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JP6700333B2 - ヘテロ接合性の消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）を評価するための方法および材料 - Google Patents

ヘテロ接合性の消失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）を評価するための方法および材料 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2011年12月21日に出願された米国特許仮出願第61/578,713号および2012年6月1日に出願された米国特許仮出願第61/654,402号に係る優先権を主張する。これらの全内容は参照により本明細書に組み入れられる。
1.技術分野
本文書は、ヘテロ接合性の消失(loss of heterozygosity)(LOH)シグネチャー(signature)の存在について試料(例えば、癌細胞)を評価することに関与する方法および材料に関する。例えば、本文書は、細胞(例えば、癌細胞)がLOHシグネチャーを含有するかどうかを判定するための方法および材料を提供する。本文書はまた、相同組換え修復(homology directed repair)(HDR)における欠損を有する細胞(例えば、癌細胞)を特定するための材料および方法、ならびに、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高い癌患者を特定するための材料および方法も提供する。本文書全体を通して、特に定めのない限り、HDR欠損およびHRD(相同修復欠損)は同義に用いられる。
2.背景情報
癌は重大な公衆の健康問題であり、米国では2009年だけで562,340人が癌で死亡している。American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 2009(非特許文献1)(米国癌学会のウェブサイトで入手可能)。癌治療における最も重要な課題の1つは、患者自身の癌に関する関連性のある臨床上有用な特徴を発見し、次いで、これらの特徴に基づいて患者の癌に最も適した治療計画を行うことである。この個別化医療分野において進展があったが、患者の癌を特徴付けるためのさらに優れた分子診断ツールが今なお大いに必要とされている。
American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 2009
概要
全体として、本発明の一局面は、癌細胞または該癌細胞のゲノムDNAにおいてLOHを評価するための方法を特徴とする。一部の態様において、該方法は、(a)癌細胞もしくは該癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体(例えば、ヒトX/Y性染色体対以外の任意のヒト染色体対)中のLOH領域を検出する工程;および(b)該LOH領域の数およびサイズ(例えば、長さ)を決定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。一部の態様において、全ゲノムを代表する多数の染色体対においてLOH領域が分析される(例えば、LOH領域の数およびサイズがゲノム全体にわたるLOH領域の数およびサイズを代表すると予想されるのに十分な染色体が分析される)。一部の態様において、該方法は、約1.5メガベース、5メガベース、12メガベース、13メガベース、14メガベース、15メガベース、16メガベース、17メガベース、またはそれ以上のメガベース(好ましくは、14メガベース、15メガベース、16メガベース、またはそれ以上のメガベース、より好ましくは15メガベースまたはそれ以上のメガベース)より長いが、染色体内にLOH領域が位置しているそれぞれの染色体の全長より短い、LOH領域(指標LOH領域)の総数を決定する工程をさらに含む。またはもしくはさらに、このような指標LOH領域の長さの合計が決定される。一部の特定の態様において、指標LOH領域の総数または指標LOH領域の長さの合計が、予め決められた参照数に等しい場合、または予め決められた参照数より大きい場合には、前記癌細胞もしくは前記ゲノムDNAまたは該癌細胞もしくは該ゲノムDNAを有している患者はHDR欠損LOHシグネチャーを有していると特定される。
(a)癌細胞もしくは癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域を検出する工程であって、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対でない、工程;ならびに(b)少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数および/もしくはLOH領域の長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、13メガベース、14メガベース、15メガベース、16メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは15メガベースもしくはそれ以上)である、工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる、癌細胞またはそのゲノムDNAにおけるLOHを評価するための代替的な方法も提供される。一部の特定の態様において、総数または長さの合計が、予め決められた参照数に等しい場合、または予め決められた参照数より大きい場合、前記癌細胞もしくは前記ゲノムDNAまたは該癌細胞もしくは該ゲノムDNAを有している患者はHDR欠損LOHシグネチャーを有していると特定される。
別の局面において、本発明は、癌細胞におけるBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子の状態を予測する方法を提供する。該方法は、癌細胞において、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数および/または長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、1つのLOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは約15メガベースもしくはそれ以上)である、工程;ならびに参照数を上回る総数または長さの合計を、BRCA1遺伝子またはBRCA2遺伝子における欠損の可能性の増加と相関付ける工程を含むか、あるいはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本発明は、癌細胞におけるHDRの状態を予測する方法を提供する。該方法は、癌細胞において、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数および/または長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、1つのLOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは約15メガベースもしくはそれ以上)である、工程;ならびに参照数を上回る総数または長さの合計を、HDRにおける欠損の可能性の増加と相関付ける工程を含むか、あるいはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本発明は、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/またはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法を提供する。該方法は、癌患者に由来する癌細胞において、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数および/または長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、1つのLOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは約15メガベースもしくはそれ以上)である、工程;ならびに参照数を上回る総数または長さの合計を、癌治療レジメンに癌患者が反応し得る可能性の増加と相関付ける工程を含むか、あるいは、これらの工程から本質的になる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
別の局面において、本発明は、治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法に関する。該方法は、癌患者に由来する癌細胞において、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数および/または長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは約15メガベースもしくはそれ以上)である、工程;ならびに参照数を上回る総数または長さの合計を、パクリタキセルまたはドセタキセルを含む治療レジメンに癌患者が反応し得ない可能性の増加と相関付ける工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本発明は癌を治療する方法に関する。該方法は、(a)癌患者に由来する癌細胞または該癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数および/または長さの合計を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは約15メガベースもしくはそれ以上)である、工程;ならびに(b)LOH領域の総数または長さの合計が参照数を上回る場合に、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物を含む癌治療レジメンを、癌患者に対して行う工程を含むか、あるいはこれらの工程から本質的になる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
前述の6つの段落に記載の方法のいずれか1つまたは複数の一部の態様において、以下のいずれか1つまたは複数を適宜、適用することができる。少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体においてLOH領域を決定することができる。癌細胞は卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞でもよい。第1の長さは、約6メガベース、12メガベース、もしくは約15メガベース、またはそれ以上であってもよい。参照数は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、もしくは20、またはそれ以上であってもよい。少なくとも一対のヒト染色体はヒト17番染色体を除いてもよい。DNA損傷物質はシスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン(oxalaplatin)、またはピコプラチンでもよく、アントラサイクリンはエピルビンシン(epirubincin)またはドキソルビシンでもよく、トポイソメラーゼI阻害物質はカンポテシン、トポテカン、またはイリノテカンでもよく、PARP阻害物質はイニパリブ(iniparib)、オラパリブ(olaparib)、またはベラピリブ(velapirib)でもよい。
別の局面において、本発明は、合計5個、8個、9個、10個、12個、15個、17個、20個、またはそれ以上の指標LOH領域を有すると判定された癌細胞を有すると特定された患者において癌を治療するのに有用である医薬の製造における、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物の使用を特徴とする。少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において指標LOH領域を決定することができる。癌細胞は卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞でもよい。指標LOH領域の長さは約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上であってもよい。指標LOH領域はヒト17番染色体以外の染色体に存在してもよい。DNA損傷物質は白金系化学療法薬でもよく、アントラサイクリンはエピルビンシンまたはドキソルビシンでもよく、トポイソメラーゼI阻害物質はカンポテシン、トポテカン、またはイリノテカンでもよく、PARP阻害物質はイニパリブ、オラパリブ、またはベラピリブでもよい。一部の態様において、患者は未治療患者である。
別の局面において、本発明は、癌患者から得られたヒト癌細胞からの少なくとも1つの染色体対中の指標LOH領域の総数または長さの合計を決定するのに有用であり、かつ、(a)癌細胞中のBRCA1遺伝子もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性の増加、(b)癌細胞中のHDRにおける欠損の可能性の増加、または(c)DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに癌患者が反応し得る可能性の増加を検出するのに有用である診断キットの製造における、ヒトゲノムDNAの複数の多型領域にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドの使用を特徴とする。少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において指標LOH領域を決定することができる。癌細胞は卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞でもよい。指標LOH領域の長さは約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上であってもよい。指標LOH領域はヒト17番染色体以外の染色体に存在してもよい。
別の局面において、本発明は、癌患者の癌細胞のLOHの状態を判定するためのシステムを特徴とする。該システムは、(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体のゲノムDNAについて複数のシグナルを発生するように構成された、試料分析器、および(b)少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数もしくは長さの合計を複数のシグナルに基づいて算出するようにプログラムされた、コンピュータサブシステムを備えるか、またはこれらから本質的になる。コンピュータサブシステムは、指標LOH領域の数または長さの合計を参照数と比較して、(a)癌細胞中のBRCA1遺伝子および/もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性、(b)癌細胞中のHDRにおける欠損の可能性、または(c)DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに癌患者が反応し得る可能性を判定するようにプログラムすることができる。該システムは、(a)、(b)、または(c)の可能性を表示するように構成された出力モジュールを備えてもよい。該システムは、癌治療レジメンの使用についての推奨を表示するように構成された出力モジュールを備えてもよい。少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において指標LOH領域を決定することができる。癌細胞は卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞でもよい。指標LOH領域の長さは約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上であってもよい。指標LOH領域は、ヒト17番染色体以外の染色体に存在してもよい。DNA損傷物質は白金系化学療法薬でもよく、アントラサイクリンはエピルビンシンまたはドキソルビシンでもよく、トポイソメラーゼI阻害物質はカンポテシン、トポテカン、またはイリノテカンでもよく、PARP阻害物質はイニパリブ、オラパリブ、またはベラピリブでもよい。
別の局面において、本発明は、コンピュータ上で実行する場合に、ヒトXおよびY性染色体以外のヒト染色体の1つまたは複数に沿った任意のLOH領域の有無を検出するための命令であって、LOH領域の長さが、約1.5メガベースもしくはそれ以上(または5メガベース、10メガベース、もしくはそれ以上、好ましくは15メガベースもしくはそれ以上)であるが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、命令;ならびに1つまたは複数の染色体対中のLOH領域の総数または長さの合計を決定するための命令を与える、コンピュータ可読媒体に組み入れられたコンピュータプログラム製品を提供する。コンピュータプログラム製品は他の命令を備えてもよい。少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において指標LOH領域を決定することができる。癌細胞は卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞でもよい。指標LOH領域の長さは約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上であってもよい。指標LOH領域はヒト17番染色体以外の染色体に存在してもよい。DNA損傷物質は白金系化学療法薬でもよく、アントラサイクリンはエピルビンシンまたはドキソルビシンでもよく、トポイソメラーゼI阻害物質はカンポテシン、トポテカン、またはイリノテカンでもよく、PARP阻害物質はイニパリブ、オラパリブ、またはベラピリブでもよい。
別の局面において、本発明は診断キットを提供する。キットは、ヒトゲノムDNAの複数の多型領域にハイブリダイズすることができる、少なくとも500個のオリゴヌクレオチド;および本明細書において提供されるコンピュータプログラム製品を含むか、またはこれらから本質的になる。コンピュータプログラム製品はコンピュータ可読媒体中に組み込まれてもよく、コンピュータ上で実行する場合に、ヒトXおよびY性染色体以外のヒト染色体の1つまたは複数に沿った任意のLOH領域の有無を検出するための命令であって、LOH領域の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上のメガベース(あるいは5メガベースもしくは10メガベース、またはそれ以上のメガベース、好ましくは約15メガベースまたはそれ以上のメガベース)であるが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、命令;ならびに1つまたは複数の染色体対中のLOH領域の総数および/または長さの合計を決定するための命令を与える。
別の局面において、本文書は、LOHシグネチャーの存在について患者の癌細胞を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、LOHシグネチャーを有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、HDR欠損状態の存在について患者の癌細胞を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、HDR欠損状態を有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、HDR経路に由来する遺伝子内の遺伝子変異の存在について患者の癌細胞を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、遺伝子変異を有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、放射線、またはDNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される薬物を投与する工程を含む、癌治療レジメンに患者が反応する可能性が高いかどうかを判定するための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、癌治療レジメンに反応する可能性が高いと特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)LOHシグネチャーを有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、LOHシグネチャーを有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は患者を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)HDR欠損状態を有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、HDR欠損状態を癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、HDR欠損状態を有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は患者を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a)HDR経路に由来する遺伝子内に遺伝子変異を有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、遺伝子変異を癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、遺伝子変異を有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、放射線、またはDNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される薬物を投与する工程を含む、癌治療レジメンに反応する可能性について患者を評価するための方法を特徴とする。該方法は、(a) LOHシグネチャーを有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)LOHシグネチャーの存在に少なくとも部分的に基づいて、患者を、癌治療レジメンに反応する可能性が高いと診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者の癌細胞の診断分析を行うための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、LOHシグネチャーを有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者の癌細胞の診断分析を行うための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、HDR欠損状態を有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者の癌細胞の診断分析を行うための方法を特徴とする。該方法は、(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、HDR経路に由来する遺伝子内に遺伝子変異を有する癌細胞を有していると特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、放射線、またはDNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される薬物を投与する工程を含む、患者の癌細胞の診断分析を行って、癌治療レジメンに癌患者が反応する可能性が高いかどうかを判定する方法を特徴とする。該方法は、(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在を検出する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、癌治療レジメンに反応する可能性が高いと特定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者を、LOHシグネチャーを有する癌細胞を有していると診断するための方法を特徴とする。該方法は、(a)LOHシグネチャーを有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、LOHシグネチャーを有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者を、HDR欠損状態を有する癌細胞を有していると診断するための方法を特徴とする。該方法は、(a)HDR欠損状態を有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、HDR欠損状態を癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、HDR欠損状態を有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、患者を、HDR経路に由来する遺伝子内に遺伝子変異を有する癌細胞を有していると診断するための方法を特徴とする。該方法は、(a)遺伝子変異を有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、遺伝子変異を癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)患者を、遺伝子変異を有する癌細胞を有していると診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
