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WO2012057315A1 - 高い親和性を有する抗cdh3抗体 - Google Patents

高い親和性を有する抗cdh3抗体 Download PDF

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Publication number
WO2012057315A1
WO2012057315A1 PCT/JP2011/074934 JP2011074934W WO2012057315A1 WO 2012057315 A1 WO2012057315 A1 WO 2012057315A1 JP 2011074934 W JP2011074934 W JP 2011074934W WO 2012057315 A1 WO2012057315 A1 WO 2012057315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
nite
cadherin
cells
cdh3
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/074934
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
佐藤　広一
富美子 野村
石井　敬介
正 松浦
須藤　幸夫
克之 見供
克志 甲田
Original Assignee
株式会社ペルセウスプロテオミクス
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ペルセウスプロテオミクス filed Critical 株式会社ペルセウスプロテオミクス
Publication of WO2012057315A1 publication Critical patent/WO2012057315A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to an anti-cadherin antibody that recognizes a specific domain of cadherin and has high affinity for cadherin.
  • Cancer is an important disease that occupies the top causes of death, but its therapeutic needs have not yet been met.
  • cancer treatment with molecular targeted drugs that design and treat drugs targeting specific molecules specifically expressed in cancer cells Has been actively studied.
  • Cadherin is an example of a molecule that can be a target for molecular therapeutics in cancer.
  • Cadherin is a membrane protein discovered as a molecule that is involved in cell adhesion with homophilicity in a calcium-dependent manner (Yoshida and Takeichi, Cell 28: 217-224, 1982).
  • Proteins having cadherin repeats (ECs) consisting of about 110 amino acid residues having high homology to each other are called cadherin superfamily, and there are over 120 kinds of proteins, which play an important role in maintaining a multicellular structure.
  • Proteins belonging to the cadherin superfamily can be broadly classified into 1) classical cadherins, 2) desmosomal cadherins, 3) protocadherins, and 4) others according to their structural characteristics.
  • Classical cadherins, major members of the cadherin superfamily are highly homologous to each other ( Figure 1). That is, it is a single transmembrane protein that is supposed to form a dimer, and has five cadherin domains of EC1-EC5 and an intracellular domain in the extracellular region.
  • Classical cadherin-mediated cell adhesion is characterized by adhesion between allogeneic cells, and is performed by cells recognizing the same type of cadherin molecules that are specifically expressed differently depending on the cell type. Allogeneic cells adhere to each other by a mechanism in which E-cadherin recognizes and binds to E-cadherin and P-cadherin recognizes and binds to P-cadherin (FIG. 2).
  • cadherin domain 1 located at the N-terminal of the extracellular domain
  • Klingel et al. Found that when the positions 1 to 213 of the amino acid sequence of human P-cadherin (SEQ ID NO: 2) and the corresponding region of human E-cadherin were interchanged, E-cadherin did not bind and P-cadherin and (Klingel H. et al., J of Cell Science 113: 2829-36, 2000).
  • classical cadherins including E-cadherin and P-cadherin are thought to bind to each other by the same mechanism.
  • antibody drug it can be prepared by combining two elements: A: binding (accumulation) to cancer cells (responsible by antibodies) and B: drug efficacy (responsible by RI and drugs). is there.
  • Such an antibody drug can be referred to as an ARMED antibody (armed antibody) because the antibody is enhanced (armed) by B: RI, a drug, a toxin or the like.
  • ARMED antibodies, RI, drugs, toxins, and the like are responsible for the efficacy, and the antibodies only have to act to accumulate in the tumor, and may have physiological activity such as ADCC, but it is not always necessary.
  • RI, drugs, toxins, and the like are each bound to antibodies by chemical methods (modification) or molecular biological methods.
  • RI-labeled antibody is an example of ARMED antibodies, already Zevalin R (FUJIFILM RI Pharma sold) are shown practically used very strong efficacy as an antibody against malignant lymphoma, the RI-labeled antibody drug followed by Development is desired.
  • An antibody (antibody drug conjugate (ADC)) obtained by linking an antibody and a drug having a strong toxicity (toxin) is also an example of the ARMED antibody.
  • ADC antibody drug conjugate
  • toxins When administered alone to a patient, toxins can also damage normal tissues and cannot be an effective treatment.
  • by linking with an antibody that binds to a tumor cell-specific antigen it has the ability to kill only tumor cells without adversely affecting normal tissue.
  • One method for obtaining a stronger antitumor effect is to increase the amount of antibody accumulated in the tumor by using an antibody having a high affinity for the antigen, thereby increasing the drug efficacy.
  • it is necessary to obtain antibodies with high affinity but the method for obtaining such antibodies is not always clear, and has become a major issue in the development of ARMED antibody drugs. Yes.
  • An object of the present invention is to provide an anti-cadherin antibody having high affinity.
  • the present inventor has diligently studied to solve the above-mentioned problems, and when the affinity of the P-cadherin antibody to the antigen expressed on the cell surface was measured, it was found that the group tends to be divided into a high affinity group and a low affinity group. It was. Therefore, when classification is performed according to the region recognized by each antibody, it is found that an antibody with high affinity recognizes either cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) with a high probability. found.
  • EC1 cadherin domain 1
  • EC2 cadherin domain 2
  • the antibody according to (3), wherein the P-cadherin is soluble P-cadherin or a fragment thereof.
  • the antibody according to any one of (1) to (4) which is a monoclonal antibody.
  • the antibody according to (5), wherein the monoclonal antibody is a chimerized antibody, a humanized antibody or a human antibody.
  • a monoclonal antibody produced by a cell having NITE BP-1150 Alternatively, a monoclonal antibody produced by a cell having NITE BP-1150.
  • the cytotoxic substance is a drug, a toxin, or a radioactive substance.
  • the cytotoxic substance is a radioactive substance selected from the group consisting of yttrium (90), indium (111) and iodine (131).
  • a cytotoxic agent comprising the antibody according to any one of (1) to (15).
  • a method for damaging cadherin-expressing cells in the patient comprising administering the above-described antibody or cytotoxic agent of the present invention to a cadherin-expressing patient. Furthermore, according to the present invention, there is provided use of the above-described antibody of the present invention for the production of a cytotoxic agent.
  • the present invention provides an antibody that recognizes either cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) of P-cadherin and has high affinity for P-cadherin.
  • An antibody that can exhibit high affinity is useful as a material for preparing a modified antibody or a modified antibody. Since the antibody of the present invention has high affinity, a labeled antibody obtained by binding a radioactive metal having cytotoxicity to this antibody is expected to have a high anticancer activity as a cytotoxic agent when administered to a cancer patient highly expressing cadherin. it can.
  • FIG. 1 shows the mature protein sequence excluding E-cadherin (CDH1), N-cadherin (CDH2), P-cadherin (CDH3) signals and propeptide sequences.
  • FIG. 2 shows the adhesion mechanism of molecules belonging to the classical cadherin family.
  • FIG. 3 shows the results of flow cytometry in which a human CDH3 forced expression cell line was reacted with a commercially available anti-human CDH3 antibody.
  • B CDH3 forced expression CHO cell CHO cell.
  • FIG. 4 shows typical flow cytometry results for 3 acquired antibodies and each cell line.
  • FIG. 5 shows the measurement results of the affinity KD (nM) of each antibody.
  • FIG. 6 shows the correspondence of CDH3 partial length protein fragments 1 to 6 with the CDH3 extracellular region.
  • FIG. 7 shows the expression result of CDH3 partial length protein.
  • FIG. 8 shows the reaction of the CDH3 partial length protein and each antibody by Western blotting.
  • FIG. 9 shows the CBB staining result of the CDH3 partial length protein expression (fragment 6).
  • FIG. 10 shows the results of ELISA for CDH3 partial length protein expression.
  • FIG. 10 shows the results of ELISA for CDH3 partial length protein expression.
  • FIG. 11 shows the biodistribution of 111 In-labeled PPAT-055-28c in a xenograft model.
  • FIG. 12 shows the biodistribution of 111 In-labeled PPAT-055-27c in a xenograft model.
  • FIG. 13 shows the antitumor effect of 90 Y-labeled PPAT-055-28c in a xenograft model.
  • FIG. 14 shows the antitumor effect of 90 Y-labeled PPAT-055-27c in a xenograft model.
  • the antibody of the present invention is an anti-cadherin antibody that recognizes either cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) and has high affinity.
  • cadherin domain 1 (EC1), cadherin domain 2 (EC2), cadherin domain 3 (EC3), cadherin domain 4 (EC4), cadherin domain 5 (EC5) of P-cadherin, E-cadherin and N-cadherin Indicates the following areas, respectively.
  • the corresponding region of other cadherins can be determined by comparing the sequences of known cadherin proteins obtained from Genbank et al.
  • Antibody affinity can be measured by a known method.
  • Methods for measuring antibody affinity include FACS, BIACORE, ELISA and the like.
  • FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
  • BIACORE BIACORE
  • ELISA ELISA
  • the method for measuring the affinity of an antibody by FACS is to obtain a point where fluorescence intensity is saturated under conditions of excess antibody, and to measure the antibody concentration that gives this half of the fluorescence intensity, this becomes the Kd value (Journal of Immunological IV Methods; 318, 147 (2007)).
  • the Kd value relating to the affinity in the specification means a case where measurement is performed under the same conditions as in Example 6. Specifically, it is as follows.
  • the affinity of the anti-CDH3 antibody was measured by a flow cytometry method (BD FACSCalibur) using a cancer cell NCI-H358 strain that is confirmed to have high expression of CDH3. That is, NCI-H358 cells were detached from the culture plate by treatment with 2 mM EDTA-PBS, and suspended in a FACS solution (1% BSA / PBS) so as to be 5 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 5 / ml. This cell suspension was seeded at 100 ⁇ 1 / well in a 96-well plate, and 100 ⁇ 1 of antibody dilution series (200 ⁇ g / ml to 0.13 ng / ml) was added, followed by reaction at 4 ° C.
  • BD FACSCalibur flow cytometry method
  • “high affinity” means that the “Kd value, which is an antibody concentration that gives 50% binding to an antigen” measured by the above method is 10 nM or less, preferably 7 nM or less. More preferably, it is 3 nM or less, More preferably, it is 1 nM or less, Especially preferably, it is 0.60 nM or less.
  • an antibody having an antibody-dependent cytotoxic activity at an antibody concentration of 1 ⁇ g / mL is less than 30%.
  • Antibody-dependent cytotoxic activity can be measured by a known method.
  • the numerical value of ADCC activity in this specification means antibody-dependent cytotoxic activity when measured under the same conditions as in Example 8. Specifically, it is as follows.
  • Bone marrow cells were collected from the femurs of C3H / HeJ Jc1 mice (8 weeks old, male, Claire Japan) and prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / mL in RPMI1640 medium containing 10% FBS. The cells were cultured for 6 days in the presence of human IL-2 (PEPROTECH) 50 ng / mL and mouse GM-CSF (PEPROTECH) 10 ng / mL. On the day of measurement, the cells were collected, washed with HAM medium containing 10% FBS, and used as an effector cell solution.
  • human IL-2 PEPROTECH
  • mouse GM-CSF PEPROTECH
  • target cells full-length CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) were used. After detaching the cells from the plate, the cells are suspended in HAM medium containing 10% FBS to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 51 Cr is added to a final concentration of 150 ⁇ Ci, and 1.5% at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator. Incubate for hours. The cells were washed twice with a medium, 10% FBS-containing HAM medium was added, and the cells were seeded on a 96-well U-bottom plate (NUNC) at 1 ⁇ 10 4 cells / well to serve as target cells.
  • NUNC 96-well U-bottom plate
  • Cytotoxic activity (%) (AC) / (BC) ⁇ 100
  • cadherin recognized by the antibody of the present invention is preferably classic cadherin. Examples include, but are not limited to, E-cadherin, N-cadherin, and P-cadherin.
  • cadherin or a partial peptide thereof can be used as an antigen for preparing the antibody of the present invention.
  • soluble CDH3 protein or the like can be used, but is not limited thereto.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody of the present invention (polyclonal antibody and monoclonal antibody) can be produced by any of various methods. Methods for producing such antibodies are well known in the art [see, for example, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)]. In this specification, the “monoclonal antibody” is not limited to an antibody produced by the hybridoma method.
  • the term “monoclonal antibody” refers to an antibody that is derived from a single clone (eg, eukaryotic, prokaryotic, phage clone), regardless of the method used.
  • Monoclonal antibodies useful in the present invention can be prepared by a variety of methods known in the art. Examples of the method include a hybridoma method, a recombinant method, a phage display method, and a combination thereof.
  • cadherin domain 1 EC1
  • cadherin domain 2 EC2
  • FCA Freund's complete adjuvant
  • FIA Freund's incomplete adjuvant
  • Aluminum hydroxide adjuvant EC1
  • Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or the like.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, 6 to 60 days after the last immunization, the antibody titer is measured by enzyme immunoassay (ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) or EIA (enzyme immunoassay)), radioimmunoassay (RIA), etc. Blood is collected on the day of showing the antibody titer to obtain antiserum.
  • ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • cadherin or a partial peptide thereof, cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) is used as an antigen to a mammal such as a rat, a mouse, Administer to rabbits.
  • the dose of the antigen per animal is 0.1 to 100 mg when no adjuvant is used, and 1 to 100 ⁇ g when an adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 1 to 10 times, preferably 2 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably 2 to 5 weeks. Then, antibody-producing cells are collected 1 to 60 days, preferably 1 to 14 days after the final immunization day.
  • antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, peripheral blood cells, etc., but spleen cells or local lymph node cells are preferred.
  • cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available cell lines of animals such as mice can be used.
  • the cell line to be used has drug selectivity and cannot survive in a HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include P3 ⁇ 63-Ag. 8).
  • Examples include mouse myeloma cell lines such as U1 (P3U1) and NS-1.
  • the myeloma cell and the antibody-producing cell are fused.
  • Cell fusion is performed by using 1 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 antibody-producing cells and 2 ⁇ 10 5 to 2 ⁇ 10 6 in animal cell culture media such as serum-free DMEM and RPMI-1640 medium.
  • 1 / ml myeloma cells are mixed (a cell ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably 5: 1), and a fusion reaction is performed in the presence of a cell fusion promoter.
  • the cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 daltons can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device utilizing electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the target hybridoma is selected from the cells after cell fusion treatment.
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, a fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium, and then plated on a microtiter plate at about 3 ⁇ 10 5 cells / well, and a selective medium is added to each well.
  • the culture is carried out with the selective medium changed. As a result, cells that grow from about 14 days after the start of culture in the selective medium can be obtained as hybridomas.
  • Hybridoma screening is not particularly limited, and may be performed according to ordinary methods. For example, a part of the culture supernatant contained in a well grown as a hybridoma is collected and bound to cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) of cadherin by enzyme immunoassay, radioimmunoassay or the like. Hybridomas producing antibodies can be screened. Cloning of the fused cells is performed by limiting dilution or the like, and finally, a hybridoma that is a monoclonal antibody-producing cell can be established.
  • EC1 cadherin domain 1
  • EC2 cadherin domain 2
  • a normal cell culture method or ascites collection method can be employed as a method for collecting a monoclonal antibody from the established hybridoma.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, MEM medium, or serum-free medium under normal culture conditions (for example, 37 ° C., 5% CO 2 concentration). Cultivate for ⁇ 14 days and obtain antibody from the culture supernatant.
  • hybridomas In the case of the ascites collection method, about 1 ⁇ 10 7 hybridomas are administered into the abdominal cavity of a myeloma cell-derived mammal and a homologous animal, and the hybridomas are proliferated in large quantities. Ascites are collected after 1-2 weeks.
  • known methods such as ammonium sulfate salting-out method, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography are appropriately selected, or a combination thereof is used. Can be purified.
  • the type of the antibody of the present invention is not particularly limited, and it is artificial for the purpose of reducing the foreign antigenicity against humans such as mouse antibody, human antibody, rat antibody, rabbit antibody, sheep antibody, camel antibody, avian antibody, etc. Any of a recombinant antibody modified into, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody may be used.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody comprising a non-human mammal, for example, a mouse antibody heavy chain and light chain variable region and a human antibody heavy chain and light chain constant region, and a DNA encoding the murine antibody variable region.
  • a humanized antibody is obtained by transplanting the complementarity determining region (CDR) of a mammal other than a human, for example, a mouse antibody, to the complementarity determining region of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known. . Specifically, several oligonucleotides were prepared so that the DNA sequence designed to link the CDR of the mouse antibody and the framework region (FR) of the human antibody had an overlapping portion at the end. And synthesized by PCR. It is obtained by ligating the obtained DNA with DNA encoding a human antibody constant region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (EP239400, International Publication WO96 / 02576, etc.) .
  • CDR complementarity determining region
  • Another method for producing humanized and chimerized antibodies is to identify the framework residues that are important for antigen binding by modeling the interaction between CDRs and framework residues and compare the sequences. Thus, there is a method of identifying an unusual framework structure residue at a specific position. See, for example, Queen et al., U.S. Pat.Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,762, and 6,180,370 (each patent is incorporated herein by reference in its entirety) Do).
  • Antibodies can be humanized by a variety of methods known in the art. For example, CDR grafting (European Patent No. 239,400; PCT Publication WO 91/09967; U.S. Patent Nos.
  • the amino acid sequence of the chimerized or humanized antibody is preferably 100% identical to the amino acid sequence of the VH or VL region derived from the cDNA expressed by the deposited hybridoma, but is 90% or more identical by genetic engineering modification.
  • An antibody having a certain sequence is also preferred. Conventionally, adjustment of residue substitution for the purpose of improving antigen binding in the process of humanization and chimerization has been performed. This is because such an antibody having a partially modified sequence is basically considered to be an antibody derived from the original hybridoma.
  • the methods for producing chimerized antibodies and humanized antibodies using genetic engineering techniques are already known. That is, the VH and VL sequences of the monoclonal antibody that is the confirmed group are genetically modified and then chimerized or humanized by a conventional method.
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen or cells expressing the desired antigen in vitro, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to have a desired human antibody having an antigen-binding activity.
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (WO93 / 12227, WO92 / 03918, WO94 / 02602, WO94 / 25585).
  • WO96 / 34096, WO96 / 33735 ).
  • variable region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared from the sequence to obtain a human antibody.
  • these antibodies recognize cadherin domain 1 (EC1) or cadherin domain 2 (EC2) and do not lose the property of being a high affinity antibody. Any of them may be a low molecular weight antibody such as an antibody fragment (fragment) or a modified antibody. Further, an antibody fragment or a low molecular weight antibody, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, ScFv (singlechainFv), Diabody, etc. fused with the Fc portion and added with ADCC activity may be used. In order to obtain such antibodies, a gene encoding these antibodies may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • a gene encoding these antibodies may be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell.
  • modified antibody an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • drug-bound antibody sputum is useful.
  • modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody bag. Antibody modification methods are known to those skilled in the art.
  • the antibody of the present invention exhibits high affinity, it can be used as a cytotoxic agent by binding radioactive substances, toxins, and the like.
  • the cytotoxic agent of the present invention can damage cancer cells, for example, by contacting them with cancer cells expressing cadherin.
  • ADC in which a cytotoxic substance such as a drug is bound to the antibody
  • drugs used in the present invention include, for example, duocarmycin, duocarmycin analogs and inducers, CC-1065, duocarmycin analogs based on CBI, duocarmycin analogs based on MCBI, Duocarmycin analogs based on CCBI, doxorubicin, doxorubicin conjugate, morpholino-doxorubicin, cyanomorpholino-doxorubicin, dolastatin, dressatin-10, combretastatin, calicheamicin, maytansine, maytansine analog, DM1, DM2, DM3 , DM4, DMI, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), monomethyl auristatin E (MMAE), 5-benzoylvalerin Acid AE ester (AEVB), tubulin, disorazole, epothilone, paclitaxel, docetaxel, SN-38, topot
  • the binding between the drug and the antibody can be produced by a known method.
  • the antibody and the drug may be directly bonded via a linking group or the like that they have, or may be indirectly bonded via another substance such as a linker.
  • linking group when the drug is directly bonded examples include a disulfide bond using an SH group and a bond via maleimide.
  • the intramolecular disulfide bond in the Fc region of the antibody and the disulfide bond of the drug are reduced, and both are bonded by a disulfide bond.
  • Another method is to introduce cysteine into the antibody by genetic engineering.
  • the linker preferably has one or more functional groups that react with the antibody or drug or both.
  • functional groups include amino groups, carboxyl groups, mercapto groups, maleimide groups, pyridinyl groups, and the like.
  • the linker may be a peptide linker.
  • Another embodiment of the present invention includes so-called immunotoxins in which toxins and toxins are chemically or genetically bound to antibodies.
  • toxin examples include the following. Diphtheria toxin A chain, Pseudomonas endotoxin, lysine chain; sugar-free ricin A chain Gelonin (Saporin) and the like can be mentioned.
  • RI-labeled antibody obtained by binding the antibody of the present invention and a radioactive substance can be mentioned.
  • the radioactive substance is preferably a cytotoxic radioactive metal when used as a cancer therapeutic agent, and is preferably a non-cytotoxic radioactive metal when used as a cancer diagnostic agent.
  • iodine 123 (123I) and iodine 131 (131I) are also a method using iodine 123 (123I) and iodine 131 (131I).
  • cytotoxic radioactive metals examples include yttrium 90 (90Y), rhenium 186 (186Re), rhenium 188 (188Re), copper 67 (67Cu), iron 59 (59Fe), strontium 89 (89Sr), and gold 198. (198Au), mercury 203 (203Hg), lead 212 (212Pb), dysprosium 165 (165Dy), ruthenium 103 (103Ru), bismuth 212 (212Bi), bismuth 213 (213Bi), holmium 166 (166Ho), samarium 153 (153Sm) ), Lutetium 177 (177Lu) and the like.
  • radioactive metals 90Y, 153Sm, and 177Lu are preferable from the viewpoint of half-life, radiation energy, easy labeling reaction, labeling rate, complex stability, and the like.
  • non-cytotoxic radioactive metals used for diagnostic agents include technesium 99m (99mTc), indium 111 (1111n), indium 113m (113mIn), gallium 67 (67Ga), gallium 68 (68Ga), and thallium 201 (201Tl).
  • Chromium 51 (51Cr), cobalt 57 (57Co), cobalt 58 (58Co), cobalt 60 (60Co), strontium 85 (85Sr), mercury 197 (197Hg), and copper 64 (64Cu) are preferably used. It is not limited to.
  • radioactive metal elements In order to bind these radioactive metal elements to the antibody of the present invention, it is preferable to react the metal chelate reagent with the antibody and react with the radioactive metal element to form a complex. In the modified antibody thus obtained, a radioactive metal element is bound to the antibody of the present invention via a metal chelating reagent.
  • metal chelating reagents used for such complex formation include (1) 8-hydroxyquinoline, 8-acetoxyquinoline, 8-hydroxyquinaldine, oxyquinoline sulfate, 0-acetyloxin, 0-benzoyloxin, Quinoline derivatives such as 0-p-nitrobenzoyloxin, quinolone compounds having a quinoline skeleton, norfloxacin, ofloxacin, enoxacin, ciprofloxacin, lomefloxacin, tosufloxacin, fleroxacin, sparfloxacin; (2) chloranilic acid, aluminon , Thiourea, pyrogallol, cuperone, bismuthiol (II), galloyl gallic acid, thiolide, 2-mercaptobenzothiazole, tetraphenylarsonium chloride, etc .; (3) ethylenediamine Tetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (ED
  • isothiocyanobenzyl DOTA, methylisothiocyanobenzyl DTPA, and cyclohexylisothiocyanobenzyl DTPA are easy to introduce metal chelates into antibodies, labeling rate, complex stability, etc. preferable.
  • a person skilled in the art can bind a radioactive metal element to the antibody of the present invention according to a conventional method.
  • the reaction can be performed by reacting the antibody of the present invention with a metal chelate reagent, preparing a labeling precursor in advance, and then reacting with a radioactive metal element.
  • the cytotoxic agent of the present invention in addition to the antibody of the present invention (a cytotoxic substance, a radioactive substance, or a toxin may be bound if desired), the cytotoxic agent of the present invention, if necessary, a pharmaceutically acceptable carrier, Excipients, diluents and the like can be appropriately contained.
  • the cytotoxic agent of the present invention can be formulated as an injection, for example.
  • the dose of the cytotoxic agent of the present invention depends on the patient's symptom level, age and body weight, administration method, etc., and the weight of the antibody as the active ingredient is usually in the range of about 10 ng to about 100 mg / kg body weight. It is.
  • Example 1 Establishment of a CDH3-expressing CHO cell line
  • a CHO cell expressing full-length CDH3 was established.
  • (1) Preparation of CDH3 gene expression vector In order to insert the full-length human CDH3 DNA shown in SEQ ID NO: 1 into the mammalian expression vector pEF4 / myc-HisB (Invitrogen), two types of restriction enzymes KpnI (Takara Bio) and XbaI (Takara) Biotechnology) at 37 ° C.
  • CDH3 full-length expression CHO clones were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result, the CDH3 full-length expression CHO cell line with high expression and good growth ( EXZ1501) was obtained. The results of measurement of this cell line and a commercially available anti-CDH3 antibody (R & D SYSTEMS) using a flow cytometer are shown in FIG.
  • Soluble CDH3 (sCDH3) protein lacking the C-terminal transmembrane region was prepared for use as an immunogen for producing anti-CDH3 antibody.
  • soluble CDH3 antigen expression vector Forward designed to amplify a portion corresponding to the CDH3 extracellular region (corresponding to 1-654 of SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as sCDH3 cDNA) using CDH3 full-length cDNA as a template PCR reaction was performed using a primer (SEQ ID NO: 7: CGCGGGTACCATGGGGCTCCCTCGT, (hCDH3FullFW)) and a reverse primer (SEQ ID NO: 8: CCGTCTAGATAACCCTCCCTTCAGGGTCC, (hCDH3SolbRV)). The reaction was performed using KOD-Plus (Toyobo Co., Ltd.) under the reaction conditions of 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for
  • this sCDH3 cDNA was treated with two types of restriction enzymes KpnI and XbaI and then treated with p4 / myc-HisB treated with KpnI and XbaI using T4 DNA ligase.
  • the insertion was performed according to the method to obtain the expression vector pEF4-sCDH3-myc-His.
  • Soluble CDH3-expressing CHO cells were selected by Western blotting using an anti-c-Myc monoclonal antibody (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY). As a result of selecting a cell line with a large amount of secretion into the culture supernatant and good growth, a soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) was obtained.
  • the selected soluble CDH3-expressing CHO cell line (EXZ1702) uses 3 roller bottles with a culture area of 1,500 cm 2 , and 333 mL of serum-free medium CHO-S-SFM-II (Invitrogen) per roller bottle. The culture supernatant was collected for 72 hours.
  • the obtained culture supernatant is soluble by affinity chromatography using a HisTrap (registered trademark) HP column (GE Healthcare Bioscience) and gel filtration chromatography using a Superdex (registered trademark) 200 pg column (GE Healthcare Bioscience).
  • Type CDH3 protein was obtained.
  • Example 3 Preparation of anti-CDH3 monoclonal antibody (1) Preparation of monoclonal antibody using soluble CDH3 protein as immunogen 50 ⁇ g of soluble CDH3 protein dissolved in physiological saline and Titer-MAX Gold (registered trademark) (Titer) Max) was mixed in an equal amount, and MRL / lpr mice (Japan SLC Co., Ltd.) were injected intraperitoneally and subcutaneously to perform initial immunization. The second and subsequent immunizations were carried out by mixing the similarly prepared soluble CDH3 protein equivalent to the amount of 25 ⁇ g protein and Titer-MAX Gold and injecting them intraperitoneally and subcutaneously.
  • Titer-MAX Gold registered trademark
  • mice Three days after the final immunization, spleen cells were aseptically prepared from mice, and cell fusion with mouse myeloma cells SP2 / O-Ag14 or P3-X63-Ag8.653 was carried out by the polyethylene glycol method according to a conventional method.
  • a CHO cell line (EXZ1501) expressing full-length CDH3 was treated with 2 mM EDTA-PBS, detached from the culture plate, and then suspended in a FACS solution so as to be 1 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • This cell suspension was seeded in a 96-well plate at 50 ⁇ L / well, the hybridoma culture supernatant was added, reacted at 4 ° C. for 60 minutes, washed twice with FACS solution (200 ⁇ L / well), and then AlexaFluor 488. Labeled anti-mouse IgG • goat F (ab ′) 2 (Invitrogen) was added and reacted at 4 ° C. for 30 minutes. Then, after washing twice with a FACS solution, flow cytometry was performed to select hybridomas that showed a strong reaction in CDH3-expressing CHO cells.
  • FIG. 4 shows typical reaction results of an antibody obtained from the selected hybridoma and a CDH3-expressing CHO cell (EXZ1501), a parental CHO cell, and a cancer cell NCI-H358 in which CDH3 is confirmed to be highly expressed. Shown in It was confirmed that all the selected antibodies reacted with CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) and NCI-H358 but not with CHO cells.
  • NITE P-987, NITE P-987 under the accession numbers NITE P-987, NITE P-987, National Institute of Technology and Evaluation of Microorganisms (Postal Code 292-0818, 2-5-8 Kazusa Kamashita, Kisarazu, Chiba, Japan) 989, NITE P-990, NITE P-991, NITE P-992, NITE P-993, NITE P-994, deposited on September 7, 2011, with accession numbers NITE BP-987, NITE BP-989, NITE BP-990, NITE BP-991, NI E BP-992, NITE BP-993, was transferred as NITE BP-994 to an international deposit under the provisions of the Budapest Treaty.
  • the hybridoma producing the antibody PPAT-055-28 was founded on September 27, 2011, by the independent microorganisms evaluation technology patent organization Microorganism Depositary Center (Zip code 292-0818, Kazusa Kamashiri, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan). 5-8) is deposited internationally under the pig best treaty under the deposit number NITE BP-1146.
  • Example 4 Preparation of chimeric antibody against CDH3 Using the hybridoma prepared in Example 3, the DNA encoding the V region of the mouse monoclonal antibody against human CDH3 was cloned as follows, and the mouse variable region and the human antibody gene were cloned. A chimeric antibody was prepared by connecting to the constant region.
  • RNA from hybridoma RNA from cytoplasmic RNA from mouse hybridoma cells was analyzed using Gough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1998) (but instead of the lysis buffer described in this paper, another TNE buffer 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1% NP-40; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, pH 8.0 was used).
  • RNA precipitate was then dissolved by adding 10-50 microliters of sterile distilled water so that the cytoplasmic RNA concentration was 0.5-2 microgram / microliter.
  • VK sense (FR1 portion) A mixture of the following 17 primers was used as a VK sense primer.
  • W represents A or T
  • R represents A or G
  • M represents A or C
  • K represents T or G
  • Y represents T or C
  • S represents G or C represents H
  • A represents A, C or T
  • B represents G
  • V represents A, G or C
  • D represents A, G or T
  • N represents A, G, C or T is shown.
  • Sequence number 19 5'-GAYATCCAGCTGAACTCAGCC-3 '(degeneracy 2)
  • J antisense (4 sets primer) J1 / J2 antisense primer (1)
  • J4 antisense primer (2) SEQ ID NO: 37: 5′-GGGACAAAGTTGGGAAATAAA-3 ′
  • J5 antisense primer (3) SEQ ID NO: 38: 5′-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3 ′ J1 / J2, J4, J5 antisense primer mixture (4)
  • VK sense signal peptide part
  • the base sequence of this primer was modified to remove the restriction enzyme site based on Novagen mouse Ig-primer set (Novagen; Merck, Cat. No. 69831-3).
  • D Set Sense Primer (Use a mixture of the following two types of primers) SEQ ID NO: 42: 5′-ATGAGRGCCCCTGCTCAGGWTYTYTGGIWTTCTT-3 ′
  • a primer having homology with the mouse heavy chain signal part (4 sets primer) at the 5 ′ end and a primer having homology with the KC part at the 3 ′ end, or a set having homology with the FR1 part at the 5 ′ end
  • a mouse immunoglobulin heavy chain variable region DNA was isolated from the cDNA by polymerase chain reaction using two types of primer sets having homology with the constant region (IGHC) of mouse heavy chain at the 3 ′ end with the primer, The sequence was analyzed.
  • the primer sequences were as follows:
  • SEQ ID NO: 56 5′-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3 ′ (degeneracy: 32)
  • SEQ ID NO: 57 5′-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTTT-3 ′ (degeneracy: 8)
  • SEQ ID NO: 58 5′-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTTCT-3 ′
  • Sequence number 59 5'-ATGGRCACGRCTACWTYY-3 '(degeneracy: 32)
  • VH sense (FR1 part) This primer is based on the nucleotide sequence of the sense primer of Tan et al., “Superhumanized” Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169 (2002) p1119-1125. Modified and designed. SEQ ID NO: 60: 5′-SAGGTSMARKCTSAGSGATCWCGG-3 ′ (degeneracy: 256)
  • VH antisense antisense primer common to 3 and 4
  • the nucleotide sequence was designed to be degenerate so that it could be annealed with all mouse IgG isoforms.
  • the genes encoding the V region of the L chain and H chain of the cloned anti-CDH3 chimeric antibody are the gene encoding the human Ck region for the chimeric L chain expression vector and human for the chimeric H chain expression vector.
  • Genes connecting the genes encoding the Cg1 region were designed, and these L-chain and H-chain chimeric antibody genes were artificially synthesized in full length by GenScript. In that case, optimization of codon usage so that gene expression in CHO-producing cells is advantageous (Kim et al., Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in MMA3, 99 301).
  • a DNA sequence essential for efficient translation (Kozak, M., J., At least six nucleotides preceding the AU initiator codon enhancement translation in Mammalian cells. 196, p947-950, 1987), mouse IGKV (k chain variable region) gene signal peptide, anti-CDH3 antibody L chain V region, human KC (k chain constant region) in this order, and both ends
  • a restriction enzyme site (NheI on the 5'-side and EcoRI on the 3'-side) was added.
  • a chimeric H chain was prepared in the same manner.
  • a pCAGGS expression vector incorporating the dhfr gene was prepared. Specifically, a dhfr gene having a CMV promoter and a poly A signal is incorporated into the transient expression vectors pCAGGS-IGH and pCAGGS-IGK.
  • a CMV promoter, a mouse dhfr gene having a Kozak sequence, and an SV40 polyA signal are each amplified by the PCR method, a mixture of these genes is connected by the PCR method, and HindIII sites are added to both ends to form a HindIII-CMV promoter-Kozak
  • a gene fragment called -dhfr-polyA-HindIII was obtained. This fragment was incorporated into the HindIII site of pCAGGS-IGH or pCAGGS-IGK to obtain pCAGGS-IGH-CMVp-dhfr-A and pCAGGS-IGK-CMVp-dhfr-A.
  • These expression vectors were able to express the chimeric antibody with the CAG promoter and the dhfr gene with the CMV promoter, and could efficiently produce the chimeric antibody using gene amplification.
  • the electroporated cells were added to Iscove's Modified Dulbecco medium (IMDM) containing 10% dialyzed FBS and not containing HT (H, hypoxanthine: T, thymidine).
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco medium
  • HT hypoxanthine: T, thymidine
  • neo + transformed cells were selected with 1 mg / mL G418, and a chimeric antibody-producing positive cell line clone Got.
  • gene amplification was performed using clones selected with G418.
  • Cell line PPAT-055 producing approximately 50-100 mg of chimeric CDH3 antibodies PPAT-055-27C, PPAT-055-28C per liter after amplification in 2 rounds of 0.25 mM, 1 mM methotrexate (MTX) -27C and PPAT-055-28C could be established.
  • MTX methotrexate
  • Example 5 Acquisition of Purified Antibody The antibody was purified from the culture supernatant using protein A by a conventional method to obtain a purified antibody.
  • Example 6 Measurement of Antibody Kd Value Methods for measuring antibody affinity include FACS, BIACORE, ELISA and the like. In order to measure the affinity of the antibody for the cell surface, the FACS method in which the antigen is not denatured is desirable. The method for measuring the affinity of an antibody by FACS is to obtain a Kd value by obtaining a point at which the fluorescence intensity is saturated under the condition of excess antibody, and measuring the antibody concentration that gives this 1/2 fluorescence intensity (references). : Journal of Immunological Methods; 318, 147 (2007))
  • the affinity of the anti-CDH3 antibody was measured by a flow cytometry method (BD FACSCalibur) using a cancer cell NCI-H358 strain confirmed to have high expression of CDH3. That is, NCI-H358 cells were detached from the culture plate by treatment with 2 mM EDTA-PBS, and suspended in a FACS solution (1% BSA PBS) so as to be 5 ⁇ 10 4 to 2 ⁇ 10 5 / ml. This cell suspension was seeded at 100 ⁇ l / well in a 96-well plate, and 100 ⁇ l of a mouse or chimeric antibody dilution series (200 ⁇ g / ml to 0.13 ng / ml) was added, followed by reaction at 4 ° C.
  • BD FACSCalibur flow cytometry method
  • Example 7 Epitope classification of anti-CDH3 monoclonal antibody by CDH3 partial length expression protein
  • the epitope classification of the obtained anti-CDH3 antibody is antibody PPAT-055-02, PPAT-055-09, PPAT-055-21, PPAT-055. 24, PPAT-055-25, PPAT-055-26, PPAT-055-27 were performed by Western blotting with a CDH3 partial sequence expression product, and the antibody PPAT-055-28 was confirmed to be a Western blot reaction. Since there was not, it carried out by ELISA method.
  • fragments 1 to 6 were designed so that the sequences overlap sufficiently between the fragments (FIG. 6).
  • Fragment 1 (positions 108-236 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCCGATGGGGTGGTTGCTCCCAAATTCG (SEQ ID NO: 9)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTACTGCCATCACAGAAGTACCTGGTAGG (SEQ ID NO: 10)
  • Fragment 2 (positions 132-348 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCAAGTCTAATAAAGATAGAGACACCAAG (SEQ ID NO: 11)
  • Reverse primer AGATACTACCTTAGTAGACTACTCTCTCACCCATCATGGCCCACTGCATTCTCA (SEQ ID NO: 12)
  • Fragment 3 (positions 237 to 461 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCGTGACAGCCACGGGATGAGGATGATG (SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTAGACACACACAGGCGCCCCCAGTG (SEQ ID NO: 14)
  • Fragment 4 (positions 349 to 550 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACCCCTGACGGTTCACTGATCTGGACG (SEQ ID NO: 15)
  • Reverse primer AGATTACCTATTAGTAGTAGGGCTCAGGGGACTGGGCCATGGTCATTTG (SEQ ID NO: 16)
  • Fragment 5 (positions 462 to 654 of SEQ ID NO: 2)
  • Forward primer TATGGAGCTCCGTACTACTACACTGCAGAAGACCCTGACAAGG (SEQ ID NO: 17)
  • Reverse primer AGATTACCTATCTAGACTAACCCTCCCTTCCAGGGTCCAGGGCAGGTTTC (SEQ ID NO: 18)
  • the expression of the CDH3 partial length protein was confirmed by the presence of a band at the expected position by carrying out Western blotting with an anti-Penta-His antibody (Qiagen) after electrophoresis of an E. coli culture solution. That is, an electrophoresis buffer corresponding to 1/10 volume of the above-mentioned E. coli culture solution was added, charged to a 5-20% gradient gel (Bio-Rad) under reducing conditions, and after electrophoresis, Immobilon (registered trademark) P (Millipore).
  • the transfer film was lightly washed with TBS-T (0.05% Tween (registered trademark) 20, TBS), shaken with TBS containing 40% BSA for 1 hour, and then 10% Block Ace (registered trademark) (Snow Brand Milk Products).
  • TBS-T 0.05% Tween (registered trademark) 20, TBS
  • Block Ace registered trademark
  • Each anti-CDH3 antibody diluted with TBS-T was added and shaken for 1 hour.
  • HRP-anti-mouse IgG antibody GE Healthcare Biosciences
  • X-ray film RX-u Fluji Film
  • ECL registered trademark
  • -Plus GE Healthcare Bioscience
  • the region recognized by each antibody was determined by the reactivity with each CDH3 partial length protein (Table 2).
  • the correspondence relationship with the region recognized by each antibody on the CDH3 sequence shown in SEQ ID NO: 2 is shown below.
  • the gene for fragment 6-Fc fusion protein was artificially synthesized by GenScript, a US gene synthesis contractor. At that time, NheI was added to the 5 prime side and EcoRI site was added to the 3 prime side for subcloning. In addition, the base sequence of the gene is optimized for the frequency of codon usage by GenScript.
  • the artificially synthesized gene “Fragment 6-Fc” incorporated into the pUC subcloning vector is digested with restriction enzymes NheI and EcoRI, and the mammalian expression vector pCAGGS digested with NheI and EcoRI, or the mouse DHFR gene for gene amplification Incorporated into pCAGGS-DHFR.
  • Soluble antigen expression plasmid (the plasmid was cleaved with PvuI in ampicillin resistance gene to convert the circular plasmid into a linear plasmid; the amount of the plasmid was 2 ⁇ g / sample) was 3Ax 10e3 cells (0.1 mL CHO cells) with Lmaxa Amaxa. Gene suspension).
  • Electroporated cells were added to Iscove's Modified Modified Dulbecco Medium (IMDM) containing 10% dialyzed FBS and without HT (H, Hypoxanthine ⁇ ⁇ ⁇ : T, Thymidine). 3 days after gene transfer, change medium to IMDM without 10% dialyzed FBS, 2 mM L-glutamine, HT, select neo + transformed cells with 1 mg / mL G418, positive to produce chimeric antibody Cell line clones were obtained. Next, gene amplification was performed using clones selected with G418. After two rounds of methotrexate (MTX) at 100 nM and 200 nM, cell lines were established that produced about 20-30 mg of soluble antigen per liter.
  • IMDM Iscove's Modified Modified Dulbecco Medium
  • H Hypoxanthine ⁇ ⁇ ⁇ : T, Thymidine
  • change medium to IMDM without 10% dialyzed FBS, 2 mM L
  • FIG. 9 shows a CBB staining diagram of an antigen expressed and purified by transient expression.
  • CDH3 partial length protein is suspended in PBS ( ⁇ ) at a concentration of 2.5 ⁇ g / mL and dispensed into a 96-well plate at 100 ⁇ L / well. It was left at 4 ° C. overnight. On the next day, the solution in the well was discarded, and washed with Buffer A: 50 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl / 1 mM CaCl 2 /0.05% Tween20 (pH 7.5).
  • PPAT-055-28C diluted with Buffer A at different concentrations was prepared, dispensed at 100 ⁇ L / well, and shaken for 1 hour on a plate shaker at room temperature.
  • HRP-labeled antibody HRP-goat anti human IgG (H + L) (absorbed with mouse, rabbit, bovine IgG) (American Qualex International, cat. A-110PD)
  • HRP-goat anti human IgG H + L
  • bovine IgG American Qualex International, cat. A-110PD
  • TMB coloring solution was added at 100 ⁇ L / well, and the mixture was allowed to stand for 15 minutes in the dark to develop color.
  • Stop solution was added at 100 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm was measured with a plate reader. The obtained results are shown in Table 2 and FIG. PPAT-055-28C and PPAT-055-28 were found to have a recognition epitope of 1-2.
  • ADCC activity is measured by a method in which an antibody is allowed to act on a radiolabeled target cell in the presence of an effector cell and its free radioactivity is measured. It was.
  • (1) Preparation of effector cells Bone marrow cells were collected from the femurs of C3H / HeJ Jcl mice (8 weeks old, male, Claire Japan) and prepared to 2 ⁇ 10 6 cells / mL in RPMI1640 medium containing 10% FBS. The cells were cultured for 6 days in the presence of human IL-2 (PEPROTECH) 50 ng / mL and mouse GM-CSF (PEPROTECH) 10 ng / mL. On the day of measurement, the cells were collected, washed with HAM medium containing 10% FBS, and used as an effector cell solution.
  • human IL-2 PEPROTECH
  • mouse GM-CSF PEPROTECH
  • target cells full-length CDH3-expressing CHO cells (EXZ1501) were used. After detaching the cells from the plate, the cells are suspended in HAM medium containing 10% FBS to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, 51 Cr is added so that the final concentration is 150 uCi, and then 1. is added at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide incubator. Cultured for 5 hours. The cells were washed twice with a medium, 10% FBS-containing HAM medium was added, and the cells were seeded on a 96-well U-bottom plate (NUNC) at 1 ⁇ 10 4 cells / well to serve as target cells.
  • NUNC 96-well U-bottom plate
  • Cytotoxic activity (%) (AC) / (BC) ⁇ 100
  • the test was performed in triplicate, and the cytotoxic activity (%) was calculated from the average value.
  • the cytotoxic activity at an antibody concentration of 1 ug / mL was 30% or more, it was determined as S, and when it was less than 30%, it was determined as W.
  • the test results are shown in Table 3.
  • Example 9 Production of RI-labeled antibody (1) Binding of DOTA to antibody PPAT-055-28C and PPAT-055-27C antibodies were dissolved in a buffer (50 mM Bicin-NaOH, 150 mM NaCl, pH 8.5), and the antibody concentration was adjusted to 10 mg / mL. On the other hand, isothiocyanobenzyl DOTA (manufactured by Macrocyclics B-205)) was dissolved in DMSO to a concentration of 10 mg / mL. The mixture was mixed and stirred so that the molar ratio of antibody to DOTA was 1: 3, and allowed to stand at 25 ° C. for 17 hours. After completion of the reaction, the product was purified with a desalting column (PD-10, GE Healthcare 17-0435-01) using PBS.
  • a desalting column PD-10, GE Healthcare 17-0435-01
  • Marking rate (lower end count / (upper end count + lower end count)) x 100 (%)
  • the labeled antibody was purified with a desalting column (PD-10, GE Healthcare, 17-0435-01) using PBS.
  • Example 11 Medicinal effect test Lung cancer-derived cell line NCI-H1373 was cultured in RPMI1640 medium containing 10% FBS, and 5 ⁇ 10 6 cells / mouse were subcutaneously injected into the right flank of nude mice (female, 7 weeks old, CLEA Japan). It was transplanted to become. NCI-H1373 transplanted mice were prepared as 8 mice per group, and 90Y-DOTA-PPAT-055-28C or 90Y-DOTA-PPAT-055-27C antibody was administered 5.6 MBq / mouse, 3.7 MBq / mouse. . As a control, physiological saline was administered at 100 ⁇ L / mouse. Administration was performed when the average tumor diameter was 100 to 150 mm 3 in any group.

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Abstract

　本発明の課題は、高い親和性を有する抗カドヘリン抗体を提供することである。本発明によれば、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体が提供される。

Description

高い親和性を有する抗CDH3抗体
　本発明は、カドヘリンの特定のドメインを認識し、かつカドヘリンに対する高い親和性を有する抗カドヘリン抗体に関する。
　癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患であるが、その治療ニーズはいまだ満たされていない。近年、従来の化学療法の正常細胞にもダメージを与えるという問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定の分子を標的として薬剤を設計し治療を行う分子標的薬による癌治療が盛んに研究されている。
　癌における分子治療薬の標的となりうる分子として、カドヘリンが挙げられる。カドヘリンは、カルシウム依存的に同種親和性の細胞接着に関与する分子として発見された膜タンパク質である（Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７－２２４,１９８２）。相互にホモロジーが高い約110アミノ酸残基からなるカドヘリンリピート(ECs)を持つタンパク質はカドヘリンスーパーファミリーと呼ばれ、１２０種類以上のタンパク質が存在し、多細胞構造の維持に重要な役割を果たしている。
　カドヘリンは癌細胞で発現が上昇する例が報告されており、正常組織と比較して癌組織での発現が高い癌細胞に対しては、カドヘリンを認識する抗体に放射性物質或いは抗癌剤を結合させた薬剤や、抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ)を有する抗体を癌の治療に用いることが検討されている（ＷＯ２００２／０９７３９５号公報、ＷＯ２００７／１０２５２５号公報）。
　カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質は、その構造の特徴により１）古典的カドヘリン、２）デスモゾームカドヘリン、３）プロトカドヘリン、４）その他に大きく分類することができる。カドヘリンスーパーファミリーの主要なメンバーである古典的カドヘリンは相互にホモロジーが高い(図1)。すなわち、2量体を形成するとされている1回膜貫通型タンパク質で、細胞外領域にEC1-EC5の5つのカドヘリンドメインと細胞内ドメインを持つ。古典的カドヘリンを介する細胞接着は同種細胞間での接着という特徴があり、細胞種により特異的に発現の状態が異なる同種のカドヘリン分子を細胞が相互に認識することによって行われる。E－カドヘリンはE－カドヘリンを認識して結合し、P－カドヘリンはP－カドヘリンを認識して結合するという機序で同種細胞相互が接着する(図２)。
　カドヘリン相互の同種/異種の認識は細胞外ドメインのＮ端に位置するカドヘリンドメイン１(ＥＣ１)によるとされる（Ｎｏｓｅ　Ａ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｃｅｌｌ　６１：１４７－１５５,  １９９０）。Klingelらは、ヒトP－カドヘリンのアミノ酸配列の第１位～第２１３位(配列番号２）とヒトＥ－カドヘリンの対応する領域を入れ替えると、Ｅ－カドヘリンとは結合せず、Ｐ－カドヘリンと結合することを示している（Ｋｌｉｎｇｅｌ　Ｈ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｊ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１３：２８２９ー３６,  ２０００）。このように、E－カドヘリン、P－カドヘリンをはじめとする古典的カドヘリンは同一の機序で相互に結合すると考えられる。
　近年、分子標的薬として多くの癌治療用の抗体医薬品が実際に上市され、その多くはＡＤＣＣを主な作用機序としている。しかしその薬効は必ずしも十分なものではなく、より強力な抗腫瘍効果を示す技術開発が進められている。
　一方、別の抗体医薬品の形態としては、Ａ：癌細胞への結合(集積)(抗体が担う)と、Ｂ：薬効(ＲＩや薬物が担う)の２要素を組み合わせて作製することが可能である。このような抗体医薬品は、抗体が、Ｂ：RI、薬物、トキシン等により薬効を増強(武装)されていることから、ＡＲＭＥＤ抗体(武装された抗体)と呼ぶことができる。ＡＲＭＥＤ抗体では、薬効はRIや薬剤、トキシン等が担い、抗体は腫瘍への集積の働きをすれば良く、ADCC等の生理活性をもっていてもよいが、必ずしももたなくてもよいことになる。RIや薬剤、毒素等は、それぞれ、抗体に化学的手法(修飾)または、分子生物学的な手法により結合させる。
　ＲＩ標識抗体は、ＡＲＭＥＤ抗体の一例であり、既にゼヴァリンR(富士フイルムＲＩファーマが販売)が悪性リンパ腫に対する抗体として実用化され非常に強い薬効が示されており、これに続くＲＩ標識抗体医薬の開発が望まれている。
　また、抗体と強力な毒性を有する薬剤（毒素)とを連結させた抗体（抗体薬物コンジュゲート(ＡＤＣ))もＡＲＭＥＤ抗体の一例である。毒素はそれ単独で患者に投与すると、正常組織にも障害を及ぼし、有効な治療手段とはなり得ない。しかしながら、腫瘍細胞特異的な抗原と結合する抗体と連結する事により、正常な組織に悪影響を及ぼさず、腫瘍細胞のみ殺傷しえる能力を持つに至る。
　このような、抗体医薬、特にＲＩＴやＡＤＣ等のＡＲＭＥＤ抗体においては、抗体は、標的となる癌に集積することが必要である。
　より強力な抗腫瘍効果を得る方法の一つとして、抗原に対する親和性の高い抗体を用いることにより、抗体の腫瘍への集積量を増加させ薬効をあげる方法がある。抗体を腫瘍に集積させるためには高い親和性の抗体を得る必要があるが、このような抗体を得る方法は必ずしも明らかではなく、またＡＲＭＥＤ抗体医薬の開発の上での大きな課題となってきている。
　上記の通り、ＡＲＭＥＤ抗体により癌を治療するというコンセプトは公知である。しかし、ドメイン構造とＰ－カドヘリンを含む古典的カドヘリンの機能との関連についての報告はあるが、親和性と古典的カドヘリンの構造との関連を示唆するものはない。
ＷＯ２００２／０９７３９５号公報 ＷＯ２００７／１０２５２５号公報
Ｙｏｓｈｉｄａ　ａｎｄ　Ｔａｋｅｉｃｈｉ,  Ｃｅｌｌ　２８：２１７－２２４,  １９８２ Ｎｏｓｅ　Ａ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｃｅｌｌ　６１：１４７－１５５,  １９９０ Ｋｌｉｎｇｅｌ　Ｈ.  ｅｔ　ａｌ.,　Ｊ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　１１３：２８２９ー３６,  ２０００
　本発明は、高い親和性を有する抗カドヘリン抗体を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、細胞表面に発現する抗原に対するＰ－カドヘリン抗体の親和性を測定したところ、親和性の高い群と低い群に分かれる傾向があることを見出した。そこで、各抗体が認識している領域により分類を行ったところ、親和性の高い抗体は、カドヘリンドメイン１(ＥＣ１)またはカドヘリンドメイン２(ＥＣ２)の何れかを高い確率で認識していることが判明した。
　エピトープにより抗体の親和性が異なる要因の一つとして、抗体が結合する領域の空間的な制限が推定される。本発明はこれらの知見に基づいて完成した
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体。
（２）　カドヘリンがＰ－カドヘリンである、（１）に記載の抗体。
（３）　Ｐ－カドヘリンまたはＰ－カドヘリンを発現する細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、（１）又は（２）に記載の抗体。
（４）　Ｐ－カドヘリンが可溶型Ｐ－カドヘリンまたはその断片である、（３）に記載の抗体。
（５）　モノクローナル抗体である、（１）から（４）の何れかに記載の抗体。
（６）　モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、（５）に記載の抗体。
（７）　抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である、（１）から（６）の何れかに記載の抗体。
（８）　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４６、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４９、又はＮＩＴＥ　ＢＰ－１１５０を有する細胞が産生するモノクローナル抗体。
（９）　（８）に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体。
（１０）　（８）に記載のモノクローナル抗体のVH及び／またはVL ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び／またはVL ドメインを有する抗体またはその断片。
（１１）　（５）又は（８）に記載の抗体を産生する細胞株。
（１２）　受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４６、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４９、又はＮＩＴＥ　ＢＰ－１１５０を有する細胞株。
（１３）　細胞傷害性物質が結合している、（１）から（１０）の何れかに記載の抗体。
（１４）　細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、（１３）に記載の抗体。
（１５）　細胞傷害性物質が、イットリウム（９０）、インジウム（１１１）およびヨウ素（１３１）からなる群より選択される放射性物質である、請求項１３又は１４に記載の抗体。
（１６）　（１）から（１５）の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
（１７）　上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、（１６）に記載の細胞傷害剤。
（１８）　細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、（１７）に記載の細胞傷害剤。
（１９）　細胞傷害性物質が、イットリウム（９０）、インジウム（１１１）およびヨウ素（131）からなる群より選択される放射性物質である、（１７）又は（１８）に記載の細胞傷害剤。
（２０）　抗癌剤として使用される、（１６）から（１９）の何れかに記載の細胞傷害剤。
（２１）　カドヘリン高発現の癌患者に投与される、（１６）から（２０）の何れかに記載の細胞傷害剤。
　更に本発明によれば、上記した本発明の抗体又は細胞傷害剤を、カドヘリン高発現の患者に投与することを含む、上記患者におけるカドヘリン高発現細胞を傷害する方法が提供される。
　更に本発明によれば、細胞傷害剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
　本発明はＰ－カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）又はカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）の何れかを認識し、Ｐ－カドヘリンに対し高い親和性を有する抗体を提供する。高い親和性を発揮しうる抗体は、修飾抗体、改変抗体を作製するための材料として有用である。本発明の抗体は親和性が高いため、本抗体に細胞傷害性を持つ放射性金属を結合させた標識抗体は、カドヘリン高発現癌患者に投与することにより、細胞傷害剤として高い抗癌作用が期待できる。
図１は、Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｎ－カドヘリン（ＣＤＨ２）、Ｐ－カドヘリン（ＣＤＨ３）のシグナル及びプロペプチド配列を除いた成熟タンパク質の配列を示す。 図２は、古典的カドヘリンファミリーに属する分子の接着機序を示す。 図３は、ヒトＣＤＨ３強制発現細胞株と市販抗ヒトＣＤＨ３抗体を反応させたフローサイトメトリーの結果を示す。Ａ：ＣＨＯ細胞ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞ＣＨＯ細胞。ａ：ａｎｔｉ－ＣＤＨ３抗体０.０１ｍｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉ－ＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉ－ＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍｌ 図４は、取得抗体３例と各細胞株との典型的なフローサイトメトリー結果を示す。Ａ：ＣＤＨ３強制発現ＣＨＯ細胞、Ｂ：ＣＨＯ細胞、Ｃ：肺がん由来細胞株ＮＣＩーＨ３５８。ａ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．０１ｍｇ／ｍｌ、ｂ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体０．１ｍｇ／ｍｌ、ｃ：ａｎｔｉーＣＤＨ３抗体１ｍｇ／ｍｌ。 図５は、各抗体の親和性KD (nM)の測定結果を示す。 図６は、ＣＤＨ３部分長タンパク質断片１から６のＣＤＨ３細胞外領域との対応を示す。 図７は、ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現結果を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５ 図８は、ＣＤＨ３部分長タンパク質と各抗体のウェスタンブロット法による反応を示す。Ａ：断片１、Ｂ：断片２、Ｃ：断片３、Ｄ：断片４、Ｅ：断片５ 図９は、ＣＤＨ３部分長タンパク質発現物（断片６）のＣＢＢ染色結果を示す。 図１０は、ＣＤＨ３部分長タンパク質発現物に対するELISAの結果を示す。 図１１は、111In標識したPPAT-055-28cのゼノグラフトモデルにおける体内分布を示す。 図１２は、111In標識したPPAT-055-27cのゼノグラフトモデルにおける体内分布を示す。 図１３は、90Y標識したPPAT-055-28cのゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍効果を示す。 図１４は、90Y標識したPPAT-055-27cのゼノグラフトモデルにおける抗腫瘍効果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
　本発明の抗体は、カドヘリンドメイン１(ＥＣ１)またはカドヘリンドメイン２(ＥＣ２)の何れかを認識し、高い親和性を有する抗カドヘリン抗体である。
　本明細書においてＰ－カドヘリン、Ｅ－カドヘリンおよびＮ－カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）、カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）、カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）、カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）、カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）は、それぞれ次の領域を示す。また、他のカドヘリンの対応する領域は、Ｇｅｎｂａｎｋ等より得られる公知のカドヘリンタンパク質の配列を比較することによって決定することができる。配列の比較は公知のプログラム、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２２　（２２）：　３６７３ー３６８０、１９９４）またはＣｌｕｓｔａｌＸ２（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　ＪＤ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２５　（２４）：　４８７６ー４８８２,  １９９７）などを用いて行うことが可能である。
・Ｐ－カドヘリン（ＣＤＨ３）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号２のアミノ酸配列の第１０８位～第２３６位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号２のアミノ酸配列の第２３７位～第３４８位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号２のアミノ酸配列の第３４９位～第４６１位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号２のアミノ酸配列の第４６２位～第５５０位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号２のアミノ酸配列の第５５１位～第６５４位
・Ｅ－カドヘリン（ＣＤＨ１）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号４のアミノ酸配列の第１５５位～第２８３位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号４のアミノ酸配列の第２８４位～第３９５位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号４のアミノ酸配列の第３９６位～第５０７位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号４のアミノ酸配列の第５０８位～第５９７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号４のアミノ酸配列の第５９８位～第７０４位
・Ｎ－カドヘリン（ＣＤＨ２）
カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）：配列番号６のアミノ酸配列の第１６０位～第２８８位
カドヘリンドメイン２（ＥＣ２）：配列番号６のアミノ酸配列の第２８９位～第４０２位
カドヘリンドメイン３（ＥＣ３）：配列番号６のアミノ酸配列の第４０３位～第５１８位
カドヘリンドメイン４（ＥＣ４）：配列番号６のアミノ酸配列の第５１９位～第６０７位
カドヘリンドメイン５（ＥＣ５）：配列番号６のアミノ酸配列の第６０８位～第７１９位
　抗体の親和性は、公知の方法で測定することが可能である。抗体の親和性の測定方法としては、FACS、BIACORE,ELISA等の方法がある。細胞表面に対する抗体の親和性を測定するには、抗原が変性していないFACS法が望ましい。FACSによる抗体の親和性の測定方法は、抗体過剰の条件下で、蛍光強度飽和する点を求め、この１／２の蛍光強度を与える抗体濃度を測定すれば、これがKd値となる（Journal of Immunological Methods；318、147(2007)）。明細書の親和性に関するKd値は、実施例６における測定と同様の条件で測定した場合を意味する。具体的には以下の通りである。
　抗ＣＤＨ３抗体の親和性の測定は、ＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ－Ｈ３５８株を用いたフローサイトメトリー法（ＢＤ社ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。すなわち、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を２ｍＭＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離し、５×１０4～２×１０5／ｍｌとなるようＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μ１／ウエル播種し、抗体希釈系列（２００μｇ／ｍｌ～０．１３ｎｇ／ｍｌ）１００μ１を添加後４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）２（インビトロジェン社）を加えて、４℃で６０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、各ウエルの蛍光強度（ＧＥＯＭｅａｎ）を測定した。得られた抗体濃度と対応するＧＥＯＭｅａｎ値より、ＸＬｆｉｔ４．２．２（ＣＴＣラボラトリーシステムズ株式会社）にり、１００％結合強度の１／２のＧＥＯ－ＭＥＡＮ（５０％結合蛍光強度）を与える抗体濃度を算出しＫｄ値とした。
　本明細書で言う「高い親和性」とは、上記方法で測定される「抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値」が１０ｎＭ以下であることを意味し、好ましくは７ｎＭ以下であり、より好ましくは３ｎＭ以下であり、より好ましくは１ｎＭ以下であり、特に好ましくは０．６０ｎＭ以下である。
　また、本発明の抗体の具体例としては、抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である抗体を挙げることができる。抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）は、公知の方法で測定することが可能である。本明細書のＡＤＣＣ活性の数値は、実施例８における測定と同様の条件で測定した場合の抗体依存性細胞傷害活性を意味する。具体的には以下の通りである。
（１）エフェクター細胞の調製
　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃ１マウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ－２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
（２）標的細胞の調製
　標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度１５０μＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
　標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度に調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベーションし、次いでエフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。細胞傷害活性は以下の式で求めた。
細胞傷害活性（％）＝（Ａ－Ｃ）／（Ｂ－Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：二標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
　本発明の抗体が認識するカドヘリンの種類は古典的カドヘリンが望ましい。例としてE－カドヘリン、N－カドヘリン、P－カドヘリンを挙げる事ができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体を作成するための抗原としては、カドヘリン又はその部分ペプチドを用いることができる。一例としては、可溶型CDH3タンパク質などを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。　本発明の抗体(ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体)は、種々の方法のいずれかによって製造することができる。このような抗体の製造法は当該分野で周知である[例えばＳａｍｂｒｏｏｋ,  Ｊ　ｅｔ　ａｌ.,　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ,  Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照]。この明細書では、“モノクローナル抗体”は、ハイブリドーマ法で作られた抗体に限定されない。“モノクローナル抗体”という用語は、単一のクローン(例えば真核生物、原核生物、ファージのクローン)に由来する抗体を意味し、どの方法で作ったかは問題とされない。本発明で役に立つモノクローナル抗体は、従来技術で知られている多彩な方法で調製することができる。方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、組み換え法、ファージ提示法や、これらの組み合わせがある。
（ａ）ポリクローナル抗体の作製
　ポリクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン又はその部分ペプチド（カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）が好ましい）を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは０．１～１００ｍｇであり、アジュバントを用いるときは１～１００μｇである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは２～５週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から６～６０日後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ(EnzymeLinked Immunosorbent Assay)又はＥＩＡ(enzyme immunoassay))、放射性免疫測定法(ＲＩＡ;radioimmunoassay)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
（ｂ）モノクローナル抗体の作製
　モノクローナル抗体を作製するためには、先ず、カドヘリン又はその部分ペプチドであるカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を抗原として、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1～100mgであり、アジュバントを用いるときは1～100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2～5週間間隔で、１～１０回、好ましくは２～５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１～６０日後、好ましくは１～１４日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
　細胞融合ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではHAT選択培地(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む)で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３×６３－Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ－１などのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
　次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ－１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、１×１０6～１×１０7個／ｍｌの抗体産生細胞と２×１０5～２×１０6個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００～６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合させることもできる。
　細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に３×１０5個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
　次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、目的とする抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によって、カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）と結合する抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生細胞であるハイブリドーマを樹立することができる。
　樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水採取法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＭＥＭ培地又は無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃、５％ＣＯ２濃度）で７～１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。
　腹水採取法の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを約１×１０7個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１～２週間後に腹水を採集する。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
　本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等の何れでもよい。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（ＥＰ２３９４００号公報、国際公開ＷＯ９６／０２５７６号公報など）。
　また、別のヒト化、キメラ化抗体の作製の手法としては例えば、CDRと枠組構造残基の相互作用をモデル化して抗原が結合する上で重要な枠組構造残基を同定し、配列を比較して特定の位置にある通常とは異なる枠組構造残基を同定するという方法がある。例えばQueen他、アメリカ合衆国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号、第6,180,370号を参照のこと(それぞれの特許は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする)。抗体は従来技術で知られている多彩な方法でヒト化することができる。例えばCDRグラフティング(ヨーロッパ特許第239,400号;PCT公開公報WO91/09967;アメリカ合衆国特許第5,225,539号、第5,530,101号、第5,585,089号)、ベニアリングまたはリサーフェシング(ヨーロッパ特許第592,106号、第519,596号;Padlan、Mol.Immunol.、第28巻、489～498ページ、1991年;Studnicka他、Prot.Eng.、第7巻、805～814ページ、1994年;RQguska他、Proc.Natl.Acad.Sci.、第91巻、969～973ページ、1994年)、鎖シャッフリング(アメリカ合衆国特許第5,565,332号)。また、キメラ化抗体の作製方法はMolecularBiotechnology 26, 39 (2004),  Journal of ImmunologicaI Methods1 25, 191 (1989)に記載されている。なおこれら文献は、参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする。
　キメラ化、ヒト化抗体のアミノ酸配列は、寄託ハイブリドーマの発現するｃＤＮＡに由来するＶＨ又はＶＬ領域のアミノ酸配列と１００％同一であることも好ましいが、遺伝子工学的な改変により、９０％以上同一である配列を有する抗体であることも好ましい。ヒト化、キメラ化の過程で抗原の結合を改善することを目的とした残基置換の調整は従来から行われている。このような、配列を一部改変した抗体は、基本的にはもとのハイブリドーマに由来する抗体と考えられるからである。
　遺伝子工学的な手法を用いる、キメラ化抗体や、ヒト化抗体の作成方法は既に既知のものである。つまり、確認された基となるモノクローナル抗体のＶＨ、ＶＬ配列を、遺伝子工学的に改変したのち、通常の方法により、キメラ化またはヒト化する。
　また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。
　さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
　また、これらの抗体は、カドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、親和性が高い抗体であるという特性を失わない限り、一価抗体、二価抗体、多価抗体のいずれでもよく、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。また、抗体断片や低分子化抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ＳｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎＦｖ）、ＤｉａｂｏｄｙなどにＦｃ部分を融合しＡＤＣＣ活性を付加したものでもよい。このような抗体を得るには、これら抗体をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい。
　抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。特に薬剤結合抗体 は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体 に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法は当業者に公知である。
　本発明の抗体は、高い親和性を示すことから、放射性物質や毒素等を結合し、細胞傷害剤として使用することができる。本発明の細胞傷害剤は、例えばカドヘリンを発現している癌細胞と接触させることにより癌細胞を傷害することができる。
　本発明における抗体の好ましい態様としては抗体に薬剤等の細胞傷害性物質を結合した、いわゆるＡＤＣをあげることができる。
　本発明で用いられる薬剤の例としては例えば　デュオカルマイシン、デュオカルマイシンのアナログ及び誘導剤、ＣＣ－１０６５、ＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＭＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ＣＣＢＩを主成分とするデュオカルマイシンアナログ、ドキソルビシン、ドキソルビシンコンジュゲート、モルフォリノ－ドキソルビシン、シアノモルフォリノ－ドキソルビシン、ドラスタチン、ドレスタチン－１０、コンブレタスタチン、カリケアミシン、マイタンシン、マイタンシンアナログ、ＤＭ１，ＤＭ２，ＤＭ３，ＤＭ４、ＤＭＩ、アウリスタチンＥ、アウリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、アウリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、５－ベンゾイルバレリン酸ＡＥエステル（ＡＥＶＢ）、チューブリシン、ジソラゾール、エポシロン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＳＮ－３８、トポテカン、リゾキシン、エキノマイシン、コルヒチン、ビンブラスチン、ビンデシン、エストラムスチン、セマドチン、エリューテロビン、メトトレキサート、メトプテリン、ジクロロメトトレキサート、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、メルファラン、リューロシン、リューロシダイン、アクチノマイシン、ダウノルビシン、ダウノルビシンコンジュゲート、マイトマイシンＣ、マイトマイシンＡ、カルミノマイシン、アミノプテリン、タリソマイシン、ポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン誘導体、エトポシド、エトポシドリン酸塩、ビンクリスチン、タキソール、タキソテールレチノイン酸、酪酸、Ｎ8－アセチルスペルミジン並びにカンプトセシン等をあげることができるが、これだけに限定されるわけではない。
　本発明におけるＡＤＣにおける、前記の薬剤と抗体との結合は公知の方法をにより作製できる。抗体と薬剤は、それら自身が有する連結基などを介して直接結合されてもよいし、また、リンカーやなどの他の物質を介して間接的に結合されてもよい。
　薬剤が直接結合される場合の連結基は、例えばＳＨ基を用いたジスルフィド結合やマレイミドを介する結合が挙げられる。例えば、抗体のＦｃ領域の分子内ジスルフィド結合と、薬剤のジスルフィド結合を還元して、両者をジスルフィド結合にて結合する。また、マレイミドを介する方法もある。また別の方法として、抗体内にシステインを遺伝子工学的に導入する方法もある。
　抗体と薬剤を、他の物質（リンカー）を介して間接的に結合することも可能である。リンカーには、抗体または薬剤または両方と反応する官能基を１または２種類以上有することが望ましい。官能基の例としてはアミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、,マレイミド基、ピリジニル基等をあげることができる。また、このリンカーはペプチドリンカーであってもよい。薬剤と抗体との結合方法に関しては、例えば、Cancer Research ;68 (22) 9280（2008）、Nature Biotechnology;26(8) 925（2008）、Bio Conjugate Chemistry;19、1673 (2008)、Cancer Research ;68 (15) 6300（2008）、又は特表2008-516896号公報などに記載の方法に準じて行うことができる。
　本発明の別の実施形態としては、抗体に毒素、トキシンを化学的または遺伝子工学的に結合した、いわゆるイムノトキシンをあげることができる。
　本発明で用いられるトキシンとしては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖、シュードモナスエンドトキシン、リシン鎖；無糖鎖リシンＡ鎖ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）サポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）等をあげることができる。
　本発明の抗体の別の実施態様としては、本発明の抗体と放射性物質とを結合したいわゆるＲＩ標識抗体をあげることができる。
　放射性物質としては、癌治療薬として用いる場合には細胞傷害性放射性金属が好ましく、癌診断薬として用いる場合には細胞非傷害性放射性金属であるのが好ましい。また、ヨウド１２３（１２３Ｉ）、ヨウド１３１（１３１Ｉ）を使用する方法もある。
　このような細胞傷害性放射性金属としては、例えばイットリウム９０（９０Ｙ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、銅６７（６７Ｃｕ）、鉄５９（５９Ｆｅ）、ストロンチウム８９（８９Ｓｒ）、金１９８（１９８Ａｕ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、鉛２１２（２１２Ｐｂ）、ジスプロシウム１６５（１６５Ｄｙ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ビスマス２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、ホルミウム１６６（１６６Ｈｏ）、サマリウム１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム１７７（１７７Ｌｕ）などを挙げることができる。
　これらの放射性金属の中でも、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕが、半減期、放射線エネルギー、容易な標識反応、標識率、錯体の安定性等の点から好ましい。
　一方、診断薬に用いる細胞非傷害性放射性金属としては、テクネシウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、インジウム１１１（１１１１ｎ）、インジウム１１３ｍ（１１３ｍＩｎ）、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、タリウム２０１（２０１Ｔｌ）、クロム５１（５１Ｃｒ）、コバルト５７（５７Ｃｏ）、コバルト５８（５８Ｃｏ）、コバルト６０（６０Ｃｏ）、ストロンチウム８５（８５Ｓｒ）、水銀１９７（１９７Ｈｇ）、銅６４（６４Ｃｕ）が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。
　これらの放射性金属元素を本発明の抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属元素が金属キレート試薬を介して本発明の抗体に結合している。
　このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８－ヒドロキシキノリン、８－アセトキシキノリン、８－ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、０－アセチルオキシン、０－ベンゾイルオキシン、０－ｐ－ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２－メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミンニ酢酸、エチレンジアミンニプロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノニ酢酸、イミノニ酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキーシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカンー１，４，７，１０－四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７－トリアザシクロノナンー１，４，７－三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカンー１，４，８，１１－四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ等が挙げられる。
　これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。
　本発明の抗体への放射性金属元素の結合は、当業者であれば常法に従って行うことができる。例えば本発明の抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属元素を反応させることにより行うことができる。
　本発明の細胞傷害剤には、本発明の抗体(所望により細胞傷害性物質、放射性物質、又はトキシンが結合していてもよい)の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤などを適宜含有させることができる。本発明の細胞傷害剤としては、例えば注射剤として製剤することができる。本発明の細胞傷害剤の投与量は、患者の症状の程度、年令及び体重、投与方法などに依存し、有効成分である抗体の重量としては通常、約10ng～約100mg/kg体重の範囲である。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１　ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株の樹立
　抗ＣＤＨ３抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞の樹立を行った。
（１）ＣＤＨ３遺伝子発現ベクターの作製
　配列番号１に示す全長ヒトＣＤＨ３ＤＮＡを哺乳類発現ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢ（インビトロジェン社）へ挿入するため、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社）及びＸｂａＩ（タカラバイオ社）で３７℃、１時間処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへＴ４ ＤＮＡリガーゼ（プロメガ社）により常法に従って挿入し、発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）ＣＤＨ３安定発現株の取得
  ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６トランスフェクション試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス社）のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5細胞のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４―ＣＤＨ３―ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ社）に混合し１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標））を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　ＣＤＨ３全長発現ＣＨＯのクローン選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法により行い、その結果、発現量が高く、かつ増殖が良好なＣＤＨ３全長発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を得た。この細胞株と市販抗ＣＤＨ３抗体（Ｒ＆Ｄ　ＳＹＳＴＥＭＳ社）のフローサイトメーターによる測定結果を図３に示す。
実施例２ 可溶型ＣＤＨ３抗原の作製
   抗ＣＤＨ３抗体作製の免疫原とするため、Ｃ末端膜貫通領域以降を欠損させた可溶型ＣＤＨ３（ｓＣＤＨ３）タンパク質を作製した。
（１）可溶型ＣＤＨ３抗原発現ベクターの作製
　ＣＤＨ３全長ｃＤＮＡをテンプレートとして、ＣＤＨ３細胞外領域に相当する部分（配列番号２の１－６５４に相当、以下ｓＣＤＨ３ｃＤＮＡ）を増幅するように設計されたフォワードプライマー （配列番号７：ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴ、（ｈＣＤＨ３ＦｕｌｌＦＷ））とリバースプライマー （配列番号８：ＣＣＧＴＣＴＡＧＡＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣ、（ｈＣＤＨ３ＳｏｌｂＲＶ））を用いてＰＣＲ反応を行った。反応にはＫＯＤ－Ｐｌｕｓ（東洋紡社）を用い、９４℃－１５秒、５５℃－３０秒、６８℃－９０秒、３０サイクルの反応条件で行った。
 その後、アガロースゲル電気泳動で目的サイズである約２．０ｋｂｐのバンドを含むゲル断片を切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キット（キアゲン社）を用いて、目的のｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを得た。
　このｓＣＤＨ３ｃＤＮＡを発現用ベクターｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢへ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＥＦ４／ｍｙｃ－ＨｉｓＢにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓを得た。
（２）可溶型ＣＤＨ３タンパク質の発現
　ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径１０ｃｍディッシュに８×１０5 個のＣＨＯ細胞を播種し一晩培養後、８μｇの発現ベクターｐＥＦ４－ｓＣＤＨ３－ｍｙｃ－Ｈｉｓと１６μＬのＦｕＧＥＮＥ６試薬を４００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地に混合、１５分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬（Ｚｅｏｃｉｎ）を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
　可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞の選抜は、抗ｃ－Ｍｙｃモノクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ　ＣＲＵＺ　ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いたウェスタンブロット法で行った。培養上清中への分泌量が多く増殖が良好な細胞株を選択した結果、可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）が得られた。選択された可溶型ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１７０２）は、培養面積１，５００ｃｍ2のローラーボトル３本を用い、ローラーボトル１本あたり無血清培地ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ－ＩＩ（インビトロジェン社）３３３ｍＬにて７２時間培養を行い、培養上清を回収した。得られた培養上清からＨｉｓＴｒａｐ（登録商標）ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるアフィニティークロマトグラフィーとＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００ｐｇカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）によるゲル濾過クロマトグラフィーにより可溶型ＣＤＨ３タンパク質を得た。
実施例３　抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体の作製
（１）可溶型ＣＤＨ３タンパク質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
　生理食塩水に溶解した５０μｇの可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄ（登録商標）（タイターマックス社）を等量混合し、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（日本エスエルシー株式会社）の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。２回目以降の免疫は同様に調製した２５μｇタンパク質量相当の可溶型ＣＤＨ３タンパク質とＴｉｔｅｒ－ＭＡＸ　Ｇｏｌｄを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から３日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞ＳＰ２／Ｏ－Ａｇ１４あるいはＰ３－Ｘ６３－Ａｇ８．６５３との細胞融合を行った。
（２）抗ＣＤＨ３抗体産生ハイブリドーマの選抜
　抗ＣＤＨ３抗体の選抜は、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を用いたフローサイトメトリーで行った。
　すなわち、全長ＣＤＨ３を発現するＣＨＯ細胞株（ＥＸＺ１５０１）を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することで培養プレートから剥離後、１×１０6個／ｍＬとなるようにＦＡＣＳ溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を５０μＬ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液（２００μＬ／ウェル）で２回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）2（インビトロジェン社）を加えて、４℃で３０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリーを実施し、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞にて強い反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
　選抜したハイブリドーマより得られた抗体と、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）、親株であるＣＨＯ細胞及びＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ－Ｈ３５８との典型的な反応結果を図４に示す。選抜した抗体全てが、ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）およびＮＣＩ－Ｈ３５８と反応し、ＣＨＯ細胞とは反応しないことを確認した。
　抗体ＰＰＡＴ－０５５－０２、ＰＰＡＴ－０５５－０９、ＰＰＡＴ－０５５－２１、ＰＰＡＴ－０５５－２４、ＰＰＡＴ－０５５－２５、ＰＰＡＴ－０５５－２６、ＰＰＡＴ－０５５－２７をそれぞれ産生するハイブリドーマは、２０１０年１０月１５日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ　Ｐ－９８７、ＮＩＴＥ　Ｐ－９８９、ＮＩＴＥ　Ｐ－９９０、ＮＩＴＥ　Ｐ－９９１、ＮＩＴＥ　Ｐ－９９２、ＮＩＴＥ　Ｐ－９９３、ＮＩＴＥ　Ｐ－９９４として寄託され、２０１１年９月７日に、受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９４としてブタベスト条約に基づく国際寄託に移管された。
　また、抗体ＰＰＡＴ－０５５－２８を産生するハイブリドーマは、２０１１年９月２７日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４６としてブタベスト条約に基づいて国際寄託されている。
実施例４：ＣＤＨ３に対するキメラ抗体の作製
　実施例３で作製したハイブリドーマを用いて、ヒトＣＤＨ３に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを以下のようにクローン化し、マウス可変領域とヒト抗体遺伝子の定常域と接続してキメラ抗体を作製した。
（１）マウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子のクローニング
（ｉ）ハイブリドーマからのＲＮＡの精製
　マウスハイブリドーマ細胞から、細胞質に存在するＲＮＡをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, １73, p93-95 (１988)により記載されている方法（ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のＴＮＥ緩衝液 25 mM Tris-HCl, pH 7.5; １% NP-40; １50 mM NaCl; １ mM EDTA, pH 8.0を用いた）に従って単離した。具体的な操作方法としては、５ｘ１０ｅ６個のハイブリドーマ細胞を０．２ｍＬのＴＮＥ緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約０．２ｍＬ細胞質上清に０．２ｍＬの抽出緩衝液(１0 mM Tris-HCl, pH7.5; 0.35 M NaCl; １%(w/v) SDS; １0 mM EDTA, pH 8.0; 7 M 尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたＲＮＡ溶液にキャリアとしてグリコーゲン（ロッシュ、Ｃａｔ Ｎｏ． ９０１３９３）を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にＲＮＡ沈殿物を、細胞質ＲＮＡ濃度が０．５～２マイクログラム／マイクロリットルになるように１０～５０マイクロリットルの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
（ii）ハイブリドーマから調製したＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーの作製
　一本鎖ｃＤＮＡを合成するため、前記のように調製した細胞質ＲＮＡの０．５～３マイクログラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ， ｐＨ ８．３（室温）； ７５ｍＭ ＫＣｌ； ３ｍＭ ＭｇＣｌ2； １０ｍＭ ＤＴＴ、１００ナノグラムのランダムプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（逆転写酵素、インビトロジェン社）を含む２０マイクロリットル反応混合液を調製し、４２°Ｃで５０分間インキュベートした。このように合成したｃＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法の鋳型として直接使用した。
（iii）抗ＣＤＨ３抗体可変領域をコードする遺伝子のＰＣＲ法による増幅
　実験に用いたプライマーはすべて北海道システム・サイエンス株式会社で合成した。
（マウスＬ鎖可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー）
　５’末端においてＦＲ１部分と相同性を有するＤＮＡプライマーと３'  末端においてマウスＬ鎖内のＪ鎖遺伝子と相同性を有する４セットプライマー　（１）、あるいは、５'  末端においてＬ鎖シグナル部分（７セットプライマー）　と３'  末端においてＫＣ部分（ＫＶＬアンチセンスプライマー）　と相同性を有するプライマーセット　（２）　の２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＬ鎖可変域ＤＮＡを単離し、遺伝子の配列を解析した。プライマー配列は次のとおりであった。
（マウスＬ鎖可変領域クローニング４セットセンスプライマー）
　「Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　－Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ-  ，　Ｂａｒｂａｓ　Ｂｕｒｔｏｎ　Ｓｃｏｔｔ　Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ」　ＰＲＯＴＯＣＯＬ　９．５を参考にＳｅｎｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　１７種、Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　３種を北海道システムサイエンスで合成した。
　ＶＫセンス（ＦＲ１部分）下記１７のプライマーの混合物をＶＫセンスプライマーとして使用した。なお、塩基配列において、ＷはＡ又はＴを示し、ＲはＡ又はＧを示し、ＭはＡ又はＣを示し、ＫはＴ又はＧを示し、ＹはＴ又はＣを示し、ＳはＧ又はＣを示し、ＨはＡ、Ｃ又はＴを示し、ＢはＧ、Ｃ又はＴを示し、ＶはＡ、Ｇ又はＣを示し、ＤはＡ、Ｇ又はＴを示し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを示す。
配列番号１９：５’-ＧＡＹＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号２０：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＷＣＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号２１：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＭＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２２：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＹＴＲＡＣＡＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２３：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＲＡＴＧＡＣＭＣＡＧＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２４：５’-ＧＡＹＡＴＴＭＡＧＡＴＲＡＭＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号２５：５’-ＧＡＹＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＹＤＣＡＧＴＣ-３’（縮重度１２）
配列番号２６：５’-ＧＡＹＡＴＹＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＣ-３’（縮重度４）
配列番号２７：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＷＣＣＡＧＴＣ-３’（縮重度４）
配列番号２８：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＷＧＣＴＳＡＣＣＣＡＡＴＣ-３’（縮重度８）
配列番号２９：５’-ＧＡＹＡＴＴＳＴＲＡＴＧＡＣＣＣＡＲＴＣ-３’（縮重度１６）
配列番号３０：５’-ＧＡＹＲＴＴＫＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＲＡＣ-３’（縮重度１６）
配列番号３１：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＢＣＡＧＫＣ-３’（縮重度１２）
配列番号３２：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＹＣＡＧＧＡ-３’（縮重度４）
配列番号３３：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＷＴ-３’（縮重度４）
配列番号３４：５’-ＧＡＹＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＡＣＣ-３’（縮重度２）
配列番号３５：５’-ＧＡＹＡＴＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣ-３’（縮重度２）
Ｊアンチセンス（４セットプライマー）
Ｊ１　／　Ｊ２アンチセンスプライマー　（１）
配列番号３６：５’-ＧＧＳＡＣＣＡＡＲＣＴＧＧＡＡＡＴＭＡＡＡ-３’（縮重度：８）
Ｊ４アンチセンスプライマー　（２）
配列番号３７：５’-ＧＧＧＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡ-３’
Ｊ５アンチセンスプライマー（３）
配列番号３８：５’-ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡ-３’
Ｊ１　／　Ｊ２，　Ｊ４，　Ｊ５アンチセンスプライマー混合物　（４）
（マウスＬ鎖可変領域クローニング７セットプライマー）
ＶＫセンス（シグナルペプチド部分）
　このプライマーはノバジェン社のマウスＩｇ-プライマーセット（　Ｎｏｖａｇｅｎ；　Ｍｅｒｃｋ，　Ｃａｔ．　Ｎｏ．　６９８３１-３）を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
Ａセットセンスプライマー
配列番号３９：５’-ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴ-３’
Ｂセットセンスプライマー
配列番号４０：５’-ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴ-３’
Ｃセットセンスプライマー
配列番号４１：５’-ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴ-３’
Ｄセットセンスプライマー（下記２種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４２：５’-ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴ-３’
配列番号４３：５’-ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧ-３’
Ｅセットセンスプライマー（下記３種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４４：５’-ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴ-３’
配列番号４５：５’-ＡＴＧＴＧＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧ-３’
配列番号４６：５’-ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣ-３’
Ｆセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号４７：５’-ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧ-３’
配列番号４８：５’-ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧ-３’
配列番号４９：５’-ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧ-３’
配列番号５０：５’-ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴ-３’
Ｇセットセンスプライマー（下記４種類のプライマーの混合物を使用）
配列番号５１：５’-ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴ-３’
配列番号５２：５’-ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴ-３’
配列番号５３：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧ-３’
配列番号５４：５’-ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧ-３’
ＫＶＬアンチセンスプライマー
配列番号５５：５’-ＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ-３’
（マウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子をＰＣＲ法で増幅するために使用するプライマー）
　５'末端においてマウスＨ鎖シグナル部分（４セットプライマー）　と相同性を有するプライマーと３'末端においてＫＣ部分と相同性を有するプライマー、あるいは、５'末端においてＦＲ１部分と相同性を有する１セットのプライマーと３'末端においてマウスＨ鎖の定常領域（ＩＧＨＣ）と相同性を有する２種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該ｃＤＮＡからマウス免疫グロブリンＨ鎖可変域ＤＮＡを単離し、遺伝子の配列を解析した。プライマー配列は次のとおりであった。
マウスＨ鎖可変領域クローニングプライマー
　ＶＨセンス（シグナル部分：４セットプライマー）
このプライマーはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．），　Ｕｎｉｔ　２．１２　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，　ａｎｄ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｖ　ＲｅｇｉｏｎｓのＴａｂｌｅ　２．１２．２を参考にした。
配列番号５６：５’-ＡＴＧＧＲＡＴＧＳＡＧＣＴＧＫＧＴＭＡＴＳＣＴＣＴＴ-３’（縮重度：３２）
配列番号５７：５’-ＡＴＧＲＡＣＴＴＣＧＧＧＹＴＧＡＧＣＴＫＧＧＴＴＴＴ-３’（縮重度：８）
配列番号５８：５’-ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴ-３’
配列番号５９：５’-ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹ-３’（縮重度：３２）
マウスＨ鎖可変領域クローニングプライマー
ＶＨセンス（ＦＲ１部分）
　このプライマーはＴａｎら、“Superhumanized" Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD28１, Journal of Immunology １69 (2002) p１１１9-１１25のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
配列番号６０：５’-ＳＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＫＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ-３’（縮重度：２５６）
ＶＨアンチセンス（３，　４に共通のアンチセンスプライマー）
　マウスＩｇＧすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
配列番号６１：５’-ＣＡＳＣＣＣＣＡＴＣＤＧＴＣＴＡＴＣＣ-３’（縮重度：６）
（２）キメラ抗体の一過性発現ベクターの作製
発現プラスミドの作製：
　ＤＮＡ　Ｅｎｇｉｎｅ　（Ｐｅｌｔｉｅｒ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ，　ＭＪ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｂｉｏ-Ｒａｄ）　を用いたＰＣＲ法により抗ＣＤＨ３マウスモノクローナル抗体のＬ鎖、Ｈ鎖それぞれの可変領域を配列番号１９～６１に示されたプライマーを用いて増幅した。増幅したＤＮＡフラグメントはサブクローニングベクターｐＧＥＭ　（プロメガ社）　に組み込んで、このベクターのＴ７，ＳＰ６ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
　キメラ抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖、および、Ｈ鎖の可変域塩基配列はＩＭＧＴ／Ｖ-ＱＵＥＳＴ　Ｓｅａｒｃｈ　ｐａｇｅ　（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ＩＭＧＴ＿ｖｑｕｅｓｔ／ｖｑｕｅｓｔ？ｌｉｖｒｅｔ＝０＆Ｏｐｔｉｏｎ＝ｍｏｕｓｅＩｇ）　で検索して、確かに抗体遺伝子がクローニングできていることを確認した。
　次に、クローン化された抗CDH3キメラ抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域をコードする遺伝子は、キメラＬ鎖発現ベクターにはヒトＣｋ領域をコードする遺伝子を、キメラＨ鎖発現ベクターにはヒトＣｇ１領域をコードする遺伝子をそれぞれ接続した遺伝子をデザインして、これらＬ鎖、Ｈ鎖キメラ抗体遺伝子をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって全長人工合成した。その際、ＣＨＯ生産細胞での遺伝子発現が有利なようにコドン使用頻度の最適化　（Ｋｉｍら、Ｃｏｄｏｎ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｈｉｇｈ-ｌｅｖｅｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ　（ＥＰＯ）　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ，　Ｇｅｎｅ，　１９９，　１９９７，　ｐ２９３-３０１の方法に従った）　をおこなった。具体的には、Ｌ鎖の場合、効率的な翻訳のために必須のＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．，　Ａｔ　ｌｅａｓｔ　ｓｉｘ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ＡＵＧ　ｉｎｉｔｉａｔｏｒ　ｃｏｄｏｎ　ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｃｅｌｌｓ．　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１９６，　ｐ９４７-９５０，　１９８７）、マウスＩＧＫＶ（k鎖可変領域）遺伝子のシグナルペプチド、抗ＣＤＨ３抗体のＬ鎖のＶ領域、ヒトＫＣ（k鎖定常域）の順に遺伝子を並列し、その両端には制限酵素部位（５'  側にＮｈｅＩ，　３'  側にＥｃｏＲＩ）を付加した。キメラＨ鎖も同様に作製した。これら人工合成遺伝子をＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、発現ベクターｐＣＡＧＧＳのＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ部位に組み込み、抗ＣＤＨ３キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ，　Ｈ鎖発現ベクターｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨを得た。
（３）キメラ抗CDH3の安定発現ベクターの作製
　遺伝子操作された抗体遺伝子を、ＣＨＯ細胞を用いて高レベルで発現させるために、ＣＭＶプロモーター配列に連結し、ポリＡシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
　キメラ抗体の安定発現生産細胞株をつくるために、ｄｈｆｒ遺伝子を組み込んだｐＣＡＧＧＳ発現ベクターを作製した。具体的には、一過性の発現ベクターであるｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫに、ＣＭＶプロモーターとポリＡシグナルを有したｄｈｆｒ遺伝子を組み込むことである。ＣＭＶプロモーター、Ｋｏｚａｋ配列をもつマウスｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４０ポリＡシグナルをそれぞれＰＣＲ法によって増幅し、これらの遺伝子の混合物をＰＣＲ法で接続するとともに両端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を付加して、ＨｉｎｄＩＩＩ-ＣＭＶプロモーター-Ｋｏｚａｋ-ｄｈｆｒ-ポリＡ-ＨｉｎｄＩＩＩという遺伝子フラグメントを得た。このフラグメントをｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ、あるいは、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫのＨｉｎｄＩＩＩ部位に組み込んでｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａ、および、ｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶｐ-ｄｈｆｒ-Ａを得た。これらの発現ベクターはキメラ抗体をＣＡＧプロモーターで、ｄｈｆｒ遺伝子をＣＭＶプロモーターで発現させることができ、効率的に遺伝子増幅を利用してキメラ抗体を生産することができた。
（４）キメラ抗CDH3を生産するＣＨＯ細胞株の樹立
　ＣＨＯ ｄｈｆｒ（-）細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p42１6-4220, １980)を用いて、２種類のプラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のＰｖｕＩでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした）すなわち、キメラ抗ＣＤＨ３Ｌ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＫ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクター、および、キメラ抗ＣＤＨ３Ｈ鎖を発現するためのｐＣＡＧＧＳ-ＩＧＨ-ＣＭＶ-ｄｈｆｒ-Ａベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のＡｍａｘａでおこなった。ＤＮＡ（Ｌ鎖、Ｈ鎖各プラスミドにつき０．００２ｍｇ／試料）を３ｘ１０ｅ３ 細胞の０．１ｍＬのＡｍａｘａエレクトロポレーションＣＨＯ用緩衝液に加えてパルスを与えた。
　エレクトロポレーション処理された細胞を、１０％の透析済みＦＢＳを含有し、ＨＴ（Ｈ，　ヒポキサンチン　：　Ｔ，　チミジン）を含まないＩｓｃｏｖｅ'ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）に加えた。遺伝子導入から３日後、１０％透析ＦＢＳ、２ ｍＭ Ｌ-グルタミン、ＨＴを含まないＩＭＤＭに培地を交換して１ｍｇ／ｍＬのＧ４１８でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体産生陽性細胞株クローンを得た。次に、Ｇ４１８で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。０．２５ｍＭ、１ｍＭの２ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、１リットルあたり約５０～１００ｍｇのキメラＣＤＨ３抗体ＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ、ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃを生産する細胞株ＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ及びＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃを樹立できた。
　樹立したキメラ抗CDH3抗体安定発現CHO細胞株であるＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ及びＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃは、２０１１年９月２７日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（郵便番号２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８）に受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４９及びＮＩＴＥ　ＡＢＰ－１１５０としてブタベスト条約に基づいて国際寄託されている。
実施例５　精製抗体の取得
　培養上清よりproteinAを用いて常法により抗体の精製を行い、精製抗体を取得した。
実施例６　抗体Kd値の測定
　抗体の親和性の測定方法としては、FACS、BIACORE,ELISA等の方法がある。細胞表面に対する抗体の親和性を測定するには、抗原が変性していないFACS法が望ましい。FACSによる抗体の親和性の測定方法は、抗体過剰の条件下で、蛍光強度飽和する点を求め、この１/２の蛍光強度を与える抗体濃度を測定すれば、これがKd値となる（参考文献：Journal of Immunological Methods；318、147(2007)）
　抗ＣＤＨ３抗体の親和性の測定は、ＣＤＨ３が高発現であると確認されている癌細胞ＮＣＩ－Ｈ３５８株を用いたフローサイトメトリー法（ＢＤ社　ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）で行った。
　すなわち、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を２ｍＭ　ＥＤＴＡ－ＰＢＳで処理することにより培養プレートから剥離し、５×１０4～２×１０5/ｍｌとなるようＦＡＣＳ溶液（１％ＢＳＡ　ＰＢＳ）に懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウエルプレートに１００μl/ウエル播種し、マウスまたはキメラ抗体の希釈系列（２００μｇ/ｍｌ～０．１３ｎｇ/ｍｌ）１００μｌを添加後４℃で６０分間反応させ、ＦＡＣＳ溶液２００μＬ／ウェル）で３回洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ・ヤギＦ（ａｂ'）２または抗ヒトＩｇＧ・ヤギ（インビトロジェン社）を加えて、４℃で６０分間反応させた。その後ＦＡＣＳ溶液で２回洗浄した後、フローサイトメトリーを実施し、各ウエルの蛍光強度（ＧＥＯ　Ｍｅａｎ）を測定した。
　得られた抗体濃度と対応するＧＥＯ　Ｍｅａｎ値より、ＸＬｆｉｔ４．２．２（ＣＴＣラボラトリーシステムズ株式会社）にり、100%結合強度の1/2のGEO-MEAN(50%結合蛍光強度)を与える抗体濃度を算出しＫｄ値とした。得られた結果を、図５及び表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例７ ＣＤＨ３部分長発現タンパク質による抗ＣＤＨ３モノクローナル抗体のエピトープ分類
　得られた抗ＣＤＨ３抗体のエピトープ分類は、抗体ＰＰＡＴ－０５５－０２、ＰＰＡＴ－０５５－０９、ＰＰＡＴ－０５５－２１、ＰＰＡＴ－０５５－２４、ＰＰＡＴ－０５５－２５、ＰＰＡＴ－０５５－２６、ＰＰＡＴ－０５５－２７についてはＣＤＨ３部分配列発現物とのウエスタンブロットで行い、抗体ＰＰＡＴ－０５５－２８については、ウェスタンブロットでの反応が確認できなかったため、ＥＬＩＳＡ法で行なった。ＣＤＨ３部分配列発現物は各断片間で十分に配列が重複するように断片１から６を設計した（図６）。
（Ａ）ウェスタンブロッティングを用いたエピトープ分類
（１）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現ベクターの作製
  実施例１の全長ＣＤＨ３ｃＤＮＡをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いて、断片１～５に相当する部分のcDNAをＰＣＲ反応により増幅した。この反応にはｉＰｒｏｏｆ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（バイオラッド社）を用い、条件は９８℃－１０秒、６０℃－１０秒、７２℃－３０秒、３５サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、ＱＩＡ（登録商標）クイックゲル抽出キットを用いて、目的のＣＤＨ３ｃＤＮＡ断片を得た。
　このＣＤＨ３断片を大腸菌発現ベクターｐＣｏｌｄ（登録商標）ＴＦ（タカラバイオ社）へ挿入するために、２種類の制限酵素ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理した後、同じくＫｐｎＩ及びＸｂａＩで処理したｐＣｏｌｄＴＦにＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて常法に従い挿入し、各断片を発現するための発現ベクターを得た。
以下のプライマーセットを用いてＰＣＲ反応を行い各断片を得た。
断片１（配列番号２の１０８位－２３６位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＣＴＧ（配列番号：９）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＴＡＧＧ（配列番号：１０）
断片２（配列番号２の１３２位－３４８位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＡＡＧＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号：１１）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＣＡ（配列番号：１２）
断片３（配列番号２の２３７位－４６１位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＣＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号：１３）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＧ（配列番号：１４）
断片４（配列番号２の３４９位－５５０位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧ（配列番号：１５）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＧＧＣＴＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＴＴＧ（配列番号：１６）
断片５（配列番号２の４６２位－６５４位）
フォワードプライマー：ＴＡＴＧＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＴＡＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＣＡＡＧＧ（配列番号：１７）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＡＣＣＴＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号：１８）
（２）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現
　（１）のＣＤＨ３断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Ｒｏｓｓｅｔｔａ（登録商標）２（メルク社）を形質転換し、ＬＢ培地中で培養。６００ｎｍの吸光値が０．４となった段階で、３０分間氷冷し、イソプロピルーβーチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）濃度を０．５ｍＭとし、２０℃で１８時間培養後、回収した。
　ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現は、大腸菌培養液を電気泳動後、抗Ｐｅｎｔａ－Ｈｉｓ抗体（キアゲン社）によるウェスタンブロット法を実施し、予想された位置にバンドが存在する事で確認した。
　即ち、上述した大腸菌培養液量の１／１０量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下５－２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、イモビロン（登録商標）Ｐ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、１０％ブロックエース（登録商標）（雪印乳業社）入りＴＢＳ－Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ－Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ－Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ（登録商標）－Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線フィルムＲＸ－ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を図７に示す。
（３）ＣＤＨ３部分配列発現物を用いた抗体エピトープ分類
　上述の各ＣＤＨ３部分長タンパク質を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、５－２０％グラジエントゲル（バイオラッド社）にチャージして電気泳動後、ブロッティング装置（バイオラッド社）を用いて、イモビロンＰ（ミリポア社）に転写した。転写膜は、ＴＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ＴＢＳ）で軽く洗った後、４０％ＢＳＡ入りＴＢＳで１時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈した各抗ＣＤＨ３抗体を加え１時間振とうした。ＴＢＳ－Ｔで洗った後１０％ブロックエース入りＴＢＳ－Ｔで希釈したＨＲＰ－抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）で１時間振とう後、ＴＢＳ－Ｔで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ＥＣＬ－Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、Ｘ線Ｆｉｌｍ　ＲＸ－ｕ（富士フイルム社）にて検出した。得られた結果を表２及び図８に示す。
　各ＣＤＨ３部分長タンパク質との反応性により、各抗体が認識する領域を決定した（表２）。
　配列番号２で示されるＣＤＨ３配列上の各抗体が認識する領域との対応関係を以下に示す。
ＥＣ１：１０８位－２３６位
ＥＣ２：２３７位－３４８位
ＥＣ３：３４９位－４６１位
ＥＣ４：４６２位－５５０位
ＥＣ５：５５１位－６５４位
（Ｂ）ELISAを用いたエピトープ分類
（１）ＣＤＨ３部分長タンパク質の発現ベクターの作製
　断片６に相当する部分は、Fcとの融合タンパク質として調製した。まず、断片６を、マウスIgG2aのFc部分と融合するようにcDNAを設計した。シグナルペプチドは、抗体κ鎖のものを使用した。断片６とマウスIgG2aのFc融合タンパク質は配列番号６２，アミノ酸配列は配列番号６３に記載した。
　断片６－Fc融合タンパク質の遺伝子は、米国の遺伝子合成受託会社であるGenScriptで人工合成した。その際、サブクローニングのために制限酵素部位を5プライム側にNheIを、3プライム側にEcoRI部位を付加した。また、遺伝子の塩基配列はGenScriptによってコドンの使用頻度の最適化が実施されている。
　pUCサブクローニングベクターに組み込まれている人工合成した遺伝子「断片６-Fc」を制限酵素NheIとEcoRIで消化して、NheIとEcoRIで消化した哺乳類用発現ベクターのpCAGGS、あるいは遺伝子増幅用にマウスDHFR遺伝子を組み込んだpCAGGS-DHFRに組み込んだ。
(２)断片６の発現
　一過性の発現はインビトロジェン社のフリースタイルを用いておこなった。方法はインビトロジェン社のプロトコールに従った。生産細胞にはインビトロジェン社の293Fを使用し、遺伝子導入試薬はフリースタイル・マックス・トランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いた。Fc融合可溶性抗原の遺伝子を導入した293Fは、CO2濃度を制御できるタイテック製の震盪機で４～８日間培養して生産した。
　定生産細胞株にはCHO dhfr－細胞（G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980）を用いた。可溶性抗原発現プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子内のPvuIでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした；プラスミド量は2 μｇ／試料）をロンザ社製のAmaxaで3 x 10e3 細胞（0.1 mLのCHO用緩衝液に懸濁）に遺伝子導入した。
エレクトロポレーション処理された細胞を、10%の透析済みFBSを含有し、HT（H, ヒポキサンチン : T, チミジン）を含まないIscove's Modified Dulbecco培地（IMDM）に加えた。遺伝子導入から3日後、10%透析FBS、2 mM L-グルタミン、HTを含まないIMDMに培地を交換して1 mg/mLのG418でｎｅｏ＋形質転換細胞の選択をおこない、キメラ抗体を産生する陽性細胞株クローンを得た。次に、G418で選択されたクローンを用いて遺伝子増幅をおこなった。100 nM、200 nMの2ラウンドのメソトレキセート（ＭＴＸ）中での増幅の後、1リットルあたり約20～30 mgの可溶性抗原を生産する細胞株を樹立した。
（３）発現させた抗原の定量
　生産細胞の培養上清をELISAにより測定して、抗体Fc部分との融合可溶性抗原が生産されていることを確認した。Fc融合タンパク質を検出するため、プレートをヤギポリクローナル抗マウス（Dako： Cat Z0420）でコートした。ブロックした後、培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗マウスIgG(Fc)-HRP (Jackson： Cat. 115-035-071) を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして450 nmにおける吸光度を測定した。標準として精製マウスＩｇＧ2aを用いた。
（４）発現させた抗原の精製
　発現は無血清培地のCHO-SFM-IIを使用し、3～4日間の培養後、上清を回収した。生産細胞として293F、あるいはCHO細胞を使用した。生産時の可溶性抗原を含む培養上清は0.45 μmメンブレンフィルターを通した後、融合蛋白のFc部分の特性を利用して、プロテインAセファロース（プロテノバ）カラムで精製した。一過性発現で発現・精製した抗原のCBB染色図を図９に示す。
（５）ＣＤＨ３部分配列発現物を用いた抗体エピトープ検定
上述のＣＤＨ３部分長タンパク質を、２．５μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ（－）に懸濁させ、９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置した。翌日、ウェル内の溶液を捨て、Buffer A: 50mM Tris-HCl / 150mM NaCl / 1mM CaCl2 / 0.05% Tween20 (pH7.5)で洗浄した。次に、PPAT-055-28Cを、濃度を変えてBuffer Aに希釈したものを調製し、１００μＬ／ウェルで分注し、室温においてプレートシェーカーで１時間震盪した。溶液を捨て、Buffer Aで洗浄した後、ＨＲＰ標識抗体（HRP-goat anti human IgG (H+L) (absorbed with mouse, rabbit, bovine IgG) (American Qualex International, cat. A-110PD)）をbufferAで１０，０００倍希釈したものを調製し、１００μＬ／ウェルで分注し、室温においてプレートシェーカーで１時間震盪した。Buffer Aで洗浄した後、TMB発色液を１００μＬ／ウェルで加え、暗所で１５分静置して発色を行った。停止液を１００μＬ／ウェルで加えた後、プレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた結果を表２及び図１０に示す。ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ及びＰＰＡＴ－０５５－２８は、認識エピトープが１－２であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例８　抗ＣＤＨ３抗体の抗体依存性細胞傷害 （ＡＤＣＣ） 活性の測定
　ＡＤＣＣ活性の測定は、放射性ラベルした標的細胞にエフェクター細胞存在下、抗体を作用させ、その遊離放射活性を測定する方法によった。
（１）エフェクター細胞の調製
　Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ　Ｊｃｌマウス（８週齢、オス、日本クレア社）の大腿骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で２ｘ１０6個／ｍＬに調製し、ヒトＩＬ－２（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）５０ｎｇ／ｍＬ、マウスＧＭ－ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社）１０ｎｇ／ｍＬ存在下で６日間培養した。測定当日に細胞を回収し、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地で洗浄後、エフェクター細胞溶液とした。
（２）標的細胞の調製
　標的細胞として、全長ＣＤＨ３発現ＣＨＯ細胞（ＥＸＺ１５０１）を用いた。細胞をプレートから剥離後、１ｘ１０7個／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地に懸濁し、終濃度）１５０ｕＣｉとなるように51Ｃｒを加え、５％炭酸ガスインキュベーター中３７℃で１．５時間培養した。この細胞を培地で２回洗浄後、１０％ＦＢＳ含有ＨＡＭ培地を加え、１ｘ１０4個／ウェルとなるように９６ウェルＵ底プレート（ＮＵＮＣ社）に播き、標的細胞とした。
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
　標的細胞にそれぞれ０．００１、０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬ濃度になるよう調製した抗体溶液を５０μＬ／ウェル分注した後、室温で１５分間インキュベートした。次いで、エフェクター細胞１００μＬ（１ｘ１０5細胞／ウェル）を分注し、炭酸ガスインキュベーター中で４時間培養した。培養上清を回収し、培養上清１００μＬ中の放射活性をシンチレーションカウンターで測定した。
　このとき、細胞傷害活性は以下の式で求めた。
   細胞傷害活性（％）＝（Ａ－Ｃ）／（Ｂ－Ｃ）×１００
Ａ：各抗体添加ウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｂ：標的細胞に２％ＮＰ４０溶液１００μＬ、 １０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地５０μＬを添加したウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
Ｃ：標的細胞にエフェクター細胞を含む１０％ＦＢＳ含有培地１５０μＬを加えたウェルの放射活性値（ｃｐｍ）
　試験は３重に測定し、その平均値から細胞傷害活性（％）を算出した。
抗体濃度が１ ｕｇ／ｍＬの時の細胞傷害活性が３０％以上の場合はＳ、３０％未満の場合はＷとして判定した。
　試験結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例９　RI標識抗体の作製
（１）抗体へのＤＯＴＡの結合
　ＰＰＡＴ－０５５－２８ＣおよびＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ抗体を緩衝液（５０ｍＭＢｉｃｉｎ－ＮａＯＨ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ８．５）に溶解し、抗体濃度を１０ｍｇ／ｍＬに調整した。一方で、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製　Ｂ－２０５））を、ＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度になる様に溶解した。抗体とＤＯＴＡのモル比が１：３となるように混合、撹拌し、２５℃で１７時間静置した。反応終了後、脱塩カラム（ＰＤ－１０、ＧＥヘルスケア社製　１７－０４３５－０１）でＰＢＳを用いて精製した。
（２）ＲＩ標識抗体の調製
（ｉ）111Ｉｎ標識
　精製したＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ、ＰＰＡＴ－０５５－２７ＣのＤＯＴＡ結合抗体を６ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液（０．２５Ｍ　酢酸アンモニウム―ＨＣｌ　ｐＨ５．５）に溶解し、111ＩｎＣｌ3溶液（MDS Nordion Inc.社製）を加えて４５℃、１時間インキュベートした。
（ｉｉ）90Ｙ標識
　精製したＰＰＡＴ－０５５－２８ｃ、ＰＰＡＴ－０５５－２７ｃのＤＯＴＡ結合抗体を６ｍｇ／ｍＬとなるように緩衝液（０．２５Ｍ　酢酸アンモニウム－ＨＣｌ　ｐＨ５．５）に溶解し、90ＹＣｌ3溶液（ｎｕｃｌｉｔｅｃ社製）を加えて４５℃、１時間インキュベートした。
（ｉｉｉ）標識率の確認
　標識反応液の一部をサンプリングし、薄層クロマトグラフィー（ＰＡＬＬ社製、６１８８５）を用いて標識率を確認した。展開溶媒を生理食塩水とし、ストリップの上端と下端の放射活性をγ－カウンターを用いて測定し標識率を以下の式により算出した。
　標識率＝（下端のカウント／（上端のカウント＋下端のカウント））×１００（％）
　標識率が９０％以上のときに後の実験に使用した。標識抗体は、脱塩カラム（ＰＤ－１０、ＧＥヘルスケア社製　１７－０４３５－０１）でＰＢＳを用いて精製した。
実施例１０　体内分布の検討
　肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ１３７３を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地用いて培養し、ヌードマウス（メス、７週齢、日本クレア）の右腹側部皮下に５×１０6個／マウスとなるように移植した。
　次に、111Ｉｎ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ及び、111Ｉｎ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃを３７０ｋＢｑ／匹となるよう投与した。
　投与後、経時的に屠殺、解剖を行って組織および腫瘍を摘出し、組織および腫瘍の重量を測定した後にγ―カウンターにより放射活性を測定し以下の式により％ＩＤ／ｇを算出した。
％ＩＤ／ｇ＝（集積ＲＩ量／総投与量ＲＩ量ｘ１００（％））／重量（ｇ）
　試験結果を図１１及び１２に示す。ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ及びＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ抗体は、共に最大で５０％ID/g以上の高い集積を示した。
実施例１１　薬効試験
　肺がん由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ１３７３を１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地用いて培養し、ヌードマウス（メス、７週齢、日本クレア）の右腹側部皮下に５×１０６個／マウスとなるように移植した。
　ＮＣＩ－Ｈ１３７３移植マウスを、１群を８匹として準備し、９０Ｙ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ又は９０Ｙ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ抗体を５．６ＭＢｑ／匹、３．７ＭＢｑ／匹投与した。対照として生理的食塩水を１００μＬ／匹投与した。投与は、いずれの群においても平均腫瘍径が１００～１５０ｍｍ3となった時点で行った。
　投与後、週２回（３日または４日毎）体重と腫瘍径の測定を行い、投与後４２日目まで観察を行った。
　試験結果を図１３及び１４に示す。９０Ｙ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２８Ｃ及び９０Ｙ－ＤＯＴＡ－ＰＰＡＴ－０５５－２７Ｃ抗体は、放射活性と正比例する抗腫瘍効果を示した。

Claims (21)

  1. カドヘリンのカドヘリンドメイン１（ＥＣ１）またはカドヘリンドメイン２（ＥＣ２）を認識し、かつ抗原に対する５０％結合を与える抗体濃度であるＫｄ値が１０ｎＭ以下である、抗カドヘリン抗体。
  2. カドヘリンがＰ－カドヘリンである、請求項１に記載の抗体。
  3. Ｐ－カドヘリンまたはＰ－カドヘリンを発現する細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. Ｐ－カドヘリンが可溶型Ｐ－カドヘリンまたはその断片である、請求項３に記載の抗体。
  5. モノクローナル抗体である、請求項１から４の何れかに記載の抗体。
  6. モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
  7. 抗体濃度１μｇ／ｍＬのときの抗体依存性細胞傷害活性が３０％未満である、請求項１から６の何れかに記載の抗体。
  8. 受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４６、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４９、又はＮＩＴＥ　ＢＰ－１１５０を有する細胞が産生するモノクローナル抗体。
  9. 請求項８に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体。
  10. 請求項８に記載のモノクローナル抗体のVH及び／またはVL ドメインのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び／またはVL ドメインを有する抗体またはその断片。
  11. 請求項５又は８に記載の抗体を産生する細胞株。
  12. 受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８７、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９８９、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９０、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９１、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９２、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９３、ＮＩＴＥ　ＢＰ－９９４、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４６、ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１４９、又はＮＩＴＥ　ＢＰ－１１５０を有する細胞株。
  13. 細胞傷害性物質が結合している、請求項１から１０の何れかに記載の抗体。
  14. 細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、請求項１３に記載の抗体。
  15. 細胞傷害性物質が、イットリウム（９０）、インジウム（１１１）およびヨウ素（１３１）からなる群より選択される放射性物質である、請求項１３又は１４に記載の抗体。
  16. 請求項１から１５の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
  17. 上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、請求項１６に記載の細胞傷害剤。
  18. 細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、請求項１７に記載の細胞傷害剤。
  19. 細胞傷害性物質が、イットリウム（９０）、インジウム（１１１）およびヨウ素（131）からなる群より選択される放射性物質である、請求項１７又は１８に記載の細胞傷害剤。
  20. 抗癌剤として使用される、請求項１６から１９の何れかに記載の細胞傷害剤。
  21. カドヘリン高発現の癌患者に投与される、請求項１６から２０の何れかに記載の細胞傷害剤。
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