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WO2013118839A1 - 酸化ｌｄｌ阻害剤 - Google Patents

酸化ｌｄｌ阻害剤 Download PDF

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Publication number
WO2013118839A1
WO2013118839A1 PCT/JP2013/052939 JP2013052939W WO2013118839A1 WO 2013118839 A1 WO2013118839 A1 WO 2013118839A1 JP 2013052939 W JP2013052939 W JP 2013052939W WO 2013118839 A1 WO2013118839 A1 WO 2013118839A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
del
oxidized ldl
ldl
cells
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/052939
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
達也 沢村
明美 垣野
Original Assignee
独立行政法人国立循環器病研究センター
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 独立行政法人国立循環器病研究センター filed Critical 独立行政法人国立循環器病研究センター
Priority to CN201380008513.0A priority Critical patent/CN104105498A/zh
Priority to US14/376,592 priority patent/US20140378659A1/en
Priority to EP13747103.3A priority patent/EP2821074A4/en
Priority to JP2013557577A priority patent/JP5884105B2/ja
Publication of WO2013118839A1 publication Critical patent/WO2013118839A1/ja
Priority to US14/820,259 priority patent/US20150335710A1/en

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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the present invention relates to oxidized LDL inhibition that can specifically bind to (i) oxidized LDL, (ii) inhibit the uptake of oxidized LDL into cells, and (iii) suppress oxidized LDL-dependent cellular reactions. It relates to the agent.
  • the oxidized LDL inhibitor according to the present invention acts by targeting oxidized LDL, and can suppress the interaction between oxidized LDL and its receptor.
  • Oxidized LDL produced by oxidation of low-density lipoprotein (hereinafter referred to as “LDL”) is known to function in an accelerated manner against arteriosclerosis, and by reducing the amount of oxidized LDL in the blood, Arteriosclerosis is exerted.
  • LDL low-density lipoprotein
  • an arteriosclerosis preventive agent containing a pine bark extract containing proanthocyanidins in a proportion of less than 95% by weight in terms of dry weight as an active ingredient is disclosed (for example, see Patent Document 1).
  • the pine bark extract has a high lipid oxidation inhibitory effect in blood vessels, and therefore, the blood level of oxidized LDL can be reduced by taking the pine bark extract.
  • LOX-1 lectin-like oxidized LDL receptor
  • LOX-1 Lectin-likeioxidized low-density lipoproteininceptor-1
  • LOX-1 has been identified as an oxidized LDL receptor for vascular endothelial cells, but is now known as a factor that promotes cardiovascular diseases such as inflammation, arteriosclerosis, thrombus, myocardial infarction, and vascular restenosis after catheter treatment. It has been. That is, an anti-arteriosclerotic effect can also be obtained by suppressing the binding of oxidized LDL to LOX-1 and the incorporation into vascular endothelial cells.
  • a composition having a LOX-1 antagonistic action which contains a plant extract of bracken belonging to the mosquito family as an active ingredient (for example, refer to Patent Document 2).
  • an arteriosclerosis inhibitor having a LOX-1 antagonistic action see, for example, Patent Document 3
  • a lectin-like oxidized LDL receptor-inhibiting pharmaceutical for example, see Patent Document 4
  • procyanidins of a monomer or higher as an active ingredient is known.
  • Del-1 Developmental endothelial locus-1
  • PS phosphatidylserine
  • Del-1 promotes angiogenesis (for example, see Non-Patent Document 3).
  • Del-1 suppresses adhesion between leukocytes and endothelial cells (anti-inflammatory action) (for example, see Non-Patent Document 1).
  • Del-1 expression is induced in damaged blood vessels and hypoxia (see, for example, Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Japanese Published Patent Publication Japanese Patent Laid-Open No. 2005-23032 (Publication Date: January 27, 2005)” Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open No. 2007-297381 (Publication Date: November 15, 2007)” Japanese Patent Publication “Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2007-320956 (Publication Date: December 13, 2007)” Japanese Published Patent Publication “Japanese Unexamined Patent Publication No. 2011-6326 (Publication Date: January 13, 2011)”
  • Del1 mediates VSMC adhesion, migration, and proliferation through interaction with integrin alpha (v) beta (3).
  • oxidized LDL receptors other than LOX-1 include SR-A (scavenger receptor-A I / II: scavenger receptor A), CD36, SR-BI (scavenger receptor class B type 1) and the like.
  • Patent Documents 2 to 4 are antagonists of LOX-1, they are effective for the intracellular uptake of oxidized LDL via LOX-1, but they are mediated through other oxidized LDL receptors. It is considered that this may not always be effective for the intracellular uptake of oxidized LDL. For this reason, the drugs described in Patent Documents 2-4 alone may not be an effective treatment means for arteriosclerotic diseases.
  • the present invention aims to find an oxidized LDL inhibitor that acts on the oxidized LDL itself as a target, not an antagonist targeting the oxidized LDL receptor, and can inhibit the binding between the oxidized LDL receptor and oxidized LDL. It was aimed.
  • the inventors of the present invention have made extensive studies to solve the above problems, and as a result, Del-1, which is a protein secreted in vascular endothelial cells and macrophages, specifically binds to oxidized LDL, The inventors have found that ii) inhibition of cellular uptake of oxidized LDL into cells and (iii) inhibition of cellular reactions dependent on oxidized LDL have led to the completion of the present invention. That is, the present invention includes the following inventions.
  • the oxidized LDL inhibitor according to the present invention is characterized by containing Del-1 (Developmental endothelial locus-1) protein as an active ingredient in order to solve the above-mentioned problems.
  • Del-1 Developmental endothelial locus-1 protein
  • the Del-1 protein is (A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or (B) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, it may be a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and having oxidized LDL inhibitory activity .
  • the present invention includes a pharmaceutical composition characterized by containing the oxidized LDL inhibitor according to the present invention.
  • the oxidized LDL inhibitor of the present invention does not target the oxidized LDL receptor like a conventionally known drug, but binds oxidized LDL itself as a target and inhibits the cellular uptake of oxidized LDL. For this reason, it is thought that the oxidized LDL inhibitor of the present invention can inhibit the intracellular uptake of all oxidized LDL performed through the oxidized LDL receptor. Therefore, the oxidized LDL inhibitor of the present invention can be an effective treatment or preventive means for arteriosclerotic diseases caused by oxidized LDL.
  • an oxidized LDL-dependent cell reaction for example, activation of NF ⁇ B and SRF
  • an oxidized LDL-dependent cell reaction for example, activation of NF ⁇ B and SRF
  • FIG. 7 shows the results of evaluating the influence of Del-1 on the uptake of oxidized LDL or LDL into LDL receptor-expressing cells or LOX-1 expressing cells
  • FIG. 2 is a fluorescence microscopic image of cells incorporating DiI-labeled LDL in the absence of 1, and (b) shows DiI-labeled LDL against LDL receptor-expressing cells in the presence of Del-1 (30 ⁇ g / ml).
  • C is a fluorescence microscopic image of a cell in which DiI-labeled oxidized LDL was incorporated in the absence of Del-1 with respect to a LOX-1 expressing cell
  • (d) ) Is a fluorescence microscopic image of a cell incorporating DiI-labeled oxidized LDL in the presence of Del-1 (30 ⁇ g / ml) against LOX-1 expressing cells, and (e) is against LDL receptor expressing cells.
  • (C) and (d) are lipid-stained images (Oil Red O-stained images) of the aortic root of 24-week-old Del-1 overexpressing mice (denoted as “Del-1-Tg” in the figure)
  • (E) is a graph showing the result of quantifying the lipid deposition area observed in the base of the aorta.
  • the oxidized LDL inhibitor of the present invention is characterized by containing Del-1 (Developmental endothelial locus-1) protein as an active ingredient.
  • Del-1 is known as a protein that is expressed and secreted in human vascular endothelial cells and macrophages (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • FIG. 1 shows the structure of Del-1 and its amino acid sequence. Del-1 is also referred to as “Homo sapiens EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3 (EDIL3), and its amino acid sequence and base sequence are disclosed in Genbank as accession number: NM005711. Del-l The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • Del-1 is a protein consisting of 480 amino acids and is divided into S, E1, E2, E3, C1, and C2 domains from the N-terminal side.
  • S means Signal peptide
  • E means EGF-like domain
  • C means factor 5/8 C-terminal domain.
  • C1 and C2 domains on the C-terminal side bind to phosphatidylserine (PS) and promote apoptotic cell phagocytosis of macrophages (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • PS phosphatidylserine
  • an action of Del-1 an action of promoting angiogenesis (for example, see Non-Patent Document 3) and an anti-inflammatory action (for example, see Non-Patent Document 1) are known.
  • E1 of Del-1 has an RGD sequence (RGD peptide) composed of arginine-glycine-aspartic acid.
  • the RGD sequence is an amino acid sequence common to proteins constituting a matrix (ECM) in many cells, and is known to be closely related to cell adhesion.
  • the present inventors can specifically bind (i) oxidized LDL, (ii) inhibit the incorporation of oxidized LDL into cells, and (iii) suppress oxidized LDL-dependent cellular reactions.
