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WO2010122243A1 - Signature moléculaire pronostique des sarcomes et utilisations - Google Patents

Signature moléculaire pronostique des sarcomes et utilisations Download PDF

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Publication number
WO2010122243A1
WO2010122243A1 PCT/FR2010/000323 FR2010000323W WO2010122243A1 WO 2010122243 A1 WO2010122243 A1 WO 2010122243A1 FR 2010000323 W FR2010000323 W FR 2010000323W WO 2010122243 A1 WO2010122243 A1 WO 2010122243A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
pool
tumor
expression
polynucleotides
Prior art date
Application number
PCT/FR2010/000323
Other languages
English (en)
Inventor
Frédéric Chibon
Jean-Michel Coindre
Alain Aurias
Original Assignee
Université Victor Segalen - Bordeaux 2
Institut Bergonié
Institut Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Université Victor Segalen - Bordeaux 2, Institut Bergonié, Institut Curie filed Critical Université Victor Segalen - Bordeaux 2
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Priority to JP2012506544A priority patent/JP5865241B2/ja
Priority to CA2759417A priority patent/CA2759417C/fr
Priority to EP10718241A priority patent/EP2473622A1/fr
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a prognostic molecular signature of sarcomas, particularly sarcomas with complex genetics, and its use for predicting metastasis-free survival and overall survival of patients with sarcoma.
  • Soft tissue sarcomas (STS) in adults are rare and heterogeneous in terms of location, histology, molecular abnormalities, and prognosis.
  • Low-differentiated STS are the most common malignant tumors in adults, representing approximately 50% of pathological diagnoses, and mainly include sarcomas with a complex karyotype, namely leiomyosarcomas (LMS), undifferentiated sarcomas (US), or malignant histiocytofibromas.
  • LMS leiomyosarcomas
  • US undifferentiated sarcomas
  • malignant histiocytofibromas malignant histiocytofibromas.
  • MMH dedifferentiated liposarcoma
  • DD-LPS dedifferentiated liposarcomas
  • poorly differentiated STS can be divided into two main groups, a group with a complex genomic profile (80%) consisting essentially of US, LMS, pleomorphic rhabdomyosarcomas and pleomorphic liposarcomas, associated with very complex profiles, but recurrent, genomic imbalances (IDBAIH et al., Invest Lab., 85 (2): 176-181, 2005; CHIBON et al., Cancer Genet Cytogenet., 141 (1): 75-78, 2003; DERRE and al., Lab.
  • DD-LPS CHIBON et al., Cancer Genet, Cytogenet., 139 (1): 24-29, 2002, COINDRE et al., Pathol Mod, 16 (3): 256-262, 2003.
  • STS are aggressive tumors capable of local and metastatic relapse. Patients with such tumors usually have a poor prognosis, 40 to 50% eventually develop distant metastases, mainly in the lungs, usually within 5 years of diagnosis (WEITZ et al., Clin J. One, 21 (14)). ): 2719-2725, 2003. ZAGARS et al., Cancer, 97 (10): 2530-2543, 2003).
  • NCI National Cancer Institute
  • FNCLCC National Federation of Cancer Control Centers
  • the histological grade is the best predictor of survival without metastasis and overall survival.
  • the most effective FNCLCC rank has been established for more than 20 years and is still the most commonly used system. It is based on semi-quantitative evaluation of tumor differentiation, necrosis, and mitotic index.
  • this system has several limitations: its reproducibility from one pathologist to another is not perfect, it does not apply to all types of sarcomas (COINDRE et al., Cancer, 91 (10): 1914- 1926, 2001) and is not informative for grade 2 cases (accounting for about 40% of cases).
  • COINDRE et al., Cancer, 91 (10): 1914- 1926, 2001 is not informative for grade 2 cases (accounting for about 40% of cases).
  • no study has provided prognostic criteria that could replace this histological grade system.
  • FRANCIS et al., BMC Genomics, 8: 73, 2007 propose a prognostic molecular signature.
  • the inventors of the present invention have discovered quite unexpectedly that establishing a molecular profile using Emerging technologies, such as DNA microarrays, could allow the identification of alterations / genes causing tumor aggressiveness, with the consequent possibility of defining a more efficient grade-based system. on molecular alterations; which leads to a major breakthrough in the field of sarcoma analysis.
  • the present invention therefore relates, in the first place, to a pool of polynucleotides comprising at least two polynucleotides chosen from the polynucleotide sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 67.
  • the polynucleotide pool of the invention may include 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 , 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, or 67 polynucleotides selected from the polynucleotide sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 67.
  • genes can be divided into 5 main groups according to their role in mitosis: control point of mitosis and the cell cycle (12 genes, SEQ ID NOs: 1-12); chromosome biogenesis, condensation, alignment and segregation (26 genes, SEQ ID NOs: 13-38); mitotic spindle and centrosome (12 genes, SEQ ID NOs: 39-50); microtubule engine, kinesin complex (8 genes, SEQ ID NOs: 51-58), and cytokinesis (4 genes, SEQ ID NOs: 59-62); among the last 5 genes grouped according to the experimental results (SEQ ID NOs: 63-67), 3 are known to be involved in chromosomal instability (SEQ ID NOs: 63-65) and 2 are associated with histological grade according to US Pat. study (SEQ ID NOs: 66 and 67). Table 1 below shows the names of each of the genes, their distribution into five main groups, and their respective sequences (references GenBank and SEQ ID NO :).
  • the polynucleotide pool may comprise the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 24.
  • the polynucleotide pool can comprise the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:
  • polynucleotide pool may comprise the polynucleotides of SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 47
  • SEQ ID NO: 58 SEQ ID NO: 24
  • at least one polynucleotide whose sequence is selected from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
  • polynucleotide pool may consist of polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:
  • polynucleotide pool may comprise only the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
  • polynucleotide pool of the invention may consist of polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:
  • the polynucleotide pool can consist only of the polynucleotides of sequences SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 24 and at least one polynucleotide whose sequence is chosen from the sequences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 to SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48 at SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 to SEQ ID NO: 67.
  • the polynucleotide pool of the invention may comprise at least one polynucleotide selected from each of the following sets of polynucleotides:
  • Set 1 SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 12;
  • Set 2 SEQ ID NO: 13 to SEQ ID NO: 38;
  • the polynucleotide pool of the present invention may be selected from Sets 1 to 5.
  • the pool of at least two polynucleotides may be made up entirely or part of Set 1, Set 2, Set 3, Set 4 or Set 5.
  • the pool of the present invention may consist wholly or in part of Set 1, or in whole or in part part of set 2, or part or all of set 3, or all or part of set 4, or all or part of set 5.
  • the polynucleotide pool can comprise the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 24 sequences. and at least one polynucleotide selected from set 5.
  • This polynucleotide pool may further comprise at least one of the other genes identified within the scope of the invention.
  • the polynucleotide pool may consist of polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 24 and at least one polynucleotide selected from set 5.
  • the polynucleotide pool of the invention comprises the polynucleotides of sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 67. It may be for example a pool consisting of sequences SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 67. Whatever the embodiment of the invention, advantageously, the polynucleotide pool may advantageously comprise at most 10 polynucleotides.
  • the pool of polynucleotides of the invention is immobilized on a support, for example a solid support or a liquid carrier.
  • a support for example a solid support or a liquid carrier.
  • the support may comprise beads on which the nucleic acids are fixed.
  • the liquid medium may be a cell culture supernatant, serum, plasma, this list not being limiting. This may be for example the support implemented in Luminex® technology.
  • the support is a solid support, it is preferably selected from the group comprising a nylon membrane, a nitrocellulose membrane, a glass slide, glass beads, a membrane on a glass support or a chip of silicon, a plastic support.
  • the solid support may be a nucleic acid chip, for example a DNA chip, (also called a gene chip, biochip, expression chip).
  • a DNA chip also called a gene chip, biochip, expression chip.
  • Such chips allow to quantitatively measure an expression variation (differential expression) of two or more polynucleotides of the polynucleotide pool of the invention between (i) 2 experimental conditions: generally a reference condition and a pathological condition or ( ii) several tumors to determine a mean of expression, according to which the tumors can be classified with respect to each other.
  • it may be an Affimetrix® DNA chip, or a DNA chip from Agilent Technologies.
  • genes identified by the present inventors may furthermore be potential targets for new therapeutic approaches targeting the early stage of metastatic potential acquisition.
  • a vital prognosis of the patients on the basis of the expression profile of these genes can be realized very early, or even during the initial diagnosis.
  • the polynucleotide pool of the invention can be used for detecting, prognosticating, diagnosing soft tissue sarcoma (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST ), or to monitor the treatment of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST).
  • the polynucleotide pool of the invention can be used to obtain a compound for the treatment of soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST).
  • the second "bottom-up" approach has been applied in the sense that the tumor expression profiles have been compared as a function of the biological phenotypes (chromosomal instability, genomic complexity and histological grades), but instead of direct gene selection, biological pathways particularly relevant for the phenotypes tested were first identified and then the genes significantly involved in these pathways were identified.
  • This selection of biological pathway is the important step which led to the happy results of the present invention in a heterogeneous group such as that of non-translocated sarcomas, and moreover in different types of tumors such as GISTs (gastrointestinal stromal tumors) and breast cancers.
  • the present invention thus also relates to an in vitro method for selecting a pool of polynucleotides, for example those of the invention, comprising the following steps: a) providing tumor biological samples from patients suffering from sarcoma of soft tissue (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST); b) detecting and / or quantifying each of the polynucleotides, separately in each of the biological tumor samples; c) comparing the expression profile of the polynucleotide pools obtained in step c) with respect to a biological phenotype, preferably of chromosomal instability, genomic complexity or histological grade, for each of the biological tumor samples; d) selecting the biologically statistically significant (p ⁇ 10 "5) for the tested phenotype; e) select the polynucleotides significantly involved in this biological pathway, the expression of which is indicative of the probability of occurrence of metastases.
  • STS soft tissue
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • expression profile is meant the totality of the results obtained when the expression of a set of polynucleotides is determined. Such a profile facilitates the use of quantitative statistical analytical techniques and allows a quick visual comparison of the results. Preferably, such a profile is obtained on a solid support, such as a DNA chip.
  • biological phenotype within the meaning of the present invention, is meant the manifestation of a genetic status, ie the set of observable characteristics characterizing a sample from a patient suffering from STS or GIST, who reflect the expression of the information carried by the chromosomes (the genotype).
  • chromosomal instability within the meaning of the present invention, is meant clonal or non-clonal rearrangements. This instability leads to losses and gains in chromosome arms and unbalanced chromosome rearrangements. The instability of chromosomes inside the nucleus of an individual's cells makes them more vulnerable in terms of neoplasia (the occurrence of cancer). It is in the tumor cells that we find this instability.
  • genomic complexity is intended to mean the number of imbalances and the nature of the chromosomal fragments involved.
  • the term "histological grade” means a consensual indicator of tumor proliferation, the risk of metastases and the response to adjuvant therapy (chemotherapy). Histological or tumor grade is a decision-making factor for the treatment of a tumor. It is determined by the histological analysis of the tumor and the grading system used is for example that of the FNCLCC. This system adopted by the National Federation of Centers for the Fight against Cancer (FNCLCC) refers to the following three characteristics:
  • the histological grade of FNCLCC soft tissue tumors is the sum of the 3 scores "Differentiation”, “Mitotic Index” and “Tumor Necrosis”: Grade 1 (total score of 2 or 3), Grade 2 (total score of 4 or 5), and Grade 3 (total score of 6 to 8).
  • the present invention also relates to an in vitro method for the analysis of soft tissue sarcoma (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST), said method comprising determining the level of expression of a polynucleotide pool according to the invention in a tumor biological sample.
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • tumor biological sample is intended to mean a tissue sample optionally derived from (i) a primary tumor (ii) from the center of a tumor (iii) a site in the tumor other than that the center and (iv) any tumor located outside the tumor tissue per se of a patient with STS.
