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WO2009037399A2 - Procede de production de spores et de metabolites provenant de microorganismes d'origine fongique et leurs utilisations - Google Patents

Procede de production de spores et de metabolites provenant de microorganismes d'origine fongique et leurs utilisations Download PDF

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Publication number
WO2009037399A2
WO2009037399A2 PCT/FR2008/001064 FR2008001064W WO2009037399A2 WO 2009037399 A2 WO2009037399 A2 WO 2009037399A2 FR 2008001064 W FR2008001064 W FR 2008001064W WO 2009037399 A2 WO2009037399 A2 WO 2009037399A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
spores
microorganisms
aeration
fms
solid
Prior art date
Application number
PCT/FR2008/001064
Other languages
English (en)
Other versions
WO2009037399A3 (fr
Inventor
Sevastianos Roussos
Mustapha Ismaili-Alaoui
Hicham Hassouni
Original Assignee
Institut De La Recherche Pour Le Developpement (Ird)
Institut Agronomique Et Veterinaire - Hassan Ii
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut De La Recherche Pour Le Developpement (Ird), Institut Agronomique Et Veterinaire - Hassan Ii filed Critical Institut De La Recherche Pour Le Developpement (Ird)
Priority to BRPI0814321-8A2A priority Critical patent/BRPI0814321A2/pt
Priority to EP08832545A priority patent/EP2173871A2/fr
Priority to MX2010001045A priority patent/MX2010001045A/es
Publication of WO2009037399A2 publication Critical patent/WO2009037399A2/fr
Publication of WO2009037399A3 publication Critical patent/WO2009037399A3/fr
Priority to TNP2010000042A priority patent/TN2010000042A1/fr
Priority to MA32558A priority patent/MA31544B1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N3/00—Spore forming or isolating processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the subject of the present invention is a new process for the production in solid medium of spores and metabolites originating from microorganisms of fungal origin and the use of the spores and metabolites thus obtained in fields such as agriculture, the environment, the environment and the environment. agronomy, agro-food, chemistry and / or pharmacy.
  • the spores of microorganisms of fungal origin represent both the form of resistance and the form of reproduction of these microorganisms.
  • Various techniques are known to date for the production of spores of microorganisms of fungal origin. The oldest, which is also the most traditional, is to cultivate the microorganism on the surface of an agar medium either in a Petri dish or in Roux vials. This technique causes problems of spore harvesting and handling of a large number of vials when the desired amount of spores is important.
  • the production of spores is carried out in trays and uses the culture of the microorganism on plant substrates such as wheat bran, straw and various products or starchy residues arranged in a few centimeters thick layer and placed in incubator ovens.
  • plant substrates such as wheat bran, straw and various products or starchy residues arranged in a few centimeters thick layer and placed in incubator ovens.
  • Complex automatic devices for loading and unloading trays have been proposed.
  • the product obtained consists not of pure spores, but of a mixture of spores, mycelium microorganism and plant residues.
  • maintaining aseptic conditions is tricky. Spore harvesting, ambient contamination and body variability are major drawbacks.
  • the processes for producing fungal microorganism spores in liquid or solid-state fermenters are performed under high humidity conditions.
  • the spores being harvested at the end of these processes by centrifugation, it is necessary to eliminate large volumes of the fermentation juice.
  • the moisture of the biomass obtained represents a risk of spore germination.
  • dry air is used at a temperature of 40 ° or 50 ° C.
  • mold spores are very sensitive to heat, and prolonged exposure to 40 ° C. causes significant spore mortality. .
  • the object of the invention is to at least partially overcome these various disadvantages with a process for producing spores of microorganisms of fungal origin on a solid medium.
  • Another object of the invention is to provide a fermentation method in solid medium (“FMS”) that does not contaminate the environment.
  • FMS solid medium
  • the subject of the present invention is a process for producing microorganism spores of fungal origin on a solid medium (solid state fermentation "FMS"), said solid medium comprising a solid absorbent, low density and practically non-fermentable, impregnated support.
  • the process of the invention comprises, during the spore production phase, the application of a water stress triggered by aeration with dry air at a temperature ranging from 15 to 30.degree. 0 C, preferably from 18 ° C to 29 ° C, and more preferably still at a temperature of 25 ° C.
  • the water stress is advantageously applied at a precise moment of the process that is to say just at the moment when the microorganism sets up its asexual reproduction system to cope with unfavorable external conditions (lack of water, lack of nutrients).
  • the method of the present invention more particularly comprises the following steps:
  • the support is ground into particles having a diameter preferably of 1 to 5 mm, and moistened with an aqueous nutrient solution containing, for example, inorganic salts.
  • the sterilization of the support thus moistened is preferably carried out by a heat treatment.
  • step (b) of impregnation of the support the amount of water used in the liquid culture medium is equivalent to about 3 to 5 times the weight of the support.
  • the impregnation of the pre-conditioned support with the liquid culture medium is carried out in a mixer to ensure a satisfactory distribution and homogenization of the mixture to be fermented.
  • the fermentation step (c) is carried out in an incubator, which will be, for example, a reaction column, a stirred or static incubator equipped with a gaseous effluent analysis device making it possible to monitor the growth of the microorganisms, their respiration, the morphological stages in particular spore germination at the beginning of the FMS and then the start of the spore production phase.
  • an incubator which will be, for example, a reaction column, a stirred or static incubator equipped with a gaseous effluent analysis device making it possible to monitor the growth of the microorganisms, their respiration, the morphological stages in particular spore germination at the beginning of the FMS and then the start of the spore production phase.
  • an incubator which will be, for example, a reaction column, a stirred or static incubator equipped with a gaseous effluent analysis device making it possible to monitor the growth of the microorganisms, their respiration, the morphological stages in particular spore germination at the beginning
  • the choice of the solid support is not related to the nature of the carbon substrate.
  • it may be chosen according to specific criteria as defined above (water retention capacity, porosity, resistance to sterilization, etc.).
  • the porosity of about 60% of the support facilitates the circulation of dry air and thus evaporates water and effectively maintain water stress.
  • the absorbent solid support used in the process of the invention is substantially non-fermentable, which means that after fermentation with the microorganism, the support substantially retains its mechanical properties. In particular, it retains much of its initial porosity.