  • a novel action of Del-1 was found and an oxidized LDL inhibitor containing Del-1 as an active ingredient was completed.
  • “Del-1 protein” refers not only to (a) Del-1 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but also (b) one amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or It is meant to include a Del-1 variant having an amino acid sequence in which several amino acids are substituted, deleted, inserted or added, and having oxidized LDL inhibitory activity.
  • the “Del-1 protein” includes the partial proteins (a) and (b) as long as they have oxidized LDL inhibitory activity. Further, the “Del-1 protein” is not limited to human-derived Del-1 shown in SEQ ID NO: 1, but also includes other mammalian-derived Del-1.
  • “Del-1 protein” includes a Del-1-like protein having an amino acid sequence other than the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having the same activity as “Del-1”.
  • Del-1 means a protein consisting of the amino acid represented by SEQ ID NO: 1, and “Del-1 protein” refers to Del-1, non-human Del-1, It is meant to include Del-1 mutants, Del-1 partial proteins, and Del-1-like proteins.
  • “one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added” means substitution, deletion, or insertion by a known mutant polypeptide production method such as site-directed mutagenesis. Or the number of amino acids that can be added (preferably 10 or less, more preferably 7 or less, most preferably 5 or less) is substituted, deleted, inserted or added.
  • a protein mutant is not limited to a protein having a mutation artificially introduced by a known mutant polypeptide production method, but is a product obtained by isolating and purifying a naturally occurring mutant protein. Also good.
  • the Del-1 protein in the present invention may contain an additional polypeptide.
  • additional polypeptide include epitope-tagged polypeptides such as His, Myc, and Flag.
  • the Del-1 protein in the present invention is a state in which a polynucleotide encoding the Del-1 protein (referred to as “Del-1 gene”) is introduced into a host cell and the protein is expressed in the cell. It may also be a case where it is isolated and purified from cells, tissues or the like.
  • the Del-1 protein may be chemically synthesized.
  • “having oxidized LDL inhibitory activity” means that the Del-1 mutant (i) specifically binds to oxidized LDL, (ii) inhibits uptake of oxidized LDL into cells, and (iii) It means having an activity capable of suppressing the cell reaction dependent on oxidized LDL. Whether the Del-1 mutant has an oxidized LDL inhibitory activity can be confirmed by the method described in the Examples.
  • the Del-1 mutant specifically binds to oxidized LDL, (i) it can specifically bind to oxidized LDL. It can be judged. If the intracellular uptake of oxidized LDL in the presence of the Del-1 mutant was significantly reduced by the method described in Example 2, compared to that in the absence of the Del-1 mutant, Del It can be judged that the -1 mutant can inhibit (ii) uptake of oxidized LDL into cells.
  • the Del can be determined that the -1 mutant can suppress (iii) oxidized LDL-dependent cell reaction. Whether the data in the presence of the Del-1 mutant is significantly reduced relative to the data in the absence of the Del-1 mutant is determined by, for example, performing a Student's T-test. Can be determined to be “significantly reduced” if the risk is significantly reduced compared to the latter data (risk rate of less than 5%).
  • the amount of Del-1 protein contained in the oxidized LDL inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to exert the effect of oxidized LDL inhibitory activity. It can be appropriately determined in consideration of the degree of purification, dosage form, intake method and the like. For example, in the present invention, since a sufficient oxidized LDL inhibitory activity can be exhibited, the content ratio of the Del-1 protein is preferably 50% (w / w) or more of the oxidized LDL inhibitor, % (W / w) or more is more preferable, and 100% (w / w) is more preferable.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is characterized by containing the above-described oxidized LDL inhibitor of the present invention. According to the pharmaceutical composition of the present invention, it is possible to inhibit the uptake of oxidized LDL into cells and also inhibit cellular reactions dependent on oxidized LDL, so that various diseases caused by oxidized LDL are caused. In particular, it is expected to be effective in treating or preventing arteriosclerotic diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention further contains other components (for example, pharmaceutically acceptable carriers and the like) other than the oxidative LDL inhibitor that are pharmaceutically acceptable, as long as the oxidative LDL inhibitory activity is not impaired. May be.
  • the term “pharmaceutically acceptable carrier” (hereinafter, also simply referred to as “carrier”) is used for the purpose of assisting prescription when producing a pharmaceutical or an agricultural chemical such as animal medicine. A substance that does not have a harmful effect on active ingredients. Furthermore, it is intended that there is no toxicity in an individual who has received the pharmaceutical composition according to the present invention and that the carrier itself does not induce the production of harmful antibodies.
  • various organic or inorganic carrier substances that can be used as a preparation material can be used, and can be appropriately selected according to the administration form and dosage form of a pharmaceutical composition described later.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, xylitol, sorbitol, erythritol, starch, crystalline cellulose and the like, but are particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field. It is not something.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, wax, talc, colloidal silica and the like, but are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • binder examples include pregelatinized starch, methylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, trehalose, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc. If it is normally used, it will not specifically limit.
  • disintegrant examples include starch, carboxymethylcellulose, low-substituted hydroxypropylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethylstarch sodium, etc., which are usually used in the pharmaceutical field. If it is, it will not specifically limit.
  • solvent examples include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, tricaprylin and the like, but are particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field. is not.
  • dissolution aid examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like. However, it is not particularly limited as long as it is usually used in the pharmaceutical field.
  • surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol
  • hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and hydroxypropylcellulose, but are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • Examples of the “isotonic agent” include sodium chloride, glycerin, D-mannitol and the like, but are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • buffering agent examples include buffers such as phosphates, acetates, carbonates, citrates and the like, but are particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field. is not.
  • analgesic agent examples include benzyl alcohol and the like, but are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • preservative examples include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid, and the like, but are particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field. Is not to be done.
  • antioxidant examples include sulfite and ascorbic acid, but are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • the stabilizer and flavoring agent are not particularly limited as long as they are usually used in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered orally or parenterally, intravenously, rectally, intraperitoneally, intramuscularly or subcutaneously. Alternatively, it can be administered by an appropriate administration route depending on the preparation form. Especially, it is preferable that the composition concerning this invention is orally administered from the reason that administration is easy.
  • parenteral refers to modes of administration including intraventricular, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous, and intraarticular injection and infusion.
  • oral preparation examples of the dosage form of such a pharmaceutical composition
  • examples of the dosage form of such a pharmaceutical composition include powders, granules, tablets, liposomes, and capsules. (Including soft capsules and microcapsules), solid preparations such as powders, and liquid preparations such as syrups.
  • liquid preparation is produced by a method usually used in the pharmaceutical field using, for example, water; an organic solvent such as glycerol, glycol, polyethylene glycol, etc .; a mixture of these organic solvents and water as the carrier. be able to.
  • the liquid preparation may further contain a solubilizing agent, a buffer, a tonicity agent, a stabilizer and the like.
  • solid preparation can be produced by a method usually used in the pharmaceutical field using, for example, an excipient, a lubricant, a binder, a disintegrant, a stabilizer, a flavoring agent and the like as the carrier. it can.
  • lubricants When preparing such oral preparations, lubricants, fluidity promoters, colorants, fragrances and the like may be further blended depending on the purpose.
  • parenteral agent examples of the dosage form of such a pharmaceutical composition
  • examples of the dosage form of such a pharmaceutical composition include injections, suppositories, and pellets. , Drops and the like.
  • a parenteral agent is prepared by converting a pharmaceutical composition according to the present invention into a diluent (eg, distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, Soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and can be prepared by further adding bactericides, stabilizers, tonicity agents, soothing agents, etc., depending on the purpose. .
  • a diluent eg, distilled water for injection, physiological saline, aqueous glucose solution, vegetable oil for injection, sesame oil, peanut oil, Soybean oil, corn oil, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.
  • a sustained-release preparation can be obtained by a technique usually used in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered alone or in combination with other drugs.
  • a method of administration in combination for example, it may be administered simultaneously as a mixture with other drugs, may be administered simultaneously or concurrently as a drug different from other drugs, or may be performed over time.
  • the present invention is not limited to this.
  • the number of times the pharmaceutical composition according to the present invention is administered per day is not particularly limited. As long as the dose of the oxidized LDL inhibitor of the present invention is within the required dose range per day, the dose may be once per day, or may be divided into multiple doses. Good.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be applied not only to humans but also to mammals other than humans (for example, mice, rats, rabbits, dogs, cats, cows, horses, pigs, monkeys, etc.). This is easily understood by those skilled in the art.
  • the amount of the oxidized LDL inhibitor (or Del-1 protein) in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount sufficient to exert the effect of the oxidized LDL inhibitory activity, It can be appropriately determined in consideration of the degree of purification, dosage form, or intake method of Del-1 protein, the sex, age, weight, health status, etc. of the subject.
  • the Del-1 protein is added to the pharmaceutical composition of the present invention, for example, so that the intake amount is 10 to 3000 mg, preferably 150 to 1000 mg per day for an adult as a dry weight. It can be included.
  • Example 1 Evaluation of binding between Del-1 and oxidized LDL by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Method) (1) Del-1 Human-derived Del-1 used for the experiment was purchased from R & D. Del-1 is a recombinant protein with a His tag added to the C-terminal side, and is expressed in CHO cells and purified.
