WO2011142488A1

WO2011142488A1 - 관절염 치료제

Info

Publication number: WO2011142488A1
Application number: PCT/KR2010/003008
Authority: WO
Inventors: 조형래; 양건주; 김주완; 라채훈; 김민경
Original assignee: 주식회사 글루칸
Priority date: 2010-05-12
Filing date: 2010-05-12
Publication date: 2011-11-17
Also published as: JP5747983B2; US20130079299A1; JP2013526515A

Abstract

본 발명은 관절염을 예방, 치료 또는 완화하는 조성물, 구체적으로, β-1,3-1,6-분지 D-글루칸을 포함하는 관절염의 예방, 치료 또는 완화에 효과적인 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 상기 β-1,3-1,6-분지 D-글루칸은 글루코오스가 베타-1,3 결합하고, 상기 글루코오스 1 내지 20개마다 글루코오스가 1,6 결합을 하되, 상기 1,6 결합을 한 글루코오스는 유기산과 결합한 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 관절염 치료제 및 건강보조식품을 제공하며, 상기 조성물의 제약학적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 관절염을 예방, 치료 또는 완화 방법을 제공한다.

Description

【명세서】

【발명의 명칭】

관절염 치료제

【기술분야】

본 발명은 관절염을 예방, 치료 또는 완화하는 조성물, 상기 조성물을 투여 하는 것을 포함하는 관절염의 예방， 치료 또는 완화 방법, 및 상기 조성물을 포함 하는 관절염의 예방， 치료 또는 완화에 효과적인 건강보조제에 관한 것이다. 보다 상세히, 상기 조성물은 β-1,3— 1,6-분지 D-글루칸올 포함하는 조성물로서, 상기 β -1,3— 1,6-분지 D-글루칸은， 글루코오스가 베타 -1，3 결합하고, 상기 글루코오스 1 내지 20 개 마다 글루코오스가 1，6 결합을 하되， 상기 1,6 결합을 한 글루코오스는 유기산과 결합한 것을 특징으로 한다.

【배경기술】

인체는 약 200 여개의 관절로 이루어져 있다. 관절이란 뼈와 뻐가 만나는 부위이다. 관절은 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록， 연골， 관절낭， 활 막, 인대， 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡 수하는 역할을 한다.

이러한 관절에 나타나는 염증성 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스， 세균 감염에 의한 감염성 관절염， 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 변형성 관절염， 결합조직의 퇴행성 변화 로 인하여 가용성 대사 산물이 관절 주변의 결합 조직 내에 결정으로 침착되는 결 정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.

퇴행성 관절염， 즉 골관절염은 관절을 구성하는 연골세포 (chondrocytes)에 노화 등의 퇴행이 발생하여， 연골세포에서 관절의 기질 물질들인 유형 Π 콜라겐

(type II collagen) 및 프로테오글리칸 등의 합성이 저해됨과 동시에, 인터루킨 -1 β (interleukin-ΐβ ) 및 종양괴사인자 - a (tumor necrosis factor- α ) 등의 염증성 사이토카인이 생성됨에 따라， 관절기질을 분해하는 기질 금속단백질 분해효소 (matrix metal loproteinase)의 합성 및 활성이 관절세포에서 증가됨으로 인해 관절 조직이 파괴됨으로써 유발되는 질병이다.

또한, 관절염은 염증성 사이토카인에 의한 일산화질소의 생성과， 생성된 일 산화질소에 의한 자가증폭적인 사이토카인의 생성으로 인해 더욱 많은 MMP의 합성 이 유발되어 관절기질의 분해가 촉진됨으로써 더욱 악화된다. 이와 동시에, 염증 성 사이토카인은 지질 대사산물인 프로스타글란딘 E2의 생성을 증가시켜 관절염에 서의 염증반웅을 유발시킨다.

<6> 류마티스 관절염은 만성 전신성 염증 질환으로, 대칭성, 다발성의 관절염과, 이에 따른 관절의 손상 및 변형이 생기는 질환이다. 류마티스 관절염에 대한 치료 를 받지 않을 경우에는 경과가 불량하여 관절 기능의 장애를 나타내며， 더 지속되 면 관절 기능의 장애로 인하여 일상 생활에 지장을 받는다. 국내에서는 전인구의 약 1 % 가 류마티스 관절염으로 고생하고 있을 것으로 추정되는데， 류마티스 관절 염의 발생를은 남성보다 여성이 3 배 정도 높으며, 주로 20 〜 40 대에서 발생하는 것으로 알려져 있다.

<7> 류마티스 관절염의 주요 원인이 점차 밝혀지고 있으며, 유전적인 요인과 감 염, 호르몬의 이상 등이 원인 인자로 생각되고 있다. 이러한 원인 인자로 인하여 '자가면역' 현상이 생기는데, 자가면역이란， 우리 몸의 면역조절 기능 이상으로 인 해 만성 염증이 몸의 여러 부위에서 다발적， 지속적으로 일어나는 현상이다.

<8> 한편， 상기 관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 농도의 감소라는 주된 작용 기전올 근거로 대별할 수 있는데， 많은 신경관절 염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증， 부종， 열감, 발 작， 경직올 일으키는 병적 과정이며， 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린 올 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다.

<9> 비스테로이드성 항염제는 통증을 감소시켜서 신경관절을 편안하게 하고 염증 을 완화시키는 효과가 있으나 , 위장장애가 나타나거나 복통올 유발하는 경우도 있 기 때문에， 활동성 소화성 궤양이나 위장 부위의 출혈적 병력이 있는 사람에게는 사용이 금지된다. 스테로이드성 항염제는 그 효과에 비해ᅳ 체중 증가나 고혈압 등 의 부작용이 심각하여 퇴행성 신경관절염에는 잘 사용하지 않는다.

<10> 특히， 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 전혀 무관하고， 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절의 과잉 사용을 유도할 소지가 있으며， 이는 신경 관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.

<11> 따라서, 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성 을 갖고， 명백한 유독성 부작용을 수반하며， 장기간 동안 지속적으로 사용할 수 없 어 그 유효성이 제한되므로 , 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치 료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다.