  • solid support of natural origin mention may be made of cereal straw, sawdust, beet pulp, olive pomace, coffee pulp, sugar cane bagasse and / or their mixtures.
  • a solid support of synthetic origin there may be mentioned a polymer foam such as polyurethane foam.
  • the solid medium culture method of the invention makes it possible in particular to diversify the nature of the usable carbon substrates, to increase the quantity of free water, to provide specific inducers and to maintain favorable conditions during the production stage. spores.
  • the triggering of the water stress after the start of the spore production phase advantageously makes it possible to stimulate the production of said spores, to maintain their production and to obtain them in dry form without contamination by the culture medium.
  • the carbon substrate included in the culture medium is advantageously chosen from the group comprising simple sugars, polysaccharides, proteins, amino acids, lipids, fatty acids, hydrocarbons, starchy natural substrates, wheat bran and / or mixtures thereof.
  • Such a substrate is a soluble substance whose concentration can be modulated.
  • the solid support is sugarcane bagasse and the carbonaceous substrate is wheat bran.
  • the solid support is used in proportions ranging from 60 to 80% relative to the carbon substrate and the carbon substrate is used in proportions ranging from 40 to 20% relative to to solid support.
  • yeast extracts examples include yeast extracts, vitamins, amino acids, trace elements, precursors of metabolites and / or mixtures thereof.
  • the process of the invention is further characterized in that the spore suspension included in the culture medium comprises from about 2 to 4. 10 7 spores per gram of total dry matter of the fungal microorganism.
  • microorganisms of fungal origin used according to the present process are filamentous fungi. These are in particular nematophages or entomopathogens. These fungi are used in biological control as agents for controlling the population of diseases and / or their vectors.
  • filamentous fungi are advantageously chosen from the group comprising the genera Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Geotrichum, Paecilomyces, Metarbizium, Trichoderma, Giberella, Fusarium, Venticillium and Mucor.
  • the genera Aspergillus, Penicillium, Rhizopus and Geotrichum will be used more particularly in the food industry, the fungi of the genus Geotrichum being used in biological fight against mold and protecting fruits and grains after harvest.
  • the genera Paecilomyces and Metarbizium are used in the field of agronomy as biopesticides, respectively against nematodes and against migratory insects such as locusts.
  • the genus Trichoderma is used in the field of environmental biotechnology, the recycling of cellulosic biomasses or the production of secondary metabolites.
  • the genus Giberella is used in the field of pharmacy because it allows to produce a phytohormone: gibberellin.
  • the method of the invention is characterized in that the aeration with dry air triggering the water stress during the spore production phase is preceded by aeration with air wet, said aeration with moist air being performed from the FMS to promote the growth of fungal microorganisms.
  • the aeration with moist air allows more particularly, at the beginning of the FMS, the germination of spores of microorganisms, then finally the start of the spore production phase. Once the production phase has begun, the aeration with moist air can be substituted by aeration with dry air, and this under conditions to obtain the highest number of spores.
  • the aeration with dry air is carried out with a flow rate ranging from 50 to 200 ml / min / column of dry air, and preferably from 50 to 100 ml. / min / column of dry air, corresponding to 50 to 20 renewals per hour of the useful volume of the FMS bioreactor.
  • the originality of the process of the invention consists in using variable volumes of dry air which, on the one hand, make it possible to maintain the permanent water stress as a means of stimulating the spore production phase, while avoiding a rapid drying out of the spore. culture medium that would stop the growth of microorganisms, and secondly to maintain throughout the process the continuous and massive production of spores. Spore production yields of the order of about 10 10 spores per gram of carrier dry matter are thus obtained.
  • the dry air flow allows at the end of the process to obtain a dry fermented product containing the biomass of the fungus mainly in the form of spores, in particular conidiospores.
  • the fermented final product containing the conidiospores has less than 3% moisture. It can be stored for several months without loss of viability.
  • the method is more particularly characterized in that: the microorganism of fungal origin is a filamentous fungus and is preferably Aspergillus Niger and / or,
  • the solid carrier is sugar cane bagasse and / or
  • the carbonaceous substrate is wheat bran and / or,
  • the mixture solid support / carbon substrate
  • namely (sugarcane bagasse / wheat bran) is used in proportions (70/30%).
  • Aeration in moist air is carried out at a flow rate of 20 to 40 ml / min / column of moist air, and preferably at a flow rate of 30 ml / min / column of moist air. Under the conditions mentioned above, it will thus be possible to obtain large quantities of spores up to 1. 168 ⁇ 10 10 spores per gram of carrier dry matter after a total duration of FMS of just 6 days.
  • the spores obtained according to the process of the invention are in large quantities and are not only dry, but are also viable and easily preserved for several months.
  • the method of the invention has other advantages.
  • the FMS process of the invention is more particularly carried out in a closed double-walled internal static bioreactor.
  • aeration with dry air it promotes the evaporation of water.
  • the water has been removed in the form of steam through aeration with dry air and low flow, thus avoiding turbulence and suspension of the spores produced in the air.
  • the water stress is exerted with dry air and cold (15 to 30 0 C) which makes it possible to avoid the destruction of spores by the high temperature.
  • the product obtained is dry, which avoids treating contaminated liquid effluents from the bioreactor.
  • the product is obtained in its packaging ready to be stored long period of time.
  • Another advantage of the process of the invention is that it promotes the production of primary and / or secondary, and preferably secondary metabolites.
  • p is favored for secondary metabolites since the latter is directly sporulation of the filamentous fungi.
  • the production of the secondary moles is directly proportional to the amount of spores produced the more spores produced under the effect of water stress, the more metabolites produced during the process of the invention. As a result, Sf promotes the production of metabolites in general.
  • the prc further characterized in that it comprises, at the end of the FMS, a recovery of primary and / or secondary metabolites produced by the sp of enzymes (pectinase , cellulase), exoenzymes, acids and micotoxins, lactones, alkaloids, steroids, gibberell ergotamines, antibiotics (penicillin) and / or mixtures thereof.
  • pectinase cellulase
  • exoenzymes acids and micotoxins
  • lactones lactones
  • alkaloids alkaloids
  • steroids gibberell ergotamines
  • antibiotics penicillin
  • the subject of the present invention is also the spores of microo ⁇ of fungal origin and / or their metabolites which can be obtained as defined above.
