WO2009045122A1 - Medicinal agent for treating and preventing diabetes complications - Google Patents
Medicinal agent for treating and preventing diabetes complications Download PDFInfo
- Publication number
- WO2009045122A1 WO2009045122A1 PCT/RU2008/000250 RU2008000250W WO2009045122A1 WO 2009045122 A1 WO2009045122 A1 WO 2009045122A1 RU 2008000250 W RU2008000250 W RU 2008000250W WO 2009045122 A1 WO2009045122 A1 WO 2009045122A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- peptide
- drug according
- water
- proinsulin
- soluble polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
Definitions
- the invention relates to pharmacology and medicine, in particular, to endocrinology, and can be used to obtain drugs intended for the prevention and treatment of diabetic complications.
- the human proinsulin C-peptide (connecting peptide) is a peptide consisting of 31 amino acids with the following sequence: EAEDLQ VGQVELGGGPGAGSLQPLALEGLSLQ.
- the C-peptide is an indicator of the formation of insulin from proinsulin in the beta cells of the pancreatic islets of Langerhans. Insulin and C-peptide are the end products of the conversion of proinsulin as a result of exposure to endopeptidase.
- the main purpose of the C-peptide in medicine is its use mainly for diagnostic purposes, in particular for monitoring the functioning of beta cells and their production of insulin; to assess the residual synthetic function of beta cells; when selecting a dose of insulin, especially in case of ineffectiveness of the use of oral hypoglycemic drugs and to confirm the remission of diabetes mellitus; etc. (“IPsulip, Pro-tidine and proinsulin in nondiabetics apd IPsulip-treated diabetics.” Heding LG. // Diabetes 1978; 27 Sprl 1: 178-183
- Insulin is a polypeptide hormone with a molecular weight of about 6000. It affects all types of metabolism in the body: it increases the penetration of glucose into the body tissues and its use, reduces the glycogen content in the liver and increases its amount in the muscles, increases the intensity of protein synthesis, and t .d.
- angiopathy nephropathy and retinopathy
- neuropathy the development of antibodies to insulin and the development of insulin resistance appear, resulting in inefficiency in the correction of glycemia and the development of ketoacidosis.
- peridin angioprotectors prodectin, anginin
- dobesylcalcium doxium
- etamsylate dicinone
- antispasmodics pentoxifylline currental
- xanthinol nicotinate theonicol, compliance
- drugs that improve cerebral circulation - cavinton and others.
- Some of these drugs have a positive effect on the hemostatic system and rheological properties of the blood, although for this purpose 5 anticoagulants, antiplatelet agents, drugs that affect coronary circulation, heparin, reopoliglukin, dipyridamole (chimes), acetylsalicylic acid, etc. . (Starkova N.T. Clinical endocrinology, p. 189, M., 1983).
- the problem to which the invention is directed is to create a medicine for the treatment and prevention of diabetic complications based on the proinsulin C-peptide, suitable for both oral and parenteral use, and having a prolonged action of the C-peptide in the body.
- the proposed drug as a water-soluble polymer contains a polymer of a molecular weight of not more than 20,000 Da, preferably from 400 to 20,000 Da, and most preferably a molecular weight of from 400 to 4000 Da, for example, polyethylene oxide or polyvinylpyrrolidone, or isoprenol, or dextran, or polyacrylamide, or polyurethane.
- the implementation of the drug as a water-soluble polymer contains polyethylene oxide, molecular weight from 400 to 4000 Da.
- the drug contains a pro-insulin C peptide immobilized on a water-soluble polymer in the following ratio, in wt.%:
- the agent may contain isolated and purified natural or synthetic, or genetically engineered C-peptide of proinsulin, as well as proinsulin as a source of C-peptide, or a mixture of C-peptide and proinsulin.
- the agent may be a lyophilized form, or a solution, or a tablet form, or an encapsulated form containing a therapeutically effective amount of a C-peptide.
- the drug may contain 950 mg of proinsulin C-peptide, and the solution may contain from 1 to 50 mg of C-peptide per 1 ml of solution.
- the medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable solvent, for example, saline or water.
- a pharmaceutically acceptable solvent for example, saline or water.
- the medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable preservative, for example trehalose, mannitol, nipogen or dextran.
- a pharmaceutically acceptable preservative for example trehalose, mannitol, nipogen or dextran.
- the medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient, for example, dextran, starch or microcrystalline cellulose.
- the drug may further comprise a pharmaceutically acceptable combination of preservative, diluent, excipient in any pharmaceutically acceptable combination and ratio.
- the drug is suitable for oral and / or parenteral and / or inhalation use, for example, intranasally.
- the proposed drug is prepared by covalent immobilization of the pro-insulin C-peptide on a water-soluble polymer using high-energy ionizing radiation in a dose that ensures free radical reactions.
- the immobilization process is carried out in an aqueous medium by mixing the C-peptide with an aqueous polymer solution pretreated with high-energy ionizing radiation.
- As ionizing radiation mainly gamma radiation or a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0-5.0 Mrad is used.
- polymers traditional for immobilizing biologically active compounds are used, preferably polymers with a molecular weight of not more than 20,000 Da, preferably from 400 to 20,000 Da, for example, polyethylene oxide or polyvinylpyrrolidone, or isoprenol, or dextran, or polyacrylamide, or polyurethane.
- polyethylene oxide of molecular weight from 400 to 4000 Da is used as a water-soluble polymer. Immobilization is carried out with a ratio of C-peptide: water-soluble polymer 1: 1-500. To do this, prepare a 1-50% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of from 400 to 4000 Da. Then the solution is irradiated with high-energy ionizing radiation, mainly gamma radiation or a stream of accelerated electrons in doses that ensure the flow of free radical reactions, mainly 1.0-5.0 Mrad.
- high-energy ionizing radiation mainly gamma radiation or a stream of accelerated electrons in doses that ensure the flow of free radical reactions, mainly 1.0-5.0 Mrad.
- a pro-insulin C-peptide is introduced into a solution of radiation-activated polyethylene oxide to a final concentration (protein) of 1 to 10 mg / ml, the mixture is stirred for 10-30 minutes until a homogeneous, clear or slightly opalescent solution is obtained.
- protein protein
- highly active carbonyl groups are formed in a water-soluble polymer.
- the polymer activated in this way forms a water-soluble complex with the C-peptide, which effectively prevents and treats diabetic complications, such as diabetic foot, retinulopathy, nephropathy, both when administered orally and parenterally.
- the immobilization of the C-peptide on dextran is also carried out in two stages. At the first stage, they are carried out using an accelerator elementary particles activation of dextran, for example, with a molecular weight of 30-40 kDa. When exposed to a solution of dextran with a free electron beam at a dose of 2 Mrad, active aldehyde groups are formed, due to which C-peptide is immobilized. At the second stage, when the C-peptide is added to the dextran solution in a ratio of 1: 10, covalent crosslinking of the C-peptide and dextran occurs. In this case, 98% of the C-peptide form a complex with dextran.
- Figure 1 shows the IR spectra of the C peptide, 1.5 kDa polyethylene oxide, and the C peptide immobilized on 1.5 kDa polyethylene oxide as described in example 1, where the IR spectrum of the C peptide is line 1, the spectrum of the C- conjugate peptide with polyethylene oxide - line 2, and the spectrum of polyethylene oxide - line 3 (in order from top to bottom on the left side of the spectrum, the bottom of the sheet).