  • LDL Plasma was separated and collected from blood collected from a healthy person into a blood collection tube to which an ACD (acid-citrate-dextrose) -containing buffer was added. Potassium bromide was added to the obtained plasma to adjust the specific gravity to 1.019, and then centrifuged at 58,000 rpm for 20 hours. The lower layer was collected and the specific gravity was adjusted to 1.063 with potassium bromide, and then centrifuged at 58,000 rpm for 20 hours. As the ultracentrifuge, L-80 manufactured by Beckman was used.
  • ACD acid-citrate-dextrose
  • the collected upper layer was dialyzed with PBS (-) as an external solution (exchanging the external solution 4 times) using a dialysis membrane (Slid-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10 K MWCO, manufactured by Pierce) to obtain purified human LDL. It was.
  • FIG. 2A is a conceptual diagram illustrating the principle of detection of Del-1 bound to LDL or oxidized LDL by ELISA.
  • FIG. 2 (b) shows the results of detection of Del-1 bound to LDL or oxidized LDL by ELISA.
  • FIG. 2 (b) confirmed that Del-1 specifically bound to oxidized LDL at concentrations of 1, 3, and 10 ⁇ g / ml. On the other hand, specific binding of Del-1 to LDL was not observed.
  • DiI-labeled LDL and DiI-labeled oxidized LDL are sometimes referred to as “DiI-LDL” and “DiI-oxLDL”, respectively.
  • LOX-1 expression vector pcDNA6.2-human LOX-1-V5
  • SR-A expression vector pcDNA6.2-human SR-A-V5
  • CD36 expression vector pcDNA6.2-human CD36-V5
  • SR-BI expression vector pcDNA6.2-human SR-BI-V5
  • LDL receptor (LDLR) expression vector are human LOX-1 cDNA (Genbank accession number: NM002543), human SR-A cDNA (Genbank Accession number: NM002445), human CD36 cDNA (Genbank accession number: NM000072), human SR-BI cDNA (Genbank accession number: NM005505) and human LDLR cDNA (Genbank accession number: NM000527)
  • human cDNA library Were cloned into a mammalian expression vector pcDNA6.2 / V5 / GW / D-TOPO (Invitrogen) to prepare expression vectors for each receptor.
  • HUVEC Human umbilical vein endothelial cells: normal human umbilical vein endothelial cells
  • THP-1 human monocytic leukemia cell line
  • RPMI 1940 medium Gibco B bovine serum containing 20 ⁇ M 2-Mercaptoethanol containing 10% FBS
  • the cells were cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • cells cultured for 72 hours in the presence of 100 nM PMA (Phorbol 12 Myristate 13 Acetate) and induced to differentiate like macrophages were used.
  • FIG. 3 (a) is a fluorescence microscopic image of a cell in which DiI-labeled LDL was incorporated in the absence of Del-1 with respect to an LDL receptor-expressing cell
  • FIG. 3 (b) is in the presence of Del-1. It is the fluorescence-microscope image of the cell which took in DiI label
  • FIG. 3 (b) is the fluorescence-microscope image of the cell which took in DiI label
  • FIG. 3 (c) is a fluorescence microscopic image of cells in which DiI-labeled oxidized LDL was incorporated in the absence of Del-1 to LOX-1 expressing cells
  • FIG. 3 (d) is a diagram of Del-1 It is a fluorescence microscope image of the cell which took up DiI labeling oxidation LDL in presence (30 microgram / ml).
  • Fig. 3 (e) shows the fluorescence intensity of cells in which DiI-labeled LDL was incorporated in LDL receptor-expressing cells in the absence or presence of Del-1 (30 ⁇ g / ml), and LOX-1 expression. It is a figure which shows the fluorescence intensity of the cell which took up DiI label
  • Del-1 is at a concentration of 30 ⁇ g / ml and the oxidation of oxidized LDL to LOX-1 expressing cells. Incorporation was inhibited by 90% or more (significant difference by Student's T test, significant difference at risk rate of less than 5%). On the other hand, Del-1 did not inhibit LDL uptake into LDL receptor-expressing cells (LDLR-expressing cells).
  • Del-1 also inhibits the uptake of oxidized LDL not only to LOX-1 but also to cells expressing other oxidized LDL receptors, SR-A, CD36, SR-BI. I found out that From this, it is considered that Del-1 does not inhibit the uptake of oxidized LDL into cells by targeting the oxidized LDL receptor, but inhibits the uptake of cells by targeting oxidized LDL itself. It was.
  • FIG. 5 shows the results when human vascular endothelial cells (HUVEC) are used, and (b) shows the results when macrophages (THP-1 induced to differentiate into macrophages) are used.
  • 5 (a) and 5 (b) are fluorescence microscopic images, and the photograph described as “+ Del-1 30 ⁇ g / ml” has incorporated oxidized LDL in the presence of Del-1 (30 ⁇ g / ml). , And a photograph not described as “+ Del-1 30 ⁇ g / ml” is a fluorescence microscope image when oxidized LDL was incorporated in the absence of Del-1.
  • Del-1 is not only a cell forcibly expressing an oxidized LDL receptor by gene transfer (see FIG. 4), but also a cell that endogenously expresses an oxidized LDL receptor (see FIG. 4). It was found that the uptake of oxidized LDL into human vascular endothelial cells (HUVEC) and macrophages (THP-1 induced to differentiate into macrophages) can also be inhibited.
  • HAVEC human vascular endothelial cells
  • THP-1 induced to differentiate into macrophages
  • BSA was used as a Del-1 comparison, but no inhibition of uptake by BSA was observed (see the plot labeled BSA in FIG. 5).
  • the plot described as BSA in FIG. 5 shows the amount of DiI-labeled oxidized LDL incorporated when BSA is present at a concentration of 30 ⁇ g / ml and oxidized LDL is incorporated.
  • Example 3 Evaluation of the inhibitory effect of Del-1 on cellular reaction by oxidized LDL (Method) (1) TetOn hLOX-1-V5-His / HA-Flag hAT1 / CHO cells (referred to as “LOX-1-AT1 / CHO cells”) were used in order to examine the cellular response due to oxidized LDL.
  • LOX-1-AT1 / CHO cells were prepared as follows. Human LOX-1 cDNA (Genbank accession number: NM002543) was incorporated into an expression vector pTRE2hyg (manufactured by Clontech) to prepare an hLOX-1 expression vector (pTRE2hyg-hLOX-1). PTRE2hyg-hLOX-1 was introduced into CHO cells using Lipofectamin2000. In order to obtain a stable expression strain, the cells were cultured in the presence of 100 ⁇ g / ml G418 (Calbiochem) and 400 ⁇ g / ml hygromycin B (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the surviving cells by drug selection were cloned for experiments. used.
  • TetOn-hLOX-1-V5His cells obtained above were cotransfected with pTRE2hyg-HA-Flag-hAT1 and pSV2bsr (Funakoshi) using Lipofectamin2000.
  • pTRE2hyg-HA-Flag-hAT1 and pSV2bsr Lipofectamin2000.
  • it was cultured in the presence of hygromycin B (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 400 ⁇ g / ml and blasticidin S 10 ⁇ g / ml (manufactured by Funakoshi), and the surviving cells were selected by drug selection for experiments. used.
  • the LOX-1-AT1 / CHO cells obtained above were used in an F12 medium (GIBCO) containing 10% FBS, 100 ⁇ g / ml G418, 400 ⁇ g / ml hygromycin B, and 10 ⁇ g / ml blasticidin S at 37 ° C. Culturing was performed under 5% CO 2 conditions.
  • Luciferase assay The luciferase assay was used for the evaluation of the cellular response by oxidized LDL. It is well known to those skilled in the art that NF ⁇ B and SRF are activated by oxidized LDL (for example, “Circulation Research. 2011; 108: 797-807, Myocardin-Related Transcription Factor A Mediates OxLDL-Induced Endothelial Injury”). checking.). Mix luciferase reporter vector pGF1-NF ⁇ B or pGF1-SRF (both System Biosciences) and pRL-CMV (Promega), and use Lipofectamin LTX (invitrogen) on LOX-1-AT1 / CHO cells. The gene was introduced. 16 hours after the gene transfer, the medium was replaced with an F12 medium containing 0.1% FBS and 300 ng / ml doxycycline, and cultured under 0.5% CO 2 conditions for 24 hours.
  • Oxidized LDL was added in the absence or presence of Del-1 and allowed to react for 20 hours in a 0.5% CO 2 incubator.
  • Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) was used. Specifically, the cells after the reaction were washed once with PBS ( ⁇ ), and the cells were collected and lysed in Passive lysis ⁇ buffer, centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes, and the supernatant was used as a sample. .
  • Luminometer Centro LB960 manufactured by Berthold was used to measure the luminescence intensity, and the value of firefly luciferase / cypridina luciferase was calculated. Each emission intensity was graphed assuming that the emission intensity under the condition that no oxidized LDL was added was 1 (see FIG. 6).
  • Del-1 can inhibit the cellular reaction dependent on oxidized LDL.
  • Example 4 Evaluation of the inhibitory effect of Del-1 on arteriosclerosis (Method) (1) Preparation of a mouse with high expression of Del-1 A mouse with high expression of Del-1 (referred to as “Del-1-Tg mouse”) was prepared as follows.
  • the human Del-1 gene (SEQ ID NO: 2) was cloned from human brain cDNA and inserted into a mammalian expression vector pcDNA6.2 / V5 / GW / D-TOPO (Invitorogen) to obtain a human De1-1 expression vector.
  • pcDNA6.2-hDel-1 was prepared.
  • Del-1-Tg mice were produced by a modified method of Gordon et al. (1980. Proc. Nalt. Acad. Sci. 77: 7380-7384). Specifically, a human Del-1 expression vector (pcDNA6.2-hDel-1) was treated with restriction enzymes (MfeI, SmaI) to prepare a DNA fragment containing the CMV promoter and Del-1 gene. This DNA fragment was microinjected into the male pronucleus of the pronuclear embryo of C57BL / 6JJcl. This DNA-injected embryo was transplanted into the oviduct of a pseudopregnant female mouse (ICR mouse) under anesthesia and allowed to deliver spontaneously to obtain a founder mouse (Del-1-Tg mouse).
  • mice that had been loaded with a high-fat diet for 20 weeks were subjected to laparotomy and thoracotomy under inhalation anesthesia with isoflurane.
  • the isolated aorta was manually detached in physiological saline and fixed with 4% (v / v) paraformaldehyde-PBS.
  • the fixed aorta was washed and equilibrated with 60% (v / v) isopropanol, and then the lipid deposited on the aorta was stained with Oil Red O staining solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Thereafter, decolorization was performed with 60% (v / v) isopropanol.
  • the tissue after staining was observed with an optical microscope.
  • FIGS. 7 (a) and 7 (b) are lipid-stained images (Oil Red O) of aortic roots of 24-week-old wild-type mice (represented by “WT” in the figure) that were allowed to freely take a high-fat diet for 20 weeks. Stained image).
  • 7 (c) and (d) are lipid-stained images (Oil Red O-stained images) of the aortic root of 24-week-old mice overexpressing Del-1 (indicated by “Del-1-Tg” in the figure). is there.
  • FIG. 7 (a)-(d) the positive staining site is indicated by an arrow.
  • FIG. 7E is a graph showing the results of quantifying the lipid deposition area observed in the aortic root.
  • the present invention specifically binds (i) oxidized LDL, (ii) inhibits the incorporation of oxidized LDL into cells, and (iii) depends on oxidized LDL. It is possible to provide an oxidized LDL inhibitor capable of suppressing a typical cellular reaction. For this reason, the oxidized LDL inhibitor of the present invention can be an appropriate treatment or preventive measure for arteriosclerotic diseases caused by oxidized LDL.
  • the present invention can be used, for example, in industries related to medicine and pharmaceuticals.

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Abstract

　本発明は、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの生理活性を抑制し、かつ(iii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し得る、酸化ＬＤＬ阻害剤を提供する。本発明にかかる酸化ＬＤＬ阻害剤は、Ｄｅｌ－１タンパク質を有効成分として含有する。Ｄｅｌ－１タンパク質は、例えば配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる。

Description

酸化ＬＤＬ阻害剤
　本発明は、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得る、酸化ＬＤＬ阻害剤に関する。本発明にかかる酸化ＬＤＬ阻害剤は、酸化ＬＤＬを標的として作用し、酸化ＬＤＬとその受容体との相互作用を抑制し得る。
　ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（以下「ＬＤＬ」という。）の酸化によって生成する酸化ＬＤＬは、動脈硬化に対して促進的に機能することが分かっており、血中の酸化ＬＤＬ量を低減することにより、抗動脈硬化作用が奏される。例えば、プロアントシアニジンを乾燥重量換算で９５重量％未満の割合で含む松樹皮抽出物を有効成分とする動脈硬化予防剤が開示されている（例えば、特許文献１参照のこと。）。松樹皮抽出物は血管における高い脂質の酸化抑制効果を有しており、このため、松樹皮抽出物を服用することにより酸化ＬＤＬの血中量を低減させることができる。
　一方、酸化ＬＤＬによる動脈硬化促進作用は、酸化ＬＤＬがレクチン様酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ－１；Ｌｅｃｔｉｎ－ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ－ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－１）を介して血管内皮細胞に取り込まれるために生ずると考えられている。ＬＯＸ－１は、血管内皮細胞の酸化ＬＤＬ受容体として同定されたが、現在では、炎症、動脈硬化、血栓、心筋梗塞、カテーテル治療後の血管再狭窄等の循環器疾患を促進する因子として知られている。つまり、酸化ＬＤＬのＬＯＸ－１との結合及び血管内皮細胞への取り込みを抑制することによっても、抗動脈硬化作用が得られる。
　このようなＬＯＸ－１阻害作用を有する予防剤として、コバノイシカグマ科に属するワラビの植物抽出物を有効成分として含有する、ＬＯＸ－１アンタゴニスト作用を有する組成物（例えば、特許文献２参照のこと。）や、ミカン科に属する植物抽出物を有効成分として含有してなり、ＬＯＸ－１アンタゴニスト作用を有する動脈硬化抑制剤（例えば、特許文献３参照のこと。）や、ＬＯＸ－１アンタゴニスト作用を有する３量体以上のプロシアニジンを有効成分とするレクチン様酸化ＬＤＬ受容体阻害用医薬品（例えば、特許文献４参照のこと。）、等が知られている。
　ところで、血管内皮細胞やマクロファージにおいて発現し、分泌されるタンパク質として、Developmental endothelial locus-1（以下「Ｄｅｌ－１」という。）が知られている。Ｄｅｌ－１については、以下の点が知られている。
（１）Ｄｅｌ－１は、脳や肺組織において発現が高い（例えば、非特許文献１を参照のこと。）。
（２）Ｄｅｌ－１は、Ｄｅｌ－１のＣ末端のＣ１、Ｃ２ドメインでフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、マクロファージのアポトーシス細胞貪食を促進する（例えば、非特許文献２参照のこと。）。
（３）Ｄｅｌ－１は、血管新生を促進する（例えば、非特許文献３参照のこと。）。
（４）Ｄｅｌ－１は、白血球と内皮細胞との接着を抑制する（抗炎症作用）（例えば、非特許文献１を参照のこと。）。
（５）損傷血管や低酸素状態でＤｅｌ－１の発現が誘導される（例えば、非特許文献４および５を参照のこと。）。
日本国公開特許公報「特開２００５－２３０３２号公報（公開日：平成１７（２００５）年１月２７日）」 日本国公開特許公報「特開２００７－２９７３８１号公報（公開日：平成１９（２００７）年１１月１５日）」 日本国公開特許公報「特開２００７－３２０９５６号公報（公開日：平成１９（２００７）年１２月１３日）」 日本国公開特許公報「特開２０１１－６３２６号公報（公開日：平成２３（２０１１）年１月１３日）」
Choi EY et al. Del-1, an endogenous leukocyte-endothelial adhesion inhibitor, limits inflammatory cell recruitment. Science 2008, Vol.322, no.5904, p1101-1104. Hanayama R et al. Expression of developmental endothelial locus-1 in a subset of macrophages for engulfment of apoptotic cells. The Journal of imuunology 2004, vol. 172, no.6, p3876-3882. Penta K et al. Del1 induces integrin signaling and angiogenesis by ligation of alphaVbeta3. Ｊ Biol. Chem., 1999, Vol.274, no.16, p11101-11109. Rezaee M et al. Del1 mediates VSMC adhesion, migration, and proliferation through interaction with integrin alpha(v)beta(3). Am J Physiol Hert Circ Physiol 2002, vol. 282, no.5, p1924-1932. Scheurer SB et al. Modulation of gene expression by hypoxia in human umbilical cord vein endothelial cells: A transcriptomic and proteomic study. Proteomics 2004, vol. 4, no.9, p1737-1760. Steinbrecher UP. Receptors for oxidized low density lipoprotein. Biochim Biophys Acta. 1999, vol. 436, no.3, p279-298.
　酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みは、ＬＯＸ－１のみならず、スカベンジャー受容体と呼ばれる一群の酸化ＬＤＬ受容体を介して行われることが知られている（非特許文献６を参照のこと）。ＬＯＸ－１以外の酸化ＬＤＬ受容体としては、例えばＳＲ－Ａ（scavenger receptor-A I/II：スカベンジャーレセプターＡ），ＣＤ３６，ＳＲ－ＢＩ（scavenger receptor class B type 1）等が存在している。
　特許文献２－４に記載された薬剤はＬＯＸ－１のアンタゴニストであるため、ＬＯＸ－１を介した酸化ＬＤＬの細胞内取り込みに対しては有効では有るものの、それ以外の酸化ＬＤＬ受容体を介して行われる酸化ＬＤＬの細胞内取り込みに対しては必ずしも有効でない場合があると考えられる。このため、特許文献２－４に記載された薬剤のみでは動脈硬化性疾患の有効な治療手段とならない場合があった。
　上記の問題を解決するためには、各種酸化ＬＤＬ受容体に対するアンタゴニストをそれぞれ準備するか、または全ての酸化ＬＤＬ受容体に対して有効な単一のアンタゴニストを準備する必要がある。しかし、このようなアンタゴニストは未だ見出されていない。
　そこで、本発明は、酸化ＬＤＬ受容体を標的とするアンタゴニストではなく、酸化ＬＤＬ自体を標的として作用し、酸化ＬＤＬ受容体と酸化ＬＤＬとの結合を阻害し得る、酸化ＬＤＬ阻害剤を見出すことを目的とした。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行ったところ、血管内皮細胞やマクロファージにおいて分泌されるタンパク質であるＤｅｌ－１が、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得る、ということを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
　本発明にかかる酸化ＬＤＬ阻害剤は、上記課題を解決するためにＤｅｌ－１（Developmental endothelial locus-1）タンパク質を有効成分として含有することを特徴としている。
　本発明にかかる酸化ＬＤＬ阻害剤において、上記Ｄｅｌ－１タンパク質は、
　（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、
　（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸化ＬＤＬ阻害活性を有するタンパク質であってもよい。
　さらに本発明は、上記本発明にかかる酸化ＬＤＬ阻害剤を含有することを特徴とする薬学的組成物をも包含する。
　本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤は、従来公知の薬剤のごとく酸化ＬＤＬ受容体を標的とするのではなく、酸化ＬＤＬ自体を標的として結合し、酸化ＬＤＬの細胞内取り込みを阻害する。このため、本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤は、酸化ＬＤＬ受容体を介して行われる全ての酸化ＬＤＬの細胞内取り込みを阻害することができると考えられる。よって、本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤は、酸化ＬＤＬによって引き起こされる動脈硬化性疾患等の有効な治療または予防手段となり得る。
　さらに驚くべきことに本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤によれば、酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応（例えば、ＮＦκＢおよびＳＲＦの活性化）を抑制することができる。
　本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤に有効成分として含まれるＤｅｌ－１に上記のような作用があることについてはこれまで一切知られておらず、本発明者らが見出した新規知見である。このため、当業者であっても本発明を容易に完成することはできず、また本発明が奏する効果は当業者に予想できる程度のものではない。
Ｄｅｌ－１の構造およびアミノ酸配列を示す図である。 （ａ）はＬＤＬまたは酸化ＬＤＬに結合したＤｅｌ－１のＥＬＩＳＡによる検出原理を説明する概念図であり、（ｂ）はＬＤＬまたは酸化ＬＤＬに結合したＤｅｌ－１をＥＬＩＳＡによって検出した結果を示すグラフである。 酸化ＬＤＬまたはＬＤＬの、ＬＤＬ受容体発現細胞またはＬＯＸ－１発現細胞へ取り込みに対するＤｅｌ－１の影響を評価した結果を示す図であり、（ａ）はＬＤＬ受容体発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、（ｂ）はＬＤＬ受容体発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、（ｃ）はＬＯＸ－１発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、（ｄ）はＬＯＸ－１発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、（ｅ）はＬＤＬ受容体発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下または存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光強度、およびＬＯＸ－１発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下または存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光強度を示すグラフである。 各種酸化ＬＤＬ受容体発現細胞（ＬＯＸ－１発現細胞、ＳＲ－Ａ発現細胞、ＣＤ３６発現細胞、ＳＲ-ＢＩ発現細胞）に対する酸化ＬＤＬの取り込みを、Ｄｅｌ－１が阻害し得るかどうかを検討した結果を示すグラフである。 酸化ＬＤＬ受容体を内在的に発現するヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびマクロファージ（マクロファージに分化誘導させたＴＨＰ－１）に対する酸化ＬＤＬの取り込みを、Ｄｅｌ－１が阻害し得るかどうかを検討した結果を示す図であり、（ａ）はヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた場合の蛍光顕微鏡像およびグラフであり、（ｂ）はマクロファージ（マクロファージに分化誘導させたＴＨＰ－１）を用いた場合の蛍光顕微鏡像およびグラフである。 酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応（ＮＦκＢおよびＳＲＦの活性化）に対するＤｅｌ－１の阻害効果を評価した結果を示すグラフであり、（ａ）はＮＦκＢの活性化を検討した結果を示し、（ｂ）ＳＲＦの活性化を検討した結果を示す。 （ａ）および（ｂ）は２０週間、高脂肪食を自由摂取させた、２４週齢の野生型マウス（図中「ＷＴ」で表す。）の大動脈基部の脂質染色像（Oil Red O染色像）であり、（ｃ）および（ｄ）は２４週齢のＤｅｌ－１過剰発現マウス（図中「Ｄｅｌ－１－Ｔｇ」で表す。）の大動脈基部の脂質染色像（Oil Red O染色像）であり、（ｅ）は大動脈基部中に観察された脂質沈着面積を定量した結果を示すグラフである。
　以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
　〔本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤〕
　本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤は、Ｄｅｌ－１（Developmental endothelial locus-1）タンパク質を有効成分として含有することを特徴としている。
　ここで「Ｄｅｌ－１」は、ヒトの血管内皮細胞やマクロファージにおいて発現し、分泌されるタンパク質として知られている（例えば、非特許文献２を参照のこと。）。図１にＤｅｌ－１の構造およびそのアミノ酸配列を示す。Ｄｅｌ－１は、「Homo sapiens EGF-like repeats and discoidin I-like domains 3（ＥＤＩＬ３）とも言われ、そのアミノ酸配列および塩基配列が、Genbankにおいてアクセッションナンバー：NM005711として公開されている。Ｄｅｌ－ｌのアミノ酸配列を配列番号１に示し、その塩基配列を配列番号２に示す。
　Ｄｅｌ－１は、４８０アミノ酸からなるタンパク質で、Ｎ末端側からＳ，Ｅ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｃ１，Ｃ２のドメインに分かれている。なお「Ｓ」はSignal peptide、「Ｅ」はEGF-like domain、「Ｃ」はfactor 5/8 C-terminal domainを意味する。特にＣ末端側のＣ１、Ｃ２ドメインでフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合し、マクロファージのアポトーシス細胞貪食を促進することが知られている（例えば、非特許文献２参照のこと。）。Ｄｅｌ－１の作用としては、血管新生を促進する作用（例えば、非特許文献３参照のこと。）、および抗炎症作用（例えば、非特許文献１を参照のこと。）が知られている。またＤｅｌ－１のＥ２には、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸からなるＲＧＤ配列（ＲＧＤペプチド）が存在する。ＲＧＤ配列は多くの細胞がマトリックス（ＥＣＭ）を構成するタンパク質において共通するアミノ酸配列であり、細胞接着に密接に関わっていることが知られている。
　本発明者らは、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得る、というＤｅｌ－１の新規作用を見出し、Ｄｅｌ－１を有効成分として含有する酸化ＬＤＬ阻害剤を完成させるに至った。
　ここで本発明において「Ｄｅｌ－１タンパク質」とは、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＤｅｌ－１のみならず、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸化ＬＤＬ阻害活性を有するＤｅｌ－１の変異体を包含する意味である。なお、「Ｄｅｌ－１タンパク質」には、酸化ＬＤＬ阻害活性を有する限りにおいて上記（ａ）および（ｂ）の部分タンパク質も含まれる。また、「Ｄｅｌ－１タンパク質」には、配列番号１に示されるヒト由来のＤｅｌ－１に限定されず、その他の哺乳動物由来のＤｅｌ－１も含まれる。例えば、サル由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：NM001132845など）、ウシ由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：XM618255）、ブタ由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：XM003123766）、ニワトリ由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：XM424906）、ラット由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：XM002728994）、マウス由来のＤｅｌ－１（Genbankアクセッションナンバー：NM001037987）等が本発明に適用可能である。さらに「Ｄｅｌ－１タンパク質」には、配列番号１に示されるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有し、且つ「Ｄｅｌ－１」と同じ活性を備えたＤｅｌ－１様のタンパク質も含まれる。つまり本明細書において特記しない限りにおいて「Ｄｅｌ－１」とは配列番号１に示されるアミノ酸からなるタンパク質を意味し、「Ｄｅｌ－１タンパク質」といえばＤｅｌ－１、ヒト由来以外のＤｅｌ－１、Ｄｅｌ－１変異体、Ｄｅｌ－１部分タンパク質、およびＤｅｌ－１様タンパク質をも含む意味である。
　ここで上記「１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このようなタンパク質の変異体は、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在する変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。
　なお、本発明におけるＤｅｌ－１タンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
　また、本発明におけるＤｅｌ－１タンパク質は、Ｄｅｌ－１タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「Ｄｅｌ－１遺伝子」という。）を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内で発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、Ｄｅｌ－１タンパク質は、化学合成されたものであってもよい。
　ここで上記「酸化ＬＤＬ阻害活性を有する」とは、Ｄｅｌ－１の変異体が、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得る活性を有することを意味する。Ｄｅｌ－１の変異体が酸化ＬＤＬ阻害活性を有するかどうかについては、実施例に記載された方法によって確認することができる。
　具体的には、実施例１に記載された方法によって、Ｄｅｌ－１の変異体が酸化ＬＤＬと特異的に結合していることが確認できれば、上記(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し得ると判断できる。また実施例２に記載された方法によって、Ｄｅｌ－１変異体の存在下における酸化ＬＤＬの細胞内取り込みが、Ｄｅｌ－１変異体非存在下におけるそれに比して有意に減少していれば、Ｄｅｌ－１変異体が(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し得ると判断できる。また実施例３に記載された方法によって、Ｄｅｌ－１変異体の存在下におけるＮＦκＢおよびＳＲＦのシグナルが、Ｄｅｌ－１変異体の非存在下におけるそれに比して有意に減少していれば、Ｄｅｌ－１変異体が(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得ると判断することができる。なお、Ｄｅｌ－１変異体の存在下のデータが、Ｄｅｌ－１変異体の非存在下のデータに対して有意に減少しているかどうかは、例えばスチューデントのＴ検定を実施して、前者のデータが後者のデータに比して有意に減少していれば（危険率５％未満）、「有意に減少している」と判断できる。
　したがって、当業者であれば、「（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、且つ酸化ＬＤＬ阻害活性を有するＤｅｌ－１の変異体」が本明細書に記載されていると理解する。また当業者であれば、過度な実験を行うことなく本明細書に記載に基づいてＤｅｌ－１の変異体を取得することが可能である。
　本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤に含有されるＤｅｌ－１タンパク質の量は、酸化ＬＤＬ阻害活性による作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、Ｄｅｌ－１タンパク質の精製度、剤型、又は摂取方法等を考慮して適宜決定することができる。例えば、本発明においては、より十分な酸化ＬＤＬ阻害活性を奏することができるため、Ｄｅｌ－１タンパク質の含有割合は、酸化ＬＤＬ阻害剤の５０％（ｗ/ｗ）以上であることが好ましく、８０％（ｗ/ｗ）以上であることがより好ましく、１００％（ｗ/ｗ）であることがさらに好ましい。
　〔本発明の薬学的組成物〕
　本願発明の薬学的組成物は、上述の本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤を含有することを特徴としている。本発明の薬学的組成物によれば、酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応をも阻害することができるため、酸化ＬＤＬが原因で引き起こされる様々な疾患、とりわけ動脈硬化性疾患の治療または予防に奏効することが期待される。
　本発明の薬学的組成物は、酸化ＬＤＬ阻害活性を損なわない限りにおいて、薬学的に許容される、酸化ＬＤＬ阻害剤以外の他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア等）をさらに含有してもよい。
　ここで、上記「薬学的に受容可能なキャリア」について以下に説明する。本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」（以下、単に「キャリア」ともいう）とは、医薬、または動物薬のような農薬を製造するときに、処方を補助することを目的として用いられる物質であって、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。さらに、本発明にかかる薬学的組成物を受容した個体において毒性が無く、且つキャリア自体は有害な抗体の産生を誘導しないものが意図される。
　上記キャリアとしては、製剤素材として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用いられ、後述する薬学的組成物の投与形態および剤型に応じて適宜選択することができる。例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等；防腐剤；抗酸化剤；安定剤；矯味矯臭剤等として配合されるが、本発明はこれらに限定されない。
　上記「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ-マンニトール、キシリトール、ソルビトール、エリスリトール、デンプン、結晶セルロース等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ワックス、タルク、コロイドシリカ等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「結合剤」としては、例えば、α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖、Ｄ-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「崩壊剤」としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリン等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ-マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「懸濁剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、あるいは、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「等張化剤」としては、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ-マンニトール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「無痛化剤」としては、例えば、ベンジルアルコール等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　上記「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等を挙げることができるが、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　また、上記安定剤、矯味矯臭剤としては、製薬分野において通常用いられるものであれば特に限定されるものではない。
　本発明にかかる薬学的組成物の投与形態としては、経口的に投与するものであっても、非経口的に、静脈内、直腸内、腹腔内、筋肉内、または皮下に投与するものであってもよく、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。中でも、投与が容易であるとの理由から、本発明にかかる組成物は、経口的に投与されることが好ましい。なお、本明細書中において、上記「非経口」とは、脳室内、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
　本発明にかかる薬学的組成物を経口的に投与する場合、かかる薬学的組成物（以下、「経口剤」ともいう）の剤型としては、例えば、粉剤、顆粒剤、錠剤、リポソーム、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤等の固形製剤や、シロップ剤等の液状製剤とすることができる。
　上記「液状製剤」は、上記キャリアとして、例えば、水；グリセロール、グリコール、ポリエチレングリコール等の有機溶媒；これらの有機溶媒と水との混合物等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。また、上記液状製剤は、さらに、溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤等を含んでいてもよい。
　上記「固形製剤」は、上記キャリアとして、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤等を用いて、製薬分野において通常用いられる方法で製造することができる。
　かかる経口剤を調製する際には、目的に応じて、潤滑剤、流動性促進剤、着色剤、香料等をさらに配合してもよい。
　また、本発明にかかる薬学的組成物を非経口的に投与する場合、かかる薬学的組成物（以下、「非経口剤」ともいう）の剤型としては、例えば、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤等とすることができる。かかる非経口剤は、製薬分野において公知の方法に従って、本発明にかかる薬学的組成物を、希釈剤（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）に溶解または懸濁させ、目的に応じて、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等をさらに加えることにより調製することができる。
　また、本発明にかかる薬学的組成物の一実施形態として、製薬分野において通常用いられる技術により、徐放性製剤とすることもできる。
　本発明にかかる薬学的組成物は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と併用して投与されてもよい。併用して投与される方法としては、例えば、他の薬剤との混合物として同時に投与されてもよいし、他の薬剤とは別の薬剤として同時にもしくは並行して投与されてもよいし、あるいは経時的に投与されてもよいが、本発明はこれに限定されない。
　また、本発明にかかる薬学的組成物が１日あたりに投与される回数は特に限定されるものではない。本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤の投与量が、１日あたりの所要の投与量範囲内であれば、１日あたり１回の投与であってもよいし、複数回に分けて投与を行ってもよい。
