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WO2012065852A2 - Therapeutisches protein - Google Patents

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Info

Publication number
WO2012065852A2
WO2012065852A2 PCT/EP2011/069326 EP2011069326W WO2012065852A2 WO 2012065852 A2 WO2012065852 A2 WO 2012065852A2 EP 2011069326 W EP2011069326 W EP 2011069326W WO 2012065852 A2 WO2012065852 A2 WO 2012065852A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gremiin
fusion protein
polypeptide
acid sequence
protein according
Prior art date
Application number
PCT/EP2011/069326
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2012065852A3 (de
Inventor
Meinrad Gawaz
Iris Irmgard Mueller
Christoph Leder
Christina Filzmayer
Original Assignee
Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum filed Critical Eberhard-Karls-Universitaet Tuebingen Universitaetsklinikum
Publication of WO2012065852A2 publication Critical patent/WO2012065852A2/de
Publication of WO2012065852A3 publication Critical patent/WO2012065852A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the present invention relates to a protein having a therapeutic, in particular anti-inflammatory or immune modulating potential, as well as its use for the treatment of diseases in which inflammatory, immunomodulatory and / or generative processes play a role, in particular in the cardiovascular area in the Atherosclerosis, after acute myocardial infarction, in the context of acute and chronic myocarditis, and in advanced heart failure, as well as inflammatory autoimmune diseases;
  • the invention further relates to a fusion protein containing the protein, a nucleic acid molecule coding therefor, a pharmaceutical composition containing the protein, and the use of the protein or the pharmaceutical composition for therapeutic treatment.
  • Atherosclerosis is a highly complex active pathological process, in the center of which there is an inflammatory reaction in the walls of the blood-carrying vessels of an affected individual.
  • the development of atherosclerosis, the so-called atherogenesis, can be divided into several phases.
  • the early phase of atherogenesis is characterized by a so-called endothelial dysfunction.
  • a number of different risk factors such as Smoking, obesity, physical inactivity, hyperlipoproteinemia and type I diabetes as well as other factors not yet identified lead to endothelial damage.
  • the permeability of the endothelium for lipoproteins and other circulating substances in the plasma increases as a result.
  • endothelial cells are activated and increasingly express so-called adhesion molecules on the cell surface.
  • selectins initially mediate the temporary contact of certain blood cells such as monocytes and T lymphocytes with the endothelium.
  • Another group of adhesion molecules the so-called Cellular Adhesion Molecules (CAMs) leads to the firm attachment of these cells to the vessel wall.
  • CAMs Cellular Adhesion Molecules
  • MCP-1 Chemoattractant protein-1
  • oxLDL low-density lipoprotein
  • the oxLDL is released into the subintimal space, where it loads the macrophages produced there from monocytes. These macrophages are transformed by the loading with oxLDL into so-called foam cells, the characteristic cells of the atherosclerotic plaques, which as further constituents i.a. T lymphocytes and from the media immigrated smooth muscle cells.
  • plaques deposit on the arterial walls and are thereby covered by a stabilizing fibrous cap consisting of smooth muscle cells and extracellular matrix.
  • Atherosclerotic plaque is now at the center of an inflammatory reaction in which various inflammatory mediators are produced, such as cytokines, chemokines, proteases, etc. This can lead to tissue necrosis, in the vicinity of which lime salts are deposited. As a result, the vessel lumen can be narrowed to complete closure with the result of circulatory disorders.
  • Cytokines also have a specific, if not even causal, role.
  • cytokine-triggered, caused or induced diseases would therefore be to specifically target the release / formation or action of certain cytokines.
  • the object of the present invention is to provide such a novel agent.
  • This object is achieved by a protein having the sequence of Gremiin, or variants or fragments thereof having the BMP binding function of Gremiin, for the treatment of diseases associated with a reduction in MIF formation and / or the CXCLl formation and / or MCP-1 formation and / or foam cell formation are treatable.
  • a fusion protein which is (a) a first polypeptide having an immunoglobulin Fc domain, and (b) a second polypeptide selected from Gremiin or variants or fragments thereof containing the Possess BMP (Bone Morphogenetic Proteins) binding function of Gremiin. It is particularly preferred if the fusion protein towards the N-terminus to the C-terminus (a) a first polypeptide having an immunoglobulin Fc domain, and (b) a second polypeptide selected from Gremiin or variants or fragments thereof containing the BMP (Bone Morphogenetic Proteins) binding function of Gremiin.
  • a pharmaceutical composition comprising the protein having the sequence of Gremiin, or variants or fragments thereof, which have the BMP binding function of Gremiin, or the fusion protein according to the invention in a contains pharmaceutically effective amount, optionally in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, and by the use of the inventive fusion protein or the pharmaceutical composition containing it as a medicament, in particular for the treatment of atherosclerosis, ischemic heart disease, myocardial infarction, stroke, heart failure, myocarditis, inflammatory cardiomyopathy, inflammatory rheumatic and autoimmune diseases, for the regeneration of ischemic tissue after mycardial infarction, and in ischemia / reperfusion after organ transplantation.
  • the object underlying the invention is completely solved in this way.
  • the protein Gremiin also known as "Drm” belongs as a protein of the DAN family to the BMP (bone morphogenetic proteins) antagonists and plays a major role in differentiation processes of various organ systems during the embryonic Development.
  • Gremini-1 is known to undergo and inhibit BMP-2, -4 and -7 antagonistic reactions.
  • BMPs also control numerous physiological and pathological processes in the adult organism.
  • the BMPs are a group of similar signaling proteins that can be used to affect adjacent cells and thus constitute cytokines. regulate the expression of numerous target genes, thereby influencing molecular mechanisms that are important for the physiological function of monocytes / macrophages, endothelial cells and smooth muscle cells.
  • BMPs influence u.a. the adhesion behavior of endothelial cells and smooth muscle cells, as well as the activity of metalloproteinases in different cell types.
  • the role of BMPs in the genesis and progression of atherogenesis has been poorly understood, and little is known about the role of their antagonists.
  • Gremiin secretes the secretion or expression of the macrophage migration inhibitory factor, the chemokine CXCL1 and the monocyte chemoattractant protein-1 (monocyte chemoattractant protein; MCP-1) lowers.
  • Gremiin inhibits foam cell formation, regulates monocyte migration, and inhibits the activity of matrix metalloproteinase 2 (MMP2).
  • MMP2 matrix metalloproteinase 2
  • Macrophage Inhibitory Factor By binding of Gremiin to the BMPs - and thereby by the inhibition of BMPs - their influence on, inter alia, monocytes for foam cell formation in the artherogenesis can be suppressed, and inhibits the formation / secretion of the "Macrophage Inhibitory Factor" (macrophage inhibition factor) become.
  • the macrophage migration inhibitory factor (MIF) was first introduced in 1966 as a cytokine secreted by T-lymphocytes with the ability to inhibit the undirected migration of macrophages. Meanwhile, MIF has been detected in many organ systems, and it is believed that this cytokine is also involved in cell-mediated immunity, immune regulation, and inflammatory responses, such as in rheumatoid arthritis.
  • MIF promotes plaque formation and plaque growth, promotes matrix metalloproteinase 2 and 9 activity, and regulates the adhesion and migration of monocytes and macrophages. MIF enhances myocardial damage after ischemia and stimulates myocardial apoptosis.
  • the protein Gremiin used for inhibiting MIF and / or CXCL1 and / or MCP-1 can have the sequences SEQ ID No. 2 (murine) or 3 (human) listed in the attached sequence listing, as well as other cross-reactive ones Species, or fragments or variants thereof, which still possess the same binding property as Gremiin.
  • fragment or a "variant" which has the binding function of the respective polypeptide is understood herein to mean an amino acid sequence which differs from the wild-type sequence or the sequence given herein by one or more amino acid substitutions .
  • modified amino acids may have "conservative" amino acid substitutions in which the exchanged amino acid has the same or similar properties as the replaced amino acid.
  • Similar small changes may also include amino acid deletions and / or insertions. Guidance for determining which and how many amino acid residues may be substituted, inserted or deleted without abolishing biological activity may, for example, be found using computer programs known in the art become.
  • the protein or polypeptide variants or fragments thereof encompassed herein include, in particular, Gremlin proteins and variants derived therefrom, both murine and human, or fragments thereof, each still having the Gremlin binding property, identical or substantially equivalent.
  • Gremlin fragments or variations are suitable which, like Gremiin, still possess a binding property to BMPs. For example, whether a modified Gremlin polypeptide possesses the binding properties of the unmodified Gremlin polypeptide can be assayed in in vitro assays, as described further herein below.
  • variants also include polypeptides each having approximately 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the respective wild-type polypeptide / protein .
  • polypeptides each having approximately 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99% sequence identity with the respective wild-type polypeptide / protein .
  • the diseases or diseases for the treatment of the use of the protein Gremiin, or of variants / fragments thereof, is suitable, include all inflammatory and immunomodulatory diseases, u.a. Atherosclerosis and ischemic heart disease, myocardial infarction, stroke, heart failure, myocarditis of inflammatory cadriomyopathy, inflammatory rheumatic and autoimmune diseases, for the regeneration of ischemic tissue after mycardial infarction, and in ischemia / reperfusion after organ transplantation. All of these diseases have in common that they have shown or derived the involvement of MIF, CXCL1 and MCP-1.
  • the invention also relates to a fusion protein comprising fusion protein a) a first polypeptide having an immunoglobulin Fc domain, and b) a second polypeptide selected from Gremiin or variants or fragments thereof, that possess the BMP binding function of Gremiin.
  • the first polypeptide is designed in terms of its amino acid sequence such that it has the Fc domain of an immunoglobulin; the Fc domain
  • the second polypeptide selected from Gremiin or variants or fragments thereof having the BMP binding function of Gremiin is thereby designed by suitable choice of the amino acid sequence such that it binds to BMP.
  • both murine Gremiin and human Gremiin as well as other human cross-reactive species are suitable for realizing the fusion protein.
  • fusion protein is understood as meaning a hybrid protein or an artificial protein which can be produced in vitro as well as in vivo by molecular biological or chemical methods known in the art.