- Figure 2 presents the dynamics of the concentration of C-peptide in rat blood plasma after subcutaneous administration of the native (line 1) and immobilized C-peptide (line 2).
- FIG. 1 The dynamics of the concentration of C-peptide in the blood plasma of rats after oral administration of the native (line 1) and immobilized C-peptide (line 2) is presented. Examples of carrying out the invention.
- the invention is illustrated by the following specific examples of the preparation of the proposed medicinal product containing a proinsulin C-peptide prepared on the basis of a genetically engineered C-peptide.
- Example 1
- a 10% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 1.5 kDa (polyethylene oxide 1500) is irradiated with a stream of accelerated electrons in a dose of 5.0 Mrad.
- the C-peptide is added to the irradiated polyethylene oxide solution to a final concentration of 10 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 10: 1).
- the mixture is stirred for 10 minutes and receive the preparation of the C-peptide in the form of a slightly opalescent solution.
- the yield of the finished product is 98%.
- a 50.0% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 0.4 kDa is irradiated with inhibitory gamma radiation at a dose of 1.0 Mrad.
- the C-peptide is added to the irradiated solution of polyethylene oxide to a final concentration of 1 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 500: 1).
- the mixture was stirred for 30 minutes to give the C-peptide preparation as a clear solution.
- the yield of the finished product is 97%.
- a 5% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 15 kDa is irradiated with a stream of accelerated electrons at a dose of 2.5 Mrad.
- the C-peptide is added to the irradiated solution of polyethylene oxide to a final concentration of 10 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 5: 1).
- the mixture was stirred for 15 minutes and a C-peptide preparation was obtained as a slightly opalescent solution.
- Output ready product is 99%.
- the table presents data on the study of the effectiveness of polyethylene oxide-modified human genetically engineered C-peptide, obtained as described in Example 1, on a model of alloxan diabetes in rats ( ⁇ radella CT, Legso MM, Mashedo JL, Macedo CS, Lopg- term effects of ipsulip th réelleraru, islap tr réellesplapt réelletiop, and pancreas transplantation ip th flesh specializedreveptiop adoptedf glomerular Northhapg Americanss ip kidp Americas (7)f hidrllohap-ypdu proposedd YlpReslt.
- the data in the table shows that the proposed tool can not only reduce, but also stabilize the glucose level of 80% compared with intact animals, which indicates high therapeutic efficacy.
- a morphological study also found that in animals of the experimental group, which was introduced the proposed tool, pathological changes in the internal organs associated with microangiopathies were practically absent. On the contrary, in animals of the control group, these changes were pronounced, which indicates a high therapeutic and the prophylactic activity of a C-peptide immobilized on a water-soluble polymer in relation to complications of diabetes mellitus.
- the pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant C-peptide) and the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide 1500 were carried out on 13 Wistar male rats weighing 430-540 g. Animals were kept on a standard diet of vivarium and for a while the study had free access to water and food, in accordance with the rules adopted by the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered subcutaneously at a dose of 5 mg / kg (in terms of C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
- the content of immobilized C-peptide in the blood of rats was higher than that of the native c-peptide after 30 minutes by 1.54 times, after l hours by 2.1 times, after 3 hours by 93 times, after 4 hours 107 times. This indicates that the immobilized C-peptide is more resistant to the action of blood peptidases.
- the prolonged action of the immobilized C-peptide is evidenced by the fact that it was determined in the blood 12 hours after administration, and native - after 6 hours. Determination of the pharmacokinetics of the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide, with enteral administration:
- Example 1 A study of the pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant C-peptide) and the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide 1500 (Example 1) was carried out on 5 Wistar male rats weighing 430-540 g. Animals were kept on a standard diet of vivarium and for a while the study had free access to water and food, in accordance with the rules adopted by the European Convention on protection of vertebrates used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered intragastrically using a probe at a dose of 10 mg / kg (in terms of C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
- the proposed drug can be introduced into the body not only parenterally, but also orally, as well as intranasally, and has a more prolonged effect in the body than the free C-peptide.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Description
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ Область техники MEDICINE FOR TREATMENT AND PREVENTION OF COMPLICATIONS IN DIABETES MELLITUS
Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности, к эндокринологии, и может быть использовано для получения лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечению диабетических осложнений. Предшествующий уровень техникиThe invention relates to pharmacology and medicine, in particular, to endocrinology, and can be used to obtain drugs intended for the prevention and treatment of diabetic complications. State of the art
Человеческий С-пептид проинсулина (соединительный пептид) является пептидом, состоящим из 31 аминокислоты со следующей последовательностью : EAEDLQ VGQVЕLGGGРGАGSLQРLАLЕGSLQ. С-пептид является показателем образования инсулина из проинсулина в бета-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин и С-пептид являются конечными продуктами преобразования проинсулина в результате воздействия эндопептидазы.The human proinsulin C-peptide (connecting peptide) is a peptide consisting of 31 amino acids with the following sequence: EAEDLQ VGQVELGGGPGAGSLQPLALEGLSLQ. The C-peptide is an indicator of the formation of insulin from proinsulin in the beta cells of the pancreatic islets of Langerhans. Insulin and C-peptide are the end products of the conversion of proinsulin as a result of exposure to endopeptidase.
После пероральной нагрузки глюкозой отмечается 5 — 6 кратное увеличение уровня С-пептида, которое сохраняется значительно дольше, чем у инсулина. В настоящее время начинают появляться отдельные данные (Соttеr MA, Еkbеrg К, Wаhгеп J, Cameron NE. Еffесts оf рrоiпsuliп С-рерtidе iп ехреrimепtаl diаbеtiс пеurораthу: vаsсulаr асtiопs апd mоdulаtiоп bу пitriс охidе sупthаsе iпhibitiоп.Diаbеtеs. 2003 Jul;52(7): 1812-7, Wаhгеп J, Еkbеrg К, Sаmпеgаrd В, Jоhапssоп BL. C- рерtidе: а пеw роtепtiаl iп thе trеаtmепt оf diаbеtiс перhrораthу.Сurr Diаb Rер. 2001 Dec;l(3):261-6. Rеviеw. PMID: 12643208 [РubМеd - iпdехеd fоr MEDLINE), свидетельствующие об умеренной эффективности C- пептида в лечении сахарного диабета и его осложнений, в частности для профилактики микроангиопатий: нефропатии и ретинопатии. Однако пока основным назначением С-пептида в медицине является его использование преимущественно в диагностических целях, в частности для контроля за функционированием бета-клеток и продуцировании ими инсулина; для оценки остаточной синтетической функции бета- клеток; при подборе дозы инсулина, в особенности в случае неэффективности применения пероральных сахароснижающих препаратов и для подтверждения ремиссии сахарного диабета; и т.д. ("Iпsuliп, С-рерtidе and proinsulin in nondiabetics апd iпsuliп-trеаtеd diabetics". Heding LG. // Diabetes 1978;27 Suррl 1 :178-183After an oral glucose load, a 5–6-fold increase in the level of C-peptide is observed, which lasts much longer than that of insulin. Currently begin to appear separate data (Sotter MA, Ekberg K, Wahgep J, Cameron NE Effests ° F rroipsulip C rertide Ip ehrerimeptal diabetis peurorathu: vassular astiops apd modulatiop bu pitris ohide supthase iphibitiop.Diabetes 2003 Jul; 52 (7).. : 1812-7, Wahgep J, Ekberg K, Sampegard B, Jhapssop BL. C-reptide: and first time it tеrеtаmtеpt оf diаbеtіс perchrоthу. Surr Diab Repr. 2001 Dec; l. : 12643208 [PubMed - i-tech for MEDLINE), indicating a moderate effectiveness of the C-peptide in the treatment of diabetes mellitus and its complications, in particular for the prevention of microangiopathies: nephropathy and retinopathy. However, while the main purpose of the C-peptide in medicine is its use mainly for diagnostic purposes, in particular for monitoring the functioning of beta cells and their production of insulin; to assess the residual synthetic function of beta cells; when selecting a dose of insulin, especially in case of ineffectiveness of the use of oral hypoglycemic drugs and to confirm the remission of diabetes mellitus; etc. (“IPsulip, Pro-tidine and proinsulin in nondiabetics apd IPsulip-treated diabetics.” Heding LG. // Diabetes 1978; 27 Sprl 1: 178-183
Единственным общепринятым методом лечения сахарного диабета до настоящего времени остается использование препаратов на основе инсулина. Инсулин является полипептидным гормоном с молекулярной массой около 6000. Он оказывает влияние на все виды обмена веществ в организме: повышает проникновение глюкозы в ткани организма и ее использование ими, снижает содержание гликогена в печени и повышает его количество в мышцах, повышает интенсивность синтеза белка и т.д. Однако при инсулинотерапии развивается целый ряд диабетических осложнений, в частности, появляется ангиопатия (нефропатия и ретинопатия), нейропатия, выработка антител к инсулину и развитие инсулинорезистентности, следствием чего является неэффективность коррекции гликемии и развитие кетоацидоза.The only generally accepted method for treating diabetes to date is the use of insulin-based drugs. Insulin is a polypeptide hormone with a molecular weight of about 6000. It affects all types of metabolism in the body: it increases the penetration of glucose into the body tissues and its use, reduces the glycogen content in the liver and increases its amount in the muscles, increases the intensity of protein synthesis, and t .d. However, with insulin therapy, a number of diabetic complications develop, in particular, angiopathy (nephropathy and retinopathy), neuropathy, the development of antibodies to insulin and the development of insulin resistance appear, resulting in inefficiency in the correction of glycemia and the development of ketoacidosis.
