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WO2011154772A1 - Composición veterinaria oral para salmónidos que comprende 1-beta-d-ribofuranosil-1h-1,2,4-triazol-3-carboxamida y el uso para el tratamiento de la anemia infecciosa del salmón (isa) en salmónidos - Google Patents

Composición veterinaria oral para salmónidos que comprende 1-beta-d-ribofuranosil-1h-1,2,4-triazol-3-carboxamida y el uso para el tratamiento de la anemia infecciosa del salmón (isa) en salmónidos Download PDF

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Publication number
WO2011154772A1
WO2011154772A1 PCT/IB2010/052548 IB2010052548W WO2011154772A1 WO 2011154772 A1 WO2011154772 A1 WO 2011154772A1 IB 2010052548 W IB2010052548 W IB 2010052548W WO 2011154772 A1 WO2011154772 A1 WO 2011154772A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fish
treatment
salmonids
antiviral
virus
Prior art date
Application number
PCT/IB2010/052548
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ana María SANDINO
Geraldine Mlynarz Zylberberg
Matilde Jashes Morgues
Eugenio Spencer Ossa
Original Assignee
Laboratorio De Diagnostico Gam, S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratorio De Diagnostico Gam, S.A. filed Critical Laboratorio De Diagnostico Gam, S.A.
Priority to CA2801896A priority Critical patent/CA2801896C/en
Priority to PCT/IB2010/052548 priority patent/WO2011154772A1/es
Priority to EP10852809.2A priority patent/EP2583681A4/en
Priority to US13/702,642 priority patent/US20130190263A1/en
Publication of WO2011154772A1 publication Critical patent/WO2011154772A1/es

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    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/7056—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing five-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
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    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Definitions

  • the present invention relates to a new oral veterinary composition for salmonids comprising ribavirin and to the use of this veterinary composition for the treatment of infectious salmon anemia caused by the infectious salmon anemia virus or ISA virus, in salmonids.
  • Infectious Salmon Anemia is an exclusive viral disease of Atlantic salmon (Salmo salar L.) in culture, discovered in 1984 in Norway (Thorud and Djupvik, Infectious anaemia in Atlantic salmon (Salmo salar L), Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 8: 109-111, 1988) and is characterized by causing high mortality in fish.
  • the etiologic agent of this disease is the Infectious Salmon Anemia Virus (ISAV). It belongs to the family Orthomyxoviridae, it has 8 segments of genomic RNA from single strands of negative polarity, which code for 8 structural proteins and 2 non-structural proteins. The genomic organization of ISAV has placed it in a new genus, the Isavirus or Aquaorthomyxovirus (Krossoy and cois, The putative polymerase sequence of infectious salmon anemia virus suggests a new genus within the Orthomyxoviridae, J Virol 73, 2136-2142, 1999).
  • the 8 segments of genomic RNA are linked to multiple copies of the viral nucleoprotein (NP), at whose 3 'ends a copy of the RNA polymerase complex formed by the PB1, PB2 and PA proteins is located; which together are called ribonucleoproteins.
  • the protein capsid consisting of the proteins of the MI and M2 matrix, is surrounded by a membranous envelope where the Hemagglutinin-esterase (HE) and Fusion (F) glycoproteins (Aspehaug and cois, Characterization of the infectious salmon anemia virus fusion protein, J Virol 79, 12544-12553, 2005).
  • the ISAV replicative cycle is very similar to that of Influenza A Virus, where the HE protein recognizes a cell receptor that contains 4- O-acetyl-sialic acid (Hellebo and cois, Infectious salmon anemia virus specifically binds to and hydrolyzes 4-O- acetylated sialic acids, J Virol 78, 3055-3062, 2004). Subsequently, the particle is entered into the cell in clathrin-covered vesicles, which merge into endosomes, giving the acidic environment necessary for fusion between the membranes, viral and endosomal, allowing virus denudation. Viral ribonucleoproteins go to the cell nucleus, where viral transcription begins.
  • Viral mRNAs produced in the nucleus are translated in the cell cytoplasm, returning only NP, PB1, PB2 and PA proteins to the nucleus; which allows the onset of viral replication and subsequently, formation of ribonucleoproteins.
  • the assembly of the mature viral particles is carried out in the cell membrane where the glycoproteins, HE and F migrate, in addition to the M proteins, which will be the NP receptors, finally releasing the virions by a budding process.
  • antiviral compounds have been approved for use in humans, primarily for the treatment of infections caused by human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B virus (HBV) and herpes virus.
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HBV hepatitis B virus
  • herpes virus the number of approved antivirals that can be used for the treatment of infections caused by RNA viruses is very limited.
  • M2 channel inhibitors amantadine and rimantadine, and neuraminidase inhibitors, oseltamivir and zanamivir, for influenza; and rivabirin for the treatment of respiratory syncytial virus (RSV), hepatitis C virus (HCV) and is also being used for the treatment of Lassa fever (Revised in: Leyseen and cois, Molecular strategies to inhibit the replicator) of RNA viruses, Antivir. Res. 78: 9-15, 2008).
  • RSV respiratory syncytial virus
  • HCV hepatitis C virus
  • Ribavirin is a synthetic nucleoside of chemical name 1-beta-D-ribofuranosyl-l / - / - l, 2,4-triazol-3-carboxamide with the following structural formula (Formula I):
  • Rivabirin is a broad-spectrum RNA virus replication inhibitor, which has been approved for the treatment of HCV infections in combination with interferon and for the treatment of pediatric RSV infections in aerosol form. It has also been used experimentally for other conditions, including Lassa fever (Khan and cois, New opportunities for field research on the pathogenesis and treatment of Lassa fever, Antivir. Res. 78: 103-115, 2008), CCHF virus (Ergonul, Treatment of Crimean-Congo hemorrhagic fever. Antivir Res. 78: 125-131, 2008) and hantavirus (Jonsson et al. Treatment of hantavirus pulmonary syndrome, Antivir. Res. 78: 162-169, 2008).
  • RNA viruses Although it has been found that the compound inhibits in vitro replication of some viruses studied, the majority being RNA viruses, it was shown to exert a protective effect only in some animal models. Also, the potency of the in vitro activity of ribavirin can vary considerably depending on the nature of the virus (Graci and Cameron, Mechanism of action of ribavirin against distinct viruses, Rev. Med. Virol. 16, 37-48, 2006) .
  • RNA viruses are sensitive to the in vitro activity of ribavirin, but only some are more susceptible than others.
  • ribavirin is not very potent as an antiviral drug, with EC50 values (50% effective concentration) of 1 ⁇ or even higher being observed regularly.
  • EC50 values 50% effective concentration
  • in vitro antiviral activity against bunyaviruses has been demonstrated including CCHF virus (Crimea-Congo hemorrhagic fever), Rift Valley fever virus and hantavirus.
  • coronavirus-SARS and flaviviruses It also inhibits coronavirus replication, including coronavirus-SARS and flaviviruses, but has not shown efficacy in animals experimentally infected with these viruses (Watts and cois, Inhibition of Crimean-Congo hemorrhagic fever viral infectivity yields in vitro by ribavirin. Am. J Trop. Med. Hyg. 41: 581-585, 1989; Huggins, Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with ribavirin, a broad-spectrum antiviral drug. Rev. Infect. Dis. 11 (Suppl. 4) S750-S761, 1989; Severson and cois, Ribavirin causes error catastrophe during Hantaan virus replication. J. Virol.
  • ribavirin is not effective in animal models infected with filovirus (Huggins, Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with ribavirin, a broad-spectrum antiviral drug. Rev. Infect. Dis. 11 (Suppl. 4) S750-S761 , 1989). It has also been observed that ribavirin is effective in vitro and in vivo against RSV, a paramyxovirus, and shows relative sensitivity in cell cultures over another paramyxovirus, the Nipah virus, but it has been shown to have only limited efficacy in animal models ( Snell, Ribavirin therapy for Nipah virus infection. J. Virol.
  • ribavirin on HSV (viral hemorrhagic septicemia virus) in EPC cell cultures ⁇ Ephitelioma papulosum cyprini) has also been evaluated.
  • the cells were infected with the virus and treated with ribavirin in concentrations of 1 to 25 pg / ml.
  • the results showed a strong inhibition of the virus at concentrations of 5, 10 and 25 pg / ml.
  • a high inhibition in the accumulation of viral RNA is also shown when 25 pg / ml is added at 0 hours post infection, with a 99.8% RNA inhibition occurring at 10 hours post infection.
  • IPNV infectious pancreatic necrosis virus
  • These mechanisms include: (1) depletion of intracellular levels of GTP by inhibition of IM P intracellular dehydrogenase, caused by the metabolite 5'-monophosphate of ribavirin; (2) inhibition of viral polymerase activity, caused by the metabolite 5'-triphosphate of ribavirin; (3) inhibition of the viral capsid by inhibition of guanyltransferase activity caused by ribavirin 5'-triphosphate; (4) inhibition of viral helicase causing the process called catastrophic error due to the accumulation of mutations, some lethal, in the viral genome.
  • ribavirin is used for the chronic treatment of hepatitis C in humans, in association with alpha interferon.
  • Rebetol® warn the FDA (Food and Drug Administration) of an important alert of primary toxicity of this compound, for the hemolytic anemia that triggers in patients treated with the product and that It can lead to a worsening of heart disease causing fatal and non-fatal myocardial infarctions.
  • an effective veterinary composition that includes an antiviral such as ribavirin, which is useful for the treatment of fish infected with the ISA virus, a problem in the world of aquaculture that currently has no effective solution and efficient that it can really stop and reverse a picture of infections caused by this virus, and that not stopping it can cause great losses, not only to the producing country but also to all consumers to whom the product finally arrives.
  • an antiviral such as ribavirin
  • the problem should be addressed by looking at the properties of the etiological agent that remain over time and that may be violated by other mechanisms.
  • the inventors taking into account that the ISA virus shares certain characteristics with the influenza virus, thought that an efficient way to control the disease could be by formulating an oral veterinary composition comprising an antiviral that has already been proven to be efficient to inhibit those types of viruses. But surprisingly they found that of all the antivirals tested, only ribavirna proved to be really effective in vitro.
  • Ribavirin is a broad spectrum antiviral compound, but from the existing background nothing suggests that it can be useful for the treatment of this disease, even more having been reported that one of its most important toxic effects is hemolytic anemia, an expert in the I would never even consider this matter for the treatment of an infection caused by ISAV, a disease that is characterized by developing severe anemia, among other complications, which as a whole are ultimately fatal to the fish. Contrary to the foregoing, the inventors of the present invention have surprisingly found that an oral veterinary composition comprising ribavirin is effective in the treatment of fish infected with the ISA virus.
  • the present invention relates to a composition exclusively for veterinary use comprising ribavirin, in a pharmaceutical form of oral powder, to incorporate into the pellet of normal fish food through an oil impregnation process, with the dual purpose, on the one hand facilitate oral administration and, on the other, improve bioavailability in the target species.
  • This veterinary composition comprising ribavirin is useful for the treatment of fish infected with the infectious salmon anemia virus or ISAV. Ribavirin will be referred to as hereafter or as 'Antiviral'.
  • the concentration of ribavirin in the formulation is between 0.5% to 5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the composition comprises veterinarily acceptable excipients for salmonids to be administered orally.
  • the composition comprises excipients such as: spray dried lactose, partially pregelatinized corn starch, lactose monohydrate, corn starch, colloidal silicon dioxide, or mixtures thereof.
  • the composition comprises partially pregelatinized corn starch as an excipient.
  • the concentration of ribavirin in the formulation is 5% by weight with respect to the total weight of the composition.
  • Figure 1 Viral viability in the presence of different concentrations of oseltamivir.
  • Figure 2 Viral viability in the presence of different concentrations of shikimic acid.
  • Figure 3 Viral viability in the presence of different concentrations of the Antiviral.
  • Figure 4 Cell viability in the presence of different concentrations of the Antiviral.
  • Figure 5 Cumulative mortality of fish treated with the Antiviral in different doses orally. This Figure shows the cumulative mortality observed in the 5 test ponds.
  • the fish in the Cl, C2 and C3 ponds are controls that did not receive Antiviral.
  • the fish in the TI and T2 ponds received doses of 800 pg / mL and 400 pg / mL of the compound.
  • Figure 6 Total average viral load per treatment in fish in ponds C3, TI and T2.
  • Figure 7 Average viral load in live fish samples. These fish died from euthanasia at the end of the trial. Viral loads of ponds C3, TI and T2 are shown.
  • Figure 8 Average viral load in samples of dead fish from ponds C3, TI and T2. These fish died during the ISA virus test.
  • Figure 9 Average viral load in samples of infected fish from ponds C3, TI and T2. These fish were infected by intraperitoneal injection.
  • Figure 10 Viral load in samples of uninfected fish from ponds C3, TI and T2. These fish were infected by co-habitation with pre-infected fish intraperitoneally.
  • Figures 11A and 11 B Necropsy photographs of fish from the Cl.
  • Figures 12A and 12B Photograph of fish necropsy of pond C2.