  • Another subject of the present invention relates to the use of microorganisms of fungal origin and / or their metabolites obtained as defined above for application in agronomy and / or agri-food.
  • filamentous spi mushrooms are used raw to develop bio-p against insects, nematodes, phytopathogenic fungi.
  • spores of fungi as a natural means of control (biological control) against the invasion of the African continent as well as the European continent is an interesting alternative to the use of pesticides traditionally used in agriculture.
  • fungi naturally parasite these animals at the same time and thus prevent their proliferation.
  • Spores of filamentous fungi can also be used raw to develop weed herbicides.
  • the invention therefore also relates to a method of biological control characterized in that an amount effective as a biopesticide and / or as a herbicide, spores of fungal microorganisms and / or their metabolites is used. .
  • Another example in the field of agronomy lies in the use of said spores as starter-inoculum ferment to start processes for producing phytohormones (gibberellins) in FMS.
  • the spores of certain beneficial molds can thus be used:
  • the subject of the invention is also the use of spores of microorganisms of fungal origin and / or their metabolites obtained according to the process as defined above for an application in the field of chemistry.
  • the field of biocatalysis where the spores of filamentous fungi can be used as such in unconventional media or can be microencapsulated for use in fine chemistry.
  • Another subject of the invention is the use of spores of microorganisms of fungal origin and / or their metabolites obtained according to the process as defined above for an application in the field of pharmacy.
  • the spores of filamentous fungi are more particularly used as "starters” for the production of secondary metabolites (mycotoxins, antibiotics) by the pharmaceutical industry.
  • FIG. 1 represents the evolution of the humidity of a 70/30% bagasse / wheat bran substrate, at 30 ° C. for different air flows and in FIG. 2 giving the results.
  • Dry air flow rates are therefore tested for respectively 5 columns (N ° 11, 12, 13, 14 and 15) of size identical, namely a column of 4 cm in diameter and 20 cm in height. Dry air flow rates are respectively 2, 4, 10, 20 and 40 times the air change of the potential volume for the five columns of the same size used (N 0 11, 12, 13, 14 and 15).
  • FIG. 1 represents the kinetic curves of evolution of the moisture of the uninoculated carrier / substrate mixture (70% sugarcane bagasse / 30% wheat bran) at 30 ° C. for the different dry air flow rates (col # 11: 0.5 l / min / neck), (collar # 12: 1 l / min / neck), (collar 13: 2.5 l / min / neck); (Col No. 14: 5 l / min / col), (Col. 15: 10 l / min / col) for 44 hours.
  • EXAMPLE 2 Effect of water stress exerted from 30 hours, 3 days and 5 days of FMS.
  • the inventors of the present invention have been able to observe that the substitution of wet aeration by dry aeration from 30 hours, 3 days or 5 days of FMS is generally very favorable for the massive production of spores.
  • Aspergillus Niger A. niger
  • Aspergillus Niger incubated at 30 ° C. on a sugarcane / wheat bran bagasse (70/30%).
  • the sporulation index (Is) represents the number of spores produced per gram of dry matter support.
  • the humid air aeration carried out at the beginning of the fermentation process in solid medium is carried out at a flow rate of 30 ml / min / column.
  • the total duration of the FMS is 10 days and 16 hours whereas from 30 hours the total duration of FMS is approximately 10 days (9 days and 22 hours).
  • the sporulation index is increased by 14 times with a sporulation index of 11.68 ⁇ 10 9, unlike dry aeration at from 30 h, where the sporulation index is 7.58 x 10 8 (twice) after 6 days (5 days and 22 h) and 4 and a half days (4 days and 10 h) respectively.
  • Dry aeration not only allows the large spore production in A niger but also shortens the total duration of FMS and avoids the phenomenon of the regermination of spores produced by reduction of water activity.
  • the availability of water is a paramount parameter for spore germination in filamentous fungi, particularly Aspergillus niger.
  • Table 1 Spore production before and after drying at different flow rates in dry air during the cultivation of A nigeren FMS at 30 ° C. for a useful volume of 100 ml.
  • the spores of A niger are viable both before and after application of the drying from 3 days of FMS with wet forced aeration. Therefore, drying does not negatively affect the viability of A niger spores.
  • Forced ventilation in moist air is generally highly recommended during the solid-state fermentation process as it provides oxygen and water for the growth of the filamentous fungus. However, it negatively influences sporulation and subsequently spore production. The phase of sporulation is generally induced by various factors including the lack of nutrients, the presence of secondary metabolites and also by the low activity of water.
  • aeration in dry air has been adopted in order to lower the water activity or the water content (moisture) and to stimulate the sporulation of the fungus concerned.
  • the application at a precise moment of the FMS of aeration in dry air makes it possible to significantly increase the sporulation index and avoids the germination of the spores.
  • the timing of aeration in dry air is crucial. It allows to calculate the productivity of the process according to the two main variables: the time necessary to have a fermented dry product and a good sporulation index.
  • the study showed that aeration at 100 ml / min / neck in dry air after 3 days of moist air FMS allows to have a final product after a total duration of 6 days of FMS with a sporulation index up to at 1,168 x 10 and a very high viability.

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Abstract

La présente invention a pour objet un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide " FMS "), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température. La présente invention a également pour objet l'utilisation des spores ainsi obtenues et/ou de leurs métabolites dans les domaines de l'agronomie, de la chimie et/ou de la pharmacie.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE SPORES ET DE METABOLITES PROVENANT DE MICROORGANISMES D'ORIGINE FONGIQUE ET LEURS UTILISATIONS.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de production en milieu solide de spores et de métabolites provenant de microorganismes d'origine fongique et l'utilisation des spores et métabolites ainsi obtenus dans des domaines tels que l'agriculture, l'environnement, l'agronomie, l'agro-alimentaire, la chimie et/ou la pharmacie.