Для профилактики и лечения диабетической ангиопатии применяют ангиопротекторы пармидин (продектин, ангинин), добезилаткальций (доксиум), этамзилат (дицинон); спазмолитические средства пентоксифиллин (трентал), ксантинола никотинат (теоникол, компламин); препараты, улучшающие мозговое кровообращение, — кавинтон и др. Некоторые из этих препаратов оказывают положительное действие на систему гемостаза и реологические свойства крови, хотя с этой целью специально назначают 5 антикоагулянты, антиагреганты, препараты, влияющие на коронарное кровообращение, гепарин, реополиглюкин, дипиридамол (курантил), ацетилсалициловую кислоту и др. (Старкова Н.Т. Клиническая эндокринология, с. 189, M., 1983).For the prevention and treatment of diabetic angiopathy, parmidin angioprotectors (prodectin, anginin), dobesylcalcium (doxium), etamsylate (dicinone) are used; antispasmodics pentoxifylline (trental), xanthinol nicotinate (theonicol, compliance); drugs that improve cerebral circulation, - cavinton and others. Some of these drugs have a positive effect on the hemostatic system and rheological properties of the blood, although for this purpose 5 anticoagulants, antiplatelet agents, drugs that affect coronary circulation, heparin, reopoliglukin, dipyridamole (chimes), acetylsalicylic acid, etc. . (Starkova N.T. Clinical endocrinology, p. 189, M., 1983).
Существует несколько комплексов и схем лечения диабетических ю осложнений, например комбинированный прием в течение 1 — l V2 месяцев курантила, фитина и глутаминовой кислоты; курс внутривенных инфузий реополиглюкина (400 мл), трентала (5 мл), гепарина (раствор для инъекций с активностью 5000 ЕД в 1 мл, 6,5 мл) в течение 7 — 10 дней; курс из 10 — 15 ретробульбарных инъекцийThere are several complexes and treatment regimens for diabetic complications, for example, a combined intake of chimes, phytin and glutamic acid for 1 - l V 2 months; a course of intravenous infusions of reopoliglukin (400 ml), trental (5 ml), heparin (injection solution with an activity of 5000 PIECES in 1 ml, 6.5 ml) for 7 to 10 days; a course of 10 to 15 retrobulbar injections
15 реополиглюкина (0,3 мл), дексазона (0,2 мл), гепарина (0,2 мл) (Ефимов А.С. Диабетические ангиопатии, M., 1989).15 reopoliglyukin (0.3 ml), dexazone (0.2 ml), heparin (0.2 ml) (Efimov A.S. Diabetic angiopathies, M., 1989).
Однако эффективных методов предупреждения и лечения диабетической ангиопатии в настоящее время не существует. Использование многочисленных лекарственных средств, влияющих на 0 состояние сосудистой стенки и системы свертывания крови, при прогрессировании нарушений углеводного обмена, не оказывает существенного профилактического действия на появление и неуклонное прогрессирование диабетической ангиопатии у многих больных сахарным диабетом. 5 Известно лекарственное средство для лечения диабета и для предотвращения его осложнений (патент GB 2104382, опубликованный 09.03.1983), представляющее собой смесь инсулина, и С-пептида, взятых в определенном весовом соотношении, и в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Однако указанное лекарственное средство предназначено исключительно для парентерального введения, внутримышечного или внутривенного, и не пригодно для перорального применения. С-пептид в кровяном русле в норме очень быстро разлагается под действием ферментов крови. А при сахарном диабете он, как производный проинсулина, вырабатывается в ограниченном количестве.However, effective methods for the prevention and treatment of diabetic angiopathy currently do not exist. The use of numerous drugs that affect the state of the vascular wall and blood coagulation system during the progression of carbohydrate metabolism disorders does not have a significant preventive effect on the appearance and steady progression of diabetic angiopathy in many patients with diabetes mellitus. 5 A drug is known for the treatment of diabetes and for the prevention of its complications (GB 2104382 patent published March 9, 1983), which is a mixture of insulin and C-peptide, taken in a specific weight ratio, and in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. However, this drug is intended solely for parenteral administration, intramuscularly or intravenously, and is not suitable for oral use. C-peptide in the bloodstream normally decomposes very quickly under the influence of blood enzymes. And with diabetes, it, as a derivative of proinsulin, is produced in limited quantities.
В настоящее время из уровня техники неизвестно лекарственных средств, содержащих полноценный С-пептид проинсулина и предназначенных для перорального применения для лечения осложнений сахарного диабета.Currently, the prior art does not know drugs containing a complete C-peptide of proinsulin and intended for oral administration for the treatment of complications of diabetes mellitus.
Раскрытие изобретенияDisclosure of invention
Задача, на решение которой направлено предложенное изобретение, состоит в создании лекарственного средства для лечения и предупреждения диабетических осложнений на основе С-пептида проинсулина, пригодного как для перорального, так и парэнтерального применения, и обладающего пролонгированным действием С-пептида в организме.The problem to which the invention is directed, is to create a medicine for the treatment and prevention of diabetic complications based on the proinsulin C-peptide, suitable for both oral and parenteral use, and having a prolonged action of the C-peptide in the body.