  • Figure 13 A Necropsy photograph of a C3 pond fish.
  • Figure 13 B Approach of the necropsy photograph of Figure 13 A.
  • Figure 14 A Necropsy photograph of an IT pond fish infected intraperitoneally with the ISA virus. This fish was treated with 800 pg / mL of the Antiviral.
  • Figure 14 B Necropsy photograph of two fish in the IT pond infected by co-habitation with the ISA virus. This fish was treated with 800 pg / mL of the Antiviral.
  • Figure 15 A Necropsy photograph of a T2 pond fish infected intraperitoneally with the ISA virus. This fish was treated with 400 pg / mL of the Antiviral.
  • Figure 15 B Necropsy photograph of a T2 pond fish infected by co-habitation with the ISA virus. This fish was treated with 400 pg / mL of the Antiviral.
  • Figure 16 Average hematocrit. The hematocrit found in the fish of the Cl, C2, C3, TI and T2 ponds is shown.
  • FIG. 17 Mortality in fish with and without treatment. The accumulated mortality in the fish of the different ponds (No. 1 to No. 8) of treatment and control is shown.
  • Figure 18 Hematocrit and Hemoglobin values. The average values found in the treated fish and in healthy and infected controls are shown.
  • SHK-1 cells derived from the Atlantic salmon kidney, were grown at 15 ° C in growth medium (Leibovitz L-15 medium, 4 mM L-glutamine, 40 ⁇ 2-mercaptoethanol, 50 g / mL gentamicin sulfate, 8% SFB).
  • Monolayers of SHK-1 cells grown for 3 days to reach a confluence of approximately 60%, were inoculated with a 1/10 dilution of an isolated virus in SHK-1 cell culture from the heart of a naturally infected fish in southern Chile, in the middle of infection (Leibovitz L-15 medium without SFB, 4 mM L-glutamine , 2- mercaptoethanol 40 ⁇ , gentamicin 50 g / mL). After a 4 hour incubation at 15 ° C the inoculum was replaced by growth. Infected monolayers were subsequently incubated at 15 ° C for 3 days. The presence of the ISA virus in the inoculums was checked by real-time RT-PCR. ISAV Replication Cycle Inhibition Assay
  • Monolayers of SHK-1 cells were grown in 6-well plates, 9.6 cm 2 in surface, the cells propagated for no more than 3 days and were infected with ISAV. After the 4 hours of incubation with the virus, the medium was changed by means of growth to which the different dilutions of the different compounds to be tested were added (Antiviral, oseltamivir or shikimic acid). After 3 days post infection the cell supernatant was collected and subjected to viral RNA extraction. Viral replication was qualitatively analyzed by quantification by real-time RT-PCR.
  • Viral viability was evaluated in cells infected with the ISA virus subjected to different concentrations of antivirals that have been shown to be effective in the treatment of influenza. It was observed that both oseltamivir, a known antiviral used for the treatment of influenza, and its precursor, shikimic acid, were ineffective in inhibiting viral replication. In the case of oseltamivir, no more than 60% inhibition of ISA virus replication was obtained at concentrations as high as 300 pg / mL ( Figure 1).
  • influenza A and B viruses have described EC 50 ranging from 0.03 ng / mL to 2.84 ng / mL (Mai Le et cois, Isolation of drug-resistant H5N1 virus, Nature 437: 1108 , 2005; Calligari and cois, Inhibition of viral Group- 1 and Group-2 neuraminidases by oseltamivir: A comparative structural analysis by the ScrewFit algorithm, Biophys. Chem. 141: 117-123, 2009).
  • the cytotoxicity of the compounds was evaluated by cell viability assays. All assays were performed in duplicate on SHK-1 cell cultures.
  • SHK-1 cell monolayers were grown in individual culture wells of 9.6 cm 2 of surface to an approximate confluence of 90-100%.
  • fetal bovine serum FBS
  • SLB fetal bovine serum
  • a solution of the Antiviral compound was added at different concentrations. The cells were incubated for 3 days at 15 ° C, the state of the cell monolayer was observed by inverted optical microscope, then the cells were washed twice with PBS, and then released with 200 ⁇ of a 0.5 mM EDTA solution and 0.02% trypsin and incubated at room temperature for 2 minutes.
  • the cells are centrifuged for 10 minutes at 3000 rpm, the supernatant was removed and resuspended in 2% SFB PBS.
  • 3uL of propidium iodide 50 Mg / mL in phosphate buffer
  • counting was performed by cytometry of the viable and non-viable cells of a total of 100,000 cells. The result was expressed as a percentage of living cells (% cell viability).
  • Antiviral ribavirin
  • ribavirin Since ribavirin is approved for use in humans by various global regulatory agencies such as the FDA and the EMEA (from English European Medicines Agency), it is possible to guarantee a certain safety for use in fish.
  • Tests were conducted in a controlled environment in seawater (25 ppt) with 156 smolt fish of the Salmo salar species of approximately 70 g in weight, at the clergy University of the Holy Conception of Chile.
  • the fish were distributed in their respective ponds and 7 days were expected to acclimatize before performing the infection procedure.
  • the fish were distributed in 5 systems with independent seawater recirculation, with two culture ponds, each with a volume of 140 L.
  • Each line had a collection pond that distributed the water to the closed system and a biological filter to control nitrogen compounds.
  • the collection pond had a minimum capacity of 40 liters, of which water is distributed to each of the ponds belonging to the line.
  • the pond must maintain the normal pH, ammonium, and oxygenation conditions accepted in fish farms.
  • the flow of water distribution to the lines is constant with a recirculation rate of 2 to 4 times / hour and a renewal rate of fresh water of 10 to 30% per day.
  • the temperature was maintained between 14 to 16 ° C.
  • Abiotic factors such as pH and ammonium concentration were those normally accepted in Fish Farm Recirculation Systems and were controlled with a biological filtration system.
  • the circulation of water from the collection to the ponds was constant, maintaining a water recirculation rate of 2 to 4 times / hour, which was maintained with the same rate between the ponds.
  • the fish were fed an amount of medicated food or control food in an amount of 0.5% of their body weight.
  • the first group corresponded to the healthy control (Cl, see Table 2) and the second group was the healthy control treated with the highest dose of antiviral (to assess toxicity) (C2, see Table 2).
  • the remaining 96 fish were distributed in three groups of 32 fish each, which were arranged in independent ponds called C3, TI and T2. 40% of the fish in each of these ponds were injected intraperitoneally with a suspension of ISA virus and the remaining 60% were expected to be infected by co-habitation. In this way the experimental infection resembles the reality of the terrain.
  • thermometers thermometers
  • hoses to aspirate meshes to move the fish
  • meshes to move the fish were properly separated and a set of material for exclusive use was assigned to each working group.
  • Antiviral formulations are available to prepare medicated foods, which are detailed in the following Table 1: Table 1: Powder formulations for oral administration of Ribavirin
  • Formulated Fl (400 pg / Kg) 0.084 g of a 1% formulation of the Antiviral was weighed and mixed with 10.21g of food. It was vigorously stirred in an inflated polyethylene bag and then 0.210 mL of vegetable oil was added. It was stirred again until complete homogenization.
  • Formulated F2 (800 pg / Kg) The same procedure as Formulated Fl was used but 0.166 g of 1% formulated was added.
  • Formulated F3 (1,600 pg / kg) The same method of Formulation Fl was used but 0.336 g of 1% formulated were added.
  • Formulated F4 0.336 g of the excipients used in the powder formulations of the Antiviral were weighed and mixed with 10.21g of food. It was vigorously stirred in an inflated polyethylene bag and then 0.210 mL of vegetable oil was added. It was stirred again until complete homogenization.
  • Table 2 The experimental design is summarized in the following Table 2:
  • the mortality of the "non-infected fish" occurred between day 22 and day 28 post infection and corresponded to fish present in the C2, C3 and T2 ponds.
  • Mortality levels expressed with the different treatments show a dose response effect where the infected pond without treatment has the highest mortality (C3).
  • the pond treated with the lowest dose of the Antiviral (T2) has lower mortality than the untreated (C3), however it is still high and in turn is higher than the treatment with the highest dose (TI).
  • the pond treated with the highest dose on the other hand, has the lowest mortality (T2) and this is equated with the mortality of the controls.
  • the Cl control the safety of the excipient is checked.
  • the C2 control the safety of the product is checked by using a dose two and four times higher than those used in fish infected with ISAV.
  • heart tissue was used as a sample and stored in absolute ethanol or later RNA, in cases that were not immediately pre-processed.
  • the presumptive diagnosis was made by evaluation of the clinical signology.
  • segment 8 of the virus genome was used. The protocols are based on that described by Mu ⁇ ir and Kibenge, Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. J. Virol. Meth. 117, 37-47, 2004.
  • TCID50 of the English 50% Tissue Culture infective dose, that is, the amount of pathogen (in this case ISA virus) that is capable of producing pathological changes or cytopathic effect, in 50% of the inoculated cells.
  • Figures 6 to 10 show the viral loads of the fish subjected to the treatments in ponds C3, TI and T2. As shown in Figure 6, the average viral load in the fish of the TI and T2 ponds that were treated with the Antiviral was less than that of the non-infected fish and its magnitude was inversely proportional to the dose used.
  • necropsy of the fish from the controlled environment trial consisted of the external and internal clinical analysis, with the morphometric parameters register, description and registration of the pathological characteristics (necropsy itself), sampling of internal organs (heart, kidney, spleen and gills) in ethanol and later RNA, with counter-samples (i.e. duplication of the sample of the same organs), in addition to the sample of a muscle medallion with skin to be used in further analyzes of deficiency (presence of the Antiviral in the muscle)
  • 'live fish' are referred to when the fish is taken alive but must be euthanized for dispatch to the laboratory, and 'dead fish' are referred when corresponding to mortality from ISA virus.
  • the fish were subjected to the autopsy process, mostly within 24 hours after sampling.
  • control fishes of the Cl and C2 ponds presented pathological characteristics within normal ranges, as well as gills of normal coloration.
  • Internal organs such as liver, spleen and kidney were normal and without inflammation.
  • the color of the visceral fat was whitish, showing normality.
  • Figure 13 shows a fish infected with ISAV that received no treatment (pond C3). On day 1 1 intraperitoneal post-infection, this first death occurred in this control. This fish showed characteristic clinical signs of ISA, which corresponds to dark burgundy liver with different shades of dark red, which corresponds to hepatic hemorrhage and visceral fat hemorrhage usually in the form of petechiae (point hemorrhage), within the most characteristic .
  • Figure 13B is the approach of Figure 13A.
  • Figures 14 and 15 show infected fish undergoing treatment with the Antiviral from the TI and 12 ponds. In general they have a mild inflammatory signology.
  • Figure 15 A shows a fish from the T2 pond that developed ISA and underwent treatment with the Antiviral. His stomach is observed with abundant food, the liver is red but its appearance is closer to normal. It is likely that this fish has been in recovery.
  • Hematocrit was determined from the fish of each treatment that remained alive. It was found that hematocrit always falls in dying fish, regardless of the cause.
  • the normal range for hematocrit values in salmon is quite wide but it can be indicated at least 44% and at most 64% (according to information obtained from the Universidad Austral de Chile).
  • the hematocrit values of the fish in the TI and T2 pond which were infected with ISAV and received doses of 800 and 400 pg / mL, respectively, showed values close to 45%, similar to each other and in turn within the normal range described These values are, on average, higher than those observed in infected fish that were not treated (C3), which suggests that treatment with the Antiviral would be producing a slight increase in the value of the hematocrit, a sign of improvement in the fish.
  • Necropsies indicated that the signs of the disease appear to be less severe in treated fish and that hematocrit results are slightly lower in untreated fish.
  • Salmo salar fish were used, which were molded from the Eco Lago Verde fish farm of Invertec, with an average weight of 70 g.
  • the fish were received in a 4000 L mother pond with saltwater at 25 ppt in recirculation with a flow of 120 L / min, at the experimental station of the Catholic University of the Holy Conception, in Concep Terms, Chile.
  • the fish were distributed in 8 200-liter ponds with 30 fish each, where they remained for the period of acclimatization, inoculation, treatment and post-treatment follow-up.
  • the acclimatization period was only 2 days, because the fish showed a very normal behavior and continued eating after being transferred from the mother pond. Since they had remained in the recirculation system of the clergy University of the Holy Conception for several weeks, the fish were already acclimatized for this trial.
  • the diet used corresponds to the following proximal formula: 50% protein, 21% lipids, 11% carbohydrates, 8% moisture, 0.7% fiber, 10% ash and 22 MJ per kg of raw energy.
  • the fish in each pond were infected, assuming cohabitation infection of the remaining 60%; In this way the infection resembles what happens in the field. Additionally, the control groups were inoculated with culture medium without virus, so that all the fish were subjected to the same management.
  • the fish were anesthetized with Benzocaine in a separate pan with a dose of 40 to 60 ppm, subsequently the fish were recovered in fresh water without benzocaine and then transferred to their original pond, where they remained during the trial.