  • Said biological tumor sample may come for example from a surgical procedure or a tumor resection performed on the patient's STS, a biopsy where a part of the tumor tissue is collected from the patient's STS for later analysis; a blood sample, for example whole blood, plasma or serum, containing tumor cells derived from the primary tumor or tumor proteins produced by the tumor cells derived from the primary tumor.
  • the level of expression of a polynucleotide pool of the present invention can be determined by any method known in the art.
  • the level of expression of at least two polynucleotides involved in the molecular signature of the invention in samples obtained from patients with STS can be determined by measuring the level of mRNA corresponding to the polynucleotide and / or the protein encoded by the polynucleotide.
  • the RNA can be isolated from the samples by methods well known to those skilled in the art, for example by that described in AUSUBEL et al. (Curr Mol Mol Biol., 1: 4.1.1-4.2.9 and 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1996).
  • the methods for detecting the level of mRNA expression that can be used to practice the present invention are well known in the art and include, but are not limited to, expression chips, northern blotting, PCR. RT-PCR, RT-PCT with Taqman probes or micro-fluid maps, and, in general, hybridization techniques (ie non-covalent bonds of two single-stranded polynucleotides, wholly complementary or sufficiently complementary to hybridize with each other, and form a double-stranded structure).
  • the level of expression of a polynucleotide pool of the present invention can be determined by routine quantitative PCR. It may further be possible to use RNAs derived from paraffin blocks containing tissue or organ samples, or biological samples.
  • a particularly efficient method for detecting the level of mRNA transcripts expressed from a plurality of the polynucleotides described involves hybridization of labeled mRNA to an oligonucleotide chip (also called a DNA chip, chip with genes, expression chips).
  • an oligonucleotide chip also called a DNA chip, chip with genes, expression chips.
  • Such a method makes it possible to simultaneously determine the level of transcription of a plurality of polynucleotides to generate polynucleotide expression profiles.
  • the oligonucleotides used in this hybridization method are generally fixed on a support, for example a solid support or a liquid support. In the case where the support is a liquid support, it may comprise beads on which the nucleic acids are fixed.
  • the liquid medium may be a cell culture supernatant, serum, plasma, this list not being limiting. This may be for example the support implemented in Luminex® technology.
  • solid carriers include, but are not limited to, membranes, filters, slides, paper, nylon, fibers, magnetic or non-magnetic beads, gels, polymers and any solid carrier known to the art. skilled person. Any solid support on which oligonucleotides can be immobilized, either directly or indirectly, either covalently or non-covalently, can be used.
  • a particularly advantageous solid support consists of a nucleic acid chip, in particular a DNA chip. These chips contain a particular oligonucleotide probe at a predefined location of the chip.
  • Each predefined location may contain more than one molecule of the particular probe. Because the oligonucleotides are at specific locations on the support, the hybridization patterns and intensities (which together form a unique expression pattern) can be interpreted in terms of the level of expression of particular polynucleotides.
  • oligonucleotide probes are preferably of sufficient length to specifically hybridize only to complementary transcripts of the polynucleotides of the invention.
  • the term "oligonucleotides” is intended to mean a single-stranded nucleic acid. Generally oligonucleotide probes consist of 16-20 nucleotides, and in some cases up to 25 nucleotides, or even up to 500 nucleotides or more.
  • the oligonucleotide probes are labeled with one or more markers to enable detection of hybridized probe / target polynucleotide complexes.
  • the markers may comprise compositions detectable by spectroscopic, biochemical, photochemical, bioelectronic, immunochemical, electrical, optical or chemical means.
  • labels include, but are not limited to, radioisotopes, chemiluminescent compounds, labeled binding proteins, heavy metal atoms, spectroscopic markers, such as fluorescent and dye labels, bound enzymes, mass spectrometry and magnetic markings.
  • Oligonucleotide probe chips for expression monitoring can be prepared and used according to methods well known in the art, as described for example in LOCKHART et al. (Nature Biotechnol., 14: 1675-1680, 1996, McGALL et al., Proc Natl Acad Sci USA 93: 13555-13460, 1996 US 6,040,138
  • Such biochips are commercially available from for example, from Affimétrix (Santa Clara, California).
  • telomere expression is also possible to detect the expression of a protein encoded by two or more of the polynucleotides involved in the molecular signature of the invention. This can be accomplished by methods well known in the art, such as, for example, the use of a probe which is detectably labeled, or which can be subsequently labeled. Generally, the probe is an antibody that recognizes the expressed protein. The expression level of the protein in the sample is then determined by an immunoassay method using the antibodies, for example dot blotting, western blotting, ELISA, immunohistochemistry, FACS, etc.
  • the method of the invention makes it possible to establish the prognosis of a patient suffering from an STS or a GIST, in particular makes it possible to determine the risk of / predicting the - occurrence of metastases.
  • predicting the occurrence of metastases within the meaning of the present invention, it is intended to determine a relative value making it possible to quantify the probability of the occurrence of metastases of one or more tissues or organs, in a patient suffering from STS or a GIST.
  • the prediction of the occurrence of metastases is expressed by a statistical value, including a p value, calculated from the expression values obtained for each of the polynucleotides tested.
  • the method of the invention makes it possible to establish the prognosis of a patient suffering from an STS or a GIST, in particular to distinguish subgroups of good or bad prognosis from a group of soft tissue sarcomas (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST) initially considered to be of the same histologic grade.
  • STS soft tissue sarcomas
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • the term "good prognosis” refers to the indication of patients not likely to relapse, that is to say the occurrence of metastases, during their treatment or in the following 5 to 6 years. their treatment, a survival with no significantly long-term metastases.
  • STS or GIST patients may be considered to belong to a "good prognosis" subgroup when they under-express the genes of the molecular signature of the invention and are prone to developing metastases in less than 20% of all types of sarcomas, and in particular in none of the GIST cases.
  • the term “poor prognosis” refers to patients who may have a relapse (metastases) during treatment or within 5 to 6 years of treatment.
  • patients with STS or GIST can be considered to belong to a subgroup of poor prognosis when they over-express the molecular signature genes and are subject to develop metastases in at least 50% of cases.
  • the determination of the level of expression of the polynucleotide pool in the method of the invention is carried out on a nucleic acid chip, also called a biochip, DNA chips, gene chip, expression chip.
  • Such chips make it possible to quantitatively measure and rapidly visualize a variation in the level of expression, or differential expression, of two or more polynucleotides between (i) 2 experimental conditions, for example a reference experimental condition and a pathological one, at from a biological sample of a patient or (ii) several tumors to determine a mean of expression, according to which the tumors can be classified with respect to each other.
  • 2 experimental conditions for example a reference experimental condition and a pathological one
  • a mean of expression according to which the tumors can be classified with respect to each other.
  • Affimetrix TM DNA chips or DNA chips from Agilent Technologies can be used.
  • the method of the invention can be used to detect, prognose, diagnose a soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST), or to monitor the treatment of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST), comprising performing a method of the invention on the nucleic acids of a biological sample said patient.
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • the present invention also relates to an in vitro method for predicting the occurrence of metastases in a patient with tissue sarcoma soft tissue (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST) comprising the following steps: a) providing a previously collected tumor biological sample of said patient to be tested; b) determining in said tumor biological sample the level of expression of a pool of polynucleotides of the invention; c) comparing the level of expression obtained in step b) with the level of expression of the same polynucleotide pool measured in a biological control sample; a deregulation of the expression level of the oligonucleotide pool relative to its corresponding expression level measured in a biological control sample being predictive of the occurrence of metastasis.
  • STS tissue sarcoma soft tissue
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • deregulation of the level of expression is meant the over-expression or the under-expression of two or more polynucleotides of a polynucleotide pool according to the invention measured in a tumor biological sample of a patient suffering from a STS or test GIST, relative to the corresponding expression measured in a biological control sample as defined below.
  • a higher level of expression in the tumor biological sample of a patient with a STS or a GIST to be tested compared to that of a biological control sample is the indication of a patient susceptible to develop metastases, which is considered an indication of a poor prognosis.
  • a lower level of expression in the tumor biological sample of a patient with a STS or a GIST to be tested compared to that of a biological control sample is the indication of a non-patient. likely to develop metastases, that is to say assimilated to the indication of a good prognosis.
  • the term "biological control sample” is intended to mean (i) a tissue sample derived from a tumor of another patient suffering from STS or GIST than that to be tested, or (ii) a tissue sample of a healthy subject, namely an individual who has no pathology or pathological symptoms diagnosed by a physician.
  • the tumors can be classified with respect to each other, depending on the level of expression of the genes of the molecular signature of the invention in each case.
  • the present invention also relates to an in vitro method for assessing the prognosis of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST), comprising the steps of: a ) provide a pre-collected tumor biological sample from the patient with STS or gastrointestinal stromal tumor (GIST) to be tested; b) determining in said tumor biological sample the level of expression of a pool of polynucleotides of the invention; c) comparing the level of expression obtained in step b) with the level of expression of the same polynucleotide pool measured in a biological control sample, where a deregulation of the level of expression of the oligonucleotide pool with respect to its level Corresponding expression levels measured in a biological control sample can identify a subgroup of good prognosis or a subgroup of poor prognosis.
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • the present invention also relates to an in vitro method for screening candidate compounds for the treatment of soft tissue sarcoma (STS) or gastrointestinal stromal tumor (GIST) comprising the steps of: a) bringing into contact a tumor biological sample previously collected with a test compound; b) determining in said tumor biological sample the level of expression of a pool of polynucleotides of the invention; c) comparing said level of expression obtained in step b) with that of the same tumor biological sample not brought into contact with the test compound, where a decrease in the level of expression in the biological tumor sample in presence of the test compound relative to that of the tumor biological sample in the absence of the test compound is an indication of a candidate compound for the treatment of STS or GIST.
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • the present invention also relates to an in vitro method for monitoring the anti-metastasis efficacy of a treatment of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST ), comprising the steps of: a) providing a previously collected tumor biological sample of said treated patient to be tested; b) determining in said tumor biological sample the level of expression of a pool of polynucleotides of the invention; c) comparing said level of expression obtained in step b) with that of a biological control sample or a biological tumor sample of said patient before treatment, where a decrease in the level of expression of the biological tumor sample after treatment compared to that of the biological control sample or the tumor biological sample before treatment is an indication of an antimetastase efficacy of the therapeutic treatment.
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • the present invention relates, fourthly, to a kit ("kit”) comprising a pool of polynucleotides of the invention.
  • kit comprising a pool of polynucleotides of the invention.
  • this kit or kit can be used, for example, for the in vitro prediction of the occurrence of metastases and / or for the evaluation of the prognosis of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or a gastrointestinal stromal tumor (GIST) and / or for monitoring the anti-metastasis efficacy of a therapeutic treatment of a patient with soft tissue sarcoma (STS) or gastrointestinal stromal tumor -intestinal (GIST).
  • STS soft tissue sarcoma
  • GIST gastrointestinal stromal tumor -intestinal
  • this kit or kit may further comprise the means for detecting and / or quantifying the expression of a nucleotide pool of the invention.
  • These means may be for example one of those defined above or exemplified below.
  • the present invention relates, fifthly, to a nucleic acid chip, in particular to a DNA chip, comprising or consisting of a pool of polynucleotides of the invention.
  • This DNA chip may for example be as defined above, in particular as regards the support.
  • a nucleic acid chip of the invention may comprise "probes", for example cDNA fragments or oligonucleotides (for example 60 to 80 bases, or more), etc., attached to a solid support. . These "probes” specifically bind the "targets” by hybridization, for example the complementary genes present in the biological samples to be tested. This hybridization requires the association by non-covalent linkages of single-stranded nucleic acid sequences that are completely complementary or sufficiently complementary to hybridize with each other and form a double-stranded structure.