Решение поставленной задачи достигается тем, что предложено лекарственное средство для лечения и предупреждения диабетических осложнений, содержащее С-пептид, ковалентно иммобилизованный на водорастворимом полимере.The solution to this problem is achieved by the fact that the proposed drug for the treatment and prevention of diabetic complications containing C-peptide covalently immobilized on a water-soluble polymer.
Предложенное лекарственное средство в качестве водорастворимого полимера содержит полимер молекулярной массы не более 20000Дa, предпочтительно от 400 до 20000Дa, и наиболее предпочтительно молекулярной массы от 400 до 4000Дa, например, полиэтиленоксид, или поливинилпирролидон, или изопренол, или декстран, или полиакриламид, или полиуретан.The proposed drug as a water-soluble polymer contains a polymer of a molecular weight of not more than 20,000 Da, preferably from 400 to 20,000 Da, and most preferably a molecular weight of from 400 to 4000 Da, for example, polyethylene oxide or polyvinylpyrrolidone, or isoprenol, or dextran, or polyacrylamide, or polyurethane.
В предпочтительном случае реализации лекарственное средство в качестве водорастворимого полимера содержит полиэтиленоксид, молекулярной массы от 400 до 4000 Да.In a preferred embodiment, the implementation of the drug as a water-soluble polymer contains polyethylene oxide, molecular weight from 400 to 4000 Da.
В еще одном предпочтительном случае реализации лекарственное средство содержит С-пептид проинсулина, иммобилизованный на водорастворимом полимере при следующем соотношении, в мac.%:In another preferred embodiment, the drug contains a pro-insulin C peptide immobilized on a water-soluble polymer in the following ratio, in wt.%:
С-пептид проинсулина - 0,002-50,0Proinsulin C peptide - 0.002-50.0
Водорастворимый полимер - 50,0-99,998. В качестве С-пептида средство может содержать выделенный и очищенный натуральный или синтетический, или генно-инженерный C- пептид проинсулина, а также проинсулин, как источник С-пептида, или смесь С-пептида и проинсулина.Water soluble polymer - 50.0-99.998. As a C-peptide, the agent may contain isolated and purified natural or synthetic, or genetically engineered C-peptide of proinsulin, as well as proinsulin as a source of C-peptide, or a mixture of C-peptide and proinsulin.
Средство может представлять собой лиофилизированную форму, или раствор, или таблетированную форму, или капсулированную форму, содержащую терапевтически эффективное количество C- пептида.The agent may be a lyophilized form, or a solution, or a tablet form, or an encapsulated form containing a therapeutically effective amount of a C-peptide.
В частности на Ir лиофилизированной массы лекарственное средство может содержать 950 мг С-пептида проинсулина, а раствор может содержать от 1 до 50 мг С-пептида на 1 мл раствора.In particular, on an Ir lyophilized mass, the drug may contain 950 mg of proinsulin C-peptide, and the solution may contain from 1 to 50 mg of C-peptide per 1 ml of solution.
Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый растворитель, например, физиологический раствор или воду.The medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable solvent, for example, saline or water.
Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый консервант, например, трегалозу, манитол, нипоген или декстран.The medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable preservative, for example trehalose, mannitol, nipogen or dextran.
Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, например, декстран, крахмал или микрокристаллическую целлюлозу. Лекарственное средство может дополнительно содержать фармацевтически приемлемую комбинацию консерванта, растворителя, наполнителя в любом фармацевтически приемлемом сочетании и соотношении.The medicament may further comprise a pharmaceutically acceptable excipient, for example, dextran, starch or microcrystalline cellulose. The drug may further comprise a pharmaceutically acceptable combination of preservative, diluent, excipient in any pharmaceutically acceptable combination and ratio.
Лекарственное средство пригодно для перорального и/или парэнтерального и/или ингаляционного применения, например интраназально.The drug is suitable for oral and / or parenteral and / or inhalation use, for example, intranasally.
Предложенное лекарственное средство готовят путем ковал ентной иммобилизации С-пептида проинсулина на водорастворимом полимере при помощи высокоэнергетического ионизирующего излучения в дозе, обеспечивающей протекание свободно-радикальных реакций.The proposed drug is prepared by covalent immobilization of the pro-insulin C-peptide on a water-soluble polymer using high-energy ionizing radiation in a dose that ensures free radical reactions.
Преимущественно процесс иммобилизации проводят в водной среде путем смешивания С-пептида с водным раствором полимера, предварительного обработанного высокоэнергетическим ионизирующим излучением.Advantageously, the immobilization process is carried out in an aqueous medium by mixing the C-peptide with an aqueous polymer solution pretreated with high-energy ionizing radiation.
В качестве ионизирующего излучения используют, преимущественно, гамма-излучение или поток ускоренных электронов в дозе 1,0-5,0 Мрад.As ionizing radiation, mainly gamma radiation or a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0-5.0 Mrad is used.
В качестве водорастворимого полимера используют традиционные для иммобилизации биологически-активных соединений полимеры, предпочтительно полимеры молекулярной массы не более 20000 Да, предпочтительно от 400 до 20000 Да, например, полиэтиленоксид, или поливинилпирролидон, или изопренол, или декстран, или полиакриламид, или полиуретан.As a water-soluble polymer, polymers traditional for immobilizing biologically active compounds are used, preferably polymers with a molecular weight of not more than 20,000 Da, preferably from 400 to 20,000 Da, for example, polyethylene oxide or polyvinylpyrrolidone, or isoprenol, or dextran, or polyacrylamide, or polyurethane.
В предпочтительном случае для приготовления лекарственного средства в качестве водорастворимого полимера используют полиэтиленоксид молекулярной массы от 400 до 4000 Да. Иммобилизацию проводят при соотношении С-пептид: водорастворимый полимер 1:1-500. Для этого готовят 1-50% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой от 400 до 4000 Да. Затем раствор облучают высокоэнергетическим ионизирующим излучением, преимущественно гамма-излучением или потоком ускоренных электронов в дозах, обеспечивающих протекание свободно-радикальных реакций, преимущественно 1,0-5,0 Мрад. Далее в раствор радиационно-активированного полиэтиленоксида вводят C- пептид проинсулина до конечной концентрации (по белку) от 1 до 10 мг/мл, смесь перемешивают в течение 10-30 минут до получения однородного прозрачного или слегка опалесцирующего раствора. При облучении в ходе радиационно-химического окисления в водорастворимом полимере образуются высокоактивные карбонильные группы. Активированный таким способом полимер образует с C- пептидом водорастворимый комплекс, который эффективно предупреждает и лечит диабетические осложнения, такие как диабетическая стопа, ретинулопатия, нефропатия, как при пероральном, так и парентеральном введении. Вследствие высокой растворимости в водных средах комплекс С-пептида с полиэтиленоксидом полностью всасывается в кровь без диффузионных ограничений. Полученный технический результат не является очевидным из известных научно- технических данных о свойствах полиэтиленоксида и С-пептида, так как в результате иммобилизации С-пептида на радиационно- активированном водорастворимом полимере могла бы произойти его инактивация или снижение активности, или появление аллергизирующих свойств.In the preferred case, for the preparation of a medicinal product, polyethylene oxide of molecular weight from 400 to 4000 Da is used as a water-soluble polymer. Immobilization is carried out with a ratio of C-peptide: water-soluble polymer 1: 1-500. To do this, prepare a 1-50% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of from 400 to 4000 Da. Then the solution is irradiated with high-energy ionizing radiation, mainly gamma radiation or a stream of accelerated electrons in doses that ensure the flow of free radical reactions, mainly 1.0-5.0 Mrad. Next, a pro-insulin C-peptide is introduced into a solution of radiation-activated polyethylene oxide to a final concentration (protein) of 1 to 10 mg / ml, the mixture is stirred for 10-30 minutes until a homogeneous, clear or slightly opalescent solution is obtained. When irradiated during radiation-chemical oxidation, highly active carbonyl groups are formed in a water-soluble polymer. The polymer activated in this way forms a water-soluble complex with the C-peptide, which effectively prevents and treats diabetic complications, such as diabetic foot, retinulopathy, nephropathy, both when administered orally and parenterally. Due to its high solubility in aqueous media, the C-peptide complex with polyethylene oxide is completely absorbed into the blood without diffusion restrictions. The technical result obtained is not obvious from the known scientific and technical data on the properties of polyethylene oxide and C-peptide, since immobilization of the C-peptide on a radiation-activated water-soluble polymer could lead to its inactivation or decrease in activity, or the appearance of allergenic properties.