  • the fusion protein can be produced by conjugation of two (or more) polypeptides by means of one or more chemical reagents or by recombinant DNA technologies, ie by genetic "linking" of the nucleic acids coding for the proteins.
  • it is possible to generate the fusion protein by using customary expression vectors which code for the fusion protein according to the invention. These expression vectors are introduced into a suitable cell, which then produces the fusion protein.
  • linker or "linker peptide”, which are used interchangeably herein, in the present invention, an amino acid or a nucleic acid sequence encoding it with up to 100 amino acids / bases understood, which serves to link two functional polypeptides, and the optionally generates a distance between the two functional polypeptides, without possessing a binding property to other molecules. This is therefore a "neutral" sequence, which can fulfill or fulfill no other than the functions just described.
  • the linker peptide may also have cleavage sites for certain enzymes via which the two polypeptides can be separated from one another.
  • binding property of Gremiin is meant the ability of Gremiin (or fragments and derivatives derived therefrom) to bind to BMPs, in particular to BMP-2, -4 or -7. By binding of Gremiin to the BMPs, the latter, as already mentioned, are inhibited.
  • the second polypeptide has a human Fc domain of an immunoglobulin, in particular of IgG 2 .
  • Gremiin By linking Gremiin with the Fc portion of an immunoglobulin, the purification of the fusion protein is greatly facilitated, and the serum stability thereof is increased. As a relatively small molecule, Gremiin has only a short serum half-life, which limits its clinical use. By linking to Fe, the stability of Gremiin in vivo can be improved.
  • Fe stands for "fragment crystallizable”; this fragment is formed by papain cleavage of the IgG molecule next to the two Fab fragments.
  • the Fc domain consists of the paired C H 2 and C H 3 domains, including the hinge region, and contains the part of the immunoglobulin that is responsible, inter alia, for the dimerization reaction.
  • commercially available human or mouse Fc DNA can be used, which can either be isolated from commercially available cDNA libraries by PCR, or which is already cloned into plasmids, which in turn can be purchased (for example, available from the company Invitrogen, San Diego, USA).
  • a variant of the Fc domain or a synthetic Fc fragment is used, which in the complex ment and Fc receptor binding region is mutated such that activation of the immune system is largely reduced and possibly even absent.
  • the first polypeptide has an amino acid sequence with SEQ ID NO: 1 from the attached sequence listing showing the sequence of the IgG 2 Fc moiety.
  • a polypeptide is advantageously provided, which is derived from the Fc fragment of the human IgG 2 - variant.
  • the second polypeptide has an amino acid sequence selected from SEQ ID NO. 2 or 3, or variants or fragments thereof that have the BMP binding function.
  • SEQ ID NO: 2 represents the amino acid sequence of murine Gremiin
  • SEQ ID NO: 3 the amino acid sequence of human Gremiin, in both cases without the signal sequence or the signal peptide comprising 24 amino acids.
  • the fusion protein does not necessarily fulfill the full function in order to fulfill the function according to the invention. must have identical amino acid sequence of Gremiin. Rather, the inventive function of the fusion protein is also fulfilled if the second polypeptide a fragment or a sequence variant of Gremiin, but still exerts the BMP binding function of Gremiin in possibly attenuated form. It is known that the proteinogenic amino acids are divided into four groups, namely polar, non-polar, acidic and basic amino acids.
  • the present invention also encompasses such a fusion protein which as a second polypeptide is a variant of Gremiin in which one or more amino acids of one of the said amino acid classes is exchanged for another amino acid of the same class.
  • a sequence variant is preferably about 70%, more preferably about 80% and most preferably about 90 to 95% homologous to the amino acid sequence of Gremiin.
  • the first polypeptide is linked directly or via one or more linker peptides with the second polypeptide.
  • the linker peptide contains the amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID No. 4). This sequence acts as a kind of spacer. It is understood that another sequence can also be used, preferably a sequence which is similar in polarity to the aforementioned. It is within the skill and skill of the art to identify suitable sequences and incorporate them into the fusion protein to link the first peptide to the second polypeptide.
  • the linker peptide via which the first polypeptide is linked to the second polypeptide in a preferred embodiment, optionally in addition to the mentioned in the previous paragraph also an amino acid sequence with SEQ ID NO. 5 from the attached sequence listing.
  • This amino acid sequence represents a thrombin site. This site can be inserted to solubilize Gremiin from Fe, if desired, by thrombin digestion.
  • linker peptides can be used to link the two polypeptides, if desired, in particular those that lead to no or only a slight change in the biological activity of the corresponding fusion protein compared to the indicated linker molecule, so that such an amino acid exchange the fusion protein according to the invention is largely unaffected in its function. It is understood, however, that the insertion of such a linker peptide is not mandatory, and this can be completely dispensed with.
  • the fusion protein according to the invention is preferred if it has the amino acid sequence with the SEQ ID Nos. 7 or 8.
  • the two sequences differ in that the sequence designated by SEQ ID No. 7 has a sequence for the secretion signal, whereas the sequence with SEQ ID No. 8 does not include this sequence.
  • the human Gremlin sequence can also be used; this is shown in SEQ ID NO. 3, so that a fusion protein is likewise protected which has the SEQ ID NO. 9 owns.
  • the invention further relates to a nucleic acid molecule comprising a sequence selected from the group: a) the nucleic acid sequence which codes for the fusion protein with the SEQ ID Nos. Or 8 or 9, or a variant thereof, which for the same polypeptide according to the degeneracy of the genetic code; b) a nucleic acid sequence coding for a polypeptide which codes for at least 70% sequence homology to the polypeptide by the SEQ ID NOs. ID Nos.
  • nucleic acid sequence encodes a polypeptide comprising from its N-terminus to its C-terminus IgG2 Fe, a nucleic acid sequence encoding a first linker epitope, a nucleic acid sequence encoding a thrombin site, one for Gremiin or a nucleic acid sequence encoding a functional variant thereof which is capable of binding to BMP; c) a nucleic acid encoding a polypeptide having in the 5'-3 'direction a first portion encoding IgG2 Fe, a second portion representing the amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly -Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, a third section encoding a thrombin site, and a fourth section encoding gremiin or a fragment or variant thereof encoding the BMP binding function of Gremiin has.
  • the invention further relates to a vector comprising a nucleic acid according to the invention; Furthermore, the invention relates to a fusion protein encoded by a nucleic acid according to the invention, as well as a cell expressing the fusion protein according to the invention.
  • fusion proteins of the invention can be prepared using recombinant expression vectors known in the art.
  • a "vector” / "expression vector” is understood as meaning a replicable DNA construct which is used for expression of the DNA encoding the fusion protein according to the invention; it comprises a transcription unit comprising an array of one or more genetic elements having a regulatory role in gene expression, for example promoters, operators or enhancers, operatively linked to a DNA sequence encoding the fusion protein of the invention expressed in mRNA transcribed and translated into the protein, and a suitable transcriptional and translational onstart and translation stop sequences.
  • the choice of promoter and other regulatory elements will generally vary depending on the (host) cell used.
  • the nucleic acid encoding the fusion protein of the invention is transfected into a host cell using recombinant DNA techniques; Suitable host cells include prokaryotic, yeast or eukaryotic cells, and will be readily apparent to one of ordinary skill in the art, in light of the present specification.
  • the host cells which have been transfected or transformed with an expression vector carrying the nucleic acid encoding the fusion protein according to the invention are cultured under conditions which promote the expression of the fusion protein according to the invention.
  • the fusion protein can then be purified and isolated from the culture medium or host cells by methods known in the art (see, for example, Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd Edition).
  • the invention also relates to cells which contain the nucleotide sequences coding for said peptide, preferably in an expression vector, and in which the polypeptide is expressed therewith.
  • the polynucleotides / nucleic acid sequences can be functionally linked to suitable expression control sequences in order to produce the relevant peptide recombinantly.
  • suitable expression control sequences are known in the art. General methods for expression of recombinant proteins are also known and exemplified by Kaufman in Methods in Enzymology (1990), 185: 537-566.
  • Suitable mammalian host cells such as, for example, monkey COS cells, ovarian cells of Hamsters (CHO cells), human kidney 293 cells, human epidermal 431 cells, human Colo205 cells, CV-1 cells, other transformed primate cell lines, cell lines derived from in vitro cultures of primary tissue or primary explants, Etc.
  • polynucleotides / nucleic acid sequences of the invention are linked to control sequences in insect expression vectors. These techniques are also known in the art.
  • the proteins / peptides may also be produced in lower eukaryotes, such as yeast, or in prokaryotes, such as bacteria.
  • Saccharomyces ssp. and Escherichia coli which can express heterologous proteins.
  • the appropriately transformed cells are cultured under suitable conditions in order to express the protein / peptide. Subsequently, the protein can be isolated from culture supernatants or from cell extracts and purified by methods known in the art.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing a fusion protein of the invention in a pharmaceutically effective amount, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, and / or optionally with other pharmaceutically active substances.
  • additives include any compound or composition which is advantageous for a therapeutic use of the composition, among which salts, Binders, solvents, dispersants, and other substances commonly used in the formulation of drugs.
  • the fusion protein according to the invention can be integrated into a suitable administration for the respective therapy.
  • administration include parenteral, e.g. intravenous, intradermal, subcutaneous, transdermal, transmucosal administration.
  • parenteral e.g. intravenous, intradermal, subcutaneous, transdermal, transmucosal administration.
  • the fusion protein With a composition prepared according to the invention, which contains the fusion protein according to the invention, and which is administered to the patient to be treated, for example injected, the fusion protein accumulates via gremiin in the area of the lesions and can bind to BMPs, which in turn inhibit them.
  • BMPs BMPs
  • the present invention also relates to the use of Gremiin itself for the treatment of said diseases.
  • the protein Gremiin may be fused with other polypeptides which stabilize the protein, such as Fe, and may be cleaved again by Gremiin in vivo.
  • Gremiin can be modified, for example, with polyethylene glycol and thereby stabilized (PEGylation), and thereby also used in this form for the treatment of the listed diseases.