【발명의 상세한 설명】【기술적 과제】

<12> 본 발명은 β -1,3-1, 6-분지 D-글루칸을 포함하는 관절염의 예방， 치료 또는 완화용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 관절염 치료제 및 건강보조식품， 및 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 관절염의 치료 방법을 제공하는 것올 목적으로 한다. 바람직하게, 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티즘 관절염이다.

【기술적 해결방법】

<13> 본 발명의 일 측면은, β -1,3-1, 6-분지 D-글루칸을 포함하는 관절염의 예방， 치료, 또는 완화용 조성물을 제공한다.

<14> 바람직하게， 상기 β— _1>6—분지 _D_글루칸은， 글투코오스가 베타 -1,3 결합 하고， 상기 글루코오스 1 내지 20 개 마다 글루코오스가 1,6 결합을 하되， 상기 1,6 결합을 한 글루코오스는유기산과 결합한 것을 특징으로 한다.

<15> 바람직하게， 상기 1,6 결합한 글루코오스에 결합하는 유기산은 젖산, 옥살 산, 옥살아세트산, 푸마르산, 말산, 숙신산， 아세트산, 부티르산, 팔미트산， 타르 타르산, 아스코르브산， 요산, 술폰산， 술핀산， 페놀, 주석산， 포름산， 시트르산， 이 소시트르산， 알파케토글루타르산, 호박산， 핵산， PGAᄂ DPGA, 및 PGA로 이루어 진 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

<16> 바람직하게， 상기 조성물은 체증 1 kg 당 21.25 mg 내지 85 mg 의 투여량으 로 투여하는 것을 특징으로 한다.

<17> 바람직하게， 상기 관절염은 골관절염 (퇴행성 관절염 ) 또는 류마티즘 관절염 인 것을 특징으로 한다.

<18> 본 발명의 또 다른 일 측면은， 상기한 조성물을 포함하는 골관절염 치료제를 제공한다.

<19> 본 발명의 또 다른 일 측면은， 상기한 조성물을 포함하는 류마티즘 관절염 치료제를 제공한다 .

<20> 본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기한 조성물을 투여하는 것을 포함하는 관 절염의 치료， 예방 또는 완화 방법을 제공한다. 이때, 상기 관절염은 바람직하게 골관절염 또는 류미티즘 관절염이다. 바람직하게 , 상기 조성물은 체증 1 kg 당

21.25 mg 내지 85 mg 의 투여량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 관절염의 치료, 예방또는 완화 방법을 제공한다.

<21> 본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기한조성물을 포함하는 관절염의 예방， 치 료 및 완화에 효과가 있는 건강보조제를 제공한다. 바람직하게, 상기 건강보조제 는 건강보조식품이다.

【유리한 효과】

<22> 본 발명에 따른 상기 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는 관절염 치료제는 부작용이 적고， 관절염의 원인을 치료하여 기존 치료제가 갖는 단점을 극복한 새로 운 치료제를 제공할 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

<23> 도 1은 골관절염 유발 후 아무런 처리를 하지 않은 군 (OA 대조군)， 디클로 페낙 소디움 처리군， 폴리칸 85ᅳ 42.5 및 21.25mg/kg을 처리한 군에 속하는 동물 모델의 몸무게 변화를 일수에 따라 나타낸 그래프이다.

<24> 도 2는 골관절염 유발 후 아무런 처리를 하지 않은 군 (OA 군), 디클로페낙 소디움을 처리한 군, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25mg/kg을 처리한 군에 속하는 동물 모델의 슬관절의 두께 변화를 일수에 따라 나타낸 그래프이다.

<25> 도 3은 골관절염을 유발하지 않고 멸균 증류수를 투여한 정상군 (Sham 대조 군), 골관절염 유발 후 디클로페낙 소디움 처리군, 폴리칸 85， 42.5 및 21.25mg/kg 을 처리한 군에 속하는 동물 모델 각각의 슬관절 두께 및 최대 신장각을 나타낸 그 래프이다.

<26> 도 4는 골관절염 유발 후 디클로 페낙 소디움 처리군, 폴리칸 85， 42.5 및

21.25mg/kg을 처리한 군에 속하는 동물 모델의 Mankin score를 나타낸 그래프이다. <27> 도 5는 골관절염 유발 후 디클로페낙 소디움 처리군， 폴리칸 85, 42.5 및

21.25mg/kg을 처리한 군에 속하는 동물 모델의 관절 부위를 절단하여 관절에서 연 골의 두께를 나타낸 그래프이다.

<28> 도 6은 골관절염 유발 후 디클 로페낙 소디움 처리군， 폴리칸 85， 42.5 및

21.25mg/kg을 처리한 군에 속하는 동물 모델의 연골 세포의 수를 나타낸 그래프이 다.

<29> 도 7은 관절염을 유발하지 않고 멸균 증류수를 투여한 정상군 (Sham 대조군

)(a,b), 류마티즘 관절염 대조군 (RA 대조군 )(c,d), 류미티즘 관절염 유발 후 디클 로페낙 소디움 처리군 (e,f), 및 폴리칸 85(k,l), 42.5(i,j) 및 21.25(g,h) mg/kg을 처리한 군의 흉선피질의 두께 증가를 나타낸 것이다. 여기서 C는 피질 영역이고， M은 골수 영역이다.

<30> 도 8은 관절염을 유발하지 않고 멸균 증류수를 투여한 정상군 (Sham 대조군

)(a,b), 류마티즘 관절염 대조군 (c,d), 류마티즘 관절염 유발 후 디클로페낙 소디 움 처리군 (e,f), 및 폴리칸 85(k,l), 42.5(i,j) 및 21.25(g,h)mg/kg을 처리한 군의 비장 동맥을 나타낸 것이다. 여기서 W는 백색속질 영역이고， R은 적색속질 영역, A는 증추 소동맥이다.