　なお、本発明の薬学的組成物は、ヒトのみならず、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、およびサル等）に対しても適用可能であることは、当業者であれば容易に理解する。
　本発明の薬学的組成物中の酸化ＬＤＬ阻害剤（またはＤｅｌ－１タンパク質）の量は、酸化ＬＤＬ阻害活性による作用が奏されるために十分な量であれば特に限定されるものではなく、Ｄｅｌ－１タンパク質の精製度、剤型、又は摂取方法や、摂取対象者の性別、年齢、体重、健康状況等を考慮して適宜決定することができる。
　酸化ＬＤＬ阻害活性による効果を得るために、本発明の薬学的組成物に、Ｄｅｌ－１タンパク質を、例えば、摂取量が乾燥重量として成人１日当たり１０～３０００ｍｇ、好ましくは１５０～１０００ｍｇとなるように含有させることができる。
　以下実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。
　〔実施例１〕ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay: 酵素免疫測定法)によるＤｅｌ－１と酸化ＬＤＬとの結合の評価
　（方法）
　（１）Ｄｅｌ－１
　実験に使用したヒト由来Ｄｅｌ－１は、Ｒ＆Ｄ社より購入した。当該Ｄｅｌ－１は、Ｃ末端側にＨｉｓタグを付加した組換えタンパクで、ＣＨＯ細胞にて発現させ、精製されたものである。
　（２）ＬＤＬの調製
　健常人からＡＣＤ（acid-citrate-dextrose）含有バッファーが添加されている採血管に採取した血液から血漿を分離回収した。得られた血漿に臭化カリウムを加えて比重を１．０１９に調整した後、５８，０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。下層を回収し、臭化カリウムにて比重を１．０６３に調整した後、５８，０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。超遠心機は、Beckman社製のＬ－８０を使用した。
　回収した上層を、透析膜（Slid-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10 K MWCO、Pierce社製）を用いて、ＰＢＳ（－）を外液として透析し（外液４回交換）、精製ヒトＬＤＬを得た。
　（３）酸化ＬＤＬの調製
　BCA Protein Assay Kit (Pierce社製)を用いて精製ヒトＬＤＬのタンパク質量を測定し、濃度が３ｍｇ/ｍｌとなるようにＰＢＳ（－）で調整した溶液に、硫酸銅を７．５μＭとなるように添加した後、３７℃、５％ＣＯ2インキュベーター内で１６時間インキュベートした。続いて、この溶液を、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を外液として透析し（外液４回交換）、ヒト酸化ＬＤＬとした。なお、実施例の結果を示す図において、酸化ＬＤＬを「ｏｘＬＤＬ」と表記する場合がある。
　（４）ＥＬＩＳＡ
　３８４ well プレート（greiner社製）に、抗ＡｐｏＢ抗体(Bindingsite社製)を固相化し、２５％ブロックエース(大日本住友製薬社製)でブロッキングを行った後、酸化ＬＤＬまたはＬＤＬを結合させた。ＰＢＳ（－）でプレートを２回洗浄後、溶液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で希釈したＤｅｌ－１を添加し、室温で１時間反応させ、結合したＤｅｌ－１を抗Ｈｉｓタグ抗体（Invitrogen社）で検出した。図２（ａ）に、ＬＤＬまたは酸化ＬＤＬに結合したＤｅｌ－１のＥＬＩＳＡによる検出原理を説明する概念図を示す。
　（結果）
　図２（ｂ）に、ＬＤＬまたは酸化ＬＤＬに結合したＤｅｌ－１をＥＬＩＳＡによって検出した結果を示す。
　図２（ｂ）によれば、Ｄｅｌ－１は、１，３，１０μg/ｍｌの濃度で酸化ＬＤＬに特異的に結合したことが確認された。一方、Ｄｅｌ－１のＬＤＬに対する特異的な結合は認められなかった。
　〔実施例２〕酸化ＬＤＬの細胞への取込みに対するＤｅｌ－１の阻害効果の評価
　（方法）
　（１）ＤｉＩ標識ＬＤＬまたはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬ（ＤｉＩ－ｏｘＬＤＬ）の作製
　ヒトＬＤＬまたはヒト酸化ＬＤＬを、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて希釈し、１ｍｇ／ｍｌとなるように調整した。この溶液に、終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるようにＤｉＩ（Ｄ２８２，Invitrogen社製）を、終濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるようにLipoprotein deficient serum (Sigma社製)を、それぞれ添加し、３７℃で１８時間反応させた。ＤｉＩは、３０μg／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに懸濁した溶液を用いた。
　反応後、塩化ナトリウムおよび臭化カリウムにて比重を１．１５に調整した後、５８，０００ｒｐｍで２０時間遠心分離処理を行った。回収した上層を、透析膜（Slid-A-Lyzer Dialysis Cassettes 10 K MWCO）を用いて、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液を外液として透析し（外液４回交換）、ＤｉＩ標識ＬＤＬまたはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを得た。なお、実施例の結果を示す図において、ＤｉＩ標識ＬＤＬおよびＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを、それぞれ「ＤｉＩ－ＬＤＬ」および「ＤｉＩ－ｏｘＬＤＬ」と表記する場合がある。
　（２）各種受容体発現細胞
　１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（GIBCO社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、４８時間培養された各種細胞を本実施例に用いた。各種受容体発現細胞は、以下のようにして作成された。
　Lipofectamin 2000 (Invitrogen)を用いて、ＣＯＳ７細胞に各種酸化ＬＤＬ受容体の発現ベクターまたはＬＤＬ受容体発現ベクターを導入した。各種酸化ＬＤＬ受容体の発現ベクターおよびＬＤＬ受容体発現ベクターの詳細は、以下の通りである。
　ＬＯＸ－１発現ベクター（pcDNA6.2-human LOX-1-V5）、ＳＲ-Ａ発現ベクター（pcDNA6.2-human SR-A-V5）、ＣＤ３６発現ベクター（pcDNA6.2-human CD36-V5）、ＳＲ－ＢＩ発現ベクター（pcDNA6.2-human SR-BI-V5）、およびＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）発現ベクターは、ヒトＬＯＸ－１ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー: NM002543）、ヒトＳＲ－Ａ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー: NM002445）、ヒトＣＤ３６ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー: NM000072）、ヒトＳＲ－ＢＩ ｃＤＮＡ（Genbankアクセッションナンバー: NM005505）およびヒトＬＤＬＲ ｃＤＮＡ(Genbankアクセッションナンバー: NM000527)を、ヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、哺乳動物発現ベクターpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO（Invitrogen社）に挿入して各受容体の発現ベクターを作製した。なお各受容体のＣ末端側にＶ５タグを付加している。
　（３）ＨＵＶＥＣ（Human umbilical vein endothelial cells: 正常ヒト臍帯静脈内皮細胞）
　LONZA社より購入した。培養には、ＥＧＭ－２培地（LONZA社製）を用い、３７℃、５%ＣＯ２条件下で培養を行った。実験には、継代回数７回以下の細胞を使用した。
　（４）ＴＨＰ－１（ヒト単球性白血病細胞株）
　１０％ＦＢＳを含む２０μＭの2-Mercaptoethanolを含むＲＰＭＩ１９４０培地（GIBCO社製）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養を行った。実験には、１００ｎＭ ＰＭＡ（Phorbol 12Myristate 13Acetate）存在下で７２時間培養し、マクロファージ様に分化誘導させた細胞を使用した。
　（５）酸化ＬＤＬまたはＬＤＬの細胞への取込み実験
　384 well プレート(greiner社製)に撒いた各種細胞を、無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄後、Ｄｅｌ－１と、ＤｉＩ標識ＬＤＬまたはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬとの混合液を加え、３７℃、５％ＣＯ２条件下で反応させた。細胞に取り込まれたＤｉＩ標識ＬＤＬまたはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬの蛍光シグナルを、INCell Analyzer 1000 （GE healthcare社製）で検出し、定量評価した。
　（結果）
　酸化ＬＤＬまたはＬＤＬの、ＬＤＬ受容体発現細胞またはＬＯＸ－１発現細胞への取り込みに対するＤｅｌ－１の影響を評価した結果を図３に示した。図３（ａ）はＬＤＬ受容体発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、図３（ｂ）はＤｅｌ－１の存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像である。また図３（ｃ）はＬＯＸ－１発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像であり、図３（ｄ）はＤｅｌ－１の存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光顕微鏡像である。
　また図３（ｅ）は、ＬＤＬ受容体発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下または存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光強度、およびＬＯＸ－１発現細胞に対して、Ｄｅｌ－１の非存在下または存在下（３０μｇ／ｍｌ）でＤｉＩ標識酸化ＬＤＬを取り込ませた細胞の蛍光強度を示す図である。図３（ｅ）において、Ｄｅｌ－１の存在下（３０μｇ／ｍｌ）でのＤｉＩ標識ＬＤＬ（またはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬ）を取り込ませた場合の蛍光強度は、Ｄｅｌ－１の非存在下でＤｉＩ標識ＬＤＬ（またはＤｉＩ標識酸化ＬＤＬ）を取り込ませた場合の蛍光強度（１００）に対する相対値で示されている。
　酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ－１を発現する細胞への酸化ＬＤＬの取り込みに対するＤｅｌ－１の影響を観察すると、Ｄｅｌ－１は３０μｇ／ｍｌの濃度で、ＬＯＸ－１発現細胞への酸化ＬＤＬの取り込みを９０％以上阻害した（スチューデントのＴ検定による有意差検定で、危険率５％未満における有意差あり。）。一方、Ｄｅｌ－１は、ＬＤＬ受容体発現細胞（ＬＤＬＲ発現細胞）へのＬＤＬの取込みを阻害しなかった。
