WO2011152098A1

WO2011152098A1 - イムノクロマトグラフ法のための展開液およびそれを用いた測定法

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Publication number: WO2011152098A1
Application number: PCT/JP2011/055593
Authority: WO
Inventors: 敬三高野; 尚大岡田
Original assignee: コニカミノルタエムジー株式会社
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-03-10
Publication date: 2011-12-08

Abstract

本発明は、低濃度の被検出物質であっても十分にこれを検出することができる正確かつ高感度なイムノクロマトグラフ法を可能にするための手段を提供する。本発明は一側面において、核酸分子を含むことを特徴とする、不溶性担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマトグラフ法における展開液を提供する。前記不溶性担体としては、たとえばシリカ粒子が好適である。また、前記シリカ粒子としては、蛍光化合物が化学的に結合もしくは吸着しているものが好適である。

Description

イムノクロマトグラフ法のための展開液およびそれを用いた測定法

　本発明は、生体試料中に含まれる非検出物質を高感度に検出することのできる免疫測定法の一つであるイムノクロマトグラフ法、特に当該方法における移動層を構成する展開液に関する。

　イムノクロマトグラフ法は、血液、唾液、尿などのサンプルに含まれる被検出物質（たとえば抗原）に、その被検出物質と特異的に結合する物質（たとえば前記抗原に対する第一の抗体）と当該物質を標識する標識物質とからなるコンジュゲートを反応させて、形成された複合体を含む移動相をクロマトグラフィーの原理により固定相に展開させ、固定相上の反応部位で固定化試薬（たとえば前記抗原に対する第二の抗体）により前記コンジュゲートを補足した後、前記標識物質から発せられるシグナルを検知する、前記サンプル中の被検出物質を定性的ないし定量的に分析するための手法である。

　このようなイムノクロマトグラフ法における標識物質としては、たとえば、コロイド状金属粒子（たとえば金粒子）、着色ラテックス粒子などが従来用いられている。これらの標識物質には、陽性・陰性の判定を目視で行えるという利点があるが、イムノクロマトグラフ法の応用の拡大にはさらなる高感度化が有望視されており、そのために、標識物質として蛍光化合物を利用し、蛍光を検出器により検出する方法が有効であると考えられる。金属粒子は、発色が強いが、原理的に蛍光は発しない。また、ラテックス粒子としては、蛍光色素を導入した蛍光ラテックス粒子もあるが、粒子表面に抗体が結合しにくく（つまりコンジュゲートを形成しにくく）、また疎水結合による非特異的結合を起こしやすい。そこで近年では、親水性が高く、また抗体の結合性が高いという特徴を有するシリカ粒子に、半導体ナノ粒子や蛍光色素のような蛍光化合物を封入したものが、新たな標識物質として期待されている。

　さて、上述のようなシリカ粒子や、従来のコロイド状金属粒子、着色ラテックス粒子などの不溶性担体を標識物質として用いる場合、（１）検出試薬（特に不溶性担体の部分）が凝集することなしに、クロマトグラフ媒体上を確実に展開移動して、反応部位に到達させること、また（２）試料中に含まれる被検出物質以外の成分の非特異的吸着に起因する偽陽性反応を抑制すること、などが要求される。

　上記のような要求を満たすための手段として、たとえば特許文献１（特開２０１０－０１９７８６号公報）では、酸素原子及び窒素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマー及びＨＬＢ値が１３～１８である非イオン性界面活性剤を含む、不溶性担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマトグラフ法における展開液が記載されている。また、特許文献２（特開２００９－１６２５３７号公報）には、シリカ粒子の表面に多糖が吸着し、さらに前記シリカ粒子の表面及び前記多糖の外側に生体分子が吸着又は共有結合してなるシリカ粒子／多糖／生体分子の複合粒子、ならびにそのような複合粒子が分散媒中に分散してなる複合粒子コロイドを用いてなる分析試薬が記載されている。

特開２０１０－０１９７８６号公報特開２００９－１６２５３７号公報

　本発明は、不溶性担体の凝集や非特異的吸着に起因する測定感度の低下を抑制することなどにより、低濃度の被検出物質であっても十分にこれを検出することができる正確かつ高感度なイムノクロマトグラフ法を可能にするための手段を提供することを目的とする。

　本発明者らは、不溶性担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマトグラフ法における展開液として、核酸分子を含むものを用いることにより、上記の課題を解決しうることを見出し、本発明を完成させるに至った。

　すなわち、本発明は一つの側面において、核酸分子を含むことを特徴とする、不溶性担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマトグラフ法における展開液を提供する。　　　