別の局面において、本文書は、放射線、またはDNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される薬物を投与する工程を含む、患者を癌治療レジメンの候補であると診断するための方法を特徴とする。該方法は、(a)LOHシグネチャーを有する癌細胞を患者が含むことを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程、および(b)LOHシグネチャーの存在に少なくとも部分的に基づいて患者を、癌治療レジメンに反応する可能性が高いと診断する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。
特に定めのない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは等価な方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、適切な方法および材料を以下で説明する。本明細書で述べた全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全てが参照として組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は例示にしかすぎず、限定することを目的としない。
[本発明1001]
以下の工程を含む、癌細胞または該癌細胞のゲノムDNAにおいてLOHを評価するための方法:
(a)癌細胞または該癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域を検出する工程であって、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対でない、工程;および
(b)該少なくとも一対のヒト染色体中の該LOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程。
[本発明1002]
以下の工程を含む、癌細胞におけるBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子の状態を予測する方法:
該癌細胞において、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および
参照数を上回る該総数を、BRCA1遺伝子またはBRCA2遺伝子における欠損の可能性の増加と相関付ける工程。
[本発明1003]
以下の工程を含む、癌細胞におけるHDRの状態を予測する方法:
該癌細胞において、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および
参照数を上回る該総数を、HDRにおける欠損の可能性の増加と相関付ける工程。
[本発明1004]
以下の工程を含む、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/またはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法:
該癌患者に由来する癌細胞において、該癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および
参照数を上回る総数を、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性の増加と相関付ける工程。
[本発明1005]
以下の工程を含む、治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法:
該癌患者に由来する癌細胞において、該癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および
参照数を上回る該総数を、パクリタキセルまたはドセタキセルを含む治療レジメンに該癌患者が反応し得ない可能性の増加と相関付ける工程。
[本発明1006]
以下の工程を含む、癌を治療する方法:
(a)癌患者に由来する癌細胞または該癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;ならびに
(b)該LOH領域の総数が参照数を上回る場合に、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物を含む癌治療レジメンを、該癌患者に対して行う工程。
[本発明1007]
合計5個またはそれ以上の指標LOH領域を有すると判定された癌細胞を有していると特定された患者において癌を治療するのに有用である医薬を製造するための、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物の使用。
[本発明1008]
(a)癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体のゲノムDNAについて複数のシグナルを発生するように構成された、試料分析器、および
(b)該少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数を該複数のシグナルに基づいて算出するようにプログラムされた、コンピュータサブシステム
を備える、癌患者の該癌細胞のLOH状態を判定するためのシステム。
[本発明1009]
前記コンピュータサブシステムが、前記指標LOH領域の数を参照数と比較して、
(a)前記癌細胞中のBRCA1遺伝子および/もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性、
(b)該癌細胞中のHDRにおける欠損の可能性、または
(c)DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに前記癌患者が反応し得る可能性
を判定するようにプログラムされている、本発明1008のシステム。
[本発明1010]
コンピュータ上で実行する場合に、
ヒトXおよびY性染色体以外のヒト染色体の1つまたは複数に沿った任意のLOH領域の有無を検出する段階であって、該LOH領域の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上であるが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、段階;ならびに
1つまたは複数の染色体対中の該LOH領域の総数を決定する段階
を含む工程を実施する、コンピュータ可読媒体に組み入れられたコンピュータプログラム製品。
[本発明1011]
ヒトゲノムDNAの複数の多型領域にハイブリダイズすることができる、少なくとも500個のオリゴヌクレオチド;および
本発明1010のコンピュータプログラム製品
を含む、診断キット。
[本発明1012]
癌患者から得られたヒト癌細胞からの少なくとも1つの染色体対中の指標LOH領域の総数を決定するのに有用であり、かつ
(a)該癌細胞中のBRCA1遺伝子もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性の増加、
(b)該癌細胞中のHDRにおける欠損の可能性の増加、または
(c)DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性の増加
を検出するのに有用である診断キットを製造するための、ヒトゲノムDNAの複数の多型領域にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドの使用。
[本発明1013]
前記LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記癌細胞が卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記LOH領域の総数が、9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1016]
前記第1の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記参照数が、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、もしくは13個、またはそれ以上である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1007または1012の使用。
[本発明1019]
前記癌細胞が卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞である、本発明1007または1012の使用。
[本発明1020]
前記指標LOH領域の総数が、9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1007または1012の使用。
[本発明1021]
前記指標LOH領域の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1007または1012の使用。
[本発明1022]
前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1008または1009のシステム。
[本発明1023]
前記癌細胞が卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞である、本発明1008または1009のシステム。
[本発明1024]
前記指標LOH領域の総数が、9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1008または1009のシステム。
[本発明1025]
前記指標LOH領域の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1008または1009のシステム。
[本発明1026]
前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1027]
前記癌細胞が卵巣癌細胞、乳癌細胞、または食道癌細胞である、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1028]
前記指標LOH領域の総数が、9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1029]
前記指標LOH領域の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1030]
前記少なくとも一対のヒト染色体がヒト17番染色体でない、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1031]
前記指標LOH領域がヒト17番染色体に存在しない、本発明1007または1012の使用。
[本発明1032]
前記指標LOH領域がヒト17番染色体に存在しない、本発明1008または1009のシステム。
[本発明1033]
前記指標LOH領域がヒト17番染色体に存在しない、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1034]
前記DNA損傷物質が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチンであるか、前記アントラサイクリンがエピルビンシンもしくはドキソルビシンであるか、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであるか、または、前記PARP阻害物質が、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブである、本発明1004または1006の方法。
[本発明1035]
前記DNA損傷物質が白金系化学療法薬であるか、前記アントラサイクリンがエピルビンシンもしくはドキソルビシンであるか、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであるか、または、前記PARP阻害物質が、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブである、本発明1012の使用。
[本発明1036]
前記DNA損傷物質が白金系化学療法薬であるか、前記アントラサイクリンがエピルビンシンもしくはドキソルビシンであるか、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであるか、または、前記PARP阻害物質が、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブである、本発明1009のシステム。
[本発明1037]
前記DNA損傷物質が白金系化学療法薬であるか、前記アントラサイクリンがエピルビンシンもしくはドキソルビシンであるか、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであるか、または、前記PARP阻害物質が、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブである、本発明1010のコンピュータプログラム製品。
[本発明1038]
(a)癌細胞または該癌細胞から得られたゲノムDNAにおいて、該癌細胞からの代表的な数のヒト染色体対中のLOH領域を検出する工程;ならびに
(b)該LOH領域の数およびサイズを決定する工程
を含む、方法。
[本発明1039]
前記代表的な数のヒト染色体対が全ゲノムを代表する、本発明1038の方法。
[本発明1040]
特定のサイズのLOH領域の数の増加をHDRにおける欠損の可能性の増加と相関付ける工程をさらに含む、本発明1038の方法。
[本発明1041]
前記特定のサイズが、約1.5メガベース、2メガベース、2.5メガベース、3メガベース、4メガベース、5メガベース、6メガベース、7メガベース、8メガベース、9メガベース、10メガベース、11メガベース、12メガベース、13メガベース、14メガベース、15メガベース、16メガベース、17メガベース、18メガベース、19メガベース、20メガベース、25メガベース、30メガベース、35メガベース、40メガベース、45メガベース、50メガベース、75メガベース、または100メガベースより長く、かつ、前記LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、本発明1040の方法。
[本発明1042]
6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、もしくは13個、またはそれ以上の前記特定のサイズのLOH領域が、HDRにおける欠損の可能性の増加と相関付けられる、本発明1040または1041の方法。
[本発明1043]
以下の工程を含む、患者において予後を判定する方法:
(a)LOHシグネチャー(signature)を有する癌細胞を該患者が含むかどうかを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、該LOHシグネチャーを該癌細胞が有することを示し、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および
(b)(1)該LOHシグネチャーの存在に少なくとも部分的に基づいて、該患者の予後が比較的良好であると判定する工程;または
(b)(2)該LOHシグネチャーの非存在に少なくとも部分的に基づいて、該患者の予後が比較的不良であると判定する工程。
[本発明1044]
患者における、疾患の治療、乳癌、卵巣癌、肝臓癌、食道癌、肺癌、頭頚部癌、前立腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、および膵臓癌からなる群より選択される癌の治療において使用するための、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される治療物質を含む組成物であって、該患者が、該患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域を有しており、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、組成物。
[本発明1045]
前記LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1044の組成物。
[本発明1046]
前記LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1044の組成物。
[本発明1047]
前記第1の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1044の組成物。
[本発明1048]
前記参照数が、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、もしくは13個であるか、またはそれを上回る、本発明1044の組成物。
[本発明1049]
以下の工程を含む、患者において癌を治療する方法:
該患者に由来する試料において、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、LOHシグネチャーを該癌細胞が有することを示し、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;
該LOH領域の数から導き出された試験値を提供する工程;
該試験値を、参照集団における該LOH領域の数から導き出された1つまたは複数の参照値(例えば、平均、中央値、三分位値(tercile)、四分位数、五分位数など)と比較する工程;ならびに
少なくとも1つの該参照値を該試験値が上回る(例えば、該参照値の少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍;該参照値より少なくとも1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差大きい)ことを明らかにする該比較する工程に少なくとも部分的に基づいて、該患者に抗癌薬を投与するか、または、化学療法および/もしくは合成致死性の剤を含む治療レジメンを推奨もしくは処方もしくは開始する工程;あるいは
少なくとも1つの該参照値を該試験値が上回らない(例えば、該参照値の1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、または1/10以下;該参照値の1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差以下である)ことを明らかにする該比較する工程に少なくとも部分的に基づいて、化学療法および/または合成致死性の剤を含まない治療レジメンを推奨または処方または開始する工程。
[本発明1050]
前記LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、本発明1049の方法。
[本発明1052]
前記第1の長さが、約6メガベース、12メガベース、もしくは15メガベース、またはそれ以上である、本発明1049の方法。
[本発明1053]
前記参照数が、6、7、8、9、10、11、12、もしくは13であるか、またはそれを上回る、本発明1049の方法。
[本発明1054]
前記化学療法が、DNA損傷物質、アントラサイクリン、およびトポイソメラーゼI阻害物質からなる群より選択され、かつ/または、前記合成致死性の剤がPARP阻害薬である、本発明1049の方法。
[本発明1055]
前記DNA損傷物質が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチンであり、前記アントラサイクリンが、エピルビンシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、かつ/または、前記PARP阻害物質が、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブである、本発明1049の方法。
本発明の1つまたは複数の態様の詳細は以下の説明および添付の図面において示される。材料、方法、および実施例は例示にしかすぎず、限定することを目的としない。本発明の他の特徴、目的、および利点は説明および図面ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
SNPアレイを用いて決定された、1番染色体に沿って乳癌患者に由来する乳癌細胞の対立遺伝子量(allele dosage)をプロットしたグラフである。矢印はヘテロ接合性領域からLOH領域への遷移部を示す。 ハイスループットシークエンシングを用いて決定された、図1と同様に1番染色体に沿って同じ乳癌患者の乳癌細胞の対立遺伝子量をプロットしたグラフである。矢印はヘテロ接合性領域からLOH領域への遷移部を示す。 細胞(例えば、癌細胞)のゲノムをLOHシグネチャーについて評価するための例示的なプロセスのフローチャートである。 本明細書に記載の技法を実行するのに使用することができるコンピュータ装置およびモバイルコンピュータ装置の一例の図である。 62人のヒト患者に由来する卵巣癌細胞において検出されたLOH領域の長さ分布をプロットしたグラフである。補正された長さは、LOH領域によってカバーされる染色体腕の割合を指す。 インタクトなBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子または欠損したBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子を有する卵巣癌細胞試料からなる訓練セットを対象にして15Mbより長く、かつ染色体全体より短いLOH領域の数をプロットしたグラフである。丸のサイズは、このような数のLOH領域を有する試料の数と比例する。 インタクトなBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子または欠損したBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子を有する卵巣癌細胞試料からなる訓練セットおよび検証セットを対象にして15Mbより長く、かつ染色体全体より短いLOH領域の数をプロットしたグラフである。丸のサイズは、このような数のLOH領域を有する試料の数と比例する。 BRCA体細胞変異を有する卵巣癌細胞試料、BRCA生殖系列変異を有する卵巣癌細胞試料、BRCA1低発現を有する卵巣癌細胞試料、またはインタクトなBRCAを有する(BRCAが正常な)卵巣癌細胞試料を対象にして15Mbより長く、かつ染色体全体より短いLOH領域の数をプロットしたグラフである。丸のサイズは、このような数のLOH領域を有する試料の数と比例する。 BRCA欠損卵巣癌試料、HDR欠損/BRCAインタクト卵巣癌試料、およびHDRインタクト卵巣癌試料のパーセントを示した表である。 表示された癌の癌細胞株を対象にして15Mbより長く、かつ染色体全体より短いLOH領域の数をプロットしたグラフである。丸のサイズは、このような数のLOH領域を有する試料の数と比例する。 肺癌試料を対象にして15Mbより長く、かつ染色体全体より短いLOH領域の数をプロットしたグラフである。 HDR欠損を有する表示された癌または癌細胞株のパーセントをプロットしたグラフである。 15Mbより長く、かつ染色体全体より短い表示された数のLOH領域を有する29個の乳癌細胞株への曝露時のIC50値(カンプトテシンのLog10 (IC50)ならびに白金化合物(オキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン)、もしくはアントラサイクリン(ドキソルビシンおよびエピルビシン)についてはLog10 (IC50)値の平均、または15Mbより長く、かつ染色体全体より短い表示された数のLOH領域を有する27個の卵巣癌細胞株への曝露時のパクリタキセルのIC50値(Log10 (IC50))をプロットしたグラフを含む。破線によって閾値を9に示した。 15Mbより長く、かつ染色体全体より短い表示された数のLOH領域を有する29個の乳癌細胞株への曝露時の白金化合物(オキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン)のLog10(IC50)値の平均をプロットした、図13からのグラフのラベル付きバージョンである。 LOHの遺伝子座および領域を特定するための例示的なコンピュータ計算プロセスのフローチャートである。 LOH領域の長さの割合、対染色体腕の長さについて補正されたこれらの領域の長さを示す。この図にある補正された最大の値は、染色体全体にわたるLOHに対応する2に等しい。 腫瘍試料におけるHRDスコアを示す。青色の丸:BRCA1欠損試料またはBRCA2欠損試料。赤色の丸:BRCA1インタクト試料およびBRCA2インタクト試料。青色の丸および赤色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。第1のコホートのHRDスコア(152個の試料のうち46個がBRCA1欠損またはBRCA2欠損であった)。 腫瘍試料におけるHRDスコアを示す。青色の丸:BRCA1欠損試料またはBRCA2欠損試料。赤色の丸:BRCA1インタクト試料およびBRCA2インタクト試料。