<31> . 도 9는 관절염을 유발하지 않고 멸균 증류수를 투여한 정상군 Sham 대조군

(a), 류마티즘 관절염 대조군 (b), 류마티즘 관절염 유발 후 디클로페낙 소디움 처 리군 (c), 및 폴리칸 85(f), 42.5(e) 및 21.25(d)mg/kg을 처리한 군의 Femur의 술 관절 관절표면을 나타낸 것이다. 여기서, S는 슬관절의 활액강이고， B는 미세삐이 다ᅳ

<32> 도 10은 관절염을 유발하지 않고 멸균 증류수를 투여한 정상군 (Sham 대조군

)(a), 류마티즘 관절염 대조군 (b), 류마티즘 관절염 유발 후 디클로페낙 소디움 처 리군 (c), 및 폴리칸 85(f), 42.5(e) 및 21.25(d)mg/kg을 처리한 군의 Tibia의 슬관 절 관절표면을 나타낸 것이다. 여기서， S는 슬관절의 활액강이고， B는 미세뼈이 다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

<33> 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한실시 형태들을설명한다. 그러나 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며， 본 발명 의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.

<34> 본 발명에 따른 관절염을 예방, 치료 또는 완화하는 조성물은 β-1,3-1,6-분 지 D-글루칸을 포함한다. 상기 β -1,3-1 ,6-분지 D-글루칸은 글루코오스가 베타- 1,3 결합한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 관절염 중 특히 골관절염 및 류마티 스 관절염의 예방, 치료 또는 완화에 효과가 있다.

<35> 상기 글루코오스는 연골세포를 자극하여 연골 형성을 촉진한다. 상기 베타-

1,3 결합을 한 글루코오스 1 내지 20 개마다 글루코오스가 1，6 결합을 한다. 상기 베타 -1,3 결합을 한 글루코오스 5 개마다 글루코오스가 1,6 결합을 한 것이 가장 바람직하다. 상기 베타— 1,3 결합 글루코오스의 사슬이 1 미만이면 연골형성 촉진 효과가 저하되고， 베타 -1,3 결합 글루코오스의 사슬이 20을 초과하면 분자량이 커 져 체내 흡수가 어려워져 연골형성 효과가 저하되므로 베타 -1，3 결합을 한 글루코 오스 1 내지 20 개마다 글루코오스가 1，6 결합을 하는 범위 내가 바람직하다. 상 기 글루코오스는 직쇄상， 측쇄상또는 환형을 이투며 결합할 수 있다.

<36> 또한， 바람직하게 상기 β -1,3-1, 6-분지 D-글루칸은 하기 화학식 I：【화학식 1】

<38> ·

<39> 과 같은 구조로 형성될 수 있다.

<41> 상기 화학식 I에서 1,6-분지 글루코오스의 잔기에는 유기산이 결합될 수 있 다. 상기 유기산으로는 젖산, 옥살산， 옥살아세트산， 푸마르산, 말산, 숙신산, 아 세트산, 부티르산, 팔미트산, 타르타르산, 아스코르브산， 요산, 술폰산, 술핀산, 페놀, 주석산， 포름산, 시트르산， 이소시트르산, 알파케토글루타르산， 호박산， 핵 산, PGAL, DPGA, PGA 등을 들 수 있다. 바람직하게, 상기 유기산은 젖산이다. 상 기 유기산은 칼슴의 흡수를촉진하고 연골세포를 활성화한다.

<42> 한편， 본 발명에 따른 조성물은 쥐， 생쥐 , 가축, 인간등의 포유동물에 다양 한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경 구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내

(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여량은 환 자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

<43> 상기 조성물의 투여는 상기 조성물 약 21.25 mg/kg 내지 85mg/kg 의 투여량 으로 투여되는 것이 바람직하다. 상기 조성물을 21.25 mg/kg 미만의 양으로 투여 하면 관절염의 치료 및 예방이 효과적으로 이루어지지 않으며， 85mg/kg을 초과하면 오히려 효과가 저하되므로, 상기 범위 내가바람직하다.

<44> 상기 조성물은 골관절염 치료제 및 류마티즘 관절염 치료제로서 사용될 수 있다. 골관절염은 연골 소실 및 관절 경직을 일으키는데, 상기 약학 조성물은 이 를 매우 효과적으로 억제하며， 경골 및 대퇴골 관절 손실 역시 매우 효과적으로 억

정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 제한다.

<45> 골관절염은 염증성 질환으로, 연골 손상 등에 의해 주위 관절의 부종이 초래 되고 관절 두께의 현저한 증가를 일으킨다[ Guo et al., 2006] . 상기 조성물은 이 러한 염증을 방지하기 위해 면역반웅세포를 현저히 증가시키며, 연골도 증가시킨 다.

<46> 류마티즘 관절염의 경우, 자가면역 체계의 이상으로 관절이 붓는데, 상기 약 학 조성물은 면역조절 또는 항염효과를 통해 류마티즘 관절염을 예방, 치료 또는 완화할 수 있다.

<47> 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제， 과립제， 정제, 캡슐제, 현탁 액， 에멀견， 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제， 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다 .

<48> 본 발명에 따른 조성물은 글루코사민， 콘드로이틴, 히알루론산， 메틸술포닐 메탄 및 크레아틴 또는 그의 적합한 유도체 및 /또는 제제 보조제 (formulation agent), 안정제， 층전제， 향미제, 염료 및 감미료와 같은 추가적인 생리 활성 성 분을 추가로 포함할 수 있다.

<49> . 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체， 부형제 및 회석제로는 락토즈， 덱스트 로즈, 수크로스， 솔비틀， 만니틀, 자일리틀, 에리스리롤， 말티를, 전분， 아카시아 고무, 알지네이트， 젤라틴, 칼슘 포스페이트， 칼슴 실리케이트， 셀롤로즈, 메틸 씰 를로즈, 미정질 샐를로스， 풀리비닐 피를리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트， 프로 필히드록시벤조에이트, 탈크， 마그네슴 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

<50> 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제 , 결합제 , 습윤제 , 붕해제, 계 면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

<51> 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡술제 등이 포 함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형 제로는, 예를 돌어, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등이 있으며, 이를 상기 고형 제제에 섞어 조제할 수 있다. 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 포함 할 수 있다.

<52> 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제, 시럽제 등이 해당 되는데, 흔히 사용되는 단순 회석제인 물, 리퀴드 파라핀 외 여러 가지 부형제， 예 를 들면 습윤제 , 감미제, 방향제， 보존제 등을 포함할 수 있다. <53> 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제， 현탁제， 유제， 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제， 현탁제로는 프로필렌글리콜

(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸을 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위템 솔 (witepsol), 마크로골， 트원 (tween) 61, 카카오지， 라우린지， 글리세로제라린 등 이 사용될 수 있다.