  • A RT-PCR for the semiquantitative presentation of the expression of gremiin at the RNA level
  • B and C immunohistochemical staining for the expression of gremiin at the protein level
  • FIG. 2 foam cell formation under the influence of Gremiin;
  • A foam cell formation under the influence of 500, 1000, and 2000 ng / ml medium;
  • B foam cell formation under the influence of Gremiin 1000 ng / ml and PRDC, BMP-2, -4 and -7 and 1000 ng / ml each in 5 independent foam cell cultures;
  • FIG. 3A Analysis of the supernatants from the foam cell cultures in the cytokine array
  • FIG. B, C, D concentrations of MIF, MCP-1 and CXCL1 under the influence of gremiin in the supernatant of monocytes, macrophages and foam cells
  • Fig. 4 is a graph showing the reduction in MIF concentration when Gremiin is given already after 8 hours incubation of monocytes;
  • Fig. 5 is a graph showing the apoptosis rate results under the influence of gremiin in macrophages / foam cells compared to PRDC and BMP2;
  • Fig. 6 shows the results of experiments to study migration inhibition of monocytes by Gremiin in the Boyden chamber (A); and (B) and (C): the results of studies on the regulation of MMP2 activity by Gremiin;
  • Fig. 7 shows the schematic structure of murine Gremlin-Fc (upper part) and the corresponding amino acid sequence (lower part);
  • Figure 9 shows the detection of binding of murine Gremlin-Fc to BMP-4.
  • FIG. 1A shows the results of the RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction):
  • RNA was isolated from the individual cell types by means of the RNeasy Mini Kit from Qiagen (Hilden, Germany) purified and used to carry out the RT-PCR.
  • Gremiin showed the highest expression in smooth muscle cells; furthermore, its expression could be detected in monocytes, macrophages and foam cells.
  • the macrophages and foam cells were formed from the isolated monocytes by culturing in serum-rich medium together with acLDL (acetylated low-density lipoprotein) for 7 days (macrophages) or 14 days (foam cells).
  • acLDL acetylated low-density lipoprotein
  • Figure 1B shows the results of immunohistochemical staining demonstrating the expression of gremiin at the protein level: Immunofluorescent staining with anti-Gremlin human and secondary monocyte (B) and macrophage and foam cell (C) antibodies is shown. Monocytes, macrophages and foam cells were human stained simultaneously with anti-CD68.
  • Fig. 2A shows the foam cell formation under the influence of 500, 1000 and 2000 ng Gremiin per ml medium: It was found that under the influence of Gremiin significantly less foam cells per visual field were present.
  • Figure 2B shows the foam cell formation under the influence of Gremiin 1000 ng / ml and PRDC, BMP-2, -4 and -7, each at 1000 ng / ml in 5 independent foam cell cultures. It could be shown that only under the influence of Gremiin a significant decrease in foam cell counts occurred. PRDC and BMP-2 and -7 even led to a tendency to increase foam cell counts.
  • the supernatants from the foam cell cultures were examined in CytokinArray: For this purpose, monocytes were cultured together with platelets in serum-rich medium for 15 days. Murine skeletal protein was added to culture at a concentration of 2000 ng / ml and 5000 ng / ml medium on day 1. The control proteins used were again PRDC, BMP-2, -4 and -7, each at a concentration of 2000 ng / ml. The supernatants were collected on day 15 and frozen in CytokinArray at -20 ° C until analysis.
  • Gremiin reduces the expression of MIF and CXCL1 also in monocytes and macrophages
  • Gremiin is also shown to regulate the activity of MMP2: Monocytes were cultured in serum-rich medium along with acLDL for 14 days to form macrophages and foam cells. On day 1.5 and 10, Gremiin 1 g / ml was added to each. On day 14, the supernatants were collected and visualized using gelatin zymography. their matrix metalloproteinase activity (MMP2 and MMP9). Gremiin resulted in a significant reduction of MMP2, the activity of MMP9 was not significantly affected. The reduction in MMP2 activity is probably due to the reduction in MIF concentration, which is reduced by Gremiin. The positive control was ILIO (Interleukin 10), which stimulates the secretion of MIF.
  • ILIO Interleukin 10
  • a fusion protein according to the invention was generated.
  • the IgG 2 Fc portion was fused via a spacer (linker peptide) and a thrombin interface with murine Gremiin (mGremlin).
  • this construct was further fused with the IgK leader sequence, which is a secretion signal.
  • the schematic overview shows that thus the C-terminus of IgG 2 Fe is linked to the N-terminus of a spacer whose C-terminus is in turn connected to the N-temrinus of a thrombin interface whose C-terminus is in turn connected to the N-terminus. Terminus of Gremiin is linked.
  • the C-terminus of the secretion signal is fused.
  • This structure is shown schematically in Flg. 7, wherein the amino acid sequence of this embodiment is shown in FIG. 7 below.
  • the fusion protein is also referred to herein as mGremlin-Fc.
  • CHO cells Choinese hamster ovary, CHO flp-In were stably transfected with a vector containing the fusion gene (pCDNA5_FRT).
  • pCDNA5_FRT a vector containing the fusion gene
  • a Western blot was prepared, using in each case 1 mg of the mGremlin-Fc, the IgK-Fc and the positive control (recombinant murine gremiin).
  • the recombinant mGremlin and the mGremlin Fc were detected by means of an anti-gremlinl antibody (Abcam, ab45292), the IgK Fc by means of an anti-human IgG antibody (Jackson, ImmunoResearch, Pennsylvania, USA; No. 109-035-098).
  • the results of this Western blot are shown in FIG.
  • the fusion protein could be successfully obtained from the culture supernatants.
  • the binding ability of the fusion protein to BMP-4 was examined.
  • a BMP-4 ELISA was carried out with increasing mGremlin-Fc concentrations.
  • the results of this experiment are shown in Figure 9, after which a concentration-dependent binding of the protein Gremiin to BMP-4 could be demonstrated.
  • the IgK Fc used for control has no binding activity, which could preclude any non-specific binding of the Fc portion.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Proteins Gremlin sowie ein Fusionsprotein, enthaltend a) ein erstes Poly-peptid, das eine Immunglobulin Fc- Domäne aufweist, sowie b) ein zweites Polypeptid, das Gremiin oder Fragmente oder Varianten davon aufweist, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, wobei das erste Polypeptid und das zweite Peptid direkt oder über ein Linkerpeptid miteinander verknüpft sind. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Fusionsproteins zur Behandlung von Erkrankungen.

Description

Therapeutisches Protein
[0001] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein mit therapeutischem, insbesondere anti-entzündlichem oder immunmodulierendem Potenzial, sowie dessen Einsatz zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen entzündliche, immun- modulatorische und/oder generative Prozesse eine Rolle spielen, wie insbesondere im Herzkreislaufbereich bei der Atherosklerose, nach akutem Myokardinfarkt, im Rahmen einer akuten und chronischen Myokarditis, und bei der fortgeschrittenen Herzinsuffizienz, sowie entzündlichen Autoimmunerkrankungen; ferner betrifft die Erfindung ein das Protein enthaltendes Fusionsprotein, ein hierfür codierendes Nukleinsäuremolekül, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Protein enthält, sowie die Verwendung des Proteins oder der pharmazeutischen Zusammensetzung zur therapeutischen Behandlung. [0002] Erkrankungen, bei denen entzündliche, immunmodulatorische und/oder generative Prozesse eine Rolle spielen, wie insbesondere im Herzkreislaufbereich bei der Atherosklerose, nach akutem Myokardinfarkt, im Rahmen der akuten und chronischen Myokarditis und bei fortgeschrittener Herzinsuffizienz, sowie entzündlichen Lungen- und Autoimmunerkrankungen, sind nach wie vor in ihrer Genese nicht oder nicht vollständig erforscht und stellen oftmals hochkomplexe Prozesse dar, bei welchen oftmals verschiedene Faktoren beteiligt sind.
[0003] So ist bspw. die Atherosklerose ein hochkomplexer aktiver pathologischer Prozess, in dessen Zentrum eine inflammatorische Reaktion in den Wänden der blutführenden Gefäße eines betroffenen Individuums steht. Die Entstehung der Atherosklerose, die sogenannte Atherogenese, kann in mehrere Phasen unterteilt werden.
[0004] Die frühe Phase der Atherogenese ist gekennzeichnet durch eine sogenannte endotheliale Dysfunktion. Eine Reihe unterschiedlicher Risikofaktoren wie z.B. Rauchen, Übergewicht, körperliche Inaktivität, Hyperlipoproteinämie und Typ- Ii-Diabetes sowie andere bislang noch nicht identifizierte Faktoren führen zu einer Schädigung des Endothels. Die Permeabilität des Endothels für Lipoproteine und andere zirkulierende Stoffe im Plasma nimmt hierdurch zu. In der Folge werden Endothelzellen aktiviert und exprimieren vermehrt sogenannte Adhäsionsmoleküle auf der Zelloberfläche. Darunter vermitteln vor allem sogenannte Selektine zunächst den temporären Kontakt bestimmter Blutzellen wie Monocyten und T-Lymphocyten mit dem Endothel. Durch eine weitere Gruppe von Adhäsionsmolekülen, den sogenannten Cellular Adhesion Molecules (CAMs), kommt es zur festen Anheftung dieser Zellen an die Gefäßwand.
[0005] Im weiteren Verlauf dringen vor allem Monocyten und in geringerem Ausmaß T-Lymphocyten in den subintimalen Raum ein. Dieses Eindringen wird durch eine andere Gruppe von Molekülen, zu denen z.B. das Chemokin Monocyte- Chemoattractant-Protein-l(MCP-l) gehört, vermittelt. Es kommt zur Differenzierung der Monocyten in Makrophagen im subintimalen Raum.
[0006] Im geschädigten Endothel kommt es ferner zur Oxidation von Lipoprotein mit geringer Dichte (LDL) und dadurch zur Bildung von oxLDL. Das oxLDL wird in den subintimalen Raum abgegeben, wo es die dort aus Monocyten hervorgegangenen Makrophagen belädt. Diese Makrophagen werden durch die Beladung mit oxLDL zu sogenannten Schaumzellen transformiert, den charakteristischen Zellen der atherosklerotischen Plaques, die als weitere Bestandteile u.a. T- Lymphocyten und aus der Media eingewanderte glatte Muskelzellen enthalten.