青色の丸および赤色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。第2のコホートのHRDスコア(53個の試料のうち19個がBRCA1欠損またはBRCA2欠損であった)。 腫瘍試料におけるHRDスコアを示す。青色の丸:BRCA1欠損試料またはBRCA2欠損試料。赤色の丸:BRCA1インタクト試料およびBRCA2インタクト試料。青色の丸および赤色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。第3のコホートのHRDスコア(435の試料のうち146個がBRCA1欠損またはBRCA2欠損であった)。 腫瘍試料におけるHRDスコアを示す。青色の丸:BRCA1欠損試料またはBRCA2欠損試料。赤色の丸:BRCA1インタクト試料およびBRCA2インタクト試料。青色の丸および赤色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。3つ全てのコホートからの複合データのHRDスコア。横列A:BRCA1欠損遺伝子、またはBRCA2欠損遺伝子、またはRAD51C欠損遺伝子のいずれかを有する224個の試料;B:84個のBRCA1変異体;C:43個のBRCA2変異体;D:BRCA1低発現またはBRCA1メチル化を有する82個の試料;E:13個のRAD51Cメチル化試料。赤色の丸:BRCA1、BRCA2、およびRAD51Cインタクト遺伝子を有する416個の試料。 癌細胞株におけるHRDスコアの比較。赤色の丸:インタクトなBRCA1またはBRCA2を有する細胞株。A:30個のインタクトな非卵巣細胞株;B:22個のインタクトな卵巣細胞株。緑色の丸:BRCA1ヘテロ接合性変異またはBRCA2ヘテロ接合性変異の6個のキャリア。紫色の丸:BRCA1またはBRCA2のいずれかにおける復帰変異を伴うホモ接合性変異の2個のキャリア。青色の丸:BRCA1もしくはBRCA2のいずれかにおけるホモ接合性変異を有するかまたはBRCA1がメチル化された7個のキャリア。緑色の丸、赤色の丸、青色の丸、および紫色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。 中央値で分けられたHRDスコアを対象にした術後全生存期間のカプラン・マイヤープロット。これらのデータは、コピー数データおよび生存情報が入手可能なTCGAデータセットからの507個の試料を用いて作成した。高HRDスコアおよび低HRDスコアを有する試料の全生存期間の中央値は、それぞれ1499(95％CI=(1355〜1769))日および1163(95％CI=(1081〜1354))日であった。 第1のコホートを対象にして異なるLOH領域の長さのカットオフについて算出されたLOHスコアとHR欠損の間の相関関係を示す。対応するlog10(p値)はy軸上にある。LOH領域のサイズのカットオフ間の関係およびLOHスコアとHR欠損との相関関係の有意性を調べた。この図は、LOHの長さのカットオフが容易に11〜21Mbになり得ることを示す。一部の好ましい態様では、その間隔のほぼ真ん中にある15Mbのカットオフを使用することができる。なぜなら、15Mbのカットオフはデータに存在する統計ノイズに対する感度が高いことが見出されたからである。 3つ全てのコホートからの複合データを対象にした、BRCA1欠損試料およびBRCA2欠損試料の3つの群におけるLOHスコアの比較を示す。横列A:49個のBRCA1生殖系列変異キャリア;B:25個のBRCA1体細胞変異キャリア;C:82個のBRCA1メチル化またはBRCA1低発現を有する試料;D:27個のBRCA2生殖系列変異キャリア;E:9個のBRCA2体細胞変異キャリア。 BRCA1欠損試料、BRCA2欠損試料、およびRAD51C欠損試料のLOHスコアの比較を示す。青色の丸はBRCA1欠損試料に対応し、赤色の丸はBRCA2欠損試料に対応し、緑色の丸はRAD51C欠損試料に対応する。赤色の丸、青色の丸、および緑色の丸の面積の合計は同じである。それぞれの丸の1つ1つの面積は、対応する数のLOH領域を有する試料の数と比例する。
詳細な説明
本文書は、LOHシグネチャーの存在について試料(例えば、癌細胞)を評価することに関与する方法および材料を提供する。例えば、本文書は、細胞(例えば、ヒト癌細胞)がLOHシグネチャー(例えば、HDR欠損LOHシグネチャー)を含有するかどうかを判定するための方法および材料を提供する。
一般的に、各染色体(男性の各常染色体)上の同じ遺伝子座に存在する配列を比較することによって、細胞ゲノム内で特定の遺伝子座がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかを明らかにすることができる。典型的に、個体は生物学的父親から1コピー、生物学的母親から1コピーを受け取るので、ヒトゲノム内の多型遺伝子座は一般的に個体内でヘテロ接合性である。場合によっては、2人の生物学的親から同一のコピーを受け継いだ結果として個体内にある多型遺伝子座または一連の多型遺伝子座はホモになる。
ヘテロ接合性の消失(LOH)は、いくつかの機構の結果として生じ得る。例えば、場合によっては、体細胞内にある一方の染色体の一領域が欠失することがある。影響を受けた細胞のゲノム内に存在するその領域が(2コピーではなく)1コピーしかないので、他方の染色体(男性の他方の非性染色体)に依然として残っている領域がLOH領域となる。このLOH領域は(例えば、約1.5Mb未満の長さから染色体の全長に等しい長さまで)任意の長さでよい。このタイプのLOH事象によってコピー数が減少する。他の場合では、体細胞内にある一方の染色体(男性の1本の非性染色体)の一領域が、他方の染色体に由来する一コピーの該領域で置換され、それによって、置換された領域内に存在していた可能性のあるヘテロ接合性が無くなることがある。このような場合、各染色体に依然として残っている領域がLOH領域となり、コピーニュートラル(copy neutral)LOH領域とも呼ばれることがある。コピーニュートラルLOH領域は(例えば、約1.5Mb未満の長さから染色体の全長に等しい長さまで)任意の長さでよい。
本明細書に記載のように、評価されている細胞のゲノムが、(a)約1.5メガベースより長く(例えば、約2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、または100メガベース(Mb)より長く、好ましくは約14または15または16メガベースより長く、より好ましくは約15メガベースより長く)、かつ(b)LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、5個もしくはそれ以上(例えば、6個もしくはそれ以上、7個もしくはそれ以上、8個もしくはそれ以上、9個もしくはそれ以上、10個もしくはそれ以上、11個もしくはそれ以上、12個もしくはそれ以上、13個もしくはそれ以上、14個もしくはそれ以上、15個もしくはそれ以上、16個もしくはそれ以上、17個もしくはそれ以上、18個もしくはそれ以上、19個もしくはそれ以上、または20個もしくはそれ以上)のLOH領域を含有する場合に、細胞試料(例えば、癌細胞試料)は「ポジティブLOHシグネチャー状態」(または、代わりに、「HDR欠損LOHシグネチャー」と呼ばれる)を有すると特定されることができる。場合によっては、評価されている細胞のゲノムが、(a)約15Mbより長く、(b)該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い9個またはそれ以上のLOH領域を含有する場合に、癌細胞試料はポジティブLOHシグネチャー状態を有すると特定されることができる。特に定めのない限り、「指標LOH領域」という用語は、ヒトX/Y性染色体対以外の一対のヒト染色体中にあり、ヘテロ接合性の消失によって特徴付けられ、長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上であるが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短い、LOH領域を指す。LOH領域を含有する染色体全体の長さは、生殖系列細胞中または非腫瘍体細胞中の対応する染色体対の短い方の染色体の長さを調べることによって決定されてもよい。一部の態様において、指標LOH領域は、約2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、もしくは100メガベース(Mb)であるか、またはそれ以上であり(好ましくは、約14または15メガベースより以上長い)、かつそのLOH領域を含有する染色体全体の長さより短い任意のLOH領域である。
ポジティブLOHシグネチャー(本明細書において「HDR欠損LOHシグネチャー」とも呼ばれる)を有すると特定された細胞(例えば、癌細胞)は、HDR欠損を有する可能性が高いと、および/またはHDR経路の1つもしくは複数の遺伝子における欠損状態欠損を有する可能性が高いと分類することができる。例えば、ポジティブLOHシグネチャー状態を有すると特定された癌細胞はHDR欠損状態を有する可能性が高いと分類することができる。場合によっては、ポジティブLOHシグネチャー状態を有すると特定された癌細胞は、HDR経路の1つまたは複数の遺伝子における欠損状態を有する可能性が高いと分類することができる。本明細書で使用する、遺伝子の欠損状態とは、遺伝子またはその産物の配列、構造、発現、および/または活性が正常と比較して欠損していることを意味する。例には、mRNA発現またはタンパク質発現が低いまたは無い、有害な変異、高度メチル化、活性(例えば、酵素活性、別の生体分子に結合する能力)の低減などが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する、経路(例えば、HDR経路)の欠損状態とは、その経路にある少なくとも1つの遺伝子(例えば、BRCA1)が欠損していることを意味する。高度に有害な変異の例には、フレームシフト変異、停止コドン変異、およびRNAスプライシングの変化につながる変異が含まれる。HDR経路遺伝子の欠損状態は癌細胞における相同組換え修復の欠損または活性低下をもたらし得る。HDR経路遺伝子の例には、表1に列挙した遺伝子が含まれるが、それに限定されるわけではない。
（表１）選択されたHDR経路遺伝子
Figure 0006700333
HDR経路遺伝子内に存在し得る遺伝子変異の例には、表2に列挙した遺伝子変異が含まれるが、それに限定されるわけではない。
（表２）HDR経路の選択された遺伝子内の可能性のある遺伝子変異
Figure 0006700333
場合によっては、細胞試料(例えば、癌細胞試料)は、染色体全体をカバーする多数のLOH領域(例えば、少なくとも7個、8個、9個、10個、またはそれ以上のLOH領域)を有すると特定されることができる。染色体全体をカバーする多数のLOH領域を有すると特定された細胞(例えば、癌細胞)は、HDR熟達(proficiency)、すなわちインタクトなHDR経路を有する可能性が高いと分類することができる。例えば、染色体全体をカバーする多数のLOH領域を有すると特定された癌細胞は、インタクトなBRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子を有する可能性が高いと特定されることができる。
本明細書に記載のように、LOH遺伝子座(ならびにLOH領域のサイズおよび数)を特定することは、最初に、様々なゲノム遺伝子座(例えば、SNP遺伝子座、大規模配列決定における1つ1つの塩基)において試料の遺伝子型を決定すること、次に、ホモ接合性遺伝子座がLOH事象によるものであるかどうかを判定することを含んでもよい。任意の適切な技法を用いて、細胞ゲノム内にある関心対象の遺伝子座における遺伝子型を決定することができる。例えば、一塩基多型(SNP)アレイ(例えば、ヒトゲノムワイドSNPアレイ)、関心対象の遺伝子座の標的化配列決定(例えば、SNP遺伝子座およびその周囲の配列の配列決定)、ならびに非標的化配列決定(例えば、全エクソーム、トランスクリプトーム、またはゲノム配列決定)さえも用いて、遺伝子座がホモ接合性またはヘテロ接合性であると特定することができる。場合によっては、染色体の長さにわたって遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性を分析し、ホモ接合性またはヘテロ接合性の領域の長さを決定することができる。例えば、SNPアレイ結果を用いて、染色体に沿って間隔をおいて並んでいる(例えば、約25kb〜約100kbの間隔をおいて並んでいる)SNP位置からなる領域を評価して、染色体に沿ったホモ接合性領域の存在だけでなく、この領域の長さも決定することができる。SNPアレイからの結果を用いて、染色体に沿って対立遺伝子量をプロットしたグラフを作成することができる。SNPiの対立遺伝子量diは、2つの対立遺伝子(AiおよびBi)の補正シグナル強度から算出することができる:di=Ai/(Ai+Bi)。このようなグラフの一例を図1に示した。本発明において有用な核酸アレイ上の非常に多くのばらつきは当技術分野において公知である。これらには、以下の様々な実施例において用いられるアレイ(例えば、実施例3のAffymetrix 500K GeneChipアレイ;実施例4のAffymetrix OncoScan(商標)FFPE Express 2.0 Services(以前はMIP CN Services))が含まれる。
複数の遺伝子座(例えば、SNP)について試料の遺伝子型が決定されると、一般的な技法を用いてLOHの遺伝子座および領域を特定することができる。ホモ接合性がLOH事象によるものであるかどうかを判定する手法の1つは、体細胞遺伝子型を生殖系列と比較する手法である。例えば、生殖系列(例えば、血液)試料および体細胞(例えば、腫瘍)試料の両方において複数の遺伝子座(例えば、SNP)の遺伝子型を決定することができる。各試料の遺伝子型を比較して(典型的には、コンピュータ計算により比較して)、生殖系列細胞ゲノムがヘテロ接合性であり、体細胞ゲノムがホモ接合性であるかどうかを判定することができる。このような遺伝子座はLOH遺伝子座であり、このような遺伝子座の領域はLOH領域である。
ホモ接合性がLOH事象によるものであるかどうかを判定するために、コンピュータ計算法も使用することができる。このような技法は、分析および比較のために生殖系列試料が利用可能でない場合に特に有用である。例えば、アルゴリズム、例えば、他の場所に記載のアルゴリズムを使用し、SNPアレイからの情報を使用してLOH領域を検出することができる(Nannya et al., Cancer Res. (2005) 65:6071-6079(2005))。典型的に、これらのアルゴリズムは、良性組織による腫瘍試料の汚染をはっきりと考慮に入れない。Abkevichらに対する国際出願番号PCT/US2011/026098; Goransson et al., PLoS One(2009)4(6):e6057を参照されたい。この汚染は、多くの場合、LOH領域の検出を困難にするほど十分にひどい。汚染があってもLOHを特定する本発明による改善された分析法には、下記のコンピュータソフトウェア製品に組み入れられた分析法が含まれる。
以下は一例である。2つの対立遺伝子AおよびBのシグナルの観察された比が2:1である場合に、2つの可能性がある。第1の可能性は、癌細胞が、正常細胞により50％汚染されている試料中で対立遺伝子Bが欠失したLOHを有する可能性である。第2の可能性は、正常細胞に汚染されていない試料中で、LOHは無いが、対立遺伝子Aが重複している可能性である。本明細書に記載のコンピュータプログラムとしてアルゴリズムを実行して、遺伝子型(例えば、SNP遺伝子型)データに基づいてLOH領域を再構築することができる。このアルゴリズムの特徴の1つは、最初に、各遺伝子座(例えば、SNP)において対立遺伝子特異的コピー数(ASCN)を再構築することである。ASCNは父性対立遺伝子および母性対立遺伝子両方のコピー数である。次いで、ASCNの一方(父性または母性)が0であるSNP領域としてLOH領域が決定される。このアルゴリズムは尤度関数を最大にすることに基づいてもよく、各遺伝子座(例えば、SNP)における(ASCNではなく)全コピー数を再構築するように設計された以前に述べられたアルゴリズムに概念的に類似してもよい。Abkevichらに対する国際出願番号PCT/US2011/026098を参照されたい。尤度関数は全ての遺伝子座のASCN、良性組織による汚染のレベル、全ゲノムにわたって平均された全コピー数、および試料特異的雑音レベルにわたって最大にすることができる。アルゴリズムの入力データは、(1)各遺伝子座の両対立遺伝子の試料特異的な標準化されたシグナル強度ならびに(2)公知のASCNプロファイルを有する多数の試料の分析に基づいて定義されたアッセイ法特異的な(異なるSNPアレイおよび配列ベースアプローチに特異的な)パラメータセットを含んでもよいか、またはこれらからなってもよい。
場合によっては、核酸配列決定法を用いて、遺伝子座をホモ接合性またはヘテロ接合性であると特定することができる。例えば、細胞試料(例えば、癌細胞試料)からゲノムDNAを抽出および断片化することができる。QIAamp(商標)DNA Mini Kit(Qiagen(商標))、MagNA(商標)Pure DNA Isolation Kit(Roche Applied Science(商標))、およびGenElute(商標)Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit(Sigma-Aldrich(商標))などの市販のキットを含むが、それに限定されるわけではない任意の適切な方法を用いてゲノム核酸を抽出および断片化することができる。抽出および断片化すると、標的化配列決定または非標的化配列決定を行って、遺伝子座における試料の遺伝子型を決定することができる。例えば、全ゲノム、全トランスクリプトーム、または全エクソーム配列決定を行って、数百万、さらには数十億の塩基対で遺伝子型を決定することができる(すなわち、塩基対が、評価しようとする「遺伝子座」でもよい)。
場合によっては、マイクロアレイ分析の代替として、公知の多型遺伝子座(例えば、SNPおよび周囲の配列)の標的化配列決定を行うことができる。例えば、この目的のために設計されたキット(例えば、Agilent SureSelect(商標)、Illumina TruSeq Capture(商標)、およびNimblegen SeqCap EZ Choice(商標))を用いて、ゲノムDNAを、分析しようとする遺伝子座(例えば、SNP位置)を含有する断片について濃縮することができる。例えば、分析しようとする遺伝子座を含有するゲノムDNAをビオチン化捕獲RNA断片にハイブリダイズして、ビオチン化RNA/ゲノムDNA複合体を形成することができる。または、DNA捕獲プローブを利用して、ビオチン化DNA/ゲノムDNAハイブリッドを形成してもよい。ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズおよび磁力を用いて、ビオチン化RNA/ゲノムDNA複合体を、ビオチン化RNA/ゲノムDNA複合体内に存在しないゲノムDNA断片から分離することができる。得られたビオチン化RNA/ゲノムDNA複合体を処理して、捕獲されたRNAを磁気ビーズから取り出し、それによって、分析しようとする遺伝子座を含有するインタクトなゲノムDNA断片を残すことができる。分析しようとする遺伝子座を含有する、これらのインタクトなゲノムDNA断片を、例えば、PCR法を用いて増幅することができる。増幅されたゲノムDNA断片は、ハイスループットシークエンシング技術または次世代配列決定技術、例えば、Illumina HiSeq(商標)、 Illumina MiSeq(商標)、Life Technologies SoLID(商標)、またはIon Torrent(商標)、もしくはRoche 454(商標)を用いて配列決定することができる。
本明細書に記載のマイクロアレイ分析と同様に、ゲノムDNA断片からの配列決定結果を用いて遺伝子座をホモ接合性またはヘテロ接合性であると特定することができる。場合によっては、染色体の長さにわたって遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性を分析して、ホモ接合性またはヘテロ接合性の領域の長さを決定することができる。例えば、染色体に沿って間隔をおいて並んでいる(例えば、約25kb〜約100kbの間隔をおいて並んでいる)SNP位置からなる領域を配列決定によって評価し、配列決定結果を用いて、染色体に沿ったホモの領域の存在を判定することだけでなく、このLOH領域の長さも決定することができる。得られた配列決定結果を用いて、染色体に沿って対立遺伝子量をプロットしたグラフを作成することができる。SNPiの対立遺伝子量diは、2つの対立遺伝子(AiおよびBi)の補正された捕獲プローブ数から算出することができる:di=Ai/(Ai+Bi)。このようなグラフの一例を図2に示した。(生殖系列におけるホモ接合性とは対照的に)ホモ接合性がLOH事象によるものであるかどうかは本明細書に記載のように判定することができる。
場合によっては、選択プロセスを使用し、遺伝子座がホモ接合性またはヘテロ接合性であると特定するように構成されたアッセイ法(例えば、SNPアレイベースアッセイ法および配列決定ベースアッセイ法)を使用して、評価しようとする遺伝子座(例えば、SNP遺伝子座)を選択することができる。例えば、細胞ゲノム内で遺伝子座がホモ接合性またはヘテロ接合性であると特定するように構成されたSNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法に含めるために任意のヒトSNP位置を選択することができる。場合によっては、ヒトゲノム内に存在する50万、100万個、150万個、200万個、250万個、またはそれ以上のSNP位置を評価して、(a)Y染色体に存在しない、(b)ミトコンドリアSNPでない、(c)白人において少なくとも約5パーセントのマイナー対立遺伝子頻度を有する、(d)白人以外の3人種(例えば、中国人、日本人、およびヨルバ族)において少なくとも約1パーセントのマイナー対立遺伝子頻度を有する、ならびに/または(e)4人種のいずれにおいてもハーディ・ワインベルグ平衡から有意に逸脱しないSNPを特定することができる。場合によっては、(a)〜(e)の基準を満たす、100,000個を超える、150,000個を超える、または200,000個を超えるヒトSNPを選択することができる。(a)〜(e)の基準を満たすヒトSNPのうち、SNPが白人において高度の対立遺伝子頻度を有し、いくらか均一に間隔を置いてヒトゲノムをカバーし(例えば、約25kb〜約500kbごとに少なくとも1つのSNP)、4人種のいずれにおいても別の選択されたSNPと連鎖不平衡にないようにSNP群(例えば、上位110,000個のSNP)を選択することができる。場合によっては、約4万個、5万個、6万個、7万個、8万個、9万個、10万個、11万個、12万個、13万個、またはそれ以上のSNPを、これらの基準を満たすものとして選択し、ヒトゲノム全体にわたってLOH領域を特定するように構成されたアッセイ法に含めることができる。例えば、SNPアレイベースアッセイ法を用いた分析のために、約70,000〜約90,000個(例えば、約80,000個)のSNPを選択することができる。配列決定ベースアッセイ法を用いた分析のために、約45,000〜約55,000個(例えば、約54,000個)のSNPを選択することができる。
本明細書に記載のように、細胞試料を評価して、試料の細胞のゲノムが、LOHシグネチャーを含有するかどうか、LOHシグネチャーを欠くかどうか、染色体全体をカバーするLOH領域の数が増加しているかどうか、または染色体全体をカバーするLOH領域の数の増加していないかどうかを判定することができる。任意の適切なタイプの試料を評価することができる。例えば、癌細胞を含有する試料を評価して、癌細胞のゲノムが、LOHシグネチャーを含有するかどうか、LOHシグネチャーを欠くかどうか、染色体全体をカバーするLOH領域の数が増加しているかどうか、または染色体全体をカバーするLOH領域の数の増加していないかどうかを判定することができる。本明細書に記載のように評価することができる癌細胞を含有する試料の例には、腫瘍生検試料(例えば、乳腺腫瘍生検試料)、ホルマリン固定しパラフィン包埋した癌細胞含有組織試料、コア針生検材料、穿刺吸引液、および腫瘍から脱落した癌細胞を含有する試料(例えば、血液、尿、または他の体液)が含まれるが、それに限定されるわけではない。ホルマリン固定しパラフィン包埋した組織試料の場合、試料を、前記のキット(例えば、QuickExtract(商標)FFPE DNA Extraction Kit(Epicentre(商標))およびQIAamp(商標)DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen(商標)))を含むが、これに限定されない、FFPE組織に最適化されたゲノムDNA抽出キットを用いたDNA抽出によって調製することができる。
場合によっては、評価しようとする癌細胞試料内の非癌細胞の数を最小化するために、組織試料に対してレーザー切開法を行うことができる。場合によっては、抗体ベースの精製法を用いて、癌細胞を濃縮すること、および/または非癌細胞を枯渇させることができる。癌細胞濃縮に使用することができる抗体の例には、抗EpCAM、抗TROP-2、抗c-Met、抗葉酸結合タンパク質、抗N-カドヘリン、抗CD318、抗抗間葉(anti-antimesencymal)幹細胞抗原、抗Her2、抗MUCl、抗EGFR、抗サイトケラチン(例えば、サイトケラチン7、サイトケラチン20など)、抗カベオリン-1、抗PSA、抗CA125、および抗サーファクタントタンパク質抗体が含まれるが、それに限定されるわけではない。