Иммобилизация С-пептида на декстране также осуществляется в два этапа. На первом этапе осуществляют с помощью ускорителя элементарных частиц активацию декстрана, например, молекулярной массой 30-40 кДа. При воздействии на раствор декстрана пучком свободных электронов дозой 2 Мрад образуются активные альдегидные группы, за счет которых и происходит иммобилизация С-пептида. На втором этапе, при добавлении С-пептида к раствору декстрана в соотношении 1 : 10 происходит ковалентная сшивка С-пептида и декстрана. При этом 98% С-пептида образуют комплекс с декстраном.The immobilization of the C-peptide on dextran is also carried out in two stages. At the first stage, they are carried out using an accelerator elementary particles activation of dextran, for example, with a molecular weight of 30-40 kDa. When exposed to a solution of dextran with a free electron beam at a dose of 2 Mrad, active aldehyde groups are formed, due to which C-peptide is immobilized. At the second stage, when the C-peptide is added to the dextran solution in a ratio of 1: 10, covalent crosslinking of the C-peptide and dextran occurs. In this case, 98% of the C-peptide form a complex with dextran.
Очевидно, что для осуществления изобретения могут быть использованы и другие фармацевтически приемлемые водорастворимые полимеры, растворители, наполнители, адьюванты, кроме указанных выше, а также другие фармацевтически приемлемые компоненты.Obviously, other pharmaceutically acceptable water-soluble polymers, solvents, fillers, adjuvants other than those mentioned above, as well as other pharmaceutically acceptable components, can be used to carry out the invention.
Краткое описание иллюстраций. Для лучшего понимания изобретения ниже приведены примеры конкретного получения предложенного лекарственного средства со ссылками на прилагаемые иллюстрации, где:A brief description of the illustrations. For a better understanding of the invention, the following are examples of specific preparation of the proposed drug with reference to the accompanying illustrations, where:
На фиг 1 показаны ИК - спектры С-пептида, полиэтиленоксида 1,5 кДа, и С-пептида, иммобилизованного на полиэтиленоксиде 1,5 кДа как описано в примере 1, где ИК-спектр С-пептида - линия 1, спектр конъюгата С-пептида с полиэтиленоксидом - линия 2, и спектр полиэтиленоксида - линия 3 (в порядке сверху вниз по левой стороне спектра, нижней части листа).Figure 1 shows the IR spectra of the C peptide, 1.5 kDa polyethylene oxide, and the C peptide immobilized on 1.5 kDa polyethylene oxide as described in example 1, where the IR spectrum of the C peptide is line 1, the spectrum of the C- conjugate peptide with polyethylene oxide - line 2, and the spectrum of polyethylene oxide - line 3 (in order from top to bottom on the left side of the spectrum, the bottom of the sheet).
Фиг.2 представлена динамика концентрации С-пептида в плазме крови крыс после подкожного введения нативного (линия 1) и иммобилизованного С-пептида (линия 2).Figure 2 presents the dynamics of the concentration of C-peptide in rat blood plasma after subcutaneous administration of the native (line 1) and immobilized C-peptide (line 2).
ФигЗ. представлена динамика концентрации С-пептида в плазме крови крыс после перорального введения нативного (линия 1) и иммобилизованного С-пептида (линия 2). Примеры осуществления изобретения.FIG. The dynamics of the concentration of C-peptide in the blood plasma of rats after oral administration of the native (line 1) and immobilized C-peptide (line 2) is presented. Examples of carrying out the invention.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения предложенного лекарственного средства, содержащего С-пептид проинсулина, приготовленного на основе генно- инженерного С-пептида. Пример 1The invention is illustrated by the following specific examples of the preparation of the proposed medicinal product containing a proinsulin C-peptide prepared on the basis of a genetically engineered C-peptide. Example 1
10% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 1,5 кДа (полиэтиленоксид 1500) облучают потоком ускоренных электронов в дозе 5,0 Мрад. В облученный раствор полиэтиленоксида вносят С-пептид до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид: С-пептид равно 10:1). Смесь перемешивают 10 минут и получают препарат С-пептида в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 98%. Пример 2A 10% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 1.5 kDa (polyethylene oxide 1500) is irradiated with a stream of accelerated electrons in a dose of 5.0 Mrad. The C-peptide is added to the irradiated polyethylene oxide solution to a final concentration of 10 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 10: 1). The mixture is stirred for 10 minutes and receive the preparation of the C-peptide in the form of a slightly opalescent solution. The yield of the finished product is 98%. Example 2
50,0% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 0,4 кДа облучают тормозным гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад. В облученный раствор полиэтиленоксида вносят С-пептид до конечной концентрации 1 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид: С-пептид равно 500:1). Смесь перемешивают 30 минут и получают препарат C- пептида в виде прозрачного раствора. Выход готового продукта составляет 97%. Пример 3A 50.0% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 0.4 kDa is irradiated with inhibitory gamma radiation at a dose of 1.0 Mrad. The C-peptide is added to the irradiated solution of polyethylene oxide to a final concentration of 1 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 500: 1). The mixture was stirred for 30 minutes to give the C-peptide preparation as a clear solution. The yield of the finished product is 97%. Example 3
5% водный раствор полиэтиленоксида с молекулярной массой 15 кДа облучают потоком ускоренных электронов в дозе 2,5 Мрад. В облученный раствор полиэтиленоксида вносят С-пептид до конечной концентрации 10 мг в 1 мл (соотношение полиэтиленоксид : С-пептид равно 5:1). Смесь перемешивают 15 минут и получают препарат C- пептида в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 99%.A 5% aqueous solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 15 kDa is irradiated with a stream of accelerated electrons at a dose of 2.5 Mrad. The C-peptide is added to the irradiated solution of polyethylene oxide to a final concentration of 10 mg in 1 ml (the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 5: 1). The mixture was stirred for 15 minutes and a C-peptide preparation was obtained as a slightly opalescent solution. Output ready product is 99%.
Препараты иммобилизованного С-пептида проинсулина, полученные как описано в примере 1, были охарактеризованы с помощью физико-химических методов - инфракрасной (ИК) спектроскопии и кругового дихроизма.The preparations of the immobilized pro-insulin C-peptide obtained as described in Example 1 were characterized using physicochemical methods — infrared (IR) spectroscopy and circular dichroism.
