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WO2007147982A2 - Procede de detection de microorganisme au sein d'un echantillon - Google Patents

Procede de detection de microorganisme au sein d'un echantillon Download PDF

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WO2007147982A2
WO2007147982A2 PCT/FR2007/001042 FR2007001042W WO2007147982A2 WO 2007147982 A2 WO2007147982 A2 WO 2007147982A2 FR 2007001042 W FR2007001042 W FR 2007001042W WO 2007147982 A2 WO2007147982 A2 WO 2007147982A2
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WO
WIPO (PCT)
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sample
signals
diluted
tube
electromagnetic
Prior art date
Application number
PCT/FR2007/001042
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English (en)
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WO2007147982A3 (fr
Inventor
Luc Montagnier
Jamal Aissa
Original Assignee
Nanectis Biotechnologies
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to CN200780030875.4A priority patent/CN101506373B/zh
Priority to US12/305,417 priority patent/US20100323391A1/en
Priority to EP07788921A priority patent/EP2044210A2/fr
Publication of WO2007147982A2 publication Critical patent/WO2007147982A2/fr
Publication of WO2007147982A3 publication Critical patent/WO2007147982A3/fr
Priority to US13/785,718 priority patent/US20130224788A1/en

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass
    • G01N37/005—Measurement methods not based on established scientific theories