[0007] Diese Plaques lagern sich an den Arterienwänden ab und werden dabei von einer stabilisierenden fibrösen Kappe bestehend aus Glattmuskelzellen und extrazellulärer Matrix überzogen. Der atherosklerotische Plaque steht nun im Zentrum einer inflammatorischen Reaktion, bei der es zur Produktion von verschiedensten Entzündungsmediatoren kommt, wie Cytokinen, Chemokinen, Proteasen etc. Dabei kann es zu Gewebenekrosen kommen, in deren Nachbarschaft Kalksalze abgelagert werden. Dadurch kann das Gefäßlumen bis zum völligen Verschluss mit der Folge von Durchblutungsstörungen verengt werden.
[0008] Auch bei anderen entzündlichen Erkrankungen, wie bspw. des Herzkreislaufsystems, der Lunge, oder bei entzündlichen Autoimmunerkrankungen allgemein, spielen, und dies hat die Forschung in den vergangenen Jahren gezeigt, u.a. auch Zytokine eine bestimmte, wenn nicht sogar ursächliche, Rolle.
[0009] Ein Ansatz zur Behandlung von durch Zytokinen angestoßenen, mit verursachten oder hervorgerufenen Krankheiten wäre es daher, gezielt gegen die Ausschüttung/Bildung oder Wirkung von bestimmten Zytokinen vorzugehen.
[0010] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein solch neues Mittel bereitzustellen. [0011] Diese Aufgabe wird durch ein Protein gelöst, das die Sequenz von Gremiin besitzt, oder Varianten oder Fragmente davon, die die BMP- Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Reduzierung der MIF-Bildung und/oder der CXCLl-Bildung und/oder der MCP- 1-Bildung und/oder der Schaumzellbildung behandelbar sind.
[0012] Diese Aufgabe wird ferner durch ein Fusionsprotein gelöst, das (a) ein erstes Polypeptid ist, das eine Immunglobulin Fc-Domäne aufweist, sowie (b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-(Bone Morphogenetic Proteine) Bindungsfunktion von Gremiin besitzen. Dabei ist insbesondere bevorzugt, wenn das Fusionsprotein in Richtung N- Terminus zum C-Terminus (a) ein erstes Polypeptid, das eine Immunglobulin Fc- Domäne aufweist, sowie (b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-(Bone Morphogenetic Proteine) Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, enthält.
[0013] Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird ferner gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Protein, das die Sequenz von Gremiin besitzt, oder Varianten oder Fragmente davon, die die BMP- Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, oder das Fusionsprotein gemäß der Erfindung in einer pharmazeutisch wirksamen Menge enthält, gegebenenfalls in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger, sowie durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Fusionsprotein oder der dieses enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Atherosklerose, ischämischen Herzerkrankungen, Herzinfarkt, Schlaganfall, Herzinsuffizienz, Myokarditis, inflammatorischer Kardiomyopathie, entzündlichen rheumatischen und Autoimmun-Erkrankungen, zur Regeneration von ischämischem Gewebe nach Mykardinfarkt, und bei der Ischämie/Reperfusion nach Organtransplantation.
[0014] Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auf diese Weise vollkommen gelöst. [0015] Das Protein Gremiin, das auch als "Drm" bekannt ist, gehört als Protein der DAN-Familie zu den BMP (bone morphogenetic proteins; knochenmorpho- genetischen Proteine)- Antagonisten und spielt eine tragende Rolle bei Differenzierungsprozessen verschiedener Organsysteme während der embryonalen Entwicklung. So ist bspw. von Gremiin- 1 bekannt, dass es mit den BMP-2, -4 und -7 eine antagonistische Reaktion eingeht und diese inhibiert.
[0016] BMPs steuern auch im adulten Organismus zahlreiche physiologische und pathologische Prozesse. Die BMPs sind eine Gruppe ähnlicher Signalproteine, durch deren Ausschüttung benachbarte Zellen beeinflusst werden können, und stellen damit Zytokine dar. So können BMPs u.a. die Expression zahlreicher Zielgene regulieren, worüber sie auf molekulare Mechanismen Einfluss nehmen können, die für die physiologische Funktion von Monozyten/Makrophagen sowie von Endothelzellen und glatten Muskelzellen von Bedeutung sind. BMPs beeinflussen u.a. das Adhäsionsverhalten von Endothelzellen und glatten Muskelzellen, sowie die Aktivität von Metalloproteinasen in verschiedenen Zelltypen. Die Rolle der BMPs bei der Entstehung und Progression der Atherogenese ist bisher kaum untersucht worden, und auch über die Rolle ihrer Antagonisten ist wenig bekannt.
[0017] Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung konnten nun zeigen, dass Gremiin die Sekretion oder Expression des "Macrophage Migration Inhibitory Factor" (Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor), des Chemokins CXCL1 und des Monocyte Chemoattractant Protein - 1 (Monozyten-Chemoattraktantprotein; MCP- 1) senkt. So führt Gremiin zu einer Hemmung der Schaumzellbildung, reguliert die Monozytenmigration und hemmt die Aktivität der Matrixmetalloproteinase 2 (MMP2). Damit kann die bei der Artherogenese eintretende Schaumzellbildung erfolgreich unterbunden und damit die Entwicklung der Artherosklerose erfolgreich bekämpft werden. Durch die Bindung von Gremiin an die BMPs - und dadurch durch die Inhibierung der BMPs - kann deren Einfluss auf u.a. Monozyten zur Schaumzellbildung bei der Artherogenese unterbunden werden, sowie die Bildung/Sekretion des "Macrophage inhibitory Factor" (Makrophagen-Inhibitions-Faktor) inhibiert werden. Der Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor (MIF) wurde erstmals 1966 als ein von T-Lymphozyten sezerniertes Zytokin beschrieben, mit der Fähigkeit die ungerichtete Migration von Makrophagen zu hemmen. Inzwischen wurde MIF in vielen Organsystemen nachgewiesen, und es wird angenommen, dass dieses Zytokin auch bei der Zell-vermittelten Immunität, Immunregulierung und bei Entzündungsreaktionen, wie bspw. auch bei der rheumatoiden Arthritis, beteiligt ist. Ferner fördert MIF die Plaquebildung und das Plaquewachstum, fördert die Aktivität der Matrixmetal- loproteinase 2 und 9, und reguliert die Adhäsion und Migration von Monozyten und Makrophagen. MIF verstärkt den myokardialen Schaden nach Ischämie und stimuliert die myokardiale Apotose.
[0018] Durch die Inhibierung von MIF mittels Gremiin wird daher ein wir- kunsgsvolles Werkzeug zur Bekämpfung von Krankheiten bereitgestellt, bei denen MIF, aber auch MCP-1 und CXCL1, eine auslösende bzw. wichtige Rolle spielen.
[0019] Das zur Inhibierung von MIF und/oder CXCL1 und/oder MCP-1 eingesetzte Protein Gremiin kann dabei die in dem angefügten Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenzen SEQ ID Nr. 2 (murin) oder 3 (human) besitzen, sowie andere kreuz-reaktive Arten, oder Fragmente oder Varianten davon, die immer noch die gleiche Bindungseigenschaft wie Gremiin besitzen.
[0020] Unter "Fragment" oder unter einer "Variante", das bzw. die die Bindungsfunktion des jeweiligen Polypeptids besitzt, wird vorliegend eine Aminosäuresequenz verstanden, die sich von der Wildtyp-Sequenz bzw. der hierin angegebenen Sequenz durch einen oder mehrere Aminosäureaustausche unterscheidet. Solche modifizierte Aminosäuren können "konservative" Aminosäurenaustausche aufweisen, bei denen die ausgetauschte Aminosäure die gleichen oder ähnlichen Eigenschaften wie die ersetzte Aminosäure aufweist. Ähnliche kleine Veränderungen können auch Aminosäuredeletionen und/oder -Insertionen umfassen. Eine Anleitung zur Bestimmung, welche und wie viele Aminosäurereste substituiert, insertiert oder deletiert werden können, ohne die biologische Aktivität aufzuheben, kann bspw. unter Verwendung vom im Stand der Technik bekannten Computerprogrammen gefunden werden. Die vorliegend umfassten Protein- oder Polypeptidvarianten oder Fragmente davon umfassen insbesondere Gremlin-Proteine und davon abgeleitete Varianten, sowohl von murine als auch humane, oder Fragmente davon, die jeweils noch die Gremlin-Bindungseigenschaft besitzen, und zwar die identische oder eine im Wesentlichen äquivalente. Dies bedeutet, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Gremlin-Fragmente oder -Variationen geeignet sind, die wie Gremiin noch eine Bindungseigenschaft an BMPs besitzen. Ob ein modifiziertes Gremlin-Polypeptid die Bindungseigenschaften des unmodifizierten Gremlin-Polypeptids besitzt, kann bspw. in in v/tro-Assays untersucht werden, wie sie in der vorliegenden Anmeldung nachstehend noch beschrieben werden. Daher umfassen Varianten auch Polypeptide mit jeweils etwas 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% Sequenzidentität mit dem jeweiligen Wildtyp-Polypeptid/-Protein. Um den Prozentsatz der Sequenzidentität zweier Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen zu bestimmten, kann gemäß im Stand der Technik bekannten Verfahren vorgegangen werden, bspw. mittels eines Alignments und Berechnung über einen mathematischen Algorithmus.
[0021] Zu den Krankheiten bzw. Erkrankungen, für deren Behandlung der Einsatz des Proteins Gremiin, oder von Varianten/Fragmenten davon, geeignet ist, zählen alle entzündlichen und immunmodulatorischen Erkrankungen, u.a. Atherosklerose und ischämische Herzerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Herzinsuffizienz, Myokarditis inflammatorischer Kadriomyopathie, entzündlichen rheumatischen und Autoimmun-Erkrankungen, zur Regeneration von ischämischen Gewebe nach Mykardinfarkt, und bei der Ischämie/Reperfusion nach Organtransplantation. All diese Erkrankungen haben gemein, dass bei ihnen die Beteiligung von MIF, CXCL1 und MCP-1 gezeigt bzw. abgeleitet wurde.