Les spores des microorganismes d'origine fongique représentent à la fois la forme de résistance et la forme de reproduction de ces microorganismes. Différentes techniques sont connues à ce jour pour la production de spores de microorganismes d'origine fongique. La plus ancienne, qui est également la plus artisanale, consiste à cultiver le micro-organisme à la surface d'un milieu gélose soit en boîte de Pétri, soit en fioles de Roux. Cette technique pose des problèmes de récolte des spores et de manipulation d'un nombre important de fioles lorsque la quantité désirée de spores est importante.
Dans une autre technique, la production de spores est réalisée en plateaux et fait appel à la culture du microorganisme sur des substrats végétaux tels que son de blé, paille et divers produits ou résidus amylacés disposés en couche de quelques centimètres d'épaisseur et placés dans des étuves d'incubation. Des dispositifs automatiques complexes de chargement et de déchargement des plateaux ont été proposés. Toutefois, il reste que le produit obtenu est constitué non pas de spores pures, mais d'un mélange de spores, de mycélium du microorganisme et des résidus végétaux. D'autre part, le maintien des conditions aseptiques est délicat. La récolte des spores, la contamination ambiante et la variabilité de l'organisme sont des inconvénients majeurs.
La production de spores de microorganismes d'origine fongique dans des cultures liquides, en utilisant des fermentateurs stérilisables, a également été décrite. Cependant, ce mode de production n'est possible que dans des conditions particulières et avec un nombre limité de champignons. En outre, la suspension recueillie contient non seulement les spores, mais également une quantité importante de métabolites et tous les débris cellulaires qui peuvent être gênants. Enfin, le maintien des conditions d'aération efficace du milieu liquide pendant de longues périodes d'incubation entraîne des dépenses d'énergie coûteuses. Les procédés de fermentations en milieu solide (« FMS ») ont aussi été proposés pour la production de spores de champignons. Généralement la culture du champignon est réalisée sur un substrat solide jouant à la fois le rôle de source carbonée, d'inducteur et de support de croissance. Ceci entraîne une limitation des possibilités de production d'enzymes et de métabolites par les champignons étant donné la nature des substrats solides agricoles essentiellement amylacés ou cellulosiques (cossettes de betterave, riz, soja, graines de céréales, son de céréales, pailles de céréales, tubercules amylacés et divers autres substrats ligno- cellulosiques). De ce fait un grand nombre d'enzymes ou de métabolites inductibles ne peuvent pas être obtenus par fermentation en milieu solide (FMS).
Par ailleurs, la récupération de métabolites produits par les microorganismes en milieu solide pose un problème délicat de séparation des fractions solides et liquides, ce qui conduit à pratiquer un ou plusieurs lavages successifs et à récupérer ces substances dans des solutions relativement diluées. En outre, il est souvent très difficile de séparer le mycélium produit du substrat/support initialement présent dans le bioréacteur.
Les fermentations aussi bien en milieu solide qu'en milieu liquide aboutissent à l'obtention de solutions diluées, ce qui entraîne un coût global de production élevée.
De plus, les procédés de production de spores de microorganismes d'origine fongique dans des fermenteurs liquides ou en milieu solide sont effectués dans des conditions d'humidité élevée. Les spores étant récoltées à la fin de ces procédés par centrifugation, il s'avère nécessaire d'éliminer des volumes importants du jus de fermentation. Par ailleurs, l'humidité de la biomasse obtenue représente un risque de germination des spores. Pour sécher cette biomasse, on utilise de l'air sec à une température de 40° ou 500C. Or, les spores de moisissures sont très sensibles à la chaleur, et une exposition prolongée à 4O0C cause une mortalité importante des spores.
Aucun des procédés de production de spores existants à ce jour, ne permet d'obtenir une grande quantité de spores qui soient à la fois viables, sèches et facilement conservables pendant plusieurs mois. L'invention a pour but de surmonter au moins en partie ces différents inconvénients avec un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de fermentation en milieu solide (« FMS ») qui ne contamine pas l'environnement.
La présente invention a pour objet un procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide « FMS »), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress hydrique déclenché par une aération avec de l'air sec à une température allant de 15 à 300C, de préférence de 18°C à 29°C, et plus préférentiellement encore à une température de 25°C.
Selon l'invention, le stress hydrique est avantageusement appliqué à un moment précis du procédé c'est-à-dire juste au moment où le microorganisme met en place son système de reproduction asexuée pour faire face à des conditions extérieures défavorables (manque d'eau, manque de nutriments).
De manière avantageuse, l'application du stress hydrique sur le support solide imprégné du milieu de culture permet :
- la stimulation de la phase de production des spores desdits microorganismes,
- le maintien de la phase de production des spores pendant plusieurs jours,
- le séchage des spores sans altérer leur viabilité,
- la non contamination du milieu de culture par d'autres micro-organismes.
Plus longtemps le stress extérieur efficace est maintenu, plus le microorganisme construira des structures de reproduction asexuée, et par conséquent des spores. Le procédé de la présente invention comporte plus particulièrement les étapes suivantes :
(a) pré-conditionnement du support solide qui implique successivement le broyage dudit support en particules, l'humidification dudit support avec une solution aqueuse nutritive pouvant contenir certains éléments du milieu de culture, lesdits éléments du milieu de culture pouvant supporter un traitement par stérilisation, et enfin la stérilisation du support ainsi humidifié,
(b) l'imprégnation du support ainsi pré-conditionné avec un milieu de culture liquide comprenant, outre ladite suspension de spores des microorganismes d'origine fongique, un ou plusieurs substrats carbonés solubles, un ou plusieurs agents de croissance, l'humidité du mélange ainsi obtenu ayant une valeur allant de 50 à 85%,
(c) la fermentation du mélange ainsi obtenu (FMS) dans des conditions de température, d'humidité et d'aération optimales pour la croissance des microorganismes, la germination de leurs spores et le démarrage de la phase de production desdites spores.
Dans l'étape (a) de pré-conditionnement ci-dessus décrite, le support est broyé en particules ayant un diamètre de préférence de 1 à 5 mm, et humidifié avec une solution aqueuse nutritive contenant par exemple des sels minéraux. La stérilisation du support ainsi humidifié est de préférence effectuée par un traitement thermique.
