the expression vector was prepared according to the method described above.
  • the amino acid sequence of human lactoferrin (hLF) / human IgG Fc fusion protein encoded by pOptiVEC / hLF-dFc, which is a hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) expression vector, is shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
  • amino acid numbers 1 to 711 are hLF
  • 712 to 714 are spacers
  • 715 to 729 are hinge regions
  • 730 to 839 are CH2 domains
  • 840 to 946 are CH3 domain amino acid sequences (FIG. 17A: Genbank accession number AAB603324.1. And AAA02914.1 sequence).
  • hinged hLF / hIgGFc fusion protein 3-1 Construction of a hinge-added hLF / hIgGFc fusion protein stable expression cell line using DG44 cells as a host The prepared pOptiVEC / hLF-dFc is introduced into DG44 cells, and a hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) stable expression cell line is introduced.
  • hLF / hIgGFc hinge-added fusion protein d
  • the expression vector treated with PvuI was named pOptiVEC / hLF-dFc / PvuI.
  • transfection into DG44 cells was performed. 20 ⁇ g of pOptiVEC / hLF-dFc / PvuI is mixed with 15 ⁇ l of “Free Style MAX Reagent” (trade name, Invitrogen) and 1200 ⁇ l of “Opti Pro SFM” (trade name, Invitrogen) and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The transfection solution was used.
  • DG44 cells (15 ⁇ 10 6 cells) are suspended in 30 ml of a medium (“complete CD DG44 medium”, Invitrogen), a transfection solution prepared in advance is mixed therein, and a CO 2 incubator (37 ° C., 5 ° C.) is mixed. % CO 2 ) for 48 hours. Thereafter, the medium was changed from “complete CD DG44 medium” to “complete CD opti CHO medium” (Invitrogen).
  • This medium is a medium that does not contain hypoxanthine or thymidine, and DHFR-deficient cells cannot grow.
  • the cell can grow if the expression vector is integrated into the chromosome of DG44 cells.
  • the cells were collected by centrifugation at 400 ⁇ g for 5 minutes and suspended in 30 ml of “complete CD optimal CHO medium” (3 ⁇ 10 6 cells / ml). Thereafter, the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) while changing the medium every two days. The cells were cultured until the cell density reached 90% or more at the start of the culture.
  • MTX methotrexate
  • the number of DG44 cells cultured in “Complete CD optimal CHO medium” was counted, and 1.2 ⁇ 10 7 cells were centrifuged at 400 ⁇ g for 5 minutes.
  • the cells were suspended in a mixed medium of 30 ml of “complete CD optimal CHO medium” and 1.5 ⁇ l of 1 mM MTX (final concentration: 0.05 ⁇ M).
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) until the cell density reached 90% or more at the start of the culture.
  • the MTX concentration was increased stepwise to 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, 2 ⁇ M, 3 ⁇ M, and 4 ⁇ M, and the same culture was performed.
  • the molecular weight of the target d is about 210 kDa. From the MTX concentration of 1 ⁇ M, a band was observed in the vicinity of about 210 kDa indicated by the arrow. As the MTX concentration increased, the band became darker, and it was confirmed that the protein expression level increased.
  • a cell line established in the presence of an MTX concentration of 4 ⁇ M was named DG44-d (hLF / hIgGFc).
  • hinge-added hLF / hIgGFc fusion protein was performed by static culture using a 175 cm 2 T flask (Greiner, 50 ml of medium) or a Nunc triple flask (200 ml of medium). .
  • the strain with stable expression of the hinged fusion protein was subcultured in a serum-free medium “Complete CD Opti CHO medium”.
  • Hybridoma Serum Free Medium (trade name, Invitrogen) +4 ⁇ M methotrexate (MTX) +60 ⁇ g / ml proline (hereinafter referred to as “Hybridoma SFM”)
  • the cell concentration is 1 ⁇ 10 6 cells /
  • the cells were seeded in ml and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 7 days. After 7 days, the supernatant and cells were separated by centrifuging the cell culture at 400 ⁇ g for 5 minutes. The cells were again suspended in 50 ml of Hybridoma SFM, and the protein was expressed by culturing at 37 ° C., 5% CO 2 for another week. The supernatant was re-centrifuged at 8000 rpm for 5 minutes, and a final concentration of 0.02% sodium azide was added to the resulting supernatant and stored at 4 ° C.
  • the medium supernatant (containing a final concentration of 0.02% sodium azide) obtained by mass expression was used as it was.
  • 400 ⁇ l of “MacroCaP SP” (trade name, GE Healthcare), which is a cation exchange carrier, is packed in “Poly-Prep Chromatography Columns” (trade name, Bio-Rad) and 10 mM for 5 column volumes (CV). Equilibrated with sodium phosphate buffer (pH 7.6).
  • the 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.6) used for equilibration was discarded, 4 ml of the medium supernatant obtained by mass expression was added, and the mixture was reacted on a seesaw shaker for 30 minutes. After the reaction, the solution was collected as a flow-through fraction. Connect "Poly-Prep Chromatography Columns” to "UV DETECTOR” (Tokyo Rika Kikai Co., Ltd., measuring absorbance at 280 nm), a micro tube pump (Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.), and set the flow rate of the pump to 1 ml / min. The carrier was washed by flowing 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.6).
  • Hinge-added d (hLF / hIgGFc), which is the target protein, was eluted from the 0.4 M NaCl fraction. From this result, it was found that the hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) bound to “MacroCaP SP” can be efficiently recovered by washing with 0.3 M NaCl and eluting with 1.0 M NaCl.
  • hinged d (hLF / hIgGFc) protein solution suspended in PBS purified with a cation exchange carrier was added and mixed by inversion until ammonium sulfate was dissolved, and then allowed to stand at 4 ° C. overnight. . Thereafter, centrifugation was performed at 15000 rpm for 30 minutes to precipitate the protein. The supernatant was collected and the precipitate was dissolved in 100 ⁇ l PBS. Each precipitate dissolved in PBS and the collected supernatant were examined by 7.5% SDS-PAGE and CBB staining.
  • the molecular weight of hLF was calculated as 80 kDa ( ⁇ 2), and the molecular weight of the Fc portion was calculated as 50 kDa.
  • the molecular weight of hLF was calculated as 80 kDa, and the molecular weight of the Fc portion was calculated as 25 kDa.
  • Each ammonium sulfate concentration and its recovery rate (%) are shown in Table 3 below.
  • the recovery rate was the highest with 70% ammonium sulfate. After ammonium sulfate precipitation, ammonium sulfate was removed by suspending the precipitate in PBS and dialyzing against PBS.
  • Lactoferrin is a non-heme iron-binding glycoprotein with a molecular weight of 80,000 and consists of two regions called N-lobe and C-lobe and contains carbonate ions (CO 3 2 - ) Capable of reversibly chelating two iron ions (Fe 3+ ) per molecule of protein in the presence of () (Anderson, et al., Nature, 344, 784-78 (1990)). The iron binding ability of lactoferrin was measured as follows.
  • Iron ions (Fe 3+ ) are released from holo-type lactoferrin to prepare apo-type lactoferrin.
  • iron recombined lactoferrin to which iron ions (Fe 3+ ) were added in the presence of carbonate ions (CO 3 2 ⁇ ) was prepared.
  • the iron content and protein concentration of apo type and iron recombined lactoferrin were measured, and the amount of iron binding was measured.
  • the apo-type lactoferrin is composed of Aspergillus-derived recombinant human LF, hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc) in 0.1 M citrate buffer (pH 2.1) for 24 hours, and distilled water.
  • Iron recombined lactoferrin is prepared by dialysis of apo-type lactoferrin for 24 hours in a phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 0.001% ammonium iron citrate, 50 mM sodium carbonate and 50 mM sodium chloride. In order to remove ions, dialysis was performed for 24 hours against distilled water and then phosphate buffer (pH 7.5) containing 50 mM sodium chloride. In order to measure iron ions bound to proteins by a colorimetric method, a serum iron measurement kit “Fe C-Test Wako” (trade name, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • the binding ability of iron was calculated as the binding amount of iron bound per mg of hLF protein quantified by the Bradford method (in the case of human IgG Fc fusion protein, 1 mg in terms of hLF calculated using the molecular weight). The results of two experiments are shown in Table 4 below.
  • Aspergillus-derived recombinant hLF and fusion protein d (hLF / hIgGFc) suspended in PBS ( ⁇ ) at 0.1 mg / ml are prepared, and a CD having a wavelength of 200 nm to 250 nm at room temperature (about 20 ° C.).
  • the spectrum was measured (J-720 used by JASCO).
  • the thermal stability of each protein was examined.
  • the wavelength to be measured is around 225 nm.
  • Aspergillus-derived recombinant hLF and hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc) suspended in PBS (-) at 0.1 mg / ml are prepared, and the wavelength is increased by 1 ° C from 30 to 90 ° C.
  • a CD spectrum at 225 nm was measured (using J-720 from JASCO).
  • hinge-added fusion protein d (hLF / hIgGFc) has improved heat stability compared to the recombinant hLF derived from Aspergillus.
  • the structurally stable hinged fusion protein d (hLF / hIgGFc) is considered to be expected to improve blood stability in vivo.
  • hinged hLF / hIgGFc fusion protein 3-4 The hinged hLF / hIgGFc fusion protein purified with the cation exchange carrier “MacroCap SP” shown in FIG. 2 was dialyzed into PBS and further diluted with PBS to prepare a sample having a concentration of 336 ⁇ g / mL. 100 ⁇ L of this sample was added to a 1.5 mL tube and allowed to react at 37 ° C. for 3 weeks. 3 ⁇ L of the sample after reaction 0, 1, 2, 3 weeks was taken, 1 ⁇ l of non-reducing 4 ⁇ sample buffer was mixed, and heat treatment was performed at 95 ° C. for 5 minutes.
  • FIG. 14 M is a marker
  • lane 1 is hLF (1 ⁇ g / lane)
  • lanes 2 to 5 are samples after 0, 1, 2, and 3 weeks, respectively.
  • M is a marker
  • lane 1 is hLF (1 ⁇ g / lane)
  • lanes 2 to 5 are samples after 0, 1, 2, and 3 weeks, respectively.
  • the band of the hinge-added hLF / hIgGFc fusion protein indicated by * became thinner and the bands of ** and *** that seemed to be degraded became darker with time. . This is considered to be decomposed by the protease mixed in during the purification process. Such degradation was not observed in the hinge-deficient fusion protein (described later).