　前記不溶性担体としては、たとえばシリカ粒子が好適である。また、前記シリカ粒子としては、蛍光化合物が化学的に結合もしくは吸着しているものが好適である。一方、前記核酸分子としては、たとえば１種以上のヌクレオチドからなるものが好適である。

　本発明は別の側面において、上記展開液を、移動層を構成する展開液として、あるいは試料希釈剤として使用することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法を提供する。

　本発明はさらなる側面において、少なくとも、上記の展開液と、クロマトグラフ媒体とを含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ用の検出キットを提供する。

　核酸分子を含む本発明の展開液を用いることにより、低濃度の被検出物質であっても十分にこれを検出することができる正確かつ高感度なイムノクロマトグラフ法が可能になる。なお、以下の推察は本発明を制約するものではないが、展開液に添加された核酸分子は、不溶性担体（たとえばシリカ粒子を利用したもの）をマスキングするような機能を有し、これにより不溶性担体の凝集や非特異的吸着に起因する測定感度の低下を抑制しているものと推察される。

　本発明の一態様としては、クロマトグラフ媒体上で移動層を構成する展開液に、予め「核酸分子」が添加されており、一方、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域に「不溶性担体で標識化された検出試薬」を存在させておき、上記展開液がクロマトグラフ媒体上で展開される際に「不溶性担体で標識化された検出試薬」が溶解する、というものが挙げられる。

　上記の態様には、たとえば次のような２つの態様が包含される。

　一方の態様（以下「本発明の第１態様」と称することがある。）では、クロマトグラフ媒体上に、展開液を添加するための「展開液添加部位」と、被検出物質を含む試料を添加するための「試料添加部位」と、不溶性担体で標識化された検出試薬が支持されている「検出試薬保持部位」と、反応部位とがこの順に配置されている。そして、展開液添加部位に核酸分子を含有する展開液を添加し、クロマトグラフ媒体上で展開させるというものである。

　もう一方の態様（以下「本発明の第２態様」と称することがある。）では、クロマトグラフ媒体上に、上述した「展開液添加部位」が配置されておらず、「試料添加部位」と「検出試薬保持部位」と「反応部位」とがこの順に配置されている。そして、核酸分子を含有する本発明の展開液を試料を稀釈するための「試料希釈液」として用い、そのようにして希釈された（本発明の展開液と混合された）試料を「試料添加部位」に添加し、クロマトグラフ媒体上で展開させるというものである。

　本発明の別の態様（以下「本発明の第３態様」と称することがある。）としては、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域に、「核酸分子」および「不溶性担体で標識化された検出試薬」を存在させておき、展開液により移動層が形成される際にこれらが溶解することにより、「不溶性担体で標識化された検出試薬」とともに「核酸分子」を含有する本発明の展開液になる、というものが挙げられる。

　これらの例示された態様以外にも、クロマトグラフ媒体上を展開していく段階において、展開液中の核酸分子が検出試薬、特に不溶性担体の部位と接触できるものであれば、そのような展開液や測定方法は本発明に含まれる。

　展開液・核酸分子
　イムノクロマトグラフ法における展開液は、移動相を構成する液体であり、固定相であるクロマトグラフ媒体上を、被検出物質を含む試料及び不溶性担体で標識化された検出試薬と共に移動する。本発明の展開液は核酸分子を含有することを主たる特徴とするものであり、展開液のそれ以外の構成要件、たとえば不溶性担体で標識化された検出試薬などの展開液中の成分や、展開液の使用方法などについては、たとえば前出の特許文献１（特開２０１０－１９７８６号公報）に記載されているような、従来のイムノクロマトグラフ法における展開液に準じたものとすることができる。

　また、前述した本発明の第２態様として示したように、本発明の展開液は、試料希釈液としても使用することができ、そのようにして希釈された試料をそのままイムノクロマトグラフ媒体上に展開させることができる。本明細書における「展開液」に関する説明は、特に断らない限り、「試料希釈液」として用いる場合にも適用可能なものとする。