Dans l'étape (b) d'imprégnation du support, la quantité d'eau utilisée dans le milieu de culture liquide est équivalente à environ 3 à 5 fois le poids du support. L'imprégnation du support pré-conditionné avec le milieu de culture liquide est effectuée dans un mélangeur permettant d'assurer une répartition et une homogénéisation du mélange à fermenter satisfaisantes.
L'étape (c) de fermentation est effectuée dans un incubateur, qui sera par exemple une colonne de réaction, un incubateur agité ou statique équipé d'un dispositif d'analyse des effluents gazeux permettant de suivre la croissance des microorganismes, leur respiration, les étapes morphologiques en particulier la germination des spores au début de la FMS et ensuite le démarrage de la phase de production des spores. Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention le support solide d'origine naturelle ou synthétique :
- présente une capacité de rétention d'eau permettant une absorption d'eau de 3 à 5 fois son propre poids,
- présente une porosité globale apparente d'environ 60% après imprégnation avec le milieu de culture,
- présente une résistance à la stérilisation.
De façon avantageuse, le choix du support solide n'est pas lié à la nature du substrat carboné. Ainsi, il pourra être choisi en fonction de critères spécifiques tels que définis ci-dessus (capacité de rétention d'eau, porosité, résistance à la stérilisation ...).
La capacité d'absorption de l'eau doit pouvoir être effectuée sans drainage sensible.
La porosité d'environ 60% du support permet de faciliter la circulation de l'air sec et ainsi d'évaporer l'eau et de maintenir efficacement le stress hydrique.
Le support solide absorbant utilisé dans le procédé de l'invention est pratiquement non fermentable, ce qui signifie qu'après la fermentation avec le microorganisme, le support conserve pratiquement ses propriétés mécaniques. En particulier, il conserve une grande partie de sa porosité initiale.
A titre d'exemple de support solide d'origine naturelle, on pourra citer la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre et/ou leurs mélanges. A titre d'exemple de support solide d'origine synthétique on pourra citer une mousse de polymère telle que la mousse de polyuréthanne.
Le procédé de culture en milieu solide de l'invention permet notamment de diversifier la nature des substrats carbonés utilisables, d'augmenter la quantité d'eau libre, d'apporter des inducteurs spécifiques et de maintenir des conditions favorables pendant l'étape de production des spores. En outre, le déclenchement du stress hydrique après le démarrage de la phase de production des spores permet de façon avantageuse de stimuler la production desdites spores, de maintenir leur production et de les obtenir sous forme sèche sans contamination par le milieu de culture.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le substrat carboné compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant les sucres simples, les polysaccharides, les protéines, les acides aminés, les lipides, les acides gras, les hydrocarbures, les substrats naturels amylacés, les sons de blé et/ou leurs mélanges.
Un tel substrat constitue une substance soluble dont on peut moduler la concentration.
Selon un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, le support solide est de la bagasse de canne à sucre et le substrat carboné est du son de blé.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, le support solide est utilisé dans des proportions allant de 60 à 80% par rapport au substrat carboné et le substrat carboné est utilisé dans des proportions allant de 40 à 20% par rapport au support solide.
A titre d'exemples d'agents de croissance présents dans le milieu de culture, on pourra citer des extraits de levure, des vitamines, des acides aminés, des oligoéléments, des précurseurs de métabolites et/ou leurs mélanges.
Le procédé de l'invention est encore caractérisé en ce que la suspension de spores comprise dans le milieu de culture comprend d'environ 2 à 4. 107 spores par gramme de matière sèche totale du microorganisme d'origine fongique.
Les microorganismes d'origine fongique mis en œuvre selon le présent procédé sont des champignons filamenteux. Il s'agit en particulier de nématophages ou d'entomopathogènes. Ces champignons sont utilisés en lutte biologique comme agents de contrôle de population des maladies et/ou de leurs vecteurs.
Les champignons filamenteux sont avantageusement choisis dans le groupe comprenant les genres Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus, Geotrichum, Paecilomyces, Metarbizium, Trichoderma, Giberella, Fusarium, Venticillium et Mucor.
A titre indicatif, les genres Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus et Geotrichum seront plus particulièrement utilisés dans le domaine de l'agroalimentaire, les champignons du genre Geotrichum étant utilisés en lutte biologique contre les moisissures et protégeant les fruits et les céréales après la récolte.
Les genres Paecilomyces et Metarbizium sont utilisés dans le domaine de l'agronomie comme biopesticides, respectivement contre les nématodes et contre les insectes migrateurs comme les criquets.
Le genre Trichoderma est utilisé dans le domaine de la biotechnologie de l'environnement, le recyclage de biomasses cellulosiques ou la production de métabolites secondaires. Le genre Giberella est utilisé dans le domaine de la pharmacie car il permet de produire une phytohormone : la gibbérelline.
Il est également envisageable d'utiliser dans le procédé de l'invention une association de champignons et de levures, bactéries ou actinomycètes.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé de l'invention est caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec déclenchant le stress hydrique lors de la phase de production des spores est précédée par une aération avec de l'air humide, ladite aération avec de l'air humide étant effectuée au départ de la FMS afin de favoriser la croissance des microorganismes d'origine fongique.
L'aération avec de l'air humide permet plus particulièrement, au début de la FMS, la germination des spores des microorganismes, puis enfin le démarrage de la phase de production des spores. Une fois la phase de production commencée, l'aération avec de l'air humide pourra être substituée par une aération avec de l'air sec, et ceci dans des conditions permettant d'obtenir le nombre le plus élevé de spores.
Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de l'invention, l'aération avec de l'air sec est effectuée avec un débit allant de 50 à 200 ml/min/colonne d'air sec, et de préférence de 50 à 100 ml/min/colonne d'air sec, correspondant à 50 à 20 renouvellements à l'heure du volume utile du bioréacteur FMS.
L'originalité du procédé de l'invention consiste à utiliser des volumes variables d'air sec qui permettent d'une part de maintenir le stress hydrique permanent comme moyen de stimulation de la phase de production des spores, tout en évitant un dessèchement rapide du milieu de culture qui provoquerait l'arrêt de croissance des microorganismes, et d'autre part de maintenir tout au long du procédé la production continue et massive de spores. Des rendements de production de spores de l'ordre d'environ 1010 spores par gramme de matière sèche de support sont ainsi obtenus.