  • FIG. 15-A shows a PVDF membrane stained with CBB.
  • M is a marker
  • lane 1 is hLF (4 ⁇ g)
  • lanes 2 to 6 are all decomposed samples (each 2 ⁇ g / lane).
  • a band (arrow) of about 50 kDa was cut out from this PVDF membrane and decolorized.
  • the N-terminal amino acid sequence of the band was analyzed with procedure 491HT (trade name, ABI).
  • the obtained amino acid sequence is T-H-T-X-P (the fourth amino acid cannot be decoded).
  • amino acid numbers 722 to 726 (within the hinge region) of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing were examined. ) (FIG. 15-B).
  • Example 2 Preparation of the fusion protein of human IgGFc region not including the human lactoferrin with a hinge region ( "hinge defective"), stability biological activity and blood evaluation 1. Construction of hinge-deficient hLF / hIgGFc fusion protein expression vector Using the vector pBSIILfAL / Bam (FIG. 1) prepared above, a fusion protein (hinge-deficient hLF / mhIgGFc) of hLF and hIgGFc not containing the hinge region was used. An expression vector for expression in animal cells was constructed.
  • an expression vector for hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc a region containing pmIgG / hLF hLF, human IgG Fc region CH2 and CH3 cDNA sequences were excised as XhoI-NotI fragments and pOptiVEC- produced above. Cloning was performed at the XhoI / NotI site of MCS (FIG. 4). This vector was named pOptiVEC / hLF-mFc (FIG. 5). The expression vector was prepared according to the method described above.
  • amino acid sequence of the hLF / hIgGFc fusion protein encoded by the hinge-deficient fusion protein hLF / mhIgGFc expression vector pOptiVEC / hLF-mFc is shown in SEQ ID NO: 6 of the Sequence Listing.
  • amino acid numbers 1 to 711 are hLF
  • 712 to 713 are spacers
  • 714 to 823 are CH2 domains
  • 824 to 930 are CH3 domain amino acid sequences (FIG. 17B: Genbank accession numbers AAB603324.1 and Based on the sequence of AAA02914.1).
  • hinge-deficient hLF / hIgGFc fusion protein 2-1. Construction of a cell line that stably expresses a hinge-deficient hLF / hIgGFc fusion protein using DG44 cells as a host In the same manner as in the case of the hinge-added type, the prepared pOptiVEC / hLF-mFc is introduced into DG44 cells, and hLF / hIgGFc fusion protein A stable expression cell line was established.
  • the expression vector treated with PvuI was named pOptiVEC / hLF-mFc / PvuI.
  • transfection was performed on DG44 cells using the prepared pOptiVEC / hLF-mFc / PvuI, and the MTX concentration was increased stepwise to carry out the same culture.
  • the target molecular weight of hLF / mhIgGFc is about 105 kDa.
  • a band was observed in the vicinity of about 105 kDa indicated by an arrow from an MTX concentration of 0.5 ⁇ M, and as the MTX concentration increased, the band became darker and it was confirmed that the protein expression level increased.
  • a cell line established in the presence of an MTX concentration of 4 ⁇ M was named DG44-hLF / mhIgGFc.
  • the target protein hinge-deficient hLF / mhIgGFc was eluted with 0.5 M to 0.7 M NaCl. From this result, it was found that the hinge-deficient hLF / mhIgGFc bound to “MacroCaP SP” can be efficiently recovered by washing with 0.4 M NaCl and eluting with 1.0 M NaCl.
  • the recovery rate was the highest with 60% ammonium sulfate. After ammonium sulfate precipitation, ammonium sulfate was removed by suspending the precipitate in PBS and dialyzing against PBS.
  • the hinge-deficient hLF / hIgGFc fusion protein has improved heat stability compared to hLF, and it can be expected to improve blood stability in vivo.
  • ELISA AssayMax Human Lactoferrin ELISA kit
  • EDTA which is an anticoagulant used at the time of blood collection, and plasma do not affect this ELISA measurement.
  • the ELISA kit used was composed of a biotinylated anti-human lactoferrin antibody (primary antibody) and peroxidase-labeled streptazibine. Therefore, there is no need to worry about the cross-reaction between the secondary antibody and the Fc region of the hinge-deficient type (hLF / mhIgGFc), which is a problem in general ELISA using a secondary antibody.
  • a calibration curve was prepared using recombinant hLF derived from Aspergillus and a hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) whose concentrations were known by the Bradford method.
  • Recombinant hLF derived from Aspergillus was 0.47 to 7.5 ng / ml
  • hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) was 0.235 to 30.0 ng / ml.
  • Each plasma sample was diluted so that the measured value was within this range, and the protein concentration was measured.
  • LF was not detected in the blood in either the Aspergillus-derived recombinant hLF or the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) administration group.
  • the Aspergillus-derived recombinant hLF administration group was almost cleared from the blood 60 minutes after administration, but the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) administration group was detected even 240 minutes later.
  • Hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) was reacted in 75% bovine serum / PBS at a concentration of 0.2 ⁇ g / ⁇ l at 37 ° C. for a long period of time I let you. Samples were taken after 0, 14, 21, 38, and 55 days, and the size and amount of remaining LF were detected by immunoblotting using an anti-hLF antibody. As a result, during the storage period of up to 55 days, the initial molecular weight was maintained with little degradation compared to 0 days, and the detected amount was not decreased (FIG. 18). Therefore, the fusion protein of the present invention is sufficiently resistant to degradation by proteases in the blood.
  • Example 3 Incorporation Evaluation of human intestinal epithelial-like cells of human lactoferrin and human IgGFc region of a fusion protein ( "hinge-defective") and chymotrypsin resistance evaluation 1. Evaluation of uptake into human small intestinal epithelial cell Caco2 LF is known to be taken up from the intestine and transferred to the thoracic lymph. Therefore, whether or not the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) produced in this study was taken up through this pathway was confirmed using human small intestinal epithelial cells Caco2 cells. hLF and the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) were labeled with Alexa Fluor 488, a fluorescent probe.
  • Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 488
  • DMSO 100 ⁇ l was added to 1 mg of Alexa Fluor 488, and then each protein added with 1M NaHCO 3 and Alexa Fluor 488 were mixed at a molar ratio of 1:10 and reacted at room temperature for 1 h. After the reaction, the reaction solution was dialyzed against 1 ⁇ PBS ( ⁇ ) for 24 hours to remove unlabeled Alexa Fluor 488.
  • Caco-2 cells were seeded in a 12-well plate to a cell concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / ml, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 for 1 week (medium exchange every 2 days). PBS (-) was added to Caco-2 cells at 1 ml / well and washed three times to completely remove the medium components.
  • each Alexa-labeled protein was added and reacted for 1 hr. After 1 hr, each Alexa-labeled protein was removed, and 1 ml / well of cold PBS (-) was added, followed by washing once. After washing, 250 ⁇ l / well of 0.25% Trypsin / EDTA was added and reacted at 37 ° C. for 5 min. After 5 minutes, the entire amount of the cells was collected in a tube, and centrifuged at 200 ⁇ g, 2 minutes, 4 ° C. using a centrifuge.
  • hLF and hinge-deficient fusion protein were not taken into Caco2 cells under 4 ° C conditions (Fig. 19A), but were taken into Caco2 cells under 37 ° C conditions. (FIG. 19B).
  • uptake at 37 ° C. was inhibited by NaN 3 (FIG. 19C) and an excess amount of unlabeled bovine lactoferrin (bLF) (FIG. 19D), so this intracellular uptake is receptor-mediated, and the hinge-deficient fusion protein (HLF / mhIgGFc) was confirmed to be taken up into cells by the LF uptake route. That is, the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) is considered to be taken in via any one or more of the lactoferrin receptor, IgG receptor, and albumin receptor.
  • FIG. 20 shows the results of electrophoresis of a sample that was allowed to stand at 37 ° C. without adding, and a sample that was allowed to stand at 37 ° C. after adding chymotrypsin of a hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc).
  • the density of each band was analyzed by ImageJ.
  • the graph was graphed assuming that the average value of the intensity of the band to which chymotrypsin was not added was 100% (FIG. 21).
  • the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) was hardly degraded, but the control hLF was degraded in 30 seconds, indicating that the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc) was resistant to chymotrypsin.
  • FIG. 22 panel B is a graph showing the correlation between elution time and protein molecular weight.
  • the blue curve (“hLF / dhIgGFc”) is the result of a hinged hLF / hIgGFc fusion protein containing a region (hinge region) to form a dimer.
  • the green curve (“hLF / mhIgGFc”) is the result of the hinge-deficient fusion protein (hLF / mhIgGFc).
  • hLF / mhIgGFc the hinge-deficient fusion protein
  • hLF / mhIgGFc the hinge-deficient fusion protein
  • the present invention provides a lactoferrin fusion protein having improved properties, uses thereof and methods for producing the same.