[0022] Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft die Erfindung auch ein Fusionsprotein, Fusionsprotein enthaltend a) ein erstes Polypeptid, das eine Immunglobulin Fc-Domäne aufweist, und b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen. [0023] Das erste Polypeptid wird hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz derart gestaltet, dass dieses die Fc-Domäne eines Immunglobulins aufweist; die Fc- Domäne
[0024] Das zweite Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, ist dabei durch geeignete Wahl der Aminosäuresequenz derart gestaltet, dass es an BMP bindet. Dabei ist im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl murines Gremiin als auch humanes Gremiin sowie andere human-kreuzreaktive Arten zur Verwirklichung des Fusionsproteins geeignet.
[0025] Vorliegend wird unter einem "Fusionsprotein" ein Hybridprotein bzw. ein artifizielles Protein verstanden, welches in vitro aber auch in vivo durch im Stand der Technik bekannte molekularbiologische oder chemische Verfahren herstellbar ist. So kann das Fusionsprotein bspw. durch Konjugation zweier (oder mehrerer) Polypeptide mittels eines oder mehrerer chemischer Reagenzien oder durch rekombinante DNA-Technologien, also durch genetische "Verknüpfung" der für die Proteine kodierenden Nukleinsäuren hergestellt werden. Dabei besteht die Möglichkeit, das Fusionsprotein durch Verwendung üblicher Expressionsvektoren zu generieren, die für das erfindungsgemäße Fusionsprotein codieren. Diese Expressionsvektoren werden in eine geeignete Zelle eingebracht, die dann das Fusionsprotein produziert.
[0026] Unter den Begriffen "Linker" oder "Linkerpeptid", die vorliegend synonym verwendet werden, wird in der vorliegenden Erfindung eine Aminosäurenoder eine diese kodierende Nukleinsäuresequenz mit bis zu 100 Aminosäuren/Basen verstanden, die der Verknüpfung zweier funktionellen Polypeptide dient, und die ggf. einen Abstand zwischen den beiden funktionellen Polypeptiden generiert, ohne dabei eine Bindungseigenschaft an andere Moleküle zu besitzen. Es handelt sich hierbei also um eine "neutrale" Sequenz, die außer den eben beschriebenen Funktionen keine anderen erfüllt oder erfüllen kann. In bestimmten Ausführungsbeispielen kann das Linkerpeptid auch Schnittstellen für bestimmte Enzyme aufweisen, über welche die beiden Polypeptide voneinander getrennt werden können.
[0027] Unter "Bindungseigenschaft von Gremiin" wird dabei die Fähigkeit von Gremiin (oder davon abgeleiteten Fragmenten und Derivaten) verstanden, an BMPs, insbesondere an BMP-2, -4 oder -7 binden zu können. Durch die Bindung von Gremiin an die BMPs werden letztere, wie bereits erwähnt, inhibiert.
[0028] Dabei ist es bevorzugt, wenn das zweite Polypeptid eine humane Fc- Domäne eines Immunglobulins, insbesondere von IgG2, aufweist.
[0029] Durch die Verknüpfung von Gremiin mit dem Fc-Anteil eines Immunglobulins wird die Aufreinigung des Fusionsproteins deutlich erleichtert, sowie die Serumstabilität dessen erhöht. Gremiin besitzt als relativ kleines Molekül nur eine kurze Serum-Halbwertszeit, was dessen klinische Verwendung beschränkt. Durch die Verknüpfung mit Fe kann die Stabilität von Gremiin in vivo verbessert werden.
[0030] "Fe" steht für "fragment crystallizable"; dieses Fragment entsteht durch Papain-Spaltung des IgG-Moleküls neben den beiden Fab-Fragmenten. Die Fc- Domäne besteht aus den gepaarten CH2- und CH3-Domänen einschließlich der Gelenkregion (engl, "hinge region") und enthält den Teil des Immunglobulins, der u.a. für die Dimerisierungsf nktion verantwortlich ist. Vorteilhafterweise kann hierbei auf käuflich erhältliche humane - oder Maus - Fc-DNA zurückgegriffen werden, die entweder aus käuflich erhältlichen cDNA-Bibliotheken durch PCR isoliert werden kann, oder die bereits in Plasmide kloniert vorliegt, welche wiederum käuflich erworben werden können (bspw. erhältlich von der Firma Invitrogen, San Diego, USA).
[0031] In einem Ausführungsbeispiel ist bevorzugt, wenn eine Variante der Fc-Domäne oder ein synthetisches Fc-Fragment eingesetzt wird, welches im Komple- ment- und Fc-Rezeptorbindungsbereich derart mutiert ist, dass eine Aktivierung des Immunsystems weitgehend reduziert wird und ggf. sogar ausbleibt.
[0032] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die Verträglichkeit des erfindungsgemäßen Fusionsproteins weiter erhöht wird. So reicht es nach Erkenntnissen der Erfinder für die erfindungsgemäße Funktion des Fusionsproteins nämlich aus, wenn das zweite Polypeptid lediglich die Stabilisierungsfunktion der Fc-Domäne des Antikörpers aufweist, nicht aber die Effektorfunktionen, die eine Aktivierung des Immunsystems bewirken. Es kann deshalb bspw. auch ein synthetisches Fc-Fragment eingesetzt werden, welches im Komplement- und Fc-Rezeptorbindungsbereich derart mutiert ist, dass eine Aktivierung des Immunsystems weitgehend reduziert wird und ggf. sogar ausbleibt.
[0033] Insbesondere ist bevorzugt, wenn das erste Polypeptid eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 1 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist, die die Sequenz des IgG2 Fc-Anteils zeigt.
[0034] Mit dieser Maßnahme wird auf vorteilhafte Art und Weise ein Polypeptid bereitgestellt, das sich von dem Fc-Fragment der humanen IgG2- Variante ableitet.
[0035] Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist das zweite Polypeptid eine Aminosäuresequenz auf, die ausgewählt ist aus der SEQ ID-Nr. 2 oder 3, oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion, besitzen.
[0036] SEQ ID Nr. 2 stellt die Aminosäuresequenz von murinem Gremiin dar, SEQ ID Nr. 3 die Aminosäuresequenz von humanem Gremiin, in beiden Fällen ohne jeweils die Signalsequenz bzw. das Signalpeptid, das 24 Aminosäuren umfasst.
[0037] Es versteht sich für einen Fachmann, dass zur Erfüllung der erfindungsgemäßen Funktion das Fusionsprotein nicht zwingend die vollständige bzw. identische Aminosäuresequenz von Gremiin aufweisen muss. Vielmehr wird die erfindungsgemäße Funktion des Fusionsproteins auch dann erfüllt, wenn das zweite Polypeptid ein Fragment oder eine Sequenzvariante von Gremiin, die jedoch noch die BMP-Bindefunktion von Gremiin in ggf. abgeschwächter Form ausübt. Bekanntermaßen werden die proteinogenen Aminosäuren in vier Gruppen unterteilt, nämlich in polare, nicht-polare, saure und basische Aminosäuren. Der Austausch einer polaren Aminosäure gegen eine andere polare Aminosäure, bspw. Glycin gegen Serin, führt in der Regel zu keiner oder nur einer geringfügigen Änderung der biologischen Aktivität des entsprechenden Proteins, so dass ein solcher Aminosäureaustausch das erfindungsgemäße Fusionsprotein in seiner Funktion weitgehend unberührt lässt. Vor diesem Hintergrund erfasst die vorliegende Erfindung auch ein solches Fusionsprotein, das als zweites Polypeptid eine Variante von Gremiin, bei der eine oder mehrere Aminosäuren einer der genannten Aminosäure-Klassen gegen eine andere Aminosäure der selben Klasse ausgetauscht ist. Eine solche Sequenzvariante ist dabei vorzugsweise zu ca. 70 %, weiter vorzugsweise zu ca. 80 % und höchst vorzugsweise zu ca. 90 bis 95 % homolog zu der Aminosäuresequenz von Gremiin.
[0038] In weiteren Ausführungsformen ist bevorzugt, wenn das erste Polypeptid direkt oder über ein oder mehrere Linkerpeptide mit dem zweiten Polypeptid verknüpft ist. Dabei ist in einer Ausführungsform bevorzugt, wenn das Linkerpeptid die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-GlyGly-Gly-Ser (SEQ ID-Nr. 4) enthält. Diese Sequenz fungiert als eine Art Abstandshalter. Es versteht sich, dass auch eine andere Sequenz eingesetzt werden kann, vorzugsweise eine Sequenz, die hinsichtlich ihrer Polarität der vorgenannten ähnlich ist. Es liegt hierbei im Können und Wissen des Fachmanns, geeignete Sequenzen zu identifizieren und entsprechend in das Fusionsprotein einzubauen, um das erste Peptid mit dem zweiten Polypeptid zu verknüpfen.
[0039] Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält das Linkerpeptid, über welches das erste Polypeptid mit dem zweiten Polypeptid in einer bevorzugten Ausführungsform miteinander verknüpft ist, ggf. zusätzlich zu der im vorherigen Absatz genannten SEQ ID-Nr. 4 noch eine Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll auf. Diese Aminosäuresequenz stellt eine Thrombinschnittstelle dar. Diese Schnittstelle kann eingefügt werden, um Gremiin - falls erwünscht - durch einen Thrombinverdau vom Fe zu lösen. Es versteht sich, dass auch andere Linkerpeptide zum Verknüpfen der beiden Polypeptide eingesetzt werden können, falls gewünscht, insbesondere solche, die im Vergleich zu dem angegebenen Linkermolekül zu keiner oder nur einer geringfügigen Änderung der biologischen Aktivität des entsprechenden Fusionsproteins führen, so dass ein solcher Aminosäureaustausch das erfindungsgemäße Fusionsprotein in seiner Funktion weitgehend unberührt lässt. Es versteht sich aber, dass die Einfügung eines solchen Linkerpeptids nicht zwingend notwendig ist, und auf dieses auch vollständig verzichtet werden kann.