Le débit d'air sec permet à la fin du procédé d'obtenir un produit fermenté sec contenant la biomasse du champignon essentiellement sous forme de spores, en particulier de conidiospores.
Le produit final fermenté contenant les conidiospores comporte moins de 3% d'humidité. Il peut être conservé pendant plusieurs mois sans perte de viabilité.
Selon un mode de réalisation avantageux, le procédé est plus particulièrement caractérisé en ce que : - le microorganisme d'origine fongique est un champignon filamenteux et est de préférence Aspergillus Niger et/ou,
- le support solide est de la bagasse de canne à sucre et/ou,
- le substrat carboné est du son de blé et/ou,
- le mélange (support solide / substrat carboné), à savoir (bagasse de canne à sucre/son de blé) est utilisé dans les proportions (70 / 30%).
Dans de telles conditions, la substitution de l'aération en air humide par de l'aération en air sec est effectuée à un débit de 100 ml/min/colonne d'air sec après trois jours entiers de FMS.
L'aération en air humide est effectuée à un débit allant de 20 à 40 ml/min/colonne d'air humide, et de préférence à un débit de 30 ml/min/colonne d'air humide. Dans les conditions susmentionnées, on pourra ainsi obtenir de grandes quantités de spores allant jusqu'à 1 ,168.1010 spores par gramme de matière sèche de support après une durée totale de FMS d'à peine 6 jours.
Les spores obtenues selon le procédé de l'invention le sont en quantité importante et sont non seulement sèches, mais sont également viables et facilement conservables pendant plusieurs mois.
Outre la production quantitativement et qualitativement satisfaisante de spores de microorganismes d'origine fongique, le procédé de l'invention présente d'autres avantages.
Un de ces avantages est que le procédé de production de spores en FMS ne contamine pas l'environnement dans lequel il est effectué.
En effet, le procédé de FMS de l'invention est plus particulièrement effectué dans un bioréacteur statique fermé à double paroi intérieure. Grâce à une aération avec de l'air sec, on favorise l'évaporation de l'eau. Il n'y a donc pas d'effluents liquides à traiter à la fin du procédé, étant donné que l'eau a été éliminée sous forme de vapeur grâce à une aération avec de l'air sec et à faible débit, évitant ainsi des turbulences et la mise en suspension dans l'air des spores produites. Par ailleurs, rappelons que le stress hydrique s'exerce avec de l'air sec et froid (15 à 300C) ce qui permet d'éviter la destruction de spores par la température élevée.
Il n'y a donc pas de contaminations car, l'activité de l'eau étant faible, on empêchera, au cours du stress hydrique, la croissance de contaminants (essentiellement bactéries et levures) en FMS. A la fin du procédé, le produit obtenu est sec ce qui évite de traiter des effluents liquides contaminés provenant du bioréacteur. Le produit est obtenu dans son emballage prêt à être stocké longue période de temps.
Un autre avantage du procédé de l'invention est qu'il favorise la prod métabolites primaires et/ou secondaires, et de préférence secondaires. En maintenant des conditions favorables pour la sporulation, on favorise la p de métabolites secondaires étant donnée que cette dernière est directemen sporulation des champignons filamenteux. La production des mi secondaires est directement proportionnelle à la quantité de spores produit plus il y aura de spores produites sous l'effet d'un stress hydrique, plus il \ métabolites produits au cours du procédé de l'invention. De ce fait, la Sf favorise la production de métabolites en général.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le prc encore caractérisé en ce qu'il comprend, à l'issue de la FMS, une ι récupération de métabolites primaires et/ou secondaires produits par les sp que des enzymes (pectinase, cellulase), des exoenzymes, des acides ni des micotoxines, des lactones, des alcaloïdes, des stéroïdes, des gibbérell ergotamines, des antibiotiques (pénicilline) et/ou leurs mélanges.
La présente invention a également pour objet les spores de microoπ d'origine fongique et/ou leurs métabolites susceptibles d'être obtenus procédé tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation de s microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le don l'agronomie et/ou de l'agroalimentaire.
Plus particulièrement, dans le domaine de l'agronomie, les spi champignons filamenteux sont utilisées brutes pour élaborer des bio-p contre les insectes, les nématodes, les champignons phytopathogènes.
A titre d'exemple, l'utilisation des spores des champignons fil< comme moyen naturel de lutte (lutte biologique) contre l'invasion des criqu continent africain mais également européen est une alternative extr intéressante à l'utilisation des pesticides traditionnellement utilisés dans l'a( En effet, les champignons parasitent naturellement ces animaux au momei alimentation et empêchent ainsi leur prolifération. Les spores des champignons filamenteux peuvent également être utilisées brutes pour élaborer des herbicides contre les mauvaises herbes.
L'invention concerne donc également une méthode de lutte biologique caractérisée en ce qu'on utilise une quantité efficace en tant que bio-pesticide et/ou en tant qu'herbicide, de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites.
Un autre exemple dans le domaine de l'agronomie réside dans l'utilisation desdites spores comme ferment « starter-inoculum » pour démarrer des procédés de production de phytohormones (gibbérellines) en FMS.
Dans le domaine de l'agro-alimentaire, les spores de certaines moisissures utiles peuvent ainsi être utilisées :
- comme agents aromatisants lors du maltage (Geotrichum notatum) contre des moisissures productrices de mycotoxines pour la production de la bière ;
- comme inoculum-starter du caillé de lait (Pénicillium roqueforti, Penicilium camemberti ...) pour l'élaboration de fromages à pâte molle ;
- comme inoculum pour l'élaboration des aliments fermentes contenant des moisissures nobles.
Mais l'usage le plus important en agro-alimentaire est l'utilisation des spores de champignons filamenteux pour démarrer différentes FMS, pour la valorisation des sous produits agricoles, la production de métabolites primaires et secondaires (enzymes, acides organiques, arômes etc.).
L'invention a encore pour objet l'utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le domaine de la chimie.
On citera plus particulièrement le domaine de la biocatalyse, où les spores des champignons filamenteux peuvent être utilisées telles quelles dans des milieux non conventionnels ou peuvent être micro-encapsulées pour des utilisations en chimie fine.