Исследование препаратов методом ИК спектроскопии. Как известно, определенным типам связей соответствуют вполне определенные полосы инфракрасного поглощения. Следовательно, в спектрах сложных молекул можно наблюдать полосы, складывающиеся из валентных колебаний C-N или C=O и др. групп. По изменению максимума поглощения каждой группы, которая меняется в той или иной степени в зависимости от конформации и типов возникающих связей можно судить о взаимодействиях между веществами. Об образовании валентных взаимодействий судили по разности, определенной при, вычитании из величин спектра С-пептида спектра. Проведенные исследования показали, что спектр очищенного препарата С-пептида иммобилизованного на полиэтиленоксиде (ПЭО) не является простым сложением спектров С-пептида и полиэтиленоксида Как видно на фиг.l, отмечена разность ИК-спектров между C- пептидом и полиэтиленоксидом и исчезновение величин поглощения в спектре разности полос (полос, наиболее интенсивных для поглощения азотистых групп белков) на уровне 859 см-1, 950 см"1 и 1074 см-1.The study of drugs by IR spectroscopy. As you know, certain types of bonds correspond to well-defined infrared absorption bands. Therefore, in the spectra of complex molecules one can observe bands composed of stretching vibrations of CN or C = O and other groups. By changing the maximum absorption of each group, which varies to one degree or another depending on the conformation and types of bonds that arise, we can judge the interactions between substances. The formation of valence interactions was judged by the difference determined by subtracting the spectrum from the spectrum of the C-peptide spectrum. Studies have shown that the spectrum of the purified preparation of the C-peptide immobilized on polyethylene oxide (PEO) is not a simple addition of the spectra of the C-peptide and polyethylene oxide. As can be seen in Fig. 1, the difference in the IR spectra between the C-peptide and polyethylene oxide and the disappearance of absorption values in the difference spectrum of the bands (bands most intense for the absorption of nitrogenous groups of proteins) at the level of 859 cm -1 , 950 cm -1 and 1074 cm -1 .
Кроме того, сопоставление спектров в области до 4000 см'1 показало, что при сравнении спектра препарата иммобилизованного на полиэтиленоксиде С-пептида, и значений спектра активированного полиэтиленоксида, полученное значение не совпадало с ИК-спектром полиэтиленоксида в области валентных колебаний связи C=O (1750- 1658 см"1). Дополнительно, в области валентных колебаний полиэтиленоксида в ик-спектрах образование комплекса характеризовали по уменьшению или исчезновению полосы внутримолекулярной водородной связи полиэтиленоксид при 2930 см"1 и смещению полосы межмолекулярной водородной связи полимера из области 3430 см-1 к 3390 см'1.In addition, a comparison of the spectra in the region up to 4000 cm '1 showed that, when comparing the spectrum of the preparation of a C-peptide immobilized on polyethylene oxide and the spectrum values of activated polyethylene oxide, the obtained value did not coincide with the IR spectrum of polyethylene oxide in the region of stretching vibrations of the C = O bond ( 1750 - 1658 cm "1 ). Additionally, in the field of stretching vibrations In the IR spectra, the formation of the complex was characterized by a decrease or disappearance of the intramolecular hydrogen bond band of polyethylene oxide at 2930 cm -1 and a shift of the intermolecular hydrogen bond band of the polymer from 3430 cm -1 to 3390 cm 1 .
Таким образом результаты исследований свидетельствуют о появлении ковалентной связи (между C-O-N-C) между полиэтиленоксидом и молекулой С-пептида. 2. Исследование препаратов методом Кругового дихроизма.Thus, the research results indicate the appearance of a covalent bond (between C-O-N-C) between polyethylene oxide and the C-peptide molecule. 2. The study of drugs by the circular dichroism method.
Изменения пространственной структуры иммобилизованного на полиэтиленоксиде С-пептида при изучении кругового дихроизма препаратов С-пептида и его коньюгата с полиэтиленоксидом, свидетельствуют о проявлении прочных контактов (например, ковалентной связи), которая, как правило, влечет перестройку пространственной структуры взаимодействующих компонентов.Changes in the spatial structure of the C-peptide immobilized on polyethylene oxide during the study of circular dichroism of C-peptide preparations and its conjugate with polyethylene oxide indicate strong contacts (e.g., covalent bonds), which, as a rule, entail a restructuring of the spatial structure of interacting components.
В таблице (см. ниже) представлены данные по исследованию эффективности модифицированного полиэтиленоксидом человеческого геннно-инженерного С-пептида, полученного как описано в примере 1, на модели аллоксанового диабета у крыс (Sраdеllа CT, Lегсо MM, Масhаdо JL, Масеdо CS, Lопg-tеrm еffесts оf iпsuliп thеrару, islеt trапsрlапtаtiоп, and pancreas transplantation iп thе рrеvепtiоп оf glоmеrulаr сhапgеs iп kidпеуs оf аllохап-iпduсеd diаbеtiс rаts. Тrапsрlапt Рrос. 2005 Oct;37(8):3468-71 ; Liu J, Yu Y, Fап YZ, Сhапg H, Liu HM, Сui Y, Сhеп Q, Wапg R. Саrdiоvаsсulаr еffесts оf епdоmоrрhiпs iп аllохап-iпduсеd diаbеtiс rаts. Рерtidеs. 2005 Apr;26(4):607-14.). В опытной группе экспериментальным животным подкожно (п/к) ежедневно вводили по 0,1 мл модифицированного полиэтиленоксидом С-пептида, полученного как описано в примере 1, за исключением того, что соотношение полиэтиленоксид : С-пептид равно 70: 1. В контрольной группе животным вводили физиологический раствор. Аллоксановый диабет индуцировался введением 60 мг аллоксана 2 раза энтерально самцам крыс Вистар (масса тела 200-250г). ТаблицаThe table (see below) presents data on the study of the effectiveness of polyethylene oxide-modified human genetically engineered C-peptide, obtained as described in Example 1, on a model of alloxan diabetes in rats (Сradella CT, Legso MM, Mashedo JL, Macedo CS, Lopg- term effects of ipsulip thеraru, islap trаsplaptаtiop, and pancreas transplantation ip thе рreveptiop оf glomerular сhapgеs ip kidpеs оf аllohap-ypduсd YlpReslt. , Сhapg H, Liu HM, Сui Y, Сhep Q, Wapg R. Сardiоvаsсsulаrеffіts оf epodomorrhips іп алохап-іпдусеd diabetis rats. Рertides. 2005 Apr; 26 (4): 607-14.). In the experimental group, 0.1 ml of the polyethylene oxide-modified C-peptide obtained as described in Example 1 was injected subcutaneously (s / c) daily to the experimental animals, except that the ratio of polyethylene oxide: C-peptide is 70: 1. In the control group, the animals were injected with saline. Alloxan diabetes was induced by the administration of 60 mg of alloxan 2 times enteral to male Wistar rats (body weight 200-250 g). Table
Эффект иммобилизованного С-пептида при пролонгированном парэнтеральном введении к ыс с аллоксановым диабетомThe effect of immobilized C-peptide with prolonged parenteral administration to ys with alloxan diabetes
Как видно из представленных результатов, иммобилизованный C- пептид при подкожном введении крысам с аллоксановой моделью диабета нормализовал функцию почек и у 75% животных стабилизировал уровень сахара в крови. Кроме того, из данных в таблице видно, что предлагаемое средство позволяет не только снизить, но и стабилизировать уровень глюкозы в 80% по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о высокой лечебной эффективности. При морфологическом исследовании также было установлено, что у животных опытной группы, которой вводилось предлагаемое средство, патологические изменения во внутренних органах связанные с микроангиопатиями, практически отсутствовали. Напротив, у животных контрольной группы эти изменения были явно выражены, что свидетельствует о высокой лечебной и профилактической активности иммобилизованного на водорастворимом полимере С-пептида в отношении осложнений сахарного диабета. Исследование фармакокинетики С-пептида (С-пептид человеческий рекомбинантный) и С-пептида человеческого рекомбинантного, иммобилизованного на полиэтиленоксиде 1500 (пример 1), проводили на 13 крысах-самцах Вистар массой 430-540 г. Животные содержались на стандартном рационе вивария и на время проведения исследования имели свободный доступ к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Препараты вводили подкожно в дозе 5 мг/кг (в пересчете на С-пептид). Пробы крови (0,3 мл) забирали из хвостовой вены бодрствующих животных в гепаринизированные капилляры, отделяли плазму центрифугированием и до момента анализа плазму хранили при температуре 3-50C не более 3 суток.As can be seen from the presented results, the immobilized C-peptide after subcutaneous administration to rats with an alloxan model of diabetes normalized renal function and stabilized blood sugar in 75% of the animals. In addition, the data in the table shows that the proposed tool can not only reduce, but also stabilize the glucose level of 80% compared with intact animals, which indicates high therapeutic efficacy. A morphological study also found that in animals of the experimental group, which was introduced the proposed tool, pathological changes in the internal organs associated with microangiopathies were practically absent. On the contrary, in animals of the control group, these changes were pronounced, which indicates a high therapeutic and the prophylactic activity of a C-peptide immobilized on a water-soluble polymer in relation to complications of diabetes mellitus. The pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant C-peptide) and the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide 1500 (Example 1) were carried out on 13 Wistar male rats weighing 430-540 g. Animals were kept on a standard diet of vivarium and for a while the study had free access to water and food, in accordance with the rules adopted by the European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered subcutaneously at a dose of 5 mg / kg (in terms of C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
Для количественного определения содержания в плазме C- пептида использовали иммуноферментный тест Меrсоdiа С-рерtidе ELISA sресifiс.For the quantitative determination of the plasma C-peptide content, the Mercodia C-resistance ELISA Sresifiс enzyme-linked immunosorbent assay was used.
