WO2011104871A1 - 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定用試薬キット - Google Patents
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
Definitions
- the present invention detects a physiologically active substance in a sample containing a biologically active substance derived from an organism having a characteristic of gelling by reaction with LAL, a blood cell extract of horseshoe crab, such as endotoxin and ⁇ -D-glucan.
- the present invention relates to a measurement method for measuring the concentration and a reagent kit used for the detection or concentration measurement.
- Endotoxin is a lipopolysaccharide present in the cell wall of Gram-negative bacteria and is the most typical pyrogenic substance. If an infusion solution, injection drug, blood, or the like contaminated with this endotoxin enters the human body, it may cause serious side effects such as fever and shock. For this reason, it is obliged to manage the above drugs so that they are not contaminated by endotoxin.
- LALLA Limulus amoebocyteeblysate
- ⁇ -D-glucan is a polysaccharide (polysaccharide) that forms a cell membrane characteristic of fungi.
- ⁇ -D-glucan By measuring ⁇ -D-glucan, it is possible to screen for fungal infections in a wide range including not only common fungi such as Candida, Spergillus, and Cryptococcus but also rare fungi.
- ⁇ -D-glucan In the measurement of ⁇ -D-glucan, it is possible to detect ⁇ -D-glucan with high sensitivity by utilizing the property that the blood cell extract component of horseshoe crab is coagulated (gel coagulation) by ⁇ -D-glucan. ing.
- predetermined physiologically active substances such as endotoxin and ⁇ -D-glucan that can be detected by blood cell extract components of horseshoe crab
- predetermined physiological It is also called measurement of the active substance.
- the sample mixed with LAL is allowed to stand, the container is turned over after a certain period of time, and it is judged whether the sample has gelled by the presence or absence of dripping of the sample.
- a turbidimetric method (stirring the sample) is used to measure and analyze the turbidity of the sample over time as the gel is generated by the reaction between LAL and the predetermined physiologically active substance.
- a colorimetric method using a synthetic substrate that develops color by being hydrolyzed by an enzyme cascade.
- the turbidimetric method may require a very long reaction time until the formation of a gel is detected when a low concentration of a predetermined physiologically active substance is allowed to act, because there are few enzymes activated. there were.
- the colorimetric method is disadvantageous in that it is easily affected by sample turbidity (such as blood lipids) and mixed pigment (such as hemoglobin due to hemolysis).
- sample turbidity such as blood lipids
- mixed pigment such as hemoglobin due to hemolysis
- the laser light scattering particle measurement method Even if the above laser light scattering particle measurement method is used, it takes 40 to 50 minutes to measure a predetermined physiologically active substance at a low concentration. In addition, the laser light scattering particle measurement method has the disadvantage that the optical system becomes complicated because particles in a minute space region are observed, making it difficult to measure multiple samples.
- a reagent in which a protein contained in LAL is bound to the surface of a fine particle such as polystyrene latex dispersed in a chemical solution in advance is mixed with a sample containing endotoxin.
- Measurement methods have been proposed. According to this, a predetermined physiologically active substance is allowed to act on the protein on the fine particles to associate the fine particles with each other, thereby generating a large aggregate at an early stage. Then, by measuring the formation of the aggregates, endotoxin detection or concentration measurement can be performed in a very short time.
- the present invention has been devised in view of the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to make it easier to use a reagent in which a protein contained in LAL is bound to the surface of fine particles dispersed in a chemical solution in advance. It is an object of the present invention to provide a technique capable of improving the accuracy of detection or concentration measurement of a predetermined physiologically active substance.
- a reagent is prepared by adsorbing proteins contained in LAL on fine particles prepared in advance and dispersed in a chemical solution. Then, by causing a sample containing a predetermined physiologically active substance to act on this reagent, the microparticles are caused to associate with each other to generate a large aggregate at an early stage, and the measurement of the predetermined physiologically active substance can be performed by detecting the formation of this aggregate.
- the most characteristic feature is that the fine particles are formed of an inorganic material.
- a predetermined protein contained in the blood cell extract of horseshoe crab is adsorbed on the surface of fine particles dispersible in the reagent, Mixing the reagent in which the fine particles adsorbed with the protein are dispersed, and the sample, By detecting the formation of a gel in the mixed solution of the reagent and the sample, the biologically active substance derived from the organism present in the sample is detected, or the degree of the formation of the gel is measured.
- a method for measuring a biologically active substance derived from a living body, which measures the concentration of an active substance The fine particles are formed of an inorganic material.
- the predetermined physiologically active substance acts on the LAL alone as described above. It has been found that larger agglomerates are produced early compared to when they are made. This is considered to be due to the protein on the microparticles being hydrolyzed by the enzyme cascade caused by the action of a predetermined physiologically active substance to become coagulin, which associates the microparticles with each other.
- this phenomenon is used to associate fine particles with each other to generate a larger aggregate at an early stage, thereby promoting the formation of a gel in a mixed solution of LAL and a sample. According to this, it becomes possible to detect a predetermined physiologically active substance or measure the concentration quickly and easily.
- the predetermined protein has a property of reacting with a predetermined physiologically active substance to form a gel and contains at least coagulogen.
- other proteins such as serine protease, may be included.
- gel generation refers to the generation of aggregates due to the association of the fine particles, the generation of gel particles due to the association of coagulin that is not adsorbed to the fine particles, and the gel of the mixture of LAL and the sample. It means a phenomenon that includes at least one of
- the degree of gel formation refers to, for example, an increase in the size or number of gel particles due to the aggregation of the above-mentioned fine particles and the association of coagulin that is not bound or adsorbed to the fine particles. Means. Alternatively, it means a change in the physical and chemical properties (eg, turbidity) of the mixture due to gelation of the mixture of LAL reagent and sample.
- the fine particles are formed of an inorganic material.
- the heat resistance of the microparticles themselves can be improved compared to the case where the microparticles are formed of an organic material such as a resin, so that dry heat sterilization can be performed in the reagent preparation process.
- the adsorptivity of the protein to the fine particles can be improved as compared with the case where the fine particles are formed of an organic material such as a resin.
- the protein can be electrostatically adsorbed on the surface of the fine particles without immobilizing a functional group such as a carboxyl group on the fine particles, and the reagent preparation process can be greatly simplified. This can also reduce the chance that the reagent is contaminated with a predetermined physiologically active substance in the preparation process.
- inorganic materials include metal oxides and minerals.
- the fine particles may be formed of any one of alumina, titania, kaolin, and manganese oxide.
- the adsorptivity of the protein in the LAL to the fine particles can be improved more reliably, and the light scattering property or light absorption property of the fine particles can be improved.
- the fine particles are formed of the above materials, sufficient mechanical strength can be obtained as fine particles. Therefore, even when the sample and the reagent containing the fine particles are mixed and stirred, the fine particles are crushed by the mechanical load. It is possible to suppress changes in physical and optical properties of the mixed solution.
- the predetermined protein may be a coagulogen purified from a blood cell extract of horseshoe crab.
- the coagulogen is hydrolyzed by the enzyme cascade in LAL to become coagulin, which associates the microparticles. Therefore, by purifying the protein in LAL in advance and extracting only the coagulogen and adsorbing it to the microparticles, it becomes possible to associate the microparticles more efficiently and to generate aggregates earlier. It becomes possible.
- the reagent in which the fine particles adsorbed with the predetermined protein are further mixed with an extract of blood cells of horseshoe crab,
- the reagent and the sample may be mixed simultaneously with or after the mixing.
- the protein in the LAL can be further replenished to the reagent in which the fine particles to which the protein is bound or adsorbed are dispersed. Then, when mixed with a sample containing a predetermined physiologically active substance, the predetermined physiologically active substance is allowed to act on the serine protease in the reagent more reliably, and the coagulogen adsorbed on the microparticles and the coagulogen in the mixed LAL are mixed. It can be hydrolyzed to coagulin. As a result, coagulin adsorbed on the microparticles or coagulin in LAL mixed with the coagulin adsorbed on the microparticles can be associated with each other, and the formation of aggregates centering on the microparticles can be achieved. Can be promoted. Thereby, the measurement of the predetermined physiologically active substance can be performed in a shorter time.
- the protein in LAL is purified in advance and only the coagulogen is extracted and bound or adsorbed to the microparticles. That is, even in these cases, when the reagent and the sample containing the predetermined physiologically active substance are mixed, the predetermined physiologically active substance can be made to act on the serine protease more reliably.
- the reagent in which the fine particles adsorbed with the predetermined protein are further mixed with an extract of blood cells of horseshoe crab, and then mixed with a sample containing the predetermined physiologically active substance.
- the timing of mixing may be after mixing with the blood cell extract or at the same time as mixing.
- the mixing with the sample containing the predetermined physiologically active substance is performed from the time when the reagent and the blood cell extract are mixed. It is desirable that the time has elapsed.
- the present invention also provides a reagent kit for measuring biologically active substances derived from living organisms, prepared by adsorbing a predetermined protein contained in an extract of blood cells of horseshoe crab on the surface of fine particles that can be dispersed in the reagent.