　本発明の展開液に含まれる「核酸分子」としては、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび２以上のヌクレオチドが結合したオリゴマーないしポリマーを用いることができる。なお、上記ヌクレオシドないしヌクレオチドには、リボヌクレオシドないしリボヌクレオチドと、デオキシヌクレオシドないしデオキシリボヌクレオチドの双方が包含され、また、ヌクレオチド中のリン酸基の数も１，２ないし３のいずれであってもよい。このような核酸分子としては、少なくとも１種のヌクレオチドからなるもの、たとえば、ＤＮＡ合成反応においてＤＮＡポリメラーゼの基質として一般的に市販、使用されているdNTP Mixtureが好適である。なお、クロマトグラフ媒体にプローブ（相補的な塩基配列を有するＤＮＡもしくはＲＮＡ）を固定化したものを用いる、核酸を被検出物質とするイムノクロマトグラフ法においては、偽陽性反応を避けるため、そのようなプローブに吸着するおそれのあるオリゴマーないしポリマーを本発明の展開液に核酸分子として添加することは避けるべきである。

　展開液中の核酸分子の濃度は、核酸分子および不溶性担体の態様に応じて適切に調整することができ、一律に規定されるわけではないが、たとえば、核酸分子としてdNTP Mixtureを用い、不溶性担体としてシリカ粒子を用いる場合、シリカ粒子に対して０．１～１０重量％の核酸分子を用いることが好ましい。

　また、本発明の展開液は、通常、水を溶媒とし、上記の核酸分子に加え、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤としては、たとえばリン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等が好ましい。このような緩衝剤により、本発明の展開液のｐＨは、６～８．５の範囲で調整されることが好ましい。さらに、他の成分として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質成分（含有量は通常０．０１重量％～１０重量％）を任意で含んでいてもよい。

　クロマトグラフ媒体
　本発明のイムノクロマトグラフ法において用いるクロマトグラフ媒体は、従来の一般的なクロマトグラフ媒体と同様、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される検出試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないものであり、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。

　上記クロマトグラフ媒体としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じクロマトグラフ媒体として機能する。セルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等が好ましく、ニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙がより好ましい。

　本発明の実施に供されるクロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色である。

　その他、クロマトグラフ媒体には、必要に応じて、被検出物質を含む試料を添加するための試料添加部位（サンプルパッド等）、試料中の血球等の固形成分を除去する部位（血球分離部位等）、展開液を添加するための展開液添加部位、反応部位に捕獲されなかった被検出物質や展開液を吸い取る吸収部位（吸収パッド等）、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料液や展開液が移動できるものであれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。

　このようなクロマトグラフ媒体と、前述したような展開液との組み合わせにより、イムノクロマトグラフ法用の検出キットを構成することもできる。この場合、クロマトグラフ媒体は、たとえば前述した本発明の第１～第３態様で示したように、組み合わせて用いられる展開液や使用される測定方法に応じた所定の部位が形成されたものとすればよい。また、この検出キットには、その他の構成部材や使用方法を示した説明書などがさらに含まれていてもよい。

　固定化試薬・反応部位
　本発明において用いるクロマトグラフ媒体上には、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体が固定化試薬として任意の位置に固定化された反応部位が形成される。固定化試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、固定化試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法と、固定化試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的又は化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体に捕捉して固定化する間接固定化方法がある。

　直接的に固定化する方法としては、物理吸着を利用しても良いし、共有結合によってもよい。一般的に、クロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜又は混合ニトロセルロースエステル膜である場合、物理吸着を利用することができる。また、共有結合ではクロマトグラフ媒体の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。

　一方、間接的に固定化する方法としては、不溶性微粒子に固定化試薬を結合した後に、クロマトグラフ媒体に固定化する方法がある。不溶性微粒子の粒径はクロマトグラフ媒体に捕捉されるが移動することのできないサイズのものを選択することができ、好ましくは平均粒径１０μｍ程度以下の微粒子である。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、本発明でもこれら公知の粒子を使用することができる。例えば、ポリスチレン、スチレン－ブタジエン共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン－エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ－アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。

　また、クロマトグラフ媒体への固定化試薬の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、インキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。反応部位の形態は特に限定されないが、たとえば被検出物質の存在を目視により確認するタイプのイムノクロマトグラフ媒体であれば、円形のスポット、クロマトグラフ媒体の展開方向に垂直にのびるライン、数字、文字や＋、－などの記号等として固定化することもできる。

　固定化試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、ツイーン２０、トリトンＸ－１００、ＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。

　不溶性担体で標識化された検出試薬・検出試薬保持部位
　本発明において用いられる検出試薬は、被検出物質と特異的に結合する物質、例えば抗体と、それを標識化するための標識物質としての不溶性担体とのコンジュゲートである。