[0040] Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Fusionsproteins ist bevorzugt, wenn es die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 7 oder 8 aufweist. Die beiden Sequenzen unterscheiden sich dadurch, dass die mit der SEQ ID Nr. 7 bezeichnete Sequenz eine Sequenz für das Sekretionssignal aufweist, wohingegen die Sequenz mit der SEQ ID Nr. 8 diese Sequenz nicht umfasst. Ferner können statt den in den Sequenzen 7 und 8 angegebenen murinen Gremlin-Sequenzen auch die humane Gremlin-Sequenz eingesetzt werden, diese ist in der SEQ ID Nr. 3 gezeigt, so dass entsprechend auch ein Fusionsprotein geschützt ist, das die SEQ ID Nr. 9 besitzt.
[0041] Die Erfindung betrifft ferner ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe: a) die Nukleinsäuresequenz, die für das Fusionsprotein mit der SEQ ID Nr. oder 8 oder 9 kodiert, oder eine Variante davon, welche für das gleiche Polypeptid gemäß der Degeneration des genetischen Codes kodiert; b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch die SEQ- ID Nr. 7, 8 oder 9 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, umfassend von seinem N-Terminus zu seinem C- Terminus IgG2 Fe, eine für ein erstes Linkerpepitd codierende Nukleinsäuresequenz, eine für eine Thrombinschnittstelle codierende Nukleinsäuresequenz, eine für Gremiin oder für eine funktionelle Variante davon codierende Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, an BMP zu binden; c) eine Nukleinsäure kodierend für ein Polypeptid, die in 5'-3'-Richtung einen ersten Abschnitt aufweist, der für IgG2 Fe kodiert, einen zweiten Abschnitt, der für die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-GlyGly-Gly-Ser kodiert, einen dritten Abschnitt, der für eine Thrombinschnittstelle kodiert, und einen vierten Abschnitt, der für Gremiin oder ein Fragment oder eine Variante davon kodiert, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzt.
[0042] Die Erfindung betrifft darüber hinaus einen Vektor, umfassend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure; ferner betrifft die Erfindung ein Fusionsprotein, kodiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, sowie eine Zelle, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein exprimiert.
[0043] Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten rekombinanten Expressionsvektoren hergestellt werden. Vorliegend wird dabei unter einem "Vektor"/"Expressionsvektor" ein replizierbares DNA-Konstrukt verstanden, das zur Expression des erfindungsgemäßen Fusionsproteins kodierender DNA verwendet wird; es umfasst eine Transkriptionseinheit, die eine Anordnung von einem oder mehreren genetischen Elementen mit einer regulatorischen Rolle bei der Genexpression, zum Beispiel Promotoren, Operatoren oder Enhancer, umfasst, die funktionell verbunden sind mit einer für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierenden DNA-Sequenz, die in mRNA transkribiert und in das Protein translatiert wird, und einem geeigneten Transkriptions- sowie Translati- onsstart- und Translationsstoppsequenzen. Die Wahl des Promotors und anderer regulatorischer Elemente variiert im Allgemeinen je nach der eingesetzten (Wirts- )zelle. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die für das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken in eine Wirtszelle transfiziert; geeignete Wirtszellen umfassen prokaryotische, Hefe- oder eukaryotische Zellen, und sind dem Fachmann leicht aufgrund seines Fachwissens in Verbindung mit der vorliegenden Beschreibung zugänglich.
[0044] Zur Herstellung des rekombinanten Fusionsproteins, werden die Wirtszellen, die mit einem Expressionsvektor, der die das erfindungsgemäße Fusionsprotein kodierende Nukleinsäure trägt, transfiziert bzw. transformiert wurden, unter Bedingungen kultiviert, die die Expression des erfindungsgemäßen Fusionsprotein fördern. Das Fusionsprotein kann dann aus dem Kulturmedium oder den Wirtszellen mit im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt und isoliert werden (siehe hierzu bspw. Sambrook und Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Auflage).
[0045] Dementsprechend betrifft die Erfindung auch Zellen, die die Nukleotidsequenzen, die für das genannten Peptid kodieren, enthalten, vorzugsweise in einem Expressionsvektor, und in denen damit das Polypeptid exprimiert wird. Hierzu können die Polynukleotide/Nukleinsäuresequenzen mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden werden, um das betreffende Peptid rekombinant herzustellen. Viele geeignete Expressionskontrollsequenzen sind im Stand der Technik bekannt. Allgemeine Verfahren zur Expression von rekombinanten Proteinen sind ebenfalls bekannt und beispielhaft von Kaufman in Methods in Enzymology (1990), 185:537-566 beschrieben.
[0046] Verschiedene Zelltypen können als Wirtszellen für die Expression der erfindungsgemäßen Proteine/Peptide dienen, beispielhaft werden hier geeignete Säugetierwirtszellen genannt, wie bspw. COS-Zellen von Affen, ovariale Zellen von Hamstern (CHO-Zellen), humane Nieren-293 Zellen, humane Epidermal-431 -Zellen, humane Colo205 -Zellen, CV-1 -Zellen, andere transformierte Zelllinien von Primaten, aus in vitro Kulturen von primärem Gewebe oder primären Explantaten gewonnene Zelllinien, etc.
[0047] Geeignet sind ferner auch Insektenexpressionssysteme. Hier werden die erfindungsgemäßen Polynukleotide/Nukleinsäuresequenzen mit Kontrollsequenzen in Insektenexpressionsvektoren verbunden. Diese Techniken sind im Stand der Technik ebenfalls bekannt. Alternativ können die Proteine/Peptide auch in niederen Eukaryonten, wie bspw. Hefe, oder in Prokaryonten, wie bspw. Bakterien, hergestellt werden. Beispielhaft werden hier Saccharomyces ssp. sowie Escherichia coli genannt, die heterologe Proteine exprimieren können.
[0048] Zur Isolierung der in den beispielhaft aufgeführten Zellen exprimier- ten Proteine, werden die entsprechend transformierten Zellen unter geeigneten Bedingungen kultiviert, um das Protein/Peptid zur Expression zu bringen. Anschließend kann das Protein aus Kulturüberständen oder aus Zellextrakten isoliert und mit im Stand der Technik bekannten Verfahren gereinigt werden.
[0049] Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein in einer pharmazeutisch wirksamen Menge enthält, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutische akzeptierbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff, und/oder ggf. mit weiteren pharmazeutisch wirksamen Stoffen.
[0050] Pharmazeutisch akzeptable Träger mit ggf. weiteren Zusätzen sind im Stand der Technik allgemein bekannt und werden bspw. in der Abhandlung von Kibbe A., Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, American Pharma- ceutical Association and Pharmaceutical Press 2000, beschrieben. Zusätze umfassen erfindungsgemäß jedwede Verbindung oder Zusammensetzung, die für eine therapeutische Verwendung der Zusammensetzung vorteilhaft sind, worunter Salze, Bindemittel, Lösungsmittel, Dispersionsmittel, und weitere im Zusammenhang mit der Formulierung von Arzneimitteln üblicherweise verwendete Stoffe fallen.
[0051] Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann dabei in eine für die jeweilige Therapie geeignete Verabreichung integriert werden. Beispiele für eine Verabreichung umfassen parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, subkutane, transdermale, transmukosale Verabreichungen. Mit einer erfindungsgemäß hergestellten Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthält, und die dem zu behandelnden Patienten verabreicht, bspw. injiziert wird, akkumuliert das Fusionsprotein über Gremiin im Bereich der Läsionen, und kann an BMPs binden, wodurch diese wiederum inhibiert werden. Dadurch kann erfolgreich bspw. die Schaumzellbildung bei der Artherosklerose verhindert werden, bzw. entzündliche Reaktionen, die durch BMPs ausgelöst werden, blockiert werden. Dadurch wird ein äußerst wirksames Werkzeug zur Behandlung von Krankheiten wie Atherosklerose, Rheumatoider Arthritis und Multipler Sklerose bereitgestellt.
[0052] Es versteht sich, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung nicht nur das oben beschriebene Fusionsprotein für einen Einsatz zur Behandlung von Atherosklerose oder entzündlichen Autoimmunkrankheiten geeignet ist, sondern auch bereits unfusioniertes Gremiin selber. Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Gremiin selber zur Behandlung der genannten Erkrankungen.