　また、各種酸化ＬＤＬ受容体発現細胞（ＬＯＸ－１発現細胞、ＳＲ－Ａ発現細胞、ＣＤ３６発現細胞、ＳＲ-ＢＩ発現細胞）に対する酸化ＬＤＬの取り込みを、Ｄｅｌ－１が阻害し得るかどうかを検討した結果を図４に示す。
　図４によれば、Ｄｅｌ－１は、ＬＯＸ－１だけではなく、他の酸化ＬＤＬ受容体である、ＳＲ－Ａ，ＣＤ３６，ＳＲ－ＢＩを発現する細胞に対する、酸化ＬＤＬの取り込みも阻害することができるということが分かった。このことから、Ｄｅｌ－１は、酸化ＬＤＬ受容体を標的として酸化ＬＤＬの細胞への取り込みを阻害しているのではなく、酸化ＬＤＬ自体を標的として細胞への取り込みを阻害していると考えられた。
　次に、酸化ＬＤＬ受容体を内在的に発現するヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびマクロファージ（マクロファージに分化誘導させたＴＨＰ－１）に対する酸化ＬＤＬの取り込みを、Ｄｅｌ－１が阻害し得るかどうかを検討した結果を図５に示す。図５（ａ）はヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いた場合の結果であり、（ｂ）はマクロファージ（マクロファージに分化誘導させたＴＨＰ－１）を用いた場合の結果である。図５（ａ）および（ｂ）における写真は蛍光顕微鏡像であり、「＋Ｄｅｌ－１　３０μｇ/ｍｌ」と記載されている写真はＤｅｌ－１（３０μｇ/ｍｌ）存在下で酸化ＬＤＬを取り込ませた場合の蛍光顕微鏡像であり、「＋Ｄｅｌ－１　３０μｇ/ｍｌ」と記載されていない写真はＤｅｌ－１非存在下で酸化ＬＤＬを取り込ませた場合の蛍光顕微鏡像である。
　図５によれば、Ｄｅｌ－１は、遺伝子導入によって酸化ＬＤＬ受容体を強制的に発現させた細胞のみならず（図４を参照のこと）、酸化ＬＤＬ受容体を内在性に発現する細胞（ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびマクロファージ（マクロファージに分化誘導させたＴＨＰ－１））への酸化ＬＤＬの取り込みをも阻害し得ることが分かった。
　なお、図５に示す各実験において、Ｄｅｌ－１の比較としてＢＳＡを使用したが、ＢＳＡによる取り込み阻害は認められなかった（図５中のＢＳＡと記載されたプロットを参照のこと）。図５中のＢＳＡと記載されたプロットは、ＢＳＡを３０μｇ/ｍｌの濃度で存在させて酸化ＬＤＬを取り込ませた場合のＤｉＩ標識酸化ＬＤＬの取り込み量を示す。
　〔実施例３〕酸化ＬＤＬによる細胞反応に対するＤｅｌ－１の阻害効果の評価
　（方法）
　（１）酸化ＬＤＬによる細胞反応を調べるために、TetOn hLOX-1-V5-His / HA-Flag hAT1 / CHO 細胞（「LOX-1-AT1/CHO細胞」という。）を使用した。
　LOX-1-AT1/CHO細胞は、次のようにして作製された。ヒトLOX-1 cDNA (Genbankアクセッションナンバー：NM002543）を、発現ベクターpTRE2hyg （Clontech社製）に組み込み、hLOX-1発現ベクター（pTRE2hyg-hLOX-1）を作製した。Lipofectamin2000を用いてpTRE2hyg-hLOX-1をＣＨＯ細胞へ遺伝子導入を行った。安定発現株を得るため、１００μｇ／ｍｌのG418 （Calbiochem社製）および４００μｇ／ｍｌのhygromycin B （和光純薬株式会社製）存在下で培養し、薬剤選択で生き残った細胞をクローン化して実験に使用した。
　上記で得られたTetOn-hLOX-1-V5His細胞に、Lipofectamin2000を用いてpTRE2hyg-HA-Flag-hAT1とpSV2bsr （フナコシ社製）をコトランスフェクションした。安定発現株を得るため、hygromycin B （和光純薬株式会社製）４００μｇ／ｍｌと、blasticidin S １０μｇ／ｍｌ（フナコシ社製）存在下で培養し、薬剤選択で生き残った細胞をクローン化して実験に使用した。
　上記で得られたLOX-1-AT1/CHO細胞を１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌのG418、４００μｇ／ｍｌのhygromycin B、および１０μｇ／ｍｌ blasticidin S含むＦ１２培地（GIBCO社）を用い、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養を行った。
　（２）ルシフェラーゼアッセイ
　酸化ＬＤＬによる細胞反応の評価には、ルシフェラーゼアッセイを用いた。酸化ＬＤＬによってＮＦκＢおよびＳＲＦが活性化されることについては、当業者に良く知られている（例えば「Circulation Research.　2011; 108: 797-807, Myocardin-Related Transcription Factor A Mediates OxLDL-Induced Endothelial Injury」を参照のこと。）。ルシフェラーゼレポーターベクターpGF1-NFκBあるいはpGF1-SRF（いずれもSystem Biosciences社）と、pRL-CMV （Promega社）とを混合し、Lipofectamin LTX（invitrogen社）を用いて、LOX-1-AT1/CHO細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入から１６時間後、０．１％ＦＢＳおよび３００ｎｇ／ｍｌのdoxycyclineを含むＦ１２培地に交換し、０．５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。
　細胞をＰＢＳ（－）で洗浄後、０．１％ＦＢＳおよび１００ｎｇ／ｍｌのdoxycyclineを含むＦ１２培地を、２００μl／ｗｅｌｌ添加した。Ｄｅｌ－１の非存在下または存在下で酸化ＬＤＬを添加し、０．５％ＣＯ２インキュベーター内で２０時間反応させた。
　ルシフェラーゼの測定には、Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega社)を使用した。具体的には、反応後の細胞をＰＢＳ（－）で１回洗浄後、細胞をPassive lysis bufferにて回収、溶解し、１０，０００ｒｐｍで２分間遠心分離処理後、上清をサンプルとして使用した。ルミノメーター Centro LB960 （Berthold社製）を用いて発光強度を測定し、ホタルルシフェラーゼ/ウミホタルルシフェラーゼの値を算出した。酸化ＬＤＬを添加していない条件の発光強度を１として各発光強度をグラフ化した（図６を参照のこと。）。
　（結果）
　図６によれば、LOX-1-AT1/CHO細胞において、酸化ＬＤＬによって惹起されるＮＦκＢおよびＳＲＦの活性化を、Ｄｅｌ－１（１０μｇ／ｍｌおよび３０μｇ／ｍｌの濃度）は有意に阻害したことが分かる。このときＢＳＡによる阻害は認められなかった。図６に示すデータは有意差検定（スチューデントのＴ検定）を行っており、危険率５％未満で有意差がある場合は図６中に「*」が付されており、危険率１％未満で有意差がある場合は図６中に「**」が付されている。
　したがって、Ｄｅｌ－１は酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を阻害し得るということが確認された。
　〔実施例４〕Ｄｅｌ－１の動脈硬化抑制効果の評価
　（方法）
　（１）Ｄｅｌ－１高発現マウスの作製
Ｄｅｌ－１高発現マウス（「Ｄｅｌ－１－Ｔｇマウス」という。）は以下のようにして作製された。
　ヒトＤｅｌ－１遺伝子（配列番号２）を、ヒト脳ｃＤＮＡからクローニングし、哺乳動物用発現ベクターpcDNA6.2/V5/GW/D-TOPO（Invitorogen社）に挿入して、ヒトＤｅ１－１発現ベクターpcDNA6.2-hDel-1を作製した。
　Ｄｅｌ－１－Ｔｇマウスの作製は、Gordonらの方法（1980. Proc.Nalt.Acad.Sci. 77:7380-7384）の改良法で実施された。すなわち、ヒトＤｅｌ－１発現ベクター（pcDNA6.2-hDel-1）を制限酵素（ＭｆｅＩ、ＳｍａＩ）で処理し、ＣＭＶプロモーターとＤｅｌ－１遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片をC57BL/6JJclの前核期胚の雄性前核に顕微注入した。このＤＮＡ注入胚を偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス）の卵管内に麻酔下にて移植し、自然分娩させ、子マウス（Ｄｅｌ－１－Ｔｇマウス）初代(Founder)を得た。
　（２）脂質染色
　２４週齢のＤｅｌ－１高発現マウス（「Ｄｅｌ－１－Ｔｇマウス」という。）および野生型マウスに、２０週間、高脂肪食（商品名: Atherogenic Rodoent Diet （型番:Ｄ１２３３６）、リサーチダイエット社）を自由摂取させた。これらのマウスを解剖し、各個体から大動脈を取り出してOil Red O染色液（和光純薬工業株式会社製）により大動脈中の脂質を染色した。具体的には以下の通りである。
　２０週間の高脂肪食負荷を行ったマウスを、イソフルランによる吸入麻酔下で開腹および開胸を行い、生理食塩水（大塚製薬製）で還流後、マウスから大動脈を摘出した。摘出した大動脈は、生理食塩水中で用手的に周辺組織を剥離した後、４％（ｖ/ｖ）パラフォルムアルデヒド－ＰＢＳを用いて固定した。固定した大動脈を６０％（ｖ/ｖ）イソプロパノールで洗浄および平衡化した後、Oil Red O染色液（和光純薬工業株式会社）により大動脈に沈着した脂質を染色した。その後、６０％（ｖ/ｖ）イソプロパノールにて脱色を行った。
　染色後の組織について、光学顕微鏡観察を行った。
　（結果）
　結果を図７に示す。図７（ａ）および（ｂ）は２０週間、高脂肪食を自由摂取させた、２４週齢の野生型マウス（図中「ＷＴ」で表す。）の大動脈基部の脂質染色像（Oil Red O染色像）である。また図７（ｃ）および（ｄ）は２４週齢のＤｅｌ－１過剰発現マウス（図中「Ｄｅｌ－１－Ｔｇ」で表す。）の大動脈基部の脂質染色像（Oil Red O染色像）である。図７（ａ）－（ｄ）中、陽性染色部位を矢印で示す。また図７（ｅ）は、大動脈基部中に観察された脂質沈着面積を定量した結果を示すグラフである。
　図７のから、野生型マウスに比べ、Ｄｅｌ－１－Ｔｇマウスでは明らかな脂質沈着の減少がみられた（Ｐ＜０．００１）。よって、Ｄｅｌ－１をマウスにて過剰発現させることにより、動脈硬化の進展を抑制し得ることが確認された。すなわち、Ｄｅｌ－１タンパク質を薬理学的に用いることにより、動脈硬化等の循環器疾患を抑制できる可能性があるといえる。
　上記説示したように、本発明によれば、本発明は、(i)酸化ＬＤＬと特異的に結合し、(ii)酸化ＬＤＬの細胞内への取り込みを阻害し、かつ(iii)酸化ＬＤＬ依存的な細胞反応を抑制し得る、酸化ＬＤＬ阻害剤を提供することができる。このため、本発明の酸化ＬＤＬ阻害剤は、酸化ＬＤＬによって引き起こされる動脈硬化性疾患等の行こうな治療または予防手段となり得る。
　したがって本発明は、例えば、医療および医薬品に関わる産業において利用可能である。

Claims (3)

  1. 　Ｄｅｌ－１（Developmental endothelial locus-1）タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする酸化ＬＤＬ阻害剤。
  2. 　上記Ｄｅｌ－１タンパク質は、
    　（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、
    　（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ酸化ＬＤＬ阻害活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の酸化ＬＤＬ阻害剤。
  3. 　請求項１または２に記載の酸化ＬＤＬ阻害剤を含有することを特徴とする薬学的組成物。
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