　本発明で用いられる標識物質としての不溶性担体には、シリカ粒子；金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子；酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子；硫黄などのコロイド状非金属粒子；合成高分子よりなるラテックス粒子などの公知のものを用いることができる。なかでも、シリカ粒子、特に半導体ナノ粒子や蛍光色素のような蛍光化合物が化学的に結合もしくは吸着したシリカ粒子は、本発明における不溶性担体として好適である。

　検出試薬の不溶性担体としてのシリカ粒子は、前出の特許文献２（特開２００９－１６２５３７号公報）に記載された発明で使用されているような、公知の方法により作製されたものを使用することができる。

　たとえば、蛍光化合物とシランカップリング剤とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、オルガノシロキサン成分とシロキサン成分とがシロキサン結合してなる層により蛍光化合物が被覆された形態の、蛍光化合物を内包するシリカ粒子を作製することができる。より具体的には、たとえば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する蛍光化合物と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を縮重合させシロキサン結合を形成させるようにすることができる。

　前記活性基を有する前記蛍光化合物の具体例としては、５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン－ＮＨＳエステル（商品名、emp Biotech GmbH社製）、ＤＹ５５０－ＮＨＳエステル又はＤＹ６３０－ＮＨＳエステル（いずれも商品名、Dyomics GmbH社製）等のＮＨＳエステル基を有する蛍光色素化合物を挙げることができる。

　前記置換基を有するシランカップリング剤の具体例としては、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル-トリエトキシシラン、Ｎ－２（アミノエチル）３－アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３－アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤を挙げることができる。中でも、ＡＰＳが好ましい。

　前記縮重合させる前記シラン化合物の具体例としては、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、γ-メルカプトプロピルトリメトキシシラン（ＭＰＳ）、γ-メルカプトプロピルトリエトキシシラン、γ-アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、３－チオシアナトプロピルトリエトキシシラン、３－グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン、３－イソシアナトプロピルトリエトキシシラン、及び３－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチルアミノ］プロピル－トリエトキシシランを挙げることができる。中でも、前記シリカ粒子内部のシロキサン成分を形成する観点からはＴＥＯＳが好ましく、前記シリカ粒子内部のオルガノシロキサン成分を形成する観点からはＭＰＳ又はＡＰＳが好ましい。

　また、蛍光化合物として、Ｓｉ／ＳｉＯ₂、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ／ＺｎＳｅ等のコア・シェル型ナノ粒子を用いた検出試薬も、公知の方法により作製することができる。たとえば、Ｓｉ／ＳｉＯ₂のコア・シェル型ナノ粒子であれば、ＳｉおよびＳｉＯ₂のスパッタ処理の後、アニール処理、フッ酸処理、次いで自然酸化処理を行うことにより調製することができる。そして、調製されたＳｉ／ＳｉＯ₂ナノ粒子と前述したようなシラン化合物（たとえばＴＥＯＳ）とを縮重合させることにより、このナノ粒子を内包するシリカ粒子を作製することができる。

　上述のような方法を用いることにより、イムノクロマトグラフ法における適切な粒径を有する、球状ないし球状に近いシリカ粒子を作製することができる。球状に近いシリカ粒子とは、具体的には、長軸と短軸の比が２以下の形状のものである。また、シリカ粒子の平均粒径は、反応条件を（反応物の量比や反応回数など）を調整することにより、たとえば５ｎｍ～１０，０００ｎｍの範囲で調節することができる。さらに、所望の平均粒径のシリカ粒子を得るために、たとえば、ＹＭ－１０、ＹＭ－１００（いずれも商品名、ミリポア社製）等の限外ろ過膜を用いて限外ろ過を行い、粒径が大きすぎたり小さすぎる粒子を除去するか、あるいは適切な重力加速度で遠心分離を行い、上清または沈殿のみを回収するような手法を組み合わせてもよい。なお、シリカ粒子の平均粒径は、たとえば電子顕微鏡を用いて所定の数のシリカ粒子を観察することにより求めることができる。

　一方、コロイド状の金属、金属酸化物もしくは非金属の粒子、ならびにラテックス粒子は、市販のものを用いてもよいし、公知の方法により調製したものを用いてもよい。たとえば、コロイド状金粒子の調製方法としては、塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法が挙げられる。