本明細書に記載の方法および材料を用いて任意のタイプの癌細胞を評価することができる。例えば、乳癌細胞、卵巣癌細胞、肝臓癌細胞、食道癌細胞、肺癌細胞、頭頚部癌細胞、前立腺癌細胞、結腸癌細胞、直腸癌細胞、または結腸直腸癌細胞、および膵臓癌細胞を評価して、癌細胞のゲノムが、LOHシグネチャーを含有するかどうか、LOHシグネチャーを欠くかどうか、染色体全体をカバーするLOH領域の数が増加しているかどうか、または染色体全体をカバーするLOH領域の数の増加していないかどうかを判定することができる。一部の態様において、癌細胞は卵巣癌、乳癌、肺癌、または食道癌の原発癌細胞または転移癌細胞である。
LOHシグネチャーの有無について癌細胞のゲノムを評価する場合に、1対または複数の対(例えば、1対、2対、3対、4対、5対、6対、7対、8対、9対、10対、11対、12対、13対、14対、15対、16対、17対、18対、19対、20対、21対、22対、または23対)の染色体を評価することができる。場合によっては、癌細胞のゲノムは、1対または複数の対(例えば、1対、2対、3対、4対、5対、6対、7対、8対、9対、10対、11対、12対、13対、14対、15対、16対、17対、18対、19対、20対、21対、22対、23対)の染色体を用いてLOHシグネチャーの有無について評価される。
場合によっては、この分析から、ある特定の染色体を排除することが有益な可能性がある。例えば、女性の場合、評価しようとする対はX性染色体対を含んでもよい。これに対して、男性の場合、一対の任意の常染色体(すなわち、X性染色体およびY性染色体の対以外の任意の対)を評価することができる。別の例として、場合によっては、分析から17番染色体対を排除してもよい。ある特定の癌では、ある特定の染色体は普通よりも高レベルのLOHを有することが判定されている。従って、本明細書に記載のように試料を分析する場合に、これらの癌を有している患者から、このような染色体を排除することが有益な可能性がある。場合によっては、試料は卵巣癌を有している患者に由来し、排除される染色体は17番染色体である。
染色体全体をカバーする多数のLOH領域の有無について癌細胞のゲノムを評価する場合に、10対またはそれ以上(例えば、13対、16対、19対、または23対)の染色体を評価することができる。女性の場合、評価しようとする対はX性染色体対を含んでもよい。これに対して、男性の場合、一対の任意の常染色体(すなわち、X性染色体およびY性染色体の対以外の任意の対)を評価することができる。場合によっては、分析から17番染色体対を排除してもよい。場合によっては、試料は卵巣癌を有している患者に由来し、排除される染色体は17番染色体である。場合によっては、癌細胞のゲノムは、10対またはそれ以上(例えば、13対、16対、19対、または23対)の染色体を用いて、染色体全体をカバーする多数のLOH領域の有無について評価される。
従って、予め定義された数の染色体を分析して、指標LOH領域の総数、好ましくは、9メガベース超、10メガベース超、12メガベース超、14メガベース超、より好ましくは15メガベース超の長さのLOH領域の総数を決定してもよい。代わりに、またはさらに、特定された全ての指標LOH領域のサイズを合計して、指標LOH領域の全長を入手してもよい。
ポジティブLOHシグネチャー状態を分類するために、指標LOH領域の総数について前述された参照数は、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、19個、20個であっても、またはそれを上回ってもよく、好ましくは5、好ましくは8、より好ましくは9または10、最も好ましくは10でもよい。指標LOH領域の全長(例えば、長さの合計)の参照数は、約75、90、105、120、130、135、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500メガベースであっても、またはそれを上回ってもよく、好ましくは約75メガベースであってもまたはそれを上回ってもよく、好ましくは約90もしくは105メガベースであってもまたはそれを上回ってもよく、より好ましくは約120もしくは130メガベースであってもまたはそれを上回ってもよく、より好ましくは約135メガベースであってもまたはそれを上回ってもよく、最も好ましくは約150メガベースであってもまたはそれを上回ってもよい。
一部の特定の態様において、約14または15メガベースを超える長さのLOH領域の総数が決定され、約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、18個、19個、または20個の参照数と比較される。代わりに、またはさらに、約14または15メガベースを超える長さのLOH領域の全長が決定され、約75、90、105、120、130、135、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、または500メガベースの参照数と比較される。
一部の態様において、患者試料中のLOH領域の数(もしくは長さの合計、またはいずれかから得られた試験値もしくはスコア)は、参照の少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍である場合に参照を「上回る」とみなされ、その上、一部の態様では、参照より少なくとも1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差大きい場合に参照を「上回る」とみなされる。逆に、一部の態様において、患者試料中のLOH領域の数(もしくは長さの合計、またはいずれかから得られた試験値もしくはスコア)は、参照の1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、または1/10以下である場合に参照「を上回らない」と見なされ、その上、一部の態様では、参照の1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差以下である場合に参照より「上回らない」と見なされる。
一部の態様において、参照数(または長さ、値、もしくはスコア)は、関連する参照集団から得られる。このような参照集団は、(a)試験されている患者と同じ癌を有している患者、(b)同じ癌サブタイプを有している患者、(c)同様の遺伝子特徴または他の臨床特徴もしくは分子特徴を有する癌を有している患者、(d)ある特定の治療に反応した患者、(e)ある特定の治療に反応しなかった患者、(f)明らかに健常な患者(例えば、癌を有さない患者または少なくとも試験された患者の癌を有さない患者)などを含んでもよい。参照数(または長さ、値、もしくはスコア)は、(a)参照集団に概して見られる数(または長さ、値、もしくはスコア)を代表するものでもよく、(b)参照集団に概してまたはある特定の部分母集団に見られる数(または長さ、値、もしくはスコア)の平均値(average)(平均(mean)、中央値など)でもよく、(c)(i)それぞれの数(または長さ、値、もしくはスコア)あるいは(ii)有すると見出された臨床特徴(例えば、反応の強さ、予後(癌特異的死亡までの時間を含む)など)によってランク付けされるように、参照集団の三分位値(tercile)、四分位数、五分位数などで見られる数(または長さ、値、もしくはスコア)(例えば、平均値、例えば、平均または中央値)を代表するものでもよい。
本明細書に記載のように、ポジティブLOHシグネチャー状態を有すると特定された癌細胞を有している患者は、ポジティブLOHシグネチャー状態に少なくとも部分的に基づいて、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高いと分類されることができる。例えば、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を有している患者は、ポジティブLOHシグネチャー状態に少なくとも部分的に基づいて、DNA損傷物質、合成致死性の剤(例えば、PARP阻害物質)、放射線、またはその組み合わせの使用を含む癌治療レジメンに反応する可能性が高いと分類することができる。好ましくは、患者は未治療患者である。DNA損傷物質の例には、白金系化学療法薬(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、およびピコプラチン)、アントラサイクリン(例えば、エピルビシンおよびドキソルビシン)、トポイソメラーゼI阻害物質(例えば、カンポテシン、トポテカン、およびイリノテカン)、DNA架橋剤、例えば、マイトマイシンC、ならびにトリアゼン化合物(例えば、ダカルバジンおよびテモゾロミド)が含まれるが、それに限定されるわけではない。合成致死性の治療アプローチは、典型的に、ある特定の腫瘍細胞の生存に特に重要な生物学的経路からの少なくとも1つの重要な成分を阻害する作用物質を投与することを伴う。例えば、腫瘍細胞に相同修復経路欠損(例えば、本発明に従って決定される相同修復経路欠損)がある場合に、ポリADPリボースポリメラーゼの阻害物質(または白金薬物、二重鎖切断修復阻害物質など)が、このような腫瘍に特によく効く場合がある。なぜなら、生存に重要な2つの経路が(一方は生物学的に、例えば、BRCA1変異により、他方は合成的に、例えば、経路薬物の投与により)遮断されるからである。癌療法の合成致死性のアプローチは、例えば、O'Brien et al., Converting cancer mutations into therapeutic opportunities, EMBO MOL. MED. (2009)1:297-299に記載されている。合成致死性の剤の例には、相同修復欠損腫瘍細胞ではPARP阻害物質または二重鎖切断修復阻害物質、PTEN欠損腫瘍細胞ではPARP阻害物質、MSH2欠損腫瘍細胞ではメトトレキセートなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。PARP阻害物質の例には、オラパリブ、イニパリブ、およびベリパリブ(veliparib)が含まれるが、それに限定されるわけではない。二重鎖切断修復阻害物質の例には、KU55933(ATM阻害物質)およびNU7441(DNA-PKcs阻害物質)が含まれるが、それに限定されるわけではない。ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高いという分類の基礎をなすポジティブLOHシグネチャー状態に加えて使用することができる情報の例には、以前の治療結果、生殖系列もしくは体細胞のDNA変異、遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイリング(例えば、ER/PR/HER2状態、PSAレベル)、腫瘍組織学(例えば、腺癌、扁平上皮癌、漿液性乳頭癌、粘液性癌、浸潤性腺管癌、非浸潤性乳管癌(非侵襲的)など)、病期、腫瘍または癌の悪性度(例えば、高分化、中分化、もしくは低分化(例えば、Gleason、modified Bloom Richardson)など)、以前の治療コースの回数などが含まれるが、それに限定されるわけではない。
ある特定の癌治療レジメン(例えば、DNA損傷物質、PARP阻害物質、放射線、またはその組み合わせの使用を含む癌治療レジメン)に反応する可能性が高いと分類されると、癌患者はこのような癌治療レジメンで治療することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。問題となっている癌を治療するための任意の適切な方法を用いて、ポジティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定された癌患者を治療することができる。例えば、白金系化学療法薬または白金系化学療法薬の組み合わせを用いて、他の場所で記載のように癌を治療することができる(例えば、米国特許第3,892,790号、同第3,904,663号、同第7,759,510号、同第7,759,488号、および同第7,754,684号を参照されたい)。場合によっては、アントラサイクリンまたはアントラサイクリンの組み合わせを用いて、他の場所で記載のように癌を治療することができる(例えば、米国特許第3,590,028号、同第4,138,480号、同第4,950,738号、同第6,087,340号、同第7,868,040号、および同第7,485,707号を参照されたい)。場合によっては、トポイソメラーゼI阻害物質またはトポイソメラーゼI阻害物質の組み合わせを用いて、他の場所で記載のように癌を治療することができる(例えば、米国特許第5,633,016号および同第6,403,563号を参照されたい)。場合によっては、PARP阻害物質またはPARP阻害物質の組み合わせを用いて、他の場所で記載のように癌を治療することができる(例えば、米国特許第5,177,075号、同第7,915,280号、および同第7,351,701号を参照されたい)。場合によっては、放射線を用いて、他の場所で記載のように癌を治療することができる(例えば、米国特許第5,295,944号を参照されたい)。場合によっては、放射線治療と共に、または放射線治療を伴わずに、異なる作用物質を含む組み合わせ(例えば、白金系化学療法薬、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、および/またはPARP阻害物質のいずれかを含む組み合わせ)を用いて癌を治療することができる。場合によっては、併用療法は、前記の作用物質または治療のいずれか(例えば、DNA損傷物質、PARP阻害物質、放射線、またはその組み合わせ)を別の作用物質または治療、例えば、タキサン剤(例えば、ドキセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン)、増殖因子阻害物質もしくは増殖因子受容体阻害物質(例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、パニツムマブ)、および/または代謝拮抗物質(例えば、5-フロウロウラシル(flourouracil)、メトトレキセート)と共に含んでもよい。
場合によっては、LOHシグネチャーを欠くゲノムを有する癌細胞を有していると特定された患者は、ネガティブLOHシグネチャー状態に少なくとも部分的に基づいて、DNA損傷物質、PARP阻害物質、放射線、またはその組み合わせを含む治療レジメンに反応する可能性が低いと分類することができる。次に、このような患者は、HDRに関連しない1種または複数種の癌治療物質、例えば、タキサン剤(例えば、ドキセタキセル、パクリタキセル、アブラキサン)、増殖因子阻害物質もしくは増殖因子受容体阻害物質(例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、スニチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ、パニツムマブ)、および/または代謝拮抗物質(例えば、5-フロウロウラシル、メトトレキセート)の使用を含む癌治療レジメンに反応する可能性が高いと分類することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。ある特定の癌治療レジメン(例えば、HDRに関連しない癌治療物質の使用を含む癌治療レジメン)に反応する可能性が高いと分類されると、癌患者はこのような癌治療レジメンで治療することができる。治療されている癌に適した任意の方法を用いて、ネガティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定された癌患者を治療することができる。ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高いという分類の基礎をなすネガティブLOHシグネチャー状態に加えて使用することができる情報の例には、以前の治療結果、生殖系列もしくは体細胞のDNA変異、遺伝子もしくはタンパク質の発現プロファイリング(例えば、ER/PR/HER2状態、PSAレベル)、腫瘍組織学(例えば、腺癌、扁平上皮癌、漿液性乳頭癌、粘液性癌、浸潤性腺管癌、非浸潤性乳管癌(非侵襲的)など)、病期、腫瘍または癌の悪性度(例えば、高分化、中分化、もしくは低分化(例えば、Gleason、modified Bloom Richardson)など)、以前の治療コースの回数などが含まれるが、それに限定されるわけではない。
ある特定の期間(例えば、1ヶ月〜6ヶ月)にわたって治療すると、患者を評価して、治療レジメンに効果があるかどうかを判定することができる。有益効果が検出された場合には、患者は同じまたは類似の癌治療レジメンを続けることができる。最小限の有益効果が検出された場合、または有益効果が検出されない場合には、癌治療レジメンに調整を加えることができる。例えば、用量、投与頻度、または治療期間を増やすことができる。場合によっては、さらなる抗癌剤を治療レジメンに付け加えてもよく、ある特定の抗癌剤を1種または複数種の異なる抗癌剤と交換することができる。適宜、治療されている患者をモニタリングし続けることができ、適宜、癌治療レジメンに変更を加えることができる。
見込みのある治療反応を予測することまたは望ましい治療レジメンを選択することに加えて、LOHシグネチャーを用いて患者の予後を判定することができる。以下の実施例3(特に図18b)に示したように、LOHシグネチャーを有する腫瘍を有している患者は、このようなLOHシグネチャーを有さない腫瘍を有している患者より有意に長い生存期間を示す。従って、1つの局面において、本文書は、患者からの試料中のLOHシグネチャーの有無を検出することに少なくとも部分的に基づいて、患者の予後を判定するための方法を特徴とする。該方法は、(a)本明細書に記載のようにLOHシグネチャーを有する癌細胞を患者が含むかどうかを判定する工程(例えば、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示し、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である)、および(b)(1)LOHシグネチャーの存在に少なくとも部分的に基づいて、患者の予後が比較的良好であると判定する工程、もしくは(b)(2)少なくとも部分的にLOHシグネチャーの非存在に基づいて、患者のが比較的不良であると判定する工程を含むか、またはこれらの工程から本質的になる。予後は、患者の生存(例えば、無増悪生存期間、全生存期間)の可能性を含んでもよく、比較的良好である予後は、一部の参照集団(例えば、この患者の癌タイプ/サブタイプを有する平均的な患者、LOHシグネチャーを有さない平均的な患者など)と比較した時の生存の可能性の増加を含む。逆に、生存の点で比較的不良である予後は、一部の参照集団(例えば、この患者の癌タイプ/サブタイプを有する平均的な患者、LOHシグネチャーを有する平均的な患者など)と比較した時の生存の可能性の減少を含む。
本明細書に記載のように、本文書は、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する細胞(例えば、癌細胞)について患者を評価するための方法を提供する。一部の態様において、患者は未治療患者である。例えば、1人または複数の臨床家もしくは医療従事者は、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を患者が含有するかどうかを判定することができる。場合によっては、1人または複数の臨床家もしくは医療従事者は、患者から癌細胞試料を入手し、癌細胞試料の癌細胞のゲノムを評価して、本明細書に記載のようにLOHシグネチャーの有無を判定することによって、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を患者が含有するかどうかを判定することができる。
場合によっては、1人または複数の臨床家もしくは医療従事者は、患者から癌細胞試料を入手し、癌細胞試料の癌細胞のゲノムを評価する能力のある試験機関に試料を提供して、本明細書に記載のようにLOHシグネチャーの有無を示すことができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。このような場合、1人または複数の臨床家もしくは医療従事者は、試験機関から直接的または間接的にLOHシグネチャーの有無についての情報を受け取ることによって、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を患者が含有するかどうかを判定することができる。例えば、試験機関は、本明細書に記載のようにLOHシグネチャーの有無について癌細胞のゲノムを評価した後、臨床家もしくは医療従事者に、評価されているある特定の患者のLOHシグネチャーの有無を示す、書面による、電子的な、もしくは口頭による報告または医療記録を提供することができるか、またはこれらにアクセスできるようにすることができる。このような書面による、電子的な、もしくは口頭による報告または医療記録があると、1人または複数の臨床家もしくは医療従事者は、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を、評価されているある特定の患者が含有するかどうかを判定することができる。
臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループが、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を評価されているある特定の患者が含有すると判定すると、臨床家もしくは医療従事者(またはグループ)は、その患者を、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると分類することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者を、HDRが欠損している可能性が高い癌細胞を有していると診断することができる。このような診断は、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有することを判定することに単に基づいてもよく、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有することを判定することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者は、ポジティブLOHシグネチャー状態および1つまたは複数の腫瘍抑制遺伝子(例えば、BRCA1/2、RAD51C)における欠損状態、癌の家族歴または行動危険因子(例えば、喫煙)の存在の組み合わせに基づいて、HDRが欠損している可能性が高いと診断されることができる。
場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者を、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異を含有する可能性が高い癌細胞を有していると診断することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。このような診断は、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有することを判定することに単に基づいてもよく、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有すること判定することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者は、ポジティブLOHポジティブ状態および癌の家族歴、または行動危険因子(例えば、喫煙)の存在の組み合わせに基づいて、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異を含有する可能性が高い癌細胞を有していると診断されることができる。