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Abstract

　本発明は、天然ラクトフェリンの生物活性を保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用 性が天然ラクトフェリン及び遺伝子組換え型ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン融合タンパク 質及びその製造方法等を提供することを目的とする。　本発明は、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの融合タンパク質であって、 （ＬＦ－ｓ－Ｙ）ｎ　又は　（Ｙ－ｓ－ＬＦ）ｎ〔式中、ＬＦはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、ＹはＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチド、ｓは０～１０個の任意のアミノ酸の配列、ｎは１～１０の整数を表す〕で表される融合タンパク質、又はその改変体を提供する。

Description

ラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法
　
本発明は、改良された特性を有するラクトフェリン融合タンパク質、その用途及びその製造方法等に関する。
　ラクトフェリンは、主に哺乳動物の乳汁中に存在し、好中球、涙、唾液、鼻汁、胆汁、精液などにも見出されている、分子量約８０，０００の糖タンパク質である。ラクトフェリンは、鉄を結合することから、トランスフェリンファミリーに属する。ラクトフェリンの生理活性としては、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用などが知られている。さらに、最近、ラクトフェリンが脂質代謝改善作用、鎮痛・抗ストレス作用、アンチエイジング作用を有することも明らかにされている。このように、ラクトフェリンは、多様な機能を示す多機能生理活性タンパク質であり、健康の回復又は増進のため、医薬品や食品などの用途に使用されることが期待されており、ラクトフェリンを含む食品は既に市販されている。
　ラクトフェリンは、経口的に摂取した場合、胃液中に存在する酸性プロテアーゼのペプシンにより加水分解を受け、ペプチドに分解されるため、ラクトフェリン分子としてはほとんど腸管まで到達することができない。しかし、ラクトフェリン受容体は消化管では小腸粘膜に存在することが知られており、最近、ラクトフェリンが腸管から体内に取り込まれて、生物活性を発現していることが明らかにされている。そのため、ラクトフェリンの持つ生物活性を発揮させるには、ラクトフェリンを胃液中でのペプシンによる加水分解を受けない状態で腸管まで到達させることが重要である。また、注射剤とした場合、キモトリプシンやエラスターゼといった組織、器官に含まれるプロテアーゼによる分解に曝されるため、体内での投与組織、器官での安定性を増加させるためには、これらのプロテアーゼに対する抵抗性を付与することが実用上重要である。
　ＩｇＧ抗体は、生体内で新生児Ｆｃ受容体（ｎｅｏｎａｔａｌ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下「ＦｃＲｎ」という）を介したリサイクリング機構により分解が抑制されるため、血中半減期が長いことが知られている。また、抗体薬は、特定のタンパク質やペプチドなどに標的が限定され、作用メカニズムが限定されるため、従来の合成化合物と比べ、副作用は少ないと考えられている。
　ＩｇＧ抗体やそのＦｃ領域を用いた融合タンパク質を利用する生物学的製剤の概念自体は、従来知られており、例えば、腎移植後の急性拒絶反応を抑制する薬として１９８６年にＣＤ３をターゲットとする抗体医薬品が承認され、長く使用されている。
　しかし、一般に融合タンパク質は、融合によって活性部位が影響を受けることにより、融合されていないタンパク質と比べ、生物活性が低減されることも頻繁に観察されている。例えば、ＴＰＯＲ結合擬似ペプチドは、内在性のＴＰＯと比べ、ＴＰＯＲとの結合量には遜色はないが、インビトロ試験において生物活性は若干低い傾向があった。
　さらに、ＩＦＮ−αとＦｃ領域とを結合してＩＦＮ−αの血中半減期を増加させた融合タンパク質については、血中半減期は大幅に増加されたものの、ＩＦＮ−αの生理活性は低下してしまうという欠点がある。したがって、望ましい特性を備えた融合タンパク質を作製するための条件等については、タンパク質ごとに充分に検討されなければならない。
特開２００７−１０５０４４号公報 特許第４２３４４３８号公報 特表２０１１−５２３３５１号公報 特表２００４−５２１６５５号公報 米国特許第５，７２３，１２５号公報
Ｊａｚａｙｅｒｉ，Ｊ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２２，１１−２６（２００８） Ｙｅｕｎｇ，Ｙ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８２，７６６３−７６７１（２００９） Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８４，１９６８−１９７６（２０１０） Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０，３７９−３８６，（１９９３） Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｄ．Ｓ．，ｍＡｂｓ，１，２６−２８（２００９） Ｇｏｎｇ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８６，２７２８８−２７２９３（２０１１）
　本発明は、抗原性を低減し、プロテアーゼ耐性を付与し、経口、組織、器官投与を可能にし、体内寿命を延ばした、臨床的有用性の高いラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。さらに、天然ラクトフェリンの生物活性を保持し、体内寿命が有意に延長されており、臨床的有用性が天然ラクトフェリン及び遺伝子組換え型ラクトフェリンよりも優れたラクトフェリン融合タンパク質及びその製造方法等を提供することを目的とする。
　本発明者らは、天然物と遜色ない高次構造を有するラクトフェリンであって、生理活性が損なわれていないうえに、長い半減期を維持するラクトフェリンを創出すべく鋭意努力し、ラクトフェリンタンパク質にＦｃＲｎ結合タンパク質（Ｆｃ領域）を融合させたものを製造し、血中での安定性を調べた結果、Ｆｃ領域と融合させたラクトフェリンタンパク質は、融合をしていないものと比べて半減期が５．４倍に顕著に増大されたことを見出した。また、ＣＤスペクトルと鉄結合能の測定の結果から、融合タンパク質において、Ｆｃ領域と融合されることによるラクトフェリン自体の立体構造の変化は見られず、熱安定性についても立体構造が少なくとも３０℃以上、さらには６５℃以上でも維持され、生物活性についても全く損なわれていないという全く予期しない結果であることを見出し、さらに、製造されたラクトフェリン融合タンパク質はプロテアーゼに対する抵抗性を有し、最も重要な生物活性である鉄キレート能も保存されているという結果を得、本発明を完成した。
　即ち、本発明は、
〔１〕　ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリンとの融合タンパク質であって、
（ＬＦ−ｓ−Ｙ）ｎ　又は　（Ｙ−ｓ−ＬＦ）ｎ
〔式中、ＬＦはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、ＹはＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチド、ｓは０~１０個の任意のアミノ酸の配列、ｎは１~１０の整数を表す〕
で表される融合タンパク質、又はその改変体；
〔２〕　ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、アルブミン又はアルブミンのＦｃＲｎ結合領域のいずれかを含む、〔１〕記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔３〕　融合タンパク質が、単量体又は二量体（ｎ＝１又は２）である、〔１〕又は〔２〕記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔４〕　融合タンパク質が、単量体である、〔１〕又は〔２〕記載の融合タンパク質、又はその改変体、又はその改変体；
〔５〕　融合タンパク質が、天然ラクトフェリンの５０％以上の鉄キレート能を保持している、〔１〕~〔４〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体；
〔６〕　融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、または／かつ　ＩｇＧ／アルブミン受容体を介して取り込まれるものである、〔１〕~〔５〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
〔７〕　融合タンパク質は、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてキモトリプシン耐性が向上したものである、〔１〕~〔６〕のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
〔８〕　〔１〕~〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体をコードする核酸分子；
〔９〕　〔８〕記載の核酸分子を含む発現ベクター；
〔１０〕　〔９〕記載の発現ベクターを含む宿主細胞；
〔１１〕　〔８〕記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物；
〔１２〕　〔８〕記載の核酸分子を含む遺伝子組換え植物；
〔１３〕　〔１〕~〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体を含む、ラクトフェリンによって改善される疾患の治療剤；
〔１４〕　〔１〕~〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体及び担体を含む、医薬品組成物；
〔１５〕　〔１〕~〔７〕のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質又はその改変体を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はその改変体を回収することを含む方法
を提供する。
　本発明の融合タンパク質又はその改変体（以下、「融合タンパク質等」と表記することがある）は、ラクトフェリンが有する鉄の結合能が保持されており、したがって、少なくとも鉄結合能に基づくラクトフェリンの重要な生物活性が保持されている。また、体内寿命が長く、プロテアーゼに対する抵抗性を有しているため、体内で長時間にわたって生物活性を発揮することができる。さらに、融合タンパク質にすることによって胃でのペプシンによる消化分解を受けにくくなっているため、さらなる腸溶化のための製剤的な処理を行わなくても、充分に腸内に到達しうる。
　また、本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換えによって製造されることによって、製造管理・品質管理の点でも有利であり、医薬品成分としての使用に特に適している。即ち、本発明にしたがった融合タンパク質等及び融合タンパク質等の製造方法により、ラクトフェリンを医薬品成分としてさらに有用性の高い形とすることができる。ラクトフェリンは、安全性が非常に高く、多様な生物活性を有するので、本発明により、有効な治療薬がない疾患又は症状の治療薬又は予防薬として、さらに有利に適用が可能となる。例えば、生活習慣病（動脈硬化、高コレステロール血症、高脂血症、高血圧、糖尿病、脂肪肝など）、がん（発がん予防、がんの二次予防、転移抑制、制癌剤の作用増強など）、自己免疫疾患（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎、悪性関節リウマチ、膠原病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、全身性紅斑性狼蒼など）、精神神経疾患（痴呆、アルツハイマー病、パーキンソン病、テンカン、うつ病、ヒキコモリ、統合失調症、各種ストレス性疾患、更年期障害など）、疼痛緩和（モルヒネ等のオピオイド増強作用、がん性疼痛、神経因性疼痛、ヘルペス後疼痛、線維筋痛症、術後疼痛、舌痛症、生理痛、歯痛、関節痛、更年期障害など）、肝炎（各種ウイルス性肝炎、非アルコール性肝炎、肝硬変など）、炎症性腸疾患（大腸性潰瘍炎、クローン病など）、過敏性腸症候群、前立腺肥大、頻尿、不眠症、便秘などへ適応を拡大できる。さらに、ラクトフェリンは、抗菌・抗ウイルス作用及び免疫能賦活作用があるので、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、各種感染症及びそれに基づく炎症、例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌の胃粘膜感染、歯周病、歯槽膿漏、口臭、口腔カンジダ症、口内炎、口角炎、鼻炎、食道炎、胆嚢炎、尿路感染症、膣感染症、水虫、ニキビ、ヘルペス属ウイルスの感染症、老人性肺炎、術後感染症などへの適用も可能であり、また、抗生物質の作用を増強する作用がある。一方、ラクトフェリンは免疫的な寛容をもたらす作用もあり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、花粉症、アトピー性皮膚炎、脂漏症、蕁麻疹等のアレルギー性疾患にも適用可能である。注目すべきことは、ラクトフェリンには鉄キレート作用に基づく強い抗酸化ストレス作用があり、本発明の融合タンパク質又はそれを含む医薬品組成物は、ウィルソン病、劇症肝炎などや、肌や眼の抗加齢・若返り作用、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、粘膜上皮細胞の角化抑制・若返り作用などへの適用も可能である。
　また、本発明の融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも１つの受容体を介して細胞に取り込まれるため、副作用が低いことが期待できる。