  • FIG. 1 represents 3 types of genomic profile (a) amplified
  • Figure 2 shows the Kaplan-Meier-free survival curves of different groups of sarcomas according to the CINSARC signature.
  • Figure 3 represents progression-free survival / Kaplan-Meier metastasis curves of three tumor groups according to the CINSARC signature.
  • Figure 4 shows progression-free survival / metastasis (% of cases without metastases versus years after treatment) of Kaplan-Meier in a group of sarcomas (tumor group in which the signature was defined) according to signature by means of the nucleotide pool consisting of the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 24.
  • Curve A shows a curve of survival of patients with good prognosis, presenting about 80% of cases without metastases at 5 years.
  • Curve B shows a survival curve of patients with poor prognosis, presenting about 50% of cases without metastases at 5 years.
  • Figure 5 represents progression-free survival / metastasis (% of cases without metastases versus years after treatment) curves of Kaplan-Meier from a group of sarcomas (tumor group independent of signature identification) according to the signature by means of the nucleotide pool consisting of the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO: 24.
  • Curve A shows a curve survival of patients with good prognosis, presenting about 90% of cases without metastases at 5 years.
  • Curve B shows a survival curve of patients with a poor prognosis, presenting about 50% of cases without metastases at 5 years.
  • the French Sarcoma Group (GSF) database as part of the Conticabase contains adult soft tissue sarcoma data processed in 11 centers with patient description, primary tumors , treatments, monitoring and tumor samples. This database contained approximately 3800 cases at the time of the study. All cases were reviewed by the subgroup of pathologists and classified according to the WHO 2002 classification using histology, immunohistochemistry and cytogenetics and molecular genetics when necessary. For this study, soft tissue sarcomas without recurrent chromosomal translocations were selected and for which a frozen tissue sample of the untreated primary tumor was available. Finally, the biological samples from 183 patients described in Table 2 below were studied.
  • Genomic DNA from frozen tumor tissues was isolated using a standard phenol-chloroform extraction protocol and analyzed on a spectrophotometer (Nanodrop).
  • a spectrophotometer NapnII (Ozyme, Saint-Quentin en Yvelines, France) and purification on a column (Qiagen PCR Purification Kit, Qiagen)
  • 1.5 ⁇ g of tumor DNA and 1.5 ⁇ g of normal DNA were labeled in using BioPrime DNA labeling System Kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) with Cy5-dCTP or Cy3-dCTP (Perkin Elmer), respectively.
  • the labeled normal and tumor DNAs were mixed and precipitated together with 100 ⁇ g of human Cot-1 DNA (Invitrogen), resuspended in 72 ⁇ l of hybridization buffer (50% formamide, 40 mM NaH 2 PO 4 , 0.1 % SDS, 10% dextran sulfate, 2X SSC). Prehybrid probes were plated and introduced into wet chambers (Corning) and hybridization was performed at 37 ° C for 48 h.
  • hybridization buffer 50% formamide, 40 mM NaH 2 PO 4 , 0.1 % SDS, 10% dextran sulfate, 2X SSC.
  • BAC Bacterial Artificial Chromosome
  • Washings after hybridization were performed as follows: washing at 65 ° C in 0.5X SSC, 0.03% SDS, followed by washing at 45 ° C in the same solution.
  • RNA Extraction and Expression Analysis Total RNA was extracted from frozen tumor sample with the TRIzol reagent (Life Technologies, Inc.). The RNA was then purified using the RNeasy® Min Elute TM Cleanup Kit (Qiagen) according to the manufacturer's instructions. The quality of PARN was verified on the Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies).
  • the genomic profiling of the 183 poorly differentiated sarcomas was performed by CGH analysis on a BAC chip containing 3803 clones. Three main recurring patterns were identified, based on both the number and type of alterations identified, among 174 genomic profiles that can be interpreted in fine (Figure 1).
  • a third group of 106 tumors (61%), referred to as "rearranged" profile, characterized by a high level of chromosomal complexity with more than 30 to 85 alterations.
  • the goal was to establish a set of sarcoma specific genes associated with the level of imbalances and able to predict the future of a patient.
  • the expression profiles of tumors classified into two groups were analyzed according to i) the number of CGH imbalances, less than 20 imbalances vs more than 35 imbalances, ii) the FNCLCC 3 histological grade vs the tumor grade 2 , and iii) Carter's signature.
  • CINSARC Complexity INdex SARComas
  • the performance of the CINSARC signature was also analyzed for patients with the same histologic grade (Figure 2).
  • Grade 3 tumors 100 cases
  • the CINSARC signature of the present invention made it possible to separate into two groups having a probability of occurrence of different metastases, tumors considered with the same metastatic potential according to the FNCLLC grade system ( This result is perhaps the most important, as it
  • a gene expression profile attributes a better clinical prognosis than that obtained with the FNCLLC grade system.
  • the CINSARC signature allowed the identification of a subgroup of tumors with poor prognosis, whereas the FNCLLC grade system failed to separate these tumors from distinct prognoses ( data not shown).
  • Example 3 Prediction of the occurrence of metastases in other cancers using CINSARC
  • the predictive value of CINSARC in other sarcomas was tested and a series of 32 GISTs were analyzed (YAMAGUCHI et al., J; Clin Oncol., 26 (25): 4100-4108, 2008).
  • the CINSARC signature allowed hierarchical unsupervised cluster analysis leading to two GIST groups with a different prognosis (p ⁇ 10-3).
  • this classification is location-independent even though the GISTs of the small intestine and those of the stomach form two separate groups in each different prognostic group.
  • the CINSARC signature is composed exclusively of genes involved in chromosome integrity and the expression is associated with chromosomal imbalances, the CINSARC signature could also have a prognostic value for highly rearranged tumors, such as breast carcinomas. Consequently, two series of breast cancer (78 and 295 cases) from the Netherlands Cancer Institute (VAN'T VEER et al., 2002, cited above, VAN de VIJVER et al., 2002, cited above) have been compiled by signing CINSARC, and again two groups of patients with different clinical outcome very significant (p ⁇ 10 "3) were obtained (Figure 3).
  • the CINSARC signature is a powerful independent predictor tool for better assessment of the occurrence of metastases as well as the attribution to patients of a better clinical prognosis compared to the FNCLCC grade system.
  • This new molecular-grade system should improve the clinical monitoring of patients.
  • this biological significance of the CINSARC signature genes defines them as potential targets for new therapeutic approaches targeting the early stage of metastatic potential acquisition.
  • CINSARC signature is associated with the occurrence of metastases through such heterogeneous tumor groups (from sarcomas to carcinomas) is sufficiently encouraging to consider, instead of the current histological grade system, the use of this profile. expression to identify patients at high risk for metastases and target complementary chemo-therapeutic strategies.
  • Example 4 Prediction of the occurrence of metastases in sarcomas using a pool of CINSARC polynucleotides The correlation of the expression signature of the polynucleotides of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 58 and SEQ ID NO:
  • a gene expression profile attributes a better clinical prognosis than that obtained with the FNCLLC grade system.
  • the CINSARC signature allowed the identification of a subgroup of tumors with poor prognosis, whereas the FNCLLC grade system failed to separate these tumors from distinct prognoses ( data not shown).

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Abstract

La présente invention est relative à une signature moléculaire pronostique des sarcomes, et notamment des sarcomes à génétique complexe, et son utilisation pour prédire la survie globale d'un patient, en particulier de prédire la survenue de métastases, mais également pour distinguer des sous-groupes de pronostic distinct au sein d'un groupe de tumeurs de même grade histologique. Cette signature moléculaire peut également être utilisée pour tester l'efficacité d'un traitement, ou pour obtenir de nouveaux agents thérapeutiques.

Description

SIGNATURE MOLÉCULAIRE PRONOSTIQUE DES SARCOMES ET
UTILISATIONS
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention est relative à une signature moléculaire pronostique des sarcomes, en particulier des sarcomes à génétique complexe, et à son utilisation pour prédire la survie sans métastases et la survie globale de patients atteints d'un sarcome.
Elle trouve de nombreuses applications, en particulier dans le domaine du pronostic ou du diagnostic des sarcomes ou pour surveiller le traitement de patients atteints d'un sarcome.
ART ANTÉRIEUR
Les sarcomes des tissus mous (STS) de l'adulte sont rares et hétérogènes en termes de localisation, d'histologie, d'anomalies moléculaires et de pronostic. Les STS peu différenciés sont les tumeurs malignes les plus fréquentes chez les adultes, représentant environ 50% des diagnostics pathologiques, et comprennent principalement les sarcomes avec un caryotype complexe, à savoir les leiomyosarcomes (LMS), les sarcomes indifférenciés (US) ou histiocytofibromes malins (MFH), et les liposarcomes dédifférenciées (DD-LPS) (FLETCHER et al., World Hearth Organisation (WHO) classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of soft tissue and bone. Lyon, IARC Press, 2002). Au niveau génétique, les STS peu différenciés peuvent être divisés en deux groupes principaux, un groupe avec un profil génomique complexe (80%) regroupant essentiellement les US, les LMS, les rhabdomyosarcomes pléomorphes et liposarcomes pléomorphes, associés avec des profils très complexes, mais récurrents, de déséquilibres génomiques (IDBAIH et al., Lab. Invest, 85(2) : 176-181, 2005 ; CHIBON et al., Cancer Genêt. Cytogenet., 141(1) : 75-78, 2003 ; DERRE et al., Lab. Invest., 81(2) : 211-215, 2001), et un second groupe avec un profil génétique simple (20%) basé sur un niveau élevé d'amplifications limitées et composé exclusivement des DD-LPS (CHIBON et al., Cancer Genêt. Cytogenet., 139(1) : 24-29, 2002 ; COINDRE et al., Mod. Pathol, 16(3) : 256-262, 2003). Les STS sont des tumeurs agressives capables de rechute locale et métastatique. Les patients avec de telles tumeurs ont habituellement un mauvais pronostic, 40 à 50% développent éventuellement des métastases distantes, principalement dans les poumons, généralement dans les 5 ans suivant le diagnostic (WEITZ et al., J. Clin. One, 21(14) : 2719-2725, 2003 ; ZAGARS et al., Cancer, 97(10) : 2530-2543, 2003).
Le traitement clinique des STS consiste principalement en la résection chirurgicale, avec des thérapies d'appoint dont la durée et la nature dépendent des marges chirurgicales, de l'histotype tumoral et du grade histologique. Cependant, le bénéfice des thérapies d'appoint comme la chimiothérapie est actuellement contesté bien que des études récentes tendent à démontrer un effet sur les rechutes locales et distantes (SMAC, Lancet, 350(9092) : 1647-1654, 1997 ; FRUSTACI et al., J. Clin. Oncol., 19(5) : 1238-1247, 2001 ; PERVAIZ et al., Cancer, 113(3) : 573-581, 2008). Néanmoins l'efficacité de la chimiothérapie est marginale (de 3 à 10% selon le critère d'évaluation, PERVAIZ et al., 2008, précité) ; ce qui pourrait résulter de la sélection des patients pour lesquels la malignité tumorale est évaluée par le grade histologique. Par ailleurs la prise en charge des patients dépend essentiellement du stade de la maladie. Bien qu'il fournisse une information valable quant à l'évolution clinique de certains types de sarcomes, le typage histologique a une valeur prédictive limitée pour d'autres types de sarcomes, notamment les sarcomes non classés, peu différenciés et à non-translocation. Pour augmenter la valeur prédictive de l'histologie en termes de pronostic, plusieurs systèmes de grade ont été générés (BRODERS et al., Surg. GynecoL, Obstet., 69 : 267-280, 1939 ; RUSSELL et al., Cancer, 40(4) : 1562-1570, 1977 ; MARKHEDE et al., Cancer, 49(8) : 1721-1733, 1982 ; TROJANI et al., Int. J. Cancer, 33(1) : 37-42, 1984 ; COSTA et al., Cancer, 53(3) : 530- 541, 1984). Parmi ceux-ci, les systèmes de l'Institut National du Cancer (NCI) (COSTA et al., 1984, précité) et de la Fédération Nationale de Centre de Lutte Contre le Cancer (FNCLCC) (TROJANI et al., 1984, précité) ont été largement utilisés même si le second système permet d'augmenter légèrement la capacité de prédiction des métastases distantes et a été considéré de ce fait comme « Pétalon-or » (GUILLOU et al., J. Clin. One, 15(1) : 350-362, 1997).