場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していることが判定された患者を、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高い癌細胞を有すると診断することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。このような診断は、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有することを判定することに単に基づいてもよく、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを含有するゲノムを有する癌細胞を含有することを判定することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者は、ポジティブLOHシグネチャー状態および1つもしくは複数の腫瘍抑制遺伝子(例えば、BRCA1/2、RAD51)の欠損状態、癌の家族歴、または行動危険因子(例えば、喫煙)の存在の組み合わせに基づいて、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高いと診断されることができる。本明細書に記載のように、LOHシグネチャーの存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると判定された患者は、白金系化学療法薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、もしくはピコプラチン、アントラサイクリン、例えば、エピルビシンもしくはドキソルビシン、トポイソメラーゼI阻害物質、例えば、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカン、PARP阻害物質、放射線、その組み合わせ、または前述のいずれかと別の抗癌剤との組み合わせの使用を含む癌治療レジメンに反応する可能性が高いと診断されることができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループが、評価されているある特定の患者が、LOHシグネチャーを欠くゲノムを有する癌細胞を含有することを判定すると、臨床家もしくは医療従事者(またはグループ)は、その患者を、LOHシグネチャーの非存在を含むゲノムを有する癌細胞を有していると分類することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を欠くゲノムを含有する癌細胞を有していると判定された患者を、機能的HDRを有する可能性が高い癌細胞を有していると診断することができる。場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を欠くゲノムを含有する癌細胞を有していると判定された患者を、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異を含有する可能性が低い癌細胞を有していると診断することができる。場合によっては、臨床家もしくは医療従事者または臨床家もしくは医療従事者のグループは、LOHシグネチャーの存在を欠くゲノムを含有する癌細胞を有していると、または染色体全体をカバーする多数のLOH領域を含有すると判定された患者を、白金系化学療法薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチン、アントラサイクリン、例えば、エピルビンシンもしくはドキソルビシン、トポイソメラーゼI阻害物質、例えば、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカン、PARP阻害物質、または放射線に反応する可能性が低い癌細胞を有すると、および/あるいはHDRに関連しない癌治療物質、例えば、1種または複数種のタキサン剤、増殖因子阻害物質または増殖因子受容体阻害物質、代謝拮抗物質などの使用を含む癌治療レジメンに反応する可能性がより高いと診断することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
本明細書に記載のように、本文書はまた、癌患者の核酸試料(例えば、ゲノム核酸試料または増幅されたゲノム核酸試料)の診断分析を行って、患者内の癌細胞が、LOHシグネチャーおよび/または染色体全体をカバーする多数のLOH領域を含有するゲノムを有するかどうかを判定するための方法を提供する。一部の態様において、患者は未治療患者である。例えば、1人または複数の検査技師または検査従事者は、患者の癌細胞のゲノムにおけるLOHシグネチャーの有無、または患者の癌細胞のゲノムにおける染色体全体をカバーする多数のLOH領域の有無を検出することができる。場合によっては、1人または複数の検査技師または検査従事者は、(a)患者から得られた癌細胞試料を受け取るか、患者から得られた癌細胞から得られたゲノム核酸試料を受け取るか、または、患者から得られた癌細胞から得られた、濃縮および/もしくは増幅されたゲノム核酸試料を受け取り、(b)受け取った材料を用いて分析(例えば、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法)を行って、本明細書に記載のようにLOHシグネチャーの有無または染色体全体をカバーする多数のLOH領域の有無を検出することによって患者の癌細胞のゲノムにおけるLOHシグネチャーの有無または染色体全体をカバーする多数のLOH領域の有無を検出することができる。場合によっては、1人または複数の検査技師または検査従事者は、臨床家もしくは医療従事者から直接的または間接的に、分析しようとする試料(例えば、患者から得られた癌細胞試料、患者から得られた癌細胞から得られたゲノム核酸試料、または患者から得られた癌細胞から得られた濃縮および/もしくは増幅されたゲノム核酸試料)を受け取ることができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループが本明細書に記載のようにLOHシグネチャーの存在を検出すると、検査技師もしくは検査従事者(またはグループ)は、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、ポジティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定することができる。例えば、1人または複数の検査技師もしくは検査従事者は、そのポジティブLOHシグネチャー状態あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、ポジティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定することができる。場合によっては、検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ポジティブLOHシグネチャー状態、HDR状態における潜在的な欠損、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、潜在的にHDRが欠損している癌細胞を有していると特定することができる。このような特定は、LOHシグネチャーの存在を検出することに単に基づいてもよく、LOHシグネチャーの存在を検出することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、検査技師または検査従事者は、ポジティブLOHシグネチャー状態ならびに試験機関において行われた他の遺伝子検査および生化学検査の結果の組み合わせに基づいて、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、潜在的にHDRが欠損している癌細胞を有していると特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
場合によっては、検査技師または検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ポジティブLOHシグネチャー状態、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異の潜在的な存在、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異を潜在的に含有する癌細胞を有していると特定することができる。このような特定は、LOHシグネチャーの存在を検出することに単に基づいてもよく、LOHシグネチャーの存在を検出することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、検査技師または検査従事者は、ポジティブLOHシグネチャー状態ならびに試験機関において行われた他の遺伝子検査および生化学検査の結果の組み合わせに基づいて、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の遺伝子変異を潜在的に含有する癌細胞を有していると特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
場合によっては、検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ポジティブLOHシグネチャー状態、潜在的に欠損しているHDR状態、1つまたは複数のHDR経路遺伝子の欠損状態の潜在的な存在、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高い癌細胞を有していると特定することができる。このような特定は、LOHシグネチャーの存在を検出することに単に基づいてもよく、LOHシグネチャーの存在を検出することに少なくとも部分的に基づいてもよい。例えば、検査技師または検査従事者は、ポジティブLOHシグネチャー状態ならびに試験機関において行われた他の遺伝子検査および生化学検査の結果の組み合わせに基づいて、LOHシグネチャーを有すると検出された癌細胞を有している患者を、ある特定の癌治療レジメンに反応する可能性が高い癌細胞を有していると特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループがLOHシグネチャーの非存在を検出すると、検査技師または検査従事者(またはグループ)は、LOHシグネチャーを欠くと検出された癌細胞を有している患者を、ネガティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定することができる。例えば、1人もしくは複数の検査技師もしくは検査従事者は、ネガティブLOHシグネチャー状態あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを欠くと検出された癌細胞を有している患者を、ネガティブLOHシグネチャー状態を有する癌細胞を有していると特定することができる。場合によっては、検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ネガティブLOHシグネチャー状態、潜在的にインタクトなHDR状態、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを欠くと検出された癌細胞を有している患者を、潜在的にインタクトなHDRを有する癌細胞を有していると特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
場合によっては、検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ネガティブLOHシグネチャー状態、HDR経路遺伝子の遺伝子変異の潜在的な非存在、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを欠くと検出された癌細胞を有している患者を、潜在的にインタクトなHDR経路遺伝子を有する癌細胞を有していると特定することができる。
場合によっては、検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループは、ネガティブLOHシグネチャー状態、潜在的にインタクトなHDR状態、HDR経路遺伝子の遺伝子変異の潜在的な非存在、あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、LOHシグネチャーを欠くと検出された癌細胞を有している患者を、ある特定の治療(例えば、白金系化学療法薬、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチン、アントラサイクリン、例えば、エピルビンシンもしくはドキソルビシン、トポイソメラーゼI阻害物質、例えば、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカン、PARP阻害物質、例えば、イニパリブ、オラパリブ、もしくはベラピリブ、または放射線)に反応する可能性が低い、および/あるいは、ある特定の癌治療レジメン(例えば、HDRに関連しない癌治療物質の使用を含む癌治療レジメン)に反応する可能性がより高い癌細胞を有していると特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
検査技師もしくは検査従事者または検査技師もしくは検査従事者のグループが染色体全体をカバーする多数のLOH領域の存在を検出すると、検査技師もしくは検査従事者(またはグループ)は、染色体全体をカバーする多数のLOH領域を有すると検出された癌細胞を有する患者を、インタクトなBRCA1、BRCA2、および/もしくはRAD51C状態またはインタクトなHDR経路を有する癌細胞を有している可能性が高いと特定することができる。例えば、1人または複数の検査技師もしくは検査従事者は、染色体全体をカバーする多数のLOH領域の存在あるいは行われた診断分析の結果(または結果の概要)を、対応する患者の名前、医療記録、記号/数字の識別子、またはその組み合わせと関連付けることによって、染色体全体をカバーする多数のLOH領域を有すると検出された癌細胞を有している患者を、インタクトなBRCA1およびBRCA2状態を有する癌細胞を有している可能性が高いと特定することができる。一部の態様において、患者は未治療患者である。
本発明による任意の分析の結果は、多くの場合、医師、遺伝カウンセラー、および/または患者(または研究者などの他の当事者)に、前記の関係者のいずれにも伝えることができるかまたは伝達することができる伝達可能な形で伝えられる。このような形は異なってもよく、手で触れることができてもよく、手で触れることができなくてもよい。結果は、記述、図、写真、チャート、画像、または他の任意の視覚形態で具体化することができる。例えば、結果を説明する際に、遺伝子型またはLOH(もしくはHRD状態)情報を示したグラフまたは図を使用することができる。記述および視覚形態は、手で触れることができる媒体、例えば、紙、コンピュータ読取り可能な媒体、例えば、フロッピーディスク、コンパクトディスク、フラッシュメモリなど、または手で触れることができない媒体、例えば、電子メールの形をした電子媒体またはインターネット上もしくはイントラネット上のウェブサイトに記録することができる。さらに、結果は音声形態で記録し、任意の適切な媒体、例えば、アナログケーブルラインまたはデジタルケーブルライン、光ファイバーケーブルなど、電話、ファクシミリ、無線携帯電話、インターネット電話などを介して伝達することもできる。
従って、試験結果に関する情報およびデータは世界のどこでも作成し、異なる場所に伝達することができる。例示として、アッセイ法が米国外で行われた場合に、試験結果に関する情報およびデータが作成され、前記のように伝達可能な形でキャスト(cast)され、次いで、米国にインポートされる。従って、本発明はまた、少なくとも1つの患者試料についてLOHシグネチャーに関する伝達可能な形の情報を生成するための方法も包含する。該方法は、(1)本発明の方法に従ってLOHシグネチャーを決定する工程;および(2)決定する工程の結果を伝達可能な形で具体化する工程を含む。伝達可能な形は、このような方法の結果である。
本明細書に記載の本発明のいくつかの態様は、本発明によるLOHシグネチャー(例えば、前記癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数であり、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体はヒトX/Y性染色体対でなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、LOH領域の総数)が何らかの参照より大きい場合に、この数を、ある特定の臨床特徴(例えば、BRCA1遺伝子もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性の増加;HDR欠損の可能性の増加;DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/もしくはPARP阻害物質などを含む治療レジメンに対する反応の可能性の増加)と相関付ける工程(または任意で、この数が何らかの参照より小さい場合に別の特徴と相関付ける工程)を伴う。本文書全体を通して、このような態様が説明される場合は必ず、本発明の別の態様は、相関付ける工程に加えて、または相関付ける工程の代わりに、以下の工程の1つまたは両方を伴ってもよい:(a)LOHシグネチャーの有無に少なくとも部分的に基づいて、患者が臨床特徴を有することを結論付ける工程;または(b)LOHシグネチャーの有無に少なくとも部分的に基づいて、患者が臨床特徴を患者が有することを伝える工程。
例示として、本文書に記載の一態様は、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/またはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法であるが、それに限定されるわけではない。該方法は、(1)該癌患者に由来する癌細胞において、該癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および(2)参照数を上回る前記総数を、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性の増加と相関付ける工程を含む。前記段落によれば、この態様のこの説明は、2つの関連する態様の説明、すなわち、以下の工程を含む、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/またはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法を含むと理解される:(1)該癌患者に由来する癌細胞において、該癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;および(2)(a)参照数を上回る総数に少なくとも部分的に基づいて、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性が高いと結論付ける工程、または(2)(b)参照数を上回る総数に少なくとも部分的に基づいて、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性が高いと伝える工程。
ある特定のアッセイ法または分析の出力(例えば、参照数より大きなLOH領域の総数など)を、何らかの臨床特徴(例えば、ある特定の治療に対する反応、癌特異死亡など)の何らかの可能性(例えば、増加、増加なし、減少など)と相関付けること、またはさらに、もしくは代わりに、このような特定のアッセイ法または分析の出力に少なくとも部分的に基づいて、このような臨床特徴を結論付けるかもしくは伝えることを伴う、本文書に記載のそれぞれの態様において、このような相関付けること、結論付けるか、または伝えることは、特定のアッセイ法または分析の出力に少なくとも部分的に基づいて、臨床特徴が発生するリスクまたは可能性を割り当てることを含んでもよい。一部の態様において、このようなリスクは、事象またはアウトカムが発生するパーセント確率である。一部の態様において、患者は、リスク群(例えば、低リスク、中リスク、高リスクなど)に割り当てられる。一部の態様において、「低リスク」は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％より小さな任意のパーセント確率である。一部の態様において、「中リスク」は、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、または50％より大きく、かつ15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、または75％より小さな任意のパーセント確率である。一部の態様において、「高リスク」は、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％より大きな任意のパーセント確率である。
本明細書で使用する、ある特定の情報を「伝えること」は、このような情報を別の人に知らせること、またはこのような情報を、もの(例えば、コンピュータ)に移すことを意味する。本発明の一部の方法では、ある特定の治療に対する反応の患者の予後または可能性が伝えられる。一部の態様において、このような予後または反応の予測に到達するために用いられる情報(例えば、本発明によるLOHシグネチャーなど)が伝えられる。この伝達は、聴覚(例えば、口頭)、視覚(例えば、書面)、電子(例えば、あるコンピュータシステムから別のコンピュータシステムに転送されたデータ)などによるものでもよい。一部の態様において、癌分類(例えば、予後、反応の可能性、適切な治療など)を伝えることは癌分類を伝える報告を作成することを含む。一部の態様において、報告は、紙の報告、聴覚による報告、または電子記録である。一部の態様において、報告は、コンピュータ計算装置(例えば、手持ち式の装置、デスクトップコンピュータ、スマートデバイス、ウェブサイトなど)に表示および/または記憶される。一部の態様において、癌分類は医師に伝えられる(例えば、分類を伝える報告が医師に提供される)。一部の態様において、癌分類は患者に伝えられる(例えば、分類を伝える報告が患者に提供される)。癌分類は、分類を具体化する情報(例えば、データ)をサーバコンピュータに転送し、中間ユーザまたはエンドユーザがこのような情報にアクセスできるようにすることによって(例えば、サーバから表示された際に情報を見ることによって、サーバから中間ユーザまたはエンドユーザの装置などに転送される1つまたは複数のファイルの形で情報をダウンロードすることによって)伝えることもできる。
本発明の態様が、何らかの事実(例えば、患者の予後またはある特定の治療レジメンに反応する患者の可能性)を結論付けることを含む場合は必ず、これは、一部の態様では、典型的には本発明に従ってLOH領域に関する情報を適用するアルゴリズムを行った後に、このような事実を結論付けるコンピュータプログラムを含んでもよい。
多数のLOH領域(例えば、LOH指標領域)またはこのようなLOH領域の全長が関与する本明細書に記載のそれぞれの態様では、本発明は、このような数もしくは長さから導き出され、このような数もしくは長さを組み込んでおり、かつ/またはこのような数もしくは長さを少なくともある程度まで反映している、試験値またはスコア(例えば、HRDスコア、LOHスコアなど)が関与する関連した態様を包含する。言い換えると、本発明の様々な方法、システムなどにおいて、ありのままの(bare)LOH領域の数または長さが用いられる必要はなく、このような数または長さから導き出された試験値またはスコアが用いられてもよい。例えば、本発明の一態様は、以下の工程を含む、患者において癌を治療する方法:(1)該患者に由来する試料において、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の数を決定する工程であって、LOH領域が、第1の長さより長いが、LOHシグネチャーを癌細胞が有することを示すLOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、第1の長さが、約1.5メガベースまたはそれ以上である、工程;(2)該LOH領域の数から導き出された試験値を提供する工程;(3)該試験値を、参照集団における該LOH領域の数から導き出された1つまたは複数の参照値(例えば、平均、中央値、三分位値、四分位数、五分位数など)と比較する工程;ならびに(4)(a)少なくとも1つの該参照値を試験値が上回る(例えば、該参照値の少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍;該参照値より少なくとも1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差大きい)ことを明らかにする該比較する工程に少なくとも部分的に基づいて、該患者に抗癌薬を投与するか、または化学療法および/もしくは合成致死性の剤を含む治療レジメンを推奨もしくは処方もしくは開始する工程;あるいは(4)(b)少なくとも1つの該参照値を試験値が上回らない(例えば、該参照値の1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、または1/10以下;該参照値の1標準偏差、2標準偏差、3標準偏差、4標準偏差、5標準偏差、6標準偏差、7標準偏差、8標準偏差、9標準偏差、または10標準偏差以下である)ことを明らかにする該比較する工程に少なくとも部分的に基づいて、化学療法および/または合成致死性の剤を含まない治療レジメンを推奨または処方または開始する工程を含む、方法を提供する。本発明は、必要に応じて変更を加えて、試験値またはスコアを用いて、患者の予後、患者がある特定の治療レジメンに反応する可能性、BRCA1欠損、BRCA2欠損、RAD51C欠損、またはHDR欠損などを患者または患者の試料が有する可能性を判定する対応する態様を包含する。