[0053] Alternativ und gemäß einer anderen Ausführungsform kann das Protein Gremiin mit anderen Polypeptiden fusioniert sein, die das Protein wie Fe stabilisieren und ggf. von Gremiin in vivo wieder abspaltbar sind. In einer anderen Ausführungsform kann Gremiin bspw. mit Polyethylenglycol modifiziert und dadurch stabilisiert sein (PEGylation), und dadurch auch in dieser Form zur Behandlung der aufgeführten Erkrankungen eingesetzt werden. [0054] Es versteht sich, dass die oben genannten und nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendet werden können, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Kurze Beschreibung der Figuren
[0055] Weitere Vorteile ergeben sich aus der beigefügten Beschreibung der Beispiele sowie den beigefügten Figuren. Es zeigen:
Fig. 1 die Analyse der Gremlin-Expression in verschiedenen Zelltypen der humanen arteriellen Gefäßwand; A: RT-PCR zur semiquantitativen Darstellung der Expression von Gremiin auf RNA- Ebene; B und C: Immunhistochemische Färbung zur Darstellung der Expression von Gremiin auf Proteinebene;
Fig. 2 Schaumzellbildung unter dem Einfluss von Gremiin; A: Schaumzellbildung unter dem Einfluss von 500, 1000, und 2000 ng/ml Medium; B: Schaumzellbildung unter dem Einfluss von Gremiin 1000 ng/ml sowie PRDC, BMP-2, -4 und -7 und jeweils 1000 ng/ml in 5 unabhängigen Schaumzellkulturen;
Fig. 3 A: Analyse der Überstände aus den Schaumzellkulturen im Cytoki- narray; B, C, D: Konzentrationen von MIF, MCP-1 und CXCL1 unter dem Einfluss von Gremiin im Überstand von Monozyten, Makrophagen und Schaumzellen; Fig. 4 ein Diagramm, das die Reduktion der MIF-Konzentration bei Gabe von Gremiin bereits nach 8 Stunden Inkubation von Monozyten wiedergibt;
Fig. 5 ein Diagramm, das die Ergebnisse zur Apoptose-Rate unter dem Ein- fluss von Gremiin in Makrophagen/Schaumzellen im Vergleich zu PRDC und BMP2 zeigt;
Fig. 6 die Ergebnisse von Versuchen zur Untersuchung der Migrationshemmung von Monozyten durch Gremiin in der Boyden-Kammer (A); sowie (B) und (C): die Ergebnisse der Untersuchungen zur Regulation der MMP2- Aktivität durch Gremiin;
Fig. 7 den schematischen Aufbau von murinem Gremlin-Fc (oberer Teil) sowie die entsprechende Aminosäuresequenz (unterer Teil);
Fig. 8 den Nachweis der gereinigten Proteine mittels Western Blot Analyse;
und
Fig. 9 den Nachweis der Bindung von murinem Gremlin-Fc an BMP-4. Beispiele
[0056] In Vorversuchen wurden die Expression von Gremiin in verschiedenen Zelltypen der humanen arteriellen Gefäßwand untersucht. Hierzu wurden Gewebestücke von arteriellen Gefäßwänden verschiedener Patienten, die sich einem gefäßchirurgischen Eingriff unterziehen mussten, intraoperativ gewonnen und anschließend Endothelzellen und glatte Muskelzellen daraus isoliert. Monozyten wurden aus dem peripheren Blut gesunder Erwachsener isoliert. CD34+ adulte Stammzellen wurden aus Nabelschnurblut gewonnen. [0057] Die Ergebnisse zu den Expressionsanalysen sind in Fig. 1 gezeigt: Fig. 1A zeigt die Ergebnisse der RT-PCR (Reverse-Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion): Hierzu wurde die RNA aus den einzelnen Zelltypen mittels des RNeasy Mini Kits von Qiagen (Hilden, Deutschland) aufgereinigt und zur Durchführung der RT-PCR eingesetzt. Die verwendeten Primer waren "exon-spanning" (Exon übergreifend), um falsch positiven Ergebnissen durch Kontamination mit genomischer DNA vorzubeugen. Wie Fig. 1A zu entnehmen ist, zeigte Gremiin die höchste Expression in glatten Muskelzellen; ferner konnte seine Expression in Monozyten, Makrophagen und Schaumzellen nachgewiesen werden. Die Makrophagen und Schaumzellen entstanden aus den isolierten Monozyten durch eine Kultivierung in serumreichem Medium zusammen mit acLDL (acetyliertes Low Density Lipoprotein) über 7 Tage (Makrophagen) bzw. 14 Tage (Schaumzellen). Zusätzlich ist die Expression der Bindungspartner von Gremiin, nämlich von BMP-2, -4 und -7 dargestellt. Auch die Expression der BMP-Rezeptoren IA und II wurde untersucht. Alle diese "Partner" von Gremiin konnten in den verschiedenen Zelltypen der arteriellen Gefäßwand nachgewiesen werden.
[0058] Fig. 1B zeigt die Ergebnisse der immunhistochemischen Färbungen zur Darstellung der Expression von Gremiin auf Proteinebene: Gezeigt ist die Immunfluoreszenzfärbung mit anti-Gremlin human und sekundärem Antikörper von Monozyten (B) und Makrophagen und Schaumzellen (C). Monoyzten, Makrophagen und Schaumzellen wurden gleichzeitig mit anti-CD68 human gefärbt.
[0059] Anschließend wurde die Schaumzellbildung ausgehend von Monozyten unter dem Einfluss von Gremiin untersucht. Hierzu wurden Monozyten zusammen mit Thrombozyten in serumreichem Medium über 15 Tage kultiviert. Murines Gremlinprotein wurde in 3 verschiedenen Konzentrationen, nämlich 500, 1000 und 2000 ng/ml Medium, an Tag 1 der Kultur dazugegeben. Als Kontrollproteine wurde ein dem Gremiin sehr ähnliches DAN-Protein, PRDC (Protein related to DAN and cerberus; mit DAN und Cerberus verwandtes Protein; ebenfalls ein BMP- Antagonist), in einer Konzentration von 1000 ng/ml zugegeben. Außerdem wurde die Wirkung der Gegenspieler von Gremiin BMP-2, -4 und -7 in einer Konzentration von 1000 ng/ml Medium untersucht. Die Schaumzellen pro Gesichtsfeld wurden an Tag 3, 6, 9, 12 und 15 anhand von jeweils 5 repräsentativen Gesichtsfeldern, Vergrößerung lOx, ermittelt.
[0060] Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Fig. 2 gezeigt: Fig. 2A zeigt die Schaumzellbildung unter dem Einfluss von 500, 1000 und 2000 ng Gremiin pro ml Medium: Es zeigte sich, dass unter dem Einfluss von Gremiin signifikant weniger Schaumzellen pro Gesichtsfeld vorhanden waren. Fig. 2B zeigt die Schaumzellbildung unter dem Einfluss von Gremiin 1000 ng/ml sowie PRDC, BMP-2, -4 und -7, mit jeweils 1000 ng/ml in 5 unabhängigen Schaumzellkulturen. Es zeigte sich, dass es nur unter dem Einfluss von Gremiin zu einem signifikanten Abfall der Schaumzellzahlen kam. PRDC und BMP-2 und -7 führten sogar zu einer tendenziellen Steigerung der Schaumzellzahlen.
[0061] In weiteren Versuchen wurden die Überstände aus den Schaumzellkulturen im CytokinArray untersucht: Hierzu wurden Monozyten zusammen mit Thrombozyten in serumreichem Medium über 15 Tage kultiviert. Murines Grem- linprotein wurde in einer Konzentration von 2000 ng/ml und 5000 ng/ml Medium an Tag 1 der Kultur zugegeben. Als Kontrollproteine wurden erneut PRDC, BMP-2, -4 und -7, jeweils in einer Konzentration von 2000 ng/ml eingesetzt. Die Überstände wurden an Tag 15 gewonnen und bis zur Analyse im CytokinArray bei -20° Celsius eingefroren.
[0062] Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Fig. 3A gezeigt: Unter dem Einfluss von Gremiin zeigten drei der getesteten Zytokine, nämlich der "Macrophage Migration Inhibitory Factor" (MIF), CXCL1 und das "Monocyte Chemoattractant Protein 1" (MCP-1) eine reduzierte Expression. Die BMP-Proteine zeigten diese Wirkung nicht. PRDC führte auch zu einem Absinken der MCP-1 Expression; zu einer Absenkung der Konzentration von MIF und CXCL1 kam es aber nicht. [0063] In diesem Zusammenhang wurden auch die Konzentrationen von MIF und CXCL1 unter dem Einfluss von Gremiin im Überstand von Monozyten, Makrophagen und Schaumzellen untersucht. Hierzu wurden zunächst die Überstände aus 5 unabhängigen Versuchen wie unter für Fig. 3A beschrieben gewonnen und im anti-MIF- und anti-CXCLl-ELISA (Enzym gekoppelter Immunadsorptionstest) untersucht (jeweils linke Graphik in Fig. 3B, 3C und 3D). In Abhängigkeit von der Konzentration von Gremiin (2 g/ml und 5 pg/ml Medium) kam es zu einem zunehmenden Abfall der Konzentration von MIF (Fig. 3B), MCP-1 (Fig. 3C) und CXCL1 (Fig. 3D).
[0064] Um zu klären, ob Gremiin die Expression von MIF und CXCL1 auch in Monozyten und Makrophagen reduziert, wurden Monozyten mit Gremiin, PRDC, BMP-2, -4 und -7 in den oben beschriebenen Konzentrationen über 48 Stunden inkubiert und ihre Überstände gewonnen (n = 11), oder sie wurden zusammen mit Thrombozyten über 7 Tage in serumreichem Medium kultiviert, so dass sich aus ihnen Makrophagen bildeten. Auch hier wurden die Proteine in der oben beschriebenen Konzentration an Tag 1 dazugegeben (n = 10). Gremiin führte zu einer signifikanten Reduktion der Konzentration von MIF, gemessen im anti-MIF-ELISA, sowohl in Monozyten, Makrophagen und Schaumzellen.
[0065] Weitere Versuche zur Untersuchung der Hemmung der MIF- Sekretion durch Gremiin zeigten (siehe Fig. 4), dass nach Inkubation von Monozyten mit Gremiin die MIF-Konzentration bereits nach weniger als 8 Stunden im Vergleich zu Kontrollen reduziert wird (Fig. 4, oben). Auch nach Stimulation der Zellen mit LPS (Lipopolysaccharid) wird MIF durch den Zusatz von Gremiin bereits nach weniger als 8 Stunden reduziert im Vergleich zu Kontrollen (Fig. 4 unten). Damit hemmt Gremiin die Sekretion von MIF aus seinen intrazellulären Speichern.
[0066] In weiteren Untersuchungen wurde die Apoptose-Rate in Makrophagen und Schaumzellen unter dem Einfluss von Gremiin untersucht. Hierzu wurden Monozyten zusammen mit Thrombozyten in serumreichen Medium über 15 Tage kultiviert. Murines Gremlinprotein wurde in einer Konzentration von 1000 ng/ml Medium an Tag 12 der Kultur dazugegeben. Als Kontrollproteine wurden PRDC und BMP2, jeweils in einer Konzentration von 1000 hg/ml Medium an Tag 12 der Kultur dazu gegeben. Als Kontrollproteine wurden PRDC und BMP2, jeweils in einer Konzentration von 1000 ng/ml Medium eingesetzt. An Tag 14 wurde ein TUNEL-Assay durchgeführt. Wie in Fig. 5 gezeigt, kam es nur unter Einfluss von Gremiin zu einem signifikanten Anstieg der Apoptose-Rate (p< 0,05) PRDC und BMP2 führten zu keiner wesentlichen Apoptose.
[0067] Ferner wurde die Beeinflussung der Migration von humanem Monozyten durch Gremiin in der Boyden-Kammer untersucht. Hierzu wurden Monozyten aus dem peripheren Blut gesunder Erwachsener isoliert und in die obere Kammer einer Boyden-Kammer pipettiert, Porengröße 5 m. In der unteren Kammer befand sich Medium mit Gremiin in zwei verschiedenen Konzentrationen (2 und 5 g/ml) (n=3). IN Abhängigkeit von der Gremlin-Konzentration kam es zu einer zunehmenden Stimulation der Monozyten-Migration. In der höheren Konzentration (5 g/ml) erwies sich Gremiin als stärkeres Chemo- Attraktant als MCP-1. Die Kombination von Gremiin und MCP-1 führte zu keiner weiteren Steigerung der Monozytenmigration. Die Kombination von Gremiin und MIF reduzierte dagegen die Migration der Monozyten im Vergleich zu Gremiin alleine (siehe Diagramm in Fig. 6A oben). Der Versuch wurde 3 Mal wiederholt, wobei auch MIF alleine in der unteren Kammer als Kontrolle (10 und 50 ng/ml) diente. Die Monozytenmigration wurde dabei am stärksten von MIF gehemmt, Gremiin erwies sich wie schon bei den ersten 3 Versuchen als starkes Chemoattraktant, eine Kombination aus Gremiin und MIF nahm eine Zwischenstellung ein (Fig. 6A Diagramm unten). Gremiin hat damit entgegen gesetzte Wirkungen auf die Monozytenmigration wie MIF.
[0068] In Fig. 6B und C ist gezeigt, dass Gremiin auch die Aktivität von MMP2 reguliert: Monozyten wurden in serumreichen Medium zusammen mit acLDL über 14 Tage kultiviert, so dass sich aus ihnen Makrophagen und Schaumzellen bildeten. An Tag 1.5 und 10 wurde jeweils Gremiin 1 g/ml dazu gegeben. An Tag 14 wurden die Überstände gewonnen und mit Hilfe der Gelatine-Zymographie hinsieht- lieh ihrer Matrixmetalloproteinaseaktivität (MMP2 und MMP9) untersucht. Gremiin führte zu einer signifikanten Reduktion von MMP2, die Aktivität von MMP9 wurde nicht wesentlich beeinflusst. Die Reduktion der MMP2-Aktivität ist dabei wohl auf die Reduktion der MIF-Konzentration zurückzuführen, die durch Gremiin gesenkt wird. Als Positivkontrolle wurde ILIO (Interleukin 10) mitgeführt, das die Sekretion von MIF stimuliert.
[0069] Basierend auf diesen Erkenntnissen wurde eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins generiert. Hierzu wurde der IgG2 Fc-Anteil über einen Spacer (Linkerpeptid) und eine Thrombinschnittstelle mit murinem Gremiin (mGremlin) fusioniert. Zur Expression in den Zellüberstand wurde dieses Konstrukt ferner mit der IgK-Leadersequenz fusioniert, die ein Sekretionssignal darstellt. Die schematische Übersicht zeigt, dass also der C-Terminus von IgG2 Fe mit dem N-Terminus des eines Spacers verknüpft ist, dessen C-Terminus wiederum mit dem N-Temrinus einer Thrombinschnittstelle verbunden ist, dessen C-Terminus wiederum mit dem N-Terminus von Gremiin verknüpft ist. An den N-Terminus von IgG2 Fe ist der C-Terminus des Sekretionssignals fusioniert. Dieser Aufbau ist schematisch in Flg. 7 gezeigt, wobei die Aminosäuresequenz dieses Ausführungsbeispiels in Fig. 7 unten gezeigt ist. Das Fusionsprotein wird vorliegend auch als mGremlin-Fc bezeichnet.
[0070] CHO-Zellen (Chinese Hamster Ovary, CHO flp-In) wurden mit einem das Fusionsgen enthaltenden Vektor (pCDNA5_FRT) stabil transfiziert. Zum Nachweis der anschließend mittels ProteinG-Agarose aus Zellkulturüberständen gereinigten Proteine wurde ein Western Blot angefertigt, wobei jeweils l g des mGremlin-Fc, des IgK-Fc sowie der Positivkontrolle (rekombinantes murines Gremiin) verwendet wurden. Der Nachweis des rekombinanten mGremlins sowie des mGremlin-Fc erfolgte mittels eines anti-Gremlinl-Anitkörpers (Abcam, ab45292), der Nachweis des IgK-Fc mittels eines anti-human IgG-Antikörpers (Jackson, ImmunoRe- search, Pennsylvania, USA; Katalog Nr. 109-035-098). Die Ergebnisse dieses Western Blots sind in Fig. 8 gezeigt. Wie Fig. 8 zu entnehmen ist, konnte das Fusionsprotein erfolgreich aus den Kulturüberständen gewonnen werden. [0071] In weiteren Versuchen wurde die Bindungsfähigkeit des Fusionsproteins an BMP-4 untersucht. Hierzu wurde ein BMP-4-ELISA mit steigenden mGrem- lin-Fc-Konzentrationen durchgeführt. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Fig. 9 gezeigt, wonach eine konzentrationsabhängige Bindung des Proteins Gremiin an BMP-4 gezeigt werden konnte. Das zur Kontrolle verwendete IgK-Fc weist keine Bindungsaktivität auf, wodurch eine etwaige unspezifische Bindung des Fc-Teils ausgeschlossen werden konnte.
[0072] Diese Ergebnisse zeigen also zusammenfassend, dass Gremlin-Fc an BMP bindet, dass es die Bildung/Sekretion von MIF und CXCL1 und MCP-1 reduziert, und dass es die Bildung von Schaumzellen inhibieren kann, die Migration von Monozyten steuern kann und die Aktivität der Matrixmetalloproteinase 2 hemmen kann, weshalb das Protein ein wertvolles Mittel zur Behandlung von entzündlichen und immunmodulatorischen Erkrankungen darstellt.

Claims

Patentansprüche
1. Protein, das die Sequenz von Gremiin besitzt, oder Varianten oder Fragmente davon, die die BMP-Bindungsfunktion oder die MIF-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen, zur Verwendung zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer Reduzierung der MIF-Bildung und/oder der CXCLl-Bildung und/oder der MCP-l-Bildung behandelbar sind.
2. Protein nach Anspruch 1, zur Behandlung von Atherosklerose, ischämischen Herzerkrankungen, Herzinfarkt, Schlaganfall, Herzinsuffizienz, Myokarditis, inflammatorischer Kadriomyopathie, entzündlichen rheumatischen und Auto- immun-Erkrankungen, zur Regeneration von ischämischen Gewebe nach My- kardinfarkt, und bei der Ischämie/Reperfusion nach Organtransplantation und Organinfarkt.
3. Protein nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz aufweist, das ausgewählt ist aus einer der SEQ ID Nrn. 2 oder 3, oder Varianten oder Fragmente davon, die die BMP- Bindungsfunktion oder MIF-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen.
4. Fusionsprotein, enthaltend a) ein erstes Polypeptid, das eine Immunglobulin Fc-Domäne aufweist, und b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen.
5. Fusionsprotein nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es in Richtung N-Terminus zum C-Terminus enthält: a) ein erstes Polypeptid, das eine Imunglobulin Fc-Domäne aufweist, und
b) ein zweites Polypeptid, das ausgewählt ist aus Gremiin oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen.
6. Fusionsprotein nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fe Domäne eine humane Immungluobulin Fc-Domäne ist.
7. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Polypeptid die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID-Nr. 1 aufweist.
8. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der SEQ-ID Nr. 2 oder 3, oder Varianten oder Fragmenten davon, die die BMP-Bindungsfunktion von Gremiin besitzen.
9. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass erste Polypeptid direkt oder über ein oder mehrere Linkerpeptide mit dem zweiten Polypeptid verknüpft ist.
10. Fusionsprotein nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Linker- peptid die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 4 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll enthält.
11. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Linkerpeptid eine Thrombinschnittstelle enthält.
12. Fusionsprotein nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Thrombinschnittstelle die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 5 aus dem beigefügten Sequenzprotokoll aufweist.
13. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es die Aminosäuresequenz mit der SEQ ID Nr. 7, 8 oder 9 aufweist.
14. Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe: a) die Nukleinsäuresequenz, die für das Fusionsprotein mit der SEQ ID Nr.
7, 8 oder 9 kodiert, oder eine Variante davon, welche für das gleiche Fusionsprotein gemäß der Degeneration des genetischen Codes kodiert; b) eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Polypeptid, das mindestens 70% Sequenzhomologie zu dem Polypeptid kodiert durch die SEQ- ID Nr. 7, 8 oder 9 aufweist, wobei die Nukleinsäuresequenz ein Polypeptid kodiert, umfassend von seinem N-Terminus zu seinem C- Terminus eine für eine Immunglobulin Fc-Domäne codierende Nukleinsäuresequenz, eine für ein Linkerpeptid codierende Nukleinsäuresequenz, eine für eine Thrombinschnittstelle codierende Nukleinsäuresequenz, und eine für Gremiin oder für eine funktionelle Variante davon codierende Nukleinsäuresequenz, die dazu in der Lage ist, an BMP zu binden; c) eine Nukleinsäure, die in 5'->3'-Richtung einen ersten Abschnitt aufweist, der für eine Immunglobulin Fc-Domäne kodiert oder für eine funktionsfähige konservative Variante davon, die dahingehend funktionsfähig ist, dass sie einem durch die Nukleinsäure kodierten Polypep- tid ermöglicht, in einer Zelle in einer Form exprimiert zu werden, die dazu in der Lage ist, an BMP zu binden, einen zweiten Abschnitt, der für die Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser- Gly-GlyGly-Gly-Ser kodiert, einen dritten Abschnitt, der für eine Thrombinschnittstelle kodiert, und einen vierten Abschnitt, der für Gremiin kodiert.
15. Vektor, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 14.
16. Fusionsprotein, kodiert durch eine Nukleinsäure nach Anspruch 14.
17. Zelle, ein Fusionsprotein exprimierend nach einem der Ansprüche 4 bis 13 oder 16.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oder ein Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 13 in einer pharmazeutisch wirksamen Menge, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutische akzeptierbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff.
19. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 4 bis 13, oder des Fusionsproteins nach Anspruch 16, oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 18, zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Behandlung von Atherosklerose, ischämischen Herzerkrankungen, Herzinfarkt, Schlaganfall, Herzinsuffizienz, Myokarditis inflammatorischer Kadriomyopathie, entzündlichen rheumatischen und Autoimmun-Erkrankungen, zur Regeneration von ischämischen Gewebe nach Mykardinfarkt, und bei der Ischä- mie/Reperfusion nach Organtransplantation.
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