Jusqu'à présent, le grade histologique est le meilleur critère prédictif de la survie sans métastase et de la survie globale. Le grade de la FNCLCC, le plus efficace, a été établi depuis plus de 20 ans et est toujours le système le plus communément utilisé. Il est basé sur l'évaluation semi-quantitative de la différenciation tumorale, la nécrose, et l'indice mitotique. Toutefois ce système présente plusieurs limitations : sa reproductibilité d'un pathologiste à l'autre n'est pas parfaite, il ne s'applique pas à tous les types de sarcomes (COINDRE et al., Cancer, 91(10) : 1914-1926, 2001) et n'est pas informatif pour les cas classés grade 2 (qui représentent environ 40% des cas). Cependant malgré ces limitations, depuis plus de 20 ans, aucune étude n'a apporté de critères pronostiques susceptibles de remplacer ce système de grade histologique.
Ces dix dernières années ont vu l'émergence de signatures moléculaires pronostiques dans un nombre grandissant de pathologies. À ce jour, le meilleur exemple de signature moléculaire est certainement celui du cancer du sein dans lequel une signature d'expression prédictive de la rechute métastatique a été établi en 2002 puis validée la même année par la même équipe sur un groupe indépendant de 295 tumeurs (VAN'T VEER et al., Nature, 415(6871) : 530-536, 2002; VAN de VIJVER et al., N. Engl. J. Med., 347(25) : 1999-2009, 2002). Jusqu'à présent dans le domaine des sarcomes, les profils d'expression ont surtout été établis dans le but d'identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques ou de mieux comprendre l'oncogenèse de ces tumeurs en relation avec la différentiation tumorale (NIELSEN et al., Lancet, 359(9314) : 1301-1307, 2002 ; BAIRD et al., Cancer Res., 65(20) : 9226-9235, 2005 ; FRITZ et al., Cancer Res., 62(11) : 2993-2998, 2002 ; MATUSHANSKY et al., Am. J. Pathol., 172(4) : 1069-1080, 2008 ; SEGAL et al., Am. J. Pathol., 163(2) : 691-700, 2003 ; LEE et al., J. Cancer, 88(4) : 510-515, 2003 ; NAKAYAMA et al., Mod. Pathol., 20(7) : 749-759, 2007 ; SINGER et al., Cancer Res., 67(14) : 6626-6636, 2007). Seulement deux études, portant sur 30 leiomyosarcomes (LEE et al., Cancer Res., 64(20) : 7201-7204, 2004) et sur 89 sarcomes pléomorphes (FRANCIS et al., BMC Genomics, 8 : 73, 2007) proposent une signature moléculaire pronostique. Mais ces deux signatures sont composées de nombreux gènes (respectivement 335 et 244, respectivement) sans lien biologique clair entre eux. Par ailleurs ces deux signatures ont été établies sur un nombre relativement restreint de sous-types de sarcomes spécifiques donnant des significations relativement faibles. Enfin, à ce jour, ces deux signatures n'ont pas été comparées au système de grade FNCLCC et n'ont pas encore été validées sur un groupe indépendant, limitant de ce fait leur utilité clinique.
Dans le domaine des sarcomes, il est à noter que le nombre d'études cherchant à corréler les altérations moléculaires au pronostic est nécessairement limité du fait de la difficulté d'obtenir un groupe d'étude homogène de tumeurs complètement annotées. Aussi à ce jour, aucune corrélation claire et avérée n'a pu être établie entre le profil génétique et la survie sans métastases.
De ce fait, la progression tumorale reste difficile à prédire à l'intérieur d'un groupe de sarcomes, et les traitements ne sont pas aussi adaptés qu'ils pourraient l'être. Par conséquent, il existe un besoin certain pour améliorer le pronostic et le diagnostic des sarcomes et par conséquent assurer un meilleur suivi clinique des patients.
C'est donc un but de la présente invention de fournir un système de grade plus efficace, fiable et reproductible permettant de pallier les inconvénients de l'art antérieur. C'est également un autre but de la présente invention de fournir les moyens et kits permettant de mettre en œuvre un tel système de grade.
EXPOSE DE L'INVENTION
Selon l'hypothèse que le système de grade de la FNCLCC pourrait représenter un résumé phénotypique d'altérations génomiques, les inventeurs de la présente invention ont découvert de manière toute à fait inattendue que l'établissement d'un profil moléculaire à l'aide de technologies émergentes, telles que les puces à ADN, pourrait permettre l'identification d'altérations/de gènes à l'origine de l'agressivité tumorale, avec de ce fait, une possibilité de définir un système de grade plus efficace basé sur les altérations moléculaires ; ce qui conduit à une avancée majeure dans le domaine de l'analyse des sarcomes.
Alors que le nombre d'études cherchant à corréler les altérations moléculaires au pronostic est limitée du fait de la difficulté d'obtenir un groupe d'étude homogène de tumeurs complètement annotées, les inventeurs ont initié un projet original visant à déterminer les profils génomiques et d'expression à partir de 183 tumeurs primaires à génétique complexe, non traitées et complètement annotées, référencées dans la base de données du GSF (Groupe Sarcome Français), partie intégrante de la base Européenne Conticabase (www.conticabase.org). L'analyse par groupement a été utilisée pour identifier les altérations moléculaires associées au résultat clinique du patient.
Cette démarche illustrée dans la partie expérimentale ci-après, a permis d'identifier un ensemble particulier de gènes, appelé « pool » ou « signature moléculaire », associés à la complexité du génome, l'agressivité tumorale, et dont le profil d'expression a permis d'établir un pronostic fiable de patients atteints d'un sarcome, en particulier de prédire la survenue de métastases, mais également de distinguer au sein d'un groupe de patients atteints d'un sarcome de même grade histologique, des sous-groupes présentant des pronostics significativement différents.
La présente invention se rapporte donc, en premier lieu, à un pool de polynucléotides comprenant au moins deux polynucléotides choisis parmi les séquences de polynucléotides SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67. En d'autres termes, le pool de polynucléotides de l'invention peut comprendre 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, ou 67 polynucléotides choisis parmi les séquences de polynucléotides SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67.
L'analyse des 67 gènes identifiés (SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67) par la base de données Gène Ontology (GO) a montré en outre que tous étaient impliqués dans le même processus biologique, c'est-à-dire le contrôle de l'intégrité du chromosome.
Les inventeurs ont en outre démontré que ces gènes peuvent être répartis en 5 groupes principaux selon leur rôle dans la mitose : point de contrôle de la mitose et du cycle cellulaire (12 gènes, SEQ ID NOs : 1-12) ; biogenèse des chromosomes, condensation, alignement et ségrégation (26 gènes, SEQ ID NOs : 13-38) ; fuseau mitotique et centrosome (12 gènes, SEQ ID NOs : 39-50) ; moteur des microtubules, complexe kinésine (8 gènes, SEQ ID NOs : 51-58), et cytokinèse (4 gènes, SEQ ID NOs : 59-62) ; parmi les 5 derniers gènes regroupés en fonction des résultats expérimentaux (SEQ ID NOs : 63-67), 3 sont connus comme étant impliqués dans l'instabilité chromosomique (SEQ ID NOs : 63-65) et 2 sont associés au grade histologique selon l'étude (SEQ ID NOs : 66 et 67). Le tableau 1 ci-dessous indique le nom de chacun des gènes, leur répartition en cinq groupes principaux, et leurs séquences respectives (références GenBank et SEQ ID NO :).
Tableau 1
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
Avantageusement, le pool de polynucléotides peut comprendre les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 24.
Avantageusement, le pool de polynucléotides peut comprendre les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID
NO : 58, SEQ ID NO : 24 et au moins un gène dont la séquence est choisie parmi les 62 autres séquences de gènes identifiés dans le cadre de l'invention. En d'autres termes, le pool de polynucléotides peut comprendre les polynucléotides de séquences SEQ ID NO :
10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 24 et au moins un polynucléotide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID
NO : 2, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 23, SEQ ID
NO : 25 à SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 48 à SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 59 à SEQ
ID NO : 67.
Alternativement, le pool de polynucléotides peut être constitué des polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID
NO : 58 et SEQ ID NO : 24. En d'autres termes, le pool de polynucléotides peut comprendre uniquement les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO :
3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24.
Alternativement, le pool de polynucléotides de l'invention peut être constitué des polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID
NO : 47, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 24 et d'au moins un gène dont la séquence est choisie parmi les 62 autres séquences de gènes identifiés dans le cadre de l'invention. En d'autres termes, le pool de polynucléotides peut être constitué uniquement des polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24 et d'au moins un polynucléotide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 25 à SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 48 à SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 59 à SEQ ID NO : 67.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le pool de polynucléotides de l'invention peut comprendre au moins un polynucléotide choisi dans chacun des sets de polynucléotides suivants :
Set 1 : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 12 ; Set 2 : SEQ ID NO : 13 à SEQ ID NO : 38 ;
Set 3 : SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 50 ;
Set 4 : SEQ ID NO : 51 à SEQ ID NO : 58, et SEQ ID NO : 59 à SEQ ID NO : 62 ;
Set 5 : SEQ ID NO : 63 à SEQ ID NO : 65, et SEQ ID NO : 66 à SEQ ID NO : 67.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le pool de polynucléotides de la présente invention peut être choisi parmi les Sets 1 à 5. En d'autres termes, le pool d'au moins deux polynucléotides peut être constitué en totalité ou en partie du Set 1, du Set 2, du Set 3, du Set 4 ou du Set 5. En d'autres termes, le pool de la présente invention peut être constitué en totalité ou en partie du Set 1 , ou en totalité ou en partie du set 2, ou en totalité ou en partie du set 3, ou en totalité ou en partie du set 4, ou en totalité ou en partie du set 5.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le pool de polynucléotides peut comprendre les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24 et au moins un polynucléotide choisi dans le set 5. Ce pool de polynucléotides peut comprendre en outre au moins un des autres gènes identifiés dans le cadre de l'invention.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le pool de polynucléotides peut être constitué des polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24 et d'au moins un polynucléotide choisi dans le set 5.
Selon un autre mode de réalisation de la présente invention, le pool de polynucléotides de l'invention comprend les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67. Il peut s'agir par exemple d'un pool constitué des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67. Quel que soit le mode de réalisation de l'invention, avantageusement, le pool de polynucléotides peut comprendre avantageusement au plus 10 polynucléotides. Il peut s'agir par exemple d'un pool comprenant au plus 10 polynucléotides, comprenant les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24 et au moins un polynucléotide de séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4 à SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 25 à SEQ ID NO : 46, SEQ ID NO : 48 à SEQ ID NO : 57, SEQ ID NO : 59 à SEQ ID NO : 67.
Quel que soit le mode de réalisation de la présente invention, avantageusement le pool de polynucléotides de l'invention est immobilisé sur un support, par exemple un support solide ou un support liquide. Dans le cas où le support est un support liquide, il peut comprendre des billes sur lesquelles sont fixés les acides nucléiques. Le milieu liquide peut être un surnageant de culture cellulaire, du sérum, du plasma, cette liste n'étant pas limitative. Il peut s'agir par exemple du support mis en œuvre dans la technologie Luminex®. Dans le cas où le support est un support solide, il est de préférence choisi dans le groupe comprenant une membrane de nylon, une membrane de nitrocellulose, une lame de verre, des billes de verre, une membrane sur un support de verre ou une puce de silicium, un support plastique. De manière particulièrement préférée, le support solide peut être une puce à acides nucléiques, par exemple une puce ADN, (aussi appelée puce à gènes, biopuce, puce d'expression). De telles puces permettent de mesurer de manière quantitative une variation d'expression (expression différentielle) de deux ou plusieurs polynucléotides du pool de polynucléotides de l'invention entre (i) 2 conditions expérimentales : généralement une condition de référence et une condition pathologique ou (ii) plusieurs tumeurs afin de déterminer une moyenne d'expression, en fonction de laquelle les tumeurs peuvent être classées les unes par rapport aux autres. À titre d'exemple non limitatif, il peut s'agir d'une puce ADN Affimétrix®, ou d'une puce ADN de la société Agilent Technologies.