図15は、コンピュータ計算システム(またはコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム(例えば、ソフトウェア))が本明細書に記載のように遺伝子型データからLOH遺伝子座または領域を特定することができる例示的なプロセスを示す。2つの対立遺伝子AおよびBのシグナルの観察された比が2:1である場合に、2つの可能性がある。第1の可能性は、癌細胞が、正常細胞により50％汚染されている試料中で対立遺伝子Bが欠失したLOHを有する可能性である。第2の可能性は、LOHは無いが、正常細胞に汚染されていない試料中で対立遺伝子Aが重複している可能性である。プロセスはボックス1500から開始する。ボックス1500では、以下のデータ:(1)各遺伝子座の両対立遺伝子の試料特異的な規準化されたシグナル強度ならびに(2)公知のASCNプロファイルを有する多数の試料の分析に基づいて定義されたアッセイ法特異的な(異なるSNPアレイおよび配列ベースアプローチに特異的な)パラメータセットがコンピュータ計算システムによって収集される。本明細書に記載のように、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法などの任意の適切なアッセイ法を用いて、染色体に沿って遺伝子座をホモ接合性またはヘテロ接合性について評価することができる。場合によっては、シグナル検出器およびコンピュータを含むシステムを用いて、複数の遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性に関するデータ(例えば、蛍光シグナルまたは配列決定結果)(例えば、各遺伝子座の両対立遺伝子の試料特異的な規準化されたシグナル強度)を収集することができる。ボックス1510では、対立遺伝子特異的コピー数(ASCN)が各遺伝子座(例えば、各SNP)において再構築される。ASCNは父性対立遺伝子および母性対立遺伝子両方のコピー数である。ボックス1530では、ホモ接合性遺伝子座またはホモ接合性遺伝子座の領域がLOHによるものであるかどうかを判定するために尤度関数が用いられる。これは、各遺伝子座(例えば、SNP)における(ASCNではなく)全コピー数を再構築するように設計された以前に述べられたアルゴリズムに概念的に類似してもよい。Abkevichらに対する国際出願番号PCT/US2011/026098を参照されたい。尤度関数は全ての遺伝子座のASCN、良性組織による汚染のレベル、全ゲノムにわたって平均された全コピー数、および試料特異的雑音レベルにわたって最大にすることができる。ボックス1540では、ASCNの一方(父性または母性)が0であるSNP領域としてLOH領域が決定される。一部の態様において、コンピュータプロセスは、患者が未治療かどうかを問い合わせる工程、または患者が未治療かどうかを判定する工程をさらに含む。
図3は、コンピュータ計算システムがLOHシグネチャーの有無を判定することができる例示的なプロセスを示す。プロセスはボックス300から開始する。ボックス300では、染色体に沿った複数の遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性に関するデータがコンピュータ計算システムによって収集される。本明細書に記載のように、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法などの任意の適切なアッセイ法を用いて、染色体に沿って遺伝子座をホモ接合性またはヘテロ接合性について評価することができる。場合によっては、シグナル検出器およびコンピュータを備えるシステムを用いて、複数の遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性に関するデータ(例えば、蛍光シグナルまたは配列決定結果)を収集することができる。ボックス310では、複数の遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性に関するデータならびに各遺伝子座の位置または空間関係をコンピュータ計算システムによって評価して、染色体に沿って存在する任意のLOH領域の長さを決定する。ボックス320では、検出されたLOH領域の数およびそれぞれの検出されたLOH領域の長さに関するデータをコンピュータ計算システムによって評価して、(a)予め設定したMb数(例えば、15Mb)より長い、またはこれに等しく、かつ(b)そのLOH領域を含有する染色体の全長より短い長さを有するLOH領域の数を決定する。または、コンピュータ計算システムは、前記のようにLOHの全長を決定するかまたはLOHの長さの合計を求めることができる。ボックス330において、コンピュータ計算システムは、LOHシグネチャーの有無を示す出力をフォーマットする。フォーマットされると、コンピュータ計算システムはユーザ(例えば、検査技師、臨床家、または医療従事者)に出力を提示することができる。本明細書に記載のように、LOHシグネチャーの有無を用いて、患者の見込みのあるHDR状態を示すこと、HDR経路遺伝子の遺伝子変異についての可能性の高い有無を示すこと、および/または可能性のある癌治療レジメンを示すことができる。
図4は、本明細書に記載の技法と共に用いられ得る、コンピュータ装置1400およびモバイルコンピュータ装置1450の一例の図である。コンピュータ計算装置1400は、様々な種類のデジタルコンピュータ、例えば、ラップトップ、デスクトップ、ワークステーション、携帯情報端末、サーバ、ブレードサーバ、メインフレーム、および他の適切なコンピュータであることが意図される。コンピュータ計算装置1450は、様々な種類のモバイル装置、例えば、携帯情報端末、携帯電話、スマートフォン、および他の類似するコンピュータ計算装置であることが意図される。ここで示した構成要素、これらの接続および関係、ならびにこれらの機能は例示にすぎないことが意図され、本文書において説明および/または請求される本発明の実行を限定することが意図されない。
コンピュータ計算装置1400は、プロセッサ1402、メモリ1404、記憶装置1406、メモリ1404および高速拡張ポート1410に接続している高速インターフェース1408、ならびに低速バス1414および記憶装置1406に接続している低速インターフェース1415を備える。構成要素1402、1404、1406、1408、1410、および1415はそれぞれ様々なバスを用いて相互接続され、共通マザーボードに、または適宜、他のやり方で装着されてもよい。プロセッサ1402は、外部入力/出力装置、例えば、高速インターフェース1408とつながっているディスプレイ1416におけるGUI用の図形情報を表示するために、メモリ1404または記憶装置1406に記憶された命令を含む、コンピュータ計算装置1400の中で実行するための命令を処理することができる。他の実行において、複数のプロセッサおよび/または複数のバスが、適宜、複数のメモリおよびメモリのタイプと共に用いられてもよい。また、複数のコンピュータ計算装置1400が接続されてもよく、それぞれの装置が(例えば、サーババンク、ブレードサーバの集まり、またはマルチプロセッサシステムとして)必要な操作の一部を提供する。
メモリ1404はコンピュータ計算装置1400内に情報を記憶する。一実行では、メモリ1404は揮発性メモリユニットである。別の実行では、メモリ1404は非揮発性メモリユニットである。メモリ1404はまた別の種類のコンピュータ可読媒体、例えば、磁気ディスクまたは光ディスクでもよい。
記憶装置1406はコンピュータ計算装置1400に大容量記憶を提供することができる。一実行では、記憶装置1406は、コンピュータ可読媒体、例えば、フロッピーディスク装置、ハードディスク装置、光ディスク装置、もしくはテープ装置、フラッシュメモリもしくは他の類似するソリッドステートメモリ装置、または、記憶領域ネットワーク中もしくは他の構成中の装置を含む数多くのいろいろな装置でもよく、これらを備えてもよい。コンピュータプログラム製品は、手で触れることができるように情報キャリアに組み入れられることができる。コンピュータプログラム製品はまた、実行された場合に1つまたは複数の方法、例えば、本明細書に記載の方法を行う命令を含んでもよい。情報キャリアは、コンピュータ可読媒体または機械可読媒体、例えば、メモリ1404、記憶装置1406、プロセッサ1402に搭載されたメモリ、または伝搬シグナルである。
高速コントローラ1408はコンピュータ計算装置1400のために帯域幅集約性(bandwidth-intensive)の動作を管理するのに対して、低速コントローラ1415は帯域幅集約性の低い動作を管理する。このような機能の割り当ては例示にすぎない。一実行では、高速コントローラ1408はメモリ1404、ディスプレイ1416(例えば、グラフィックスプロセッサまたはアクセラレータを介して)、および高速拡張ポート1410につなげられ、高速拡張ポート1410は様々な拡張カード(図示せず)を受け入れてもよい。この実行において、低速コントローラ1415は記憶装置1406および低速拡張ポート1414につなげられる。低速拡張ポートは様々な通信ポート(例えば、USB、ブルートゥース、イーサーネット、またはワイヤレスイーサーネット)を備えてもよく、例えば、ネットワークアダプターを介して、1つまたは複数の入力/出力装置、例えば、キーボード、ポインティング装置、スキャナー、光学読取り装置、蛍光シグナル検出器、またはネットワーキング装置、例えば、スイッチもしくはルータにつなげられてもよい。
図面に示したように、コンピュータ計算装置1400は多数の異なる形で実行することができる。例えば、コンピュータ計算装置1400は標準的なサーバ1420として実行されてもよく、このようなサーバの集まりにおいて複数回実行されてもよい。コンピュータ計算装置1400はラックサーバシステム1424の一部として実行されてもよい。さらに、コンピュータ計算装置1400はパーソナルコンピュータ、例えば、ラップトップコンピュータ1422の中で実行されてもよい。または、コンピュータ計算装置1400からの構成要素が、モバイル装置(図示せず)中の他の構成要素、例えば、装置1450と組み合わされてもよい。このような装置はそれぞれコンピュータ計算装置1400、1450の1つまたは複数を備えてもよく、システム全体が、互いに通信する複数のコンピュータ計算装置1400、1450からなってもよい。
コンピュータ計算装置1450は、構成要素(例えば、スキャナー、光学読取り装置、蛍光シグナル検出器)の中でも、プロセッサ1452、メモリ1464、入力/出力装置、例えば、ディスプレイ1454、通信インターフェース1466、およびトランシーバ1468を備える。装置1450には、さらなる記憶を提供するためにマイクロドライブまたは他の装置などの記憶装置も設けられてよい。構成要素1450、1452、1464、1454、1466、および1468はそれぞれ様々なバスを用いて相互接続され、構成要素のいくつかは共通マザーボードにまたは適宜、他のやり方で装着されてもよい。
プロセッサ1452は、メモリ1464に記憶されている命令を含む、コンピュータ計算装置1450内の命令を実行することができる。プロセッサは、別々のかつ複数のアナログプロセッサおよびデジタルプロセッサを備えるチップのチップセットとして実行されてもよい。プロセッサは、例えば、装置1450の他の構成要素をうまく調整するために、例えば、ユーザインターフェースの制御、装置1450によって動かされるアプリケーション、および装置1450による無線通信を提供してもよい。
プロセッサ1452は、制御インターフェース1458およびディスプレイ1454につなげられたディスプレイインターフェース1456を介してユーザと通信することができる。ディスプレイ1454は、例えば、TFTLCD(薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ)もしくはOLED(有機発光ダイオード)ディスプレイまたは他の適切なディスプレイ技術でよい。ディスプレイインターフェース1456は、ディスプレイ1454を駆動して図形情報および他の情報をユーザに提示するための適切な回路を備えてもよい。制御インターフェース1458はユーザからコマンドを受信し、プロセッサ1452に送信するためにコマンドを変換してもよい。さらに、外部インターフェース1462は、装置1450と他の装置との近接場(near area)通信を可能にするようにプロセッサ1452と通信してもよい。外部インターフェース1462は、例えば、一部の実行では有線通信を提供してもよく、他の実行では無線通信を提供してもよく、複数のインターフェースが用いられてもよい。
メモリ1464はコンピュータ計算装置1450内に情報を記憶する。メモリ1464は、コンピュータ可読媒体、揮発性メモリユニット、または非揮発性メモリユニットの1つまたは複数として実行することができる。拡張メモリ1474が拡張インターフェース1472を介して設置され、装置1450に接続されてもよい。拡張インターフェース1472は、例えば、SIMM(シングル・インライン・メモリ・モジュール)カードインターフェースを含んでもよい。このような拡張メモリ1474は、余分な記憶空間を装置1450に提供してもよく、装置1450のためのアプリケーションまたは他の情報を記憶してもよい。例えば、拡張メモリ1474は本明細書に記載のプロセスを実施または補足する命令を含んでもよく、安全な情報も含んでよい。従って、例えば、拡張メモリ1474は装置1450用のセキュリティーモジュールとして提供されてもよく、装置1450の安全な使用を可能にする命令でプログラムされてもよい。さらに、ハッキングできないように識別情報をSIMMカードに入れるなどSIMMカードを介して安全なアプリケーションが追加情報と共に提供されてもよい。
メモリは、例えば、下記で議論されるようにフラッシュメモリおよび/またはNVRAMメモリを含んでもよい。一実行では、コンピュータプログラム製品は手で触れることができるように情報キャリアに組み入れられる。コンピュータプログラム製品は実行された場合に1つまたは複数の方法、例えば、本明細書に記載の方法を行う命令を含む。情報キャリアは、コンピュータ可読媒体または機械可読媒体、例えば、メモリ1464、拡張メモリ1474、プロセッサ1452に搭載されたメモリ、または受信され得る伝搬シグナル、例えば、トランシーバ1468もしくは外部インターフェース1462で受信され得る伝搬シグナルである。
装置1450は通信インターフェース1466を介して無線通信してもよい。通信インターフェース1466は、必要な場合、デジタル信号処理回路を備えてもよい。通信インターフェース1466は、様々なモードまたはプロトコール、例えば、特に、GSMボイスコール、SMS、EMS、またはMMSメッセージング、CDMA、TDMA、PDC、WCDMA、CDMA2000、またはGPRSの下で通信を提供してもよい。このような通信は、例えば、無線周波トランシーバ1468を介して発生してもよい。さらに、例えば、ブルートゥース、WiFi、または他のこのようなトランシーバ(図示せず)を用いて、短距離通信が発生してもよい。さらに、GPS(汎地球測位システム)レシーバモジュール1470が、さらなるナビゲーション関連無線データおよび位置関連無線データを装置1450に提供してもよく、ナビゲーション関連無線データおよび位置関連無線データは、適宜、装置1450上で動作するアプリケーションによって用いられてもよい。
装置1450はまたオーディオコーデック1460を用いて可聴音通信してもよい。オーディオコーデック1460はユーザからの音声情報を受信し、使用可能なデジタル情報に変換し得る。さらに、オーディオコーデック1460は、例えば、スピーカを介して、例えば、装置1450のハンドセットにおいてユーザに可聴音を発生し得る。このような音声はボイステレフォンコールからの音を含んでもよく、記録された音声(例えば、音声メール、ミュージックファイルなど)を含んでもよく、装置1450上で動作するアプリケーションが作成した音声も含んでもよい。
図面に示したように、コンピュータ計算装置1450は多数の異なる形で実行することができる。例えば、コンピュータ計算装置1450は携帯電話1480として実行されてもよい。コンピュータ計算装置1450はまたスマートフォン1482、携帯情報端末、または他の類似したモバイル装置の一部としても実行されてもよい。
本明細書に記載のシステムおよび技法の様々な実行は、デジタル電子回路、集積回路、特別に設計されたASIC(特定用途向け集積回路)、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、および/またはその組み合わせにおいて実現することができる。これらの様々な実行は、記憶システム、少なくとも1つの入力装置、および少なくとも1つの出力装置からデータおよび命令を受信し、記憶システム、少なくとも1つの入力装置、および少なくとも1つの出力装置にデータおよび命令を送信するようにつなげられた、特殊用途でもよく一般用途でもよい少なくとも1つのプログラマブルプロセッサを含む、プログラム可能なシステム上で実行可能および/または解釈可能な1つまたは複数のコンピュータプログラムにおける実行を含んでもよい。
これらのコンピュータプログラム(プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、またはコードとも知られる)はプログラマブルプロセッサの機械命令を含み、高水準の手続き形プログラミング言語および/もしくはオブジェクト指向プログラミング言語ならびに/またはアセンブリ/機械言語で実行することができる。本明細書で使用する「機械可読媒体」および「コンピュータ可読媒体」という用語は、機械可読シグナルとして機械命令を受け取る機械可読媒体を含むプログラマブルプロセッサに機械命令および/またはデータを提供するのに用いられる任意のコンピュータプログラム製品、機器、および/または装置(例えば、磁気ディスク、光ディスク、メモリ、およびプログラム可能論理デバイス(PLD))を指す。「機械可読シグナル」という用語は、プログラマブルプロセッサに機械命令および/またはデータを提供するのに用いられる任意のシグナルを指す。
ユーザとの対話を提供するために本明細書に記載のシステムおよび技法は、情報をユーザに表示するためのディスプレイ装置(例えば、CRT(陰極線管)またはLCD(液晶ディスプレイ)モニタ)ならびにユーザがコンピュータに入力するのを可能にするキーボードおよびポインティング装置(例えば、マウスまたはトラックボール)を有するコンピュータ上で実行することができる。他の種類の装置を用いて、ユーザとの対話を提供することもできる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは任意の種類の感覚フィードバック(例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバック)でよい。ユーザからの入力は、音響入力、音声入力、または触覚入力を含む任意の形で受信することができる。
本明細書に記載のシステムおよび技法は、バックエンドコンポーネント(例えば、データサーバとして)を備える、またはミドルウェアコンポーネント(例えば、アプリケーション・サーバ)を備える、またはフロントエンドコンポーネント(例えば、例えば、ユーザが本明細書に記載のシステムおよび技法の実行と対話することができるためのグラフィカル・ユーザインタフェースもしくはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータ)、またはこのようなバックエンドコンポーネント、ミドルウェアコンポーネント、もしくはフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを備えるコンピュータ計算システムにおいて実行することができる。システムのコンポーネントは任意の形態または媒体のデジタルデータ通信(例えば、通信ネットワーク)によって相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク(「LAN」)、ワイドエリアネットワーク(「WAN」)、およびインターネットが含まれる。
コンピュータ計算システムはクライアントおよびサーバを備えてもよい。クライアントおよびサーバは一般的に互いに離れており、典型的には通信ネットワークを介して対話する。クライアントおよびサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で動作し、互いにクライアント-サーバ関係を有するコンピュータプログラムによって発生する。
場合によっては、本明細書において提供されるコンピュータ計算システムは1つまたは複数の試料分析器を備えるように構成されてもよい。試料分析器は、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体のゲノムDNAについて複数のシグナルを発生するように構成されてもよい。例えば、試料分析器は、染色体に沿って遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性を特定するやり方で解釈することができるシグナルを発生することができる。場合によっては、試料分析器は、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法の1つまたは複数の工程を実施するように構成されてもよく、このようなアッセイ法からシグナルを発生および/または捕獲するように構成されてもよい。場合によっては、本明細書において提供されるコンピュータ計算システムはコンピュータ計算装置を備えるように構成されてもよい。このような場合、コンピュータ計算装置は試料分析器からシグナルを受信するように構成されてもよい。コンピュータ計算装置は、本明細書に記載の方法または工程の1つまたは複数を実施するための、コンピュータ実行可能命令またはコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム(例えば、ソフトウェア)を含んでもよい。場合によっては、このようなコンピュータ実行可能命令は、試料分析器、別のコンピュータ計算装置、SNPアレイベースアッセイ法、または配列決定ベースアッセイ法からのシグナルを分析するようにコンピュータ計算装置を命令することができる。このようなシグナルを分析して、遺伝子型、ある特定の遺伝子座におけるホモ接合性、ホモ接合性の領域、LOH領域の数を決定すること、LOH領域のサイズを決定すること、特定のサイズもしくはサイズ範囲を有するLOH領域の数を決定すること、試料がLOHシグネチャーポジティブであるかどうかを判定すること、少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数を決定すること、BRCA1遺伝子および/もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性を判定すること、HDRにおける欠損の可能性を判定すること、癌患者がある特定の癌治療レジメン(例えば、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、PARP阻害物質、もしくはその組み合わせを含むレジメン)に反応する可能性を判定すること、またはこれらの項目の組み合わせを決定することができる。
場合によっては、本明細書において提供されるコンピュータ計算システムは、LOH領域の数、LOH領域のサイズ、特定のサイズまたはサイズ範囲を有するLOH領域の数、試料がLOHシグネチャーポジティブであるかどうか、少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数、BRCA1遺伝子および/もしくはBRCA2遺伝子における欠損の可能性、HDRにおける欠損の可能性、癌患者がある特定の癌治療レジメン(例えば、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、PARP阻害物質、もしくはその組み合わせを含むレジメン)に反応する可能性、またはこれらの項目の組み合わせを示す出力をフォーマットするためのコンピュータ実行可能命令またはコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム(例えば、ソフトウェア)を備えてもよい。場合によっては、本明細書において提供されるコンピュータ計算システムは、LOHシグネチャーの有無または指標LOH領域の数に少なくとも部分的に基づいて、ある特定の患者に望ましい癌治療レジメンを決定するための、コンピュータ実行可能命令またはコンピュータ実行可能命令を含むコンピュータプログラム(例えば、ソフトウェア)を備えてもよい。
場合によっては、本明細書において提供されるコンピュータ計算システムは、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法を行うことができるように、試料(例えば、癌細胞)を処理するように構成された前処理装置を備えてもよい。前処理装置の例は、非癌細胞とは対照的に癌細胞ついて細胞集団を濃縮するように構成された装置、細胞を溶解し、かつ/またはゲノム核酸を抽出するように構成された装置、ならびに特定のゲノムDNA断片について試料を濃縮するように構成された装置を含むが、それに限定されるわけではない。
本文書はまた、本明細書に記載のように試料(例えば、癌細胞)評価するためのキットを提供する。例えば、本文書は、LOHシグネチャーの存在について癌細胞を評価するための、または少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数を決定するためのキットを提供する。本明細書において提供されるキットは、SNPプローブ(例えば、本明細書に記載のSNPアレイベースアッセイ法を実施するためのSNPプローブのアレイ)またはプライマー(例えば、配列決定ベースアッセイ法を介してSNP領域を配列決定するように設計されたプライマー)のいずれかを、本明細書に記載の方法または工程の1つまたは複数を実施するためのコンピュータ実行可能命令(例えば、特定のサイズまたはサイズ範囲を有するLOH領域の数を決定するためのコンピュータ実行可能命令)を含むコンピュータプログラム製品と組み合わせて含んでもよい。場合によっては、本明細書において提供されるキットは、ヒトゲノムDNAの多型領域にハイブリダイズすることができる少なくとも500個、1000個、10,000個、25,000個、または50,000個のSNPプローブを含んでもよい。場合によっては、本明細書において提供されるキットは、ヒトゲノムDNAの多型領域を配列決定することができる少なくとも500個、1000個、10,000個、25,000個、または50,000個のプライマーを含んでもよい。場合によっては、本明細書において提供されるキットは、SNPアレイベースアッセイ法または配列決定ベースアッセイ法を行うための1つまたは複数の他の成分を含んでもよい。このような他の成分の例は、緩衝液、配列決定用ヌクレオチド、酵素(例えば、ポリメラーゼ)などを含むが、それに限定されるわけではない。本文書はまた、本明細書に記載の方法または工程の1つまたは複数を実施するためのキットの製造における、本明細書において提供される任意の適切な数の材料の使用を提供する。例えば、本文書は、LOHシグネチャーの存在について癌細胞を評価するためのキットの製造における、SNPプローブの収集物(例えば、10,000〜100,000個のSNPプローブの収集物)および本明細書において提供されるコンピュータプログラム製品の使用を提供する。別の例として、本文書は、LOHシグネチャーの存在について癌細胞を評価するためのキットの製造における、プライマーの収集物(例えば、SNP領域を配列決定するための10,000〜100,000個のプライマーの収集物)および本明細書において提供されるコンピュータプログラム製品の使用を提供する。