　被検出物質に特異的に結合する物質と不溶性担体とからなるコンジュゲートは、公知の方法により作製することができるが、一般的には、それらを物理化学的吸着によって結合する方法と、共有結合によって結合する方法に大別することができる。前者としては、例えば、シリカ粒子や金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を添加した後、所定の時間放置して物理吸着させるような方法が挙げられ、このような方法には操作が簡便であるという利点がある。一方、後者としては、例えば、不溶性担体の粒子表面に導入したカルボキシル基と生体分子のアミノ基を縮合剤を用いてアミド結合で結合する方法や、いわゆる架橋試薬を用いて不溶性担体と生体分子とを結合する方法が挙げられ、このような方法には生体分子を定量的かつ不可逆的に導入することができるという利点がある。また、上記のような方法によりコンジュゲートを作製した後は、牛血清アルブミン溶液のようなブロッキング剤を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることが好ましい。

　実際のイムノクロマトグラフ法の実施において、不溶性担体により標識化された検出試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することもできるし、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部と反応部位との間の領域（検出試薬保持部位）に存在させて適用することもできる。クロマトグラフ媒体上に存在させる場合、展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、不溶性担体により標識化された検出試薬を所定の部位（検出試薬保持部位）に支持させておくことが好ましい。この検出試薬支持部には、不溶性担体の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。検出試薬を塗布・乾燥等によりクロマトグラフ媒体上に存在させる際には、クロマトグラフ媒体に直接、塗布・乾燥等することもできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に塗布・乾燥等して検出試薬保持部材を形成した後、固定化試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置してもよい。

　被検出物質・試料
　本発明において、イムノクロマトグラフ法により検出される被検出物質は、それに特異的に結合する物質が存在するものであれば特に限定されるものではない。典型的な被検出物質は、蛋白質ないしペプチドであるが、核酸、糖（特に糖タンパク質の糖部分、糖脂質の糖部分等）、複合糖質なども含まれる。本発明において「特異的に結合する」とは、生体分子が持つ親和力に基づいて結合することを意味する。このような親和力に基づく結合としては、抗原と抗体との結合、糖とレクチンとの結合、ホルモンと受容体との結合、酵素と阻害剤との結合、相補的核酸同士及び核酸と核酸結合蛋白質との結合などが挙げられる。従って、被検出物質が抗原性を有する場合、被検出物質に特異的に結合する物質としてはポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を例示することができる。また、被検出物質が糖の場合、被検出物質に特異的に結合する物質としてはレクチンタンパク質を例示することもできる。具体的な被検出物質としては、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２タンパク、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＣＡ１９－９、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、免疫抑制酸性タンパク（ＩＰＡ）、ＣＡ１５－３、ＣＡ１２５、エストロゲンレセプター、プロゲステロンレセプター、便潜血、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＲＰ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、梅毒抗体、インフルエンザウイルス、ヒトヘモグロビン、クラミジア抗原、Ａ群β溶連菌抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＢｓ抗原、ロタウイルス、アデノウイルス、アルブミン、糖化アルブミン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

　被検出物質を含む試料としては、例えば、生体試料、即ち、全血、血清、血漿、尿、唾液、喀痰、鼻腔又は咽頭拭い液、髄液、羊水、乳頭分泌液、涙、汗、皮膚からの浸出液、組織や細胞及び便からの抽出液等が挙げられる。これらの試料は、必要に応じて、被検出物質と検出試薬又は固定化試薬が特異的な結合反応を起こしやすい状態に処理をする。処理方法は酸、塩基、界面活性剤等の各種化学薬品等を用いた化学的処理方法、加熱・撹拌・超音波等を用いた物理的処理方法のいずれでもよく、またその両方法を用いてもよい。たとえば、インフルエンザウイルスＮＰ抗原等の通常は表面に露出していない領域を利用して、被検出物質と検出試薬又は固定化試薬との結合反応を行う場合には、界面活性剤等による処理を行うのが好ましい。この目的に使用される界面活性剤としては、特異的な結合反応、例えば、抗原抗体反応に与える影響を考慮して、非イオン性界面活性剤を使用するのが好ましい。また、これらの試料は、必要に応じて、固定相であるクロマトグラフ媒体において展開可能となるように展開液で希釈してもよい。

　１．イムノクロマトグラフ媒体上への反応部位の形成
　25×2.5cmのニトロセルロース膜(ミリポア社製：HF120)に抗体塗布機(BioDot社製)を用いて、5重量%のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液(pH:7.4)で1.0mg/mLの濃度になるように希釈した抗AFP（アルファ-フェトプロテイン）抗体を塗布し、50℃で30分間乾燥させた。乾燥後、該ニトロセルロース膜を0.5重量%のカゼイン(和光純薬工業社製)を含むリン酸緩衝液(pH:7.4)200mLに30℃で30分間浸漬し、ブロッキングを行った。ブロッキング後、0.05重量%のTween20を含有する洗浄液で洗浄し、室温で一晩乾燥させ、クロマトグラフ媒体上に反応部位を形成した。