Les gènes identifiés par les présents inventeurs, qui sont tous impliqués dans le même processus biologique, peuvent en outre être des cibles potentielles de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'étape précoce d'acquisition du potentiel métastatique. En outre, un pronostic vital des patients sur base du profil d'expression de ces gènes peut être réalisé très tôt, voire lors du diagnostic initial.
Ainsi selon un mode particulier de mise en œuvre de la présente invention, le pool de polynucléotides de l'invention peut être utilisé pour détecter, pronostiquer, diagnostiquer un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ou pour surveiller le traitement d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST). Selon un autre mode particulier de mise en œuvre de la présente invention, le pool de polynucléotides de l'invention peut être utilisé pour l'obtention d'un composé destiné au traitement d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST). Afin d'identifier, généralement à partir des données de puces à ADN d'expression, le profil d'expression associé à un groupe de pronostic, deux approches principales peuvent être utilisées, l'approche descendante ou « top-down » supervisée destinée à sélectionner les gènes directement corrélés à un mauvais pronostic (VAN'T VEER et al., 2002, précité ; SOTIRIOU et al., J. Natl. Cancer Inst, 98(4) : 262-272, 2006) et l'approche « bottom-up » supervisée par laquelle les profils d'expression associés à un phénotype biologique particulier sont tout d'abord identifiés puis ultérieurement corrélés à un résultat clinique (SOTIRIOU et al., N. Engl. J. Med., 360(8) : 790-800, 2009). Dans le cadre de la présente invention, la seconde approche « bottom-up » (lit. de bas en haut) a été appliquée au sens où les profils d'expression tumoraux ont été comparés en fonction des phénotypes biologiques (instabilité chromosomique, complexité génomique et grades histologiques) mais au lieu d'une sélection directe des gènes, les voies biologiques particulièrement pertinentes pour les phénotypes testés ont tout d'abord été identifiées puis les gènes significativement impliqués dans ces voies ont été identifiés. Cette sélection de voie biologique (et non de gènes) est l'étape importante ayant conduit aux résultats heureux de la présente invention dans un groupe hétérogène tel que celui des sarcomes à non-translocation, et par ailleurs dans différents types de tumeurs telles que les GISTs (tumeurs stromales gastro-intestinales) et les cancers du sein.
La présente invention se rapporte donc également à un procédé in vitro de sélection d'un pool de polynucléotides, par exemple ceux de l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) fournir des échantillons biologiques tumoraux provenant de patients atteints d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) ; b) détecter et/ou quantifier chacun des polynucléotides, séparément dans chacun des échantillons biologiques tumoraux ; c) comparer le profil d'expression des pools de polynucléotides obtenus à l'étape c) par rapport à un phénotype biologique, de préférence d'instabilité chromosomique, de complexité génomique ou de grade histologique, pour chacun des échantillons biologiques tumoraux ; d) sélectionner la voie biologique statistiquement significative (p<10"5) pour le phénotype testé ; e) sélectionner les polynucléotides significativement impliqués dans cette voie biologique, et dont l'expression est indicative de la probabilité de survenue de métastases.
On entend par « profil d'expression », la totalité des résultats obtenus quand l'expression d'un ensemble de polynucléotides est déterminée. Un tel profil facilite l'utilisation de techniques analytiques statistiques quantitatives et permet une comparaison visuelle rapide des résultats. De préférence, un tel profil est obtenu à sur un support solide, tel qu'une puce à ADN.
Par « phénotype biologique », au sens de la présente invention, on entend la manifestation d'un statut génétique, soit l'ensemble des caractéristiques observables caractérisant un échantillon issu d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST, qui reflètent l'expression de l'information portée par les chromosomes (le génotype).
Par « instabilité chromosomique », au sens de la présente invention, on entend des réarrangements clonaux ou non clonaux. Cette instabilité conduit à des pertes et des gains de bras chromosomiques et à des réarrangements chromosomiques non équilibrés. L'instabilité des chromosomes à l'intérieur du noyau des cellules d'un individu rend celles-ci plus vulnérables en terme de néoplasie (survenue de cancer). Ce sont dans les cellules tumorales que l'on retrouve cette instabilité.
Par « complexité génomique », au sens de la présente invention, on entend la détermination du nombre de déséquilibres et de la nature des fragments chromosomiques impliqués.
Par « grade histologique »», au sens de la présente invention, on entend un indicateur consensuel de la prolifération tumorale, du risque de métastases et de la réponse à une thérapie adjuvante (chimiothérapie). Le grade histologique ou tumoral est un facteur décisionnel pour le traitement d'une tumeur. Il est déterminé par l'analyse histologique de la tumeur et le système de grading utilisé est par exemple celui de la FNCLCC. Ce système adopté par la Fédération Nationale des Centres de Lutte Contre le Cancer (FNCLCC) re ose sur les 3 caractéristi ues suivantes :
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Le grade histologique des tumeurs des tissus mous de la FNCLCC est la somme des 3 scores "Différenciation", "Index mitotique" et "Nécrose tumorale" : Grade 1 (score total de 2 ou 3), Grade 2 (score total de 4 ou 5), et Grade 3 (score total de 6 à 8).
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro d'analyse d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ledit procédé comprenant la détermination du niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'invention dans un échantillon biologique tumoral.
Par « échantillon biologique tumoral », au sens de la présente invention, on entend un échantillon tissulaire issu au choix (i) d'une tumeur primaire (ii) du centre d'une tumeur (iii) d'un site dans la tumeur autre que le centre et (iv) de toute tumeur localisée à l'extérieur du tissu tumoral per se d'un patient atteint d'un STS. Ledit échantillon biologique tumoral peut provenir par exemple d'un acte chirurgical ou d'une résection tumorale réalisée sur le STS du patient, d'une biopsie où une partie du tissu tumoral est collecté du STS du patient pour une analyse ultérieure ; d'un échantillon sanguin, par exemple de sang entier, plasma ou sérum, contenant des cellules tumorales issues de la tumeur primaire ou des protéines tumorales produites par les cellules tumorales issues de la tumeur primaire.
Le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de la présente invention peut être déterminée par n'importe quelle méthode connue de l'art. Par exemple, le niveau d'expression d'au moins deux polynucléotides impliqués dans la signature moléculaire de l'invention dans les échantillons obtenus de patients atteints d'un STS peut être déterminé en mesurant le niveau d'ARNm correspondant au polynucléotide et/ou la protéine codée par le polynucléotide. L' ARN peut être isolé des échantillons par des méthodes bien connues de l'homme du métier, par exemple par celle décrite dans AUSUBEL et al. (Curr. Protocols Mol. Biol., 1 : 4.1.1-4.2.9 et 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1996). Les méthodes pour la détection du niveau d'expression de l'ARNm utilisables pour mettre en œuvre la présente invention sont bien connues de l'art et comprennent, sans s'y limiter, les puces d'expression, le northern blotting, la PCR quantitative en temps réel, la RT-PCR, la RT-PCT avec sondes Taqman ou les cartes micro fluides, et de manière générale, des techniques d'hybridation (à savoir d'association par des liaisons non covalentes de deux polynucléotides simple brin, totalement complémentaires ou suffisamment complémentaires pour s'hybrider entre elles, et former une structure double-brin).
Avantageusement, lorsque le pool de polynucléotides comprend au plus 10 polynucléotides, le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de la présente invention peut être déterminée par PCR quantitative en routine. Il peut en outre être possible d'utiliser des ARN issus de blocs de paraffine contenant des prélèvements de tissus ou d'organes, ou d'échantillons biologiques.
Selon l'invention, une méthode particulièrement efficace pour détecter le niveau des transcrits d'ARNm exprimés à partir d'une pluralité des polynucléotides décrits implique l'hybridation d'ARNm marqué à une puce d'oligonucléotides (aussi appelée puce à ADN, puce à gènes, puces d'expression). Une telle méthode permet de déterminer simultanément le niveau de transcription d'une pluralité de polynucléotides pour générer des profils d'expression des polynucléotides. Les oligonucléotides utilisés dans cette méthode d'hybridation sont généralement fixés sur un support, par exemple un support solide ou un support liquide. Dans le cas où le support est un support liquide, il peut comprendre des billes sur lesquelles sont fixés les acides nucléiques. Le milieu liquide peut être un surnageant de culture cellulaire, du sérum, du plasma, cette liste n'étant pas limitative. Il peut s'agir par exemple du support mis en œuvre dans la technologie Luminex®. Des exemples de supports solides comprennent, sans s'y limiter, des membranes, des filtres, des lames, du papier, du nylon, des fibres, des billes magnétiques ou non, des gels, des polymères et tout support solide connu de l'homme du métier. N'importe quel support solide sur lequel des oligonucléotides peuvent être immobilisés, soit directement soit indirectement, soit de manière covalente soit de manière non-covalente, peut être utilisé. Un support solide particulièrement avantageux consiste en une puce à acides nucléiques, en particulier une puce à ADN. Ces puces contiennent une sonde oligonucléotidique particulière en une localisation prédéfinie de la puce. Chaque localisation prédéfinie peut contenir plus d'une molécule de la sonde particulière. Du fait que les oligonucléotides se situent à des endroits spécifiques du support, les profils d'hybridation et les intensités (qui forment ensemble un profil d'expression unique) peuvent être interprétés en termes de niveau d'expression de polynucléotides particuliers.
Les sondes oligonucléotidiques sont de préférence de longueur suffisante pour s'hybrider spécifiquement, seulement aux transcrits complémentaires des polynucléotides de l'invention. Par « oligonucléotides », au sens de la présente invention, on entend un acide nucléique simple brin. Généralement les sondes oligonucléotidiques sont constituées de 16-20 nucléotides, et dans certains cas jusqu'à 25 nucléotides, voire jusqu'à 500 nucléotides ou plus. Une fois que les sondes sont mises en contact avec l'ARNm ou une copie de l'ADNc, la présence de l'ARNm ou de l'ADNc hybride est détectée par des méthodes connues de l'art. Par exemple, les sondes oligonucléotidiques sont marquées par un ou plusieurs marqueurs pour permettre la détection des complexes sonde hybridée/polynucléotide cible. Les marqueurs peuvent comprendre des compositions pouvant être détectées par des moyens spectroscopiques, biochimiques, photochimiques, bioélectroniques, immunochimiques, électriques, optiques ou chimiques. Des exemples de marqueurs comprennent, sans s'y limiter, des radioisotopes, des composés chimioluminescents, des protéines de liaison marquées, des atomes de métaux lourds, des marqueurs spectroscopiques, tels que les marqueurs fluorescents et colorants, les enzymes liées, des étiquettes de spectrométrie de masse et des marquages magnétiques. Par exemple, il s'agit de marquage Cy3/Cy5 ou Alexa pour les biopuces, de marquage FAM (6- carboxyfluorescéine) ou TAMRA (6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine) pour des sondes Taqman. Les puces de sonde oligonucléotidique pour la surveillance de l'expression peuvent être préparées et utilisées selon des méthodes bien connues de l'art, comme décrit par exemple dans LOCKHART et al. (Nature Biotechnol., 14 : 1675-1680, 1996 ; McGALL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93 : 13555-13460, 1996 ; US 6,040,138. De telles biopuces sont disponibles dans le commerce auprès, par exemple, d'Affimétrix (Santa Clara, Californie).