本発明は以下の実施例においてさらに説明される。以下の実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定しない。
実施例1-LOH領域およびHDRの評価
進行卵巣癌患者に由来する2セットの腫瘍を使用した。94個の腫瘍からなる第1のセット(訓練セット)を用いて候補シグネチャーを導き出し、40個の腫瘍からなる第2のセット(検証セット)を用いてシグネチャーを検証した。BRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子の全てのコード領域を配列決定して、生殖細胞系列変異および体細胞変異を検出した。BRCA1およびBRCA2のmRNA発現レベルを測定し、Affymetrix SNPマイクロアレイを行った。
コンピュータプログラムを用いて、マイクロアレイデータから得られた対立遺伝子強度に基づいてLOHシグネチャー状態を再構築した。遺伝子型(例えば、SNP遺伝子型)データに基づいてLOH領域を再構築するためにアルゴリズムを開発し、コンピュータプログラムとして実行した。
このアルゴリズムの特徴の1つは、最初に、各遺伝子座(例えば、SNP)において対立遺伝子特異的コピー数(ASCN)を再構築することであった。ASCNは父性対立遺伝子および母性対立遺伝子両方のコピー数である。次いで、ASCNの一方(父性または母性)が0であるSNP領域としてLOH領域を決定した。このアルゴリズムは尤度関数を最大にすることに基づき、各遺伝子座(例えば、SNP)における(ASCNではなく)全コピー数を再構築するように設計された以前に述べられたアルゴリズムに概念的に類似した。Abkevichらに対する国際出願番号PCT/US2011/026098を参照されたい。尤度関数を全ての遺伝子座のASCN、良性組織による汚染のレベル、全ゲノムにわたって平均された全コピー数、および試料特異的雑音レベルにわたって最大にした。アルゴリズムの入力データは、(1)各遺伝子座の両対立遺伝子の試料特異的な規準化されたシグナル強度ならびに(2)公知のASCNプロファイルを有する多数の試料の分析に基づいて定義されたアッセイ法特異的(異なるSNPアレイおよび配列ベースアプローチに特異的)なパラメータセットを含んだ。
腫瘍にBRCA1遺伝子および/もしくはBRCA2遺伝子の1つまたは複数の有害な変異があった場合、または腫瘍にBRCA1 mRNA低発現があった場合に、この分析の目的で腫瘍がHDR欠損であると定義した。残りの腫瘍は、この分析の目的でHDR非欠損である可能性が高いと定義した。
LOH領域の長さの分布を調べた(図5)。LOH領域の3つの分類:(1)染色体全体に影響をおよぼすLOH;(2)典型的には染色体腕の一部または染色体腕全体に影響を及ぼす、大きなLOH領域(約15Mbより長い);および(3)複数の短いLOH領域(約15Mbより短い)を使用した。次に、訓練セットだけを用いて、これらの3つの分類の1つのLOH領域の数を、HDR欠損との可能性のある相関関係について評価した。(1)短いLOH領域の数はHDR欠損と有意に相関しなかった(p>0.05);(2)染色体全体をカバーするLOHはHDR欠損と弱く相関した(p=0.0011);および(3)大きなLOH領域の数がHDR欠損と有意に相関した(p=1.9e-8)ことが発見された。より具体的には、全てのHDR欠損腫瘍に多数の大きなLOH領域(例えば、9個またはそれ以上)があったのに対して、HDR非欠損である可能性の高い腫瘍の大多数には少数の大きなLOH領域があったことが発見された(図6〜8)。HDR非欠損である可能性の高い腫瘍は、実際には、BRCA1およびBRCA2の変異およびmRNA低発現を除く他の遺伝子変化によりHDR欠損になったことはほぼ間違いなかった。大きなLOH領域の数に加えて、これらの領域の全長もHDR欠損と有意に相関した。
検証セットを用いて、これらの結果が確認された:(1)短いLOH領域の数はHDR欠損と有意に相関しなかった(p>0.05)こと;(2)染色体全体をカバーするLOHはHDR欠損と弱く相関した(p=0.05)こと;および(3)大きなLOH領域の数はHDR欠損と有意に相関した(p=3.9e-6)こと。
134個の腫瘍を訓練データセットおよび検証データセットの組み合わせから3つの群:(1)BRCA1および/もしくはBRCA2遺伝子に1つもしくは複数の有害な変異があった場合またはBRCA1 mRNA低発現があった場合にはBRCA欠損;(2)9個またはそれ以上の大きなLOH領域(15Mbより長いが、染色体全体の長さより短い)があった場合にはHDR欠損/BRCAインタクト;(3)9個未満の大きなLOH領域(15Mbより長いが、染色体全体の長さより短い)があった場合にはHDRインタクトに分けた。この分析の結果を図9に示した。図9は、卵巣腫瘍の中でBRCA欠損ならびにBRCA欠損によらないHDR欠損の頻度が高いことを示す。
図10は、異なるタイプの癌細胞株について大きなLOH領域(15Mbより長いが、染色体全体の長さより短い)の分布を示す。丸のサイズは、このような数の大きなLOH領域を有する試料の数と比例する。乳癌細胞株および食道癌細胞株の中でHDR欠損(このような大きなLOH領域のうち少なくとも9個を有する細胞株)の頻度は最も高い。結腸癌細胞株の中でHDR欠損は観察されなかった。卵巣腫瘍の以前の所見を検証して、全てのBRCA欠損細胞株がHDR欠損であることも見出された。
図11は、公的利用可能な肺腫瘍データセット(Gene Expression OmnibusからのGSE19399)の大きなLOH領域(15Mbより長いが、染色体全体の長さより短い)の分布を示す。肺腫瘍の中でHDR欠損(少なくとも9個の大きなLOH領域を有すると定義した)の頻度が極めて大きいことが観察された(39％)。
図12に様々な腫瘍および細胞株の分析結果をまとめた。いくつかの腫瘍および細胞株について、少なくとも9個の大きなLOH領域(15Mbより長いが、染色体全体の長さより短い)を有する試料の割合として定義したHDR欠損の頻度を示した。この頻度は卵巣腫瘍の中で50％と高く、脳および結腸細胞株の中では全く観察されなかった。従って、HDR欠損は癌の大多数にとって重要な役割を果たすと考えられる。
実施例2-化学毒性反応
化学毒性反応実験の調製において、全ての細胞株を75cm2組織培養フラスコ(VWR International, Inc. カタログ番号353136)および推奨増殖培地に入れて37℃+5％CO2で増殖させた。それぞれの実験を行う前に、それぞれの細胞株をトリプシン処理し(Invitrogen Corporationカタログ番号25200-056)、計数し、底が透明な96ウェルポリスチレンマイクロプレート(Perkin Elmerカタログ番号600518)の縦列2〜12の1ウェル当たり培地100μL中、2500個の細胞または5000個の細胞で、Advanced RPMI 1640(Invitrogen Corporationカタログ番号12633-020)、3％FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen Corporationカタログ番号15140-122)に入れて播種した。縦列1には1ウェル当たり100μLの培地だけを入れた。次いで、細胞を播種したプレートを37℃+5％CO2で一晩インキュベートした。
2種類の異なる最終薬物濃度作業ストックを調製した。薬物溶解のために100％DMSOが必要な場合、最高濃度用の希釈剤としてAdvanced RPMI 1640を使用した。低濃度にはAdvanced RPMI 1640+高濃度作業ストック中の全DMSOに等しい予め決められた量のDMSOを使用した。最低濃度には最大60％のDMSOを使用した。これは、ウェルごとのDMSO濃度を等しく保ち、DMSOの結果として非特異的細胞死を阻止するために行った。2種類の薬物濃度のうち低い方を96ウェル薄壁PCRサイクルプレート(Robbins Scientificカタログ番号1055-00-0)の横列A〜D、縦列12に入れたのに対して、高い方の濃度を同じプレートの横列E〜H、縦列12に入れた。1:2または1:3の段階希釈を縦列12〜3に降順に行った。縦列1および2を細胞なし/薬物なしおよび薬物対照なしに使用した。これにより、それぞれの薬物濃度について四つ組(quadruplet)データポイントが可能になった。希釈が完了すると、5μLを希釈プレートから播種細胞プレートの対応するウェルに移した。次いで、薬物を入れたプレートを37℃+5％CO2で3日間または6日間インキュベートした。
3日投与レジメンまたは6日投与レジメンの後に、ATPliteアッセイ法(Perkin Elmer カタログ番号6016941)をATPLiteアッセイ法プロトコールに従って各プレートの各ウェルに対して行った。次いで、ルミネセンスをFUSION装置で読み取り、.CSVファイルとしてセーブした。それぞれの細胞株および薬物の組み合わせについて、薬物なし対照の4回の反復を平均し、100で割って、規準化されたパーセント生存を算出するのに使用する「ノーマライゼーション係数(normalization factor)」を作成した。薬物なし対照の規準化されたパーセント生存は100％であった。それぞれの薬物濃度について細胞+薬物ウェルの4回の反復を平均し、ノーマライゼーション係数で割った。0に等しい濃度から開始する、それぞれの薬物濃度のパーセント生存を用いて、所有権を主張できるソフトウェアを用いてIC50を算出した。
図13は、乳癌細胞株および卵巣癌細胞株の化学療法に対する反応を示す。y軸には、29個の乳癌細胞株への曝露時には様々な化学療法薬(カンプトテシン、ならびに白金化合物(オキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン)については結果の平均、またはアントラサイクリン(ドキソルビシンおよびエピルビシン))のLog10 (IC50)値、ならびに27個の卵巣癌細胞株への曝露時にはパクリタキセルのLog10 (IC50)値を表示した。x軸には、これらの細胞株について15Mbより長く、かつ染色体全体より短い大きなLOH領域の数を表示した。破線によって閾値を9に示した。
図14は、29個の乳癌細胞株への曝露時の白金化合物(オキサリプラチン、シスプラチン、およびカルボプラチン)による治療に対する反応細胞株および非反応細胞株の中の特異度および感度を示す、図13からのグラフの一バージョンである。破線によって、15Mbより長く、かつ染色体全体より短い大きなLOH領域の数の閾値を9に示した。実線によって細胞株を反応細胞株および非反応細胞株に分けた。
実施例3-HR欠損アッセイ法のさらなる検証
材料および方法
卵巣腫瘍試料
3つの独立したヒト卵巣癌コホートを使用した。1: 152個の選択されなかった卵巣癌試料。2: 53個の高悪性度漿液性卵巣腫瘍。.3: 完全な情報が入手可能な、435個の漿液性卵巣癌試料からの公的利用可能なデータを、2011年10月31日にThe Cancer Genome Atlas(TCGA)Networkウェブサイトからダウンロードした。全てのコホートをInstitutional Review Board(IRB)により認可されたプロトコールの下で入手した。患者および腫瘍の特徴を表2に示した。記載のアッセイ法では様々な数の試料を使用した(表3)。
（表２）患者および癌の特徴
Figure 0006700333
Figure 0006700333
（表３）各アッセイ法において使用した試料の数
Figure 0006700333
細胞株
67個の癌細胞株を分析した(29個の卵巣癌細胞株、34個の乳癌細胞株、3個の結腸癌細胞株、1個の膵臓癌細胞株)。3個の乳癌細胞株をDSMZ(Braunschweig, Germany)から入手した。結腸癌細胞株、膵臓癌細胞株、および残りの乳癌細胞株をATCC(Manassas, VA)から入手した。癌細胞株をT75フラスコに入れ、RPMI+10％FBS+1％ペニシリン/ストレプトマイシン培地中、37℃で約5×106細胞密度まで増殖させた。例外は、非標準培地、L-グルタミン、またはインシュリンを必要とする細胞株であった。懸濁液中で増殖させた細胞を1.5mL遠心管に入れて5分間、1700rpmで遠心分離し、上清を捨てた。単層で増殖させた細胞から培地を吸引によって除去し、PBSで洗浄し、トリプシン溶液を添加した。細胞をはがした後、培地に入れて収集し、1.5mL微量遠心機管に移し、1700rpmで5分間、遠心分離した。上清を捨てた。単離した細胞を200μLのPBSに再懸濁した。
凍結した腫瘍および細胞株からのゲノムDNAおよび全RNAの抽出
10μm凍結切片を切断およびマイクロダイセクトした。QIAzol溶解試薬を添加した後に組織をホモジナイズし(TissueRuptor(Qiagen))、これに続いて、Qiagen miRNAeasy Mini Kitを用いて製造業者のプロトコールに従ってRNAを単離した。QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)を用いて製造業者のプロトコールに従って、56℃での一晩溶解インキュベーションおよびRNaseA処理を行ってDNAを単離した。
BRCA1およびBRCA2配列決定
Hennessy at al., 2010に記載のようにBRCA1およびBRCA2を配列決定した。特定された変異は、以前に述べられた基準に基づいて有害であると分類された、または有害だと疑われた場合にのみ分析に含めた(Beaudet and Tsui, 1993)。
プロモーターメチル化qPCRアッセイ法
Methyl-Profiler DNA Methylation PCR Array System(SABiosciences)を用いて製造業者の推奨プロトコールに従ってメチル化レベルを定量した。DNAメチル化感受性制限酵素およびDNAメチル化依存性制限酵素を用いて、それぞれ、非メチル化ゲノムDNAまたはメチル化ゲノムDNAを選択的に消化した。消化後DNAを、関心対象の領域に隣接するプライマーを用いたリアルタイムPCRによって定量した。それぞれの消化物の量を偽(mock)消化物の量と比較することによって、差次的にメチル化したDNAの相対濃度を求めた。
BRCA1プロモーターメチル化配列決定アッセイ法
50〜300ngのDNAを、酸性条件下、バイサルファイト存在下で60℃において約5時間インキュベートし、95℃まで短時間上昇させた。インキュベーション後、反応物をスピンカラムに結合させ、バイサルファイトを除去するために塩基条件下で洗浄し、次いで、変換されたDNAを15μLに溶出した。プライマーの小文字領域は、増幅されているゲノム領域に特異的である。プライマーの大文字領域は454 Titaniumケミストリーテール(chemistry tail)および4bpバーコード(領域特異的塩基の前にある最後の4個の塩基)に対応する。複数の組み合わせでフォワードプライマーおよびリバースプライマーを組み合わせることによって、1回の配列反応で100個までの試料を多重化(multiplex)することができる。
BRCA1および細胞周期進行シグネチャーの発現アッセイ法
Amplification Grade DeoxyribonucleaseI(Sigma-Aldrich Inc.)を用いて製造業者のプロトコールに従って30分という長時間のインキュベーション時間でRNAを処理した。High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて製造業者の説明書に従って逆転写を行った。
Taqman PreAmp Master Mix Kit(Applied Biosystems)プロトコールを用いて5μL反応体積で反復プレ増幅(preamplification)を独立して行った。細胞周期遺伝子アッセイ法の場合、プレ増幅反復をそれぞれ8サイクルおよび18サイクルで行った。BRCA1アッセイ法のみ3回のプレ増幅反復を18サイクルで行った。増幅後産物を低EDTA Tris-EDTA(TE)で1:5に希釈した。次いで、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)をGene Expression M48 Dynamic Arrays(Fluidigm, South San Francisco, CA)において製造業者のプロトコールに従って実施および評価した。比較サイクル閾値(CT)法を用いて相対遺伝子発現を算出した。異なるサイクル数のプレ増幅からのCTsを、全ての反復に共通してみられる、反復における遺伝子の平均によって中心に置いた。結果として得られた値を、最初に、ハウスキーパー(housekeeper)遺伝子の平均CTsによって、次いで、第1のコホートに由来する全ての試料に対する各アッセイの規準化されたCTsの平均によって規準化して、ΔΔCTを得た。CCPスコアおよび相対BRCA1発現を、それぞれ、細胞周期遺伝子およびBRCA1アッセイ法のΔΔCTsの負数の平均として算出した。
BRCA1発現が消失した試料の特定:
CCP発現およびBRCA1発現が反相関している(anti-correlated)試料をBRCA1欠損と定義した。BRCA1発現が異常な患者を特定するための閾値を、大きな卵巣癌試料セット(n=300)においてロバスト線形回帰を用いて定義した。繰り返し加重最小二乗 (IWLS)を用いてBRCA1発現をCCPスコアに対して回帰推定した。下端にある99％予測間隔の外にある点を異常とみなした。この方法は、Timmsらに対する国際出願番号PCT/US2011/054369においてさらに詳細に述べられている。
Affymetrix 500K GeneChipアレイ
Affymetrix Mapping 500K NspIまたはStyIマイクロアレイハイブリダイゼーション用のビオチン化DNAの作製において、Affymetrix GeneChip Mapping NspIまたはStyI Assay Kitを使用した(それぞれのアッセイ法を別々に調製した)。ゲノムDNA(250ng)をNspIまたはStyI制限酵素で消化し、T4 DNAリガーゼを用いてアダプターを制限断片末端に付加した。アダプターにより改変された試料を、Clontech Titanium Taqを用いてPCR増幅した。これにより、平均サイズ200〜1,100bpの増幅産物が作製された。Clontech DNA増幅精製キットを用いて増幅産物を精製した。Affymetrix Fragmentation Reagentを用いて90μgの精製DNAを断片化した。断片化試料を、GeneChip DNA Labeling Reagentを用いてビオチン標識した。ビオチン標識DNAを、Affymetrix回転オーブン(rotation oven)に入れてNspIまたはStyI Affymetrixマイクロアレイ上で49℃において16〜18時間ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、プローブアレイ洗浄手順および染色手順を製造業者のマニュアルに従って自動Affymetrix Fluidics Stationsで行った。マイクロアレイをスキャンし、生データをAffymetrix GeneChip Scanner 3000によって収集した。
SNPマイクロアレイデータのCN分析およびLOH分析
このアルゴリズムは、それぞれのSNP位置において可能性が最も高い対立遺伝子特異的コピー数を決定するように設計されている。対応する可能性は、非癌ストローマ細胞DNAによる癌DNA試料の汚染をはっきりと考慮に入れている。CN分析用の同様のアルゴリズムがAbkevichらに対する国際出願番号PCT/US2011/026098(公報番号WO/2011/106541)において詳述されている。本文書において使用するアルゴリズムを2つのバージョンで実行した。一方は内部で作成されたAffymetrix 500K GeneChip アレイデータの分析用であり、他方はTCGAウェブサイト(http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm? diseaseType=OV)からダウンロードされたGenomeWideSNP6 Affymetrixアレイデータの分析用である。後者のアレイはSNPプローブに加えて、ヒトゲノム全体にわたる非多型位置用の多数のプローブを含有する。これらのプローブはCN分析に有益であるが、LOH分析に直接有益でない。
統計解析
本文書におけるp値は、他で特定しない限りコルモゴルフ・スミルノフ(Kolmogorov-Smirnov)検定を用いて算出した。
結果
HR欠損腫瘍
腫瘍試料は、BRCA1またはBRCA2の生殖系列変異もしくは体細胞変異またはBRCA1のメチル化もしくはmRNA低発現があった場合にHR欠損であるとみなした。第2のコホートに由来する53個の試料のうち14個および第3のコホートに由来する435個の試料のうち83個(これらのうち2つをさらなる分析から排除した。下記を参照されたい)と共に、第1のコホートに由来する152個の試料のうち31個がBRCA1変異および/またはBRCA2変異のキャリアであった。変異を表4にまとめた。
（表４）試験コホートにおいて検出されたBRCA1、BRCA2、およびRAD51Cの異常
Figure 0006700333
1 1コピーのBRCA2がインタクトなままであったため、これらの変異のうち2つを分析から排除した。
BRCA1およびBRCA2両方のプロモーターCpGアイランドを対象にしてメチル化度を測定した。BRCA1では複数の試料においてメチル化が観察されたが、BRCA2では観察されなかった。第1のコホートに由来する126個の試料のうち11個、第2のコホートに由来する34個のうち3個、第3のコホートに由来する435個の試料のうち64個が高レベルのBRCA1プロモーターメチル化によりHR欠損であると定義された。有害なBRCA1変異またはBRCA2変異は、第3のコホートに由来する1つの試料を除いて、これらの試料のいずれにも観察されなかった。
BRCA1またはBRCA2のmRNA低発現もHR欠損につながる可能性があり、プロモーターメチル化以外の機構の結果である可能性がある。第1のコホートに由来する137個の試料および第2のコホートに由来する53個の試料を対象にしてBRCA1およびBRCA2の発現レベルを測定した。20個の試料においてBRCA1発現が異常に低かった。BRCA1発現が異常に低い5個の試料しか、BRCA1プロモーターメチル化によりHR欠損であるとフラグが立てられなかった。BRCA2では異常に低い発現は観察されなかった。
機能するためにはインタクトな1コピーのBRCA1またはBRCA2が必要である。全てのBRCA1欠損試料について、BRCA1遺伝子はLOH領域内に含まれる。さらに、2個を除く全てのBRCA2欠損試料についてBRCA2遺伝子がLOH領域内に観察される。これらの2個のBRCA2欠損試料は本発明者らの分析においてHR欠損であるとみなされなかった。
LOH領域の長さの分布
異なる長さのLOHを有する領域は異なる経路を介して癌ゲノムに現れる可能性があり、従って、LOHとHR欠損との関係はLOH領域の長さによって決まる可能性があるというのが初期の仮説であった。これらのLOH領域が観察されている染色体腕の長さについて補正されたLOH領域の長さの分布を図16に示した。13番染色体、14番染色体、15番染色体、および22番染色体を排除した。なぜなら、これらの染色体の短腕にはSNPが利用できないからである。この分布において3つの特異な特徴が観察された。第一に、多くの短いLOH領域がある。第二に、1本の染色体腕の長さまである、長く平らなLOH領域テールがある。1本の染色体腕より長いが、染色体全体より短いLOH領域はほとんどない。最後に、染色体全体にわたるLOHに対応する高いピークがある。観察された分布は、CNのばらつきについて得られた類似の分布(Beroukhim et al. 2010)とは全く異なる。このことから、CNのばらつきにおよびLOH領域は異なる機構を介して発生し得ることが示唆される。
HR欠損を有する試料とLOHを有する試料の間の相関関係
試料の第1のコホートを「発見(discovery)」コホートとして使用した。ほぼ全ての試料において17番染色体全体にわたってLOHが観察されたのでこの染色体上にあるLOH領域を分析から排除したのは、おそらく、卵巣癌進行に重要な遺伝子がこの染色体にあると考えられるためである。本発明者らは、HR欠損と、短いLOH領域(<15Mb)の数、長いLOH領域(>15Mbであるが、染色体全体より短い)の数、および染色体全体をカバーするLOH領域の数の間の相関関係を調べた。様々な異なるLOH領域の長さのカットオフを使用することができる。HR欠損の検出に対するこのカットオフの影響を図19およびその付随する考察において調査したが、15Mbが一般的に好ましいと見出された。短いLOH領域の数とHR欠損の間には有意な相関関係は無かった。染色体全体をカバーするLOH領域の数はインタクトなBRCA1またはBRCA2を有する腫瘍において有意に多かった(p=4×10-5)。長いLOH領域の数(本実施例3の後、および本文書全体を通して「HRDスコア」と呼ぶ)は欠損BRCA1または欠損BRCA2を有する腫瘍において有意に高かった(p=9×10-11)(図17a)。