<54> 상기 조성물은， 상기 살펴본 바와 같이 관절염 치료제로 사용될 수 있을 뿐 만 아니라 관절염을 예방 또는 완화시키기 위한 건강보조제로도 사용될 수 있다. <??> 상기 건강보조제는 식품으로 제공될 수 있는데, 본원에서 정의되는 "건강기 능식품 "은 건강기능식품에 관한 법률 제 6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가 진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 상기 "기능성' '이라 함은, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같 은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

<56> 이 외에 본 발명에 따른 건강보조제는 여러 가지 영양제， 비타민 , 광물 (전해 질 )， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 둥)， 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제， 방부제， 글리세린, 알콜， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

<57> 본 발명에 따른 건강보조제는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며， 통상의 음료와 같이 여러 가 지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 천연 탄수 화물의 예는 모노사카라이드， 예를 들어， 포도당， 과당 등; 디사카라이드, 예를 들 어 말토스， 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린， 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리를, 소르비를， 에리쓰리틀 등의 당알콜이다. 상 술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레 바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제 (사카린， 아스파르탐 등)를 유 리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 m£당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

<58>

<59> 이하， 본원 발명의 조성물을 포함하는 일 예로서 폴리칸 (Polycan) [Glucan

Corp. Ltd., Korean]을 사용하여 골관절염 및 류마티스 관절염에 대한 효과를 도면 을 참고하여 살펴보겠다. 하기의 실험예는 본 발명을 보다 잘 이해하기 위한 것이 며, 이로써 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

<60>

【발명의 실시를 위한 형태】

<6i> 실험예 1 - 'β -1,3—1， 6-분지 D-글루칸 '의 효능 검증 방법

<62> 실험예 1-1: 실험 준비

<63> β -1,3-1 ,6-분지 D-글루칸 중 하나인 , 상업적으로 구입 가능한 폴리칸

ΤΜ

(Polycan) (1.7brix)[Glucan Corp. Ltd., KOREA]올 준비하고， 상기 폴리칸

(Polycan) 의 대조약물로서 디클로페낙 소디움 (Diclofenac sodium) [Sigma, USA]을 준비하였다. 실험 동물로는 Spr ague-Daw ley Rats(6 주령 수컷, SIX., JAPAN) [ANNEX I ~ III]을 준비하였다.

<64>

<65> 실험예 1-2: 군 분리

<66> 실험군을 총 6개 군으로 나누고， 각 군마다 상기 Spr ague-Daw ley Rats를 8 마리씩 준비하였다. 골관절염올 유발시키지 않은 래트로서 멸균 증류수를 투여한 정상군인 Sham 대조군을 마련하였다. 또한， 음성대조군으로서 골관절염 유발 후 아무런 처리를 하지 않은 0A 대조군과， 양성대조군으로서 골관절염 유발 후 2mg/kg 의 디클로페낙 소디움 투여군홀 준비하였다.

<67> 처리군으로서 골관절염을 유발한 후 각각 다른 농도인 폴리칸 85 mg/kg,

42.5 mg/kg, 및 21.25 mg/kg로 처리한폴리칸투여군을 준비하였다.

<68>

<69> 실험예 1-3: 투여

<70> 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 을 매일 84 일간 경구 투여하였다. 상기 투여시 멸균 증류수를 매체로 사용하였으며， 5ml/kg으로 투여하였다. 또한， 상기 풀리칸을 배양액에 희석하여 kil/kg의 농도로 단회 관절낭 내에 주입하였다.

<71> 양성 대조군에 상기 디클로페낙 소디움 2mg/kg을 매일 84 일간 경피 투여하 였으며， 생리 식염수를 매체로 사용하여 lml/kg으로 투여하였다. 배양액에 회석된 상기 폴리칸의 주입은 골관절염 유발 1 주일 후 실시하였으며, 디클로페낙 소디움 역시 골관절염 유발 1 주일 후부터 투여를 시작하였다.

<72> <73> 실험예 1—4: 골관절염의 유발

<74> 상기 실험 동물인 마우스를 졸레틸 (Zoletile 50； Vir bac Lab. , France)로 마취한 다음 왼쪽 관절낭을 노출하고, Anterior cruciate ligament transaction 및 partial medial meniscectomy를 실시하여 골관절염을 유발하였다. Sham 수술군에 서는 관절낭을 절제하여 장기 안쪽의 반월판 (medial meniscus)을 확인한 다음 절제 하지 않고 관절낭을 폐쇄하였다.

<75>

<76> 실험예 1—5: 관찰

<77> 투여일부터 84 일간의 체중 , 슬관절 두께의 변화를 1 주일에 한번씩 측정하 여 관찰하였으며 , 최종 희생일에 슬관절의 최대 신장각도 및 capsule 노출 후 슬관 절 두께를 각각 측정하였고, Safranin 0 염색 하에 대퇴골 및 경골의 Makin score 와 연골의 두께를 각각 조직형태계측 (histomorphometry)적으로 측정하였으며 , 대퇴 골 및 경골 관절면의 연골에서 각각 BrdU면역반응성 역시 평가하였다.

<78>

<79> 실험예 2 - 'β— 1,3-1,6-분지 D-글루칸 '(폴리칸 )의 골관절염에 대한 효능 분석

<80> 실험예 2-1: 체중의 변화

<81> 도 1에 나타난 바와 같이， 실험예 1과 같이 한 결과, 전 실험 기간 동안 정 상군 (Sham 대조군) 및 음성대조군 (OA 대조군)에서 의미있는 체중 및 증체량의 변화 는 인정되지 않았다. 84 일간의 증체량이 OA 대조군에서는 Sham 대조군에 비해 -0.82%의 변화를 나타내었으며， 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg투여군에서는 각각， OA 대조군에 비해 -2.98, 1.76， 7.76 및 8.88% 변 화를 나타내었다.