Il est également possible de détecter l'expression d'une protéine codée par deux ou plusieurs des polynucléotides impliqués dans la signature moléculaire de l'invention. Ceci peut être réalisé par des méthodes bien connues de l'art, tel que, par exemple, l'utilisation d'une sonde qui est marquée de manière détectable, ou qui peut être marquée ultérieurement. Généralement, la sonde est un anticorps qui reconnaît la protéine exprimée. Le niveau d'expression de la protéine dans l'échantillon est alors déterminé par une méthode d'immunodosage utilisant les anticorps, par exemple dot blotting, western blotting, ELISA, immunohistochimie, FACS, etc
Selon un mode particulier de mise en œuvre, le procédé de l'invention permet d'établir le pronostic d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST, en particulier permet de déterminer le risque de/prédire la - survenue de métastases.
Par « prédire la survenue de métastases », au sens de la présente invention, on entend déterminer une valeur relative permettant de quantifier la probabilité de survenue de métastases d'un ou plusieurs tissus ou organes, chez un patient atteint d'un STS ou d'un GIST. De préférence, la prédiction de la survenue de métastases est exprimée par une valeur statistique, incluant une valeur p, calculée à partir des valeurs d'expression obtenues pour chacun des polynucléotides testés. Selon un autre mode particulier de mise en œuvre, le procédé de l'invention permet d'établir le pronostic d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST, en particulier de distinguer des sous-groupes de bon ou mauvais pronostic parmi un groupe de sarcomes des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) initialement considérés comme appartenant au même grade histologique.
Par « bon pronostic », au sens de la présente invention, on entend l'indication de patients non susceptibles de présenter une rechute, c'est-à-dire la survenue de métastases, pendant leur traitement ou dans les 5 à 6 ans suivant leur traitement, soit une survie sans métastases à long terme significativement différente. Ainsi dans le cadre de la présente invention; on peut considérer que des patients atteints d'un STS ou d'un GIST appartiennent à un sous-groupe de « bon pronostic » lorsque qu'ils sous-expriment les gènes de la signature moléculaire de l'invention et sont sujet à développer des métastases dans moins de 20% des cas tout type de sarcomes, et en particulier dans aucun des cas de GIST. A contrario on entend par « mauvais pronostic », l'indication de patients susceptibles de présenter une rechute (survenue de métastases) pendant leur traitement ou dans les 5 à 6 ans suivant leur traitement. Ainsi dans le cadre de la présente invention, on peut considérer que des patients atteints d'un STS ou d'un GIST appartiennent à un sous- groupe de mauvais pronostic lorsqu'ils sur-expriment les gènes de la signature moléculaire et sont sujet à développer des métastases dans au moins 50% des cas. Avantageusement, la détermination du niveau d'expression du pool de polynucléotides dans le procédé de l'invention est réalisée sur une puce à acides nucléiques, aussi appelée biopuce, puces à ADN, puce à gènes, puce d'expression. De telles puces permettent de mesurer de manière quantitative et de visualiser rapidement une variation du niveau d'expression, ou expression différentielle, de deux ou plusieurs polynucléotides entre (i) 2 conditions expérimentales, par exemple une condition expérimentale de référence et une pathologique, à partir d'un échantillon biologique d'un patient ou (ii) plusieurs tumeurs afin de déterminer une moyenne d'expression, en fonction de laquelle les tumeurs peuvent être classées les unes par rapport aux autres. À titre d'exemple non limitatif, on peut utiliser des puces ADN Affimétrix™, ou des puces ADN de la société Agilent Technologies.
Selon un mode particulier de mise en œuvre, le procédé de l'invention peut être utilisé pour détecter, pronostiquer, diagnostiquer un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ou pour surveiller le traitement d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro- intestinale (GIST), comprenant la mise en œuvre d'un procédé de l'invention sur les acides nucléiques d'un échantillon biologique dudit patient.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro de prédiction de la survenue de métastases chez un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté dudit patient à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de l'invention ; c) comparer le niveau d'expression obtenu à l'étape b) au niveau d'expression du même pool de polynucléotides mesuré dans un échantillon biologique contrôle ; une dérégulation du niveau d'expression du pool d'oligonucléotides par rapport à son niveau d'expression correspondant mesuré dans un échantillon biologique contrôle étant prédictive de la survenue de métastase.
On entend par « dérégulation du niveau d'expression », la sur-expression ou la sous-expression de deux ou plusieurs polynucléotides d'un pool de polynucléotides selon l'invention mesurée dans un échantillon biologique tumoral d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST à tester, par rapport à l'expression correspondante mesurée dans un échantillon biologique contrôle tel que défini ci-après. En particulier, un niveau d'expression supérieur dans l'échantillon biologique tumoral d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST à tester par rapport à celui d'un échantillon biologique contrôle est l'indication d'un patient susceptible de développer des métastases, ce qui est assimilé à l'indication d'un mauvais pronostic. A contrario, un niveau d'expression inférieur dans l'échantillon biologique tumoral d'un patient atteint d'un STS ou d'un GIST à tester par rapport à celui d'un échantillon biologique contrôle est l'indication d'un patient non susceptible de développer des métastases, c'est-à-dire assimilé à l'indication d'un bon pronostic. Par « échantillon biologique contrôle », au sens de la présente invention, on entend (i) un échantillon tissulaire issu d'une tumeur d'un autre patient atteint d'un STS ou d'un GIST que celui à tester ou (ii) un échantillon tissulaire d'un sujet sain à savoir un individu ne présentant aucune pathologie ou symptômes pathologiques diagnostiqués par un médecin. Ainsi les tumeurs peuvent être classées les unes par rapport aux autres, en fonction du niveau d'expression des gènes de la signature moléculaire de l'invention dans chaque cas.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro d'évaluation du pronostic d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté du patient atteint d'un STS ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de l'invention ; c) comparer le niveau d'expression obtenu à l'étape b) au niveau d'expression du même pool de polynucléotides mesuré dans un échantillon biologique contrôle, où une dérégulation du niveau d'expression du pool d'oligonucléotides par rapport à son niveau d'expression correspondant mesuré dans un échantillon biologique contrôle permet d'identifier un sous-groupe de bon pronostic ou un sous-groupe de mauvais pronostic.
La présente invention rapporte également à un procédé in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon biologique tumoral préalablement collecté avec un composé test ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de l'invention ; c) comparer ledit niveau d'expression obtenue dans l'étape b) avec celui du même échantillon biologique tumoral n'ayant pas été mis en contact avec le composé test, où une diminution du niveau d'expression dans l'échantillon biologique tumoral en présence du composé test par rapport à celui de l'échantillon biologique tumoral en absence du composé test est l'indication d'un composé candidat pour le traitement d'un STS ou d'un GIST.
La présente invention se rapporte également à un procédé in vitro de surveillance de l'efficacité anti-métastase d'un traitement d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté dudit patient traité à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides de l'invention ; c) comparer ledit niveau d'expression obtenu à l'étape b) avec celui d'un échantillon biologique contrôle ou d'un échantillon biologique tumoral dudit patient avant traitement, où une diminution du niveau d'expression de l'échantillon biologique tumoral après traitement par rapport à celui de l'échantillon biologique contrôle ou de l'échantillon biologique tumoral avant traitement est l'indication d'une efficacité antimétastase du traitement thérapeutique.
La présente invention se rapporte, en quatrième lieu, à une trousse (« kit ») comprenant un pool de polynucléotides de l'invention. Selon l'invention, cette trousse ou kit peut être utilisée par exemple pour la prédiction in vitro de la survenue de métastases et/ou pour l'évaluation du pronostic d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro- intestinale (GIST) et/ou pour la surveillance de l'efficacité anti-métastase d'un traitement thérapeutique d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST).
Selon l'invention, cette trousse ou kit peut comprendre en outre les moyens de détection et/ou quantification de l'expression d'un pool de nucléotides de l'invention. Ces moyens peuvent être par exemple l'un de ceux définis ci-dessus ou exemplifiés ci-dessous.
La présente invention se rapporte, en cinquième lieu, à une puce à acides nucléiques, en particulier à une puce à ADN, comprenant ou étant constituée d'un pool de polynucléotides de l'invention. Cette puce à ADN peut être par exemple telle que définie ci-dessus, notamment concernant le support. Avantageusement une puce à acides nucléiques de l'invention peut comprendre des « sondes », par exemple des fragments d'ADNc ou oligonucléotides (par exemple de 60 à 80 bases, ou plus), etc...., fixées sur un support solide. Ces « sondes » fixent de façon spécifique par hybridation les « cibles », par exemple les gènes complémentaires, présents dans les échantillons biologiques à tester. Cette hybridation nécessite l'association par des liaisons non covalentes des séquences d'acides nucléiques simple brin, totalement complémentaires ou suffisamment complémentaires pour s'hybrider entre elles, et former une structure double-brin.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES - La Figure 1 représente 3 types de profil génomique (a) amplifié
(16%) (a) bras (23%) et (d) réarrangé (61%).
La Figure 2 représente les courbes de survie sans métastases de Kaplan-Meier de différents groupes de sarcomes selon la signature CINSARC.
La Figure 3 représente les courbes de survie sans progression/métastases de Kaplan-Meier de trois groupes de tumeurs selon la signature CINSARC.
La Figure 4 représente les courbes de survie sans progression/métastases (% de cas sans métastases en fonction des années après le traitement) de Kaplan-Meier d'un groupe de sarcomes (groupe de tumeurs dans lequel a été définie la signature) selon la signature au moyen du pool de nucléotides consistant en les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24. La courbe A montre une courbe de survie de patients à bon pronostique, présentant environ 80% de cas sans métastases à 5 ans. La courbe B montre une courbe de survie de patients à un mauvais pronostique, présentant environ 50% de cas sans métastases à 5 ans.
La Figure 5 représente les courbes de survie sans progression/métastases (% de cas sans métastases en fonction des années après le traitement) de Kaplan-Meier d'un groupe de sarcomes (groupe de tumeurs indépendant de l'identification de la signature) selon la signature au moyen du pool de nucléotides consistant en les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24. La courbe A montre une courbe de survie de patients à bon pronostique, présentant environ 90% de cas sans métastases à 5 ans. La courbe B montre une courbe de survie de patients à un mauvais pronostique, présentant environ 50% de cas sans métastases à 5 ans.
EXEMPLES
Exemple 1 : pool de la présente invention
Patients et échantillons
La base de données du groupe sarcome Français (GSF) en tant qu'entité de la Conticabase (www.conticabase.org) contient les données de sarcomes des tissus mous d'adulte traités dans 11 centres avec la description des patients, des tumeurs primaires, des traitements, du suivi et des échantillons tumoraux. Cette base de données contenait environ 3800 cas au moment de l'étude. Tous les cas ont été revus par le sous- groupe de pathologistes et classés selon la classification WHO 2002 en utilisant l'histologie, Fimmunohistochimie et la cytogénétique et génétique moléculaire lorsque cela a été nécessaire. Pour cette étude, des sarcomes des tissus mous sans translocations chromosomiques récurrentes ont été sélectionnés et pour lesquels un échantillon tissulaire congelé de la tumeur primaire non traitée était disponible. Au final les échantillons biologiques provenant de 183 patients décrits dans le tableau 2 ci-dessous ont été étudiés.
Tableau 2
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Extraction ADN et analyse par CGH (Hybridation Génomique Comparative) sur puce ADN
L'ADN génomique de tissus tumoraux congelés a été isolé en utilisant un protocole d'extraction au phénol-chloroforme standard et a été analysé sur un spectrophotomètre (Nanodrop). Ainsi après digestion avec Dpnll (Ozyme, Saint-Quentin en Yvelines, France) et purification sur colonne (Qiagen PCR Purification Kit, Qiagen), 1,5 μg d'ADN tumoral et 1,5 μg d'ADN normal ont été marqués en utilisant le BioPrime DNA labeling System Kit (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) avec Cy5-dCTP ou Cy3- dCTP (Perkin Elmer), respectivement. Les ADNs normaux et tumoraux marqués ont été mélangés et précipités ensemble avec 100 μg d'ADN Cot-1 humain (Invitrogen), resuspendus dans 72 μl de tampon d'hybridation (50% formamide, 40 mM NaH2PO4, 0,1% SDS, 10% sulfate de dextran, 2X SSC). Des sondes préhybridées ont été déposées sur des lames et introduites dans des chambres humides (Corning) et l'hybridation a eu lieu à 37°C pendant 48 h.
Afin d'établir les profils génomiques, des puces BAC (Bacterial Artificial Chromosome) composées de 3803 clones BAC ont été réalisées avec une moyenne de 1 Mb entre les clones. Les clones BAC ont été déposés en trois exemplaires.
Les lavages après l'hybridation ont été réalisés comme suit : un lavage à 65°C dans du 0,5X SSC, 0,03% SDS, suivi d'un lavage à 45°C dans la même solution.
Les lames ont été scannées (Scanarray 4000XL, Packard Bioscience) et analysées avec le logiciel d'analyse d'images GenePix Pro 5.1. La normalisation, la filtration subdivisée, l'analyse par groupement et la représentation graphique ont été réalisées en utilisant la plateforme d'analyse par CGH sur puce ADN (CAPWeb). Les clones avec plus de 50% de valeurs manquantes ont été éliminés. Les ratios Cy5-Cy3 supérieurs à 2 ont été considérés comme des amplifications, des ratios supérieurs à 1,2 et inférieurs à 0,8 ont été considérés comme des gains et des pertes, respectivement. L'analyse par CGH sur puce ADN (calcul des altérations génomiques) a été réalisée par l'interface VAMP (LA ROSA et al., Bioinformatics, 22(17) : 2066-2073, 2006).
Extraction ARN et analyse d'expression L'ARN total a été extrait à partir d'échantillon tumoraux congelés avec le réactif TRIzol (Life technologies, Inc.). L'ARN a alors été purifié en utilisant le RNeasy® Min Elute™ Cleanup Kit (Qiagen), selon les instructions du fabricant. La qualité de PARN a été vérifiée sur le bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies).
Les échantillons ont ensuite été analysés sur puce Human génome U 133 Plus 2.0 (Affimetrix®), selon les instructions du fabricant. Toutes les données des puces à ADN ont été normalisées simultanément en utilisant l'algorithme GCRMA (WU et al., J. Am. Stat. Assoc, 99 : 909-917, 2004). Les analyses de groupement hiérarchiques ont été réalisées en utilisant le logiciel dChip (http://biosunl.harvard.edu/complab/dchip/). Pour les tests de Welch, Willcoxon et SAM, les valeurs p ont été ajustées en utilisant la procédure de Benjamini-Hochberg (R-multitest package).
L'analyse dans la base de données Gène Ontology (GO ; http://www.geneontology.org/) a été réalisée pour trouver un enrichissement statistique aux limites de la GO. Analyse statistique
Des tests de Chi-deux (test χ2) ont été réalisés pour évaluer le lien entre les différentes caractéristiques tumorales, altérations génomiques, profils d'expression et résultat clinique. L'influence réciproque parmi les différents facteurs prédictifs a été déterminée par une analyse multivariée en utilisant un test de régression logistique amont. Tous les facteurs ont été inclus dans les analyses de régression logistique, sans tenir compte de leurs valeurs P obtenues par analyse univariée, mais seulement ceux avec une valeur P < 5% ont été retenus dans les modèles finaux. Les survies sans métastases ont été obtenues par la méthode de Kaplan-Meier et comparées avec le test logarithmique par rangs. Tous les tests statistiques ont été à deux faces et le seuil de signification a été de p = 0,05. Toutes les analyses statistiques (modèle de régression logistique) ont été réalisées en utilisant la version 8 du logiciel SAS.
RÉSULTATS
Profil génomique des 183 sarcomes mal différenciés
L'établissement du profil génomique des 183 sarcomes peu différenciés a été réalisé par analyse CGH sur une puce BAC contenant 3803 clones. Trois profils récurrents principaux ont été identifiés, selon à la fois le nombre et le type d'altérations identifiés, parmi 174 profils génomiques interprétables in fine (Figure 1). Un premier groupe de 28 tumeurs (16%) à génétique simple, dénommé profil « amplifié », basé sur les co-amplifications et correspondant presque exclusivement à des liposarcomes dédifférenciés. Un second groupe de 40 tumeurs (23%), dénommé profil « bras », avec quelques altérations (moins de 30), impliquant principalement une altération du chromosome entier ou de la totalité d'un bras du chromosome. Un troisième groupe de 106 tumeurs (61%), dénommé profil « réarrangé », caractérisé par un niveau élevé de complexité chromosomique avec plus de 30 à 85 altérations.
Il reste à démontrer si le profil génomique est associé au résultat clinique. L'analyse de groupement supervisée selon le profil génomique (profil
« bras » vs profil « réarrangé ») n'a pas permis de prédire de manière significative la survenue de métastases (p = 0,17). De manière intéressante, une corrélation positive a été trouvée entre le profil « réarrangé » et le grade 3 histologique, dans les 183 sarcomes de l'étude (p = 0,001), et dans le sous-groupe des 117 sarcomes des membres à génétique complexe avec les profils « bras » et « réarrangé » (p = 2,2XlO"4). Le grade histologique étant une évaluation indirecte de l'agressivité tumorale, il a été montré que, même si aucune corrélation avec un mauvais résultat clinique n'a été obtenue, la complexité génomique est associée à l'agressivité tumorale. II reste à démontrer si l'expression des gènes associée à la complexité génomique et/ou le grade tumoral pourrait être prédictif de la survenue de métastases.
Profils d'expression et établissement de la signature moléculaire pronostique Les profils d'expression génique des 183 sarcomes de l'étude ont été reconsidérés afin de tester l'hypothèse d'une corrélation entre l'expression spécifique des gènes dans les tumeurs à génome complexe et la survenue de métastases.
Pour ce faire, les 183 échantillons ont été groupés dans un premier temps en fonction d'une signature précédemment établie et composée de 70 gènes sélectionnés comme étant liés à l'instabilité chromosomique (CARTER et al., Nat. Genêt., 38(9) : 1043- 1048, 2006). Mais cela a conduit à une prédiction de tendance mais non significative de la survie sans métastases.
Aussi dans un deuxième temps, le but a été d'établir un jeu de gènes spécifiques des sarcomes associé au niveau des déséquilibres et capable de prédire le devenir d'un patient. Dans trois analyses supervisées, ont été analysés les profils d'expression de tumeurs classées en deux groupes selon i) le nombre de déséquilibres CGH, moins de 20 déséquilibres vs plus de 35 déséquilibres, ii) le grade histologique FNCLCC 3 vs le grade tumoral 2, et iii) la signature de Carter. À partir des deux premières comparaisons, 118 clones correspondant à 86 gènes et 92 clones correspondant à 73 gènes ont été significativement exprimés de manière différentielle entre les tumeurs stratifiées soit par les déséquilibres CGH (facteur d'expression différentielle (= nombre de fois où le gène est plus exprimé) >3 ; ou non, p<0,01) ou par grade (facteur d'expression différentielle >2 ; p<0,01), respectivement. Ces gènes ont ensuite été soumis à l'analyse par la base de données Gène Ontology dans le but de déterminer les voies associées aux déséquilibres CGH et au grade histologique. De manière intéressante, ces voies sont extrêmement similaires dans les groupes déterminés selon les déséquilibres CGH et ceux déterminés par les comparaisons de grade histologique, et sont principalement impliquées dans l'intégrité des chromosomes et le contrôle de la mitose (Tableau 3). Parmi les gènes de la signature de Carter, 22 gènes, qui n'ont pas encore été identifiés dans les deux premières comparaisons, ont été significativement exprimés (p<10"5) de manière différentielle entre les deux groupes de sarcomes.
D'après ces résultats, ont été sélectionnés tous les gènes significatifs appartenant aux voies sur-représentées de manière significative à partir des deux premières comparaisons (p<10"5 ; tableau 3) et les 22 gènes de la signature de Carter définis ci- dessus.
Tableau 3 a) d'après le test de Welch
Nombre de sondes/clones d'entrée : 92
Figure imgf000025_0001
b) d'a rès le test de Welch
Figure imgf000025_0002
Figure imgf000026_0001
Ce set final de gènes, dénommé par les inventeurs CINSARC (Complexity INdex SARComas), est constitué de 67 gènes tous impliqués dans le contrôle du génome.
Exemple 2 : Prédiction de Ia survenue de métastases dans les sarcomes à l'aide du CINSARC
La corrélation de la signature d'expression CINSARC avec la survenue de métastases a été évaluée dans le groupe entier d'étude (183 sarcomes). L'analyse par groupement a permis la classification des tumeurs en trois sous-groupes (sous-goupes 1 , 2, 3), avec une différence significative dans la survenue des métastases (Figure 2). L'analyse multivariée a montré que les tumeurs du sous-groupe 3 ont un risque de métastases triple en comparaison des tumeurs du sous-groupe 1 (analyse de Kaplan-Meier ; HR = 3,01 ; 95% CI [1,8-5,2] ; p<10" ). Une analyse multivariée prenant en compte d'autres facteurs pronostiques standards, tel que le type histologique, le grade tumoral FNCLCC, la taille des tumeurs, la localisation, l'envahissement vasculo-nerveux ou osseux, le sexe et l'âge, a montré également un risque de métastases trois fois supérieur pour la sous-groupe 3 en comparaison du sous-groupe 1 (modèle de Cox ; HR = 3,1 ; 95% CI [1,8-5,4], p<10"3). Ces résultats ont montré que la signature CINSARC est un facteur pronostique indépendant associé fortement au développement de métastases. Après cette validation de la signature CINSARC en tant que facteur pronostique indépendant, 6 sous-groupes spécifiques de sarcomes ont également été testés par une analyse par groupement non-supervisée (Figure 2). Parmi les 117 sarcomes des membres à génétique complexe, l'analyse univariée a réparti les tumeurs en deux sous- groupes et démontré un risque de métastases triple pour le sous-groupe 2 vs le sous-groupe 1 (analyse de Kaplan-Meier ; HR = 3,1 ; 95% CI [1,6-6,0] ; p<10"3). De manière similaire, parmi les 52 leiomyosarcomes, trois sous-groupes de résultat clinique significatif différent (P=O5OOl) ont été trouvés (il est intéressant de noter que le sous-groupe 2 consiste presque exclusivement en des LMS développés dans le tronc interne au lieu du tronc externe pour les deux autres sous-groupes). Aussi lorsque seuls les LMS du tronc externe sont pris en considérations par une analyse par groupement non-supervisée, les 36 patients sont répartis en deux sous-groupes avec une différence sextuple de risque métastatique (analyse de Kaplan-Meier ; HR = 6 ; 95% CI [2,1-16,9] ; p<10~3).
La performance de la signature CINSARC a également été analysée pour des patients du même grade histo logique (Figure 2). Au sein des tumeurs de grade 3 (100 cas), un risque métastatique triple a été observé dans les tumeurs du sous-groupe 2 vs les tumeurs du sous-groupe 1 (analyse de Kaplan-Meier ; HR = 3 ; 95% CI [1,6-5,6] ; p<10"3) et au sein des tumeurs de grade 2 (40 cas) avec des profils bras ou réarrangé (à savoir toutes sauf les DD-LPS), les patients ont été également répartis en deux groupes de résultat clinique différent (analyse de Kaplan-Meier ; HR = 2,6 ; 95% CI [1-7,5] ; p = 0,05). La survie sans métastases n'est pas significativement différente dans les deux groupes de liposarcomes dédifférenciés regroupés selon la signature CINSARC. Ainsi la signature CINSARC de la présente invention a permis de séparer en deux groupes ayant une probabilité de survenue de métastases différente, des tumeurs considérées avec le même potentiel métastatique selon le système de grade FNCLLC (Figure 2). Ce résultat est peut-être le plus important, dans la mesure où il démontre clairement que la signature CINSARC peut être un système plus efficace que celui actuellement utilisé pour déterminer des stratégies thérapeutiques.