  • the administration of the veterinary composition comprising 5% of the antiviral ribavirin was performed orally for 10 days.
  • physicochemical parameters were measured, such as: ammonium, nitrite, nitrate, OD, T °, Salinity, on a daily basis.
  • mortality it is extracted and analyzed to confirm that the cause of mortality is due to infection with the ISA virus and the action of some other pathogen is ruled out.
  • the fish will remain for a period of 12 days in the ponds to follow the course of the post treatment infection.
  • the fish were distributed as follows:
  • Pond 1 30 infected fish without treatment with more excipient food
  • Pond 2 30 infected fish treated with medicated food series 1.
  • Pond 3 30 infected fish without treatment with more excipient food.
  • Pond 4 30 infected fish treated with medicated food series 2.
  • Pond 5 30 infected fish without treatment with more excipient food.
  • Pond 6 30 infected fish treated with medicated food series 3.
  • Pond 7 30 uninfected and untreated fish.
  • Pond 8 30 uninfected and untreated fish.
  • Treated should be equal to or greater than 40% of the fish.
  • the fresh gill smear showed mainly: absence of parasites and fungi in all the samples analyzed; Moderate hyperplasia (inflammation of the gill tissue) (grade II to III, mostly) and abundant presence of organic matter, which may be due to the fact that the fish had recently eaten food and the environmental conditions in the culture ponds.
  • the fresh smear of the skin and intestine showed an absence of parasites in all the samples analyzed.
  • the IFAT / BKD analysis showed the absence of Renibacterium salmoninarum in all the samples analyzed.
  • TSA spleen and gills
  • the RT-PCR analysis for ISAV evidenced the absence of the ISA virus in all the samples analyzed.
  • the ponds No. 1, No. 3 and No. 5 correspond to the tests carried out with fish inoculated with ISA virus, with administration of food with excipient, that is, they correspond to the ponds with untreated fish. In them, mortality started from day 11, day 4 and day 25 post inoculation, respectively.
  • Ponds N ° 2, N ° 4 and N ° 6, correspond to trials with fish treated with the oral veterinary composition comprising ribavirin of production series 1, 2 and 3, respectively. In these ponds there was no development of the disease in the treatment period as observed in the ponds without treatment.
  • Table 3a Distribution of mortality in the trial time.
  • the appearance of the first mortalities was followed by being sent to the laboratory for necropsy.
  • the dead fish analyzed showed in general systemic commitment to various levels of bleeding at the level of internal organs, within them mainly at the level of visceral fat, digestive system and in particular at the liver level; the most characteristic was "red wine" liver in some fish, with different shades of dark red, even or mottled, which corresponds to liver hemorrhage; it was also possible to observe fat hemorrhage visceral usually in the form of petechiae (point hemorrhage) in addition to nonspecific signs, such as absence of food in the digestive tract, bleeding and / or congestion of the digestive tract and internal organs with inflammation of varying intensity.
  • petechiae point hemorrhage
  • the fish had already carried out the process of adaptation to the pond system, in a mother pond, therefore, they were already carrying an important period of acclimatization at the test site.
  • Table 4a Degree of appetite and activity of post-inoculation fish (days 1 to 12)
  • Table 5 Degree of appetite and activity of the fish during the treatment period.
  • infected untreated fish (ponds 1, 3 and 5) persistently showed fish with regular and bad appetite as well as lethargy.
  • Hematocrit Values obtained from the blood of randomly sampled fish during the course of the trial ranged between 24 and 35.5%. However, when obtaining the hematocrit averages of each treatment no effect of the treatment is appreciated, since all the values oscillate in around 30%.
  • the oral veterinary composition comprising the antiviral has been specially formulated for the control of infectious salmon anemia, ISA, and that it is very effective when administered at the beginning of the disease, in individuals with a positive diagnosis of ISAV, without clinical symptoms or in individuals in the early stages of the symptomatology.
  • the recommended oral dose is 1.6 mg / kg body weight, for 10 days.
  • the veterinary composition in the form of oral powder comprising the antiviral should be impregnated through an oily base to the food. Its administration should follow the pattern of feeding rate and should be added to the pellet of food of adequate size to the size of the individuals to be treated.
  • Table 9 shows the calibrated doses of food pellets for oral administration of the composition of the invention: Table 9: Dosage of the antiviral for oral administration in fish
  • Table 10 details the different formulations developed that contain as an active ingredient the antiviral for a powdered pharmaceutical form, designed for use in an oily suspension or as a solid component in the formula of a medicated food pellet. For each composition the manufacturing procedure used is indicated. Table 10: Veterinary compositions comprising the antiviral and its manufacturing process.
  • formula 11 was used to obtain a suspension of the product in fish oil equivalent to 2% of the weight of pellet to be impregnated .
  • the method implemented showed to be selective for the analyte and degradation products evidenced in the samples subjected to degradation protocol under different conditions.
  • Table 11 shows the results obtained from the raw material and product samples when autoclaved 121 ° C at 15 psi pressure (1 atmosphere) and 25% relative humidity.
  • Table 11 Results of degradation of raw material (antiviral, ribavirin) and starch formulated product, when subjected to 121 ° C at 15 psi pressure (1 atmosphere) and 25% relative humidity
  • Table 12 shows the evaluation results obtained from the different compositions analyzed with the analytical method implemented. These compositions correspond to those detailed in Table 10.
  • Table 12 Average rating and relative standard deviation (RSD) of the various compositions developed in the present invention.

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Abstract

La presente invención se refiere a una nueva composición veterinaria oral para salmónidos que comprende 1-beta-D-ribofuranosil-1H-l,2,4-triazol-3-carboxamida y al uso de esta composición para el tratamiento de Ia anemia infecciosa del salmón ocasionada por el virus de Ia anemia infecciosa del salmón o virus ISA, en salmónidos.

Description

COMPOSICIÓN VETERINARIA ORAL PARA SALMÓNIDOS QUE COMPRENDE l-BETA-P-RIBOFURANOSIL-lH-l,2,4-TRIAZOL-3- CARBOXAMIDA Y EL USO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (ISA) EN SALMÓNIDOS
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a una nueva composición veterinaria oral para salmónidos que comprende ribavirina y al uso de esta composición veterinaria para el tratamiento de la anemia infecciosa del salmón ocasionada por el virus de la anemia infecciosa del salmón o virus ISA, en salmónidos.
ESTADO DE LA TECNICA
La Anemia Infecciosa del Salmón (ISA) es una enfermedad viral exclusiva del salmón Atlántico (Salmo salar L.) en cultivo, descubierta en 1984 en Noruega (Thorud y Djupvik, Infectious anaemia in Atlantic salmón (Salmo salar L), Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 8: 109-111, 1988) y se caracteriza por provocar una alta mortalidad en los peces. Los signos más comunes son anemia severa; exoftalmia; ascitis; hemorragia petequial en visceras, tejido adiposo y piel; y necrosis hemorrágica en el hígado de los peces infectados (Falk y Dannevig, Demonstraron of infectious salmón anaemia (ISA) viral antigens in cell cultures and tissue sections. Vet. Res. 26: 499-504, 1995; Falk y cois, Characterization of infectious salmón anemia virus, an orthomyxo-like virus isolated from Atlantic salmón (Salmo salar L), J. Virol. 71 : 9016-9023, 1997; Muñir y Kibenge, Detection of infectious salmón anaemia virus by real-time RT- PCR. J. Virol. Methods 117: 37-47, 2004). En el ámbito económico, esta enfermedad ha provocado grandes pérdidas en los países productores de salmones donde ha sido declarada, tales como Noruega, Canadá, Escocia, Islas Faroe y Estados Unidos (Kibenge y cois, Isolation and Identification
i of infectious salmón anaemia virus (ISAV) from Coho salmón in Chile, Dis Aquat Organ 45, 9-18, 2001; Lovely y cois, First Identification of infectious salmón anaemia virus in North America with haemorrhagic kidney syndrome, Dis Aquat Organ 35, 145-148, 1999; Falk y cois, Identification and characterization of viral structural proteins of infectious salmón anemia virus, J Virol 78, 3063-3071, 2004). Incluso, en el caso de Noruega, las altas mortalidades produjeron pérdidas que abarcaron casi la totalidad de la producción, reportándose hasta un 80% de mermas en la producción total de ese país. Chile, un país que hasta hace poco estaba libre de esta enfermedad, también ha sido atacado por el virus, debido por una parte, a la globalización de los mercados y por otra, a las intensas condiciones en que se desarrollan los cultivos, lo que permite una fácil diseminación, representando un problema muchas veces difícil de controlar. Finalmente el agente patógeno fue detectado por primera vez en Chile en el año 2001 (Kibenge y cois, Isolation and Identification of infectious salmón anaemia virus (ISAV) from Coho salmón in Chile, Dis Aquat Organ 45, 9-18, 2001).
El agente etiológico de esta enfermedad es el Virus de la Anemia Infecciosa del Salmón (ISAV) . Pertenece a la familia Orthomyxoviridae, posee 8 segmentos de RNA genómico de simple hebra de polaridad negativa, que codifican para 8 proteínas estructurales y 2 proteínas no estructurales. La organización genómica de ISAV lo ha situado en un nuevo género, los Isavirus o Aquaorthomyxovirus (Krossoy y cois, The putative polymerase sequence of infectious salmón anemia virus suggests a new genus within the Orthomyxoviridae, J Virol 73, 2136-2142, 1999). Los 8 segmentos de RNA genómico se encuentran unidos a múltiples copias de la nucleoproteína viral (NP), en cuyos extremos 3' se sitúa una copia del complejo RNA polimerasa formado por las proteínas PB1, PB2 y PA; que en conjunto se denominan ribonucleoproteínas. La cápside proteica, constituida por las proteínas de la matriz M I y M2, está rodeada por una envoltura membranosa donde se encuentran insertadas las glicoproteínas Hemaglutinina-esterasa (HE) y de Fusión (F) (Aspehaug y cois, Characterization of the infectious salmón anemia virus fusión proteína, J Virol 79, 12544-12553, 2005).
El ciclo replicativo de ISAV es muy similar al del Virus Influenza A, donde la proteína HE reconoce un receptor celular que contenga ácido 4- O-acetil-siálico (Hellebo y cois, Infectious salmón anemia virus specifically binds to and hydrolyzes 4-O-acetylated sialic acids, J Virol 78, 3055-3062, 2004). Posteriormente la partícula es ingresada a la célula en vesículas cubiertas con clatrina, las que se fusionan a endosomas, otorgando el ambiente ácido necesario para la fusión entre las membranas, viral y endosomal, permitiendo el denudamiento del virus. Las ribonucleoproteínas virales van hacia el núcleo celular, lugar donde comienza la transcripción viral . Los mRNA virales producidos en el núcleo son traducidos en el citoplasma celular, volviendo al núcleo sólo las proteínas NP, PB1, PB2 y PA; lo que permite el inicio de la replicación viral y posteriormente, formación de las ribonucleoproteínas. El ensamblaje de las partículas virales maduras se realiza en la membrana celular hacia donde migran las glicoproteínas, HE y F, además de las proteínas M, que serán los receptores de NP, liberando finalmente los viriones por un proceso de yemación.
El estudio de las enfermedades provocadas por microorganismos permite diseñar distintas estrategias de control, ya sea con un diagnóstico temprano, combatiendo la diseminación de la enfermedad o principalmente, atacando su origen, es decir, a los mismos microorganismos. En el caso de los virus, es indispensable el estudio tanto del ciclo replicativo en general como de la función y estructura de cada una de las proteínas virales. A través de estos estudios se ha observado que los orthomyxovirus presentan una alta tasa de recombinación y mutaciones que dan origen a nuevas cepas de un año a otro. Este es el principal motivo por el cual la prevención a través de vacunas no asegura protección contra la infección de estos agentes, dando lugar a desarrollar terapias alternativas que eviten la propagación de la infección dentro y entre distintos organismos. El diseño y ensayo de compuestos que interfieren con el ciclo replicativo de los virus es un área de estudio relevante para el control de los orthomyxovirus como ISAV.
A la fecha, se han aprobado aproximadamente 40 compuestos antivirales para su uso en humanos, principalmente para el tratamiento de infecciones producidas por el virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de la hepatitis B (HBV) y virus herpes. En cambio, el número de antivirales aprobados que pueden ser usados para el tratamiento de infecciones producidas por virus RNA es my limitado. Entre estos se encuentran, sin considerar el tratamiento para el HIV, los inhibidores del canal M2, amantadina y rimantadina, y los inhibidores de neuraminidasa, oseltamivir y zanamivir, para la influenza; y rivabirina para el tratamiento del virus sincitial respiratorio (RSV), el virus de la hepatitis C (HCV) y también se está utilizando para el tratamiento de la fiebre de Lassa (Revisado en: Leyseen y cois, Molecular strategies to inhibit the replicador) of RNA viruses, Antivir. Res. 78: 9-15, 2008).