<82>

<83> 실험예 2-2: 슴관절 두께의 변화

<84> 도 2를 참조하면, 골관절염 대조군 (OA 대조군)의 경우， 정상 대조군 (Sham 대 조군)에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 유발 슬관절 두께의 증가가 각각 투여일부터 관 찰되었다. 한편 상기 세 가지 용량의 폴리칸 및 디클로페낙 소디움 투여군에서는 각각 투여 21일 후부터 골관절염 유발 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 슬관절 두께의 감소가 인정되었다. 최종 부검시 술관절의 두께는 OA 대조 군에서는 Sham 대조군에 비해 18.66%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2mg/kg, 폴리칸 85， 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 -5.79, -5.61, -4.28 및 -5.74% 변화를 나타내었다.

<85>

<86> 실험예 2-3: Capsule 노출 후 슴관절 두께의 변화

<87> 모든 OA 유발군에서는 Sham 대조군과 비교하여 유의성 있는 (p< 0.01) capsule 노출 후 관절 두께의 증가가 각각 인정되었고， 디클로페낙 소디움 및 모든 폴리칸 투여군에서는 골관절염 유발 대조군과 유사한 두께를 각각 나타내었다. Joint capsule 노출 후 슬관절의 두께는 OA 대조군에서는 Sham 대조군에 비해 15.40%의 변화를 나타내었으며， 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85， 42 .5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 -0.99， -2.77, -1.00 및 -2.17% 변화를 나타내었다.

<88>

<89> 실험예 2-4: 슴관절 최대 신장각도

<90> 도 3을 참조하면， 0A 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 유의성 있는

(p<0.01) 슬관절 최대 신장각도의 증가가 인정되었으나, 모든 폴리칸 처리군 및 디 클로페낙 소디움 투여군에서는 0A 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 슬관절 최대 신장 각도의 감소가 각각 인정되었다. 슬관절 최대 신장 각도는 0A 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 159.39%의 변화를 나타내었으며 , 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 —18.18, -18.52, -28. 96 및 -24.07% 변화를 나타내었다.

<91>

<92> 실험예 2-5： Mankin score

<93> Mankin score는 관절염의 정도를 나타내는 수치로서， 신장각, 통증, 발열， 두께 등을 포괄하여 수치로 나타낸 값으로， 수치가 적을수록 정상에 가까운 것이 다. 도 4를 참조하면， 0A 대조군에서는 Sham 대조군에 비해 유의성 있는 (ρθ.01) 경골 및 대퇴골 관절면 연골의 Mankin score의 증가가 각각 인정되었으나, 모든 폴 리칸 처리군 및 디클로페낙 소디움 투여군에서 0A 대조군에 비해 현저한 대퇴골 및 경골 Mankin score의 감소가 각각 인정되었다.

<94> 대퇴골의 mankin score는 OA 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 1216.67%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85， 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 0A 대조군에 비해 -27.85， -36.71, -48.10 및 -31.65% 변 화를 나타내었다. <95> 경골의 mankin score는 OA 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 2166.67%의 변 화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2mg/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 -20.59, -29.41, -27.94 및 -20. 59% 변화를 나타내었다.

<96>

<97> 실험예 2-6: 연골 두께의 변화

<98> 도 5를 참조하면, OA 대조군에서는 Sham 대조군에 비해 유의성 있는

(p<0.01) 경골 및 대퇴골 관절면 연골 두께의 감소가 각각 인정되었으나， 모든 폴 리칸 처리군 및 디클로페낙 소디움 투여군에서 OA 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 경골 및 대퇴골 연골 두께의 증가가 폴리칸 21.25 mg/kg 투여군을 제외하 고 각각 인정되었다.

<99> 한편, 출리칸 21.25 mg/kg 투여군에서도 OA 대조군에 비해 유의성 있는

(p<0.01) 대퇴골 연골 두께의 증가가 인정되었으며， 경골 연골 두께 역시 증가를 나타내었다.

<ιοο> 대퇴골 관절면의 연골 두께는 OA 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 -46.78% 의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 35.11, 71.84, 86.87 및 69.38% 변화를 나타내었다.

<ιοι> 대퇴골 관절면의 연골 두께는 OA 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 -61.99% 의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85， 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 68.81， 96.23, 79.51 및 18.74% 변화를 나타내었다.

<102>

<|03> 실험예 2-7: BrdU 면역 반음성의 변화

<104> 도 6을 참조하면， OA 대조군에서는 Sham 대조군에 비해 유의성 있는

(p<0.01) 경골 및 대퇴골 관절면 연골의 BrdU 면역반응 세포수의 감소가 각각 인정 되었으나， 폴리칸 85 및 42.5 mg/kg 투여군에서는 OA 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 ) BrdU 면역반응성을 나타내는 연골세포의 수적 증가가 경골 및 대퇴골 관 절면 연골에서 각각 인정되었다.

<105> 한편 디클로페낙 소디움 투여군에서는 OA 대조군과 유사한 BrdU 면역반웅 세 포수가 경골 및 대퇴골에서 각각 인정되었고, 폴리칸 21.25 mg/kg 투여군에서는 OA 대조군에 비해 현저한 BrdU 면역반웅 세포의 증가가 경골 관절 연골에서 인정되었 으며 , 대퇴골 관절 연골에서는 OA 대조군과 유사한 세포수가 인정되었다 .

<106> 대퇴골 관절면 연골에서 BrdU 면역반웅 세포의 수는 OA 대조군의 경우 Sham 대조군에 비해 -82.69%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 ig/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 9.52, 239.68, 207.94 및 6.35% 변화를 나타내었다.

<107> 경골 관절면 연골에서 BrdU면역반웅 세포의 수는 OA 대조군의 경우 Sham 대 조군에 비해 -80.43%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움 2 mg/kg, 폴리칸 85, 42.5 및 21.25 mg/kg 투여군에서는 각각 OA 대조군에 비해 1.56, 259.38, 245.31 및 57.81% 변화를 나타내었다.

<108>

<109> 실험예 3: 'β-1,3— 1,6-분지 D-글루칸 '(폴리칸 )의 류마티즘 치료 효능 검증 실험

<ιιο> 실험예 3-1: 조직 처리

<π ι> 가슴샘 및 비장의 주변 결합 조직을 분리하여 10%증성 포르말린에 고정시킨 다음， 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고， 3~4 ^의 종방향 (longitudinal) 절편을 제작하여 Hematoxyl ineosin 염색을 실시하고， 광학현미경 하에서 관찰하였다.

<Π2> 또한, 양측 후지의 슬관절 (Knee joint) 역시 주변 결합조직을 분리하여 10% 중성 포르말린에 고정시킨 다음, 탈회액 [24.4% formic acid, 및 0.5N sodium hydroxide]올 이용하여 5 일 동안 탈회시키고， 일반적인 방법으로 탈수 및 파라핀 포매를 실시하고， 3~4 an의 종방향 (longitudinal) 절편을 제작하여 Hematoxylineosin 염색을 실시하고 광학현미경 하에서 관찰하였다.

<113>

<i i4> 실험예 3-2: HISTQMQRPH0METRY

<| |5> 폴리칸이 콜라겐으로 유발된 류마티즘 관절염 (RA) DBA마우스의 면역 이상에 미치는 영향을 평가하기 위해, 가슴샘 전체 및 피질의 두께, 비장 전체 및 백색 수 질의 직경， 백색 수질의 단위 면적 (1画 ²) 당 수를 40 배 현미경 시야에서 자동영상 분석장치 (DMI-300 Image Processin g; DMI , Korea)를 이용하여 각각 측정하였으며 , 이전의 방법 [Dudler et al . , 2000; van Holten et al . , 20 04； Kim et al . , 2007] 에 따라 슬관절의 대퇴골 및 경골 관절면 연골의 두께, 프로테오글리칸 (proteoglycans) 소실 정도 및 침식 (erosion)을 각각 100 배 현미경 시야에서 자동 영상분석장치 (DMI-300 Image Processing; D MI, Korea)를 이용하여 평가하였다.

<ι ΐ6> 프로테오글리칸의 소실 정도는 이전의 방법들 [Williams et al . , 1992；

Dudler et al. , 2000； van Holten et al. , 2004]에 따라 프로테오글리칸 (proteoglycans) 특수 염색인 Safranin 0 염색성을 3 등급으로 구분하여 평가하였 다. 즉, 프로테오글리칸의 소실이 없는 경우를 0， 완전 소실되어 전혀 염색성을 나타내지 않는 경우를 3으로 평가하였다.

<ι ΐ7> 관절 연골면의 손상 정도 역시 이전의 방법들 [Willi ams et al., 1992； van

Holten et al. , 2004； Kim et al.,2007]에 따라 침식 (erosion)이 전혀 인정되지 않 는 경우를 0， 심한 침식 (erosion)에 의해 골 조직의 손상까지 일어난 경우를 4로 하여， 4 등급으로 구분하여 평가하였다.

<118>

<| |9> 실험예 3-3: 동물 모델

<|20> 콜라겐을 이용한 RA 유발 마우스 모델은， 현재 여러 가지 물질들의 RA에 대 한 효력 평가에 가장 널리 이용되고 있는 동물 모델 중 하나로 [Liu et al., 2008； Miyake et al. , 2008； Pa nayi et al.,2008], 자가면역에 의한 RA의 유발이 초래된 다. 따라서 , 콜라겐 유발 RA시 가슴샘과 비장의 임파구 증가 등 전형적인 면역증 가가 일어나는 것으로 알려져 있다 [Agata et al., 2000； Chen and Wei, 2003 ； Zhang et al. , 2004] . 그러므로， 상기 콜라겐을 이용한 RA 유발 마우스의 가슴샘 과 비장을 관찰하여 본원 발명의 효과를 분석하였다.

<121>

<122> 실험예 3-4 ： 동물 모델의 가슴샘과 비장 분석 ᅳ

<123> 상기 실험예에 의한 결과， 디클로페낙 소디움 및 폴리칸 85 mg/kg 투여군에 국한하여 가슴샘 피질 두께의 유의성 없는 증가가 인정되었으나, 가슴샘에서는 정 상 대조군 (Sham 대조군)과 비교하여 유의성 있는 변화가 모든 RA 유발군에서 인정 되지 않았다 .

<124> 한편， 도 7 및 도 8을 참조하면, 비장에서는 정상 대조군에 비해 유의성 있 는 (ρθ.01) 비장 전체 및 백색 수질 직경 증가와， 현저한 백색 수질의 수적 증가, 즉 비장의 비대 및 임파구 증생이 RA 유발 대조군 (RA 대조군)에서 인정되었다. 이러한 비장의 비대는 상기 세 가지 용량의 모든 폴리칸 투여에 의해 현저히 억제 되는 것으로 관찰된 반면， 디클로페낙 소디움 투여군에서는 RA 대조군에 비해 오히 려 유의성 있는 (ρθ.01) 비장 전체 두께의 증가를 나타내었다.

<125> 이러한 디클로페낙 소디움의 효과는 투여 경로가 경구가 아닌 주사 경로를

취한 결과, 염증 반웅성의 증가에 의한 이차적인 증가로 판단되고, 폴리칸은 면역 조절 효과의 결과로 판단된다.

<126> 본 실험의 결과， 폴리칸 21.25 mg/kg 투여군과 42.5 mg/kg 투여군에서는 명

백한 용량 의존성이 인정되었으나, 85 mg/kg 투여군에서는 42.5 mg/kg 투여군과 유 사하거나 다소 감소된 효과가 인정되었다.

<127> 가슴샘 전체 두께는 RA 대조군에서 정상 대조군에 비해 2.84%의 변화를 나타

내었으며, 디클로페낙 소디움, 폴리칸 21.25， 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 -2.80， 1.45, 6.17 및 4.85%의 변화를 각각 나타내었다.

<128> 가슴샘 피질의 두께는 RA 대조군에서 정상 대조군에 비해 4.37%의 변화를 나

타내었으며， 디클로페낙 소디움, 폴리칸 21.25, 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 18.83， 4.37, 9.82 및 16.30%의 변화를 각각 나타내었다. 아울러, 하기 표 1을 참조하면 처리군에서 가슴샘의 전체 두께 및 피질의 두께가 증가되고 ¬으으 O Ol rJ.

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<129> 【표 1】

<130>

<i3i> 비장 전체 두께는 RA 대조군에서 정상 대조군 (Sham 대조군)에 비해 24.32%

의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움, 폴리칸 21.2 5, 42.5 및 85 mg/kg 투 여군에서는 RA 대조군에 비해 17.49, -6.71, -11.12 및 -10.44%의 변화를 각각 나 타내 었다.

<132>

<133> 실험예 3-5 ： 동물 모델의 비장 백색 수질 분석

<134> 비장 백색 수질의 수는 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해 19.40%의 변화를

나타내었으며， 디클로페낙 소디움, 폴리칸 21.25, 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는

RA 대조군에 비해 5.00, -6.25， -5.00 및 -13.75%의 변화를 각각 나타내었다. <i35> 비장 백색 수질의 직경은 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해 24.09%의 변화 를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움， 폴리칸 21.25, 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서 는 RA 대조군에 비해 -8.14, -16.99， -22.65 및 -22.01%의 변화를 각각 나타내었 다. 아울러， 하기 표 2를 참조하면， 처리군의 전체 두께, 백색 수질의 수 및 백색 수질의 두께가 감소하는 것을 알 수 있다.

<136> 하기 표에서는 8 마리 동물 모델의 土 SD (평균士표준편차로 변경) 값으로 나 타내었으며 , 'pO.Ol 및 "pO.05로서 Sham 대조군과 비교하였다. ^† ρθ.01 류마티즘 관절염 대조군 (RA 대조군)과 비교하였다.

<137> 【표 2】

<138>

<i39> 실험예 3—6: 프로테오글리칸 소실 및 침식 (erosion) 분석

<140> 콜라겐 유발 관절염에서는 조직학적으로 관절 연골의 프로테오글리칸의 소실 과 이에 따른 침식 (erosion), 즉 전형적인 RA가 관찰되는 것으로 알려져 있다 [Williams et al . , 1992； Dudler et al. , 2000； van Hoi ten et al., 2004； Kim et al., 2007] . 본 실험의 결과에서도, 정상 대조군 (Sham 대조군)에 비해 유의성 있 는 (ρθ.01) 슬관절의 대퇴골 및 경골 관절면 연골의 프로테오글리칸의 감소， erosion score의 증가 및 연골 두께 자체의 감소가 RA 유발 대조군에서 각각 인정 되었다.

<i4i> 한편， 도 9 및 도 10을 참조하면, 이러한 콜라겐 유발 RA 소견이 21.25 mg/kg 투여군의 경골을 제외한 모든 폴리칸 투여군에서 투여 용량 의존적으로 현저 히 억제되었으며, 폴리칸 2ᄂ 25 mg/kg 투여군에서도 유의성 있는 (p<0.05) 프로테 오글리칸의 소실의 억제가 인정되었으나, erosion score 및 경골 관절 연골의 두께 는 RA 대조군과 유사하게 관찰되었다.

<142> 반면, 디클로페낙 소디움 투여에 의해서도 콜라겐 유발 RA 소견이 현저히 억 제되었다. 디클로페낙 소디움은 비스테로이드계 항염증제로， 프로스타글란딘 합성 억제에 의한 콜라겐 유발 RA에 대한 효과는 이미 잘 알려져 있으며， 여러 가지 물 질의 항 RA 효과 평가에 비교 약물로 사용되어 왔다 [Sanchez-Pernaute et al. , 1997； Rordorf et al., 2005] .

<143>

<144> 실험예 3-7: 동물모델의 대퇴골 관절연골 분석

<145> 대퇴골 관절연골의 Safranin 0 score 는 RA 대조군에서 정상 대조군 (Sham 대 조군)에 비해 1000.00%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움, 폴리칸 21.25, 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 -63.64, -36.36, -63.64 및 -59.09%의 변화를 각각 나타내었다.

<146> 대퇴골 관절 연골의 erosion score는 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해

400.00%의 변화를 나타내었으며， 디클로페낙 소디움， 폴리칸 21.25， 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 -36.00， -20.00, -44.00 및 -44.00%의 변화 를 각각 나타내었다.

<147> 대퇴골 관절 연골의 두께는 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해 -43.79%의 변 화를 나타내었으며 , 디클로페낙 소디움， 플리칸 21.25， 42.5 및 85 mg/kg 투여군에 서는 RA 대조군에 비해 333.70， 21.12, 44.14 및 64.65%의 변화를 각각 나타내었 다.

<148> 하기 표 3을 참조하면, 처리군은 대조군에 비하여 Safranin 값， erosion 값 및 경골 관절 연골의 두께는 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다. 또한, 하기 표 는 16 관절의 士 SD로서 나타내었으며, ρθ.01 및 "p<0.05로서 Sham 대조군과 비교 하였다. ^† p<0.01 류마티즘 관절염 대조군 (RA 대조군)과 비교하였다.

<149> 【표 3】 Group Safranin 값 erosion 값 경골 관절 연골의

(Max = 3) (Max = 3) 두께 (隱)

Sham 대조군 0.125±0.342 0.313±0.479 0.193±0.030

RA 대조군 1.375士 0.957* 1.563士 1.094' 0.108土 0.025' 디클로페낙 소디움 0.500士 0.577 1.000士 0.000" 0.470±0.674^†† 처리군

폴리칸 21.25 mg/kg 0.875±0.71 9^* 0.250±0.683' 0.131土 0.030'^t† 폴리칸 42.5 mg/kg 0.500士 0.516^† 0.875士 0.500" 0.156±0.024'^† 폴리칸 85 mg/kg 0.563±0.629^†† 0.875土 0.691" 0.178±0.046^†

<150>

<i5i> 실험예 3—8 ： 동물 모델의 경골 관절 연골 분석

<152> 경골 관절 연골의 Safranin 0 score 는 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해

209.09%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움， 폴리칸 21.25， 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 —29.41， -29.41, -50.00 및 -73.53%의 변화 를 각각 나타내었다.

<153> 경골 관절 연골의 erosion score는 RA 대조군에서 Sham 대조군에 비해

966.67%의 변화를 나타내었으며, 디클로페낙 소디움, 풀리칸 21.25， 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서는 RA 대조군에 비해 -75.00, -6.25, -46.88 및 -46.88%의 변화 를 각각 나타내었다.

<154> 경골 관절 연골의 두께는 RA 대조군에서 정상 대조군에 비해 -43.00%의 변화 를 나타내었으며， 디클로페낙 소디움 폴리칸 21.25, 42.5 및 85 mg/kg 투여군에서 는 RA 대조군에 비해 38.75， 0.67, 14.0 8 및 36.64%의 변화를 각각 나타내었다.

<\55> 하기 표 3을 참고하면， 처리군은 류마티즘 대조군 (RA 대조군)에 비하여

Safranin 값 및 erosion 값은 감소하는 추세를 보였으며， 경골 관절 연골의 두께는 증가하는 것을 알 수 있다. 또한, 하기 표는 16 관절의 士 SD로서 나타내었으며， p<0.01 및 "p<0.05로서 Sham 대조군과 비교하였다. ^†p<0.01 류마티즘 관절염 대조 군 (RA 대조군)과 비교하였다.

<156> 【표 4】 Group Saf ranin 값 erosion 값 경골 관절 연골의

(Max = 3) (Max - 4) 두께 (画)

Sham 대조군 0.688士 0.704 0.188±0.403 0.213±0.038

RA 대조군 2.125±0.885' 2.000士1.265 0.122士 0.050' 디클로페낙 소디움 1.500士 0.577 0.500士 1.000 0.169士 0.024^†† 처리군

폴리칸 21.25 mg/kg 1.500土 0.966^*†† 1.875士 1.455 0.122士 0.038' 폴리칸 42.5 mg/kg 1.063士 0.929^† 1.063士 0.929 0.139·士 0.043' 폴리칸 85 mg/kg 0.563±0.629^† 1.063土 0.998 0.166±0.043'^†

<157>

<158> 실험예 4 - 'β-1,3-1,6-분지 D-글루칸 '(폴리칸 )의 독성실험

<159> 실험예 4-1: 마우스 준비

<160> 6 주령의 수컷 ICR 마우스와 암컷 ICR 마우스 (Charles River, Japan) 각각

20 마리를 준비하였다. 상기 마우스를 20~25^°C의 온도, 30~35%의 습도에서 폴리카 보네이트 케이지 마다 5 마리씩 넣어두었다. 낮과 밤의 사이클을 12시간: 12시간으 로 하였다. 또한， 제한을 두지 않고 물을 공급하였으며, 모든 쥐들은 희생시키기 전까지 밤 동안은 굶겼다.

<161>

<!62> 실험예 4-2: 시험물 및 배합

TM

<163> 폴리칸 (Glucan Corp. Ltd. , Korea)은 갈색을 면 점액질이지만 균일한 용액 이다. 상기 폴리칸을 4^°C의 냉장실에 보관하였다. 수컷 및 암¾ 마우스의 그룹 마다 각각 1000, 500 및 250 mg/kg으로 시험물을 경구투여하였다. 마우스들은 하 기 표 5와 같이 그룹을 나누고 번호를 붙였다.

<164> 【표 5】

<165> <166> 실험예 4-3: 통계학적 분석

<167> LD₅₀은 Probit 방법으로 계산되었다. 통계학적 분석은 Window에 사용되는

SPSSCRe lease 6.1.3, SPSS Inc. , USA)를 사용하여 수행되었다.

<168>

<169> 실험예 4-4: 결과

<170> 표 5에서 나타난 조건과 같이 각각의 투여량을 달리하여 경구 투여한 모든 마우스들의 날짜 경과에 따른 생존을을 하기 표 6에 나타내었다.

<171> 【표 6】

<172>

<173> 표 6을 살펴보면， 상기 암컷과 수컷 마우스들이 모두 살아남은 것을 알 수 있다. 그러므로 폴리칸을 경구 투여한 후의 암컷 및 수컷 마우스 모두의 LD₅₀ 및 근사치 LD는 1000 mg/kg이 넘는 것으로 산정되었다.

<174>

<175> 본 발명은 상술한 실시 형태 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니며 첨부된 청구범위에 의해 그 범위가 정해진다. 따라서, 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가 진 자에 의해 다양한 형태의 치환， 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발 명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims

【청구의 범위]

【청구항 1]

β -1,3-1, 6-분지 D-글루칸을 포함하는, 관절염의 치료, 예방 또는 완화에 효 과적인 조성물.

【청구항 2】

제 1 항에 있어서, 상기 β-1,3-1,6-분지 D-글루칸은 하기 식 I：

(I)

로 표현되고， 상기 식 I 중 1,6—분지 글루코오스의 잔기에 유기산이 결합된 것을특징으로 하는조성물.

【청구항 3】

제 1 항에 있어서, 상기 β -1,3-1 ,6-분지 D-글루칸은 글루코오스가 베타 -1,3 결합하고, 상기 글루코오스 1 내지 20 개 마다 글루코오스가 1,6 결합을 하되 , 상 기 1,6 결합을 한글루코오스는 유기산과 결합한조성물.

【청구항 4】 '

제 2 항 또는 제 3 항에 있어서. 상기 유기산은 젖산， 옥살산， 옥살아세트 산， 푸마르산, 말산, 숙신산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산， 타르타르산， 아스코 르브산, 요산, 술폰산， 술핀산, 페놀, 주석산, 포름산， 시트르산, 이소시트르산， 알파케토글루타르산, 호박산， 핵산ᅳ PGAL, DPGA, 및 PGA로 이루어진 그룹에서 선택 되는 것을특징으로 하는 조성물.

【청구항 5】

제 4항에 있어서, 상기 유기산은 젖산인 것을 특징으로하는조성물.

【청구항 6】

제 1 항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서， 상기 관절염은 골 관절염 또 는 류마티즘 관절염인 것을특징으로 하는 조성물.

정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR

【청구항 7】

제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는， 관절염을 치료, 예방 또는 완화하기 위한 관절염 치료제.

【청구항 8】

제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는， 관절염의 치료， 예방 또는 완화에 효과적인 건강보조제.

【청구항 9]

제 8 항에 있어서， 상기 건강보조제는 건강보조식품인 건강보조제.

【청구항 10]

제약학적 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 7 항에 따른 관절염 치료제를 투여하는 것을 포함하는 관절염의 치료， 예방 또 는 완화 방법 .

【청구항 111

제 10 항에 있어서， 상기 관절염은 골관절염 또는 류마티즘 관절염인 관절염 의 치료， 예방 또는 완화 방법ᅳ

【창구항 12]

제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 조성물 또는 치료제를 21.25 mg/kg 내지 85 mg/kg의 투여량으로 투여하는 관절염의 치료, 예방 또는 완화 방법.