En outre, pour la première fois dans le domaine des sarcomes, un profil d'expression de gènes attribue un pronostic clinique meilleur que celui obtenu avec le système de grade FNCLLC. Ainsi, dans le groupe entier réunissant différents histotypes, la signature CINSARC a permis l'identification d'un sous-groupe de tumeurs avec un mauvais pronostic alors que le système de grade FNCLLC n'a pas réussi à séparer ces tumeurs de pronostics distincts (données non représentées).
Exemple 3 : Prédiction de la survenue de métastases dans d'autres cancers à l'aide du CINSARC La valeur prédictive du CINSARC dans d'autres sarcomes a été testée et une série de 32 GIST a été analysée (YAMAGUCHI et al., J ; Clin. Oncol., 26(25) : 4100- 4108, 2008). Comme représenté dans la Figure 3, la signature CINSARC a permis une analyse par groupement non-supervisée hiérarchique conduisant à deux groupes de GIST avec un pronostic différent (p<10-3). De manière intéressante, cette classification est indépendante de la localisation même si les GIST de l'intestin grêle et celles de l'estomac forment deux groupes séparés dans chaque groupe de pronostic différent.
La signature CINSARC étant exclusivement composée de gènes impliqués dans l'intégrité des chromosomes et l'expression étant associée aux déséquilibres chromosomiques, la signature CINSARC pourrait également avoir une valeur pronostique pour des tumeurs fortement réarrangées, tel que les carcinomes du sein. Par conséquent, deux séries de cancer du sein (78 et 295 cas) de l'Institut du Cancer des Pays-Bas (VAN'T VEER et al., 2002, précité ; VAN de VIJVER et al., 2002, précité) ont été rassemblées selon la signature CINSARC, et une fois encore deux groupes de patients avec un résultat clinique différent très significatif (p<10"3) ont été obtenus (Figure 3).
Comme démontré dans l'étude, la signature CINSARC est un outil prédictif indépendant puissant permettant une meilleure évaluation de la survenue des métastases ainsi que l'attribution aux patients d'un meilleur pronostic clinique par rapport au système de grade FNCLCC. Ce nouveau système de grade moléculaire devrait ainsi permettre d'améliorer le suivi clinique des patients. En outre cette signification biologique des gènes de la signature CINSARC les définit comme des cibles potentielles de nouvelles approches thérapeutiques ciblant l'étape précoce d'acquisition du potentiel métastatique.
Le fait que la signature CINSARC soit associée à la survenue de métastases à travers de tels groupes hétérogènes de tumeurs (des sarcomes aux carcinomes) est suffisamment encourageant pour envisager, à la place du système de grade histologique actuel, l'utilisation de ce profil d'expression pour identifier des patients à risque élevé de métastases et cibler des stratégies chimio-thérapeutiques complémentaires.
Les stratégies thérapeutiques courantes associent la résection chirurgicale et la chimiothérapie/radiothérapie dans des situations adjuvante ou néo-adjuvante. Cependant seuls les sarcomes ayant un potentiel métastatique élevé devraient bénéficier d'un tel traitement. C'est actuellement le cas pour les GIST dont le traitement adjuvant par l'imatinib est en cours de validation pour les tumeurs à haut risque de récidive. Cependant les systèmes actuellement utilisés sont imparfaits. L'utilisation de la signature CINSARC pourrait améliorer la sélection de ces patients et ainsi augmenter le bénéfice des thérapies adjuvantes.
Il existe donc un intérêt important dans l'utilisation de la signature CINSARC en tant que critère majeur de décision pour l'admissibilité d'une thérapie adjuvante, en particulier concernant les GIST (tumeurs stromales gastro-intestinales) pour lesquelles une thérapie ciblée existe déjà (Glivec®).
Exemple 4 : Prédiction de la survenue de métastases dans les sarcomes à l'aide d'un pool de 5 polynucléotides du CINSARC La corrélation de la signature d'expression des 5 polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID
NO : 24 du CINSARC avec la survenue de métastases a été évaluée sur deux séries de sarcomes (Figures 4 et 5). L'analyse par groupement a permis la classification des tumeurs en deux sous-groupes (sous-goupes A et B), avec une différence significative dans la survenue des métastases. L'analyse par la méthode des centres les plus proches a montré que les tumeurs du sous-groupe B ont un risque de métastases supérieur en comparaison des tumeurs du sous-groupe A. Ces résultats ont montré que la signature CINSARC à 5 gènes est un facteur pronostique indépendant associé fortement au développement de métastases.
Ce résultat est important, dans la mesure où il démontre clairement que la signature de cinq gènes du CINSARC peut être un système plus efficace que celui actuellement utilisé pour déterminer des stratégies thérapeutiques.
En outre, pour la première fois dans le domaine des sarcomes, un profil d'expression de gènes attribue un pronostic clinique meilleur que celui obtenu avec le système de grade FNCLLC. Ainsi, dans le groupe entier réunissant différents histotypes, la signature CINSARC a permis l'identification d'un sous-groupe de tumeurs avec un mauvais pronostic alors que le système de grade FNCLLC n'a pas réussi à séparer ces tumeurs de pronostics distincts (données non représentées).

Claims

REVENDICATIONS
1. Pool de polynucléotides comprenant au moins deux polynucléotides choisis parmi les séquences de polynucléotides SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67.
2. Pool de polynucléotides selon la revendication 1, ledit pool de polynucléotides comprenant les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24.
3. Pool de polynucléotides selon la revendication 1, ledit pool de polynucléotides comprenant au moins un polynucléotide choisi dans chacun des sets de polynucléotides suivants :
Set 1 : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 12 ; Set 2 : SEQ ID NO : 13 à SEQ ID NO : 38 ; Set 3 : SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 50 ;
Set 4 : SEQ ID NO : 51 à SEQ ID NO : 58, et SEQ ID NO : 59 à SEQ ID NO : 62 ;
Set 5 : SEQ ID NO : 63 à SEQ ID NO : 65, et SEQ ID NO : 66 à SEQ ID NO : 67.
4. Pool de polynucléotides selon la revendication 3, ledit pool comprenant les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58 et SEQ ID NO : 24 et au moins un polynucléotide du Set 5.
5. Pool de polynucléotides selon la revendication 1, ledit pool comprenant au moins deux polynucléotides choisi dans:
Set 1 : SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 12 ; ou Set 2 : SEQ ID NO : 13 à SEQ ID NO : 38 ; ou Set 3 : SEQ ID NO : 39 à SEQ ID NO : 50 ; ou Set 4 : SEQ ID NO : 51 à SEQ ID NO : 58, et SEQ ID NO : 59 à SEQ ID
NO : 62 ; ou
Set 5 : SEQ ID NO : 63 à SEQ ID NO : 65, et SEQ ID NO : 66 à SEQ ID NO : 67.
6. Pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, ledit pool de polynucléotides comprenant au plus dix polynucléotides.
7. Pool de polynucléotides selon la revendication 1, ledit pool de polynucléotides étant constitué des polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO : 58, SEQ ID NO : 24.
8. Pool de polynucléotides selon la revendication 1, ledit pool de polynucléotides comprenant les polynucléotides de séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 67.
9. Pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, immobilisé sur un support solide ou liquide.
10. Utilisation d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour l'obtention d'un composé destiné au traitement d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST).
11. Procédé in vitro d'analyse d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ledit procédé comprenant une détermination du niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 dans un échantillon biologique.
12. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ladite détermination du niveau d'expression permet de prédire la survenue de métastases.
13. Procédé selon la revendication 11, dans lequel ladite détermination du niveau d'expression permet de distinguer des sous-groupes de bon ou mauvais pronostic parmi un groupe de sarcomes des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) de même grade histologique.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, dans lequel ladite détermination du niveau d'expression est réalisée sur une puce à acides nucléiques.
15. Utilisation d'un procédé selon la revendication 11, pour détecter et/ou pronostiquer et/ou diagnostiquer un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ou pour surveiller le traitement d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST).
16. Procédé in vitro de prédiction de la survenue de métastases chez un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro- intestinale (GIST) comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté dudit patient à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ; c) c) comparer le niveau d'expression obtenu à l'étape b) au niveau d'expression du même pool de polynucléotides mesuré dans un échantillon biologique contrôle, une dérégulation du niveau d'expression du pool d'oligonucléotides par rapport à son niveau d'expression correspondant mesuré dans un échantillon biologique contrôle étant prédictive de la survenue de métastase.
17. Procédé in vitro d'évaluation du pronostic d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté du patient atteint d'un STS à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ; c) comparer le niveau d'expression obtenu à l'étape b) au niveau d'expression du même pool de polynucléotides mesuré dans un échantillon biologique contrôle, où une dérégulation du niveau d'expression du pool d'oligonucléotides par rapport à son niveau d'expression correspondant mesuré dans un échantillon biologique contrôle permet d'identifier un sous-groupe de bon pronostic ou un sous-groupe de mauvais pronostic.
18. Procédé in vitro de criblage de composés candidats pour le traitement d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) comprenant les étapes suivantes : a) mettre en contact un échantillon biologique tumoral avec un composé test ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ; c) comparer ledit niveau d'expression obtenue dans l'étape b) avec celui du même échantillon biologique tumoral n'ayant pas été mis en contact avec le composé test, où une diminution du niveau d'expression dans l'échantillon biologique tumoral en présence du composé test par rapport à celui de l'échantillon biologique tumoral en absence du composé test est l'indication d'un composé utile dans le traitement d'un STS ou d'un GIST.
19. Procédé in vitro de surveillance de l'efficacité anti-métastase d'un traitement d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), comprenant les étapes suivantes : a) fournir un échantillon biologique tumoral préalablement collecté dudit patient traité à tester ; b) déterminer dans ledit échantillon biologique tumoral le niveau d'expression d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à
4 ; c) comparer ledit niveau d'expression obtenu à l'étape b) avec celui d'un échantillon biologique contrôle ou d'un échantillon biologique tumoral dudit patient avant traitement, où une diminution du niveau d'expression de l'échantillon biologique tumoral après traitement par rapport à celui de l'échantillon biologique contrôle ou de l'échantillon biologique tumoral avant traitement est l'indication d'une efficacité antimétastase du traitement thérapeutique.
20. Procédé in vitro de sélection d'un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 comprenant les étapes suivantes : a) fournir des échantillons biologiques tumoraux provenant de patients atteints d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale
(GIST) ; b) détecter et/ou quantifier chacun des polynucléotides, individuellement dans chacun des échantillons biologiques tumoraux ; c) comparer le profil d'expression des pools de polynucléotides obtenus à l'étape c) par rapport à un phénotype biologique, de préférence d'instabilité chromosomique, de complexité génomique ou de grade histologique, pour chacun des échantillons biologiques tumoraux ; d) sélectionner la voie statistiquement significative (p<10"5) pour le phénotype testé ; e) sélectionner les polynucléotides signifïcativement impliqués dans cette voie biologique, et dont l'expression est indicative de la probabilité de survenue de métastases.
21. Kit comprenant un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
22. Kit pour la prédiction in vitro de la survenue de métastases, l'évaluation du pronostic d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous ( STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) et/ou la surveillance de l'efficacité antimétastase d'un traitement thérapeutique d'un patient atteint d'un sarcome des tissus mous (STS) ou d'une tumeur stromale gastro-intestinale (GIST), ledit kit comprenant les moyens pour détecter et/ou quantifier l'expression d'un pool de nucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
23. Puce à acides nucléiques comprenant un pool de polynucléotides selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, immobilisé sur un support solide ou liquide.
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