Un autre objet de l'Invention réside dans l'utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus pour une application dans le domaine de la pharmacie. Les spores des champignons filamenteux sont plus particulièrement utilisés comme « starter » pour la production de métabolites secondaires (mycotoxines, antibiotiques) par l'industrie pharmaceutique.
Les exemples ci-après illustrent l'invention, ils ne la limitent en aucune façon. Ces exemples permettent de mettre en évidence d'autres avantages et caractéristiques de la présente invention.
Il y est fait référence à la figure 1 qui représente l'évolution de l'humidité d'un substrat bagasse/son de blé 70/30 %, à 300C pour différents débits d'air et à la figure 2 donnant les résultats de l'application d'un stress hydrique (indice de sporulation (108) en fonction du temps (h).
EXEMPLE 1 : Etude du séchage du mélange (support solide / substrat carboné) non inoculé
Avant d'étudier les effets de l'aération avec de l'air sec sur la production de spores d'Aspergillus Niger sur le mélange (bagasse de canne à sucre /son de blé) dans les proportions (70 / 30 %), il est important de connaître les cinétiques du séchage pour ce mélange en fonction de différents débits d'airs secs sur des colonnes de taille identique.
Différentes valeurs de débits d'air sec (0,5 ; 1 ; 2,5 ; 5 et 10 l/min/colonne) sont donc testées pour respectivement 5 colonnes (N° 11 , 12, 13, 14 et 15) de taille identique, à savoir une colonne de 4 cm de diamètre et de 20 cm de hauteur. Les débits en air sec sont respectivement de 2, 4, 10, 20 et 40 fois le renouvellement d'air du volume potentiel pour les 5 colonnes de taille identique utilisées (N0 11 , 12, 13, 14 et 15).
La figure 1 représente les courbes cinétiques d'évolution de l'humidité du mélange non inoculé support / substrat (bagasse de canne à sucre 70 % / son de blé 30 %) à 300C pour les différents débits d'air sec (col. N° 11 : 0,5 l/min/col), (col N° 12 : 1 l/min/col), (col. 13 : 2,5 l/min/col) ; (col N° 14 : 5 l/min/col), (col. 15 : 10 l/min/col) pendant 44 heures.
Conclusion :
On observe (voir figure 1) qu'au fur et à mesure que le débit en air sec diminue, le séchage prend plus de temps. Au bout de 44 heures maximum, le produit sec est obtenu pour le débit 2 fois le volume utile de la colonne (colonne 11).
La même expérience a été réalisée avec des dimensions différentes de colonnes. Il a ainsi été démontré que la porosité du substrat et la fluidité de l'air à travers la matrice solide n'est pas affectée par le changement d'échelle.
EXEMPLE 2 : Effet du stress hydrique exercé à partir de 30 heures, de 3 jours et de 5 jours de FMS.
Les Inventeurs de la présente invention ont pu remarquer que la substitution de l'aération humide par de l'aération à sec à partir de 30 heures, de 3 jours ou de 5 jours de FMS est généralement très favorable pour la production massive de spores d'Aspergillus Niger (A. niger) incubé à 300C sur bagasse de canne à sucre / son de blé (70/30 %).
En effet, tous les indices de sporulation obtenus après l'application du séchage, à n'importe quel débit, sont supérieurs à ceux obtenus en air humide (voir tableau 1 ci-dessous). L'indice de sporulation (Is) représente le nombre de spores produites par gramme de support de matière sèche.
L'aération en air humide effectuée au début du procédé de fermentation en milieu solide est réalisée un débit de 30 ml/min/colonne.
La substitution de l'aération en air humide par de l'aération à sec à un débit de 0,05 l/min/colonne à partir de 3 jours entiers ou à partir de 30 h de FMS augmente significativement l'indice de sporulation avec un facteur d'environ 14 fois pour le premier et de 10 fois pour le deuxième.
Cependant, à partir de 3 jours la durée totale de la FMS est de 10 jours et 16 h alors qu'à partir de 30 h la durée totale de FMS est d'environ 10 jours (9 jours et 22 h). Lorsque l'aération est à 0,1 l/min/colonne à partir de 3 jours, l'indice de sporulation est augmenté de 14 fois avec un indice de sporulation de 11 ,68 x 109 contrairement à l'aération à sec à partir de 30 h où l'indice de sporulation est de 7,58 x 108 (2 fois) au bout de 6 jours (5 jours et 22 h) et 4 jours et demi (4 jours et 10 h) respectivement.
L'aération à sec permet non seulement la production importante de spores d'A niger mais permet aussi de raccourcir la durée totale de FMS et d'éviter le phénomène de la regermination des spores produites par réduction de l'activité de l'eau. La disponibilité de l'eau est un paramètre primordial pour la germination des spores chez les champignons filamenteux notamment Aspergillus niger.
En conclusion, l'aération en air sec à un débit de 100 ml/min/colonne après 3 jours de FMS à aération humide semble la meilleure procédure afin de produire d'importantes quantités de spores (1 ,168 x 1010) après à peine 6 jours (5 jours et 22 h) de FMS.
Tableau 1 : Production de spores avant et après séchage à différents débits en air sec lors de la culture d'A nigeren FMS à 300C pour un volume utile de 100 ml.
Figure imgf000014_0001
Ce tableau est illustré par la figure 2 dans laquelle Is= indice de sporulation et SHy = stress hydrique ;
L'étude de la viabilité des spores d'Aspergillus Niger a également été effectuée par les Inventeurs afin de déterminer si les spores produites au terme de la FMS avant et après séchage sont viables ou non (voir tableau 2 ci-dessous). Tableau 2 : Viabilité des spores d1 A niger avant et après séchage à un débit de 100 ml/min/colonne après 3 jours d'aération humide et après 6 jours au total de FMS.
Figure imgf000015_0001
Conclusion du tableau 2 :
Les spores d'A niger sont viables aussi bien avant et après application du séchage à partir de 3 jours de FMS à aération forcée humide. Par conséquent, le séchage n'affecte pas négativement la viabilité des spores d'A niger.