Пробы крови у каждого животного отбирали в каждой временной точке.Blood samples from each animal were taken at each time point.
При исследовании фармакокинетики С-пептида забор проб крови проводили до и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3; 4 , 6 и 12 ч после введения препарата. При изучении фармакокинетики иммобилизованного C- пептида пробы крови забирали до и через 0,25; 0,5; 1; 2; 3;4; 6 и 12 ч после введения препарата.In the study of the pharmacokinetics of the C-peptide, blood samples were taken before and after 0.25; 0.5; one; 2; 3; 4, 6 and 12 hours after administration of the drug. When studying the pharmacokinetics of an immobilized C-peptide, blood samples were taken before and after 0.25; 0.5; one; 2; 3; 4; 6 and 12 hours after administration of the drug.
Для построения фармакокинетических кривых использовали кратность между исходным содержанием С-пептида (до введения препарата) и найденным содержанием препарата в каждой временной точке. Выбор временных точек для исследования концентрации C- пептида в крови производили по данным предварительных исследований с учетом рекомендаций [Холодов Л.E., Яковлев B.П., 1985].To build pharmacokinetic curves used the multiplicity between the initial content of the C-peptide (before drug administration) and the found drug content at each time point. The choice of time points for studying the concentration of C-peptide in the blood was made according to preliminary studies taking into account the recommendations [Kholodov L.E., Yakovlev B.P., 1985].
Динамика концентрации С-пептида в плазме крови крыс после подкожного введения нативного и иммобилизованного С-пептида представлены на фиг. 2.The dynamics of the concentration of C-peptide in rat blood plasma after subcutaneous administration of the native and immobilized C-peptide is shown in FIG. 2.
Как видно из представленных результатов, содержание иммобилизованного С-пептида в крови крыс было выше, чем нативного с-пептида через 30 мин в 1,54 раза, через lчас в 2,1 раза, через 3 часа в 93 раза, через 4 часа в 107 раз. Это свидетельствует о том, что иммобилизованный С-пептид более стоек к действию пептидаз крови. О пролонгированном действии иммобилизованного С-пептида свидетельствует тот факт, что он определялся в крови через 12 часов после введения, а нативный - через 6 часов. Определение фармакокинетики С-пептида человеческого рекомбинантного, иммобилизованного на полиэтиленоксиде, при энтеральном введении:As can be seen from the presented results, the content of immobilized C-peptide in the blood of rats was higher than that of the native c-peptide after 30 minutes by 1.54 times, after l hours by 2.1 times, after 3 hours by 93 times, after 4 hours 107 times. This indicates that the immobilized C-peptide is more resistant to the action of blood peptidases. The prolonged action of the immobilized C-peptide is evidenced by the fact that it was determined in the blood 12 hours after administration, and native - after 6 hours. Determination of the pharmacokinetics of the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide, with enteral administration:
Исследование фармакокинетики С-пептида (С-пептид человеческий рекомбинантный) и С-пептида человеческого рекомбинантного, иммобилизованного на полиэтиленоксиде 1500 (пример 1), проводили на 5 крысах-самцах Вистар массой 430-540 г. Животные содержались на стандартном рационе вивария и на время проведения исследования имели свободный доступ к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Препараты вводили внутрижелудочно при помощи зонда в дозе 10 мг/кг (в пересчете на С-пептид). Пробы крови (0,3 мл) забирали из хвостовой вены бодрствующих животных в гепаринизированные капилляры, отделяли плазму центрифугированием и до момента анализа плазму хранили при температуре 3-50C не более 3 суток.A study of the pharmacokinetics of the C-peptide (human recombinant C-peptide) and the human recombinant C-peptide immobilized on polyethylene oxide 1500 (Example 1) was carried out on 5 Wistar male rats weighing 430-540 g. Animals were kept on a standard diet of vivarium and for a while the study had free access to water and food, in accordance with the rules adopted by the European Convention on protection of vertebrates used for experimental and other scientific purposes. The drugs were administered intragastrically using a probe at a dose of 10 mg / kg (in terms of C-peptide). Blood samples (0.3 ml) were taken from the tail vein of awake animals into heparinized capillaries, the plasma was separated by centrifugation, and until analysis the plasma was stored at a temperature of 3-5 ° C for no more than 3 days.
Для количественного определения содержания в плазме C- пептида использовали иммуноферментный тест Меrсоdiа С-рерtidе ELISA sресifiс.For the quantitative determination of the plasma C-peptide content, the Mercodia C-resistance ELISA Sresifiс enzyme-linked immunosorbent assay was used.
Пробы крови у каждого животного отбирали в каждой временной точке.Blood samples from each animal were taken at each time point.
При исследовании фармакокинетики С-пептида забор проб крови проводили до и через 1, 2, 3, 4, 5, 6 и l2 ч после введения препарата.In the study of the pharmacokinetics of the C-peptide, blood samples were taken before and after 1, 2, 3, 4, 5, 6, and l2 h after administration of the drug.
При изучении фармакокинетики иммобилизованного С-пептида пробы крови забирали до и через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 и 12 ч после введения препарата.When studying the pharmacokinetics of an immobilized C-peptide, blood samples were taken before and after 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, and 12 hours after drug administration.