第2のコホートおよび第3のコホートを用いて、第1のコホートについて得られた結果を検証した。HR欠損と染色体全体をカバーするLOH領域の数との相関関係は、第2のコホートでは、おそらく少ない試料数のために検証されなかったが、第3のコホートでは、インタクトなBRCA1およびBRCA2のある腫瘍の中で有意に大きかった(p=3×10-11)。両コホートについてHRDスコアとHR欠損の間で強く有意な相関関係が観察され(それぞれp=2×10-7およびp=9×10-30)、インタクトなBRCA1およびBRCA2を有する卵巣腫瘍の中でHRDスコアは明らかに小さかった(図17bおよび図17c)。
RAD51Cおよび他のHR経路遺伝子における変化
入手可能なデータから、BRCA1およびBRCA2は卵巣癌においてHR欠損を担う主要な遺伝子であることが示唆されている。しかしながら、他の多くの遺伝子も重要である可能性があり、例えば、RAD51C(Meindl et al., 2010)およびRAD51D(Loveday et al., 2011)は、最近、卵巣癌の素因遺伝子として意味づけられている。第1のコホートにおいて、HR経路に関与する8個のさらなる遺伝子のプロモーターCpGアイランドを対象にしてメチル化度を測定した(表5)。RAD51Cにのみ高レベルのプロモーターメチル化があった(89個の試料のうち3個)。第3のコホートにおいて、435個の試料のうち11個にRAD51Cプロモーターメチル化があった。両コホートに由来するRAD51Cメチル化ポジティブ試料の全てがLOHのためにRAD51C遺伝子座においてホモ接合性であった。RAD51Cプロモーターメチル化を有する試料においてHRDスコアが高いかどうか試験するために、両コホートに由来するこれらの試料を、RAD51Cメチル化が無いBRCAインタクトな試料と比較した。BRCA1遺伝子およびBRCA2遺伝子についての本発明者らの観察と一致して、RAD51Cメチル化を有する試料の中でHRDスコアは有意に高かった(p=0.0003)。
（表５）使用したプロモーターメチル化アッセイ法(SABiosciences)
Figure 0006700333
第3のコホートにおいて、HR経路遺伝子の有害な変異およびメチル化が報告されている(TCGA,2011)。変異を調査し、分析を、有害になる可能性が高い異常(例えば、ナンセンス変異およびフレームシフト変異)に限定した。その結果、6個の遺伝子(ATM、ATR、FANCA、FANCD2、FANCM、およびPALB2)において合計8個の有害な変異が得られた。5個のさらなる試料にHR経路遺伝子のメチル化があった。第2の対立遺伝子の消失は13個の試料のうち1個にしか検出されなかった(FANCMナンセンス変異)。腫瘍抑制因子の機能を無くすためには両対立遺伝子の非活性化が必要であるので、これらの13個の試料のほとんどがインタクトなHRを有すると予想される。驚くべきことではないが、これらの試料の大半においてHRDスコアは高くなかった。
複合データの分析
3つ全てのコホートのHRDスコアとHR欠損(BRCA1欠損、BRCA2欠損、またはRAD51C欠損と定義した)との相関関係を図17dに示した。極めて有意な関係が認められた(p=2×10-54)。
重要な問題は、異なるゲノム遺伝子座によるHR欠損についてHRDスコアの分布が同じであるかどうかである。これに答えるために、BRCA1欠損腫瘍、BRCA2欠損腫瘍、およびRAD51C欠損腫瘍のHRDスコアの分布を別々に分析した(図21)。有意差が観察され(p=7×10-5)、BRCA1欠損試料の平均HRDスコア(16.1;SD=4.3)はBRCA2欠損試料(13.0;SD=3.9)より高かった。BRCA1またはBRCA2のいずれかとRAD51C(14.5;SD=5.1)とのHRDスコアの差は有意でなかった。
第1の2つのコホートに由来する一部の試料および第3のコホートに由来する全ての試料から正常組織が入手可能であった。これを用いて、BRCA1およびBRCA2の変異が生殖系列変異または体細胞変異であったかどうかを判定した。BRCA1欠損またはBRCA2欠損のいずれかのHRDスコアの分布において体細胞と生殖系列の間に有意差はない(図20)。
BRCA1欠損細胞株およびBRCA2欠損細胞株におけるHRDスコア
選択されなかった乳房細胞株(n=34)および卵巣細胞株(n=29)を複数の供給源から入手した。BRCA1およびBRCA2の状態が公表されている、NCI60から入手したさらに3個の結腸細胞株および1個の膵臓細胞株を分析した。これらの67個の細胞株のうち、7個にホモ接合性の有害な変異があったか、BRCA1プロモーターメチル化があり、2個に明らかな機能復帰変異を伴うホモ接合性変異があり、6個にヘテロ接合性変異があった。図18aは、これらの3つの変異体群ならびに野生型試料のHRDスコアの分布を示す。野生型卵巣腫瘍と野生型癌細胞株の間でHRDスコアの分布は有意差がない。ヘテロ接合性変異のある癌細胞株の中でHRDスコアの分布は野生型癌細胞株に似ている。おそらく、BRCA1またはBRCA2の両コピーが機能しなくなる場合にだけ、細胞がHR欠損になるためであろう。BRCA1またはBRCA2いずれかの両コピーの機能的消失のある癌細胞株について、BRCA1欠損遺伝子、BRCA2欠損遺伝子、またはRAD51C欠損遺伝子を有する卵巣腫瘍について観察されたHRDスコアに似た高いHRDスコアが観察された。BRCA1変異およびBRCA2変異の復帰変異を有する癌細胞株についてもHRDスコアが高い。このことは、HR欠損が不可逆的なLOH変化をもたらすという最初の仮説を裏付けている。野生型細胞株またはヘテロ接合性変異細胞株におけるHRDスコアの分布と、ホモ接合性変異(復帰変異あり、もしくは復帰変異なし)またはBRCA1プロモーターメチル化を有する細胞株におけるHRDスコアの分布との差は極めて有意である(p=10-5)。重要なことに、データセットから卵巣癌細胞株を除いた後、HRDスコアとBRCA1欠損およびBRCA2欠損の間に有意な相関関係がある(p=0.01)。このことは、HRDスコアとHR欠損との関係は卵巣癌に限定されないことを示唆している。
HR欠損と全生存期間(OS)と無増悪生存期間(PFS)との相関関係
高いHRDスコアを有している患者の生存が改善した第3のコホートについて、PFS(p=0.03)とOS(p=6×10-5)の間で有意な相関関係が観察された(図18b)。Coxモデルを用いてP値を算出した。この結果は、BRCA1およびBRCA2の生殖系列変異が卵巣癌を対象にしたアウトカム改善と関連することを示す以前に報告されたデータと一致し、かつこのデータを展開する(Rubin et al., 1996, Boyd et al., 2000; Cass et al., 2003; Tan et al., 2008, Hennessy et al., 2010)。
考察
HRDスコアを2つの独立した卵巣癌データセットにおいて検証した。HRDスコアは、乳房細胞株および膵臓細胞株においてもHR欠損の原因となる変異を反映した。
（表６）BRCA1およびBRCA2が欠損した腫瘍ならびにBRCA1およびBRCA2がインタクトな腫瘍についてのHRDスコアの平均、ならびに対応するp値
Figure 0006700333
15Mbより長いが、染色体全体より短い中間クラスのLOHサイズは欠損HR遺伝子と強く正に相関した。このことから、このタイプのLOHクラスの全てではないがほとんどが、その発生の一環として二重鎖DNA切断を組み込み、HRによる修復を必要とするために存在することが示唆される。対照的に、染色体全体レベルでのLOHの頻度はHR欠損腫瘍において有意に低かった。染色体全体レベルでのLOHは、二重鎖DNA切断が関与しない別の競合機構により発生するということが考えられる1つの説明である。
BRCA1異常およびBRCA2異常に加えて、RAD51Cプロモーターメチル化が卵巣腫瘍において観察された。2つのデータセットにおいて高いHRDスコアがRAD51C欠損と有意に関連付けられた。3つのデータセットにおいて、さらなるHR欠損腫瘍は1つしか確認されず、LOHによるFANCMナンセンス変異が第2の対立遺伝子を消失させた。FANCM変異に関連したHRDスコア(8)はHRDスコアの高い試料について正常分布の範囲内にある。
明らかにインタクトなBRCA1、BRCA2、およびRAD51Cを有する腫瘍の中で、相当な割合の試料が高いHRDスコアを有する。これらの試料の多くにおいて他のHR経路遺伝子にかなりの割合の異常があるということが考えられる1つの説明である。正常組織による腫瘍の汚染が異常の検出を複雑にしているということが別の説明である。データから、HRDスコアは他のアッセイ法より汚染に対する感度が低く、検出されなかった異常が、かなりの割合の高HRDスコア試料を説明し得ることが示唆される(補足結果を参照されたい)。
発表された研究から、BRCA2変異細胞株において白金剤への曝露後に、BRCA2機能を回復させる二次復帰変異が発生し得ることが証明されている(Sakai et al., 2009; Sakai et al., 2008; Edwards et al., 2008)。Norquist et al., (2011)は、再発腫瘍の約28％にBRCA機能を回復させる二次変異があることを観察した。復帰変異は、主として、白金剤への前曝露が行われた個体において見られ、白金耐性を予測するものであった。HRDスコアは、腫瘍ゲノムにおいて発生する累積異常に起因する。DNAベースのHR欠損マーカーはHR欠損と機能的に結び付けられているので、HR欠損と強く関連付けられている可能性が高い。結果として、HRDスコアは極めてロバストなHR欠損尺度である。しかしながら、その永続性は、スコアが復帰変異に対する感度が低いという可能性が高いことを意味する。本研究において用いられた腫瘍から処置後試料を入手できなかった。しかしながら、細胞株から得られたデータはこの仮説と一致する。復帰変異が検出されないと偽陽性となる。これは、ネオアジュバント状況またはアジュバント状況において、ごくわずかな腫瘍に影響を及ぼす可能性が高く(Norquist et al., 2011)、見込みのある非反応者であると間違って個体を特定する偽陰性より重要でない。
高いHRDスコアはHR欠損と強く相関する。このスコアを用いて、(作用物質の中でも)DNA損傷物質およびPARP阻害物質に反応する可能性の高い患者を特定することができる。このような試験は乳癌および卵巣癌において明らかに臨床上有用であり、HR欠損があまり特徴付けられていない他の癌へのPARPiおよび白金塩の使用を拡大するのに使用することができる。
実施例4-HR欠損アッセイ法のさらなる検証
材料および方法
本実施例において分析した患者コホートは56人の乳癌患者を含んだ。これらの乳癌患者は全員、BRCA変異ポジティブであるか、トリプルネガティブ乳癌を有する(ほとんどがTNBCである)。ステージI〜IIIが含まれた(ほとんどがIIまたはIIIであった)。患者に、6サイクルのネオアジュバントゲムシタビン+イニパリブ+カルボプラチンを与えた。反応を、治療後の比較的少ない残存癌量(residual cancer burden)として測定した。
56個の新鮮凍結した乳腺腫瘍を分析した。汚染度の中央値は60％である。9個の試料の汚染は少なくとも90％であった。これらの腫瘍のうち11個がBRCA1有害変異のキャリアであり、3個がBRCA2有害変異のキャリアであった。これらの腫瘍の全てにおいて欠損遺伝子にLOHがあった。BRCA1有害変異のキャリアのうち1つにBRCA2有害変異もあった。しかしながら、この試料にはBRCA2遺伝子にLOHが存在しなかった。
治療に反応した患者(残存癌量0または1)から30個の試料を入手した。これらのうち13個はBRCA1/2欠損である。26個の試料を非反応者(残存癌量2または3)から入手した。このうち1人はBRCA1欠損である。Affymetrix MIPアレイを用いたAffymetrixによってジェノタイピング分析を行った(米国特許第6,858,412号;米国特許出願公開第US20060234264号; Hardenbol et al., Nature Biotechnology (2003) 21: 673-678;Wang et al., BMC Med Genomics (2009) 2:8に記載;これらはそれぞれ、その全てが参照により本明細書に組み入れられる)。HRDスコアを前記のように算出した。
結果
反応者の平均HRDスコアは16.5であった。BRCA1/2インタクト反応者およびBRCA1/2欠損反応者の平均HRDスコアは同じであった。非反応者の平均HRDスコアは11.4であった。BRCA1/2インタクト非反応者の平均HRDスコアは11.6であり、BRCA1欠損非反応者の平均HRDスコアは8であった。マンホイットニーU検定によって、治療に対する反応とHRDスコアとの関係のp値は0.004であった。BRCA1/2欠損試料を排除した場合、治療に対する反応とHRDスコアとの関係は有意なままである(p値=0.02)。
残存癌量0および1の試料の間でのHRDスコア差は有意でなかった。同様に、残存癌量2および3の試料の間でのHRDスコア差は有意でなかった。治療に対する反応と臨床パラメータ(病期、悪性度)との相関関係は有意でなかった。
他の態様
本発明は本発明の詳細な説明と共に説明されたが、前述の説明は例示を目的とし、本発明の範囲を制限しないことが理解されるはずである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点、および変更は添付の特許請求の範囲内にあるものである。

Claims (32)

  1. 以下の工程を含む、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、および/またはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法:
    癌細胞において、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、少なくとも１１メガベースであり、該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞である、工程;および
    該LOH領域の総数が参照数を上回る場合に、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性が示され、該参照数が、１０またはそれ以上である、工程。
  2. 以下の工程を含む、パクリタキセルまたはドセタキセルを含む癌治療レジメンに対する癌患者の反応を予測する方法:
    癌細胞において、該癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中のLOH領域の総数を決定する工程であって、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該第1の長さが、少なくとも１１メガベースであり、該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞である、工程;および
    該LOH領域の総数が参照数を上回る場合に、該癌治療レジメンに該癌患者が反応し得ない可能性が示され、該参照数が、１０またはそれ以上である、工程。
  3. 請求項１に記載の方法により、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、および／またはPARP阻害物質を含む該癌治療レジメンに反応し得ると予測された癌患者、または請求項２の方法により、パクリタキセルまたはドセタキセルを含む該癌治療レジメンに反応し得ないと予測された癌患者に投与されるように用いられることを特徴とする、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物を含む、癌を治療するための医薬。
  4. 請求項１に記載の方法により、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、および／またはPARP阻害物質を含む該癌治療レジメンに反応し得ると予測された癌患者、または請求項２の方法により、パクリタキセルまたはドセタキセルを含む該癌治療レジメンに反応し得ないと予測された癌患者に投与されるように用いられることを特徴とする癌を治療するための医薬を製造するための、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、およびPARP阻害物質からなる群より選択される1種または複数種の薬物の使用。
  5. (a)ゲノムDNAについて複数のシグナルを発生するように構成され、該シグナルが、癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体における遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性を同定し、および該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞である、試料分析器、および
    (b)該少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数を該複数のシグナルに基づいて算出するようにプログラムされており、該指標LOH領域が、少なくとも１１メガベースであるが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短いLOHにより特徴付けられる、ヒトX/Y性染色体対以外の一対のヒト染色体中のLOH領域であり、および癌患者が、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに反応し得る可能性を判定するように該指標LOH領域の数を参照数と比較するようにプログラムされており、該参照数が、１０またはそれ以上である、コンピュータサブシステム
    を備える、癌患者の該癌細胞のLOH状態を判定するためのシステム。
  6. (a)ヒトゲノムDNAの複数の多型遺伝子座にハイブリダイズすることができる、少なくとも500個のオリゴヌクレオチド;および
    (b)癌細胞の少なくとも一対のヒト染色体中の指標LOH領域の数を、該遺伝子座のホモ接合性またはヘテロ接合性を同定する複数のシグナルに基づいて算出するようにプログラムされており、該指標LOH領域が、少なくとも１１メガベースであるが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短いLOHにより特徴付けられる、ヒトX/Y性染色体対以外の一対のヒト染色体中のLOH領域であり、および癌患者が、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに反応し得る可能性を判定するように該指標LOH領域の数を参照数と比較するようにプログラムされており、該参照数が、１０またはそれ以上であり、および該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞である、コンピュータプログラム製品、
    を含む、診断キット。
  7. ヒトゲノムDNAの均一の間隔の複数の多型遺伝子座にハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチドの使用であって、
    (a)癌患者から得られたヒト癌細胞からの少なくとも1つの染色体対中の指標LOH領域の総数を決定し、
    ここで、各オリゴヌクレオチドは、特定の多型遺伝子座にハイブリダイズし、および該該指標LOH領域が、少なくとも１１メガベースであるが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短いLOHにより特徴付けられる、ヒトX/Y性染色体対以外の一対のヒト染色体中のLOH領域であり、および該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞であり、かつ
    (b)該癌患者が、DNA損傷物質、アントラサイクリン、トポイソメラーゼI阻害物質、放射線、もしくはPARP阻害物質を含む癌治療レジメンに該癌患者が反応し得る可能性の増加を検出するための、
    使用。
  8. 以下の工程を含む、患者において予後を判定する方法:
    (a)患者に由来する試料においてLOHシグネチャー(signature)を有する癌細胞を該患者が含むかどうかを判定する工程であって、癌患者の癌細胞からの少なくとも一対のヒト染色体中の参照数より多いLOH領域の存在が、該LOHシグネチャーを該癌細胞が有することを示し、該LOH領域が、第1の長さより長いが、該LOH領域を含有する染色体全体の長さより短く、該少なくとも一対のヒト染色体がヒトX/Y性染色体対ではなく、該参照数が、１０またはそれ以上であり、該第1の長さが、少なくとも１１メガベースであり、および該癌細胞が、卵巣癌、乳癌、肺癌または食道癌の原発癌細胞若しくは転移癌細胞である、工程;および
    (b)(1)該LOHシグネチャーの存在に基づいて、該患者の、該患者の癌タイプを有する平均的な参照患者と比較した場合の生存の可能性の増加が示される工程;または
    (b)(2)該LOHシグネチャーの非存在に基づいて、該患者の、該患者の癌タイプを有する平均的な参照患者と比較した場合の生存の可能性の減少が示される工程。
  9. 前記LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、請求項1、2または8に記載の方法。
  10. 前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、請求項5に記載のシステム。
  11. 前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、請求項6に記載のキット。
  12. 前記指標LOH領域が、少なくとも2対、5対、10対、または21対のヒト染色体において決定される、請求項7に記載の使用。
  13. 前記LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、請求項1、2または8に記載の方法。
  14. 前記指標LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、請求項5に記載のシステム。
  15. 前記指標LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、請求項6に記載のキット。
  16. 前記指標LOH領域の総数が9個、15個、20個、またはそれ以上である、請求項7に記載の使用。
  17. 前記参照数が、11個、12個、もしくは13個であるか、またはそれを上回る、請求項1、2または8に記載の方法。
  18. 前記参照数が、11個、12個、もしくは13個であるか、またはそれを上回る、請求項5に記載のシステム。
  19. 前記参照数が、11個、12個、もしくは13個であるか、またはそれを上回る、請求項6に記載のキット。
  20. 前記少なくとも一対のヒト染色体が、ヒト17番染色体ではない、請求項1、2または8に記載の方法。
  21. 前記少なくとも一対のヒト染色体が、ヒト17番染色体ではない、請求項5に記載のシステム。
  22. 前記少なくとも一対のヒト染色体が、ヒト17番染色体ではない、請求項6に記載のキット。
  23. 前記少なくとも一対のヒト染色体が、ヒト17番染色体ではない、請求項7に記載の使用。
  24. 前記指標LOH領域が、ヒト17番染色体中にない、請求項5に記載のシステム。
  25. 前記指標LOH領域が、ヒト17番染色体中にない、請求項6に記載のキット。
  26. 前記指標LOH領域が、ヒト17番染色体中にない、請求項7に記載の使用。
  27. 前記DNA損傷物質が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチンであり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項1に記載の方法。
  28. 前記DNA損傷物質が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチンであり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項3に記載の医薬。
  29. 前記DNA損傷物質が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサラプラチン、もしくはピコプラチンであり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項4に記載の使用。
  30. 前記DNA損傷物質が、白金系化学療法薬であり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項5に記載のシステム。
  31. 前記DNA損傷物質が、白金系化学療法薬であり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項6に記載のキット。
  32. 前記DNA損傷物質が、白金系化学療法薬であり、前記アントラサイクリンが、エピルビシンもしくはドキソルビシンであり、前記トポイソメラーゼI阻害物質が、カンポテシン、トポテカン、もしくはイリノテカンであり、または、前記PARP阻害物質が、オラパリブ、もしくはベラピリブである、請求項7に記載の使用。
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