図１は、全長ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）ｃＤＮＡを含むベクターｐＢＳＩＩＬｆＡＬにＢａｍＨＩサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを挿入し、ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／Ｂａｍを作製する方法の概略を表す図である。 図２は、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列をもつベクターｐＴｅｕＩｇＧの構造及びこのベクターへのｈＬＦｃＤＮＡの挿入を表す図である。 図３は、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列をもつベクターｐｍＩｇＧの構造及びこのベクターへのｈＬＦｃＤＮＡの挿入を表す図である。 図４は、ＤＧ４４細胞用発現ベクターｐＯｐｔｉ−ＶＥＣにベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＴ７プライマー結合部位からＴ３プライマー結合部位までの領域を挿入し、ベクターｐＯｐｔｉ−ＶＥＣ−ＭＣＳを作製する方法の概略を表す図である。 図５は、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクター及びヒンジ欠損融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターの作製方法の概略を表す図である。ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦのｈＬＦ、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列を含む領域、又はｐｍＩｇＧ／ｈＬＦのヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＭＣＳのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。 図６は、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）をＤＧ４４細胞に発現誘導させた際の発現量を表す図である。 図７は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃをＤＧ４４細胞に発現誘導させた際の発現量を表す図である。 図８は、ヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の精製を表す図である。 図９は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの精製を表す図である。 図１０は、ヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮を表す図である。 図１１は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの硫酸アンモニウム沈殿による濃縮を表す図である。 図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＡはｈＬＦのＣＤスペクトルを表す。 図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＢはヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのＣＤスペクトルを表す。 図１２は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の二次構造の相同性を表す図である。パネルＣはヒンジ付加融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）のＣＤスペクトルを表す。 図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＡはｈＬＦのＣＤスペクトルを表す。 図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＢはヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのＣＤスペクトルを表す。 図１３は、ｈＬＦ、ヒンジ欠損型及びヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を表す図である。パネルＣはヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）のＣＤスペクトルを表す。 図１４は、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解を表す図である。 図１５−Ａは、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の３７℃、３週間後の分解物を表す図である。 図１５−Ｂは、ヒンジ付加ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の模式図とその分解箇所を表す図である。 図１６は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの血中安定性を表す図である。 図１７−Ａは、発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃがコードするヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）／ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号５）を表す図である。二重線はスペーサーアミノ酸、斜字体はヒンジ領域のアミノ酸、下線つきの太字はＣＨ２ドメインのアミノ酸、太字はＣＨ３ドメインのアミノ酸の配列をそれぞれ表す。 図１７−Ｂは、発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃがコードするｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列表の配列番号６）を表す図である。二重線はスペーサーアミノ酸、下線つきの太字はＣＨ２ドメインのアミノ酸、太字はＣＨ３ドメインのアミノ酸の配列をそれぞれ表す。 図１８は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの血清溶液中での安定性を示す図である。 図１９は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの小腸上皮様細胞への取り込みを表す図である。 図２０は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのキモトリプシン耐性を表す電気泳動写真である。 図２１は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃのキモトリプシン耐性を表す図である。 図２２は、ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃが溶液中でホモダイマーを形成することを示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１２年４月２３日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１２−０９８０８５号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
　本発明の融合タンパク質は、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの生物学的に活性な融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質においてラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドと結合されるタンパク質又はペプチドは、一般に、ＦｃＲｎに結合することの知られている配列を含むタンパク質やペプチドであり、生体に対して適合可能又は薬理学的に不活性であればよい。例えば、血液成分タンパク質であるＩｇＧ又はアルブミンはＦｃＲｎに結合することが知られている。したがって、本発明において使用されるＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとしては、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７）、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖にあるＦｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、ＣＨ２ドメイン、アルブミン、アルブミンのＦｃＲｎ結合領域を含む領域が挙げられる。これらのタンパク質及びペプチドのアミノ酸配列は公知であり、本発明において使用される場合、天然の配列と同一であってもよく、また、変異を有していてもよい。
　好ましくは、本発明において使用されるＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドは、ラクトフェリンと融合させた状態から分解しにくいものが良い。例えば、ＩｇＧのヒンジ領域を含むＦｃ領域を使用するとヒンジ領域がジスルフィド結合を形成することにより二量体形態の融合タンパク質が形成されるが、ヒンジ領域はプロテアーゼに対して感受性が高いため、ヒンジ領域を含まないもの、又はヒンジ領域のシステインを他のアミノ酸で置換したり、システインの位置を変更したものを使用することができる。あるいは、糖鎖付加部位を含む他のアイソタイプ由来のヒンジ領域と入れ替えることで、糖鎖によりプロテアーゼ耐性を増大させてもよく（特許文献２）、これらもＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドに含まれる。
　ヒンジ領域のプロテアーゼによる分解を防ぐためには、ヒンジ領域を削除することにより、ヒンジ欠損型融合タンパク質を作製する方法が好ましい。この融合タンパク質はヒンジ領域を持たないことから、エフェクター機能に関わるＦｃγレセプターや、補体への結合低下が考えられ、副作用につながるエフェクター機能を介した細胞障害や、血中からの融合タンパク質の排除につながるエフェクター機能を介した免疫反応の活性化が軽減し、ヒンジ領域を有するもの（ヒンジ付加型融合タンパク質等）と比較して有利である。
　このようなＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドは、ＦｃＲｎ結合領域に加えて、他の配列を含んでいてもよく、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの多量体を形成するＪ鎖が含まれる配列を付加することによって、さらに多量体化することができる。
ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとは、融合タンパク質においてどちらをＮ末端側又はＣ末端側に位置させてもよいが、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをＮ末端側、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをＣ末端側とすることが好ましい。したがって、本発明の融合タンパク質としては、（ＬＦ−Ｙ）ｎで表されるもの、及び／又は前記〔１〕の式においてｎ＝１又は２のものが好ましく、（ＬＦ−Ｙ）ｎで表されるものであってｎ＝１のものがさらに好ましい。なお、後述するように、ＬＦとＹとの間に付加的な配列が存在してもよい。
　本発明の融合タンパク質等において使用される「ラクトフェリン」（ＬＦ）又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドは、遺伝子組換え型（一部のアミノ酸が置換された改変型を含む）ラクトフェリンであって、使用される配列の由来する生物種及び改変の有無などは問わない。例えば、ラクトフェリンは、ヒト及び種々の動物（ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ等）から得られる天然のラクトフェリンと同一のアミノ酸配列を有していてもよいし、目的とするラクトフェリンの生理活性を有する限りにおいて、一部のアミノ酸が欠失、付加、置換していてもよい。ラクトフェリンの機能的（生物活性を有する）断片、ペプチドは、種々のものが公知であり（例えば、「プログラム・抄録集第２回　臨床ラクトフェリンシンポジウム２００９」、２１~２７頁（島崎敬一）、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２０１１　Ｓｅｐ；３２（９）：１９５３−６３．Ｅｐｕｂ　２０１１　Ｊｕｌ　３０，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ　ｆｏｒ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｕｓｅ，Ｂｒｏｕｗｅｒ　ＣＰ，Ｒａｈｍａｎ　Ｍ，Ｗｅｌｌｉｎｇ　ＭＭ、Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ．２０１０　Ｊｕｎ；２３（３）：４９３−５０５．Ｅｐｕｂ　２０１０　Ｍａｒ　１８，Ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｈＬＦ１−１１　ｐｒｉｍｅｓ　ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ　ｆｏｒ　ａｎ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＴＬＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｄｏｅｓ　ＡＭ，Ｂｏｇａａｒｄｓ　ＳＪ，Ｊｏｎｋ　Ｌ，Ｗｕｌｆｅｒｉｎｋ　Ｍ，Ｖｅｌｄｅｒｓ　ＭＰ，Ｎｉｂｂｅｒｉｎｇ　ＰＨ、Ｊ　Ａｇｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．２０１０　Ｊｕｎ　９；５８（１１）：６７２１−７，Ａｎｔｉｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ　Ｂ−ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｒｕｉｚ−Ｇｉｍｅｎｅｚ　Ｐ，Ｉｂａｎｅｚ　Ａ，Ｓａｌｏｍ　ＪＢ，Ｍａｒｃｏｓ　ＪＦ，Ｌｏｐｅｚ−Ｄｉｅｚ　ＪＪ，Ｖａｌｌｅｓ　Ｓ，Ｔｏｒｒｅｇｒｏｓａ　Ｇ，Ａｌｂｏｒｃｈ　Ｅ，Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ　Ｐ）、必要に応じて設計することができる。
　本発明の融合タンパク質等に関して「生物（学的）活性」とは、特にことわらない限り、ラクトフェリンの生理薬理活性を意味する。特に、本発明の融合タンパク質等は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）と同等の鉄キレート（結合）能を有している。具体的には、後述する実施例の方法で測定して天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の鉄結合能を１００％とした場合に、本発明の融合タンパク質等は、少なくとも５０％以上（例えば約５０％~約１５０％又は約５０％~約１２０％）の鉄結合能を保持しており、好ましい態様においては、本発明の融合タンパク質等は、天然ラクトフェリン（又は天然と同等の配列を有する組換え型ラクトフェリン）の約７０％~約１００％又はそれ以上（例えば約７０％~約１５０％又は約７０％~約１２０％）、さらには約９０％以上に相当する鉄結合能を有する。なお、鉄結合能は、実施例に記載した方法又はそれと同等の方法によって測定する場合、±２０％程度の誤差がありうる。
　本発明の融合タンパク質は、さらに、付加的なアミノ酸配列及び（又は）糖鎖等を含んでいてもよい。ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドと、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの間に、スペーサー配列として適切な長さの任意のアミノ酸配列を有することができる。スペーサー配列（ｓ）は、例えば０~１０個、又は０~５個の任意のアミノ酸の配列であることができる。その他の付加的な配列は、スペーサー配列のような立体構造上の利点を提供するものであってもよく、また、例えばシグナルペプチドや精製に利用されるタグ配列のように、何らかの機能を融合タンパク質に与えるものであってもよく、これらを有するものを改変体と称する。
　本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換えにより製造することができる。所望のアミノ酸配列を有するラクトフェリン遺伝子とＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドの遺伝子とを、常法により連結し、所望の宿主細胞において発現させるのに必要なその他の要素を含む発現ベクターを構築し、このベクターを宿主細胞に導入して融合タンパク質を発現させ、発現された融合タンパク質を細胞又は培地から回収することができる。
　本発明の融合タンパク質等をコードする核酸分子は、公知の配列及び標準的な遺伝子操作技術によって設計し、作製することができる。ラクトフェリン及びＦｃＲｎ結合領域含有タンパク質をコードする遺伝子は、公知の核酸又はアミノ酸配列に基づくプローブを用いて、一般に利用可能な種々のゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーからクローニングしたり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって合成することにより、得ることができる。これらの遺伝子に所望の改変を加えたり変異を導入してもよい。