Conclusion générale
L'aération forcée en air humide est généralement fort recommandée lors du processus de la fermentation en milieu solide vu qu'il permet d'apporter de l'oxygène et de l'eau nécessaires à la croissance du champignon filamenteux concerné. Cependant, elle influence négativement la sporulation et par la suite la production de spores. La phase de la sporulation est induite généralement par différents facteurs notamment le manque de nutriments, la présence de métabolites secondaires et aussi par la faible activité de l'eau.
Dans la présente invention, l'aération en air sec a été adoptée afin de baisser l'activité de l'eau ou la teneur en eau (humidité) et de stimuler par la suite la sporulation du champignon concerné.
L'application à un moment précis de la FMS de l'aération en air sec permet d'augmenter significativement l'indice de sporulation et évite la germination des spores. Le choix du moment de l'aération en air sec est crucial. Il permet de calculer la productivité du processus en fonction des deux variables principales : le temps nécessaire pour avoir un produit sec fermenté et un bon indice de sporulation. L'étude a montré que l'aération à 100 ml/min/col en air sec après 3 jours de FMS en air humide permet d'avoir un produit final après une durée totale de 6 jours de FMS avec un indice de sporulation allant jusqu'à 1.168 x 1010 et une viabilité très élevée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de production de spores de microorganismes d'origine fongique sur un milieu solide (fermentation en milieu solide « FMS »), ledit milieu solide comportant un support solide absorbant, de faible densité et pratiquement non fermentable, imprégné d'un milieu de culture approprié à la croissance desdits microorganismes et comprenant une suspension de spores desdits microorganismes, caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress choisi parmi un stress hydrique, un stress en oxygène et/ou un stress en température.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend, lors de la phase de production des spores, l'application d'un stress hydrique déclenché par une aération avec de l'air sec à une température allant de 15 à 3O0C.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
(a) pré-conditionnement du support solide qui implique successivement le broyage dudit support en particules, l'humidification dudit support avec une solution aqueuse nutritive pouvant contenir certains éléments du milieu de culture, lesdits éléments du milieu de culture pouvant supporter un traitement par stérilisation, et enfin la stérilisation du support ainsi humidifié,
(b) l'imprégnation du support ainsi pré-conditionné avec un milieu de culture liquide comprenant, outre ladite suspension de spores des microorganismes d'origine fongique, un ou plusieurs substrats carbonés solubles, un ou plusieurs agents de croissance, l'humidité du mélange ainsi obtenu ayant une valeur allant de 50 à 85%,
(c) la fermentation du mélange ainsi obtenu (FMS) dans des conditions de température, d'humidité et d'aération optimales pour la croissance des microorganismes, la germination de leurs spores et le démarrage de la phase de production desdites spores.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le support solide d'origine naturelle ou synthétique : - présente une capacité de rétention d'eau permettant une absorption d'eau de 3 à 5 fois son propre poids,
- présente une porosité globale apparente d'environ 60% après imprégnation avec le milieu de culture,
- présente une résistance à la stérilisation.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'un support solide d'origine naturelle est avantageusement choisi dans le groupe comprenant la paille de céréale, la sciure de bois, la pulpe de betterave, les grignons d'olive, la pulpe de café, la bagasse de canne à sucre et/ou leurs mélanges, et en ce qu'un support solide d'origine synthétique est par exemple une mousse de polymère.
6. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que le substrat carboné compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant les sucres simples, les polysaccharides, les protéines, les acides aminés, les lipides, les acides gras, les hydrocarbures, les substrats naturels amylacés, les sons de blé et/ou leurs mélanges.
7. Procédé selon les revendications 5 et 6, caractérisé en ce que le support solide est de la bagasse de canne à sucre et le substrat carboné est du son de blé.
8. Procédé selon les revendications 3 et 4, caractérisé en ce que le support solide est utilisé dans des proportions allant de 60 à 80% par rapport au substrat carboné et en ce que le substrat carboné est utilisé dans des proportions allant de 40 à 20% par rapport au support solide.
9. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent de croissance compris dans le milieu de culture est avantageusement choisi dans le groupe comprenant les extraits de levure, les vitamines, les acides aminés, les oligoéléments, les précurseurs de métabolites et/ou leurs mélanges.
10 Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la suspension de spores comprise dans le milieu de culture comprend d'environ 2 à 4. 107 spores par gramme de matière sèche totale du microorganisme d'origine fongique.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que les microorganismes d'origine fongique sont des champignons filamenteux, en particulier des champignons nématophages ou entomopathogènes.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que les champignons filamenteux sont avantageusement choisis dans le groupe comprenant les genres Aspergillus, Pénicillium, Rhizopus, Geotrichum, Paecilomyces, Metarbizium, Trichoderma, Giberella, Fusarium, Venticillium et Mucor.
13. Procédé selon les revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec déclenchant le stress hydrique lors de la phase de production des spores est précédée par une aération avec de l'air humide, ladite aération avec de l'air humide étant effectuée au départ de la FMS afin de favoriser la croissance des microorganismes.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec est effectuée avec un débit allant de 50 à 200 ml/min/colonne d'air sec, et de préférence de 50 à 100 ml/min/colonne d'air sec.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 7 et 11 , caractérisé en ce que :
- le microorganisme d'origine fongique est un champignon filamenteux et est de préférence Aspergillus Niger et/ou,
- le support solide est de la bagasse de canne à sucre et/ou,
- le substrat carboné est du son de blé et/ou,
- le mélange (support solide / substrat carboné), à savoir (bagasse de canne à sucre/son de blé) est utilisé dans les proportions (70 / 30%).
16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que l'aération avec de l'air sec est effectuée à un débit de 100 ml/min/colonne d'air sec, après trois jours entiers de FMS effectuée avec une aération avec de l'air humide.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend, à l'issue de la FMS, une étape de récupération de métabolites primaires et/ou secondaires produits par les spores, tels que des enzymes (pectinase, cellulase), des exoenzymes, des acides nucléiques, des micotoxines, des lactones, des alcaloïdes, des stéroïdes, des gibbérellines, des ergotamines, des antibiotiques (pénicilline) et/ou leurs mélanges.
18. Utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une application dans le domaine de l'agronomie et/ou de l'agroalimentaire.
19. Utilisation de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17, pour une application dans le domaine de la chimie.
20. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de spores de microorganismes d'origine fongique et/ou de leurs métabolites obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 17.
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