La ribavirina es un nucleósido sintético de nombre químico 1-beta- D-ribofuranosil-l/-/- l,2,4-triazol-3-carboxamida con la siguiente fórmula estructural (Fórmula I) :
Figure imgf000005_0001
La rivabirina es un inhibidor de la replicación de virus RNA de amplio espectro, que se ha aprobado para el tratamiento de infecciones del HCV en combinación con interferon y para el tratamiento de infecciones RSV pediátricas en forma de aerosol. También se ha utilizado experimentalmente para otras condiciones, incluyendo fiebre de Lassa (Khan y cois, New opportunities for field research on the patogénesis and treatment of Lassa fever, Antivir. Res. 78: 103-115, 2008), virus CCHF (Ergonul, Treatment of Crimean-Congo hemorrhagic fever. Antivir Res. 78: 125-131, 2008) y hantavirus (Jonsson y cois. Treatment of hantavirus pulmonary syndrome, Antivir. Res. 78: 162-169, 2008). Si bien se ha encontrado que el compuesto inhibe la replicación in vitro de algunos virus estudiados, siendo la mayoría virus RNA, fue mostrado que ejerce un efecto protector sólo en algunos modelos animales. Así también, la potencia de la actividad in vitro de la ribavirina puede variar considerablemente dependiendo de la naturaleza del virus (Graci y Cameron, Mechanism of action of ribavirin against distinct viruses, Rev. Med. Virol. 16, 37-48, 2006).
Se ha reportado que la mayoría de los virus RNA son sensibles a la actividad in vitro de la ribavirina, pero sólo algunos son más susceptibles que otros. En general, la ribavirina no es muy potente como un medicamento antiviral observándose regularmente valores de EC50 (concentración efectiva 50%) de 1 μΜ o incluso mayores. Específicamente, se ha demostrado actividad antiviral in vitro contra bunyaviruses incluyendo el virus de la CCHF (Fiebre hemorrágica de Crimea-Congo), virus de la fiebre de Rift Valley y hantavirus. También inhibe la replicación de coronavirus, incluyendo los coronavirus-SARS y flaviviruses, pero no ha mostrado eficacia en animales infectados experimentalmente con estos virus (Watts y cois, Inhibition of Crimean- Congo hemorrhagic fever viral infectivity yields in vitro by ribavirin. Am. J. Trop. Med. Hyg. 41 : 581 -585, 1989; Huggins, Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with ribavirin, a broad-spectrum antiviral drug. Rev. Infect. Dis. 11 (Suppl. 4) S750-S761, 1989; Severson y cois, Ribavirin causes error catastrophe during Hantaan virus replication. J. Virol. 77: 481 -488, 2003; Saijo y cois, Inhibitory effect of mizoribine and ribavirin on the replication of severe acute respiratory syndrome (SARS)- associated coronavirus. Antivir. Res. 66: 159-163, 2005; Barnard y cois, Enhacement of the infectivity of SARS-CoV in BALB/c mice by IMP dehydrogenase inhibitors, including ribavirin. Antivir. Res. 71 : 53-63, 2006; Neyts y cois, Use the yellow fever virus vaccine strain 17D for the study of strategies for the treatment of Bellow fever virus infections. Antivir. Res. 30 (2-3): 125-132, 1996). De igual manera, la ribavirina no es efectiva en modelos animales infectados con filovirus (Huggins, Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with ribavirin, a broad- spectrum antiviral drug. Rev. Infect. Dis. 11 (Suppl. 4) S750-S761, 1989). También se ha observado que la ribavirina es efectiva in vitro e in vivo contra el RSV, un paramixovirus, y muestra relativa sensibilidad en cultivos celulares sobre otro paramixovirus, el virus Nipah, pero se ha demostrado que posee sólo una eficacia limitada en modelos animales (Snell, Ribavirin therapy for Nipah virus infection. J. Virol. 78: 10211, 2004; Georges-Courbot y cois, Poly-(I)-poly(C12U) but not ribavirin prevenís death in a hámster modelo f Nipah virus infection. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 1768-1772, 2006).
También se ha evaluado el efecto de ribavirina sobre el VHSV (virus de la septicemia hemorrágica viral) en cultivos de células EPC {Ephitelioma papulosum cyprini) . Las células se infectaron con el virus y se trataron con ribavirina en concentraciones de 1 a 25 pg/ml. Los resultados mostraron una fuerte inhibición del virus a las concentraciones de 5, 10 y 25 pg/ml . También se muestra una alta inhibición en la acumulación de RNA viral cuando se adicionan 25 pg/ml a las 0 horas post infección, ocurriendo una inhibición de RNA del 99,8% a las 10 horas post infección. En este reporte se concluye que el método de medición empleado (RT-PCR en tiempo real) puede ser utilizado en combinación con los métodos clásicos para estudiar la progresión de la infección y la cinética de replicación del virus, pero que sin embargo no siempre existe una correlación de los resultados in vitro con la protección otorgada al pez, por lo que es necesario realizar pruebas in vivo (Marroquí y cois., Assessment of the inhibitory effect of ribavirin on the rainbow trout rhabdovirus VHSV by real-time reverse-transcription PCR, Vet. Microbio!. 122: 52-60, 2007). En este caso se ensayó un virus que infecta a las truchas arcoiris y se probó su efecto in vitro. No existen reportes in vivo y nada hace sugerir que en peces puedan observarse los mismos efectos que en las células en cultivo.
Por otra parte se ha evaluado el efecto antiviral de la ribavirina en cultivos celulares infectados con IPNV (virus de la necrosis pancreática infecciosa) (Jashés y cois. Inhibitors of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) repl ¡catión, Antiviral Res. 29: 309-312, 1996; Hudson y cois, The efficacy of amantadme and other antiviral compounds against two salmonid viruses in vitro, Antiviral Res. 9: 379-385, 1988). Se observó que este antiviral es capaz de inhibir la replicación in vitro del virus IPN con una EC50 de 0,5 pg/mL y con una CC50 de 100 pg/mL, aun así no fue el antiviral más efectivo y no se continuó evaluando su actividad in vivo (Jashés y cois. Inhibitors of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) replication, Antiviral Res. 29: 309-312, 1996).
En un estudio in vivo reportado en el año 1980, se analizó el efecto de ribavirina en truchas arcoiris infectadas con IPNV. El compuesto se administró en solución en los tanques donde estaban sumergidos los peces mediante una exposición con el antiviral de una sola vez durante dos horas. La administración se realizó en concentraciones crecientes a los peces separados en dos lotes de 6 tanques cada uno. Los resultados mostraron que existe una disminución de la tasa de peces muertos en alrededor de 5%, pero no fue lineal respecto a la concentración del antiviral utilizada . Asimismo la dosis más alta de ribavirina administrada, 400 pg, no produjo el mayor decrecimiento en la tasa de muertes. Se concluye que dosis mayores de ribavirina tampoco producirían un mayor decrecimiento en la cantidad de peces muertos. Las alternativas de tratamiento serían una exposición sostenida al antiviral para lograr disminuir significativamente la tasa de muerte de peces infectados, sin embargo se plantea que los costos involucrados podrían ser económicamente prohibitivos y que la mayoría de los propietarios de criaderos de peces se mostrarían reacios a iniciar cualquier tratamiento antiviral antes de la existencia de una enfermedad viral evidente (Savan y Dobos. Effect of virazole on rainbow trout Salmo gairdneri Richardson fry infected with infectious pancreatic necrosis virus, J. Fish Dis., 3: 437-440, 1980). No se reportaron ensayos posteriores, por lo que la utilidad de la ribavirina en el tratamiento de truchas infectadas con el IPNV no fue demostrada .
Se han propuesto varios mecanismos moleculares responsables de la actividad antiviral de la ribavirina (Hong y Cameron, Pleiotropic mechanisms of ribavirin antiviral activities, Prog. Drug Res. 59: 41 -69, 2002; Revisado en: Leyseen y cois, Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses, Antivir. Res. 78: 9-15, 2008) . Estos mecanismos incluyen : ( 1 ) depleción de los niveles intracelulares de GTP por inhibición de la IM P deshidrogenasa intracelular, ocasionado por el metabolito 5'-monofosfato de la ribavirina ; (2) inhibición de la actividad polimerasa viral, ocasionado por el metabolito 5'-trifosfato de la ribavirina ; (3) inhibición de la cápside viral por inhibición de la actividad de la guaniltransferasa ocasionada por ribavirina 5'-trifosfato; (4) inhibición de la helicasa viral provocando el proceso denominado error catastrófico por el resultado de la acumulación de mutaciones, algunas letales, en el genoma viral .
A la fecha, aun es materia de debate la magnitud de la contribución del error catastrófico, de la depleción de los niveles intracelulares de GTP y de los otros mecanismos propuestos en la actividad antiviral de la ribavirina y de cómo contribuirían en la actividad in vivo de este antiviral . Como ya se ha mencionado, la ribavirina se utiliza para el tratamiento crónico de la hepatitis C en humanos, en asociación con alfa interferon. En la información del producto que contiene ribavirina como principio activo, Rebetol®, advierten en la FDA (Food and Drug Administration) de una importante alerta de toxicidad primaria de este compuesto, por la anemia hemolítica que desencadena en pacientes tratados con el producto y que puede conducir a un empeoramiento de una enfermedad cardíaca generando infartos al miocardio fatales y no fatales.
De los antecedentes expuestos no existe a la fecha una composición veterinaria efectiva que comprenda ribavirina para ser utilizada en salmónidos para el tratamiento de peces infectados con el virus ISA.
Así es que se advierte la necesidad de un composición veterinaria efectiva que comprenda un antiviral tal como ribavirina, que sea útil para el tratamiento de peces infectados con el virus ISA, un problema del mundo de la acuicultura que a la fecha no tiene una solución efectiva y eficiente que realmente pueda detener y revertir un cuadro de infecciones provocado por este virus, y que al no detenerlo puede ocasionar grandes pérdidas, no sólo al país productor sino que también a todos los consumidores a quienes finalmente llega el producto.
El hecho que se necesite una composición veterinaria efectiva y eficiente va ligado también al costo del tratamiento, de manera de no encarecer el producto final para así dar la posibilidad de administrar un producto no sólo cuando ya se haya propagado la enfermedad sino que también, y como se ha sugerido para otras patologías tratadas con antivirales, administrar el medicamento en las fases tempranas de la infección, lo que permitiría una mayor protección disminuyendo la propagación por la fase de la replicación en la que se encuentra el virus. Así se evitaría que los peces sanos sean infectados por cohabitación, bloqueando la propagación y deteniendo finalmente la enfermedad. De los antecedentes existentes no existe una composición veterinaria que sea capaz de inhibir el virus ISA y menos aun que pueda hacerlo in vivo, o en peces infectados naturalmente.
Como se ha comentado previamente, considerando la alta mutación que experimenta el virus ISA que lleva a que año a año se deban cambiar las vacunas porque pierden su efectividad, se debería abordar el problema mirando las propiedades del agente etiológico que permanecen en el tiempo y que puedan ser vulneradas por otros mecanismos. De esta forma, los inventores tomando en consideración que el virus ISA comparte ciertas características con el virus influenza, pensaron que una manera eficiente de controlar la enfermedad podía ser mediante la formulación de una composición veterinaria oral que comprenda un antiviral que ya ha sido demostrado ser eficiente para inhibir esos tipos de virus. Pero sorprendentemente encontraron que de todos los antivirales probados, sólo la ribavirna mostró ser realmente efectiva in vitro.
La ribavirina es un compuesto antiviral de amplio espectro, pero de los antecedentes existentes nada hace sugerir que pueda ser útil para el tratamiento de esta patología, más aun habiéndose reportado que uno de sus efectos tóxicos más importantes es la anemia hemolítica, un experto en la materia jamás pensaría siquiera destinarlo para el tratamiento de una infección ocasionada por el ISAV, enfermedad que se caracteriza por desarrollar una anemia severa, entre otras complicaciones, que en su conjunto finalmente son fatales para el pez. Contrario a todo lo predicho, los inventores de la presente invención han encontrado sorprendentemente que una composición veterinaria oral que comprende la ribavirina es efectiva en el tratamiento de peces infectados con el virus ISA. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con una composición de uso exclusivamente veterinario que comprende ribavirina, en una forma farmacéutica de polvo oral, para incorporar al pellet del alimento normal de los peces mediante un proceso de impregnación en aceite, con el doble propósito, por una parte facilitar su administración vía oral y por otra mejorar la biodisponibilidad en la especie objetivo.
Esta composición veterinaria que comprende ribavirina es útil para el tratamiento de peces infectados con el virus de anemia infecciosa del salmón o ISAV. La ribavirina se denominará de aquí en adelante como tal o como 'Antiviral'.
En una realización preferida, la concentración de ribavirina en la formulación está comprendida entre 0,5% a 5% en peso respecto al peso total de la composición.
En otra realización preferida, la composición comprende excipientes veterinariamente aceptables para salmónidos para ser administrados por vía oral.
En otras realizaciones preferidas, la composición comprende excipientes tales como: lactosa spray dried, almidón de maíz parcialmente pregelatinizado, lactosa monohidrato, almidón de maíz, dióxido de silicio coloidal, o sus mezclas.
En otra realización preferida, la composición comprende como excipiente almidón de maíz parcialmente pregelatinizado.
En una realización específica, la concentración de ribavirina en la formulación es de 5% en peso respecto al peso total de la composición.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Viabilidad viral en presencia de distintas concentraciones de oseltamivir.
Figura 2 : Viabilidad viral en presencia de distintas concentraciones de ácido shikimico. Figura 3 : Viabilidad viral en presencia de distintas concentraciones del Antiviral .
Figura 4 : Viabilidad celular en presencia de distintas concentraciones del Antiviral .
Figura 5 : Mortalidad acumulada de peces tratados con el Antiviral en distintas dosis por vía oral. Esta Figura muestra la mortalidad acumulada observada en los 5 estanques del ensayo. Los peces de los estanques Cl, C2 y C3 son controles que no recibieron Antiviral . Los peces de los estanques TI y T2 recibieron dosis de 800 pg/mL y 400 pg/mL del compuesto.
Figura 6 : Carga viral promedio total por tratamiento en los peces de los estanques C3, TI y T2.
Figura 7 : Carga viral promedio en muestras de peces vivos. Estos peces murieron por eutanasia al final del ensayo. Se muestran las cargas virales de los estanques C3, TI y T2.
Figura 8 : Carga viral promedio en muestras de peces muertos de los estanques C3, TI y T2. Estos peces murieron durante el ensayo por el virus ISA.
Figura 9 : Carga viral promedio en muestras de peces infectados de los estanques C3, TI y T2. Estos peces fueron infectados por inyección intraperitoneal .
Figura 10 : Carga viral en muestras de peces no infectados de los estanques C3, TI y T2. Estos peces fueron infectados por co-habitación con los peces pre-infectados intraperitonealmente.
Figuras 11A y 11 B: Fotografías de necropsia de peces del estanque Cl .
Figuras 12A y 12B: Fotografía de necropsia de peces del estanque C2.
Figura 13 A: Fotografía de necropsia de un pez del estanque C3.
Figura 13 B: Acercamiento de la Fotografía de necropsia de la Figura 13 A.
Figura 14 A: Fotografía de necropsia de un pez del estanque TI infectado intraperitonealmente con el virus ISA. Este pez fue tratado con 800 pg/mL del Antiviral . Figura 14 B: Fotografía de necropsia de dos peces del estanque TI infectados por co-habitación con el virus ISA. Este pez fue tratado con 800 pg/mL del Antiviral .
Figura 15 A: Fotografía de necropsia de un pez del estanque T2 infectado intraperitonealmente con el virus ISA. Este pez fue tratado con 400 pg/mL del Antiviral .
Figura 15 B : Fotografía de necropsia de un pez del estanque T2 infectado por co-habitación con el virus ISA. Este pez fue tratado con 400 pg/mL del Antiviral .
Figura 16 : Hematocrito promedio. Se muestra el hematocrito encontrado en los peces de los estanques Cl, C2, C3, TI y T2.
Figura 17 : Mortalidad en los peces con y sin tratamiento. Se muestra la mortalidad acumulada en los peces de los diferentes estanques (N° l a N°8) de tratamiento y control .
Figura 18 : Valores de Hematocrito y Hemoglobina. Se muestran los valores promedios encontrados en los peces tratados y en controles sanos e infectados.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
ENSAYOS DE INHIBICION DE LA REPLICACION VIRAL
Cultivo celular SHK- 1
Las células SHK-1, derivadas del riñon de salmón atlántico, fueron crecidas a 15°C en medio de crecimiento (Medio Leibovitz L- 15, L- glutamina 4 mM, 2-mercaptoetanol 40 μΜ, gentamicina-sulfato 50 g/mL, 8% SFB).
Propagación del virus ISA
Monocapas de células SHK-1, crecidas durante 3 días hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente 60%, fueron inoculadas con una dilución 1/10 de un virus aislado en cultivo de células SHK-1 a partir del corazón de un pez infectado naturalmente en el sur de Chile, en medio de infección (Medio Leibovitz L- 15 sin SFB, L-glutamina 4 mM, 2- mercaptoetanol 40 μΜ, gentamicina 50 g/mL) . Luego de una incubación de 4 horas a 15°C el inoculo fue reemplazado por medio de crecimiento. Las monocapas infectadas fueron incubadas posteriormente a 15°C durante 3 días. La presencia del virus ISA en los inóculos fue chequeada por RT-PCR tiempo real. Ensayo de inhibición del ciclo replicativo de ISAV
Se crecieron monocapas de células SHK- 1 en placas de 6 pocilios, de 9,6 cm2 de superficie, las células se propagaron por no más de 3 días y fueron infectadas con ISAV. Una vez pasadas las 4 horas de incubación con el virus, se cambió el medio por medio de crecimiento al que se agregaron las distintas diluciones de los distintos compuestos a ensayar (Antiviral, oseltamivir o ácido shikimico) . Luego de 3 días post infección el sobrenadante celular fue recolectado y sometido a extracción del RNA viral. La replicación viral fue analizada cualitativamente mediante cuantificación por RT-PCR tiempo real.
Se evaluó la viabilidad viral en células infectadas con el virus ISA sometidas a distintas concentraciones de antivirales que han mostrado ser efectivos en el tratamiento de la influenza. Se observó que tanto el oseltamivir, un conocido antiviral utilizado para el tratamiento de la influenza, como su precursor, el ácido shikimico, fueron poco efectivos en inhibir la replicación viral . Para el caso del oseltamivir se obtuvo no más de un 60% de inhibición de la replicación del virus ISA en concentraciones tan altas como 300 pg/mL (Figura 1). En cambio para los virus de la influenza A y B se han descrito EC50 que van desde 0,03 ng/mL hasta 2,84 ng/mL (Mai Le y cois, Isolation of drug-resistant H5N1 virus, Nature 437: 1108, 2005; Calligari y cois, Inhibition of viral Group- 1 and Group-2 neuraminidases by oseltamivir: A comparative structural analysis by the ScrewFit algorithm, Biophys. Chem. 141 : 117-123, 2009).
Los resultados obtenidos con el ácido shikimico fueron menos promisorios, puesto que no se observó inhibición de la replicación viral hasta concentraciones tan elevadas como 300 pg/mL (Figura 2), observándose además que no existe una correlación entre la cantidad de virus y las dosis del compuesto probadas.
Estos resultados demuestran que aun cuando los antivirales pueden ser efectivos para determinados virus, no implica que también puedan serlo para otros virus relacionados, ni siquiera en condiciones apropiadas in vi tro.
Por otra parte, al someter a las células infectadas con el virus ISA a distintas concentraciones del Antiviral (ribavirina) se observó una inhibición de la replicación del virus que aumentó a medida que se aumentaba la concentración del compuesto (Figura 3). La concentración que inhibe en un 50% la replicación del virus ISA (EC5o) fue de aproximadamente 0,4 pg/mL. Es decir que a concentraciones bastante bajas del Antiviral ya se obtiene una inhibición efectiva de la replicación del virus.
Como ya fue discutido, un resultado positivo en la inhibición in vitro para ISAV no hace suponer que el compuesto sea efectivo para el tratamiento de la enfermedad producida por el mismo virus en peces.
DETERMINACION DE LA TOXICIDAD
La citotoxicidad de los compuestos se evaluó mediante ensayos de viabilidad celular. Todos los ensayos fueron realizados por duplicado en cultivos de células SHK-1.
Para evaluar el efecto citotóxico de los compuestos antivirales sobre la viabilidad celular, se crecieron monocapas de células SHK-1 en pocilios de cultivo individuales de 9,6 cm2 de superficie hasta una confluencia aproximada de un 90- 100%. Con el fin de obtener un número constante de células o un cultivo en estado estacionario de crecimiento, se retiró el suero fetal bovino (SFB) del medio de cultivo. A cada pocilio se agregó una solución del compuesto Antiviral a concentraciones distintas. Las células fueron incubadas por 3 días a 15°C, se observó el estado de la monocapa celular al microscopio óptico invertido, posteriormente las células fueron lavadas dos veces con PBS, y luego soltadas con 200 μΙ de una solución de EDTA 0,5 mM y tripsina al 0,02% y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las células se centrifugan por 10 minutos a 3000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron en PBS 2%SFB. A 200 uL de la suspensión de células, se agregó 3uL de ioduro de propidio (50 Mg/mL en tampón fosfato) y se realizó el conteo por citometría de las células viables y no viables de un total de 100.000 células. El resultado se expresó en porcentaje de células vivas (% de viabilidad celular) .
En la Figura 4 se muestra el efecto de concentraciones crecientes del
Antiviral (ribavirina) sobre la viabilidad celular. Se observó que las células se mantienen intactas, cercanas al 100%, hasta al menos una concentración de 1 mg/mL del Antiviral .
En estos experimentos, se encontró que la concentración que produce un 50% de toxicidad celular (CC50) fue mayor a 400 mg/mL, concentraciones muy por encima de los valores de EC5o encontrados (Figura 3).
Con estos resultados aun no es posible asegurar que el Antiviral sea efectivo en el tratamiento de la enfermedad ocasionada por el virus ISA en salmónidos, puesto que si bien es muy promisorio que el compuesto inhiba eficientemente la replicación viral in vitro y que no muestre citotoxicidad hasta concentraciones 107 veces más altas que la efectiva, no es posible extrapolar su utilidad in vivo.
Dado que la ribavirina está aprobada para su uso en humanos por varios organismos regulatorios mundiales como la FDA y la EMEA (del inglés European Medicines Agency), es posible garantizar una cierta seguridad para su uso en peces.
ESTUDIO 1 :
EVALUACION DEL EFECTO ANTIVIRAL DE LA COMPOSICION VETERINARIA ORAL QUE COMPRENDE RIBAVIRINA
Se realizaron pruebas en ambiente controlado en agua de mar (25 ppt) con 156 peces smolt de la especie Salmo salar de aproximadamente 70 g de peso, en la Universidad Católica de la Santísima Concepción de Chile.
Los peces se distribuyeron en sus respectivos estanques y se esperó 7 días para que se aclimataran antes de realizar el procedimiento de infección. Los peces se distribuyeron en 5 sistemas con recirculación de agua de mar independientes, con dos estanques de cultivo, cada uno con un volumen de 140 L. Cada línea poseía un estanque de acopio que distribuía el agua al sistema cerrado y un filtro biológico para controlar los compuestos nitrogenados.
El estanque de acopio tenía una capacidad mínima de 40 litros, de éste se distribuye el agua a cada uno de los estanques pertenecientes a la línea. El estanque debe mantener las condiciones de pH, amonio, y oxigenación normales aceptadas en pisciculturas. El flujo de distribución de agua a las líneas es constante con una tasa de recirculación de 2 a 4 veces/hora y un tasa de renovación de agua fresca del 10 a 30% por día.
La temperatura se mantuvo entre 14 a 16 °C. Los factores abióticos tales como pH y concentración de amonio fueron los normalmente aceptados en Sistemas de Recirculación de pisciculturas y fueron controlados con un sistema de filtración biológica.
La circulación de agua desde el acopio a los estanques era constante, manteniendo una tasa de recirculación de agua de 2 a 4 veces/hora, la que se mantuvo con la misma tasa entre los estanques. Los peces se alimentaron con una cantidad de alimento medicado o de alimento control en una cantidad del 0,5 % de su peso corporal.
Luego de la aclimatación se separaron dos grupos de 30 peces los que se mantuvieron sin infectar. El primer grupo correspondió al control sano (Cl, ver Tabla 2) y el segundo grupo fue el control sano tratado con la mayor dosis de antiviral (para evaluar toxicidad) (C2, ver Tabla 2).
Los 96 peces restantes se distribuyeron en tres grupos de 32 peces cada uno, los que dispusieron en estanques independientes denominados C3, TI y T2. El 40% de los peces de cada uno de estos estanque se inyectó por vía intraperitoneal con una suspensión de virus ISA y se esperó que el 60% restante se infecte por co-habitación. De este modo la infección experimental se asemeja a la realidad de terreno.
El material que estuvo en contacto con los peces como termómetros, mangueras para aspirar, mallas para trasladar los peces, se separaron debidamente y se asignó a cada grupo de trabajo un conjunto de material de uso exclusivo.
Dos de los tres grupos de peces infectados se trataron con el compuesto antiviral durante 10 días seguidos (TI y T2, ver Tabla 2) y el otro grupo fue el control infectado sin tratamiento (C3) . El tratamiento se inició el día 11 post infección y se proporcionó con el alimento. Se probaron 2 dosis de compuesto antiviral mezcladas con el alimento y también el excipiente sin el antiviral mezclado con el alimento.
Debido a que se distribuyeron 30 peces por estanque, que son pequeños, de peso promedio de 70 g, y que se les administraría sólo el 0,5% del peso corporal de alimento medicado, a los peces no se les administró alimento normal, con el fin de asegurar que ingirieran todo el alimento que se les suministra.
Preparación del Alimento medicado :
Se dispone de formulaciones del Antiviral para preparar los alimentos medicados, que se detallan en la siguiente Tabla 1 : Tabla 1 : Formulaciones en polvo para administración oral de Ribavirina
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* Almidón de maíz parcialmente pregelatinizado.
Se prepararon cuatro tipos de alimentos medicados denominados:
Formulado Fl, Formulado F2, Formulado F3 y Formulado F4.
Formulado Fl : (400 pg/Kg) Se pesaron 0,084 g de una formulación al 1% del Antiviral y se mezcló con 10,21g de alimento. Se agitó vigorosamente en una bolsa inflada de polietileno y luego se agregó 0,210 mL de aceite vegetal . Se agitó nuevamente hasta completa homogeneización.
Formulado F2 : (800 pg/Kg) Se utilizó el mismo procedimiento del Formulado Fl pero se agregaron 0, 168 g de formulado al 1 %.
Formulado F3 : ( 1.600 pg/Kg) Se utilizó el mismo procedimiento del Formulado Fl pero se agregaron 0,336 g de formulado al 1 %. Formulado F4: Se pesaron 0,336 g de los excipientes utilizados en las formulaciones en polvo del Antiviral y se mezclaron con 10,21g de alimento. Se agitó vigorosamente en una bolsa inflada de polietileno y luego se agregó 0,210 mL de aceite vegetal. Se agitó nuevamente hasta completa homogeneización. El diseño experimental se resume en la siguiente Tabla 2 :
Tabla 2: Distribución de los diferentes ensayos con sus codificaciones
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En los peces del estanque control infectado (C3) se observó la primera mortalidad en el día 11 post infección.
La mortalidad de los "peces infectados" ocurrió a lo largo de los días 11 al día 17 post infección intraperitoneal y afectó a peces que estaban en los estanques C3, Tl y T2,
La mortalidad de los "peces no infectados" ocurrió entre el día 22 y el día 28 post infección y correspondió a peces presentes en los estanques C2, C3 y T2.
Esta distribución de la mortalidad resultó interesante ya que se separó claramente en dos etapas, primero murieron los peces que fueron infectados intraperitonealmente y luego los peces que se infectaron por co-habitación. Esto último para el caso de los estanques C3 y T2. Luego del tratamiento oral de 10 días de duración, los peces se mantuvieron en sus respectivos estanques hasta el día 30 post infección intraperitoneal, luego de lo cual todos los peces que sobrevivieron al estudio fueron sacrificados.
La mortalidad acumulada en los 30 días de ensayo se gráfica en la
Figura 5, donde se observa claramente que el control infectado C3 que no recibió tratamiento (control positivo) fue el que presentó mayor mortalidad llegando a un 21,9%.
En el estanque control Cl, que no fue infectado y no recibió tratamiento (control negativo), no se observaron muertes a lo largo de todo el periodo de estudio. En cambio en el control C2 que no fue infectado pero recibió una dosis de 1600 pg/kg, se observó una mortalidad acumulada del 3,33%.
En el estanque donde los peces fueron infectados y recibieron una dosis de 400 pg/kg del antiviral (T2), se observaron menos muertes que en el estanque infectado que no recibió tratamiento (C3), llegando a un 12,5%.
La mortalidad más baja de todo el ensayo observada en peces infectados, fue en el estanque del tratamiento T2 que recibió 800 pg/kg del antiviral, llegando a tan sólo un 3, 1%.
Estos resultados evidencian que hubo un claro desarrollo de la enfermedad y que ésta fue efectivamente controlada con la administración del Antiviral .
Los niveles de mortalidad expresados con los distintos tratamientos muestran un efecto dosis respuesta donde el estanque infectado sin tratamiento tiene la mayor mortalidad (C3) . El estanque tratado con la menor dosis del Antiviral (T2) tiene menor mortalidad que el no tratado (C3), sin embargo ésta aun es alta y a su vez es mayor que el tratamiento con mayor dosis (TI). El estanque tratado con la mayor dosis, en cambio, presenta la menor mortalidad (T2) y ésta se equipara con la mortalidad de los controles. Con el control Cl se comprueba la inocuidad del excipiente. Con el control C2 se comprueba la inocuidad del producto al usar una dosis dos y cuatro veces mayor que las utilizadas en los peces infectados con ISAV.
Con estos resultados se evidencia que sería factible utilizar dosis aun más altas para el tratamiento de peces infectados, aun cuando con las concentraciones ya estudiadas se observa un efecto realmente sorprendente.
Diagnóstico ISA
Para el diagnóstico de la enfermedad se utilizó como muestra tejido de corazón y se guardaron en etanol absoluto o RNA later, en los casos que no se precesaron inmediatamente.
El diagnóstico molecular se realizó con RT-PCR en tiempo real para
ISA.
El Diagnóstico presuntivo se realizó por evaluación de la signología clínica.
Todas las muestras analizadas de los peces provenientes de los estanques Cl y C2, fueron negativos a la presencia del virus ISA. De manera que se confirmó que los controles sanos que no enfermaron clínicamente de ISA, fueron negativos a los análisis de diagnóstico molecular específico para el virus. Se puede aseverar por tanto, que no hubo contaminación cruzada entre estanques infectados y no infectados.
Determinación de la Carga viral
Para la cuantificación del número de copias de ISAV se utilizó el segmento 8 del genoma del virus. Los protocolos se basan en lo descrito por Muñir y Kibenge, Detection of infectious salmón anaemia virus by real- time RT-PCR. J. Virol. Meth. 117, 37-47, 2004.
Estos resultados se expresaron como TCID50 del inglés 50% Tissue Culture infective dosis, es decir, la cantidad de agente patógeno (en este caso virus ISA) que es capaz de producir cambios patológicos o efecto citopático, en el 50% de las células inoculadas.
En las Figuras 6 a 10 se muestran las cargas virales de los peces sometidos a los tratamientos en los estanques C3, TI y T2. Como se muestra en la Figura 6, la carga viral promedio en los peces de los estanques TI y T2 que fueron tratados con el Antiviral, fue menor que la de los peces no infectados y su magnitud fue inversamente proporcional a la dosis utilizada .
La carga viral en los peces vivos fue muy similar en los dos estanques de tratamiento TI y T2 (Figura 7), y sólo levemente menor que la de los peces infectados sin tratamiento (C3) . En cambio, en los peces muertos (Figura 8) la carga viral fue significativamente menor en los peces tratados con la mayor dosis del antiviral (TI ), respecto a los que recibieron la menor dosis (T2) y a los que no recibieron tratamiento (C3) . Estos resultados son consistentes con la mayor tasa de mortalidad observada en los grupos T2 y C3.
De la misma manera, en los peces infectados (Figura 9) la carga viral fue menor en los peces tratados con la mayor dosis del Antiviral (TI ), siendo prácticamente iguales las cargas virales de los peces tratados con dosis más bajas (T2) y los sin tratamiento (C3) .
Con el tratamiento de 800 pg/kg del Antiviral no se observó mortalidad en los peces que co-habitaron, pero se confirmó la infección de estos peces porque se detectaron cargas virales, como se observa en la Figura 10 (TI ) . En el tratamiento con 400 ug/kg se observó un carga viral levemente mayor en los peces no infectados intraperitonealmente (T2 en la Figura 10) y se evidencia que finalmente fueron infectados por cohabitación con aquellos.
Las cargas virales de los peces tratados (TI y T2) fueron en todos los casos menores que la de lo peces sin tratar (C3) y es dosis dependiente. Análisis de Necropsias
La necropsia de los peces del ensayo de ambiente controlado consistió en el análisis clínico externo e interno, con el registro de parámetros morfométricos, descripción y registro de las características anatomopatologico (necropsia propiamente tal), toma de muestras de órganos internos (corazón, riñon, bazo y branquias) en etanol y RNA later, con contramuestras (es decir duplicación de la muestra de los mismos órganos), además de la muestra de un medallón de músculo con piel para ser utilizado en análisis ulteriores de carencia (presencia del Antiviral en el músculo) .
Las muestras de corazón de cada pez fueron procesadas para el análisis de carga viral, las restantes muestras fueron guardadas a -80°C.
Para efectos de nomenclatura, los 'peces vivos' son referidos cuando el pez se toma vivo pero debe ser sometido a eutanasia para su despacho al laboratorio, y los 'peces muertos' son referidos cuando corresponde a mortalidad por virus ISA.
Los peces fueron sometidos al proceso de necropsia, mayoritariamente dentro de las 24 horas post toma de muestra.
Al finalizar el ensayo la totalidad de los peces fueron sometidos a eutanasia y a necropsia.
Como se muestra en las Figuras 11A y 11 B, los peces control de los estanques Cl y C2 presentaron características anatomopatológicas dentro de rangos normales, como también branquias de coloración normal . Los órganos internos como hígado, bazo y riñon se visualizaron normales y sin inflamación. La coloración de la grasa visceral fue blanquecina, evidenciando normalidad.
De la misma manera, los peces de los estanques control C2 mostraron características anatomopatológicas normales (Figuras 12 A y 12B), incluso en la Figura 12 B se observa un pez con el estómago lleno de alimento, lo que denota un pez apetente y con alta probabilidad de buen estado de salud. Todos los peces muestreados de los estanques Cl y C2 fueron negativos a los análisis moleculares de ISAV.
La Figura 13 muestra un pez infectado con ISAV que no recibió tratamiento (estanque C3). El día 1 1 post-infección intraperitoneal se produjo esta primera muerte en este control. Este pez evidenció signos clínicos característicos de ISA, que corresponde a hígado color burdeo oscuro con distintas tonalidades de rojo oscuro, lo cual corresponde a hemorragia hepática y hemorragia en grasa visceral usualmente en forma de petequias (hemorragia en punto), dentro de lo más característico. La Figura 13B es el acercamiento de la Figura 13A.
Las Figuras 14 y 15 muestran peces infectados sometidos a tratamiento con el Antiviral provenientes de los estanques TI y 12. En general presentan una signología inflamatoria leve.
La Figura 15 A muestra un pez del estanque T2 que desarrolló ISA y fue sometido a tratamiento con el Antiviral. Se observa su estómago con abundante alimento, el hígado se aprecia rojo pero su aspecto es más cercano a lo normal . Es probable que este pez haya estado en recuperación.
Se observó que a la necropsia de los peces de muestras "vivas" los hallazgos anatomopatológicos fueron menos severos, contrario a lo encontrado en las necropsias de los peces de muestras "muertas", donde los peces evidenciaron signos clínicos severos de ISA.
Toda la mortalidad analizada evidenció signos clínicos de ISA, los que fueron más evidentes en los peces que desarrollaron por mayor tiempo la enfermedad, es decir en los que fueron infectados intraperiotonealmente respecto a los que se infectaron por co-habitación.
Esto podría haber resultado debido al mayor tiempo de contacto con el virus.
En general el consumo de alimento fue moderado, sin embargo, a partir del día 21 post infección viral, se evidencia ausencia de alimento en el estómago de todos los peces muestreados (controles y tratados). El día anterior fue el último día de tratamiento y por tanto de administración de alimento medicado ya sea con excipiente o con Antiviral. Es decir que todos los peces fueron sometidos a un cambio en la alimentación, lo cual requiere un periodo de adaptación.
Evaluación del hematocrito
Se determinó el hematocrito de los peces de cada tratamiento que permanecieron vivos. Se comprobó que el hematocrito baja siempre en los peces moribundos, independiente de la causa.
Como se comentó, los hallazgos anatomopatológicos fueron más severos en las necropsias de los peces de muestras "muertas" que "vivas". Por tanto es posible que el hematocrito de muestras vivas pueda no ser un indicador definitivo para predecir ISA, pero sí constituye un importante parámetro para evaluar la toxicidad del Antiviral utilizado.
El rango normal para valores de hematocrito en salmones es bastante amplio pero se puede indicar como mínimo 44% y como máximo 64% (según información obtenida de la Universidad Austral de Chile) .
Como se observa en la Figura 16, el hematocrito promedio de los peces de los estanques Cl y C2 fue normal y similar entre ellos, con valores cercanos al 50%. Estos peces fueron los controles sanos, es decir, no infectados con el virus ISA.
La diferencia entre Cl y C2 está dada por el hecho que los peces del estanque C2 recibieron una dosis de 1600 pg/mL del Antiviral; en cambio los peces del Cl no recibieron el Antiviral sino que sólo el alimento con los excipientes. Se visualizó que los peces control (C2) que recibieron el Antiviral, presentaron un hematocrito levemente mayor, del 54%.
Es notable observar que los peces que recibieron una elevada dosis del Antiviral, compuesto caracterizado por producir anemia hemolítica, no mostraron signos de desarrollar anemia, por el contrario, su hematocrito permaneció en niveles normales (C2). El valor del hematocrito de las muestras de sangre de los peces provenientes del estanque C3, que fueron infectados con ISAV y no recibieron el Antiviral, evidenció un valor promedio de 42, 1%. Esto lleva a sugerir que el valor del hematocrito podría estar disminuyendo en los peces vivos producto de la anemia ocasionada por la infección viral.
Los valores de hematocrito de los peces del estanque TI y T2, que fueron infectados con el ISAV y que recibieron dosis de 800 y 400 pg/mL, respectivamente, evidenciaron valores cercanos al 45%, similares entre ellos y a su vez dentro del rango normal descrito. Estos valores son, en promedio, mayores al observado en los peces infectados que no recibieron tratamiento (C3), lo que permite sugerir que el tratamiento con el Antiviral estaría produciendo una leve alza en el valor del hematocrito, signo de mejoría en los peces.
Estos resultados son realmente sorprendentes puesto que como se ha mencionado, está informado oficialmente en organismos regulatorios internacionales, que productos que contienen ribavirina para su administración en humanos pueden producir anemia hemolítica; y por otra parte la enfermedad generada por el virus ISA se caracteriza por presentar anemia severa. Es decir que de ninguna manera podrían haberse predicho los efectos encontrados en la presente invención.
Las necropsias indicaron que los signos de la enfermedad aparentemente son menos severos en los peces tratados y que los resultados de hematocrito están levemente más bajos en los peces sin tratar.
Los resultados permiten concluir que el tratamiento con el compuesto Antiviral disminuye significativamente la mortalidad y aunque no impide la infección viral de los peces cohabitantes sí disminuye sus cargas virales y los signos de la enfermedad, lo que les permite mantenerse vivos, activos y alimentándose aun en presencia del virus.
ESTUDIO 2 : EVALUACION DEL EFECTO ANTIVIRAL DE LA COMPOSICION VETERINARIA
ORAL QUE COMPRENDE RIBAVIRINA
Se utilizaron 240 peces Salmo salar esmoltificados provenientes de la piscicultura Eco Lago Verde de la empresa Invertec, con un peso promedio de 70 g.
Se seleccionaron peces que no presentan antecedentes de enfermedad por ISAV, lo que fue chequeado mediante un muestreo y posterior análisis de diagnóstico molecular por RT-PCR en tiempo real . Adicionalmente, los peces se chequearon para enfermedades bacterianas y virales. Antes del traslado de los peces a la estación experimental se muestrearon 60 peces para realizar el chequeo sanitario, el cual considera análisis de necropsia, Frotis Fresco de branquias, intestino y piel, tinción Gram de órganos internos (Bazo, riñon y cerebro), tinción Naranja de Acridina de branquias, IFAT BKD de riñon, IFAT SRS de riñon, cultivos bacteriológicos, RT-PCR para IPNv.
Los peces se recibieron en un estanque madre de 4000 L con agua salada a 25 ppt en recirculación con flujo de 120 L/min, en la estación experimental de la Universidad Católica de la Santísima Concepción, en Concepción, Chile. Varias semanas después de su ingreso los peces se distribuyeron en 8 estanques de 200 litros con 30 peces cada uno, donde permanecieron por el periodo de aclimatación, inoculación, tratamiento y seguimiento posterior al tratamiento. En este ensayo el periodo de aclimatación fue tan solo de 2 días, debido a que los peces mostraron un comportamiento muy normal y siguieron comiendo luego de ser trasladados desde el estanque madre. Dado que habían permanecido por varias semanas en el sistema de recirculación de la Universidad Católica de la Santísima Concepción los peces ya se encontraban aclimatados para este ensayo.
Durante los días que duró el ensayo los peces se alimentaron al
0,7 a 0,9 % de peso corporal (pc/día) . Los días de tratamiento, el medicado fue incorporado en el 0,5% pe adicionando 0,4 ó 0,2% de alimento normal (sin medicar) .
La dieta utilizada corresponde a la siguiente fórmula proximal : 50% de proteínas, 21% de lípidos, 11% de carbohidratos, 8% de humedad, 0,7% de fibra, 10% de ceniza y 22 MJ por Kg de energía bruta.
En este periodo los peces se observaron diariamente y cualquier comportamiento anormal fue registrado. También se realizó un registro diario de la apetencia de los peces (bueno, regular o malo). La alimentación se realizó en forma manual, controlada y en una ración AM . Para la infección experimental con virus ISA se utilizó un aislado viral chileno, el cual fue secuenciado en la región hipervariable (HPR) dando como resultado un HPR de tipo 7b, como la gran mayoría de los aislados de nuestro país. Esta se realizó por inyección intraperitoneal en la línea ventral a razón de 0,2 mi de inoculo por pez el cual tenía un titulo de 104 TCID50 siguiendo lo descrito por Jorgensen y col, Gene expresión analyses in Atlantic salmón challenged with infectious salmón anemia virus reveal differences between individuáis with early, intermedíate and late mortality, BMC Genomics 9, 179-194, 2008 y por Mjaaland y col, Susceptibility and immune responses following experimental infection of MHC compatible Atlantic salmón (Salmo salar L.) with different infectious salmón anaemia virus isolates, Arch Virol 150, 2195-2216 2005. Se infectó el 40% de los peces de cada estanque, asumiendo infección por cohabitación del 60% restante; de este modo la infección se asemeja a lo que ocurre en terreno. Adicionalmente se inoculó con medio de cultivo sin virus a los grupos controles, con el fin de que todos los peces estuvieran sometidos al mismo manejo. Para realizar el procedimiento descrito, los peces fueron anestesiados con Benzocaína en una batea aparte con una dosis de 40 a 60 ppm, posteriormente los peces fueron recuperados en agua fresca sin benzocaína y luego trasladados a su estanque de origen, donde permanecieron durante el ensayo. La administración de la composición veterinaria que comprende 5% del antiviral ribavirina, se realizó por vía oral durante 10 días. Suponiendo que la replicacion viral será entre los 2 y 8 días post infección como se describe en Totland y col ., 1996., evitando así la diseminación en el pez y entre peces. Se prepararon 3 series de alimento medicado que contienen 1600 ug/Kg de pez vivo del compuesto antiviral.
Durante el tiempo que duró el ensayo se midieron parámetros fisicoquímicos, tales como : amonio, nitrito, nitrato, OD, T°, Salinidad, en forma diaria. En cuanto a la mortalidad ésta se extrae y se analiza para corroborar que la causa de la mortalidad es por la infección con el virus ISA y se descarta la acción de algún otro patógeno.
De la mortalidad generada se enviaran peces al laboratorio para realizar análisis de necropsia, cargas virales y aislamiento e identificación del patógeno.
Una vez finalizado el tratamiento los peces permanecerán por un período de 12 días en los estanques para seguir el curso de la infección post tratamiento.
Los peces se distribuyeron de la siguiente manera :
Estanque 1 : 30 peces infectados sin tratamiento con alimento más excipiente
Estanque 2: 30 peces infectados tratados con alimento medicado serie 1.
Estanque 3 : 30 peces infectados sin tratamiento con alimento más excipiente.
Estanque 4: 30 peces infectados tratados con alimento medicado serie 2.
Estanque 5 : 30 peces infectados sin tratamiento con alimento más excipiente.
Estanque 6: 30 peces infectados tratados con alimento medicado serie 3.
Estanque 7 : 30 peces sin infectar y sin tratamiento. Estanque 8 : 30 peces sin infectar y sin tratamiento.
Para evaluar la Eficacia del tratamiento con la composición veterinaria al 5% de ribavirina se realizó lo siguiente :
a) Registro diario de mortalidad.
b) Cuantificación de las cargas virales de los peces muertos
c) Necropsia de los peces muertos
d) Registro de la observación diaria del comportamiento general de los
peces en cuanto a :
a. Apetito, el cual se calificó como: bueno, regular, malo
b. Actividad, la que se calificó como: activo, aletargado, orillado, e) Registro de parámetros fisicoquímicos.
f) Muestreo al azar de peces de cada estanque con el fin de extraer sangre para análisis de hematocrito y hemoglobina.
g) Aislamiento viral de algunas muestras de peces muertos
Para evaluar la eficacia del tratamiento se aplicaron los siguientes criterios:
a) El porcentaje de mortalidad inespecífica debe ser menor al 5%. Por sobre este porcentaje el ensayo será invalidado.
b) La mortalidad registrada en los peces infectados con virus ISA no
tratados debe ser igual o mayor al 40% de los peces.
Si se produce mortalidad se registra y se retira para realizar análisis de : a) Necropsia de cada uno de los peces muertos
b) RT-PCR de virus ISA
Análisis realizados previos al inicio del ensayo
El detalle de los resultados de los análisis de los frotis frescos de branquias, piel e intestino, las tinciones Gram y Naranja de Acridina, los análisis bacteriológicos incluyendo IFAT para BKD y los análisis virales mediante RT-PCR de IPNV e ISAV realizados antes de comenzar el ensayo se resumen a continuación :
Al frotis fresco de branquias se evidenció principalmente: ausencia de parásitos y hongos en todas las muestras analizadas; hiperplasia (inflamación del tejido branquial) moderada (grado II a III, mayoritariamente) y abundante presencia de materia orgánica, lo que puede deberse a que los peces habían consumido alimento recientemente y a las condiciones medioambientales en los estanques de cultivo.
Al frotis fresco de piel e intestino se evidenció ausencia de parásitos en todas las muestras analizadas.
La tinción Gram de frotis de bazo, riñon y cerebro de todos los peces muestreados evidenció ausencia de estructuras bacterianas.
La tinción Naranja de Acridina de frotis de branquias de todos los peces muestreados evidenció ausencia de estructuras bacterianas.
El análisis IFAT/BKD evidenció ausencia de Renibacterium salmoninarum en todas las muestras analizadas.
Los análisis bacteriológicos evidenciaron ausencia de desarrollo bacteriano desde las muestras analizadas provenientes de riñon, cerebro
(TSA), bazo y branquias (TYES).
El análisis RT-PCR para IPNv evidenció solo una de las muestras analizadas levemente positiva (1 pool de 12 pooles total).
El análisis RT-PCR para ISAV evidenció ausencia del virus ISA en todas las muestras analizadas.
No se realizó análisis de SRS debido a que los peces provenían de agua dulce.
En conclusión, a pesar de algunas características anatomopatológicas alteradas que se describieron en las necropsias, el aspecto general del lote es relativamente bueno y está dentro de lo habitual en la industria, por tanto se consideran peces representativos de la industria chilena. Esto también incluye la presencia de algunos peces portadores de IPNV en el grupo seleccionado. En consecuencia se consideró que los peces eran aptos para el ensayo.
Mortalidad diaria
Los estanques N° l, N°3 y N°5, corresponden a los ensayos realizados con peces inoculados con virus ISA, con administración de alimento con excipiente, es decir corresponden a los estanques con peces no tratados. En ellos la mortalidad inició a partir del día 11, día 4 y día 25 post inoculación, respectivamente.
El mayor número de muertos lo concentraron estos estanques en el período definido como "tratamiento".
Los estanques N°2, N°4 y N°6, corresponden a los ensayos con peces tratados con la composición veterinaria oral que comprende ribavirina de las series de producción 1, 2 y 3, respectivamente. En estos estanques no hubo desarrollo de la enfermedad en el periodo de tratamiento como se observó en los estanques sin tratamiento.
La distribución de la mortalidad en el tiempo se aprecia en la Tabla 3a y Tabla 3b. La diferencia en los porcentajes de mortalidad en los peces sin tratar respecto de los tratados se puede observar claramente en la Figura 17.
Todos los peces muertos del ensayo fueron sometidos a necropsia y a análisis de carga viral.
Tabla 3a: Distribución de la mortalidad en el tiempo del ensayo.
Figure imgf000035_0001
Tabla 3b: Distribución de la mortalidad en el tiempo del ensayo
Figure imgf000035_0002
Necropsias
Fue posible apreciar la aparición de peces enfermos con signología clínica de ISA que se evidenció de la siguiente manera : externamente, la signología fue inespecífica, tal como letargía, disminución del apetito, usualmente de coloración oscura y muerte.
La aparición de las primeras mortalidades fue seguida de su envío a laboratorio para su necropsia. Los peces muertos analizados, manifestaron en general compromiso sistémico con diversos niveles de hemorragia a nivel de órganos internos, dentro de ellos principalmente a nivel de grasa visceral, sistema digestivo y en particular a nivel hepático; lo más característico fue hígado color "vino tinto" en algunos peces, con distintas tonalidades de rojo oscuro, parejo o moteado, lo cual corresponde a hemorragia hepática; también fue posible observar hemorragia en grasa visceral usualmente en forma de petequias (hemorragia en punto) además de signos inespecíficos, tales como ausencia de alimento en tubo digestivo, hemorragia y/o congestión de tubo digestivo y órganos internos con inflamación de variada intensidad .
Cargas virales
Respecto a las cargas virales, todos los peces muertos mostraron cargas virales positivas lo que corrobora que los peces estaban desarrollando la infección, aunque en algunos casos ésta fue moderada . Esto también se comprobó con el aislamiento del virus en cultivo celular SH K- 1 desde órganos realizado a partir de algunos peces.