　核酸分子を複製するために使用する宿主細胞及びベクター系、及び融合タンパク質を発現させるために使用する宿主及びベクター系は、公知の多数の真核細胞（哺乳動物細胞、植物細胞、酵母、昆虫細胞など）及び原核細胞（細菌など）の系から適宜選択して使用することができる。
　本発明の融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列及びＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列（又は、ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドをコードする配列及びラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドをコードする配列）に加えて、一般に、作動可能に連結された状態で、転写プロモーター、分泌シグナルペプチド配列、転写ターミネーター、ポリＡシグナルなどの要素を含み、さらに通常、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを含む。
　これらのベクターを用いて、公知の種々の技術にしたがって宿主細胞を形質転換することができる。
　本発明の融合タンパク質等は、遺伝子組換え植物及び遺伝子組換え動物を製造することによって、これらの動物及び植物に産生させることができる。例えば、ヒツジ、ヤギなどの非ヒト動物のゲノムに本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を組み込むことにより、本発明の融合タンパク質を乳汁中に分泌させるようにすることができる。また、植物に組み込むことによって本発明の融合タンパク質等を産生する有用植物を製造することもできる（例えば特表２００４−５２８０２２号公報）。
　本発明の融合タンパク質等は、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞の培地などから、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーなどの種々のクロマトグラフィー技術を適宜用いて単離精製することができる。特に好ましい精製方法としては、イオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。
　ラクトフェリンは、抗菌作用、鉄代謝調節作用、細胞増殖活性化作用、造血作用、抗炎症作用、抗酸化作用、食作用亢進作用、抗ウイルス作用、ビフィズス菌生育促進作用、抗がん作用、がん転移阻止作用、トランスロケーション阻止作用、脂質代謝改善作用、鎮痛作用、抗ストレス作用などを含む広範な生理活性を有しており、これらの作用によって、生活習慣病（例えば、高コレステロール血症、高脂血症など）、疼痛管理（がん性疼痛、神経因性疼痛など）、膠原病（シェーグレン症候群によるドライアイ及びドライマウス、リウマチ性関節炎など）、歯周病、Ｃ型肝炎などを含む、多くの疾患又は症状の治療（改善を含む）及び予防が可能である。
　本発明の融合タンパク質等は、ラクトフェリンの生物活性を充分に保持しているので、単独で、又は他の薬剤と組合せて、ラクトフェリンが有効である疾患の予防又は治療剤として、投与することができる。また、本発明の融合タンパク質等は、製剤学の分野で公知の各種の担体、治療上不活性な基剤及び／又は添加物を配合することによって、所望の剤型の医薬品組成物とすることができる。便宜上、本発明に関して医薬品又は医薬品組成物というときは、投与対象が人の場合のほか、動物である場合（即ち、獣医薬等）も含む。このような医薬品組成物に含有させることができる各種成分及び剤型は当業者には充分に公知である。
　本発明の融合タンパク質等を含む治療剤又は医薬品組成物の有効投与量は、治療又は予防すべき疾患又は症状の種類や程度、投与対象の状態、剤型、投与経路などによって異なり、公知の有効ラクトフェリン量を目安に適宜選択することができる。一般に、公知の有効ラクトフェリン量と比較して有意に少ない用量（例えばラクトフェリン量換算で１／２~１／２０量）とすることができ、同等の用量で用いるのであれば投与回数を減らすことが可能である。
　以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
実施例１：ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）とヒンジ領域を含むヒトＩｇＧＦｃ領域との融合タンパク質の作製及び生物活性評価
　１．ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）遺伝子のクローニング
　ヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）ｃＤＮＡは、ヒトｃＤＮＡライブラリー（商品名「Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ」、クロンテック社）からＰＣＲ法により取得した。フォーワード側プライマーとして、Ｓ＿ＬＦｅｘ＿ＸｈｏＩ＿ＡＴＧ（配列番号１；５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＴＣ（開始コドンであるＡＴＧの上流に下線部ＸｈｏＩサイトを導入）、リバース側プライマーとして、ＡＳ＿ＬＦｅｘ＿ＴＡＡ　＿ＸｂａＩ（配列番号２；５’−ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣ（終止コドンＴＡＡの下流に下線部ＸｂａＩサイトを導入）を用い、ＤＮＡ合成酵素は「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ」（商品名、東洋紡社）を使用して、ｈＬＦ　ｃＤＮＡを増幅した。
　得られたＤＮＡ断片に、Ａを付加し、「ＴＯＰＯ　ＴＡクローニングベクター」（商品名、インビトロジェン社）にクローニングした。その後、このベクターをＸｈｏＩとＸｂａＩで消化することにより、ｈＬＦ　ｃＤＮＡのＤＮＡ断片を切り出し、予めＸｈｏＩとＸｂａＩで消化したベクター「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ」（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にクローニングした。このベクターを、「ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ」と命名した。ｈＬＦ　ｃＤＮＡの塩基配列は、ジデオキシ法シークエンシングで確認した。ｐＢＳＩＩＬｆＡＬには、ｈＬＦ遺伝子全長がベクターのＸｈｏＩ及びＸｂａＩ制限酵素サイトに挟まれる形でクローン化されている。ｐＢＳＩＩＬｆＡＬの構造を図１（左図）に示す。
　上記で作製した、ｈＬＦ遺伝子全長を含むベクターｐＢＳＩＩＬｆＡＬを用いて、ｈＬＦ遺伝子３’末端側に存在するＥｃｏＲＩとＸｂａＩとの間にＢａｍＨＩサイトを導入したベクター、ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／Ｂａｍを作製した。合成オリゴヌクレオチドＥｃｏ＿ｈＬＦ＿Ｂａｍ−Ｓ（配列番号３；５’−ＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＴＣＣＴ−３’）及びＥｃｏ＿ｈＬＦ＿Ｂａｍ−Ａ（配列番号４；５’−ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧ−３’）を用意し、それぞれ１００μＭの濃度で滅菌水に溶解した。その後、以下の表１に示した試薬を混合して、サンプル溶液とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このサンプル溶液を７０℃に加熱後、ゆっくり室温まで冷却させることでアニーリングさせ、二本鎖ＤＮＡを形成させた（アニーリングオリゴ）。ＥｃｏＲＩとＸｂａＩとで完全消化したｐＢＳＩＩＬｆＡＬ（１０ｎｇ／μｌ）を用意し、以下の表２に示した試薬を混合して、１６℃で３０分間ライゲーションした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　このライゲーション溶液５μｌとコンピテントセルＴＯＰ１０　５０μｌとを混合し、氷上で３０分インキュベートした。その後、４２℃で４０秒間、コンピテントセルにヒートショックをかけ、氷上で２分間静置後、ＳＯＣ培地を１００μｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。１時間インキュベートしたサンプルを、アンピシリン入りＬＢ寒天培地に播き、３７℃で一晩培養した。翌日、得られたコロニーを１．５ｍｌのＬＢ液体培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン入り）中で３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、一晩、振とう培養した。
　プラスミドＤＮＡ抽出は、「ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ」（商品名、ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて行った。アニーリングオリゴとｐＢＳＩＩＬｆＡＬとのライゲーションは、アニーリングオリゴ近傍の塩基配列を解読することで確認した。作製したベクターを、ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／Ｂａｍと命名した（図１、右）。
　２．ヒンジ領域を含むｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質発現ベクターの構築
　２−１　ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦの構築
　ｈＬＦとヒトＩｇＧＦｃ（ｈＩｇＧＦｃ）との融合タンパク質（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）がヒンジ領域でジスルフィド（ｓ−ｓ）結合により二量体化した構造の融合タンパク質（ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）と表記することがある）を動物細胞にて発現させるための発現ベクターを構築した。
　ヒトＩｇＧＦｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列をもつ発現ベクター、ｐＴｅｕＩｇＧ（図２）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／ＢａｍのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターを、ｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦと命名した。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
　なお、ｐＴｅｕＩｇＧは、強力な発現プロモーターであるＳＲαの下流にヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域に対応するゲノムＤＮＡ配列を導入して構築した（Ｓａｔｏ，Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７１，６０３−６０８（２００３））。
　ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の安定発現細胞株構築のために、ＣＨＯ細胞の一種であるＤＨＦＲ欠損チャイニーズハムスター卵巣由来細胞（ＤＧ４４）を用いた。ＤＨＦＲとは、ジヒドロ葉酸還元酵素であり、核酸の生合成には必須である。ＤＨＦＲのアンタゴニストであるメトトレキサート（ＭＴＸ）の存在下で細胞を培養すると、ＤＨＦＲの産生が阻害される。その際、細胞は生き残るためにＤＨＦＲ遺伝子を増幅し、ＤＨＦＲ遺伝子の近傍に存在する遺伝子も増幅されるために、その遺伝子のタンパク質発現が増幅することが知られている。このようにして、目的とするタンパク質を高発現させることが可能である。
　ＤＧ４４細胞用発現ベクターには、インビトロジェン社製ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商品名）を使用した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＴ７プライマー結合部位からＴ３プライマー結合部位までの領域をＰＣＲ法で増幅して、ＴＡクローニング法でｐＯｐｔｉＶＥＣに連結することにより、ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＭＣ
Ｓを作製した（図４）。
　ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターを作製するために、ベクターｐＴｅｕＩｇＧ／ｈＬＦから、ｈＬＦ、ヒトＩｇＧＦｃ領域のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３のゲノム配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、ｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＭＣＳのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。このベクターをｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃと命名した（図５）。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
　ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）発現ベクターであるｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃがコードするヒトラクトフェリン（ｈＬＦ）／ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を、配列表の配列番号５に記載した。配列番号５において、それぞれ、アミノ酸番号１~７１１はｈＬＦ、７１２~７１４はスペーサー、７１５~７２９はヒンジ領域、７３０~８３９はＣＨ２ドメイン、８４０~９４６はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列である（図１７Ａ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ６０３２４．１．及びＡＡＡ０２９１４．１配列に基づく）。
　３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現及び精製
　３−１．ＤＧ４４細胞を宿主とするヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株の構築
　作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃをＤＧ４４細胞へ導入して、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）安定発現細胞株を樹立した。発現ベクターを効率的に細胞へ導入するために、ベクター２０μｇ分をＰｖｕＩで制限酵素処理して直鎖状にした。このサンプルにフェノール／クロロホルム１容量分を加え、ミキサー（Ｖｏｒｔｅｘ）で攪拌してタンパク質を除去した。１５０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を新しいチューブに移した。上清に１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム及び２．５容量の１００％エタノールを加え、１５０００ｒｐｍで２０分間遠心してベクターを沈殿させた。上清を除去したチューブに、７０％エタノールを１００μｌ加えてリンスした。その後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を捨て、１０分間風乾した。風乾したチューブに滅菌水１５μｌを加え、発現ベクターを懸濁した。ＰｖｕＩ処理した発現ベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩと命名した。