　２．標識物質および検出試薬の調製
　5-(および-6)-カルボキシテトラメチルローダミン・サクシミジルエステル(商品名、emp Biotech GmbH社製)5.8mgを1mLのジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した。ここに2.6μLのAPSを加え、室温(25℃)で1時間反応を行った。得られた反応液150μLにエタノール44.8mL、TEOS360mL、蒸留水11.2mL、28質量%アンモニア水800μLを加え、室温で24時間反応を行った。反応液を18000×gの重力加速度で30分遠心分離を行い、上清を除去した。沈殿したシリカ粒子に蒸留水を4mL加え、粒子を分散させ、再度18000×gの重力加速度で30分間遠心分離を行った。本洗浄操作をさらに2回繰り返し、標識シリカナノ粒子分散液に含まれる未反応のTEOSやアンモニア等を除去し、ローダミン含有シリカ粒子を得た。

　次に、得られたローダミン含有シリカ粒子(粒径100nm)0.5mLに、リン酸緩衝液(pH7.4)で0.1mg/mLの濃度になるように希釈した抗AFP（アルファ-フェトプロテイン）抗体を0.1mL加え、室温で10分間静置した。つづいて、10質量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH:7.4)を0.1mL加え、十分撹拌した後、8000×gで15分間遠心分離を行った。上清を除去した後、1重量%の牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液(pH7.4)0.1mLを加え、検出試薬とした。

　３．クロマトグラフ媒体の作製
　上記のようにして調製した検出試薬をグラスファイバー製パッドに均一になるように添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、検出試薬保持部材とした。次いで、バッキングシートから成る基材に、上記のようにして反応部位が形成されたクロマトグラフ媒体、検出試薬保持部材、試料を添加する部分に用いるサンプルパッド、及び展開した試料や不溶性担体を吸収するための吸収パッドを貼り合わせた。最後に、裁断機で幅が5mmとなるように裁断し、クロマトグラフ媒体を作製した。

　４．測定
　上記のようにして作製したクロマトグラフ媒体を用いて、以下の方法で試料中のAFP（アルファ-フェトプロテイン）の存在の有無を測定した。即ち、0.05体積%Tween20、核酸分子としてのdNTP Mixture(TaKaRa社製、Code No.4030)25mmol/L、1.0重量%牛血清アルブミンおよび150mM塩化ナトリウムを含むトリス緩衝溶液(pH:8.0)からなる展開液を陰性検体試料とし、ここに所定の濃度のAFP（アルファ-フェトプロテイン）を加えたものを陽性検体試料とし、各々100μLをクロマトグラフ媒体のサンプルパッドに載せて展開させ、15分後に反応部位（シグナル：S）、および非反応部位（ノイズ：N）での蛍光を測定した。S/N比の結果を表１に示す。

　５．比較例
　核酸分子としてのdNTP Mixture(TaKaRa社製、Code No.4030)25mmol/lを配合しなかったこと以外は上記実施例と同様にして、陰性検体試料および陽性検体試料を調製し、反応部位および非反応部位での蛍光を測定した。S/N比の結果を表１に示す。

　核酸を含有する展開液を用いた場合（実施例）、核酸を含有しない展開液を用いた場合（比較例）に比べて、高感度に試料中のAFP（アルファ-フェトプロテイン）を測定することができた。即ち、核酸分子を含有する本発明の展開液をイムノクロマトグラフ法に用いることにより、良好なS/N比を得られることが明らかになった。尚、本実験において、テストラインのシグナルは全て確認している。

Claims

　核酸分子を含むことを特徴とする、不溶性担体で標識化された検出試薬を用いるイムノクロマトグラフ法における展開液。
　前記不溶性担体がシリカ粒子である、請求項１に記載の展開液。
　前記シリカ粒子が、蛍光化合物が化学的に結合もしくは吸着しているものである、請求項２に記載の展開液。
　前記核酸分子が１種以上のヌクレオチドからなるものである、請求項１～３のいずれかに記載の展開液。
　移動相を構成する展開液として請求項１～４のいずれかに記載の展開液を使用することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法。
　試料希釈剤として請求項１～４のいずれかに記載の展開液を使用することを特徴とする、イムノクロマトグラフ法。
　少なくとも、請求項１～４のいずれかに記載の展開液と、クロマトグラフ媒体とを含むことを特徴とする、イムノクロマトグラフ法用の検出キット。