Se destaca el resultado negativo de muestras provenientes de peces pertenecientes a los estanques de los controles sanos (muestra viva) y se destaca la carga viral del único pez muerto proveniente del estanque N°6. El resultado de la carga de los controles sanos evidencia, que no tenían carga viral y por tanto se descarta la contaminación cruzada entre los estanques. Al comparar los resultados positivos de los peces infectados tratados, con los peces infectados no tratados, se aprecia que la carga viral (copy number) tiende a ser más baja en los peces infectados tratados, además se mueren menos peces. Esto también queda en evidencia al observar el resultado del otro pez vivo muestreado que pertenece al estanque N°4 (estanque tratado que no tuvo mortalidad en todo el período de estudio, pero que estaba infectado porque tenía carga viral, aunque baja) .
Aclimatación
Los peces ya habían realizado el proceso de adaptación al sistema de estanques, en un estanque madre, por lo tanto, ya llevaban un período importante de aclimatación en el lugar del ensayo.
Durante el período que definimos como aclimatación, se realizó el traslado de los peces a los estanques definitivos de la prueba, motivo por el cual hubo hasta dos días de ayuno. Hubo 3 muertos por manejo, los cuales fueron repuestos en forma inmediata, por lo que no se contabilizaron como mortalidad. Inoculación
El día 10 post inoculación se manifiestan los primeros peces orillados de los estanques infectados, siendo más repetitivo en los peces pertenecientes a los estanques N°l y N°5.
Los peces de los estanques tratados así como los controles sanos evidenciaron buena apetencia y actividad en todo el período, como se aprecia en las Tablas 4a y 4b.
En las Tablas 4 a 6, el significado de las abreviaciones utilizadas es el siguiente:
Figure imgf000037_0001
Actividad
AC Activo
AC* Activo con presenci a de algún pez orillado .
AL Aletargado
0 Orillado
AY Ayuno
Tabla 4a: Grado de apetencia y actividad de los peces post-inoculación (días 1 a 12)
INOCULACION 1
Figure imgf000037_0002
Tabla 4b: Grado de apetencia y actividad de los peces post-inoculación (días 13 a 25)
INOCULACION 2
Figure imgf000038_0001
Durante el período de tratamiento, todos los peces ingirieron adecuadamente el alimento medicado y el alimento con excipiente sin medicar. Sin embargo, manifiestan lentitud en la ingesta del alimento algunos peces de los estanques 3 y 5, de los cuales también persiste la aparición de peces orillados, como se observa de los resultados mostrados en la Tabla 5.
Tabla 5: Grado de apetencia y actividad de los peces durante el periodo de tratamiento.
TRATAMIENTO
Figure imgf000038_0002
Post-tratamiento
Posterior al tratamiento, los peces infectados no tratados (estanques 1, 3 y 5) evidenciaron persistentemente peces con apetencia regular y mala así como letargía. Los peces pertenecientes a los estanques tratados en cambio, mostraron mejor comportamiento y actividad. Estos comportamientos se evidencian con los resultados mostrados en la Tabla 6. Tabla 6: Grado de apetencia y actividad de los peces durante el periodo post-tratamiento.
POST - TRATAMIENTO
Figure imgf000039_0001
Valores sanguíneos
Los Valores de Hematocrito obtenidos de sangre de peces muestreados al azar en el transcurso del ensayo se ubicaron en un rango moderado entre 24 a 35,5%. Sin embargo, al obtener los promedios del hematocrito de cada tratamiento no se aprecia efecto del tratamiento, ya que todos los valores oscilan en alrededor del 30%.
La misma tendencia se pudo apreciar con los valores promedio de hemoglobina (Hb).
De tal manera se concluye que el tratamiento no produce efectos secundarios en los valores sanguíneos de hematocrito y hemoglobina en las concentraciones ensayadas (Ver Tabla 7 y Figura 18).
Las tendencias individuales de cada estanque tratado mostraron que evidentemente el tratamiento no produce una tendencia negativa sobre los valores sanguíneos de hematocrito y hemoglobina. Tabla 7: Resultados promedios de los valores de Hematocrito y Hemoglobina de los peces en estudio. Tratamiento Hematocrito (%) Hemoglobina (g%)
Control sano 30,79 10,53
Control infectado 30,92 10,09
Tratados 30,31 10,03
Parámetros físico-químicos
Diariamente, el agua de los estanques fue sometida a medición de parámetros físico químicos, tales como: nitrito, nitrato, amonio, pH, temperatura y oxígeno disuelto.
Los parámetros físico-químicos, se mantuvieron dentro de rangos normales, los que se definen en la Tabla 8. Tabla 8:
Figure imgf000040_0001
En los casos en que el amonio, el amoníaco o el nitrito eran mayor al valor normal especificado en la Tabla 8, se procedía al cambio de agua (mezcla de agua con salinidad a 24 ppt), fresca.
Los resultados anteriormente expuestos indican que se cumplieron los criterios establecidos para evaluar la eficacia del tratamiento con la composición veterinaria antiviral al 5% de ribavirina, ya que se obtuvo: a) un cero por ciento de mortalidad inespecífica en los estanques sin infectar y sin tratar.
b) entre un 43% y un 63% de mortalidad en los estanques infectados sin tratamiento y c) entre un 0% y un 3% de mortalidad en los estanques infectados y tratados con la composición antiviral .
En conclusión :
a) el porcentaje de mortalidad inespecífica fue menor al 5% y de la mortalidad específica fue mayor al 40%, lo que valida el ensayo y, b) la sobrevivencia registrada en los peces tratados se encuentra entre el 100% al 84% respecto a la observada en los peces sin tratar. Con este estudio se demuestra la eficacia de la composición veterinaria al 5% de ribavirina como efectivo para el tratamiento de salmónidos afectados por la enfermedad ISAV.
INDICACIONES, DOSIS Y ADMINISTRACION
De los resultados obtenidos, se puede asegurar que la composición veterinaria oral que comprende el antiviral ha sido especialmente formulada para el control de la anemia infecciosa del salmón, ISA, y que resulta muy eficaz al ser administrada en los inicios de la enfermedad, en individuos con diagnóstico positivo a ISAV, sin sintomatología clínica o en individuos en los primeros estadios de la sintomatología.
La dosis oral recomendada es de 1,6 mg/Kg de peso corporal, durante 10 días.
La composición veterinaria en la forma de polvo oral que comprende el antiviral debe impregnarse a través de una base oleosa al alimento. Su administración debe seguir el patrón de tasa de alimentación y debe ser adicionado al pellet del alimento de tamaño adecuado a la talla de los individuos a tratar.
A continuación, en la Tabla 9 se indican las dosis por calibres de los pellets de alimento para administración oral de la composición de la invención : Tabla 9: Dosis del antiviral para administración oral en peces
Figure imgf000042_0001
Se sugiere suministrar la composición veterinaria de la invención por 10 días continuados, una vez al día, en la mañana con una buena demanda de alimento, de manera de facilitar su administración oral y la efectividad del tratamiento.
Composiciones veterinarias de acuerdo a la presente invención
En la Tabla 10 se detallan las diferentes formulaciones desarrolladas que contienen como principio activo el antiviral para una forma farmacéutica en polvo, diseñada para el uso en una suspensión oleosa o bien como componente sólido en la fórmula de un pellet de alimento medicado. Para cada composición se indica el procedimiento de fabricación empleado. Tabla 10: Composiciones veterinarias que comprenden el antiviral y su procedimiento de fabricación.
Figure imgf000043_0001
Pruebas de impregnación del pellet con el producto desarrollado (formulado en polvo')
Con el objetivo de establecer un método básico de obtención en escala de laboratorio de un pellet impregnado con el producto desarrollado, se procedió a utilizar la fórmula 11 para obtener una suspensión del producto en aceite de pescado equivalente al 2% del peso de pellet a impregnar.
Con este fin fueron utilizados 500 g de pellet calibre 2,9 mm (Nutra Alpha Plus 60 Skretting) los cuales fueron impregnados en un proceso de recubrimiento efectuado en paila de grajeado tradicional en condiciones controladas de funcionamiento.
A esta muestra se le estableció un método de preparación y extracción del activo y se analizó utilizando el sistema cromatográfico definido.
El método implementado mostró ser selectivo para el analito y productos de degradación evidenciados en las muestras sometidas a protocolo de degradación en diferentes condiciones.
Producto de las pruebas de degradación del analito en solución se estableció que el activo es sensible a la degradación en medio alcalino a temperatura ambiente y catalizado por temperatura, siendo la reducción de aproximadamente un 36 y 88% respectivamente. En medio ácido se aprecia degradación en ambiente catalizado por temperatura llegando a una reducción de 38% de la concentración inicial. No se aprecia productos de degradación, producto de fotolisis u oxidación.
Asimismo, el estudio permite establecer la estabilidad de la solución acuosa del analito, mantenida refrigerada hasta 48 horas post elaboración. En la Tabla 11 se muestran los resultados obtenidos de las muestras de materia prima y producto al ser sometidos a autoclave 121°C a 15 psi de presión (1 atmósfera) y 25% de humedad relativa. Tabla 11: Resultados de degradación de materia prima (antiviral, ribavirina) y producto formulado con almidón, al ser sometidos a 121°C a 15 psi de presión (1 atmósfera) y 25% de humedad relativa
Muestra de Materia prima (antiviral) % RSD
Antiviral
MP 5 minutos en autoclave 97,2 0,8
MP 10 minutos en autoclave 91,9 5,5
MP 30 minutos en autoclave 90,3 11,7
MP 20 min. secado + 30 minutos en 99,5 9,4 autoclave
Muestra Materia prima (antiviral) +
almidón
10 % antiviral 5 minutos en autoclave 85,0 6,1
10 % antiviral 10 minutos en autoclave 99,0 30,4
10 % antiviral 30 minutos en autoclave 109,0 10,1
10 % antiviral 20 min . secado + 30 minutos 102,0 24,9 en autoclave
Los resultados sugieren que el principio activo es resistente a un proceso productivo en el cual se considere exposición a un tiempo breve de alta temperatura y humedad relativa. Resultados de las distintas composiciones veterinarias ensayadas:
En la Tabla 12 se muestran los resultados de valoración obtenidos de las distintas composiciones analizadas con el método analítico implementado. Estas composiciones corresponden a las detalladas en la Tabla 10.
Tabla 12: Valoración promedio y desviación estándar relativa (RSD) de las distintas composiciones desarrolladas en la presente invención. Fórmula Valoración RSD
N° Promedio (%) (o/o)
1 76,5 1,45
2 95,5 0,91
3 87,2 0,37
4 86,2 2,8
5 98,9 1,1
6 96,6 0,73
7 88,7 1,19
8 101,7 2,06
11 100 0
Los resultados obtenidos en las series analizadas muestran un mejor comportamiento del producto en forma farmacéutica sólida (fórmulas 6, 8 y 11) la cuales tienen como base al excipiente almidón pre-gelatinizado obtenido por vía seca y dilución geométrica del activo en el excipiente. Las diferencias obtenidas respecto del valor teórico pueden explicarse por pérdidas durante el proceso o falta de uniformidad (mezclado insuficiente).
Desde el punto de vista galénico, con la fórmula 11 se logra una mejor suspendibilidad en fase oleosa (aceite de pescado), y además mostró buenos resultados analíticos de valoración. La suspensión obtenida es capaz de mantenerse sin sedimentación al menos por 5 minutos sin agitación, si éste último proceso se mantiene durante la aplicación del producto en el pellet la sedimentación no ocurre.
Como producto del ensayo de impregnación se evidencia la conveniencia de tener un proceso de preparación de suspensión con la fase oleosa mantenida a temperatura ambiente y agitación mantenida hasta el momento de la aplicación en el pellet. El proceso de mezcla utilizado (paila de grajeado) mostró ser eficiente en el modelo de proceso implementado a escala de laboratorio. 5

Claims

REIVINDICACIONES
1. - Composición veterinaria oral para salmónidos CARACTERIZADA porque comprende l-beta-D-ribofuranosil-l/-/-l,2,4-triazol-3- carboxamida y excipientes veterinariamente aceptables.
2. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque comprende 0,5% a 5% en peso, respecto al peso total de la composición, de 1-beta-D- ribofuranosil-l/-/-l,2,4-triazol-3-carboxamida.
3. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque comprende 99,5% a 95% en peso, respecto al peso toral de la composición, de excipientes veterinariamente aceptables.
4. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque comprende excipientes seleccionados entre: lactosa spray dried, almidón de maíz parcialmente pregelatinizado, lactosa monohidrato, almidón de maíz, dióxido de silicio coloidal, o sus mezclas.
5. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque comprende almidón de maíz parcialmente pregelatinizado.
6. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque comprende 99,5% a 95% en peso, respecto al peso total de la composición, de almidón de maíz parcialmente pregelatinizado.
7. - Composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque está mezclada con pellets de alimento para peces.
8. - Uso de la composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 1 CARACTERIZADA porque sirve para preparar un medicamento destinado para el tratamiento de la anemia infecciosa del salmón (ISA) en salmónidos.
9. - Uso de la composición veterinaria oral para salmónidos de acuerdo a la reivindicación 8 CARACTERIZADA porque sirve para preparar un medicamento para ser mezclado con pellets de alimento para peces.
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