　作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩを用いてＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行った。ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｄＦｃ／ＰｖｕＩ　２０μｇ分を、「Ｆｒｅｅ　Ｓｔｙｌｅ　ＭＡＸ　Ｒｅａｇｅｎｔ」（商品名、インビトロジェン社）１５μｌ、「Ｏｐｔｉ　Ｐｒｏ　ＳＦＭ」（商品名、インビトロジェン社）１２００μｌと混合し、室温で１０分間静置して、トランスフェクション溶液とした。ＤＧ４４細胞（１５×１０６細胞）を培地（「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ＤＧ４４　ｍｅｄｉｕｍ」、インビトロジェン社）３０ｍｌに懸濁して、この中に予め用意したトランスフェクション溶液を混合して、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で４８時間培養した。その後、培地を「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ＤＧ４４　ｍｅｄｉｕｍ」から「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」（インビトロジェン社）に交換した。この培地はヒポキサンチンやチミジン不含の培地であり、ＤＨＦＲ欠損細胞は生育できない。一方、ＰｖｕＩで制限酵素処理した発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子をコードしているため、ＤＧ４４細胞の染色体に発現ベクターが組み込まれれば、細胞が生育可能となる。トランスフェクション後４８時間経過した細胞を、４００×ｇで５分間遠心して集め、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」３０ｍｌに懸濁した（３×１０６細胞／ｍｌ）。その後、培地交換を２日毎に行いながら、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で培養した。細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。
　その後、メトトレキサート（ＭＴＸ、和光純薬）による細胞内のゲノム増幅を行った。「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」で培養したＤＧ４４細胞の細胞数を計測し、１．２×１０７細胞分を４００×ｇで５分間遠心した。この細胞を、「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」３０ｍｌと１ｍＭ　ＭＴＸ　１．５μｌ（終濃度：０．０５μＭ）の混合培地に懸濁した。その後、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。その後は、ＭＴＸの濃度を０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭと段階的に上げて、同様の培養を行った。
　３−２．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現確認
　１．２×１０７細胞分の細胞を、各濃度（０、０．０５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ）のＭＴＸを含む「ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」に懸濁してＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で細胞密度が培養開始時の９０％以上になるまで培養した。その時点で４００×ｇで５分間遠心して細胞を沈殿させ、その上清を回収した。上清１５μｌに非還元の４×サンプル緩衝液（０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）を２ｍｌ、ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社）を０．８ｇ、グリセリン（Ｗａｋｏ社）を４ｍｌ混和し、純水で１０ｍｌにメスアップして調製）を５μｌ混合し、９５℃で５分間熱処理を行い、７．５％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。バンドの染色にはＣＢＢを用いた。
　結果を図６に示す。目的であるｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の分子量は、約２１０ｋＤａである。ＭＴＸ濃度１μＭから、矢印で示した約２１０ｋＤａ付近にバンドが見られ、ＭＴＸ濃度が上昇するにつれて、そのバンドは濃くなり、タンパク質の発現量が増加したことが確認できた。
　ＭＴＸ濃度４μＭ存在下で樹立した細胞株を、ＤＧ４４−ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）と命名した。
　３−３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の大量発現
　大量発現は、１７５ｃｍ２のＴフラスコ（グライナー社製、培地５０ｍｌ使用）、あるいはＮｕｎｃ社製トリプルフラスコ（培地２００ｍｌ使用）を用いた静置培養で行った。ヒンジ付加型融合タンパク質安定発現株は、無血清培地「Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ＣＤ　Ｏｐｔｉ　ＣＨＯ　ｍｅｄｉｕｍ」で継代培養した。タンパク質発現の際は、培地を「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉｕｍ」（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）＋４μＭ　メトトレ　キセート（ＭＴＸ）＋６０μｇ／ｍｌ　プロリン（以下「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ」という）に換え、細胞濃度１×１０６細胞／ｍｌで播き、３７℃、５％ＣＯ２で７日間培養した。７日後、細胞培養液を４００×ｇで５分間遠心することにより、上清と細胞とを分けた。細胞は、再びＨｙｂｒｉｄｏｍａ　ＳＦＭ　５０ｍｌに懸濁して、３７℃、５％ＣＯ２でさらに１週間培養することによりタンパク質を発現させた。上清は、８０００ｒｐｍで５分間再遠心し、得られた上清に最終濃度０．０２％アジ化ナトリウムを加え、４℃にて保存した。
　３−４．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の精製
　精製には、大量発現で得られた培地上清（最終濃度０．０２％アジ化ナトリウムを含む）をそのまま使用した。陽イオン交換担体である「ＭａｃｒｏＣａＰ　ＳＰ」（商品名、ＧＥヘルスケア社）４００μｌを「Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ」（商品名、バイオラッド社）に充填して、５カラム容量（ＣＶ）分の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化した。平衡化に使用した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）を捨てて、大量発現で得られた培地上清４ｍｌを加え、シーソーシェイカーで３０分間反応させた。反応後、溶液は素通り画分として回収した。「Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｃｏｌｕｍｎｓ」を、「ＵＶ　ＤＥＴＥＣＴＯＲ」（東京理化器械社、２８０ｎｍの吸光度を測定）、マイクロチューブポンプ（東京理化器械社）と接続し、ポンプの流速を１ｍｌ／ｍｉｎに設定し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）を流して担体を洗浄した。「ＵＶ　ＤＥＴＥＣＴＯＲ」の２８０ｎｍの吸光度が上昇し始めた時点から、排出液を回収した（Ｗａｓｈ画分）。この回収は２８０ｎｍの吸光度が０になるまで続けた。その後、溶液を０．２Ｍ　ＮａＣｌ＋１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．６）に換えて同様の操作を行った（０．２Ｍ　ＮａＣｌ溶出画分）。この一連の操作を、ＮａＣｌ濃度を０．１Ｍずつ上げながら１．０Ｍ　ＮａＣｌまで続けた。回収した各溶出液は、４℃にて保存した。
　各溶出画分１５μｌに非還元の４×サンプル緩衝液を５μｌ混合し、９５℃で５分間熱処理を行い、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。バンドの染色にはＣＢＢを用いた。
　その結果を、図８に示す。０．４Ｍ　ＮａＣｌの画分から目的タンパク質であるヒンジ付加型ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）が溶出していた。この結果から、「ＭａｃｒｏＣａＰ　ＳＰ」に結合したヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、０．３Ｍ　ＮａＣｌで洗浄して、１．０Ｍ　ＮａＣｌで溶出することにより効率よく回収できることがわかった。
　３−５．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮
　液量１ｍｌに対し、硫酸アンモニウムが２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％飽和になるように、それぞれ硫酸アンモニウム０．１１３ｇ、０．１７６ｇ、０．２４２ｇ、０．３１４ｇ、０．３９０ｇ、０．４７２ｇ、０．５６１ｇ、０．６５７ｇを微量電子天秤で量りとり、２．０ｍｌチューブに入れた。それぞれのチューブに、陽イオン交換担体で精製したＰＢＳに懸濁したヒンジ付加型ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）タンパク質溶液を１ｍｌずつ加え、硫酸アンモニウムが溶けるまで転倒混和した後、４℃で一晩静置した。その後、１５０００ｒｐｍ、３０分間の条件で遠心を行い、タンパク質を沈殿させた。上清を回収し、沈殿は１００μｌのＰＢＳに溶解した。ＰＢＳで溶かした各沈殿と回収した上清を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で調べた。
　その結果を図１０に示す。５０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿が認められた。さらに、沈殿が認められた５０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムの画分については、溶液中のタンパク質濃度を、既知濃度のＢＳＡをスタンダードとしてブラッドフォード法（プロテインアッセイ、バイオラッド社）で測定して、硫酸アンモニウム沈殿での回収率を算出した（ｎ＝５）。ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の場合は、分子量を用いてｈＬＦ換算濃度を算出した。具体的には、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の場合は、ｈＬＦの分子量が８０ｋＤａ（×２）、Ｆｃ部分の分子量は５０ｋＤａとして計算した。ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの場合は、ｈＬＦの分子量が８０ｋＤａ、Ｆｃ部分の分子量は２５ｋＤａとして計算した。各硫酸アンモニウム濃度とその回収率（％）を以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　７０％硫酸アンモニウムで回収率が最も高かった。硫酸アンモニウム沈殿後は、沈殿をＰＢＳに懸濁して、ＰＢＳに対して透析を行うことで、硫酸アンモニウムを除去した。
　４．生物学的活性測定
　４−１．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の鉄結合能の測定
　ラクトフェリンは分子量８万の非ヘム性の鉄結合性糖タンパク質で、Ｎローブ、Ｃローブと呼ばれる二つの領域からなり、炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）の存在下でタンパク質１分子当たり２個の鉄イオン（Ｆｅ３＋）を可逆的にキレート結合する能力を有する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４４，７８４−７８（１９９０））。ラクトフェリンの鉄結合能の測定は、以下のように行った。ホロ（ｈｏｌｏ）型ラクトフェリンから鉄イオン（Ｆｅ３＋）を遊離させ、アポ（ａｐｏ）型ラクトフェリンを調製する。次いで炭酸イオン（ＣＯ３ ２−）存在下で鉄イオン（Ｆｅ３＋）を付加させた鉄再結合ラクトフェリンを調製した。ａｐｏ型及び鉄再結合ラクトフェリンの鉄含量及びタンパク質濃度を測定し、鉄結合量の測定を行った。具体的には、ａｐｏ型ラクトフェリンは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ヒトＬＦ、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．１）で２４時間、さらに蒸留水で２４時間透析を行い、調製した。鉄再結合型ラクトフェリンは、ａｐｏ型ラクトフェリンを０．００１％クエン酸鉄アンモニウム、５０ｍＭ炭酸ナトリウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で２４時間透析を行った後、過剰の鉄イオンを除去するため、蒸留水、次いで５０ｍＭ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対し２４時間透析を行い、調製した。タンパク質に結合している鉄イオンを比色法で測定するため、血清鉄測定キット「Ｆｅ　Ｃ−テストワコー」（商品名、和光純薬）を用いた。鉄の結合能は、ブラッドフォード法で定量したｈＬＦタンパク質１ｍｇ（ヒトＩｇＧＦｃ融合タンパク質の場合は、分子量を用いて算出したｈＬＦ換算で１ｍｇ）あたりに結合している鉄の結合量として算出した。２回実験を行った結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦの鉄の結合活性を１００％とした場合、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、ほぼ１００％の活性を示した。
　４−２．ＣＤスペクトルを用いたヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性の検討
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦとヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）の熱安定性を、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルで解析した。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルとは、物質にある波長をあてた場合の右円偏光と左円偏光の吸収の差を測定する方法で、タンパク質の二次構造の有無や種類、含量を推定することが可能である。
　まず、ＰＢＳ（−）に０．１ｍｇ／ｍｌで懸濁したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を用意し、室温（約２０℃）で、波長２００ｎｍ~２５０ｎｍのＣＤスペクトルを測定した（日本分光のＪ−７２０使用）。
　その結果を、図１２に示す。組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）と、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）（パネルＣ）の二次構造には、大きな違いは認められなかった。
　次に、各タンパク質の熱安定性を調べた。タンパク質溶液の温度を低温から高温へ変化させながらＣＤスペクトルを測定すると、ある温度で［θ］が上昇し一定の値を取る。この現象は、熱によりタンパク質の変性が起きて、二次構造が変化することに起因している。熱安定性を観察する場合は、一般に測定する波長は２２５ｎｍ付近を用いる。ＰＢＳ（−）に０．１ｍｇ／ｍｌで懸濁したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、ヒンジ付加型
融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）を用意し、３０~９０℃まで１℃ずつ上昇させながら、波長２２５ｎｍのＣＤスペクトルを測定した（日本分光のＪ−７２０使用）。
　結果を図１３に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）は、６７℃付近でＣＤスペクトル値の大きな変化が観察された。一方、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）（パネルＣ）では、３０~９０℃まで加熱しても２２５ｎｍにおけるＣＤスペクトルに大きな変化は観察されなかった。
　以上より、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦと比較して、ヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、熱に対する安定性が向上していることが示された。構造的に安定になったヒンジ付加型融合タンパク質ｄ（ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ）は、インビボにおける血中安定性の向上も期待できると考えられる。
　４−３．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の安定性の検討
　３−４．で示した陽イオン交換担体「ＭａｃｒｏＣａｐ　ＳＰ」で精製後のヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質を、ＰＢＳに透析し、さらにＰＢＳで希釈することで３３６μｇ／ｍＬの濃度のサンプルを調製した。このサンプルを１．５ｍＬチューブに１００μＬ加えて、３７℃で３週間静置反応させた。反応０、１、２、３週間後のサンプルを３μＬとり、非還元の４×サンプル緩衝液を１μｌ混合し、９５℃、５分熱処理を行った。その後、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
　ＣＢＢ染色の結果を図１４に示す。図１４において、Ｍはマーカー、レーン１はｈＬＦ（１μｇ／レーン）、レーン２~５はそれぞれ０、１、２、３週間後のサンプルである。３７℃でも数週間は安定であるものの、時間経過と共に、＊で示したヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のバンドが薄くなり、分解物と思われる＊＊、＊＊＊のバンドが濃くなった。これは精製過程で混入したプロテアーゼにより分解したものと考えられる。なお、ヒンジ欠損型融合タンパク質（後述）では、このような分解は観察されなかった。
　４−４．ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解箇所の解析
　ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の分解箇所を特定するために、分解したバンドのＮ末端アミノ酸配列を解析した。上述した方法で、ヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（１２μｇ分）を３７℃で３週間静置反応させ、その後、分解したサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。泳動後、定法に従いタンパク質をＰＶＤＦ膜（ミリポア社）に転写した。ＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色した図を図１５−Ａに示す。図１５−Ａにおいて、Ｍはマーカー、レーン１はｈＬＦ（４μｇ）、レーン２~６はいずれも分解後のサンプル（各２μｇ／レーン）である。このＰＶＤＦ膜から約５０ｋＤａのバンド（矢印）を切り出し、脱色した。そのバンドのＮ末端アミノ酸配列を、ｐｒｏｃｉｓｅ　４９１ＨＴ（商品名、ＡＢＩ社）で解析した。得られたアミノ酸配列は、Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｘ−Ｐ（４アミノ酸目は解読不能）であり、その配列を調べたところ、配列表の配列番号５のアミノ酸番号７２２~７２６（ヒンジ領域内）に対応していた（図１５−Ｂ）。
実施例２：ヒトラクトフェリンとヒンジ領域を含まないヒトＩｇＧＦｃ領域との融合タンパク質（「ヒンジ欠損型」）の作製、生物活性及び血中安定性評価
　１．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質発現ベクターの構築
　上記で作製したベクターｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／Ｂａｍ（図１）を使用して、ｈＬＦとヒンジ領域を含まないｈＩｇＧＦｃとの融合タンパク質（ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を動物細胞にて発現させるための発現ベクターを構築した。
　ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターを作製するために、ヒトＩｇＧＦｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列をもつ発現ベクターｐｍＩｇＧ（図３）のＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩサイトに、ｐＢＳＩＩＬｆＡＬ／ＢａｍのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ断片をクローニングした。このベクターをｐｍＩｇＧ／ｈＬＦと命名した。各発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。
　なお、ｐｍＩｇＧは、以下のようにして構築した。前述したヒンジ付加型融合タンパク質発現ベクターであるｐＴｅｕＩｇＧのＢａｍＨＩ−ＸｂａＩに存在するヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３領域に対応するゲノムＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２とＣＨ３領域に対応するｃＤＮＡ配列に入れ替えて作製した。
　ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターを作製するために、ｐｍＩｇＧ／ｈＬＦのｈＬＦ、ヒトＩｇＧ　Ｆｃ領域のＣＨ２、ＣＨ３のｃＤＮＡ配列を含む領域をＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片として切り出し、上記で作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ−ＭＣＳ（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩサイトにクローニングした。このベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃと命名した（図５）。発現ベクターの作製は、上記記載の方法に準じた。ヒンジ欠損型融合タンパク質ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ発現ベクターｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃがコードするｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号６に記載した。配列番号６において、それぞれ、アミノ酸番号１~７１１はｈＬＦ、７１２~７１３はスペーサー、７１４~８２３はＣＨ２ドメイン、８２４~９３０はＣＨ３ドメインのアミノ酸配列である（図１７Ｂ：Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＢ６０３２４．１及びＡＡＡ０２９１４．１の配列に基づく）。
　２．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現及び精製
　２−１．ＤＧ４４細胞を宿主とするヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株の構築
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃをＤＧ４４細胞へ導入して、ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質安定発現細胞株を樹立した。ＰｖｕＩ処理した発現ベクターを、ｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃ／ＰｖｕＩと命名した。
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、作製したｐＯｐｔｉＶＥＣ／ｈＬＦ−ｍＦｃ／ＰｖｕＩを用いてＤＧ４４細胞へのトランスフェクションを行い、ＭＴＸの濃度を段階的に上げて、同様の培養を行った。
　２−２．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の発現確認
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で解析した。
　結果を図７に示す。目的であるｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃの分子量は、約１０５ｋＤａである。ＭＴＸ濃度０．５μＭから矢印で示した約１０５ｋＤａ付近にバンドが見られ、ＭＴＸ濃度が上昇するにつれて、そのバンドは濃くなり、タンパク質の発現量が増加したことが確認できた。
　ＭＴＸ濃度４μＭ存在下で樹立した細胞株を、ＤＧ４４−ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃと命名した。
　２−３．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の大量発現
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、細胞を継代培養し、融合タンパク質を大量発現させた。得られた上清を４℃にて保存した。
　２−４．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の精製
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、大量発現で得られた培地上清から融合タンパク質を精製した。
　その結果を、図９に示す。０．５Ｍから０．７Ｍ　ＮａＣｌで、目的タンパク質であるヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃが溶出した。この結果から、その後は「ＭａｃｒｏＣａＰ　ＳＰ」に結合したヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃは、０．４Ｍ　ＮａＣｌで洗浄して、１．０Ｍ　ＮａＣｌで溶出することにより効率よく回収できることがわかった。
　２−５．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿による濃縮
　ヒンジ付加型の場合と同様にして、融合タンパク質を硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＣＢＢ染色で調べた。
　その結果を図１１に示す。６０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムで沈殿が認められた。さらにｎ沈殿が認められた６０％から９０％の飽和硫酸アンモニウムの画分については、溶液中のタンパク質濃度をブラッドフォード法で測定して、硫酸アンモニウム沈殿での回収率を算出した（ｎ＝２）。各硫酸アンモニウム濃度とその回収率（％）を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　６０％硫酸アンモニウムで回収率が最も高かった。硫酸アンモニウム沈殿後は、沈殿をＰＢＳに懸濁して、ＰＢＳに対して透析を行うことで、硫酸アンモニウムを除去した。
　３．生物的活性測定
　３−１．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の鉄結合能の測定
　ラクトフェリンの鉄結合能の測定は、ヒンジ付加型の場合と同様にして行った。２回実験を行った結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦの鉄の結合活性を１００％とした場合、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は１００％の活性を示した。
　３−２．ＣＤスペクトルを用いたヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性の検討
　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦとヒンジ付加型、及びヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の熱安定性を、ヒンジ付加型の場合と同様にしてＣＤスペクトルで解析した。その結果を、図１２に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）と、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（パネルＢ）の二次構造には、大きな違いは認められなかった。
　次に、ヒンジ付加型の場合と同様にして、各タンパク質の熱安定性を調べた。結果を図１３に示す。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（パネルＡ）は、６７℃付近でＣＤスペクトル値の大きな変化が観察されたのに対し、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質（パネルＢ）では、３０~９０℃まで加熱しても２２５ｎｍにおけるＣＤスペクトルに大きな変化は観察されなかった。
　以上より、ｈＬＦと比較して、ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質は熱に対する安定性が向上していることが示され、インビボにおける血中安定性の向上も期待できると考えられる。
　３−３．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のラットを用いた血中安定性の検討
　８週齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（雄）６頭に、ペントバルビタールナトリウムによる麻酔下にて、外頸静脈に採血用カニューレを留置した。大腿静脈内注射によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ（１ｍｇ／ｋｇ体重で投与）及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）（ｈＬＦ換算で１ｍｇ／ｋｇ体重で投与）を投与した。投与前及び投与後５、１０、１５、３０、６０、１２０、１８０、２４０分後に外頸静脈に留置したカニューレから採血し、血漿中のｈＬＦ濃度はＥＬＩＳＡ（「ＡｓｓａｙＭａｘ　Ｈｕｍａｎ　Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ」、Ａｓｓａｙｐｒｏ社製）により測定した。なお、予備検討により、採血時に使用した抗凝固剤であるＥＤＴＡ、及び血漿は、このＥＬＩＳＡ測定に影響を及ぼさないことを確認している。また、使用したＥＬＩＳＡキットは、ビオチン化抗ヒトラクトフェリン抗体（１次抗体）とペルオキシダーゼ標識ストレプトアジビンで構成されている。したがって、２次抗体を使用する一般的なＥＬＩＳＡで問題となる２次抗体とヒンジ欠損型（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のＦｃ領域との交差反応を懸念する必要がない。
　まず、ブラッドフォード法で濃度既知であるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を用いて、検量線を作成した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦは０．４７~７．５ｎｇ／ｍｌで、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は０．２３５~３０．０ｎｇ／ｍｌで、それぞれ直線性が得られたので、この範囲に測定値が入るように各血漿サンプルを希釈してタンパク質濃度を測定した。
　その結果を、図１６に示す。投与前はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群ともに血中からＬＦは検出されなかった。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ投与群は投与後６０分後には血中からほぼクリアランスされたが、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群は２４０分後においても検出された。
　統計解析ソフトウエア「ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　４」（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて、血中半減期と時間曲線下面積（ａｒｅａ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）を算出した。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦ投与群の半減期は１２．６分であるのに対し、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群は６７．７分と約５．４倍に延長した。ＡＵＣについては、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）投与群がｈＬＦ投与群の約７．４倍に増加していた。以上より、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の組換え型ｈＬＦと比較して、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は血中安定性の著しい向上を示した。
　３−４．ヒンジ欠損型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質のインビトロでのプロテアーゼ耐性試験
　ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）を、７５％ウシ血清／ＰＢＳ中で、０．２μｇ／μｌの濃度で長期間３７℃で反応させた。０、１４、２１、３８、５５日後にサンプルを採取して、抗ｈＬＦ抗体を用いたイムノブロッティングにより残存するＬＦのサイズ及び量を検出した。
　その結果、５５日間までの保存期間中、０日と比較してほとんど分解を受けずに当初の分子量を維持し、検出量も減少していなかった（図１８）。したがって、本発明の融合タンパク質は、血中でのプロテアーゼによる分解に対し、十分な耐性を有する。
実施例３：ヒトラクトフェリンとヒトＩｇＧＦｃ領域の融合タンパク質（「ヒンジ欠損型」）のヒト小腸上皮様細胞への取り込み評価及びキモトリプシン耐性評価
　１．ヒト小腸上皮様細胞Ｃａｃｏ２への取り込み評価
　ＬＦは腸管から取り込まれて胸管リンパに移行することが知られている。そこで、本研究で作製したヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）がこの経路より取り込まれるかを、ヒト小腸上皮様細胞Ｃａｃｏ２細胞を用いて確認した。
　ｈＬＦとヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、蛍光プローブであるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８で標識した。１ｍｇのＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８にＤＭＳＯ　１００μｌを加え、その後、１Ｍ　ＮａＨＣＯ３を加えた各タンパク質とＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８をモル比１：１０で混合して、室温で、１ｈ反応させた。反応後、反応液を１×ＰＢＳ（−）に対して２４時間透析を行い、未標識Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８を除去した。
　Ｃａｃｏ−２細胞を１２ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに細胞濃度　５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように撒き込み、３７℃，５％　ＣＯ２で１週間培養（２日おきに培地交換）した。Ｃａｃｏ−２細胞にＰＢＳ（−）を１ｍｌ／ｗｅｌｌ加えて、３回洗浄を行い、培地成分を完全に取り除いた。次に、Ａｌｅｘａ標識済みの各タンパク質を１５μｇ／ｗｅｌｌ加えて、１ｈｒ反応させた。１ｈｒ後、Ａｌｅｘａ標識済みの各タンパク質を取り除き、ｃｏｌｄ　ＰＢＳ（−）を１ｍｌ／ｗｅｌｌ加えて、１回洗浄を行った。洗浄後、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡを２５０μｌ／ｗｅｌｌ加えて、３７℃条件下で５ｍｉｎ反応させた。５ｍｉｎ後、細胞をｔｕｂｅに全量回収して、遠心機を用いて、２００×ｇ，２ｍｉｎ，４℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、ｃｏｌｄ　ＰＢＳ（−）を１ｍｌ／ｔｕｂｅ加えて、軽く懸濁をして、２００×ｇ，２ｍｉｎ，４℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｔｕｂｅ加えて、軽く懸濁をして、室温で１５ｍｉｎ反応させた。１５ｍｉｎ後、２００×ｇ，２ｍｉｎ，４℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、１μｇ／ｍｌビスベンズイミド／ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｔｕｂｅ加えて、軽く懸濁をして、室温で１５ｍｉｎ反応させた（核染色）。１５ｍｉｎ後、２００×ｇ，２ｍｉｎ，４℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、ｃｏｌｄ　ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｔｕｂｅ加えて、軽く懸濁をした。懸濁後、２００×ｇ，２ｍｉｎ，４℃で遠心を行った。遠心後、上清液を取り除き、ｃｏｌｄ　ＰＢＳ（−）を２００μｌ／ｔｕｂｅ加えて、軽く懸濁をして、全量を８ｗｅｌｌ　ｃｈａｍｂｅｒ　ｐｌａｔｅに移した。その後、共焦点レーザースキャン顕微鏡ＬＳＭ５１０で取り込みの蛍光を観察した。
　その結果、ｈＬＦ及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は４℃条件下ではＣａｃｏ２細胞へ取り込まれないが（図１９Ａ）、３７℃条件下ではＣａｃｏ２細胞へ取り込まれていることが確認された（図１９Ｂ）。また３７℃における取り込みは、ＮａＮ３（図１９Ｃ）、および過剰量の未標識ウシラクトフェリン（ｂＬＦ）（図１９Ｄ）で阻害されたため、この細胞内取り込みはレセプター介在性であり、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はＬＦの取り込みルートで細胞内に取り込まれることが確認された。すなわち、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体又はアルブミン受容体のいずれか１つ以上の受容体を介して取り込まれるものと考えられる。
　２．ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシン消化耐性評価
　本実験で用いたＢｕｆｆｅｒは、表７の通り調製し、その後ｐＨを７．４に調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　ｈＬＦやヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は１ｍｇ／ｍｌとなるように本Ｂｕｆｆｅｒにサスペンドした。
［消化酵素耐性試験］
　１５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ　ｈＬＦ、あるいはヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）をＢｕｆｆｅｒ　１２０μｌと混合して、３７℃で５分間静置した。その後、１６．７μｇ／ｍｌのキモトリプシン溶液３０μｌを加え、３７℃で静置反応した。経時的に反応サンプル３６μｌを回収し、あらかじめ用意しておいたＳａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、４％　ＳＤＳ、２０％　Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ＢＰＢ少量）１２μｌに加え、消化反応を停止させた。その後、反応液は１０％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動後（１５μｌ／レーン使用）、ＣＢＢ染色した。
　左から順に分子量マーカー、ｈＬＦのキモトリプシンを加えずに３７℃で静置反応させたサンプル、ｈＬＦのキモトリプシンを加えて３７℃静置反応させたサンプル、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンを加えずに３７℃静置反応させたサンプル、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンを加えて３７℃静置反応させたサンプルの泳動結果を図２０に示す。
　各バンドの濃さをＩｍａｇｅＪにより解析した。キモトリプシンを加えないバンドの濃さの平均値を１００％としてグラフ化した（図２１）。ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はほとんど分解されなかったが、コントロールであるｈＬＦは３０秒で分解がおこり、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）のキモトリプシンに対する消化耐性が示された。
　また、表７に示すＢｕｆｆｅｒに溶解したｈＬＦ及びヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）をゲルカラムクロマトグラフィー分析したところヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）はホモダイマーとして存在することが分かった（図２２）。
　図２２パネルＢは溶出時間とタンパク分子量の相関性を示すグラフである。クロマトグラフ（図２２パネルＡ）で、青曲線（「ｈＬＦ／ｄｈＩｇＧＦｃ」）は２量体を形成するための領域（ヒンジ領域）を含むヒンジ付加型ｈＬＦ／ｈＩｇＧＦｃ融合タンパク質の結果である。他方、緑曲線（「ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ」）はヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）の結果である。ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ及びｈＬＦ／ｄｈＩｇＧＦｃをゲルろ過すると、両者の溶出時間にほとんど差がないことが判明した。このことから、ヒンジ欠損型融合タンパク質（ｈＬＦ／ｍｈＩｇＧＦｃ）は、溶液中ではダイマーを形成していることが示された。
　本発明は、改良された特性を有するラクトフェリン融合タンパク質、その用途及びその製造方法を提供する。

Claims (15)

  1. 　ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドとラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチドとの融合タンパク質であって、
    　（ＬＦ−ｓ−Ｙ）ｎ　又は　（Ｙ−ｓ−ＬＦ）ｎ
    　〔式中、ＬＦはラクトフェリン又はラクトフェリンの生物活性断片もしくはペプチド、ＹはＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチド、ｓは０~１０個の任意のアミノ酸の配列、ｎは１~１０の整数を表す〕
    で表される融合タンパク質、又はその改変体。
  2. 　ＦｃＲｎ結合領域を含むタンパク質又はペプチドが、ＩｇＧ、ＩｇＧの重鎖、ＩｇＧの重鎖Ｆｃ領域、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメイン、アルブミン又はアルブミンのＦｃＲｎ結合領域のいずれかを含む、請求項１記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  3. 　融合タンパク質が、単量体又は二量体（ｎ＝１又は２）である、請求項１又は２記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  4. 　融合タンパク質が、単量体である、請求項１又は２記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  5. 　融合タンパク質が、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンの５０％以上の鉄キレート能を保持している、請求項１~４のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  6. 　融合タンパク質は、ラクトフェリン受容体、ＩｇＧ受容体及びアルブミン受容体からなる群より選択される少なくとも１つの受容体を介して取り込まれるものである、請求項１~５のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  7. 　融合タンパク質は、天然又は遺伝子組換え型ラクトフェリンと比べてキモトリプシン耐性が向上したものである、請求項１~６のいずれか１項記載の融合タンパク質、又はその改変体。
  8. 　請求項１~７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体をコードする核酸分子。
  9. 　請求項８記載の核酸分子を含む発現ベクター。
  10. 　請求項９記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  11. 　請求項８記載の核酸分子を含む非ヒト遺伝子組換え動物。
  12. 　請求項８記載の核酸分子を含む遺伝子組換え植物。
  13. 　請求項１~７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体を含む、ラクトフェリンによって改善される疾患の治療剤。
  14. 　請求項１~７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体及び担体を含む、医薬品組成物。
  15. 　請求項１~７のいずれか１項記載の融合タンパク質又はその改変体の製造方法であって、この融合タンパク質又はその改変体をコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養して融合タンパク質を発現させ、この宿主細胞又はその培地から融合タンパク質又はその改変体を回収することを含む方法。
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