Для построения фармакокинетических кривых использовали кратность между исходным содержанием С-пептида (до введения препарата) и найденным содержанием препарата в каждой временной точке.To construct the pharmacokinetic curves, we used the multiplicity between the initial content of the C-peptide (before drug administration) and the found drug content at each time point.
Результаты представлены на фиг.З.The results are presented in Fig.Z.
Как видно из представленных результатов, всасывание из желудка происходит только для иммобилизованного С-пептида. Нативный С-пептид не всасывается и не влияет на концентрацию C- пептида в крови. Иммобилизованный с-пептид хорошо всасывается из желудка, его максимальная концентрация в крови достигается через 5 часов и превышает исходный уровень в 147 раз, через 12 часов уровень превышения - 10 раз. Из желудка всасывалось 17% введенного препарата. Эти результаты подтверждают возможность применения иммобилизованного С-пептида при пероральном применении. Промышленная применимостьAs can be seen from the presented results, absorption from the stomach occurs only for the immobilized C-peptide. The native C-peptide is not absorbed and does not affect the concentration of C-peptide in the blood. The immobilized c-peptide is well absorbed from the stomach, its maximum concentration in the blood is reached after 5 hours and exceeds the initial level by 147 times, after 12 hours the level excess - 10 times. 17% of the administered drug was absorbed from the stomach. These results confirm the possibility of using immobilized C-peptide for oral administration. Industrial applicability
Таким образом, приведенные выше примеры доказывают получение предложенного лекарственного средства и возможность его применения для лечения и предупреждения диабетических осложнений. Предложенное лекарственное средство может вводиться в организм не только парэнтерально, но и перорально, а также интраназально, и имеет более пролонгированное действие в организме, чем свободный С-пептид. Thus, the above examples prove the receipt of the proposed drug and the possibility of its use for the treatment and prevention of diabetic complications. The proposed drug can be introduced into the body not only parenterally, but also orally, as well as intranasally, and has a more prolonged effect in the body than the free C-peptide.
Claims
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2007137048 | 2007-10-05 | ||
| RU2007137048/15A RU2007137048A (en) | 2007-10-05 | 2007-10-05 | MEDICINE FOR TREATMENT AND PREVENTION OF COMPLICATIONS IN SUGAR DIABETES |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2009045122A1 true WO2009045122A1 (en) | 2009-04-09 |
Family
ID=40526423
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2008/000250 Ceased WO2009045122A1 (en) | 2007-10-05 | 2008-04-22 | Medicinal agent for treating and preventing diabetes complications |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2007137048A (en) |
| WO (1) | WO2009045122A1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010033204A3 (en) * | 2008-09-19 | 2010-06-03 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of c-peptides |
| JP2013533217A (en) * | 2010-05-17 | 2013-08-22 | セビックス・インコーポレイテッド | PEGylated C-peptide |
| US9682153B2 (en) | 2008-09-19 | 2017-06-20 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of therapeutic peptides |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU654620A1 (en) * | 1976-12-06 | 1979-03-30 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В.Ломоносова | Method of obtaining immobilized enzymes |
| RU94006023A (en) * | 1993-02-25 | 1996-04-20 | Стерлинг Уинтроп Инк. (US) | Physiologically active composition on the base of lyophilized, modified by polyalkylene oxide complexes of protein and peptide with cyclodextrin and method for its production |
| RU2213557C2 (en) * | 2001-12-26 | 2003-10-10 | Закрытое акционерное общество "Аксис" | Pharmaceutical composition eliciting thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties |
| WO2004083234A2 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Nobex Corporation | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
-
2007
- 2007-10-05 RU RU2007137048/15A patent/RU2007137048A/en unknown
-
2008
- 2008-04-22 WO PCT/RU2008/000250 patent/WO2009045122A1/en not_active Ceased
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU654620A1 (en) * | 1976-12-06 | 1979-03-30 | Московский Ордена Ленина И Ордена Трудового Красного Знамени Государственный Университет Им. М.В.Ломоносова | Method of obtaining immobilized enzymes |
| RU94006023A (en) * | 1993-02-25 | 1996-04-20 | Стерлинг Уинтроп Инк. (US) | Physiologically active composition on the base of lyophilized, modified by polyalkylene oxide complexes of protein and peptide with cyclodextrin and method for its production |
| RU2213557C2 (en) * | 2001-12-26 | 2003-10-10 | Закрытое акционерное общество "Аксис" | Pharmaceutical composition eliciting thrombolytic, anti-inflammatory and cytoprotective properties |
| WO2004083234A2 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Nobex Corporation | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010033204A3 (en) * | 2008-09-19 | 2010-06-03 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of c-peptides |
| US9682153B2 (en) | 2008-09-19 | 2017-06-20 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates of therapeutic peptides |
| JP2013533217A (en) * | 2010-05-17 | 2013-08-22 | セビックス・インコーポレイテッド | PEGylated C-peptide |
| EP2571896A4 (en) * | 2010-05-17 | 2014-01-08 | Cebix Inc | Pegylated c-peptide |
| US8691755B2 (en) | 2010-05-17 | 2014-04-08 | Cebix Ab | Pegylated C-peptide |
| US8927488B2 (en) | 2010-05-17 | 2015-01-06 | Cebix, Inc. | Pegylated C-peptide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2007137048A (en) | 2009-04-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4754660B2 (en) | How to treat diabetes symptoms | |
| CN1258379C (en) | Botulinum toxin pharmaceutical composition | |
| Hinds et al. | PEGylated insulin in PLGA microparticles. In vivo and in vitro analysis | |
| Yue et al. | Abnormalities of granulation tissue and collagen formation in experimental diabetes, uraemia and malnutrition | |
| US20050147581A1 (en) | Macromolecular drug complexes having improved stability and therapeutic use of the same | |
| CN112274633A (en) | Somalutide blood sugar-reducing and weight-reducing microneedle patch and preparation method and application thereof | |
| NO175287B (en) | Process for the preparation of an intravenous pharmaceutical preparation | |
| JPH10504835A (en) | Pharmaceutical composition comprising a bile salt and a buffer that enhances the bioavailability of the active compound | |
| JPH0470317B2 (en) | ||
| CN1791425A (en) | C1 inhibitor with short half-life for transient treatment | |
| WO2019006690A1 (en) | Polypeptide pharmaceutically acceptable salt et use thereof | |
| WO2009045122A1 (en) | Medicinal agent for treating and preventing diabetes complications | |
| Baez et al. | Role of the neurohypophysis in ferritin-induced antidiuresis | |
| WO2008033058A2 (en) | Method for producing insulin in the form of an oral preparation | |
| EP0353861A1 (en) | Angiogenesis inhibitor | |
| RU2413531C2 (en) | Method of producing oral preparation of proinsulin c-peptide | |
| RU2076733C1 (en) | Method of insulin derivatives preparing | |
| JP3167763B2 (en) | Wound healing promoter | |
| JPH08245403A (en) | Composition for medical treatment of insulin-resistant syndrome | |
| CN118806878B (en) | Amphoteric bacterial cellulose-encapsulated insulin micelle and preparation method thereof | |
| CN1586620A (en) | Poly gelatin peptide injection and its preparing method | |
| JPH08782B2 (en) | Anti-inflammatory agent | |
| RU2155602C1 (en) | Insulin-containing drug for oral using and method of its preparing | |
| Carli et al. | Pharmacokinetic of sodium cefoperazone in calves | |
| WO2000009147A1 (en) | Blood sugar level controlling agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 08753924 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 08753924 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |