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WO2011125750A1 - バイオセンサ - Google Patents

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Publication number
WO2011125750A1
WO2011125750A1 PCT/JP2011/058030 JP2011058030W WO2011125750A1 WO 2011125750 A1 WO2011125750 A1 WO 2011125750A1 JP 2011058030 W JP2011058030 W JP 2011058030W WO 2011125750 A1 WO2011125750 A1 WO 2011125750A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reaction layer
layer
biosensor
reaction
electrode
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/058030
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直秀 西脇
翔一 宮本
顕嗣 稲川
博宣 村瀬
Original Assignee
シーシーアイ株式会社
有限会社アルティザイム・インターナショナル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シーシーアイ株式会社, 有限会社アルティザイム・インターナショナル filed Critical シーシーアイ株式会社
Priority to KR1020127025698A priority Critical patent/KR101727630B1/ko
Priority to EP11765650.4A priority patent/EP2554982B1/en
Priority to CA2794887A priority patent/CA2794887C/en
Priority to ES11765650.4T priority patent/ES2533375T3/es
Priority to CN201180017947.8A priority patent/CN102959392B/zh
Priority to JP2012509520A priority patent/JP5950816B2/ja
Priority to US13/637,833 priority patent/US8852413B2/en
Publication of WO2011125750A1 publication Critical patent/WO2011125750A1/ja
Priority to HK13109673.0A priority patent/HK1182444A1/xx

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor, particularly a biosensor for measuring neutral fat concentration.
  • the present invention relates to a biosensor capable of quickly quantifying the concentration of a specific component in a specific sample such as a biological sample using an enzyme reaction, and more particularly to a biosensor for measuring neutral fat concentration.
  • Biosensors have been applied in fields such as medicine.
  • Biosensors are various chemical substances ranging from low molecules to macromolecules, and biosensors having various functions are being developed according to the measurement objects.
  • biosensors that can easily quantify specific components (substrates) contained in biological samples and foods without dilution or stirring are known.
  • an enzyme reaction layer in which an electrode system having at least a working electrode and a counter electrode is formed on an insulating substrate, and an oxidoreductase and an electron acceptor are immobilized on the electrode system with a fixing agent such as a hydrophilic polymer.
  • a biosensor has been proposed in which a filtration layer (blood cell removal layer) is provided on the enzyme reaction layer, and a cover is covered from the filtration layer.
  • This biosensor quantifies the substrate concentration in the sample by the following method.
  • a sample solution such as blood is dropped onto the filtration layer, and the filtrate penetrates into the enzyme reaction layer.
  • the oxidoreductase and the electron acceptor are dissolved in the sample solution, and the enzyme reaction proceeds between the substrate and the enzyme.
  • This enzymatic reaction oxidizes the substrate and simultaneously reduces the electron acceptor.
  • the reduced electron acceptor is electrochemically oxidized, and the substrate concentration in the sample solution is obtained from the oxidation current value obtained at this time.
  • a method for quantifying neutral fat in a sample as described below is known.
  • the neutral fat contained in the sample solution is decomposed into free fatty acid and glycerol by, for example, lipoprotein lipase (LPL).
  • LPL lipoprotein lipase
  • Glycerol produced here is glycerol kinase (GK) and glycerol-3-phosphate oxidase (GPO) or glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) as shown in the following formulas (1) and (2).
  • GK glycerol kinase
  • GPO glycerol-3-phosphate oxidase
  • GPDH glycerol-3-phosphate dehydrogenase
  • glycerol can be quantified by measuring the decrease of the oxidized electron acceptor, the increase of the reduced electron acceptor or the amount of dihydroxyacetone phosphate represented by the following formula.
  • glycerol can be quantified by electrochemically measuring the increased amount of reduced electron acceptor.
  • LPL lipoprotein lipase
  • GK glycerol kinase
  • GPO glycerol-3-phosphate oxidase
  • Patent Document 1 a biosensor that reduces the cost of an enzyme by using two types of enzymes, ie, a neutral lipolytic enzyme and glycerol dehydrogenase (GLDH), as an enzyme used for a neutral lipolytic reaction.
  • a neutral lipolytic enzyme ie, a neutral lipolytic enzyme and glycerol dehydrogenase (GLDH)
  • GLDH glycerol dehydrogenase
  • NAD + -dependent glycerol dehydrogenase NAD + -dependent glycerol dehydrogenase as shown in the following formula (3) is known as a method using one type of enzyme without being affected by dissolved oxygen.
  • the biosensor of Patent Document 2 has a structure in which two reaction layers of a polymer layer containing GLDH and a hydrophilic polymer and a filter paper layer carrying neutral lipolytic enzyme on the filter paper are sequentially laminated on the electrode. .
  • the biosensor of Patent Document 3 has a structure in which two reaction layers of a polymer layer containing GLDH and a hydrophilic polymer and a nonwoven fabric layer carrying a neutral lipolytic enzyme are sequentially laminated on the electrode. It is characterized by.
  • the measurement time is 2 minutes in the example (paragraph “0100” in Patent Document 2 and paragraph “0100” in Patent Document 3), and the measurement time is still sufficient.
  • a biosensor that can be measured in a shorter time is not desired.
  • an object of the present invention is to provide a biosensor capable of measuring the concentration of a specific component such as neutral fat in a sample in a short period of time.
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems.
  • the reaction layer is formed by applying a solution containing lipolytic enzyme directly on the layer containing oxidoreductase to form a layer containing lipolytic enzyme It was found that the reaction rate by the two enzymes can be improved by adopting the structure. Based on the above findings, the present invention has been completed.
  • the above-described object is to provide a bio, which has an insulating substrate, an electrode system including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode system.
  • the sensor wherein the sample supply unit is formed on the electrode system and includes pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD), or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • a second reaction layer formed by applying a solution containing a lipolytic enzyme on the first reaction layer.
  • the target component concentration can be measured in a short time.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG. 3.
  • 3 is a graph showing measurement results of neutral fat concentration in whole blood of Examples 1 and 2 and a comparative example. It is a graph showing the measurement result of the neutral fat density
  • the present invention is a biosensor having an insulating substrate, an electrode system including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode system.
  • the sample supply unit includes an oxidoreductase formed on the electrode system and including pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD), or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group.
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • a first reaction layer also referred to herein simply as “first reaction layer”
  • second reaction layer formed by applying a solution containing a lipolytic enzyme on the first reaction layer.
  • a biosensor having a reaction layer including a reaction layer (also simply referred to herein as a “second reaction layer”).
  • the reaction layer has a two-layer structure including a first reaction layer containing an oxidoreductase and a second reaction layer containing a lipolytic enzyme.
  • the second reaction layer is composed of a lipolytic enzyme. It is characterized by forming by directly apply
  • a biosensor in which the above two enzymes are mixed to form a single layer as described in Patent Document 1, and an oxidoreductase and a hydrophilic polymer as described in Patent Documents 2 and 3 A biosensor having a two-layer structure in which a neutral lipolytic enzyme is separately supported on a carrier layer such as a filter paper or a nonwoven fabric and the filter paper layer or the nonwoven fabric layer is provided on the polymer layer has been reported. .
  • an oxidoreductase such as glycerol dehydrogenase (GLDH) is generally less soluble than a lipolytic enzyme, which affects the lipolytic enzyme.
  • GLDH glycerol dehydrogenase
  • a solution containing a lipolytic enzyme is applied on the first reaction layer containing the oxidoreductase to directly form the second reaction layer. Therefore, when a sample containing fat such as neutral fat passes through the sample supply section, the lipolytic enzyme in the second reaction layer is highly soluble, so when it comes into contact with the sample, it quickly dissolves and the fat in the sample is removed. Decomposes to produce free fatty acids and glycerol. This reaction is completed in about the same time as the dissolution of the lipolytic enzyme is completed. Next, since the oxidoreductase exists as the first reaction layer between the second reaction layer and the electrode, the lipolytic enzyme in the second reaction layer starts to dissolve after the dissolution is completed.
  • the lipid-degraded sample quickly penetrates into the first reaction layer, dissolves the oxidoreductase, generates a reduced electron carrier from the produced glycerol, and uses the increased amount of the reduced electron carrier as an electric charge. Measure chemically. For this reason, according to the biosensor of the present invention, fat in a sample can be quantified in a short time.
  • the mechanisms of Patent Documents 1 to 3 and the mechanism of the present invention are inferences, and the present invention is not limited by the mechanism.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing an embodiment of the biosensor of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG.
  • the biosensor shown in FIGS. 1 and 2 is also referred to as a “first biosensor”.
  • an electrode system including a working electrode 2, a reference electrode 3, and a counter electrode 4 is formed on an insulating substrate 1 (also simply referred to as “substrate” in the present specification).
  • the said electrode system should just contain a working electrode and a counter electrode at least. For this reason, the reference electrode 3 can be omitted.
  • the adhesive 6 is installed at the end on the insulating substrate 1.
  • the working electrode 2, the reference electrode 3 and the counter electrode 4 function as means for electrically connecting the biosensor.
  • the working electrode 2, the reference electrode 3, and the counter electrode 4 can form electrodes having a desired pattern by appropriately referring to or combining conventionally known knowledge such as screen printing / sputtering method.
  • An insulating layer 5 is formed on the working electrode 2, the reference electrode 3 and the counter electrode 4 formed on the insulating substrate 1 so as to expose the electrode system.
  • the insulating layer 5 functions as an insulating means for preventing a short circuit between the electrodes.
  • a working electrode working part 2-1, a reference electrode working part 3-1, and a counter electrode working part 4-1 are formed so as to sandwich the insulating layer 5. Then, the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 are sequentially formed on the working electrode working part 2-1, the reference electrode working part 3-1, and the counter electrode working part 4-1. Has been. In FIG. 1, the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the space S positioned between the second reaction layer 9 and the cover 7 form a sample supply unit. .
  • the first reaction layer 8 includes an oxidoreductase (hereinafter referred to as “the present invention”) containing at least pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group. Also referred to as “oxidoreductase”).
  • the present invention containing at least pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group.
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • the second reaction layer 9 is formed on the first reaction layer 8 and is formed by applying a solution containing at least a lipolytic enzyme.
  • the second reaction layer is formed by applying a solution containing a lipolytic enzyme” means that the lipid-decomposing enzyme is not supported on a carrier such as a filter paper or a non-woven fabric. It means that a coating film is formed by applying a solution containing a degrading enzyme directly to the first reaction layer and drying.
  • the action part (2-1, 3-1, 4-1) includes a potential applying means for applying a potential to the sample in the first reaction layer 8 and a sample when the biosensor is used. It functions as a current detection means for detecting the flowing current.
  • the working part (2-1, 3-1, 4-1) may be referred to as working electrode 2, reference electrode 3 and counter electrode 4.
  • the working electrode 2 and the counter electrode 4 are paired when the biosensor is used, and serve as current measuring means for measuring an oxidation current (response current) that flows when a potential is applied to the sample in the first reaction layer 8. Function.
  • a predetermined potential is applied between the counter electrode 4 and the working electrode 2 with the reference electrode 3 as a reference.
  • the biosensor of this embodiment is configured by bonding a cover 7 so as to cover the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 via an adhesive (double-sided tape) 6 installed on the substrate 1. Is done.
  • the adhesive (double-sided tape) 6 may be installed on the electrode side, may be installed only on the cover 7 side, or may be installed on both.
  • the sample supply unit further includes an electron carrier.
  • the electron carrier in such a form may be present in the sample supply unit in any form.
  • the first reaction layer 8 includes an electron carrier (an electron carrier is disposed in the first reaction layer 8)
  • the second reaction layer 9 is an electron carrier.
  • the electron carrier is arranged in the second reaction layer 9
  • a third reaction layer containing the electron carrier is further arranged, and the like. Any of these forms (a) to (c) may be applied, or two or more of the above forms (a) to (c) may be applied in combination. Of the above forms, (i) or (c) is more preferred. That is, in the biosensor of the present invention, the second reaction layer has an electron carrier (the electron carrier is disposed in the second reaction layer), or a third reaction layer including the electron carrier is further provided. More preferably.
  • a layer containing a surfactant (hereinafter also referred to as a surfactant layer) is further divided into the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9. It is preferable to provide the sample supply unit so as to separate them.
  • the arrangement of the surfactant layer is not particularly limited, but for example, the surfactant layer is preferably separated from the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 and formed on the cover side.
  • the surfactant layer is formed on the cover side, the spread and wettability of the sample such as whole blood to the cover side is improved and the sample is supplied to the sample as compared with the case where the cover 7 directly touches the sample.
  • the cover 7 directly touches the sample.
  • the third reaction layer having the electron carrier is further separated from the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9. Further, it is preferable to provide the sample supply unit.
  • the arrangement of the third reaction layer is not particularly limited.
  • the third reaction layer is separated from the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 and formed on the cover side. Is preferred.
  • the biosensor of the present invention including the third reaction layer, an electrode including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate and the insulating substrate.
  • a sample supply unit formed on the electrode system, wherein the sample supply unit is formed on the electrode system, and pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a prosthetic group, It is formed by applying a first reaction layer containing an oxidoreductase containing flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN), and a solution containing a lipolytic enzyme on the first reaction layer.
  • a second reaction layer, and a third reaction layer containing an electron carrier is disposed in a form separated from the first reaction layer and the second reaction layer.
  • FIG. 3 is an exploded perspective view showing another embodiment of the biosensor of the present invention including the third reaction layer.
  • 4 is a cross-sectional view of the biosensor of FIG.
  • the biosensor shown in FIGS. 3 and 4 is also referred to as a “second biosensor”.
  • the basic structure further includes a third reaction layer 10 containing an electron carrier (ie, in addition to the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9,
  • the biosensor shown in FIGS. 1 and 2 is the same except that the three reaction layers 10 are disposed. That is, the side formed on the cover 7 side is referred to as the third reaction layer 10, and the side formed on the electrode side is sequentially referred to as the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 from the electrode side. At this time, the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, the third reaction layer 10, and the space portion disposed between the second reaction layer 9 and the third reaction layer 10. S forms a sample supply section.
  • the first reaction layer 8 includes an oxidoreductase
  • the second reaction layer 9 includes a lipolytic enzyme
  • the third reaction layer 10 includes an electron carrier.
  • the oxidoreductase, the lipolytic enzyme and the electron carrier are not simultaneously contained in the same reaction layer.
  • the 3rd reaction layer 10 is formed in the clearance gap between the both ends on the cover 7 in which the adhesive agent (double-sided tape) 6a was installed in both ends.
  • the adhesive (double-sided tape) 6a adhered to the cover 7 is bonded to each other to constitute a structure.
  • the adhesive (double-sided tape) 6 may be installed only on the substrate 1 side, or may be installed only on the cover 7 side.
  • the structure of the first biosensor and the structure of the second biosensor are the same except that the second biosensor further has the third reaction layer 10, and thus is clearly specified.
  • the specific description of the constituent elements described below applies to the first biosensor and the second biosensor of the present invention.
  • the term “1 sensor” may be used in describing the content of each constituent element.
  • “1 sensor” refers to the size of a general biosensor, sample supply. It is assumed that the sample supplied to the section is “0.1 to 20 ⁇ l (preferably about 2 ⁇ l)”. Therefore, in a biosensor that is smaller or larger than that, the present invention can be applied by appropriately adjusting the content of each constituent element.
  • the insulating substrate 1 used in the present invention is not particularly limited, and a conventionally known substrate can be used.
  • An example is plastic, paper, glass, ceramics, and the like. Further, the shape and size of the insulating substrate 1 are not particularly limited.
  • plastic there is no particular limitation on the plastic, and any conventionally known plastic can be used.
  • PET polyethylene terephthalate
  • polyester polystyrene
  • polypropylene polypropylene
  • polycarbonate polycarbonate
  • polyimide acrylic resin
  • acrylic resin etc.
  • the electrode of the present invention includes at least a working electrode 2 and a counter electrode 4.
  • the electrode of the present invention is not particularly limited as long as it can electrochemically detect the reaction between the sample (object to be measured) and the oxidoreductase of the present invention.
  • a carbon electrode, a gold electrode, a silver electrode, A platinum electrode, a palladium electrode, etc. are mentioned. From the viewpoint of corrosion resistance and cost, a carbon electrode is preferred.
  • a two-electrode system including only the working electrode 2 and the counter electrode 4 or a three-electrode system further including the reference electrode 3 may be used.
  • the three-electrode method can be preferably used rather than the two-electrode method from the viewpoint that the potential is controlled with higher sensitivity.
  • a sensing electrode for sensing the amount of liquid may be included.
  • the portion (acting portion) in contact with the sample supply unit may be different in constituent material from the other electrode portions.
  • the reference electrode action part 3-1 may be made of silver / silver chloride.
  • a biosensor since a biosensor is generally disposable, it is good to use a disposable electrode as an electrode.
  • the material which comprises the insulating layer 5 is not restrict
  • resin such as PET and polyethylene, glass, ceramics, paper, etc.
  • PET Preferably, it is PET.
  • the sample supply unit includes the first reaction layer 8 including the oxidoreductase and the second reaction layer 9 including the lipolytic enzyme.
  • the sample supply unit also has a surfactant layer.
  • the sample supply unit includes the first reaction layer 8 containing an oxidoreductase and the second reaction layer 9 containing a lipolytic enzyme, It has the 3rd reaction layer 10 separated and formed from the 1 reaction layer 8 and the 2nd reaction layer 9, and the said 3rd reaction layer 9 contains an electron carrier.
  • the oxidoreductase and the electron carrier can be contained in separate reaction layers. Deterioration during storage due to contact with the enzyme can be prevented.
  • the thicknesses of the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 are not particularly limited, and can be appropriately selected so as to be a normal reaction layer thickness.
  • the first reaction layer 8 is preferably 0.01 to 25 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, particularly preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the thickness of the second reaction layer 9 is preferably 0.01 to 25 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, and particularly preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the total thickness of the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 is preferably 0.02 to 50 ⁇ m, more preferably 0.05 to 20 ⁇ m, and particularly preferably 0.1 to 16 ⁇ m. .
  • the thickness control method in this case, For example, it can control by adjusting suitably the application quantity (for example, dripping quantity) of the solution containing a predetermined component.
  • the thickness is 0.
  • the thickness is preferably 01 to 25 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, still more preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the separation distance between the second reaction layer 9 and the surfactant layer is preferably 0.05 to 1.5 mm, more preferably 0.07 to 1.25 mm, and still more preferably 0.09 to 1 mm. If it is the said range, a capillary phenomenon will occur easily and a sample will be easy to be introduced into a sample supply part.
  • the thickness of the 1st reaction layer 8, the 2nd reaction layer 9, and the surfactant layer formed as needed may be the same, or may differ.
  • the thickness of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer in the case of the second biosensor of the present invention is not particularly limited, and may be a normal reaction layer thickness. Can be selected as appropriate.
  • the first reaction layer 8 is preferably 0.01 to 25 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, particularly preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the thickness of the second reaction layer 9 is preferably 0.01 to 25 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, and particularly preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the total thickness of the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 is preferably 0.02 to 50 ⁇ m, more preferably 0.05 to 20 ⁇ m, and particularly preferably 0.1 to 16 ⁇ m. .
  • the thickness of the third reaction layer 10 is preferably 0.01 to 10 ⁇ m, more preferably 0.025 to 10 ⁇ m, and particularly preferably 0.05 to 8 ⁇ m.
  • the thicknesses of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 may be the same or different.
  • thickness control method for example, thickness can be controlled by adjusting the application quantity (for example, dripping quantity) of the solution containing a predetermined component suitably.
  • the separation distance between the second reaction layer 9 and the third reaction layer 10 is not particularly limited, but is preferably 0.05 to 1.5 mm, more preferably 0.075 to 1.25 mm, Particularly preferred is 0.1 to 1 mm.
  • the separation distance can be controlled by controlling the thickness of the adhesive. That is, the adhesive also serves as a spacer that separates the second reaction layer 9 and the third reaction layer 10.
  • the first reaction layer 8 in the present invention comprises an oxidoreductase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD), or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group (also referred to as “coenzyme”).
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • a prosthetic group also referred to as “coenzyme”.
  • a polyol dehydrogenase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a prosthetic group is preferable.
  • the oxidoreductase of the present invention may be used alone or in the form of a mixture.
  • the oxidoreductase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group is not particularly limited and depends on the type of sample.
  • redox enzymes containing pyrroloquinoline quinone (PQQ) as a prosthetic group include glycerol dehydrogenase, sorbitol dehydrogenase, mannitol dehydrogenase, arabitol dehydrogenase, galactitol dehydrogenase, xylitol dehydrogenase, adonitol dehydrogenase, erythritol dehydrogenase, ribitol dehydrogenase , Propylene glycol dehydrogenase, fructose dehydrogenase, glucose dehydrogenase, gluconic acid Hydrogenase, 2-ketogluconic acid dehydrogenase, 5 ketogluconic acid dehydrogenase, 2,5 Jiketogurukon dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, cyclic alcohol dehydrogenase, acetaldehyde dehydrogena
  • oxidoreductases containing flavin adenine dinucleotide (FAD) or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group include glucose oxidase, glucose dehydrogenase, D-amino acid oxidase, succinate dehydrogenase, monoamine oxidase, sarcosine dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, Examples include sorbitol dehydrogenase, D-lactate dehydrogenase, and cholesterol oxidase.
  • glycerol dehydrogenase containing at least one of pyrroloquinoline quinone (PQQ) or flavin adenine dinucleotide (FAD) is preferred as the prosthetic group
  • PQQ-dependent glycerol dehydrogenase containing pyrroloquinoline quinone (PQQ) as the prosthetic group
  • the above-mentioned oxidoreductase of the present invention may be purchased from commercially available products or may be prepared by itself.
  • a method for preparing the oxidoreductase itself for example, a known method of culturing bacteria producing the oxidoreductase in a nutrient medium and extracting the oxidoreductase from the culture (for example, JP, 2008-220367, A).
  • examples of bacteria that produce the glycerol dehydrogenase include bacteria belonging to various genera such as Gluconobacter and Pseudomonas.
  • PQQ-dependent glycerol dehydrogenase present in the membrane fraction of bacteria belonging to the genus Gluconobacter can be preferably used.
  • Gluconobacter albidas (Gluconobacter albidus) NBRC 3250, 3273, 103509, 103510, 103516, 103520, 103521, 103524; Gluconobacter cerinus NBRC 3267, 3274, 3275, 3276; Gluconobacter frateurii NBRC 3171, 3251, 3253, 3262, 3264, 3265, 3268, 3270, 3285, 3286, 3290, 16669, 103413, 103421, 103427, 10428, 103429, 103437, 103438, 103439, 1034 0, 10441, 103446, 103453, 103454, 103456, 103457, 103458, 103659, 103461, 103462, 103465, 103466, 103467, 103468, 103469, 10347, 103471, 103472, 103473, 103474, 33475, 103476, 103477, 10
  • the medium for cultivating the PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is a natural medium, even if it is a synthetic medium, as long as it contains appropriate amounts of carbon sources, nitrogen sources, inorganic substances and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used.
  • carbon sources for example, glucose, glycerol, sorbitol and the like are used.
  • nitrogen source include nitrogen-containing natural products such as peptones, meat extracts and yeast extracts, and inorganic nitrogen-containing materials such as ammonium chloride and ammonium citrate.
  • the inorganic substance potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate or the like is used.
  • specific vitamins are used as needed.
  • the above carbon source, nitrogen source, inorganic substance, and other necessary nutrients may be used alone or in combination of two or more.
  • the culture is preferably performed by shaking culture or aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is preferably 20 ° C. to 50 ° C., more preferably 22 ° C. to 40 ° C., and most preferably 25 ° C. to 35 ° C.
  • the culture pH is preferably 4-9, more preferably 5-8. Even under conditions other than these, it is carried out if the strain to be used grows.
  • the culture period is usually preferably 0.5 to 5 days.
  • oxidoreductase is accumulated in the cells.
  • These oxidoreductases may be enzymes obtained by the above culture or recombinant enzymes obtained by transducing oxidoreductase genes into E. coli and the like.
  • the obtained PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is extracted.
  • a commonly used extraction method can be used.
  • an ultrasonic crushing method, a French press method, an organic solvent method, a lysozyme method, or the like can be used.
  • the method for purifying the extracted oxidoreductase is not particularly limited.
  • salting-out method such as ammonium sulfate or sodium nitrate, metal aggregation method using magnesium chloride or calcium chloride, denucleic acid using streptomycin or polyethyleneimine, or DEAE (diethylamino)
  • An ion exchange chromatography method such as ethyl) -sepharose or CM (carboxymethyl) -sepharose can be used.
  • the partially purified enzyme or purified enzyme solution obtained by these methods may be used as it is or in a chemically modified form.
  • the oxidoreductase derived from the culture obtained by the above-described method is described in, for example, JP-A-2006-271257. It can be used after being appropriately chemically modified using a method or the like.
  • the chemical modification method is not limited to the method described in the above publication.
  • the oxidoreductase of this invention can select suitably by the kind of sample to measure, the addition amount of a sample, the kind of electron carrier, the quantity of the hydrophilic polymer mentioned later, etc. .
  • the amount of enzyme enzyme activity amount
  • it is preferably 0.01 to 100 U, more preferably 0.05 to 50 U, and particularly preferably 0.1 to 10 U.
  • the definition and measurement method of the activity unit (U) of the PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is based on the method described in JP-A-2006-271257.
  • an oxidoreductase containing a PQQ-dependent glycerol dehydrogenase will be described later, but it is also preferable to prepare it in a buffer solution such as glycylglycine.
  • the 2nd reaction layer 9 in this invention contains the lipolytic enzyme which hydrolyzes the ester bond which comprises lipid. Therefore, the biosensor of the present invention can be used as a neutral fat sensor. Although it does not restrict
  • the content of LPL is not particularly limited, and can be appropriately selected depending on the type of sample to be measured, the amount of sample added, the amount of hydrophilic polymer used, the type of electron carrier, and the like.
  • the amount of enzyme (enzyme activity) that rapidly decomposes neutral fat and does not reduce the solubility of the reaction layer preferably 0.1 to 1000 activity units (U ), More preferably 1 to 500 U, particularly preferably 10 to 100 U.
  • the definition and measuring method of the activity unit (U) of LPL are based on the method as described in international publication 2006/104077 pamphlet.
  • LPL is preferably prepared with a buffer solution such as glycylglycine.
  • the oxidative degradation enzyme and the lipolytic enzyme are present in separate layers, a first reaction layer and a second reaction layer, respectively. If it is such a form, the hydrolysis reaction by a lipolytic enzyme will advance efficiently.
  • the biosensor of the present invention preferably includes an electron carrier.
  • the electron carrier may be included in the first reaction layer 8 or the second reaction layer 9, but is preferably included in the third reaction layer separately from these reaction layers.
  • the reaction layer containing the electron carrier is more preferably separated from the electrode, and is separated from the first reaction layer 8 or the second reaction layer 9, particularly the second reaction layer 9. It is particularly preferable to make it exist. That is, the present invention is a biotechnology having an insulating substrate, an electrode system including at least a working electrode and a counter electrode formed on the insulating substrate, and a sample supply unit formed on the electrode system.
  • oxidoreductase wherein the sample supply unit is formed on the electrode system and contains pyrroloquinoline quinone (PQQ), flavin adenine dinucleotide (FAD), or flavin mononucleotide (FMN) as a prosthetic group
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • FMN flavin mononucleotide
  • a second reaction layer formed by applying a solution containing a lipolytic enzyme on the first reaction layer, and further, electron transfer
  • a biosensor second biosensor formed by separating a third reaction layer containing a body from the first and second reaction layers.
  • the third reaction layer 10 includes an electron carrier (sometimes referred to as “electron acceptor”).
  • an electron carrier sometimes referred to as “electron acceptor”.
  • the electron carrier receives electrons generated by the action of the oxidoreductase when the biosensor is used, that is, is reduced.
  • the reduced electron carrier is electrochemically oxidized by applying a potential to the electrode after completion of the enzyme reaction.
  • concentration of a desired component in the sample can be calculated from the magnitude of the current flowing at this time (hereinafter also referred to as “oxidation current”).
  • an electron carrier used in the present invention a conventionally known electron carrier can be used, and can be appropriately determined according to the sample and the oxidoreductase used.
  • an electron carrier may be used independently or may be used in combination of 2 or more type.
  • examples of the electron carrier include potassium ferricyanide, sodium ferricyanide, ferrocene and derivatives thereof, phenazine methosulfate and derivatives thereof, p-benzoquinone and derivatives thereof, 2,6-dichlorophenolindophenol, methylene blue, Nitrotetrazolium blue, osmium complexes, ruthenium complexes such as hexaammineruthenium (III) chloride, and the like can be suitably used. Of these, hexaammineruthenium (III) chloride and potassium ferricyanide are preferable, and hexaammineruthenium (III) chloride is more preferably used.
  • the content of the electron carrier is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the amount of the sample added. As an example, from the viewpoint of containing a sufficient amount with respect to the base mass per sensor, preferably 1 to 2000 ⁇ g, more preferably 5 to 1000 ⁇ g, and particularly preferably 10 to 500 ⁇ g of an electron carrier is included. Good.
  • the electron carrier is also preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine, as will be described later.
  • the first reaction layer 8, the second reaction layer 9 or the third reaction layer 10 has a surfactant if necessary. Moreover, in the 1st biosensor of this invention, it isolate
  • the oxidoreductase is composed of protein, if the electrode surface adheres to the electrode surface, the electrode surface may be passivated. Therefore, in conventional general biosensors, the enzyme is not in direct contact with the electrode. The structure was taken. However, inclusion of a surfactant in the first reaction layer 8 significantly suppresses and prevents the redox enzyme from adhering to the electrode, and as a result, oxidized electrons by the redox enzyme in the vicinity of the electrode. The conversion efficiency of the transmitter to the reduced electron carrier can be improved. In other words, the correlation with the substrate concentration in the sample solution can be further increased.
  • the surfactant is formed on the cover 7 side
  • the spread and wettability of the sample such as whole blood to the cover side is improved compared to the case where the cover 7 directly touches the sample, and the sample is supplied to the sample supply unit. It is preferable because it can be introduced quickly.
  • the surfactant used in the present invention is not particularly limited as long as the enzyme activity of the oxidoreductase of the present invention to be used is not lowered.
  • a nonionic surfactant, an amphoteric surfactant, a positive surfactant is used.
  • An ionic surfactant, an anionic surfactant, a natural surfactant and the like can be appropriately selected and used. These may be used alone or in the form of a mixture.
  • it is at least one of a nonionic surfactant and an amphoteric surfactant from the viewpoint of not affecting the enzyme activity of the oxidoreductase of the present invention.
  • the nonionic surfactant is not particularly limited, but is preferably a polyoxyethylene or alkyl glycoside from the viewpoint of not affecting the enzyme activity of the oxidoreductase of the present invention.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycol (Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation)) is preferred.
  • the alkylglycoside nonionic surfactant is not particularly limited, but alkylglycoside and alkylthioglycoside having an alkyl group having 7 to 12 carbon atoms are preferable.
  • the carbon number is more preferably 7 to 10, particularly preferably 8 carbon atoms.
  • the sugar moiety is preferably glucose or maltose, more preferably glucose. More specifically, n-octyl- ⁇ -D-glucoside and n-octyl- ⁇ -D-thioglucoside are preferable.
  • Alkyl glycoside nonionic surfactants can be applied easily and uniformly during the manufacturing process when used in biosensors.
  • alkylthioglycoside is very preferable to alkylglycoside from the viewpoint of spread and wettability.
  • the amphoteric surfactant is not particularly limited.
  • CHAPS 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonic acid
  • CHAPSO 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammoni O) -2-hydroxypropanesulfonic acid
  • Zwittergent registered trademark
  • CHAPS is particularly preferable. This is because CHAPS is a low hemolytic agent among the surfactants.
  • the cationic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include cetylpyridinium chloride and trimethylammonium bromide. These may be used alone or in the form of a mixture.
  • the anionic surfactant is not particularly limited, and examples thereof include sodium cholate and sodium deoxycholate. These may be used alone or in the form of a mixture.
  • the natural surfactant is not particularly limited, and examples thereof include phospholipids, and preferred examples include lecithins such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated lecithin, and high-purity lecithin. These may be used alone or in the form of a mixture.
  • a low hemolytic surfactant As specific examples, CHAPS, Tween, and Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation) (polyoxyethylene polyoxypropylene glycol) are preferable.
  • the surfactant may be contained in any reaction layer of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10.
  • the first reaction layer 8 or the third reaction layer 10 more preferably the first reaction layer 8 and the third reaction layer 10 contain a surfactant.
  • the types and blending amounts of the surfactants included in these reaction layers are the same or different. Also good. At this time, it is preferable to select in consideration of the interaction with each constituent element contained in the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10.
  • the first reaction layer 8 contains an oxidoreductase.
  • a PQQ-dependent glycerol dehydrogenase is contained as the oxidoreductase, they are hydrophobic. Therefore, it is preferable that at least the first reaction layer 8 contains a surfactant.
  • a surfactant for example, CHAPS, Tween, Emulgen PP-290, etc.
  • a low hemolytic surfactant for example, CHAPS, Tween, Emulgen PP-290, etc.
  • the third reaction layer 10 contains an electron carrier (for example, hexaammon ruthenium (III) chloride). From the viewpoint of improving the accuracy of the biosensor by improving, it is more preferable that the third reaction layer 10 also contains a surfactant. Also in this case, it is preferable to use a low hemolytic surfactant (for example, CHAPS, Tween, Emulgen PP-290, etc.) from the viewpoint of spreading and wettability. By applying such a device, the accuracy as a biosensor is further improved.
  • an electron carrier for example, hexaammon ruthenium (III) chloride.
  • a surfactant for example, CHAPS, Tween, Emulgen PP-290, etc.
  • the content of the surfactant is not particularly limited and can be appropriately adjusted according to the amount of the sample added.
  • amphoteric surfactants it is preferable from the viewpoint of increasing the solubility of the oxidoreductase of the present invention per sensor, not deactivating the enzyme activity, and being easy to apply in the production process. 0.01 to 100 ⁇ g, more preferably 0.05 to 50 ⁇ g, particularly preferably 0.1 to 10 ⁇ g may be contained.
  • such a surfactant is preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine.
  • the content means the total amount.
  • a nonionic surfactant is used as the surfactant, the solubility of the oxidoreductase of the present invention is increased per sensor, the enzyme activity is not deactivated, and it is easy to apply in the production process. From the viewpoint, 0.01 to 100 ⁇ g is preferable, 0.05 to 50 ⁇ g is more preferable, and 0.1 to 10 ⁇ g is particularly preferable.
  • a surfactant is also preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine.
  • the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, or the third reaction layer 10 in the present invention may further contain a hydrophilic polymer.
  • the oxidoreductase is composed of a protein, if the oxidoreductase is attached to the electrode surface, there is a possibility that the electrode surface may be passivated. Had a configuration that would not be in direct contact.
  • the inclusion of a hydrophilic polymer in the first reaction layer 8 significantly suppresses and prevents the redox enzyme from adhering to the electrode, and as a result, the oxidized form of the redox enzyme in the vicinity of the electrode.
  • the conversion efficiency of the electron carrier to the reduced electron carrier can be improved, in other words, the correlation with the substrate concentration in the sample solution can be further increased.
  • the hydrophilic polymer may be the first reaction layer 8 or the second reaction layer 9 in the case of the first biosensor, or the first reaction layer 8 in the case of the second biosensor. It may be contained in either the second reaction layer 9 or the third reaction layer 10.
  • the hydrophilic polymer has a function of immobilizing the oxidoreductase or electron carrier of the present invention on the electrode. For this reason, when the first reaction layer 8, the second reaction layer 9 or the third reaction layer 10, particularly the first reaction layer 8 or the third reaction layer 10 contains a hydrophilic polymer, the substrate 1 and Peeling of these reaction layers from the electrode surface can be prevented.
  • the hydrophilic polymer also has an effect of preventing cracks on the surfaces of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10, and increases the reliability of the biosensor. It is effective. Furthermore, adsorption of adsorptive components such as proteins to the electrode can also be suppressed.
  • the 1st reaction layer 8, the 2nd reaction layer 9, or the 3rd reaction layer 10 contains a hydrophilic polymer, it may have a form in which a hydrophilic polymer is contained in the reaction layer.
  • a hydrophilic polymer layer containing a hydrophilic polymer may be formed so as to cover the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, or the third reaction layer 10.
  • hydrophilic polymer that can be used in the present invention
  • conventionally known polymers can be used. More specifically, as the hydrophilic polymer, polyamino acids such as polyethylene glycol, carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl ethyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, and polylysine, Examples thereof include polystyrenesulfonic acid, gelatin and derivatives thereof, acrylic acid polymer or derivatives thereof, maleic anhydride polymer or salts thereof, starch and derivatives thereof, and the like.
  • carboxymethyl cellulose polyvinyl pyrrolidone, polyethylene glycol, and polyvinyl alcohol are preferred from the viewpoint of not deactivating the enzyme activity of the oxidoreductase of the present invention and having high solubility. These may be used alone or in the form of a mixture.
  • the blending amount of such a hydrophilic polymer is preferably 0.01 to 100 ⁇ g from the viewpoint that an enzyme and an electron carrier can be immobilized per sensor and the solubility of the reaction layer is not lowered. More preferably, it is 0.05 to 50 ⁇ g, and particularly preferably 0.1 to 10 ⁇ g.
  • the hydrophilic polymer is preferably prepared in a buffer solution such as glycylglycine. Further, when a hydrophilic polymer is present in two or more reaction layers of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, or the third reaction layer 10, each hydrophilic layer included in these reaction layers The type and blending amount of the polymer may be the same or different. At this time, it is preferable to select in consideration of the interaction with each constituent element contained in the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10.
  • At least one of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 may further contain sugar.
  • Sugars do not participate in enzyme reactions related to measurement, and can be appropriately selected and used without reacting themselves, and can contribute to immobilization and stabilization of each layer.
  • Sugar may be contained in any of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10, but is preferably contained in at least the first reaction layer 8.
  • the sugar that can be contained in at least one of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 does not have a free aldehyde group or a ketone group, and has no reducing property.
  • Non-reducing sugars are preferred. Examples of such non-reducing sugars include trehalose-type microsaccharides in which reducing groups are bonded to each other, glycosides in which saccharide reducing groups and non-saccharides are bonded, sugar alcohols reduced by hydrogenation of saccharides and the like.
  • examples include trehalose type small sugars such as sucrose, trehalose and raffinose; glycosides such as alkyl glycosides, phenol glycosides and mustard oil glycosides; and sugar alcohols such as arabitol and xylitol. It is done.
  • These non-reducing sugars may be used alone or in the form of a mixture of two or more.
  • trehalose, raffinose, and sucrose are preferable, and trehalose is particularly preferable.
  • the amount of sugar contained in at least one of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 is preferably 0.1 to 500 ⁇ g, more preferably 0.5 ⁇ g per sensor. ⁇ 400 ⁇ g, more preferably 1 to 300 ⁇ g. If the sugar is in the form of a mixture, the blending amount means the sum of all components. If it is said range, it can contribute to fixation and stabilization of each layer, without reducing the performance of a sensor.
  • At least one of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 may further contain a protein. Proteins do not participate in enzyme reactions related to measurement, and can be used by appropriately selecting those that do not react themselves and do not exhibit physiological activity, and can contribute to immobilization and stabilization of each layer .
  • the protein may be contained in any of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10, but is preferably contained in at least the first reaction layer 8.
  • proteins that can be included in at least one of the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 include bovine serum albumin (BSA), casein, sericin, and hydrolysates thereof. It is done. These proteins may be used alone or in the form of a mixture of two or more. Of these, BSA is preferred because it is readily available and inexpensive.
  • the molecular weight of the protein is preferably 10 to 1000 kDa, more preferably 25 to 500 kDa, and still more preferably 50 to 100 kDa. At this time, the molecular weight employs a value measured using a gel filtration chromatography method.
  • the amount of protein contained in the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 is preferably 0.1 to 200 ⁇ g, more preferably 0.5 to 100 ⁇ g, more preferably 1 sensor per sensor.
  • the amount is preferably 1 to 50 ⁇ g. If the protein is in the form of a mixture of two or more, the blending amount means the sum of all components. If it is said range, it can contribute to fixation and stabilization of each layer, without reducing the performance of a sensor.
  • the method for forming the first reaction layer 8, the second reaction layer 9, and the third reaction layer 10 in the first and second biosensors of the present invention is not particularly limited. Below, preferable embodiment of the production method of the 2nd biosensor of this invention is described. The present invention is not limited to the following method.
  • the production of the first biosensor of the present invention is not particularly limited, but can be carried out in the same manner except that, for example, the third reaction layer is not formed below.
  • the first reaction layer 8 and the third reaction layer 10 may be formed by any method, but the second reaction layer 9 can be formed by applying a solution containing a lipolytic enzyme. Formed on layer 8.
  • the application method is not particularly limited, and a solution containing a lipolytic enzyme is dropped or applied to a spray device, a bar coater, a die coater, a reverse coater, a comma coater, a gravure coater, a spray coater, a doctor knife, or the like.
  • a method of applying using an instrument can be used.
  • the method for forming the first reaction layer 8 and the third reaction layer 10 is not particularly limited, and a method equivalent to the method for forming the second reaction layer can be used.
  • the formation method of the second reaction layer 9 and the formation method of the first reaction layer 8 and the third reaction layer 10 may be the same or different.
  • it is preferable to use the same method and a method of drying the coating film after applying a solution containing a predetermined component dropwise is particularly preferable.
  • Such a method is preferable in that a biosensor can be easily produced and the manufacturing cost during mass production can be reduced.
  • the first reaction layer is formed as follows. That is, an oxidoreductase solution (for example, PQQ-dependent glycerol dehydrogenase) and, if necessary, a surfactant (for example, emulgen) and a desired component such as a glycylglycine buffer are mixed to obtain an oxidoreductase solution To prepare. A predetermined amount of this oxidoreductase solution is dropped on the electrode (action part). After dropping the prepared oxidoreductase solution, the first reaction layer is formed on the electrode (action part) by drying it in a thermostat kept at a predetermined temperature or on a hot plate.
  • an oxidoreductase solution for example, PQQ-dependent glycerol dehydrogenase
  • a surfactant for example, emulgen
  • a desired component such as a glycylglycine buffer
  • the surfactant may be simply contained in the first reaction layer, or a layer containing a surfactant may be formed so as to cover the first reaction layer, or on the electrode.
  • a surfactant layer may be formed, and the first reaction layer 8 may be formed thereon.
  • an adhesive may be installed on the substrate 1 in advance.
  • a surfactant for example, Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation) is mixed with desired components such as a glycylglycine buffer solution and a volatile organic solvent to obtain a surfactant.
  • a predetermined amount of this surfactant solution is dropped on the electrode, the first reaction layer, or on the second reaction layer, the third reaction layer or the cover 7 as described later.
  • the surfactant layer is formed by drying in a constant temperature bath or a hot plate kept at a predetermined temperature.
  • the second reaction layer is formed as follows. That is, a lipolytic enzyme solution (eg, lipoprotein lipase (LPL)) is mixed with a desired component such as a glycylglycine buffer to prepare a lipolytic enzyme solution. A predetermined amount of this lipolytic enzyme solution is dropped onto the oxidoreductase layer prepared above. After dropping the prepared lipolytic enzyme solution, the second reaction layer is formed on the first reaction layer by drying in a thermostat or a hot plate maintained at a predetermined temperature. A surfactant may be further added to the second reaction layer. The surfactant may be simply contained in the second reaction layer, or a layer containing the surfactant may be formed as described above so as to cover the second reaction layer.
  • a lipolytic enzyme solution eg, lipoprotein lipase (LPL)
  • LPL lipoprotein lipase
  • the third reaction layer is formed as follows. That is, an electron carrier (for example, hexaammineruthenium (III) chloride) and, if necessary, a desired component such as a surfactant (for example, emulgen) and a glycylglycine buffer solution are mixed to form an electron carrier. Prepare the solution. A predetermined amount of this electron carrier solution is dropped on the cover 7. After the prepared electron carrier solution is dropped, the third reaction layer is formed on the cover by drying in a constant temperature bath maintained at a predetermined temperature or on a hot plate.
  • an electron carrier for example, hexaammineruthenium (III) chloride
  • a surfactant for example, emulgen
  • glycylglycine buffer solution glycylglycine buffer solution
  • the surfactant may be simply contained in the reaction layer, or a layer containing the surfactant may be formed as described above so as to cover the reaction layer, or the surfactant may be formed on the cover.
  • a layer may be formed, and the third reaction layer 10 may be formed thereon. Note that an adhesive may be installed on the cover 7 in advance.
  • the substrate 1 on which the first reaction layer 8 and the second reaction layer 9 are formed and the cover 7 on which the third reaction layer 10 is formed are bonded together with adhesives 6a and 6b.
  • the second biosensor can be manufactured.
  • the sample used in the present invention is preferably in the form of a solution. It does not restrict
  • the sample is not particularly limited, but for example, biological samples such as whole blood, plasma, serum, saliva, urine, bone marrow; drinking water such as juice, foods such as soy sauce, sauce; drainage, rain water, pool water, etc. Is mentioned.
  • biological samples such as whole blood, plasma, serum, saliva, urine, bone marrow; drinking water such as juice, foods such as soy sauce, sauce; drainage, rain water, pool water, etc.
  • whole blood, plasma, serum, saliva, bone marrow and more preferred is whole blood.
  • the sample solution may be used as it is, or a solution diluted with an appropriate solvent may be used for the purpose of adjusting the viscosity or the like.
  • the substrate contained in the sample is a substance that can react with each enzyme contained in the first reaction layer and the second reaction layer of the present invention and generate a measurable current as described later. Good.
  • the desired component (substrate) in the sample examples include sugars such as glucose, polyhydric alcohols such as glycerol, sorbitol, and arabitol, lipids such as neutral fat and cholesterol, organic acids such as glutamic acid and lactic acid, creatine, and creatinine Etc. For the same reason as above, it is preferable to select a lipid such as neutral fat or cholesterol as the substrate.
  • the form in particular of supplying a sample to a sample supply part is not restrict
  • the sample may be supplied from the horizontal direction.
  • the desired component (substrate) in the sample is converted into the second reaction layer 9.
  • oxidoreductase contained in the first reaction layer 8 are oxidized and release electrons simultaneously with their own oxidation.
  • the electrons released from the substrate are captured by the electron carrier dissolved from the third reaction layer 10, and the electron carrier changes from the oxidized type to the reduced type.
  • the biosensor is allowed to stand for a predetermined time, whereby the substrate is completely oxidized by the lipolytic enzyme and the oxidoreductase, and a certain amount of electron carrier is converted from the oxidized form to the reduced form.
  • the reaction time for completing the reaction between the substrate and the enzyme (that is, the measurement time) can be significantly shortened.
  • the reaction time (measurement time) for completing the reaction between the substrate and the enzyme is not particularly limited, but is usually 1 to 120 seconds, preferably 1 to 90 seconds, more preferably 1 to 90 seconds after addition of the sample. 60 seconds, particularly preferably 1 to 45 seconds.
  • a predetermined potential is applied between the working electrode 2 and the counter electrode 4 through the electrode for the purpose of oxidizing the reduced electron carrier.
  • the reduced electron carrier is electrochemically oxidized and converted into an oxidized form.
  • the amount of the reduced electron carrier before applying the potential is calculated, and the amount of the substrate reacted with the enzyme can be quantified.
  • the value of the potential applied when flowing the oxidation current is not particularly limited, and can be appropriately adjusted with reference to conventionally known knowledge. For example, a potential of about ⁇ 200 to +700 mV, preferably 0 to +500 mV may be applied between the counter electrode 4 and the working electrode 2.
  • the potential applying means for applying the potential is not particularly limited, and a conventionally known potential applying means can be appropriately used.
  • a chronoamperometry method for measuring a current value after a predetermined time after applying a predetermined potential may be used.
  • a chronocoulometry method may be used in which a charge amount obtained by integrating the current response by the chronoamperometry method with time is measured.
  • the chronoamperometry method can be preferably used in that it is measured by a simple apparatus system.
  • the mode of calculating the substrate concentration by measuring the current (oxidation current) when oxidizing the reduced electron carrier has been described as an example, but in some cases, it remains without being reduced.
  • a form in which the substrate concentration is calculated by measuring a current (reduction current) when reducing the oxidized electron carrier may be employed.
  • the biosensor of the present invention may be used in any form and is not particularly limited. For example, it can be used for various applications such as a disposable biosensor for disposable use, a biosensor for continuously measuring a predetermined value by embedding at least an electrode part in a human body.
  • the biosensor of the present invention can be applied to conventionally known sensors such as a neutral fat sensor and a cholesterol sensor.
  • the oxidoreductase and the lipolytic enzyme are contained in separate reaction layers, the degradation of neutral fat into glycerol by the lipolytic enzyme and the oxidation reaction by the redox enzyme proceed rapidly. . For this reason, glucose and a neutral fat density
  • Example 1 As the electrode, DEP Chip EP-N (manufactured by Biodevice Technology Co., Ltd.) was used. In the DEP Chip EP-N, a working electrode 2 made of carbon, a reference electrode 3 and a counter electrode 4 are formed on an insulating substrate 1, and a working electrode working part 2-1 made of carbon is sandwiched between insulating layers 5. A reference electrode working part 3-1 made of silver / silver chloride and a counter electrode working part 4-1 made of carbon are formed.
  • the first reaction layer (GLDH layer) was formed by the following procedure.
  • Per sensor volume of 2 ⁇ l of sample “whole blood” supplied
  • the final concentration is 1.5 U for PQQ-dependent glycerol dehydrogenase and 5 mM glycylglycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) .65 ⁇ g) and Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation) were mixed to a concentration of 0.025% (0.5 ⁇ g) to obtain a solution (GLDH solution).
  • the obtained GLDH solution was dropped so as to cover the working electrode working part, reference electrode working part, and counter electrode working part of EP-N, and dried at 30 ° C. for 5 minutes, and the first reaction layer (GLDH layer) was formed. Obtained.
  • the second reaction layer (LPL layer) was formed by the following procedure.
  • the lipoprotein lipase (LPL, manufactured by Asahi Kasei Co., Ltd.) is 75 U, and glycylglycine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is mixed to 5 mM (0.65 ⁇ g) to obtain a solution. (LPL solution) was obtained. The obtained LPL solution was dropped so as to be layered (coated) on the formed GLDH layer and dried at 30 ° C. for 5 minutes to obtain a second reaction layer (LPL layer).
  • LPL lipoprotein lipase
  • the LPL layer as the second reaction layer was formed (multilayered) on the GLDH layer as the first reaction layer.
  • the third reaction layer (electron carrier layer) was formed by the following procedure.
  • Hexaammine ruthenium (III) chloride manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 100 mM 65 ⁇ g
  • glycylglycine Japanese sum
  • a mediator solution was obtained by mixing 25 mM (3.25 ⁇ g) of Koyo Pure Chemical Industries, Ltd. and 0.1% (2 ⁇ g) of Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation).
  • the obtained mediator solution was dropped into a gap formed by bonding an adhesive (double-sided tape) to a cover made of PET and then dried at 50 ° C. for 5 minutes to form a third reaction layer (electron carrier layer).
  • the neutral fat A sensor was fabricated and the characteristics were evaluated. At this time, the thicknesses of the first reaction layer, the second reaction layer, and the third reaction layer are each 5 ⁇ m, and the separation distance between the second reaction layer and the third reaction layer is 0.15 mm. there were.
  • Example 1 After inhaling 2 ⁇ l of the sample solution (whole blood, triglyceride value 300 mg / dl), after waiting for each second as a reaction time, a potential of +200 mV is applied between the working electrode and the counter electrode with reference electrode as a reference. The value of the current flowing between the working electrode and the counter electrode after 2 seconds was measured. This current value is proportional to the concentration of the reduced electron carrier, that is, the concentration of degraded neutral fat in the whole blood, and the neutral fat concentration in the whole blood can be determined from this current value.
  • Table 1 Table 1 and FIG. In FIG. 5, the result of Example 1 is represented by a white circle ( ⁇ ).
  • Example 2 A first reaction layer (GLDH layer) was formed in the same manner as in Example 1.
  • the second reaction layer (electron carrier-containing LPL layer) was formed by the following procedure.
  • an electron carrier-containing LPL layer as a second reaction layer was formed (multilayered) on the GLDH layer as the first reaction layer.
  • the surfactant layer was formed by the following procedure.
  • a neutral fat sensor is formed by bonding together a cover on which a surfactant layer is formed and an adhesive (double-sided tape) adhered to the substrate on which the first reaction layer and the second reaction layer are formed.
  • an adhesive double-sided tape
  • Example 2 For the neutral fat sensor thus prepared, the current value was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1 and FIG. In FIG. 5, the results of Example 2 are represented by white triangles ( ⁇ ).
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, a GLDH solution and an LPL solution were prepared. Next, the GLDH solution and the LPL solution are mixed so that the amount of each component per sensor (the amount of the supplied sample “whole blood” is 2 ⁇ l) is the same as in the example, and the mixture is EP-N Example 1 except that the working electrode working part, the reference working part, and the counter working part were coated and dried at 30 ° C. for 5 minutes to form a mixed layer of the GLDH layer and the LPL layer. Thus, a comparative neutral fat sensor was produced.
  • Example 1 For the comparative triglyceride sensor thus produced, the current value was measured in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1 and FIG. In FIG. 5, the result of Comparative Example 1 is represented by a black square ( ⁇ ).
  • Example 3 The electrode used was a three-electrode system designed and manufactured independently. In this electrode, a working electrode 2 made of carbon, a reference electrode 3 and a counter electrode 4 are formed on an insulating substrate 1, and a working electrode working part 2-1 made of carbon, silver chloride is sandwiched between insulating layers 5. A reference electrode working part 3-1 made of silver and a counter electrode working part 4-1 made of carbon are formed.
  • the first reaction layer (GLDH layer) was formed by the following procedure.
  • Per sensor volume of 1 ⁇ l of sample “whole blood” to be supplied) at a final concentration, 1.0 U of PQQ-dependent glycerol dehydrogenase and 10 mM of glycylglycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 3 ⁇ g), Emulgen PP-290 (manufactured by Kao Corporation) 0.05% (0.5 ⁇ g), and polyethylene glycol 6000 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.75% (7. 5 ⁇ g) to obtain a solution (GLDH solution). The obtained GLDH solution was dropped so as to cover the working electrode working part, reference electrode working part and counter electrode working part of the electrode, and dried at 40 ° C. for 5 minutes to obtain a first reaction layer (GLDH layer). .
  • the second reaction layer (electron carrier-containing LPL layer) was formed by the following procedure.
  • an electron carrier-containing LPL layer as a second reaction layer was formed (multilayered) on the GLDH layer as the first reaction layer.
  • the surfactant layer was formed by the following procedure.
  • a neutral fat sensor is formed by bonding together a cover on which a surfactant layer is formed and an adhesive (double-sided tape) adhered to the substrate on which the first reaction layer and the second reaction layer are formed.
  • an adhesive double-sided tape
  • the neutral fat sensor thus obtained was evaluated as follows. After inhaling 1 ⁇ l of sample liquid (whole blood, triglyceride value (183 mg / dl) and waiting for each second as a reaction time, a potential of +200 mV is applied between the working electrode and the counter electrode based on the reference electrode, After 1 second, the value of the current flowing between the working electrode and the counter electrode was measured, and this current value was proportional to the concentration of the reduced electron carrier, that is, the concentration of degraded triglyceride in whole blood.
  • the neutral fat concentration in whole blood can be determined from the values, and the results are shown in Table 1 and Fig. 6. In Fig. 6, the results of Example 3 are represented by white circles ( ⁇ ).
  • Example 4 The current value was the same as in Example 3 except that polyvinyl alcohol 500 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having the same concentration was used instead of 0.75% (7.5 ⁇ g) of polyethylene glycol 6000 of Example 3. Was measured. The results are shown in Table 1 and FIG. In FIG. 6, the result of Example 4 is represented by a black circle ( ⁇ ).
  • Example 5 In the same manner as in Example 3, except that 10% (100 ⁇ g) of trehalose (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used instead of 0.75% (7.5 ⁇ g) of polyethylene glycol 6000 of Example 3, The value was measured. The results are shown in Table 1 and FIG. In FIG. 7, the result of Example 5 is represented by a white square ( ⁇ ).
  • Example 6 In the same manner as in Example 3, except that 1% (10 ⁇ g) of BSA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used instead of 0.75% (7.5 ⁇ g) of polyethylene glycol 6000 of Example 3, The value was measured. The results are shown in Table 1 and FIG. In FIG. 7, the result of Example 6 is represented by a white triangle ( ⁇ ).
  • BSA manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the layer is present in a mixed state, the low solubility of GLDH also affects the solubility of LPL, resulting in a decrease in the overall solubility.
  • LPL dissolves and reacts quickly by forming the two enzymes as separate layers, and then GLDH is reacted. Dissolves and reacts.
  • the reaction time can be shortened by the present invention, because the reactivity of the two enzymes is improved in each layer, and the overall reactivity is improved.
  • reaction time was 45 seconds, which was shortened to the same extent as in Examples 1 and 2. Therefore, even when sugar, protein, or hydrophilic polymer is mixed in at least one of the first reaction layer, the second reaction layer, and the third reaction layer, an excellent reaction time shortening effect can be obtained. ing.
  • Insulating substrate 2 working electrode, 2-1 Working electrode working part, 3 Reference electrode, 3-1 Reference electrode working part, 4 counter electrode, 4-1 Counter electrode action part, 5 Insulating layer, 6 (6a, 6b) adhesive, 7 Cover, 8 First reaction layer, 9 Second reaction layer, 10 Third reaction layer, S space part.

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Abstract

【課題】短時間で試料中のグルコースや中性脂肪等の特定成分の濃度を測定できるバイオセンサを提供する。 【解決手段】絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、前記電極系上に形成され、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層と、を含む反応層を有する、バイオセンサ。

Description

バイオセンサ
　本発明は、バイオセンサ、特に中性脂肪濃度測定用バイオセンサに関する。特に、本発明は、生体試料等の特定の試料中の特定成分の濃度を、酵素反応を利用して迅速に定量できるバイオセンサ、特に中性脂肪濃度測定用バイオセンサに関する。
　近年、バイオセンサが医療等の分野において応用されている。バイオセンサの測定対象は低分子から高分子に至るまでの様々な化学物質であり、測定対象に応じて、種々の機能を有するバイオセンサの開発が進められている。
　従来、生体試料および食品中に含まれる特定成分（基質）を希釈や撹拌等を行うことなく簡易に定量することができるバイオセンサが知られている。例えば、絶縁性の基板上に少なくとも作用極および対極を有する電極系を形成し、この電極系上に酸化還元酵素および電子受容体を親水性ポリマー等の固定化剤で固定化させた酵素反応層を設け、次いでこの酵素反応層の上に濾過層（血球除去層）を設け、さらにこの濾過層の上からカバーを被せて一体化したバイオセンサが提案されている。
　このバイオセンサは、以下の方法により試料中の基質濃度を定量する。まず、濾過層に血液等の試料溶液を滴下し、その濾過液が酵素反応層に浸透する。これにより、酸化還元酵素および電子受容体が試料溶液中に溶解し、基質と酵素との間で酵素反応が進行する。この酵素反応によって基質が酸化され、同時に電子受容体が還元される。酵素反応の終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値から試料溶液中の基質濃度を求めるものである。
　例えば、中性脂肪をバイオセンサで測定する方法としては、以下のように試料中の中性脂肪を定量する方法が知られている。まず、試料溶液に含まれる中性脂肪は、例えば、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）により遊離脂肪酸とグリセロールとに分解される。ここで生じたグリセロールは、下記式（１）および式（２）で示すように、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることにより定量することができる。すなわち、下記式に示される、酸化型電子受容体の減少、還元型電子受容体の増加またはジヒドロキシアセトンリン酸の量を測定することによって、グリセロールを定量することができる。特に還元型電子受容体の増加量を電気化学的に測定することによって、グリセロールを定量することが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　しかしながら、上記中性脂肪測定に用いられるリポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）、およびグリセロール－３－リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）の３種の酵素はいずれも高価である。
　このような問題を解決するために、中性脂肪分解反応に用いる酵素として、中性脂肪分解酵素とグリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）との２種類を用いることで、酵素のコストを低下させたバイオセンサが開示されている（特許文献１）。しかしながら、特許文献１のバイオセンサは、測定時間および精度が十分であるとはいえず、より一層の高精度化および測定の迅速化が望まれている。
　一方、溶存酸素の影響を受けず、１種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すようにＮＡＤ＋依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤ－ＧＬＤＨ）を用いる方法が知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　しかしながら、この反応は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。
　より安価で簡便にグリセロールを定量する方法としては、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオールデヒドロゲナーゼ（ＰＱＱ－ＰＤＨ）を用いる方法がある。
この方法は、下記式（４）の反応によって行われるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がない等のメリットがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記を考慮して、短時間かつ高精度で中性脂肪を測定できるバイオセンサを目的として、中性脂肪分解酵素とグリセロールデヒドロゲナーゼとを異なる層に配置したバイオセンサが報告された（特許文献２、３）。ここで、特許文献２のバイオセンサは、電極上に、ＧＬＤＨおよび親水性ポリマーを含むポリマー層と、濾紙に中性脂肪分解酵素を担持した濾紙層との２反応層を順次積層する構造を有する。また、特許文献３のバイオセンサは、電極上に、ＧＬＤＨおよび親水性ポリマーを含むポリマー層と、不織布に中性脂肪分解酵素を担持した不織布層との２反応層を順次積層する構造を有することを特徴とする。
国際公開第２００６／１０４０７７号パンフレット 特開２００９－２４４０１３号公報 特開２００９－２４４０１４号公報
　しかしながら、上記特許文献２、３に記載されるバイオセンサでも、測定時間が実施例で２分（特許文献２の段落「０１００」および特許文献３の段落「０１００」）と、依然として測定時間が十分短いとはいえず、より短時間で測定できるバイオセンサが望まれている。
　したがって、本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、短時間で試料中の中性脂肪等の特定成分の濃度を測定できるバイオセンサを提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。その結果、濾紙や不織布等の担持体を使用せずに、反応層を、酸化還元酵素を含む層上に直接脂質分解酵素を含む溶液を塗布して脂質分解酵素を含む層を形成する２層構造とすることにより、上記２酵素による反応速度を向上できることを知得した。上記知見に基づいて、本発明を完成した。
　すなわち、上記目的は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、前記電極系上に形成され、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層と、を含む反応層を有する、バイオセンサによって達成される。
　本発明のバイオセンサを用いると、短時間で目的とする成分濃度の測定ができる。
本発明のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。 図１のバイオセンサの断面図である。 本発明のバイオセンサの他の実施形態を示す分解斜視図である。 図３のバイオセンサの断面図である。 実施例１～２および比較例の全血中の中性脂肪濃度の測定結果を表すグラフである。 実施例３および４の全血中の中性脂肪濃度の測定結果を表すグラフである。 実施例５および６の全血中の中性脂肪濃度の測定結果を表すグラフである。
　本発明は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、前記電極系上に形成され、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層（本明細書中では、単に「第一の反応層」とも称する）と、前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層（本明細書中では、単に「第二の反応層」とも称する）と、を含む反応層を有する、バイオセンサを提供する。本発明は、反応層を、酸化還元酵素を含む第一の反応層および脂質分解酵素を含む第二の反応層から構成される２層構造とし、この際、第二の反応層は脂質分解酵素を含む溶液を第一の反応層上に直接塗布することによって形成されることを特徴とする。
　従来、上述したように、特許文献１に記載されるような上記２酵素を混合して単一層としたバイオセンサ、ならびに特許文献２や３に記載されるような、酸化還元酵素および親水性ポリマーを含むポリマー層と、濾紙や不織布等の担持体に別途中性脂肪分解酵素を担持し、これら濾紙層や不織布層とをポリマー層上に設けた２層構造としたバイオセンサが報告されている。このうち、上記特許文献１のバイオセンサの場合には、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）等の酸化還元酵素が一般的に脂質分解酵素に比べて溶解性が低く、そのことが脂質分解酵素に影響を与えるために、両者の酵素による反応が速やかに進行せず、ばらつきが生じる。その結果、センサ全体としての酵素反応が遅延してしまい、測定時間を十分短縮できないものと考えられる。また、上記特許文献２および３のバイオセンサの場合には、脂質分解酵素を別途濾紙や不織布に担持させているため、酸化還元酵素の溶解性は良いものの、ポリマー層への試料の浸透に時間が掛かり、その結果、やはり全体としての酵素反応が遅延してしまい、測定時間を十分短縮できないものと考えられる。
　これに対して本発明では、酸化還元酵素を含む第一の反応層上に、脂質分解酵素を含む溶液を塗布して第二の反応層を直接形成する。したがって、中性脂肪等の脂肪を含む試料が試料供給部を通過すると、第二の反応層中の脂質分解酵素は溶解性が高いため、試料と接触するとすばやく溶解して、試料中の脂肪を分解して遊離脂肪酸およびグリセロールを生成する。またこの反応は、脂質分解酵素の溶解が完了するのとほぼ同じ所要時間で完了する。次に、酸化還元酵素は、第二の反応層と電極との間に第一の反応層として存在するため、第二の反応層中の脂質分解酵素が溶解完了後、溶解をし始める。脂質が分解された試料は第一の反応層にすばやく浸透して、酸化還元酵素を溶解するとともに、生成したグリセロールから還元型電子伝達体を生成し、当該還元型電子伝達体の増加量を電気化学的に測定する。このため、本発明のバイオセンサによれば、試料中の脂肪を短時間で定量することが可能である。なお、上記特許文献１～３のメカニズムおよび本発明のメカニズムは推論であり、本発明は上記メカニズムにより限定されるものではない。
　以下、図面を参照しながら本発明のバイオセンサの実施形態を具体的に説明する。なお、本発明は、下記特許請求の範囲で規定される概念から逸脱しない限り、下記実施形態に限定されない。また、図面の寸法比率は、説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
　図１は、本発明のバイオセンサの一実施形態を示す分解斜視図である。図２は、図１のバイオセンサの断面図である。なお、本明細書では、図１および２に示されるバイオセンサを「第１のバイオセンサ」とも称する。
　図１および２が示すとおり、絶縁性基板１（本明細書中、単に「基板」とも称する）の上に、作用極２、参照極３および対極４を含む電極系が形成されている。なお、上記電極系は、少なくとも作用極および対極を含むものであればよい。このため、参照極３は省略することができる。また、接着剤６が、絶縁性基板１上の端部に設置される。作用極２、参照極３および対極４は、バイオセンサを電気的に接続するための手段として機能している。作用極２、参照極３および対極４は、例えば、スクリーン印刷・スパッタリング法等の従来公知の知見を適宜参照し、あるいは組み合わせて、所望のパターンの電極を形成することができる。
　そして、絶縁性基板１上に形成された作用極２、参照極３および対極４には電極系を露出するように、絶縁層５が形成されている。絶縁層５は、各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法等の従来公知の手法により形成されうる。
　また、絶縁層５を挟むように、作用極作用部分２－１、参照極作用部分３－１および対極作用部分４－１が形成されている。そして、電極系を構成する、作用極作用部分２－１、参照極作用部分３－１および対極作用部分４－１上には、第一の反応層８および第二の反応層９が順次形成されている。なお、図１では、第一の反応層８と、第二の反応層９と、前記第二の反応層９とカバー７との間に位置する空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。
　ここで、第一の反応層８は、少なくとも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素（以下、「本発明の酸化還元酵素」とも称する）を含む。
　また、第二の反応層９は、前記第一の反応層８上に形成され、少なくとも、脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される。なお、本明細書中、「第二の反応層が脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される」とは、脂質分解酵素を濾紙や不織布等の担持体に担持させることなく、脂質分解酵素を含む溶液を直接第一の反応層に塗布し、乾燥することによって、塗膜を形成することを意味する。
　ここで、上記作用部分（２－１、３－１、４－１）は、バイオセンサの使用時に、第一の反応層８中の試料に電位を印加するための電位印加手段および試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。なお、作用部分（２－１、３－１、４－１）を含めて作用極２、参照極３および対極４と称する場合もある。作用極２および対極４は、バイオセンサの使用時に一対となって、第一の反応層８中の試料に電位を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサの使用時には、参照極３を基準として、対極４と、作用極２との間に所定の電位が印加される。
　本実施形態のバイオセンサは、基板１に設置された接着剤（両面テープ）６を介して第一の反応層８および第二の反応層９を覆うようにカバー７が接着されることにより構成される。なお、接着剤（両面テープ）６は、電極側に設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよいし、両方に設置してもよい。
　本発明のバイオセンサにおいて、試料供給部は、さらに電子伝達体を含むことが好ましい。このような形態における電子伝達体は、いずれの形態で試料供給部中に存在してもよい。具体的には、（ア）第一の反応層８が電子伝達体を含む（電子伝達体を第一の反応層８に配置する）形態、（イ）第二の反応層９が電子伝達体を含む（電子伝達体を第二の反応層９に配置する）形態、（ウ）電子伝達体を含む第三の反応層をさらに配置する形態等が挙げられる。これらの形態（ア）～（ウ）のいずれかが適用されても、あるいは上記形態（ア）～（ウ）の２以上が組み合わせて適用されてもよい。上記形態のうち、（イ）または（ウ）がより好ましい。すなわち、本発明のバイオセンサは、上記第二の反応層が電子伝達体を有する（電子伝達体を第二の反応層に配置する）、または、電子伝達体を含む第三の反応層をさらに有することがより好ましい。
　前者（第二の反応層が電子伝達体を有する）の場合、界面活性剤を含む層（以下界面活性剤層とも称する）をさらに、前記第一の反応層８および第二の反応層９と分離するように、前記試料供給部にもうけることが好ましい。この際、界面活性剤層の配置は特に制限されないが、例えば、界面活性剤層が、第一の反応層８および第二の反応層９と分離されてカバー側に形成されることが好ましい。その際、界面活性剤層がカバー側に形成されていると、カバー７が直接試料にふれる場合よりも、カバー側への全血等の試料の広がりや濡れ性がよくなり、試料を試料供給部に素早く導入できる利点もある。
　また、後者（第三の反応層が電子伝達体を有する）の場合、電子伝達体を有する第三の反応層をさらに、前記第一の反応層８および第二の反応層９と分離するように、前記試料供給部にもうけることが好ましい。この際、第三の反応層の配置は特に制限されないが、例えば、上記第三の反応層は、第一の反応層８および第二の反応層９と分離されてカバー側に形成されることが好ましい。このような配置で、電子伝達体を有することによって、電子伝達体自身、また酸化還元酵素の、保存中の安定性の向上という効果が得られる。これは電子伝達体と酸化還元酵素が互いに接触しないことによる効果である。
　すなわち、上記第三の反応層を含む場合の、本発明のバイオセンサの他の実施形態によると、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、前記電極系上に形成され、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層と、を含む反応層を有し、さらに電子伝達体を含む第三の反応層を第一の反応層および第二の反応層と分離した形態で配置される。以下、上記本発明の他の実施形態によるバイオセンサを、図３、４を参照しながら説明する。
　図３は、本発明のバイオセンサの、上記第三の反応層を含む、他の実施形態を示す分解斜視図である。図４は、図３のバイオセンサの断面図である。なお、本明細書では、図３、４に示されるバイオセンサを「第２のバイオセンサ」とも称する。
　図３、４に示されるとおり、基本的な構造は、電子伝達体を含む第三の反応層１０をさらに設ける（すなわち、第一の反応層８および第二の反応層９に加えて、第三の反応層１０を配置する）以外は、図１、２で示されるバイオセンサと同様である。すなわち、カバー７側に形成される方を第三の反応層１０と称し、電極側に形成される方を電極側から順次第一の反応層８および第二の反応層９と称する。この際、第一の反応層８と、第二の反応層９と、第三の反応層１０と、前記第二の反応層９および前記第三の反応層１０の間に配置される空間部Ｓと、が試料供給部を形成する。前記第一の反応層８が酸化還元酵素を含み、前記第二の反応層９が脂質分解酵素を含み、かつ前記第三の反応層１０が電子伝達体を含む。換言すれば、当該他の実施形態による第２のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素、脂質分解酵素および電子伝達体は同時に同一の反応層に含まれない。なお、第三の反応層１０は、両端に接着剤（両面テープ）６ａが設置されたカバー７上の両端の隙間に形成されてなる。
　第２のバイオセンサは、第一の反応層８および第二の反応層９が形成されている基板１に接着された接着剤（両面テープ）６ｂと、第一の反応層８が形成されているカバー７に接着した接着剤（両面テープ）６ａと、が互いに貼り合わされることにより、構成されてなる。なお、接着剤（両面テープ）６は、基板１側のみに設置してもよいし、カバー７側のみに設置してもよい。
　以下、各構成要件を詳説する。なお、上記の通り、第１のバイオセンサの構造と、第２のバイオセンサの構造とは、第２のバイオセンサがさらに第三の反応層１０を有すること以外は同様であるので、特に明記しない限り、下記に記載する構成要件の具体的な説明は、本発明の第１のバイオセンサにも、第２のバイオセンサにも適用される。また、各構成要件の含有量を説明する際に「１センサ」という用語を用いることがあるが、本明細書における「１センサ」とは、一般的なバイオセンサの大きさである、試料供給部に供給される試料が「０．１～２０μｌ（好ましくは２μｌ程度）」であるものを想定している。よって、それよりも小さかったり、大きかったりするバイオセンサにおいては、各構成要件の含有量を適宜調整することによって、本発明を適用することができる。
　＜絶縁性基板＞
　本発明において使用される絶縁性基板１は、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、プラスチック、紙、ガラス、セラミックス等である。また、絶縁性基板１の形状やサイズについては、特に制限されない。
　プラスチックとしても、特に制限はなく従来公知のものを使用することができる。一例を挙げると、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリイミド、アクリル樹脂等が使用できる。
　＜電極＞
　本発明の電極は、少なくとも作用極２と対極４とを含む。
　本発明の電極は、試料（測定対象物）と、本発明の酸化還元酵素との反応を電気化学的に検出できるものであれば特に制限されず、例えば、カーボン電極、金電極、銀電極、白金電極、パラジウム電極等が挙げられる。耐腐食性およびコストの観点からは、カーボン電極が好ましい。
　本発明においては、作用極２および対極４のみの二電極方式であっても、参照極３をさらに含む三電極方式であってもよい。なお、電位の制御がより高感度で行われるという観点からは、二電極方式よりも三電極方式が好ましく用いられうる。また、その他、液量を感知するための感知電極等を含んでいてもよい。
　また、試料供給部と接触する部分（作用部分）は、それ以外の電極部分と構成材料が異なってもよい。例えば、参照極３が、カーボンからなっている場合に、参照極作用部分３－１が、銀／塩化銀からなっていてもよい。なお、バイオセンサは、一般的に使い捨てであるため、電極としては、ディスポーザブル電極を用いるとよい。
　＜絶縁層＞
　絶縁層５を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙等により構成されうる。好ましくは、ＰＥＴである。
　＜試料供給部＞
　上記の通り、本発明の第１のバイオセンサにおいて、試料供給部は、酸化還元酵素を含む第一の反応層８と脂質分解酵素を含む第二の反応層９とを有する。また、第一の反応層および第二の反応層と分離されて、カバー７側に界面活性剤層が設けられる場合には、試料供給部は界面活性剤層をも有する。
　一方で、本発明の第２のバイオセンサにおいては、前記試料供給部が、酸化還元酵素を含む第一の反応層８と脂質分解酵素を含む第二の反応層９とに加えて、前記第一の反応層８および第二の反応層９から分離されて形成される第三の反応層１０を有し、前記第三の反応層９が電子伝達体を含む。本発明の第２のバイオセンサのように、第三の反応層を設けることによって、酸化還元酵素および電子伝達体を別々の反応層に含有させることができるため、電子伝達体と、かかる酸化還元酵素とが接触することによる保存中の劣化を防ぐことができる。
　本発明において、第一の反応層８および第二の反応層９の厚みは、特に制限されず、通常の反応層の厚みとなるように適宜選択できる。第一の反応層８は、好ましくは０．０１～２５μｍ、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、特に好ましくは０．０５～８μｍである。また、第二の反応層９の厚みは、好ましくは０．０１～２５μｍ、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、特に好ましくは０．０５～８μｍである。さらに、第一の反応層８および第二の反応層９の厚みの合計厚みは、好ましくは０．０２～５０μｍ、より好ましくは０．０５～２０μｍ、特に好ましくは０．１～１６μｍにするとよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、所定の成分を含む溶液の塗布量（例えば、滴下する量）を適宜調節することにより、制御することができる。
　また、本発明の第一のバイオセンサにおいて、第一の反応層８および第二の反応層９と分離されてカバー７側に界面活性剤層が形成される場合には、その厚みは０．０１～２５μｍが好ましく、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、さらに好ましくは０．０５～８μｍである。第二の反応層９と、界面活性剤層との離隔距離は好ましくは０．０５～１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７～１．２５ｍｍ、さらに好ましくは０．０９～１ｍｍである。上記範囲であれば、毛細管現象が起こりやすく、試料が試料供給部に導入されやすい。ここで、第一の反応層８、第二の反応層９、および必要に応じて形成される界面活性剤層の厚さは、同じであっても異なっていてもよい。
　また、本発明の第２のバイオセンサの場合における第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層の厚みは、特に制限されず、通常の反応層の厚みとなるように適宜選択できる。第一の反応層８は、好ましくは０．０１～２５μｍ、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、特に好ましくは０．０５～８μｍである。また、第二の反応層９の厚みは、好ましくは０．０１～２５μｍ、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、特に好ましくは０．０５～８μｍである。さらに、第一の反応層８および第二の反応層９の厚みの合計厚みは、好ましくは０．０２～５０μｍ、より好ましくは０．０５～２０μｍ、特に好ましくは０．１～１６μｍにするとよい。
　また、第三の反応層１０の厚さは、好ましくは０．０１～１０μｍ、より好ましくは０．０２５～１０μｍ、特に好ましくは０．０５～８μｍにするとよい。ここで、第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の厚さは、同じであっても異なってもよい。この際の、厚みの制御方法としても特に制限はないが、例えば、所定の成分を含む溶液の塗布量（例えば、滴下する量）を適宜調節することにより、厚みを制御することができる。なお、第二の反応層９と、第三の反応層１０との、離隔距離には特に制限はないが、好ましくは０．０５～１．５ｍｍ、より好ましくは０．０７５～１．２５ｍｍ、特に好ましくは０．１～１ｍｍである。上記範囲であれば、保存中に酸化還元酵素と、電子伝達体とが接触せず、また、毛細管現象が起こりやすく、試料が反応層に吸引されやすい。離隔距離は、接着剤の厚みを制御することにより、制御することができる。つまり、接着剤は、第二の反応層９と、第三の反応層１０と、を離隔される、スペーサとしての役割をも担う。
　（酸化還元酵素）
　本発明における第一の反応層８は、補欠分子族（「補酵素」とも称する）としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む。特に、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素が好ましい。なお、本発明においては、本発明の酸化還元酵素を単独で、または混合物の形態として使用してもよい。
　本発明において、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、特に制限されず、試料の種類に依存するが、補欠分子族として、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含む酸化還元酵素としては、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、マンニトールデヒドロゲナーゼ、アラビトールデヒドロゲナーゼ、ガラクチトールデヒドロゲナーゼ、キシリトールデヒドロゲナーゼ、アドニトールデヒドロゲナーゼ、エリスリトールデヒドロゲナーゼ、リビトールデヒドロゲナーゼ、プロピレングリコールデヒドロゲナーゼ、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２－ケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、５ケト－グルコン酸デヒドロゲナーゼ、２，５－ジケトグルコン酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、環状アルコールデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アミンデヒドロゲナーゼ、シキミ酸デヒドロゲナーゼ、ガラクトースオキシダーゼ等が挙げられる。
補欠分子族としてフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、Ｄ－アミノ酸オキシダーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、モノアミンオキシダーゼ、サルコシンデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ、コレステロールオキシダーゼ等が挙げられる。
　中でも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）またはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の少なくとも一方を含むグリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むグリセロールデヒドロゲナーゼ（以下、「ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素」とも称する）が特に好ましい。
　上記の本発明の酸化還元酵素は、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酸化還元酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酸化還元酵素を産生する細菌を、栄養培地に培養し、該培養物から当該酸化還元酵素を抽出する公知の方法が挙げられる（例えば、特開２００８－２２０３６７号公報参照）。
　具体的には、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を例に挙げると、当該グリセロールデヒドロゲナーゼを産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属等様々な属に属する細菌が挙げられる。特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素が好ましく用いられうる。中でも、入手の容易さから、グルコノバクター・アルビダス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｉｄｕｓ）ＮＢＲＣ　３２５０、３２７３、１０３５０９、１０３５１０、１０３５１６、１０３５２０、１０３５２１、１０３５２４；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ　３２６７、３２７４、３２７５、３２７６；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ　３１７１、３２５１、３２５３、３２６２、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２８５、３２８６、３２９０、１６６６９、１０３４１３、１０３４２１、１０３４２７、１０３４２８、１０３４２９、１０３４３７、１０３４３８、１０３４３９、１０３４４０、１０３４４１、１０３４４６、１０３４５３、１０３４５４、１０３４５６、１０３４５７、１０３４５８、１０３４５９、１０３４６１、１０３４６２、１０３４６５、１０３４６６、１０３４６７、１０３４６８、１０３４６９、１０３４７０、１０３４７１、１０３４７２、１０３４７３、１０３４７４、１０３４７５、１０３４７６、１０３４７７、１０３４８２、１０３４８７、１０３４８８、１０３４９０、１０３４９１、１０３４９３、１０３４９４、１０３４９９、１０３５００、１０３５０１、１０３５０２、１０３５０３、１０３５０４、１０３５０６、１０３５０７、１０３５１５、１０３５１７、１０３５１８、１０３５１９、１０３５２３；グルコノバクター・ジャポニカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ　３２６０、３２６３、３２６９、３２７１、３２７２；グルコノバクター・カンチャナブリエンシス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｋａｎｃｈａｎａｂｕｒｉｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ　１０３５８７，１０３５８８；グルコノバクター・コンドニ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｋｏｎｄｏｎｉｉ）ＮＢＲＣ　３２６６；グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ　３１３０、３１８９、３２４４、３２８７、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、１２５２８、１４８１９；グルコノバクター・ロセウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｏｓｅｕｓ）ＮＢＲＣ　３９９０；グルコノバクター・エスピー（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ）ＮＢＲＣ　３２５９、１０３５０８；グルコノバクター・スファエリカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ　１２４６７；グルコノバクター・タイランディカス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ　ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ　３１７２、３２５４、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８９、３２９１、１００６００、１００６０１等を使用することができる。
　上記ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。炭素源としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトール等が使用される。窒素源としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。その他、特定のビタミン等が必要に応じて使用される。上記の炭素源、窒素源、無機物、およびその他の必要な栄養素は、単独で用いても２種以上組み合わせて用いてもよい。
　培養は、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は好ましくは２０℃～５０℃、より好ましくは２２℃～４０℃、最も好ましくは２５℃～３５℃である。培養ｐＨは好ましくは４～９、より好ましくは５～８である。これら以外の条件下でも、使用する菌株が生育すれば実施される。培養期間は通常０．５～５日が好ましい。上記培養により、菌体内に酸化還元酵素が蓄積される。なお、これらの酸化還元酵素は、上記培養によって得られた酵素であっても、酸化還元酵素遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
　次いで、得られたＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を抽出する。抽出方法は一般に使用される抽出方法を用いることができ、例えば超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、リゾチーム法等を用いることができる。抽出した酸化還元酵素の精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝等の塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンを用いる除核酸、またはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）－セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）－セファロース等のイオン交換クロマト法等を用いることができる。
　なお、これらの方法で得られる部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用しても、または化学修飾された形態で使用してもよい。本発明において、化学修飾された形態の酸化還元酵素を使用する場合には、上記の方法で得られる培養物由来の酸化還元酵素を、例えば、特開２００６－２７１２５７号公報に記載されるような方法等を用いて適宜化学修飾して使用することができる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
　本発明の酸化還元酵素の含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、電子伝達体の種類や、後述する親水性高分子の量等によって適宜選択することができる。一例を挙げると、例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を使用する場合には、１センサあたり、グリセロールの分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、好ましくは０．０１～１００Ｕ、より好ましくは０．０５～５０Ｕ、特に好ましくは０．１～１０Ｕである。なお、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素の活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、特開２００６－２７１２５７号公報に記載の方法による。また、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含む酸化還元酵素は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
　（脂質分解酵素）
　また、本発明における第二の反応層９は、脂質を構成するエステル結合を加水分解する脂質分解酵素を含む。ゆえに、本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサとして使用ことができる。かような脂質分解酵素として、特に制限されないが、具体的には、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）、リパーゼ、エステラーゼが好適に挙げられる。特に、反応性の観点で、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ）が好ましい。
　ＬＰＬの含有量については特に制限はなく、測定する試料の種類や試料の添加量、使用する親水性高分子の量や電子伝達体の種類等によって適宜選択することができる。一例を挙げると、中性脂肪の分解を迅速に行い、且つ反応層の溶解性を下げない酵素量（酵素活性量）という観点から、１センサあたり、好ましくは０．１～１０００活性単位（Ｕ）、より好ましくは１～５００Ｕ、特に好ましくは１０～１００Ｕである。なお、ＬＰＬの活性単位（Ｕ）の定義および測定方法は、国際公開第２００６／１０４０７７号パンフレットに記載の方法による。また、ＬＰＬは、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
　本発明では、前記酸化分解酵素と前記脂質分解酵素とは、それぞれ、第一の反応層および第二の反応層という別の層に分かれて存在する。かような形態であれば、脂質分解酵素による加水分解反応が効率よく進行する。
　（電子伝達体）
　本発明のバイオセンサは、電子伝達体を含むことが好ましい。ここで、電子伝達体は、第一の反応層８または第二の反応層９に含まれてもよいが、これらの反応層とは別に第三の反応層に含まれることが好ましい。この場合には、電子伝達体を含む反応層は、電極とは離間して存在させることがより好ましく、第一の反応層８または第二の反応層９、特に第二の反応層９と離間して存在させることが特に好ましい。すなわち、本発明は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、前記試料供給部が、前記電極系上に形成され、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層と、前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層と、を含む反応層を有し、さらに、電子伝達体を含む第三の反応層を前記第一および第二の反応層と分離されて形成されてなる、バイオセンサ（第２のバイオセンサ）が提供される。
　本発明の第２のバイオセンサでは、第三の反応層１０は、電子伝達体（「電子受容体」とも称する場合がある）を含む。このように電子伝達体を電極とは離間して存在させることにより、局部電池のような現象により電子伝達体が自動的に還元されてしまうのを抑制・防止できる。これにより、精度がより向上したバイオセンサを提供することができる。
　電子伝達体は、バイオセンサの使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子伝達体は、酵素反応の終了後に電極への電位の印加によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（以下、「酸化電流」とも称する）の大きさから、試料中の所望の成分の濃度が算出されうる。
　本発明において使用される電子伝達体としては、従来公知のものを使用することができ、試料や使用する酸化還元酵素に応じて適宜決定できる。なお、電子伝達体は、単独で用いても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　電子伝達体としては、より具体的には、フェリシアン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロセンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェートおよびその誘導体、ｐ－ベンゾキノンおよびその誘導体、２，６－ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、ニトロテトラゾリウムブルー、オスミウム錯体、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物等のルテニウム錯体等を好適に使用することができる。これらのうち、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物、フェリシアン化カリウムが好ましく、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物がより好ましく使用される。
　電子伝達体の含有量については特に制限はなく、試料の添加量等に応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、１センサあたり、基質量に対して十分量を含有させるという観点から、好ましくは１～２０００μｇ、より好ましくは５～１０００μｇ、特に好ましくは１０～５００μｇの電子伝達体が含まれるとよい。また、電子伝達体は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
　（界面活性剤）
　本発明のバイオセンサにおいては、第一の反応層８、第二の反応層９または第三の反応層１０が、必要であれば界面活性剤を有する。また、本発明の第１のバイオセンサにおいては、第一の反応層８および第二の反応層９と分離されて、界面活性剤層がカバー７側に形成されていてもよい。
　酸化還元酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるため、従来の一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採っていた。しかし、第一の反応層８に界面活性剤を含有させることにより、酸化還元酵素が電極に固着することを有意に抑制・防止し、その結果、電極近傍での、酸化還元酵素による酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率を向上できる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性を高くすることができる。また、カバー７側に界面活性剤が形成されていると、カバー７が直接試料に触れる場合よりも、カバー側への全血等の試料の広がりや濡れ性がよくなり、試料を試料供給部に素早く導入できるため好ましい。
　本発明に用いられる界面活性剤としては、使用する本発明の酸化還元酵素の酵素活性が低下しないものであれば、特に制限されないが、例えば、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、天然型界面活性剤等を適宜選択して使用することはできる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、非イオン性界面活性剤および両性界面活性剤の少なくとも一方である。
　非イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、本発明の酸化還元酵素の酵素活性に影響を及ぼさないという観点から、ポリオキシエチレン系またはアルキルグリコシド系であることが好ましい。
　ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔ－オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｐ－ｔ－ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）］、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ　２０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノパリミテート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｐａｌｍｉｔａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ　４０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ　６０）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ　Ｓｏｒｂｉｔａｎ　Ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ；Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製））等が好ましい。中でも、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げるという観点から、ポリオキシエチレン－ｐ－ｔ－オクチルフェノール（オキシエチレン数＝９，１０）［（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｐ－ｔ－ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｏｌ；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００）］、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製））が好ましい。
　アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤としては、特に制限はないが、炭素数７～１２のアルキル基を有するアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド等が好ましい。かかる炭素数については、より好ましくは７～１０であり、特に好ましくは炭素数８である。糖部分は、グルコース、マルトースが好ましく、より好ましくはグルコースである。より具体的には、ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシドであると好ましい。アルキルグリコシド系非イオン性界面活性剤は、バイオセンサに使用する際、製造過程において、非常に塗りやすく、均一にできる。特に、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド）が反応層１０（第一の反応層８、第二の反応層９）に含有されると、試料溶液を滴下した際の広がりが非常によく、濡れ性がよい（表面張力を起こしにくくする。）。よって、広がりや濡れ性の観点で考えると、アルキルグリコシドよりもアルキルチオグリコシドが非常に好ましい。なお、これらは、単独で用いても混合物の形態で用いてもよい。
　両性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、ｎ－アルキル－Ｎ－Ｎ－ジメチル－３－アンモニオ－１－プロパンスルホン酸（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標））等が挙げられる。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。好ましくは、３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）または３－［（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）である。特にＣＨＡＰＳが好ましい。その理由は、ＣＨＡＰＳは界面活性剤の中でも低溶血性のものだからである。
　陽イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、セチルピリジニウムクロリド、トリメチルアンモニウムブロミドが挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
　陰イオン性界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
　天然型界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、リン脂質が挙げられ、好ましくは、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添レシチン、高純度レシチン等のレシチン等が挙げられる。これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
　上記の界面活性剤のうち、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤を使用することが好ましい。具体例を挙げると、上記のＣＨＡＰＳや、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）が好ましい。
　また、本発明の第２のバイオセンサにおいては、界面活性剤は、第一の反応層８、第二の反応層９、および第三の反応層１０のいずれの反応層に含まれてもよいが、好ましくは第一の反応層８または第三の反応層１０、より好ましくは第一の反応層８および第三の反応層１０が界面活性剤を含む。これにより、酸化還元酵素や電子伝達体の溶解が促進されうる。また、上記３反応層の２以上の反応層に界面活性剤を存在させる場合には、これらの反応層に含める各界面活性剤の種類や配合量は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９、第三の反応層１０に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
　より具体的には、まず、上記の通り、第一の反応層８に酸化還元酵素が含有されるが、例えば、酸化還元酵素としてＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を含有させる場合、それらは疎水性が強いため、少なくとも第一の反応層８には界面活性剤が含有されることが好ましい。この場合、界面活性剤の種類としては、バイオセンサの精度をより向上させる観点で、試料として全血を使用する場合、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ－２９０等）を使用することが好ましい。一方で、上記述べた通り、第２のバイオセンサでは、第三の反応層１０は電子伝達体（例えば、ヘキサアンモンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）を含有するが、この際、広がりや濡れ性を向上させて、バイオセンサの精度をより向上させるとの観点で、第三の反応層１０にも界面活性剤が含有されることがより好ましい。この場合にもまた、広がりや濡れ性の観点で考えると、低溶血性の界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ、エマルゲンＰＰ－２９０等）を使用することが好ましい。このような工夫を施すことによって、よりバイオセンサとしての精度が向上する。
　界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料の添加量等に応じて適宜調節されうる。
　界面活性剤として、両性のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１～１００μｇ、より好ましくは０．０５～５０μｇ、特に好ましくは０．１～１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、後述もするが、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。なお、界面活性剤が１センサに２種類以上含まれるときは、含量は、その合計量を意味する。
　界面活性剤として、非イオン性界面活性剤のものを用いる場合、１センサあたり、本発明の酸化還元酵素の溶解性を上げ、且つ酵素活性を失活させず、また製造工程において塗布しやすいという観点から、好ましくは０．０１～１００μｇ、より好ましくは０．０５～５０μｇ、特に好ましくは０．１～１０μｇが含まれるとよい。また、かような界面活性剤は、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。
　（親水性高分子）
　本発明における第一の反応層８、第二の反応層９、または第三の反応層１０は、さらに親水性高分子を含んでもよい。
　上記したように、酸化還元酵素はタンパク質から構成されているため、電極表面にそれが付着すると、電極表面が不動態化する虞があるため、従来の一般的なバイオセンサにおいては、電極に酵素が直接接触しないような構成を採っていた。しかし、第一の反応層８に親水性高分子を含有させることにより、酸化還元酵素が電極に固着することを有意に抑制・防止し、その結果、電極近傍での、酸化還元酵素による酸化型電子伝達体の還元型電子伝達体への変換効率を向上できる、換言すれば、より試料液中の基質濃度との相関性を高くすることができる。
　また、親水性高分子は、第１のバイオセンサの場合には、第一の反応層８もしくは第二の反応層９、または第２のバイオセンサの場合には、第一の反応層８、第二の反応層９もしくは第三の反応層１０のいずれに含有されてもよい。親水性高分子は、本発明の酸化還元酵素または電子伝達体等を電極上に固定化する機能を有する。このため、第一の反応層８、第二の反応層９または第三の反応層１０、特に第一の反応層８または第三の反応層１０が親水性高分子を含むと、基板１および電極表面からのこれらの反応層の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、上記第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質等の吸着性成分の電極への吸着もまた、抑制されうる。なお、第一の反応層８、第二の反応層９または第三の反応層１０が親水性高分子を含む場合、反応層内に親水性高分子が含まれる形態を有していてもよく、または第一の反応層８、第二の反応層９または第三の反応層１０を覆うように親水性高分子を含む親水性高分子層を形成させた形態を有してもよい。
　本発明に用いることができる親水性高分子としては、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸の重合体またはその誘導体、無水マレイン酸の重合体またはその塩、スターチおよびその誘導体等が挙げられる。これらのうち、本発明の酸化還元酵素の酵素活性を失活させず、且つ溶解性が高いという観点から、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよびポリビニルアルコールが好ましい。なお、これらは、単独で用いても、混合物の形態で用いてもよい。
　なお、このような親水性高分子の配合量は、１センサあたり、酵素や電子伝達体を固定化でき、且つ反応層の溶解性を下げないという観点から、好ましくは０．０１～１００μｇであり、より好ましくは０．０５～５０μｇであり、特に好ましくは０．１～１０μｇである。親水性高分子は、後述もするが、例えば、グリシルグリシンのような緩衝液で調製しておくことも好ましい。また、上記第一の反応層８、第二の反応層９または第三の反応層１０の２以上の反応層に親水性高分子を存在させる場合には、これらの反応層に含める各親水性高分子の種類や配合量は、同一であっても異なるものであってもよい。この際、第一の反応層８、第二の反応層９、第三の反応層１０に含有される各構成要件との相互作用を考慮して選択することが好ましい。
　（糖）
　本発明の第一のバイオセンサおよび第二のバイオセンサにおいて、第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の少なくとも一つは、さらに糖を含んでもよい。糖は測定に関わる酵素反応に関与せず、また、自身が反応することもないものを適宜選択して使用することができ、各層の固定化や安定化に寄与し得る。糖は、第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０のいずれに含まれてもよいが、少なくとも第一の反応層８に含まれることが好ましい。
　第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の少なくとも一つに含み得る糖としては、遊離性のアルデヒド基やケトン基を持たない、還元性を有していない非還元糖が好ましい。このような非還元糖としては、還元基同士の結合したトレハロース型小糖類、糖類の還元基および非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコール等が挙げられる。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型小糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール等の糖アルコール等が挙げられる。これら非還元糖は、単独で用いてもよいし、二種以上の混合物の形態で用いてもよい。中でも、トレハロース、ラフィノース、スクロースが好ましく、特にトレハロースが好ましい。
　第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の少なくとも一つに含まれる糖の配合量は、１センサあたり好ましくは０．１～５００μｇ、より好ましくは０．５～４００μｇ、さらに好ましくは１～３００μｇである。糖が混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。上記の範囲であれば、センサの性能を低下させることなく各層の固定化や安定化に寄与できる。
　（タンパク質）
　本発明の第１および第２のバイオセンサにおいて、第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の少なくとも一つは、さらにタンパク質を含んでもよい。タンパク質は測定に関わる酵素反応に関与せず、また、自身が反応することもない、生理活性を示さないものを適宜選択して使用することができ、各層の固定化や安定化に寄与し得る。タンパク質は、第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０のいずれに含まれてもよいが、少なくとも第一の反応層８に含まれることが好ましい。
　第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０の少なくとも一つに含み得るタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、セリシン、およびそれらの加水分解物が挙げられる。これらのタンパク質は単独でも二種以上の混合物の形態で用いてもよい。このうち、入手し易くコストも安いことからＢＳＡが好ましい。好ましいタンパク質の分子量は、１０～１０００ｋＤａ、より好ましくは２５～５００ｋＤａ、さらに好ましくは５０～１００ｋＤａである。この際、分子量はゲル濾過クロマトグラフィー法を用いて測定した値を採用する。
　第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０に含まれるタンパク質の配合量は、１センサあたり好ましくは０．１～２００μｇ、より好ましくは０．５～１００μｇ、さらに好ましくは１～５０μｇである。タンパク質が二種以上の混合物の形態であれば、配合量は全成分の合計を意味する。上記の範囲であれば、センサの性能を低下させることなく各層の固定化や安定化に寄与できる。
　＜バイオセンサの製造方法＞
　本発明の第１および第２のバイオセンサにおける第一の反応層８、第二の反応層９および第三の反応層１０を形成する方法にも特に制限はない。以下では、本発明の第２のバイオセンサの作製方法の好ましい実施形態を説明する。なお、本発明は、下記の方法に限定されるものではない。また、本発明の第１のバイオセンサの作製もまた、特に制限されないが、例えば、下記において第三の反応層を形成しない以外は、同様にして実施できる。
　前記第一の反応層８および第三の反応層１０は、いずれの方法によって形成されてもよいが、第二の反応層９は、脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって第一の反応層８上に形成される。ここで、塗布方法は、特に制限されず、脂質分解酵素を含む溶液を、滴下により、あるいはスプレー装置、バーコーター、ダイコーター、リバースコーター、コンマコーター、グラビアコーター、スプレーコーター、ドクターナイフ等の塗布器具を用いて塗布する方法が使用できる。
　また、前記第一の反応層８および第三の反応層１０の形成方法は、特に制限されず、上記第二の反応層の形成方法と同等の方法が使用できる。この際、第二の反応層９の形成方法、ならびに前記第一の反応層８および第三の反応層１０の形成方法は、同一であってもあるいは異なるものであってもよいが、作製のしやすさや製造コスト等を考慮すると、同様の方法を使用することが好ましく、所定の成分を含む溶液を滴下により塗布した後、塗膜を乾燥する方法が特に好ましい。このような方法は、簡便にバイオセンサを作製でき、また、大量生産時における製造コストを安く抑えることができる点で好ましい。
　まず、第一の反応層を以下のようにして形成する。すなわち、酸化還元酵素（例えば、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素）、ならびに必要に応じて界面活性剤（例えば、エマルゲン）およびグリシルグリシン緩衝液等の所望の成分を混合して、酸化還元酵素溶液を調製する。この酸化還元酵素溶液を、電極（作用部分）に、所定量滴下する。調製した酸化還元酵素溶液を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させることにより、第一の反応層を電極（作用部分）に形成する。なお、界面活性剤については、単に第一の反応層内に含有されていてもよいし、第一の反応層を覆うように界面活性剤を含む層を形成してもよいし、電極上に界面活性剤層を形成させ、その上に第一の反応層８を形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、親水性高分子等）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。なお、予め基板１に接着剤を設置してもよい。
　界面活性剤層を形成する場合は、界面活性剤（例えば、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）をグリシルグリシン緩衝液、揮発性有機溶媒等の所望の成分と混合して、界面活性剤溶液を調製する。この界面活性剤溶液を、電極や第一の反応層上に、または、後述するように、第二の反応層、第三の反応層またはカバー７上に、所定量滴下する。界面活性剤溶液を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させることにより、界面活性剤層を形成する。
　次に、第二の反応層を以下のようにして形成する。すなわち、脂質分解酵素（例えば、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ））をグリシルグリシン緩衝液等の所望の成分を混合して、脂質分解酵素溶液を調製する。この脂質分解酵素溶液を、上記で作製した酸化還元酵素層に、所定量滴下する。調製した脂質分解酵素溶液を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させることにより、第二の反応層を第一の反応層上に形成する。なお、界面活性剤をさらに第二の反応層に追加してもよい。界面活性剤は単に第二の反応層内に含有されていてもよいし、第二の反応層を覆うように界面活性剤を含む層を上記の通り形成してもよい。また、必要に応じ上記した他の成分（例えば、親水性高分子等）を添加してもよい。また、必要に応じエタノール等の揮発性有機溶媒を添加しておいてもよい。揮発性有機溶媒を添加しておくことで、早く乾きやすく、結晶化が小さくて済む。
　また、第三の反応層は以下のようにして形成する。すなわち、電子伝達体（例えば、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物）、ならびに必要に応じて界面活性剤（例えば、エマルゲン）およびグリシルグリシン緩衝液等の所望の成分を混合して、電子伝達体溶液を調製する。この電子伝達体溶液を、カバー７に、所定量滴下する。調製した電子伝達体溶液を滴下した後、所定の温度に保った恒温槽内やホットプレート上にて乾燥させることにより、第三の反応層をカバー上に形成する。この際、界面活性剤については、単に反応層内に含有されていてもよいし、反応層を覆うように界面活性剤を含む層を上記の通り形成してもよいし、カバーに界面活性剤層を形成し、その上に第三の反応層１０を形成してもよい。なお、予めカバー７に接着剤を設置してもよい。
　最後に、第一の反応層８および第二の反応層９が形成されている基板１と、第三の反応層１０が形成されているカバー７を、接着剤６ａ、６ｂを介して張り合わせることにより、第２のバイオセンサを製造することができる。
　＜バイオセンサの適用＞
　本発明において使用される試料は、好ましくは、溶液形態である。溶液形態における溶媒としても特に制限されず、従来公知の溶媒を適宜参照し、あるいは組み合わせて適用することができる。
　試料としても、特に制限はされないが、例えば、全血、血漿、血清、唾液、尿、骨髄等の生体試料；ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類；排水、雨水、プール用水等が挙げられる。好ましくは、全血、血漿、血清、唾液、骨髄であり、より好ましくは全血である。
　なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度等を調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料に含まれる基質についても特に制限はなく、本発明の第一の反応層および第二の反応層に含まれる各酵素と反応し、後述するように測定可能な電流を生じうる物質であればよい。
　試料中の所望の成分（基質）としては、例えば、グルコース等の糖類、グリセロール、ソルビトール、アラビトール等の多価アルコール、中性脂肪、コレステロール等の脂質、グルタミン酸や乳酸等の有機酸類、クレアチン、クレアチニン等が挙げられる。上記と同様の理由から、中性脂肪やコレステロール等の脂質が基質として選択されることが好ましい。
　試料を試料供給部へ供給する形態は特に制限されず、例えば、毛細管現象を利用して、反応層（第一の反応層８、第二の反応層９、第三の反応層１０）に対して水平方向から試料を供給してもよい。
　反応層（第一の反応層８、第二の反応層９、第三の反応層１０）へと試料が供給されると、試料中の所望の成分（基質）は、第二の反応層９に含まれる脂質分解酵素と第一の反応層８に含まれる酸化還元酵素の作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、第三の反応層１０から溶け出した電子伝達体に捕捉され、これに伴って電子伝達体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサを所定時間放置することにより、脂質分解酵素と酸化還元酵素によって基質が完全に酸化され、一定量の電子伝達体が酸化型から還元型へと変換される。
　本発明のバイオセンサによると、基質と酵素との反応を完結させる反応時間（即ち、測定時間）を有意に短縮できる。この際、基質と酵素との反応を完結させる反応時間（測定時間）は、特に制限されないが、試料添加後、通常は１秒～１２０秒、好ましくは１秒～９０秒、より好ましくは１～６０秒、特に好ましくは１～４５秒である。
　その後、還元型の電子伝達体を酸化する目的で、電極を介して、作用極２と対極４との間に、所定の電位を印加する。これにより、還元型の電子伝達体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される電流（以下、「酸化電流」とも称する）の値から、電位印加前の還元型の電子伝達体の量が算出され、さらに、酵素と反応した基質の量が定量されうる。酸化電流を流す際に印加される電位の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、－２００～＋７００ｍＶ程度、好ましくは０～＋５００ｍＶの電位を、対極４と作用極２との間に印加すればよい。電位を印加するための電位印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電位印加手段が適宜用いられうる。
　酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電位を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。
　以上、還元型の電子伝達体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子伝達体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより基質濃度を算出する形態が採用されてもよい。
　本発明のバイオセンサは、いずれの形態で使用してもよく特に制限されない。例えば、使い捨て用途としてのディスポーザブルタイプのバイオセンサ、少なくとも電極部分を人体に埋め込んで連続的に所定の値を測定するためのバイオセンサ等、様々な用途に使用できる。
　本発明のバイオセンサは、中性脂肪センサ、コレステロールセンサ等の従来公知のセンサに適用することが可能である。
　本発明の効果を以下に纏める。
　本発明のバイオセンサにおいては、酸化還元酵素および脂質分解酵素を別の反応層に含有されるため、脂質分解酵素による中性脂肪のグリセロールへの分解および酸化還元酵素による酸化反応が速やかに進行する。このため、短時間で試料中のグルコースや中性脂肪濃度を測定できる。また、この際、測定値のばらつきがほとんど生じず、バイオセンサの測定精度がより向上する。
　本発明の効果を、以下の実施例および比較例を用いて説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。なお、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を意味する。
　＜全血中の中性脂肪濃度の測定＞
　（実施例１）
　電極は、ＤＥＰ　Ｃｈｉｐ　ＥＰ－Ｎ（有限会社バイオデバイステクノロジー製）を使用した。ＤＥＰ　Ｃｈｉｐ　ＥＰ－Ｎは、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分２－１、銀／塩化銀からなる参照極作用部分３－１、カーボンからなる対極作用部分４－１が形成されている。
　第一の反応層（ＧＬＤＨ層）は以下の手順で形成した。
　１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を１．５Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業工業株式会社製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）を０．０２５％（０．５μｇ）になるように混合し、溶液（ＧＬＤＨ溶液）を得た。得られたＧＬＤＨ溶液をＥＰ－Ｎの作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、３０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層（ＧＬＤＨ層）を得た。
　第二の反応層（ＬＰＬ層）は以下の手順で形成した。
　１センサ（試料液量２μｌ）あたり、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ、旭化成株式会社製）を７５Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業工業製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）になるように混合し、溶液（ＬＰＬ溶液）を得た。得られたＬＰＬ溶液を、形成させたＧＬＤＨ層の上に重層（被覆）するように滴下し、３０℃で５分間乾燥させ、第二の反応層（ＬＰＬ層）を得た。
　このようにして、第一の反応層であるＧＬＤＨ層上に第二の反応層であるＬＰＬ層を形成（重層）した。
　第三の反応層（電子伝達体層）は以下の手順で形成した。
　１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（和光純薬工業工業株式会社製）を１００ｍＭ（６５μｇ）、グリシルグリシン（和光純薬工業工業株式会社製）を２５ｍＭ（３．２５μｇ）、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）を０．１％（２μｇ）になるように混合し、メディエーター溶液を得た。得られたメディエーター溶液を、ＰＥＴからなるカバーに接着剤（両面テープ）を貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、第三の反応層（電子伝達体層）を形成した。
　第三の反応層が形成されているカバーと、第一の反応層および第二の反応層が形成されている基板に接着した接着剤（両面テープ）とを互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層、第二の反応層および第三の反応層の厚みはそれぞれ５μｍであり、第二の反応層と第三の反応層との離隔距離は０．１５ｍｍであった。
　試料液（全血、中性脂肪値３００ｍｇ／ｄｌ）２μｌを吸入させてから反応時間として各秒数待機後、参照極を基準にして作用極と対極の間に＋２００ｍＶの電位を印加し、５秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち全血中の分解された中性脂肪の濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。結果を表１および図５に示す。なお、図５中、実施例１の結果は、白抜き丸（○）で表わす。
　（実施例２）
　上記実施例１と同様にして、第一の反応層（ＧＬＤＨ層）を形成した。
　第二の反応層（電子伝達体含有ＬＰＬ層）は以下の手順で形成した。
　１センサ（試料液量２μｌ）あたり、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ、旭化成株式会社製）を７５Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業工業製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（和光純薬工業工業株式会社製）を１００ｍＭ（６５μｇ）になるように混合し、溶液（電子伝達体含有ＬＰＬ溶液）を得た。得られた電子伝達体含有ＬＰＬ溶液を、形成させたＧＬＤＨ層の上に重層（被覆）するように滴下し、３０℃で５分間乾燥させ、第二の反応層（電子伝達体含有ＬＰＬ層）を得た。
　このようにして、第一の反応層であるＧＬＤＨ層上に第二の反応層である電子伝達体含有ＬＰＬ層を形成（重層）した。
　界面活性剤層は、以下の手順で形成した。
　１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたり、終濃度で、グリシルグリシン（和光純薬工業工業株式会社製）を２５ｍＭ（３．２５μｇ）、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）を０．１％（２μｇ）になるように混合し、界面活性剤溶液を得た。得られた界面活性剤溶液を、ＰＥＴからなるカバーに接着剤（両面テープ）を貼り合わせた隙間に滴下後、５０℃で５分間乾燥させ、界面活性剤層を形成した。
　界面活性剤層が形成されているカバーと、第一の反応層および第二の反応層が形成されている基板に接着した接着剤（両面テープ）とを互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層、第二の反応層および界面活性剤層の厚みはそれぞれ５μｍであり、第二の反応層と界面活性剤層との離隔距離は０．１５ｍｍであった。
　このようにして作製された中性脂肪センサについて、実施例１と同様にして、電流値を測定した。その結果を表１および図５に示す。なお、図５中、実施例２の結果は、白抜き三角（△）で表わす。
　（比較例）
　上記実施例１と同様にして、ＧＬＤＨ溶液とＬＰＬ溶液を調製した。次に、ＧＬＤＨ溶液とＬＰＬ溶液とを、１センサ（供給される試料「全血」の量２μｌ）あたりの各成分量が実施例と同じになるように混合し、その混合液をＥＰ－Ｎの作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、３０℃で５分間乾燥させてＧＬＤＨ層とＬＰＬ層の混合層を形成した以外は、実施例１と同様にして、比較用中性脂肪センサを作製した。
　このようにして作製された比較用中性脂肪センサについて、実施例１と同様にして、電流値を測定した。その結果を表１および図５に示す。なお、図５中、比較例１の結果は、黒塗り四角（◆）で表わす。
　（実施例３）
　使用する電極には、独自に設計・製造した３電極系の電極を使用した。この電極は、絶縁性基板１の上に、それぞれカーボンからなる作用極２、参照極３、対極４が形成され、絶縁層５を挟んで、カーボンからなる作用極作用部分２－１、銀塩化銀からなる参照極作用部分３－１、カーボンからなる対極作用部分４－１が形成されている。
　第一の反応層（ＧＬＤＨ層）は以下の手順で形成した。
　１センサ（供給される試料「全血」の量１μｌ）あたり、終濃度で、ＰＱＱ依存性グリセロール脱水素酵素を１．０Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を１０ｍＭ（１．３μｇ）、エマルゲンＰＰ－２９０（花王株式会社製）を０．０５％（０．５μｇ）、および親水性高分子としてポリエチレングリコール６０００（和光純薬工業株式会社製）を０．７５％（７．５μｇ）になるように混合し、溶液（ＧＬＤＨ溶液）を得た。得られたＧＬＤＨ溶液を電極の作用極作用部分、参照極作用部分、および対極作用部分を被覆するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、第一の反応層（ＧＬＤＨ層）を得た。
　第二の反応層（電子伝達体含有ＬＰＬ層）は、以下の手順で形成した。
　１センサ（試料液量１μｌ）あたり、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ、旭化成株式会社製）を８０Ｕ、グリシルグリシン（和光純薬工業株式会社製）を５ｍＭ（０．６５μｇ）、ヘキサアンミンルテニウム（ＩＩＩ）塩化物（和光純薬工業株式会社製）を２００ｍＭ（６１．９μｇ）になるように混合し、溶液（電子伝達体含有ＬＰＬ溶液）を得た。得られた電子伝達体含有ＬＰＬ溶液を、形成させたＧＬＤＨ層の上に重層（被覆）するように滴下し、４０℃で５分間乾燥させ、第二の反応層（電子伝達体含有ＬＰＬ層）を得た。
　このようにして、第一の反応層であるＧＬＤＨ層上に第二の反応層である電子伝達体含有ＬＰＬ層を形成（重層）した。
　界面活性剤層は、以下の手順で形成した。
　界面活性剤層が形成されているカバーと、第一の反応層および第二の反応層が形成されている基板に接着した接着剤（両面テープ）とを互いに貼り合わせることにより、中性脂肪センサを作製し、特性評価を行った。なお、この際、第一の反応層、第二の反応層および界面活性剤層の厚みはそれぞれ５μｍであり、第二の反応層と界面活性剤層との離隔距離は０．１ｍｍであった。
　このようにして得られた中性脂肪センサは以下のように評価した。試料液（全血、中性脂肪値（１８３ｍｇ／ｄｌ）１μｌを吸入させてから反応時間として各秒数待機後、参照極を基準にして作用極と対極の間に＋２００ｍＶの電位を印加し、１秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。この電流値は、還元した電子伝達体の濃度、すなわち全血中の分解された中性脂肪の濃度に比例し、この電流値から全血中の中性脂肪濃度を求めることができる。結果を表１および図６に示す。なお、図６中、実施例３の結果は、白抜き丸（○）で表わす。
　（実施例４）
　実施例３の０．７５％（７．５μｇ）のポリエチレングリコール６０００の代わりに同濃度のポリビニルアルコール５００（和光純薬工業株式会社製）を用いた以外は、実施例３と同様にして電流値を測定した。その結果を表１および図６に示す。また、図６中、実施例４の結果は黒塗り丸（●）で表す。
　（実施例５）
　実施例３の０．７５％（７．５μｇ）のポリエチレングリコール６０００の代わりに１０％（１００μｇ）のトレハロース（和光純薬工業株式会社製）を用いた以外は、実施例３と同様にして電流値を測定した。その結果を表１および図７に示す。また、図７中、実施例５の結果は白抜き四角（□）で表す。
　（実施例６）
　実施例３の０．７５％（７．５μｇ）のポリエチレングリコール６０００の代わりに１％（１０μｇ）のＢＳＡ（和光純薬工業株式会社製）を用いた以外は、実施例３と同様にして電流値を測定した。その結果を表１および図７に示す。また、図７中、実施例６の結果は白抜き三角（△）で表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表１、図５、図６および図７から明らかなように、比較例の比較用中性脂肪センサでは測定された電流値が平衡に達するまでに約１２０秒かかるのに対し、実施例１～６の中性脂肪センサでは約４５秒で電流値が平衡に達することが分かる。これらの結果から、本発明のバイオセンサを使用することにより、従来より短時間で中性脂肪を測定できることが明らかに示される。比較例の結果は、溶解性において、酸化還元酵素であるＧＬＤＨよりも脂質分解酵素であるＬＰＬの方が優れているため、比較例の比較用中性脂肪センサのように、ＧＬＤＨおよびＬＰＬを同じ層に混合状態で存在させると、ＧＬＤＨの溶解性の低さがＬＰＬの溶解性にも影響を及ぼし、結果として全体の溶解性が低下するためであると考えられる。一方、本発明の中性脂肪センサではこのような問題は解決されており、実施例に示されるように、上記２酵素を別層にすることにより、ＬＰＬはすばやく溶解し反応し、その後、ＧＬＤＨが溶解して反応する。その結果として、２酵素をそれぞれ別層に含有させる方が、全体としての反応性が良くなるため、本発明により反応時間の短縮が実現されると推察される。
　また、実施例３～６においても、反応時間は４５秒と実施例１～２と同程度に短縮されている。したがって、第一の反応層、第二の反応層および第三の反応層の少なくとも一つに、糖、タンパク質または親水性高分子を混合した場合にも、優れた反応時間短縮の効果が得られている。
１　　絶縁性基板、
２　　作用極、
２－１　　作用極作用部分、
３　　参照極、
３－１　　参照極作用部分、
４　　対極、
４－１　　対極作用部分、
５　　絶縁層、
６（６ａ、６ｂ）　　接着剤、
７　　カバー、
８　　第一の反応層、
９　　第二の反応層、
１０　第三の反応層、
Ｓ　　空間部。

Claims (7)

  1. 　絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成されてなる、少なくとも作用極および対極を含む電極系と、前記電極系上に形成されてなる試料供給部と、を有するバイオセンサであって、
    　前記試料供給部が、
    　前記電極系上に形成され、少なくとも、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を含む酸化還元酵素を含む第一の反応層と、
    　前記第一の反応層上に脂質分解酵素を含む溶液を塗布することによって形成される第二の反応層と、
    を含む反応層を有する、バイオセンサ。
  2. 　前記試料供給部が、さらに電子伝達体を含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
  3. 　前記電子伝達体は、第二の反応層に配置される、または
    　電子伝達体を有する第三の反応層をさらに、前記第一および第二の反応層と分離するように、前記試料供給部にもうける、請求項２に記載のバイオセンサ。
  4. 　前記酸化還元酵素が、補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素である、請求項１～３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  5. 　前記第一の反応層、第二の反応層、または第三の反応層は、界面活性剤をさらに含む、請求項３または４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  6. 　前記第一の反応層、第二の反応層、または第三の反応層は、親水性高分子をさらに含む、請求項３～５のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
  7. 　前記第一の反応層、第二の反応層、または第三の反応層は、糖およびタンパク質の少なくとも一つをさらに含む請求項３～６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
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