- the fine particles may be a reagent kit for measuring biologically active substances derived from living organisms, characterized in that the fine particles are formed of an inorganic material.
- the fine particles may be formed of a metal oxide or a mineral.
- the fine particles may be formed of any material of alumina, titania, kaolin, and manganese oxide.
- the predetermined protein may be a coagulogen purified from an extract of horseshoe crab blood cells.
- the present invention it is possible to more easily prepare a reagent in which the protein contained in LAL is bound to the surface of fine particles dispersed in advance in a chemical solution, and the accuracy of detection or concentration measurement of a predetermined physiologically active substance can be improved. It becomes possible to improve.
- G factor when ⁇ -D-glucan binds to G factor in LAL, G factor is activated to become active G factor. Active G factor hydrolyzes the precursor of clotting enzyme in LAL. Coagulation enzyme. As a result, similarly to the reaction between endotoxin and LAL, coagulin is produced, and the produced coagulin associates with each other to further produce an insoluble gel.
- measuring methods capable of quantifying endotoxin include turbidimetry (including stirring turbidimetry) and laser light scattering particle measurement as described above. As shown in FIG. 10, these measurement methods detect the coagulin aggregate produced by the above-mentioned LAL enzyme cascade reaction as turbidity in the former and the latter as fine particles of gel produced in the system. This enables highly sensitive measurement.
- the laser light scattering particle measurement method directly measures the fine particles of the gel generated in the system, so it is more sensitive than the turbidimetric method and generally requires a sample consisting of LAL and specimen. Since the agitation is performed, gel formation can be detected in a shorter time compared to the turbidimetric method.
- the optical system becomes complicated because particles in a minute space region are observed, and measurement with a simple apparatus may be difficult.
- coagulogen is bound to the surface of fine particles made of an inorganic substance that can be detected by the turbidimetric method or the laser light scattering particle measurement method or slightly smaller than the limit that can be detected. Then, a sample containing endotoxin is mixed with a reagent prepared by mixing this with the LAL reagent. As a result, coagulin produced in LAL and coagulin adsorbed on the fine particles are associated with each other, and coagulin adsorbed on the fine particles are associated with each other in a short time in the turbidimetric method or laser light scattering. Produce agglomerates of a size that can be detected by particle counting. As a result, endotoxin can be measured more rapidly by the turbidimetric method or the laser light scattering particle measurement method.
- FIG. 1 shows the aggregation mechanism of fine particles according to this example.
- the left side of the central arrow is a schematic diagram of the reagent before reacting with endotoxin.
- the right side of the arrow is a schematic diagram of the reagent after reacting with endotoxin.
- beads 1 that are fine particles in this example, coagulogen 2 bonded to the surface of the fine particles, and coagulogen 3 not bonded to the surface of the fine particles are dispersed.
- the fine particles in which the coagulogen 2 is bound to the beads 1 are referred to as LAL-bound beads 10.
- the material used for the beads 1 is preferably one that can be subjected to a dry heat sterilization treatment.
- an inorganic material is desirable instead of an organic material such as a resin. If it does so, it will become possible to inactivate endotoxin by heat by dry heat sterilization in the formation stage of the bead 1 or the adjustment stage of the LAL binding bead 10, and the risk that the LAL binding bead 10 will be contaminated by endotoxin is reduced. be able to.
- Non-Patent Document 1 discusses the amount of bovine serum albumin adsorbed on silica, titania, and alumina from the viewpoint of the isoelectric point of protein and the zero charge point of metal oxide.
- Non-Patent Document 2 shows that the zero charge point of metal oxide may vary greatly depending on the type of buffer solution present in the solution. Here, whether or not a material has a high protein adsorptivity is determined by the relationship between the isoelectric point of the protein and the zero charge point of the bead 1.
- the isoelectric point of coagulogen is about 10 and is very high on the alkali side.
- a material having a zero charge point such that the beads 1 are negatively charged in a neutral environment (pH 7) is more desirable in order to more strongly adsorb proteins.
- a material with a zero charge point charged on the minus side may be used, or a material charged on the minus side in an environment where an appropriate buffer solution exists may be used.
- the material of the beads 1 is required to have a certain level of turbidity when aggregation occurs.
- the aggregation of the beads 1 based on the reaction between the protein in LAL and endotoxin is measured by an optical means such as a turbidimetric method or a laser light scattering particle method.
- the aggregation of the beads 1 is measured using the intensity change of transmitted light or scattered light by the mixed liquid in which the beads 1 are dispersed. Therefore, the material of the beads 1 is preferably a white material that easily scatters light, or a black or specific colored material that easily absorbs light.
- the material of the beads 1 that is advantageous for measuring endotoxin in the present embodiment is preferably one that does not dissolve in water during use. Further, a material having a specific gravity close to water and not extremely large is desirable from the viewpoint of easy stirring. Furthermore, since it is difficult for the particle diameter to change by stirring, it is desirable to have mechanical strength enough to withstand stirring.
- the material of the beads 1 is preferably metal oxide particles or mineral particles that are insoluble in water in the neutral region, among inorganic materials.
- the metal oxide particles include silica, titania, zirconia, alumina, ceria, manganese oxide, ferrite, and a composite or mixture thereof.
- magnesia MgO
- calcia CaO
- alumina Al 2 O 3
- alumina-titania Al 2 O 3 —TiO 2
- mullite 3Al 2 O 3 -2SiO 2
- spinel Al 2 O 3
- zirconia ZrO 2
- chromia Cr 2 O 3
- yttria Y 2 O 3
- ceria CeO 2
- barium titanate BaTiO 3
- hafnia HfO 2
- the beads 1 of this embodiment are required to have a uniform particle size.
- the uniformity of the particle size is an important factor.
- the endotoxin and the reagent containing the LAL-bound bead 10 are mixed, the progress of aggregation varies if the bead 1 has a non-uniform particle size.
- changes in turbidity and the number of particles become slow, which may cause inconveniences such as a decrease in measurement accuracy and a decrease in measurement reproducibility.
- Examples of materials that are already distributed as particles having sufficient particle size uniformity include titania, alumina, and manganese oxide.
- coagulogen 2 when adsorbed on the bead 1, it may be adsorbed on the bead 1 without selecting a protein contained in the LAL, or the coagulogen in the LAL may be purified and adsorbed.
- a protein other than the coagulogen 2 may be adsorbed on the bead 1, but the process of purifying the coagulogen in the LAL Can be omitted, and the cost for preparation and purification of the reagent can be reduced.
- FIG. 1 there are more other proteins (not shown) contained in LAL in addition to coagulogens 2 and 3 on the beads 1 and in the reagents around the beads 1. Become.
- PCM Polybead Calboxylate Microsphere
- LAL reagent Limulus HS-T Single Test Wako
- a centrifuge tube with a maximum capacity of 2.0 mL
- add 0.1 M carbonate buffer of pH 9.6 to the maximum volume
- mix well and then centrifuge at 12500 rpm for 5 minutes in a tabletop centrifuge.
- PCM was precipitated and the supernatant was removed.
- the PCM was centrifuged to remove the supernatant, and again washed with a phosphate buffer three times in the same manner. Finally, 0.5 mL of 0.2M borate buffer at pH 8.5 was added to the PCM precipitate obtained. In addition, it was suspended. Next, two LAL reagent solutions in which 0.25 mL of borate buffer was added to the LAL reagent and dissolved were prepared, and these and the PCM suspension were mixed to a volume of 1.0 mL. Furthermore, PMSF (Phenylmethanesulfonyl fluoride), which is a serine protease inhibitor, was added to this to a final concentration of 4 mM. The reaction was carried out by stirring at room temperature for 4 hours or more so that the activated carboxyl group on the PCM in the mixed solution and the amino group of each protein in LAL had an amide bond.
- PMSF Phenylmethanesulfonyl fluoride
- the mixed solution is centrifuged to remove the supernatant, and then resuspended in 1.2 mL of borate buffer. Further, 50 ⁇ L of 0.25 M 2-aminoethanol / borate buffer is added to this solution, and the mixture is stirred at room temperature for 30 minutes. The mixture was allowed to invert and the unreacted activated carboxyl group on PCM was consumed with aminoethanol. Further, the PCM suspension was centrifuged to obtain a PCM precipitate, and then resuspended in physiological saline for injection (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.). A reagent was obtained. Finally, preservatives and surfactants were added to adjust the LAL-bound bead reagent to the optimal concentration.
- inorganic metal oxide particles specifically, alumina fine particles are used as the beads 1.
- alumina fine particles are used as the beads 1.
- the bead 1 made of alumina may be formed, for example, by spraying atomized aerosol of aluminum on a flame and oxidizing each particle of the aerosol.
- the alumina beads 1 are usually formed at a high temperature of 1000 ° C. or higher, it can be ensured that the microparticles are not contaminated with endotoxin at least in the formation stage of the beads 1.
- the particle size when the particle size is large (primary particle size is 0.3 to 0.4 ⁇ m), the particle itself is a strong light scatterer, so it is suitable for the method of measuring light transmittance (absorbance). ing.
- the particle size is small (primary particle size is 0.1 ⁇ m or less), the particle itself does not generate so strong scattering, so it is suitable for use in light scattering measurement methods (laser light scattering particle measurement method, Rayleigh scattering method, etc.) It can be said that.
- spherical alumina particles ASFP-20 (average particle size 0.3 ⁇ m) manufactured by Denka were subjected to dry heat treatment (250 ° C., 3 hours) to inactivate contaminating endotoxin by heat. Since spherical alumina particles can be sterilized by dry heat at high temperature, endotoxin can be more completely inactivated at this stage.
- spherical alumina particles were dispersed in distilled water for injection so as to have a concentration of 20 mg / mL, and centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes. .
- the dispersion of spherical alumina particles was added to 300 ⁇ L of one Limulus reagent (Wako Pure Chemicals, HS-T) to dissolve the Limulus reagent.
- heat treatment was performed at 60 ° C. for 20 minutes using an aluminum block heater to adsorb and immobilize the protein in the Limulus reagent onto the spherical alumina particles.
- the spherical alumina particles have a strong adsorptive power for proteins such as coagulogen, and are more easily adsorbed and fixed by heating. Therefore, in this embodiment, the protein can be fixed to the spherical alumina particles by a simpler process.
- the serine protease in the Limulus reagent is completely inactivated by this heat treatment. Therefore, when spherical alumina particles are used, it is not necessary to add a serine protease inhibitor such as PMSF.
- a preservative sodium azide
- a surfactant Triton X-100
- the use of the fine particles of alumina, which is an inorganic substance and metal oxide, as the material of the beads 1 makes it possible to greatly simplify the production process of the LAL-bound bead reagent (total 30 minutes to 1). time). This can reduce the risk of contamination with endotoxin during the preparation of the LAL-bound bead reagent.
- the bead 1 is an inorganic substance (metal oxide)
- endotoxin can be completely inactivated by high-temperature heat treatment.
- the protein when spherical alumina particles are used as the material, the protein is adsorbed and fixed on the alumina surface by the adsorption force to the protein of the alumina fine particles. Therefore, by adjusting the concentration of the beads 1 and the concentration of the protein, it is possible to create a state in which the entire surface of the beads 1 is covered with the protein without cross-linking the beads 1. If it does so, it can suppress that bead 1 aggregates carelessly, and can improve the uniformity of dispersion in a LAL binding bead reagent.
- the protein in the Limulus reagent was adsorbed and fixed to the spherical alumina particles by heat treatment at 60 ° C. for 20 minutes using an aluminum block heater. Therefore, heat treatment is not always necessary.
- Aerosil alumina particles ALuC primary particle size 0.03 ⁇ m
- the particles were dispersed in water for injection so as to have a concentration of 10 mg / mL, and centrifuged at 3000 rpm for 1 minute, and the particles and the large-sized particles were removed by centrifugation.
- the fine particle dispersion was diluted twice with distilled water for injection and added to 100 ⁇ L of one Limulus reagent (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., HS-T) to dissolve the Limulus reagent.
- coagulin which is an insoluble protein in the Limulus reagent
- the reagent is originally clouded by the beads, but the coagulin is associated with the coagulin produced on the beads at the beginning of the generation of the coagulin and the beads aggregate. Turbidity disappears and the light transmittance rises once.
- Endotoxin detection time was defined as the time at which the inflection point appeared using a method (parallel difference method) for detecting the inflection point at which the light transmittance changes rapidly.
- FIG. 2 shows a graph in which the endotoxin concentration is plotted on the horizontal axis, the detection time is plotted on the vertical axis, and the logarithm is plotted as a logarithm.
- the LAL-bound bead reagent of the present invention it was found that by using the LAL-bound bead reagent of the present invention, it is possible to greatly shorten the measurement time while maintaining the measurement accuracy of the endotoxin concentration. Further, as can be seen from FIG. 2, when the LAL-bound bead reagent is not used, the detection time is extremely long in the region where the endotoxin concentration is low, and the region that cannot be practically measured is widened. Therefore, the measurement limit of endotoxin concentration can be expanded by using the LAL-bound bead reagent in this example.
- Example 2 (Laser light scattering particle measurement) Endotoxin dilution series (prepared by diluting with distilled water for injection to be 2, 0.2, 0.02, 0.002, 0.0002 EU / mL) 100 ⁇ L of the measurement glass container manufactured in Production Example 3 ( ⁇ 7 mm). Next, the Limulus reagent (ES-II manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in 100 ⁇ L of the LAL-bound bead suspension prepared in Production Example 1 and transferred to a glass cuvette containing the above endotoxin-diluted water. Measurement was performed using a light scattering particle measuring apparatus (EX-300, Kowa).
- EX-300 light scattering particle measuring apparatus
- the Limulus reagent was dissolved in 100 ⁇ L of distilled water for injection instead of the LAL-bound bead reagent, transferred to a glass container containing endotoxin-diluted water, and measured in the same manner.
- endotoxin reacts with the Limulus reagent
- coagulin which is an insoluble protein in the Limulus reagent
- gel particles are generated in the sample. Since this scatters light, it is detected as gel fine particles by EX-300.
- FIG. 3 shows a graph of the relationship between the elapsed time after mixing the LAL-bound bead reagent and endotoxin and the number of detected particles.
- FIG. 4 shows a graph in which the endotoxin concentration is plotted on the horizontal axis and the detection time is plotted on the vertical axis, and plotted in logarithmic scale.
- the LAL-bound bead reagent of the present invention it was found that by using the LAL-bound bead reagent of the present invention, it is possible to greatly shorten the measurement time while maintaining the measurement accuracy of the endotoxin concentration. In this measurement, endotoxin was detected at the time when the total number of gel particles exceeded 20.
- titania particles used as the beads 1
- titania particles (Aeroxide P25 manufactured by Nippon Aerosil Co., Ltd.) were subjected to a dry heat treatment at 250 ° C. for 3 hours, and the mixed endotoxin was completely inactivated by heat.
- this was dispersed with distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to 10 mg / mL, and 150 ⁇ L was added to the Limulus reagent (HS-T, manufactured by Wako Pure Chemical Industries) to dissolve the reagent.
- the protein of the Limulus reagent was adsorbed and fixed on the particle surface by heating at 60 ° C.
- FIG. 5 shows the relationship between the endotoxin concentration and the endotoxin detection time when the LAL-bound bead reagent is used and when the LAL-bound bead reagent is not used.
- both axes are plotted logarithmically, both are linearly approximated, and even when titania bead 1 is used, the measurement time can be greatly shortened while maintaining endotoxin concentration measurement accuracy.
- alumina spherical alumina ASFP-20 manufactured by Denki Kagaku Kogyo (Denka)
- silica Allumina 300 manufactured by Nippon Aerosil
- titania Aloxide P25 manufactured by Nippon Aerosil
- manganese oxide (IV) Powder is formed from these inorganic materials using hydroxyapatite (manufactured by Covalent Materials), kaolin (manufactured by Kanto Chemical), and bentonite (manufactured by Kanto Chemical) as mineral fine particles.
- the LAL-bound bead reagent was prepared from the beads 1, and the effect of shortening the endotoxin measurement time was examined.
- titania (Ti) showed the highest absorbance, and the absorbance decreased in the order of alumina (Al) and kaolin (Kao). Further, in the particle suspension of bentonite (Ben), manganese oxide (Mn), hydroxyapatite (HAP), and silica (Si), lower absorbance than that of kaolin (Kao) was obtained. Next, 50 ⁇ L of these particle suspensions were added to Limulus reagent (HS-T single test manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) previously dissolved in 50 ⁇ L of distilled water for injection, and stirred with a vortex mixer. The treatment was performed at 60 ° C. for 30 minutes, and the protein in the Limulus reagent was immobilized on the particles.
- Limulus reagent H-T single test manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- Alumina and titania raw materials are diluted to 3.0 mL, and other raw materials are diluted to 1.5 mL with distilled water for injection. Further, 50 ⁇ L of each bead solution is diluted with endotoxin diluted solution (0. The mixture was mixed with 50 ⁇ L of Limulus reagent (ES-II, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) dissolved in (02 EU / mL), and the agglutination reaction was examined using a stirring turbidimetric measuring apparatus (EX-100, manufactured by Kowa).
- ES-II Limulus reagent
- EX-100 stirring turbidimetric measuring apparatus
- FIG. 7 shows the results when silica is used (region A in FIG.
- region B has a slightly increased light transmittance due to particle aggregation. Is a phase that seems to be).
- silica the main cause of the decrease in the light transmittance as described above is the low absorbance per weight.
- hydroxyapatite when hydroxyapatite was used as the beads 1, a phenomenon was observed in which the light transmittance decreased regardless of the aggregation reaction caused by the reaction between LAL and endotoxin.
- the cause of this phenomenon in hydroxyapatite is considered to be that the light transmittance is reduced by the disintegrated beads 1 regardless of the aggregation reaction because hydroxyapatite has weak mechanical strength and disintegrates by stirring.
- FIG. 9 the graph of the change of the light transmittance by collapse of a hydroxyapatite is shown.
- the protein adsorptivity is high as the material of the beads 1.
- Absorbance per weight is high.
- alumina, titania, kaolin, and manganese oxide are materials that can be sufficiently used as the beads 1 by satisfying the above conditions.
- the inorganic material used for the fine particles of the present invention is not limited to those exemplified.
- the composition of the material satisfying these conditions is a composite compound, a plurality of beads having different compositions may be mixed.
- silica alumina, alumina titania, titania zirconia, or the like can be used, or beads made of alumina, titania, silica, etc. may be mixed and used at an appropriate ratio.
- the LAL-bound bead reagent is prepared by adsorbing to the beads 1 without selecting the protein contained in the LAL.
- the LAL-bound bead reagent is further mixed with the LAL reagent and then mixed with the sample containing endotoxin to aggregate the LAL-bound bead 10 as in the above-described example, the LAL-bound bead 10 is formed. It is desirable that as much coagulogen as possible be adsorbed on the beads 1 to be adhered. Therefore, when the LAL-bound bead 10 is generated, the purified coagulogen may be adsorbed to the bead 1 rather than bound to the bead 1 without selecting the protein contained in the LAL.
- the LAL-bound bead reagent prepared in the above examples corresponds to the endotoxin measurement reagent kit in the present invention.
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Abstract
ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を予め薬液中に分散した微粒子の表面に結合させた試薬を、より簡単に調製可能であり、所定生理活性物質の検出または濃度測定の精度を向上させることが可能な技術を提供する。ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め準備され薬液中に分散したビーズの上に吸着させた試薬を作る。そして、この試薬にエンドトキシンを含む試料を作用させることにより、ビーズ同士を会合させて早期に大きな凝集塊を生成させ、この凝集塊の生成を検出することでエンドトキシンの測定を行う。そして、上記のビーズを、アルミナ、カオリン、酸化マンガンなどの無機性の素材で形成した。
Description
本発明は、エンドトキシンやβ－Ｄ－グルカンなど、カブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料において、前記生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び、同検出または濃度測定に用いられる試薬キットに関する。
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。
ところで、カブトガニの血球抽出物(以下、「ＬＡＬ : Limulus amoebocyte lysate」ともいう。)の中には、エンドトキシンによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＬＡＬとエンドトキシンとが反応する際には、エンドトキシンの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＬＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＬＡＬの特性を用いて、エンドトキシンを高感度に検出することが可能である。
また、β－Ｄ－グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β－Ｄ－グルカンを測定することにより、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲において真菌感染症のスクリーニングなどが可能となる。β－Ｄ－グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ－Ｄ－グルカンによって凝固（ゲル凝固）する特性を利用して、β－Ｄ－グルカンを高感度に検出することが可能となっている。
上記したエンドトキシンやβ－Ｄ－グルカンなどの、カブトガニの血球抽出成分によって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定（以下、これを単に所定生理活性物質の測定ともいう。）を行う方法としては、ＬＡＬと混和した試料を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無により試料がゲル化したかどうかを判定し、試料に一定濃度以上の所定生理活性物質が含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。また、所定生理活性物質の別の高感度な定量法として、ＬＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法（試料を攪拌しながら濁りを計測する攪拌比濁法を含む。）や、酵素カスケードにより加水分解されて発色する合成基質を用いる比色法などがある。
上記の定量法のうち比濁法は、低濃度の所定生理活性物質を作用させたときには、活性化される酵素が少ないためゲルの生成が検出されるまでに非常に長い反応時間を要する場合があった。一方比色法は、試料の濁り（血脂質など）や混入する色素（溶血によるヘモグロビンなど）の影響を受け易いという不都合があった。これらのことから、特に、救急時における患者の血液中の所定生理活性物質の測定や、人工透析時の透析液や血液中の所定生理活性物質の測定には、上記の比濁法や比色法は必ずしも最適な方法とは言えなかった。
また、ＬＡＬと所定生理活性物質とを混和した試料を攪拌することによりゲル微粒子を早期に生成させるとともに、ゲル微粒子により散乱されるレーザー光の強度からゲル微粒子の大きさと数を解析して、凝集初期のゲル微粒子生成を測定するレーザー光散乱粒子計測法が提案されている。この方法によれば、測定時間を比濁法に比べて約３分の１に短縮でき、且つ、試料の濁りや色の影響を低減できることが報告されている。
しかしながら、上記のレーザー光散乱粒子計測法を用いたとしても、低濃度の所定生理活性物質の測定には４０～５０分の測定時間を要する。また、レーザー光散乱粒子計測法においては微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、多検体測定が困難であるという不都合があった。
これに対し、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め薬液中に分散したポリスチレンラテックスなどの微粒子の表面に結合させた試薬を作り、この試薬とエンドトキシンを含む試料とを混和させる、所定生理活性物質の測定方法が提案されている。これによれば、微粒子上の蛋白質に所定生理活性物質を作用させて微粒子同士を会合させ、早期に大きな凝集塊を生成させることができる。そして、この凝集塊の生成を光学的に測定することでエンドトキシンの検出または濃度測定を極めて短時間で行うことが可能となる。
しかしながら、上記ポリスチレンラテックスの微粒子を用いた測定法においては、高温で乾熱滅菌処理を行なうことが困難なため、試薬の調製中に試薬がエンドトキシンに汚染されてしまうおそれがあった。また、ポリスチレンラテックスの微粒子上にＬＡＬ中の蛋白質を結合するためには、ポリスチレンラテックスの微粒子表面にカルボキシル基などの官能基を固定する必要があり、試薬の調製のための工数が多くなる不都合があった。このことは、試薬がエンドトキシンに汚染される危険性を助長することにもなっていた。
Satoshi Fukuzaki, Hiromi Urano and Kazuya Nagata "Adsorption of bovine serum albumin onto metal oxide surfaces", Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 81, Issue 2, 1996, Pages 163-167
福崎智司、浦野博水「酸化物の表面電荷特性とタンパク質の吸着挙動」、防菌防黴誌、Volume 27, No.1, 1999, Pages 33-40
本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を予め薬液中に分散した微粒子の表面に結合させた試薬を、より簡単に調製可能であり、所定生理活性物質の検出または濃度測定の精度を向上させることが可能な技術を提供することである。
本発明に係る所定生理活性物質の測定方法においては、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め準備され薬液中に分散した微粒子の上に吸着させた試薬を作る。そして、この試薬に所定生理活性物質を含む試料を作用させることにより、微粒子同士を会合させて早期に大きな凝集塊を生成させ、この凝集塊の生成を検出することで所定生理活性物質の測定を行う。そして、上記の微粒子を無機性の素材で形成したことを最大の特徴とする。
より詳細には、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させ、
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成されたことを特徴とする。
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成されたことを特徴とする。
ここで、カブトガニの血球の抽出物であるＬＡＬ中に含まれる蛋白質を微粒子の上に吸着させた状態で所定生理活性物質を作用させると、前述のように、ＬＡＬ単体に所定生理活性物質を作用させた場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成することが分かっている。これは、微粒子上の蛋白質が所定生理活性物質の作用で惹起される酵素カスケードにより加水分解されてコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させることによると考えられている。
本発明においては、この現象を利用し、微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させ、ＬＡＬと試料との混和液におけるゲルの生成を促進することとした。これによれば、所定生理活性物質の検出または濃度の測定を迅速且つ簡便に行うことが可能になる。
なお、上記において所定の蛋白質は、所定生理活性物質と反応してゲルを生成させる特性を有するものであり、少なくともコアギュロゲンを含む。また、セリンプロテアーゼ等の他の蛋白質を含んでいてもよい。また、本発明においてゲルの生成とは、上記の微粒子同士の会合による凝集塊の生成、微粒子に吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の生成、ＬＡＬと試料との混和液のゲル化、の少なくともいずれかを含んだ現象を意味している。
また、本発明においてゲルの生成の程度とは、例えば、上記の微粒子同士の会合による凝集塊及び、微粒子に結合または吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の大きさまたは数の増加を意味する。あるいは、ＬＡＬ試薬と試料との混和液のゲル化に起因する混和液の物理、化学特性（例、濁度）の変化を意味する。
ここで、上記の微粒子としてポリスチレンラテックス等の樹脂製の微粒子を用いた場合について考える。この場合には、まず、微粒子の製造過程において高熱が作用する工程がない（高熱を作用させると樹脂が変性してしまう）ため、微粒子自体が初期段階で所定生理活性物質に汚染されていないという保証が得られづらい。また、上記の樹脂製の微粒子にはコアギュロゲンなどのＬＡＬ中の蛋白質が比較的吸着されづらいために、微粒子上にカルボキシル基などの官能基を固定して活性化するための工程が必要となる。このことにより、試薬の調製工程が複雑になってしまう。また、このことは、調製過程において試薬が所定生理活性物質に汚染される機会が増加することにも繋がっていた。
これに対し本発明では、上記の微粒子を無機性の素材で形成することとした。そうすると、微粒子を樹脂などの有機性の素材で形成した場合と比較して、微粒子自体の耐熱性を向上させられるため、試薬の調製過程において乾熱滅菌処理を行なうことができる。その結果、調整過程において試薬が所定生理活性物質に汚染されることを抑制できる。また、樹脂などの有機性の素材で微粒子を形成した場合と比較して、蛋白質の微粒子への吸着性を向上させることができる。従って、微粒子上にカルボキシル基などの官能基を固定させなくとも、静電的に蛋白質を微粒子表面に吸着させることができ、試薬の調製工程を大幅に簡略化することができる。また、このことにより、調製過程において試薬が所定生理活性物質に汚染される機会を減少させることができる。なお、無機性の素材の例としては、例えば金属酸化物や鉱物を挙げることができる。
また、本発明において上記の微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかにより形成されるようにしてもよい。これらの素材で微粒子を形成すれば、ＬＡＬ中の蛋白質の微粒子への吸着性をより確実に向上させることができるとともに、微粒子の光散乱性または光吸収性を向上させることができる。そうすれば、比濁法において試料とＬＡＬ試薬の混和液の吸光度の変化をより明確に検出することが可能となり、また、レーザー光散乱法において前記混和液からの散乱光強度のピークをより明確に検出することが可能となる。その結果、より高精度に所定生理活性物質の測定を行なうことが可能となる。
また、微粒子を上記の素材で形成すれば、微粒子として充分な機械的強度を得られるため、試料と微粒子を含む試薬とを混和させて攪拌した際にも、機械的な負荷によって微粒子が粉砕され、混和液の物理的、光学的性質が変化することを抑制できる。
ここで、前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。
前述のように、ＬＡＬに所定生理活性物質を作用させた際の凝集反応においては、コアギュロゲンがＬＡＬ中の酵素カスケードにより加水分解されてコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させる。従って、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に吸着させておくことで、より効率的に微粒子同士を会合させることが可能となり、より早期に凝集塊を生成させることが可能となる。
また、本発明においては、前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させるようにしてもよい。
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させるようにしてもよい。
これによれば、蛋白質が結合または吸着した微粒子が分散した試薬に対して、さらにＬＡＬ中の蛋白質を補給しておくことができる。そうすると、所定生理活性物質を含有する試料と混和した際に、より確実に所定生理活性物質を試薬中のセリンプロテアーゼに作用させ、微粒子上に吸着されたコアギュロゲン及び、混合されたＬＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンとすることができる。その結果、より確実に、微粒子上に吸着されたコアギュリン同士または、微粒子上に吸着されたコアギュリンと混合されたＬＡＬ中のコアギュリンとを会合させることができ、微粒子を中心とした凝集塊の生成を促進することができる。これにより、より短時間での所定生理活性物質の測定が可能となる。
また、これによれば、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に結合または吸着させた場合にも有利である。すなわちこれらの場合でも、前記試薬と所定生理活性物質を含有する試料とを混和した際に、より確実に所定生理活性物質をセリンプロテアーゼに作用させることができる。
なお、上記においては、前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、その上で所定生理活性物質を含有する試料と混和するところ、この混和の時期は、前記血球抽出物との混合の後であってもよいし、混合と同時であってもよい。しかし、試薬中に補給されたコアギュロゲンやセリンプロテアーゼをより均一に分散させておけるという点では、所定生理活性物質を含有する試料との混和は、前記試薬と前記血球抽出物との混合時から所定時間が経過した後とするのが望ましい。
また、本発明は、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させて調製された、生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであって、前記微粒子は、無機性の素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであってもよい。
その場合、前記微粒子は、金属酸化物または鉱物で形成されるようにしてもよい。また、前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されるようにしてもよい。また、所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
本発明にあっては、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を予め薬液中に分散した微粒子の表面に結合させた試薬を、より簡単に調製可能であり、所定生理活性物質の検出または濃度測定の精度を向上させることが可能となる。
ＬＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。図 １０に示すように、エンドトキシンがＬＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となる、活性型Ｃ因子はＬＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＬＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＬＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
また、同様にβ－Ｄ－グルカンがＬＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＬＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、エンドトキシンやβ－Ｄ－グルカンなどの所定生理活性物質についてＬＡＬを用いて測定すれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。以下においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明を続けるが、本発明はエンドトキシンのみならず、β－Ｄ－グルカンを始め他の所定生理活性物質に適用することが可能である。
エンドトキシンを定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法（攪拌比濁法を含む）ならびに、レーザー光散乱粒子計測法などが挙げられる。図１０に示すように、これらの測定法は上述のＬＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
しかしながら、比濁法では個々のコアギュリンはナノメータオーダーの微小な粒子であるため、これらが漸次会合していっても、光学的に検出可能な大きさまで成長しないと濁りとして検出できない。また、比濁法においては一般的に試料を静置して系全体におけるゲルの生成を待つので、コアギュリン同士の衝突確率が低く、会合の速度は必ずしも速くない。従って、比濁法を用いた場合には、エンドトキシンの検出または濃度測定が可能なるまでには相当の時間を要する場合があった。
それに対して、レーザー光散乱粒子計測法では、系内に生成されたゲルの微粒子を直接測定するため、比濁法よりも高感度であり、且つ、一般的にＬＡＬと検体からなる試料を強制的に攪拌するので、比濁法と比較して短時間でゲルの生成を検出できる。しかしながら、レーザー光散乱粒子計測法においては、微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、簡便な装置による測定が困難である場合があった。
本実施形態においては、予め、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出され得るか、検出され得る限界より若干小さいサイズの無機物からなる微粒子の表面にコアギュロゲンを結合させておく。そして、これをＬＡＬ試薬と混合して調製した試薬に、エンドトキシンを含有する試料を混和する。これにより、ＬＡＬ中に生成されるコアギュリンと微粒子上に吸着されたコアギュリンとを会合させ、また、微粒子上に吸着されたコアギュリン同士を会合させて、短時間で、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出可能なサイズの凝集塊を生成する。その結果、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法によって、より迅速にエンドトキシンの測定を行うことができる。
図１には、本実施例による微粒子の凝集メカニズムを示した。図１において中央の矢印の左側はエンドトキシンと反応する前の試薬の模式図である。矢印の右側はエンドトキシンと反応した後の試薬の模式図である。
図１に示すとおり、反応前は、本実施例における微粒子であるビーズ１と、微粒子の表面に結合されたコアギュロゲン２と、微粒子の表面に結合されていないコアギュロゲン３とが分散した状態である。なお、以下において便宜上、ビーズ１にコアギュロゲン２を結合させた状態の微粒子をＬＡＬ結合ビーズ１０と呼ぶことにする。
ここで、ビーズ１に用いられる素材が満たすべき条件について考える。ビーズ１に用いられる素材は、まず、ビーズ１自体を乾熱滅菌処理できるものが望ましい。換言すると、樹脂などの有機性の素材ではなく無機性の素材が望ましい。そうすれば、ビーズ１の形成段階またはＬＡＬ結合ビーズ１０の調整段階においてエンドトキシンを乾熱滅菌で熱により不活性化することが可能となり、ＬＡＬ結合ビーズ１０がエンドトキシンに汚染される危険性を低下させることができる。
また、ビーズ１に用いられる素材は、蛋白質の吸着性の高い素材であることが求められる。なお、非特許文献１には、ウシ血清アルブミンのシリカ、チタニア、ならびに、アルミナへの吸着量が蛋白質の等電点と酸化金属の零電荷点の視点から論ぜられている。また、非特許文献２では、酸化金属の零電荷点は溶液中に存在する緩衝液の種類によって 大きく変化する場合があることが示されている。ここで、蛋白質の吸着性の高い素材であるか否かは、蛋白質の等電点とビーズ１の零電荷点との関係によって定められる。すなわち、ビーズ１が蛋白質を吸着するためにはビーズ１と蛋白質との間に電位差があることが要求される。例えばコアギュロゲンが電気的に中和されるｐＨである等電点は約１０であるという報告があるので、コアギュロゲンとの間で充分な電位差を有する素材としては、チタニア（ｐＨ６．１）、ジルコニア（ｐＨ７．３）などが挙げられる。また、非特許文献２にあるように、アルミナは零電荷点がアルカリ側に高いが（ｐＨ９．０）、溶液に含まれる緩衝液の影響を受け易く、零電荷点が大きく酸性側にシフトする。そのため、アルミナでも、リムルス試薬のように緩衝液を含む充分にコアギュロゲンを吸着することが充分に可能である。
なお、コアギュロゲンの等電点は約１０と、アルカリ側に非常に高くなっているため、例えばｐＨ７付近の中性の環境（試薬の調整及び使用時にはｐＨ６－８に収まることが多い）においては、コアギュロゲンはプラス側に荷電していると考えられる。従って、蛋白質をより強力に吸着するには中性の環境（ｐＨ７）でビーズ１がマイナス側に帯電するような零電荷点を有する素材がより望ましいと言える。このとき、零電荷点がマイナス側に帯電している素材であっても良いし、適当な緩衝液が存在する環境においてマイナス側に帯電するような素材であっても良い。
また、ビーズ１の素材としては、凝集が生じた際の濁りの強度がある程度以上強いことが求められる。本実施例では、ＬＡＬ中の蛋白質とエンドトキシンとの反応に基づくビーズ１の凝集を比濁法やレーザー光散乱粒子法などの光学的手段によって測定する。換言すると、ビーズ１が分散された混和液による透過光や散乱光の強度変化を利用してビーズ１の凝集を測定する。従って、ビーズ１の素材としては、光を散乱し易い白色の素材、あるいは、光を吸収し易い黒色あるいは特定の有色の素材が望ましい。
その他、本実施例におけるエンドトキシンの測定に有利なビーズ１の素材としては、使用中に水に溶解しないものが望ましい。また、攪拌のし易さの観点から比重が水に近く極端に大きくない素材が望ましい。さらに、攪拌によって粒径が変化しては困るので、攪拌に耐える程度の機械的な強度を有するものが望ましい。
以上の要件より、ビーズ１の素材としては、無機物の中でも、中性領域の水に不溶の酸化金属の粒子または鉱物の粒子が望ましい。酸化金属粒子の例としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、アルミナ、セリア、酸化マンガン、フェライト並びに、これらの複合物あるいは混合物が挙げられる。その他、マグネシア（ＭｇＯ）、カルシア(ＣａＯ)、アルミナ(Ａｌ２Ｏ３)、アルミナ－チタニア(Ａｌ２Ｏ３－ＴｉＯ２)、ムライト(３Ａｌ２Ｏ３-２ＳｉＯ２）、スピネル(Ａｌ２Ｏ３－ＭｇＯ)、ジルコニア(ＺｒＯ２)、クロミア(Ｃｒ２Ｏ３)、イットリア(Ｙ２Ｏ３)、セリア(ＣｅＯ２)、チタン酸バリウム(ＢａＴｉＯ３)、ハフニア(ＨｆＯ２)などが、本実施例に係るビーズ１の素材として使用できる可能性がある。
その他、本実施形態のビーズ１としては、粒度が揃っていることも要求される。特に、レーザー光散乱粒子計測法でエンドトキシンの測定を行う場合には粒度の均一性は重要な要因となる。エンドトキシンとＬＡＬ結合ビーズ１０を含む試薬とを混和させた場合に、ビーズ１の粒度が不均一だと凝集の進行がばらついてしまう。その結果、濁度や粒子数の変化が緩慢になって測定精度が低下したり、測定の再現性が低下するなどの不都合が生じるおそれがある。既に、充分な粒度均一性を有する粒子として流通している素材としては、チタニア、アルミナ、酸化マンガンなどを挙げることができる。
なお、ビーズ１上にコアギュロゲン２を吸着させる際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に吸着させてもよいし、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製して吸着させてもよい。ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなく微粒子に吸着させる方法をとった場合には、ビーズ１上にコアギュロゲン２以外の蛋白質も吸着される可能性もあるが、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製する工程を省略することができるので試薬の調製、精製に係るコストを低減することができる。なお、その場合には、図１において、ビーズ１上及び、ビーズ１の周囲の試薬中にコアギュロゲン２、３以外に、ＬＡＬ中に含まれる他の蛋白質（不図示）がより多く存在することとなる。
次に、本実施形態におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬による実際のエンドトキシンの検出または濃度測定について、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスを使用した場合と比較しつつ説明する。
＜比較製造例１＞（ポリスチレンラテックスを用いた場合）
まず、比較製造例として、カルボキシル基をビーズ表面に有するポリスチレンラテックス粒子とＬＡＬ試薬とを不可逆的な酵素阻害剤を作用させた環境下で結合させたＬＡＬ結合ビーズ試薬の製造例について説明する。具体的には、カルボキシル基を表面に有するビーズ１として、Polyscience社製の粒径０．４５μｍ、あるいは、１．０μｍのPolybead Calboxylate Microsphere（以下「ＰＣＭ」と略す。）を用いた。
まず、比較製造例として、カルボキシル基をビーズ表面に有するポリスチレンラテックス粒子とＬＡＬ試薬とを不可逆的な酵素阻害剤を作用させた環境下で結合させたＬＡＬ結合ビーズ試薬の製造例について説明する。具体的には、カルボキシル基を表面に有するビーズ１として、Polyscience社製の粒径０．４５μｍ、あるいは、１．０μｍのPolybead Calboxylate Microsphere（以下「ＰＣＭ」と略す。）を用いた。
ＬＡＬ試薬としては、和光純薬製のエンドトキシン検出試薬であるリムルスＨＳ－Ｔシングルテストワコー（以下「ＬＡＬ試薬」または「リムルス試薬」と略す。）を用いた。１．０ｍＬのＰＣＭを最大容量２．０ｍＬの遠心管に入れて、さらにｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸バッファを最大容量まで加えてよく混合した後、卓上遠心器で１２５００ｒｐｍにて５分間遠心してＰＣＭを沈殿させて上澄みを除去した。この炭酸バッファとの混和、遠心、上澄みの除去といった一連の作業をさらに２回繰り返し、次に、沈殿させたＰＣＭにｐＨ４．５の０．０２Ｍのリン酸バッファを最大容量まで加えて混和させた後、同様に遠心分離、上澄みの除去という操作を合計３回行なった。
次に、遠心分離して上澄みを除去したＰＣＭに対し、オートクレーブにて１２１℃、２０分の条件で加熱処理を行った。これにより、この時点でＰＣＭがエンドトキシンに汚染されていたとしても、当該エンドトキシンのかなりの部分を不活性化することができる。その後さらに、バッファによる洗浄を行った。
次に、得られたＰＣＭの沈殿物にリン酸バッファを０．７５ｍＬ加え、さらに、０．７５ｍＬの２．０％カルボジイミド水溶液（水溶性カルボジイミド、同仁化学製）を加えて、室温で３時間転倒攪拌法を用いて攪拌してＰＣＭ上のカルボキシル基を活性化させた。
反応後のＰＣＭは遠心して上澄みを除去した後、再び、同様にリン酸バッファで３回洗浄し、最後に得られたＰＣＭの沈殿物にｐＨ８．５の０．２Ｍホウ酸バッファ０．５ｍＬを加えて懸濁させた。次に、ＬＡＬ試薬にホウ酸バッファを０．２５ｍＬ加えて溶解させたＬＡＬ試薬溶液を２本用意し、これらとＰＣＭ懸濁液を混合して容量を１．０ｍＬとした。さらに、これにセリンプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（Phenylmethanesulfonyl fluoride）を最終濃度で４ｍＭになるように加えた。混合溶液中のＰＣＭ上にある活性化したカルボキシル基とＬＡＬ中の各蛋白質が持つアミノ基がアミド結合するように室温で４時間以上攪拌して反応させた。
その後、混合溶液を遠心して上澄みを除去した後、１．２ｍＬのホウ酸バッファに再懸濁させ、さらに、この溶液に０．２５Ｍの２－アミノエタノール／ホウ酸バッファを５０μＬ加えて室温で３０分転倒攪拌させて、ＰＣＭ上の未反応の活性化カルボキシル基をアミノエタノールで消費した。さらに、ＰＣＭ懸濁液を遠心してＰＣＭ沈殿物を得た後に注射用生理食塩水（大塚製薬製）で再懸濁、遠心、上澄みの除去による一連の操作で合計３回洗浄してＬＡＬ結合ビーズ試薬を得た。最後に、防腐剤と界面活性剤とを添加してＬＡＬ結合ビーズ試薬を最適濃度に調整した。
以上のように、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスを用いた場合には、非常に多くの工程を踏んでＬＡＬ結合ビーズ試薬を得ることとなり、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を得るために２日を費やす場合もある。
これに対し、本実施形態に係るＬＡＬ結合ビーズ試薬では、ビーズ１として無機物の金属酸化物粒子、具体的にはアルミナの微粒子を使用することとした。以下、ビーズ１としてアルミナの微粒子を使用した場合のＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製法について説明する。
アルミナ製のビーズ１は、例えば、霧状のアルミのエアロゾルを火炎に吹きつけ、エアロゾルの各粒子を酸化させることにより形成してもよい。これからも分かるように、アルミナのビーズ１は、通常１０００℃以上の高温において形成されるので、少なくともビーズ１の形成段階においては、微粒子がエンドトキシンに汚染されていないことを保証できる。
なお、アルミナに関しては、粒子サイズが大きい場合（一次粒子のサイズとして０．３～０．４μｍ）は粒子自体が強い光散乱体であるために、光透過率（吸光度）を測定する手法に適している。粒子サイズが小さい場合（一次粒子のサイズとして０．１μｍ以下）は粒子自体はそれほど強い散乱を発生させないので、光散乱計測法（レーザー光散乱粒子計測法、レイリー散乱法など）での使用に適していると言える。
＜製造例１＞（光透過率測定用のＬＡＬ結合ビーズの製造）
デンカ製の球状アルミナ粒子ＡＳＦＰ－２０（平均粒径０．３μｍ）を、念のため乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。球状アルミナ粒子は、高温で乾熱滅菌することが可能なので、この段階においてもエンドトキシンをより完全に不活性化することができる。
デンカ製の球状アルミナ粒子ＡＳＦＰ－２０（平均粒径０．３μｍ）を、念のため乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。球状アルミナ粒子は、高温で乾熱滅菌することが可能なので、この段階においてもエンドトキシンをより完全に不活性化することができる。
次に、球状アルミナ粒子を２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、球状アルミナ粒子の分散液をリムルス試薬（和光純薬、ＨＳ－Ｔ）１本に対して３００μＬになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。ボルテックスミキサーで攪拌して混和させた後、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理して球状アルミナ粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行った。
なお、前述のように球状アルミナ粒子はコアギュロゲンなどの蛋白質に対して強い吸着力を有しており、さらに加熱によってより蛋白質を吸着、固定し易い状態となる。従って本実施形態では、より簡単な工程で球状アルミナ粒子への蛋白質の固定を実現することができる。また、この熱処理によりリムルス試薬中のセリンプロテアーゼは完全に失活する。従って、球状アルミナ粒子を用いた場合には、ＰＭＳＦなどのセリンプロテアーゼ阻害剤を添加する必要なくなる。加熱処理後、防腐剤（アジ化ナトリウム）と界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）を０．０５％になるように加えて、総量が３．０ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈した。
このように、ビーズ１の素材として、無機物であり、金属酸化物であるアルミナの微粒子を用いたことにより、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の製造工程を極めて簡単にすることができた（合計３０分～１時間）。これにより、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調整中にエンドトキシンによる汚染が発生する危険性を低減することができる。また、ビーズ１が無機物（金属酸化物）であるので高温の熱処理によってエンドトキシンを完全に不活性化することができる。
また、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスの微粒子を用いた場合には、微粒子上に固定されたカルボキシル基とＬＡＬ中の蛋白質とをアミド結合することで結合させた。この場合には、蛋白質どうしの架橋が生じ易く、結果として、ビーズ１の凝縮物が出来易く、ビーズ１の分散性を均一に維持することが困難な場合があった。
それに対し、素材として球状アルミナ粒子を用いた場合は、アルミナの微粒子が有する蛋白質に対する吸着力によってアルミナ表面に蛋白質を吸着・固定する。従って、ビーズ１の濃度と蛋白質の濃度とを調整することで、ビーズ１どうしを架橋させることなく、ビーズ１の表面全体を蛋白質で覆うような状態を作ることが可能である。そうすると、ビーズ１どうしが不用意に凝集してしまうことを抑制でき、ＬＡＬ結合ビーズ試薬における分散の均一性を向上させることができる。なお、本製造例では、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理することで、球状アルミナ粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行ったが、球状アルミナ粒子は充分に高い蛋白質の吸着性を有しているので、熱処理は必ずしも必要ではない。
＜製造例２＞（レーザー光散乱粒子計測法用のＬＡＬ結合ビーズの製造）
アエロジル社製アルミナ粒子ＡＬｕＣ（１次粒子粒径０．０３μｍ）を乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。次に、粒子を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、３０００ｒｐｍで1分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、微粒子の分散液を２倍に注射用蒸留水で希釈し、リムルス試薬（和光純薬、ＨＳ－Ｔ）１本に対して１００μＬになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。
アエロジル社製アルミナ粒子ＡＬｕＣ（１次粒子粒径０．０３μｍ）を乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。次に、粒子を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、３０００ｒｐｍで1分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、微粒子の分散液を２倍に注射用蒸留水で希釈し、リムルス試薬（和光純薬、ＨＳ－Ｔ）１本に対して１００μＬになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。
ボルテックスミキサーで攪拌して混和させた後、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理してアルミナ微粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行った。また、この熱処理によりリムルス試薬中のセリンプロテアーゼは完全に失活した。加熱処理後、防腐剤（アジ化ナトリウム）と界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）を０．０５％になるように加えて、総量が１．５ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈した。
＜製造例３＞（エンドトキシンフリーガラス容器）
光透過率測定法ではφ６ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ０．７５ｍｍ、長さ３．５ｍｍ）を内在した専用の容器を、一方、レーザー散乱粒子計測法では、φ７ｍｍ、長さ５０ｍｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ１ｍｍ、長さ５ｍｍを）を内在した専用の容器を使用した。これらの容器をガラス容器の開口部をアルミ箔で覆い、さらに、２０本ずつアルミ箔で小分けに梱包したものを鉄製の乾熱処理缶に詰め、２５０℃で３時間加熱処理して、エンドトキシンを不活性化した。
光透過率測定法ではφ６ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ０．７５ｍｍ、長さ３．５ｍｍ）を内在した専用の容器を、一方、レーザー散乱粒子計測法では、φ７ｍｍ、長さ５０ｍｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ１ｍｍ、長さ５ｍｍを）を内在した専用の容器を使用した。これらの容器をガラス容器の開口部をアルミ箔で覆い、さらに、２０本ずつアルミ箔で小分けに梱包したものを鉄製の乾熱処理缶に詰め、２５０℃で３時間加熱処理して、エンドトキシンを不活性化した。
次に、上記で製造した球状アルミナ粒子を用いたＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いたエンドトキシン測定について説明する。
＜実施例１＞（光透過率測定）
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）５０μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ６ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ－II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ試薬１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、攪拌比濁型エンドトキシン測定装置（ＥＸ－１００、興和）を用いて測定を行った。また、同時にリムルス試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）５０μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ６ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ－II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ試薬１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、攪拌比濁型エンドトキシン測定装置（ＥＸ－１００、興和）を用いて測定を行った。また、同時にリムルス試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。
エンドトキシンがリムルス試薬と反応するとＬＡＬ結合ビーズが含まれない試料ではリムルス試薬中に不溶性の蛋白質であるコアギュリンが生成されるため、混和液が濁って光透過率が減少してくる。一方、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた混和液ではもともと試薬がビーズによって白濁しているが、コアギュリンの生成が開始した初期にコアギュリンがビーズ上に生成されたコアギュリンと会合してビーズが凝集するために濁りがなくなり、光透過率が一旦上昇する。光透過率が急激に変化する変局点を検出する手法（並列差分法）を用いて変局点が現われた時刻をエンドトキシン検出時間とした。
図２にはエンドトキシン濃度を横軸に、検出時間を縦軸に取り、両対数でプロットしたグラフを示す。図２に示すように、本発明のＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用することにより、エンドトキシン濃度の測定精度は維持しつつ大幅な測定時間の短縮が可能であることが分かった。また、図２から分かるように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用しない場合には、エンドトキシン濃度が低い領域では検出時間が極端に長くなっており、現実的に測定不可能な領域が広くなっている。従って、本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いることでエンドトキシン濃度の測定限界を広げることが可能となる。
＜実施例２＞（レーザー光散乱粒子計測）
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）１００μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ７ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ－II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ懸濁液１００μＬで溶解させ、それを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラスキュベットに移注し、レーザー光散乱粒子計測装置（ＥＸ－３００、興和）を用いて測定を行った。
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）１００μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ７ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ－II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ懸濁液１００μＬで溶解させ、それを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラスキュベットに移注し、レーザー光散乱粒子計測装置（ＥＸ－３００、興和）を用いて測定を行った。
また、同時にリムルス試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水１００μＬで溶解させ、それをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。エンドトキシンがリムルス試薬と反応するとＬＡＬ結合ビーズが含まれない混和液ではリムルス試薬中に不溶性の蛋白質であるコアギュリンが生成されるため、試料中にゲル粒子が発生する。これは光を散乱するため、ＥＸ－３００によってゲル微粒子として検出される。
一方、ＬＡＬ結合ビーズを混和液に含む場合、製造例２で製造したＬＡＬ結合ビーズ試薬は製造例１のＬＡＬ結合ビーズ試薬と比較して濁りが少なく、ＥＸ－３００で測定してもほとんど光散乱体として検出されない。しかし、エンドトキシンを作用させて反応が進行すると試料中にコアギュリンが生成され、ＬＡＬ結合ビーズを架橋していくので、ゲル粒子として検出されるようになる。図３には、ＬＡＬ結合ビーズ試薬とエンドトキシンとの混和後の経過時間と、検出された粒子数との関係のグラフを示す。
図３に示されるように、ＬＡＬ結合ビーズが存在しない場合、コアギュリン（５ｎｍ程度）が検出可能な大きさに成長するまで時間がかかるが、ＬＡＬ結合ビーズが存在するとコアギュリン単独の粒子が充分な大きさに成長するのを待たずに、会合したビーズ１が凝集微粒子として検出されるため、検出粒子数の立ち上がりが早くなる。図４にはエンドトキシン濃度を横軸に、検出時間を縦軸に取り、両対数でプロットしたグラフを示す。図４に示すように、本発明のＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用することによりエンドトキシン濃度の測定精度は維持しつつ大幅な測定時間の短縮が可能であることが分かった。なお、本測定ではエンドトキシンの検出はゲル粒子の総数が２０を越えた時刻とした。
＜実施例３＞
次に、ビーズ１としてチタニア粒子を用いた場合について説明する。本実施例においては、チタニア粒子（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）を２５０℃で３時間乾熱処理し、混入しているエンドトキシンを熱により完全に不活性化した。次に、これを１０ｍｇ/ｍＬになるように注射用蒸留水（大塚製薬製）で分散させたのち、１５０μＬをリムルス試薬（ＨＳ－Ｔ、和光純薬製）に加えて試薬を溶解した後、６０℃で２０分加熱して粒子表面にリムルス試薬の蛋白質を吸着及び固定させた。さらに、これを注射用蒸留水で３．０ｍＬになるように希釈し、そのうちの２．０ｍＬでリムルス試薬（ＥＳ-IIマルチテスト試薬、和光純薬製）を溶解し、溶解した試薬５０μＬとエンドトキシン希釈系列溶液５０μＬを測定容器内で混和させ、攪拌比濁法測定装置（ＥＸ－１００、興和製）でエンドトキシン凝集反応を測定した。
次に、ビーズ１としてチタニア粒子を用いた場合について説明する。本実施例においては、チタニア粒子（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）を２５０℃で３時間乾熱処理し、混入しているエンドトキシンを熱により完全に不活性化した。次に、これを１０ｍｇ/ｍＬになるように注射用蒸留水（大塚製薬製）で分散させたのち、１５０μＬをリムルス試薬（ＨＳ－Ｔ、和光純薬製）に加えて試薬を溶解した後、６０℃で２０分加熱して粒子表面にリムルス試薬の蛋白質を吸着及び固定させた。さらに、これを注射用蒸留水で３．０ｍＬになるように希釈し、そのうちの２．０ｍＬでリムルス試薬（ＥＳ-IIマルチテスト試薬、和光純薬製）を溶解し、溶解した試薬５０μＬとエンドトキシン希釈系列溶液５０μＬを測定容器内で混和させ、攪拌比濁法測定装置（ＥＸ－１００、興和製）でエンドトキシン凝集反応を測定した。
上記の測定の結果、アルミナをビーズ１として用いた場合と略同様の現象が観察された。すなわち、凝集反応の初期にはビーズ１の会合により光透過率が一旦上昇した。そして、その後に光透過率が減少した。本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用した場合とＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用しない場合におけるエンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間の関係を図５に示す。図５に示すように両軸を対数でプロットするといずれも直線近似され、チタニア粒子のビーズ１を使用した場合にも、エンドトキシン濃度の測定精度を維持しつつ測定時間を大幅に短縮することが可能であることがわかった。
＜実施例４＞
次に、ビーズ１に用いられる酸化金属微粒子として、アルミナ（電気化学工業（デンカ）製球状アルミナＡＳＦＰ－２０）、シリカ（日本アエロジル製Ａｅｒｏｓｉｌ３００）、チタニア（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）、および、酸化マンガン（IV）粉末（関東化学製）を、鉱物微粒子としてハイドロキシアパタイト（コバレントマテリアル製）、カオリン（関東化学製）、および、ベントナイト（関東化学製）を用いて、これらの無機性の素材で形成されたビーズ１によりＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製し、エンドトキシン測定時間の短縮効果を調べた。
次に、ビーズ１に用いられる酸化金属微粒子として、アルミナ（電気化学工業（デンカ）製球状アルミナＡＳＦＰ－２０）、シリカ（日本アエロジル製Ａｅｒｏｓｉｌ３００）、チタニア（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）、および、酸化マンガン（IV）粉末（関東化学製）を、鉱物微粒子としてハイドロキシアパタイト（コバレントマテリアル製）、カオリン（関東化学製）、および、ベントナイト（関東化学製）を用いて、これらの無機性の素材で形成されたビーズ１によりＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製し、エンドトキシン測定時間の短縮効果を調べた。
これらのビーズ１を２５０℃で３時間乾熱処理し、コンタミしたエンドトキシンの熱による不活性化を行い、それぞれのビーズ１の濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように注射用蒸留水で懸濁した。これらの粒子懸濁液を１０ｍｇ/ｍＬに希釈し、波長４３０ｎｍの光を入射させた場合における吸光度は各々図６のようになった。
図６に示すように、最も高い吸光度を示したのはチタニア（Ｔｉ）であり、アルミナ（Ａｌ）、カオリン（Ｋａｏ）の順番で吸光度は低くなった。また、ベントナイト（Ｂｅｎ）、酸化マンガン（Ｍｎ）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、シリカ（Ｓｉ）の粒子懸濁液ではカオリン（Ｋａｏ）の場合より低い吸光度が得られた。次に、予め５０μＬの注射用蒸留水で溶解しておいたリムルス試薬（和光純薬製ＨＳ－Ｔシングルテスト）に対してこれらの粒子懸濁液５０μＬを加えてボルテックスミキサーで攪拌し、それぞれを６０℃で３０分間処理し、粒子上にリムルス試薬中の蛋白質を固定化した。
アルミナ、ならびに、チタニア原料のものは３．０ｍＬに、それ以外の原料のものは１．５ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈し、さらに、それぞれのビーズ液５０μＬをエンドトキシン希釈溶液（０．０２ＥＵ/ｍＬ）で溶解したリムルス試薬（ＥＳ-II、和光純薬製）５０μＬと混和させて、攪拌比濁法測定装置（ＥＸ－１００、興和製）を用いて凝集反応を調べた。
測定結果を図７に示す。図７においては、今回調べた無機性の粒子では、既に効果について述べたチタニア、アルミナのほかに、カオリン、酸化マンガンにおいても凝集反応初期にビーズ１が会合して光透過率が上昇する現象が顕著であることが確認された。一方、シリカ、ベントナイトを用いた場合は、凝集反応初期に光透過率が上昇する相が小さく、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いることによる効果はあまり大きくなかった。図８にはシリカを用いた場合の結果を示す（図８中の領域Ａはエンドトキシン凝集反応と無関係に光透過率が減少していく相、領域Ｂは若干粒子の凝集により光透過率が上昇しているように見える相である）。シリカを用いた場合に上記のように光透過率の上昇が弱くなる原因としては、重量あたりの吸光度が低いことが主因として挙げられる。
また、ビーズ１としてハイドロキシアパタイトを用いた場合は、ＬＡＬとエンドトキシンとの反応に起因する凝集反応とは無関係に光透過率が減少して行く現象が観察された。ハイドロキシアパタイトにおけるこの現象の原因としては、ハイドロキシアパタイトは機械的強度が弱く、攪拌により崩壊してしまうため、凝集反応とは無関係に崩壊したビーズ１による光透過率の減少が生じたためと考えられる。図９には、ハイドロキシアパタイトの崩壊による光透過率の変化のグラフを示す。
上記より、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を製造するに当たっては、ビーズ１の素材として、（１）蛋白質の吸着性が高い。（２）重量あたりの吸光度が高い。（３）攪拌という外力に対して崩壊しないだけの機械的強度を有する。という条件を満たすものが望ましいことが確認された。また、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンは、上記の条件を満たすことで、ビーズ１として充分に使用可能な素材であることが確認された。
なお、本発明の微粒子に使用される無機性の素材は、例示されたものに限られないことは当然である。（１）蛋白質の吸着性が高い。（２）重量あたりの吸光度が高い。（３）攪拌という外力に対して崩壊しないだけの機械的強度を有する。という条件を満たす素材であれば使用することができる。それらの条件を満たす素材の組成が複合化合物である場合はもちろんのこと、組成の異なるビーズを複数混合したものであっても良い。例えば、シリカアルミナ、アルミナチタニア、チタニアジルコニア等を使用することも可能であるし、アルミナ、チタニア、シリカを素材としたビーズを適当な割合で混合して使用しても構わない。
なお、本実施形態における製造例１及び２では、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に吸着させてＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製している。しかし、上記の実施例のように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をさらにＬＡＬ試薬と混合した上で、エンドトキシンを含有する試料と混和し、ＬＡＬ結合ビーズ１０を凝集させる場合には、ＬＡＬ結合ビーズ１０を形成するビーズ１上にはなるべく多くのコアギュロゲンが吸着していることが望ましい。従って、ＬＡＬ結合ビーズ１０を生成する際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に結合させるよりもむしろ、精製したコアギュロゲンをビーズ１に吸着させるようにしてもよい。
なお、上記の実施例において調製されたＬＡＬ結合ビーズ試薬は、本発明におけるエンドトキシンの測定用試薬キットに相当する。
１・・・ビーズ
２・・・コアギュロゲン
３・・・コアギュロゲン
１０・・・ＬＡＬ結合ビーズ
２・・・コアギュロゲン
３・・・コアギュロゲン
１０・・・ＬＡＬ結合ビーズ
Claims (9)
- カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させ、
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。 - 前記微粒子は、金属酸化物または鉱物で形成されたことを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
- 前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させることを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。 - カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させて調製された、生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであって、前記微粒子は、無機性の素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
- 前記微粒子は、金属酸化物または鉱物で形成されたことを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
- 前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする請求項６に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
- 前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項６から８のいずれか一項に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
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