Definitions

  • the present invention relates to the detection of latent infections in humans and animals, by demonstrating the inhibition, by the individual to be examined, electromagnetic signals generated by a microorganism.
  • WO 09417406 It is also known in the prior art (WO 09417406), a method and a device used to transmit the biological activity of a first so-called carrier material to a second so-called target material, free of any traces of said carrier material and physically separated from the latter, the target not initially having said biological activity.
  • the method consists in (i) exposing the material carrying the biological activity of interest to an electric or electromagnetic signal sensor, (ii) amplifying the electromagnetic or electrical signals characteristic of the manifestation of the biological activity emitted then (iii) ) exposing the target material to an emitter of electrical or electromagnetic signals, said emitter being connected to said sensor via a transmission and amplification circuit, for transmitting the signal characteristic of the biological activity to said target.
  • the inventor of the present invention described a method for characterizing biochemical elements exhibiting a biological activity, in this case microorganisms, by analysis of the low frequency electromagnetic signals, said process bringing improvements to the techniques of the prior art.
  • the method also relates to the biological analysis of recording the electromagnetic or electrical "signatures" corresponding to known biochemical elements, and comparing said previously recorded "signatures” to that of a biochemical element to be characterized.
  • the method involves filtration and dilution steps to eliminate microorganisms and cells. present in the initial sample, the highest dilutions generating the most electrical or electromagnetic signals while the least diluted samples do not present, most of the time, no electrical or electromagnetic signals.
  • microorganisms of different types such as bacteria and viruses
  • produce "nanostructures” that persist in aqueous solutions and that it is these “nanostructures” that emit electromagnetic signals.
  • Said “nanostructures” behave as polymers having a size less than 0.02 ⁇ m for viruses, and less than 0.1 ⁇ m for bacteria of conventional size and have a density of between 1.12 and 1.30 g / ml. .
  • This inhibitory power thus relates both to the emitting structures of its own plasma, but also to those of a specific bacterial germ, which would make it possible to use the latter as a universal identification system.
  • the invention can therefore identify a bacterial or viral origin in diseases where these germs have not been identified.
  • a first object of the invention relates to a process for the preparation of reagents intended for a test for the detection of microorganisms and in particular for infection in humans or animals.
  • the method comprises the following steps: a) centrifugation of a biological or artificial liquid medium containing a selected specific microorganism; b) filtration of the supernatant obtained in step (a); c) preparing a series of diluted samples corresponding to increasing dilutions of the filtrate obtained in step (b), up to a dilution of the filtrate by a factor of 10 "at least 15, d) subjecting the diluted samples obtained in step (c) at an excitation field of electrical, magnetic and / or electromagnetic nature; e) the analysis of the electrical signals detected by means of a solenoid and the digital recording of said electrical signal after analogue / digital conversion of said signal, f) the selection of the diluted samples with which characteristic electrical signals are obtained in (e), by characteristic signals means signals whose amplitude is at
  • a test sample for the presence or absence of said selected specific microorganism
  • a human or animal individual suspected of being infected by said selected specific microorganism, or (ii) a biological sample or a biological or artificial liquid suspected of containing said selected specific microorganism, or (iii) a food, cosmetic or pharmaceutical composition capable of containing said selected specific microorganism.
  • biological fluids is meant any liquid coming from the human or the animal, for example the blood, the urine, the various secretions.
  • artificial liquid is meant any reconstituted liquid for the culture of microorganisms, for example the various culture broths for bacteria, yeasts and molds, and culture media of cells infected with a virus.
  • Another subject of the invention concerns a microorganism detection system within a sample.
  • This system comprises: a) a tube T1, which contains a reference sample transmitting characteristic electromagnetic signals, by characteristic signals is meant signals whose amplitude is at least 1.5 times greater than the signals of the background noise emitted by the water and / or have a frequency shift to higher values; b) a T2 tube which contains a sample emitting characteristic electromagnetic signals, said sample being identical to that contained in the tube T1; c) a protective enclosure protecting the T1 and T2 tubes from external electromagnetic fields of very low frequencies; d) a T3 tube that contains a control solution that does not emit electromagnetic signals; e) equipment for receiving electromagnetic signals.
  • the tube Upon detection, the tube will be T2 placed in contact with or in contact with the sample X to be tested for the presence or absence of a selected specific microorganism.
  • Another subject of the invention relates to a method for detecting a microorganism within a sample, characterized in that said method comprises the following steps: a) a sample X for which the presence of a suspected microorganism, for example E coli, must be established, is placed in the presence of a sample as obtained after step (f) of the method according to any one of claims 1 to 3, said sample as obtained after step (f) being a dilution from the filtrate of a culture or a biological medium which contained said microorganism suspected of being present in sample X; b) the comparison of the electromagnetic signal emitted by sample X, in the presence of the sample as obtained after step (f), obtained in step (a), with the electromagnetic signal emitted by an aliquot of same sample as obtained after step (f) not subject to sample X.
  • Sample X means (i) a human or animal individual suspected of being infected with the selected specific microorganism, or (ii) a biological sample or a biological or artificial fluid suspected of containing the selected specific microorganism, or (iii) a food, cosmetic or pharmaceutical composition capable of containing said selected specific microorganism.
  • the methods according to the invention allow (i) the preparation of reagents for a test for the detection of microorganisms involved in chronic diseases and / or intended to detect systemic latent infections under circumstances in which a rapid and non-invasive response is required, as is the case, for example, with regard to the detection of avian influenza viruses, (ii) the identification of an infection in humans or animals.
  • EXAMPLE 1 A BACTERIAL CULTURE LOW DILUTED AND NON-TRANSMITTING "NEGATIVE" ELECTROMAGNETIC SIGNALS ELECTROMAGNETIC SIGNA UX EMITTED BY A HIGH DILUTION FROM THE SAME CULTURE
  • a culture of Escherichia coli bacteria (E. coli) in LB medium (Luria broth) is centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes to remove the cells.
  • the bacterial supernatant is then filtered through a Millipore PEVD filter with a porosity of 0.45 ⁇ m and the filtrate is filtered again on a Millipore filter with a porosity of 0.1 ⁇ m.
  • a series of diluted samples are prepared by diluting the filtrate from 10 to 10 in water for injection to 10-15 . The successive dilutions are shaken vigorously with a vortex, while 15 seconds, between each dilution.
  • the diluted samples are dispensed into 1.5 milliliter Eppendorf conical plastic tubes.
  • the volume of liquid is usually 1 milliliter.
  • Each diluted sample is tested for the emission of basic frequency electromagnetic signals.
  • the method for detecting SEM includes a step for transforming the electromagnetic field from different diluted samples into a signal, including an electrical signal, by means of a solenoid sensing said electromagnetic field.
  • the transformation of the electromagnetic field from the analyzed diluted sample into an electrical signal is performed as follows:
  • the detection of the signals is carried out with equipment shown diagrammatically in FIG. 1.
  • the equipment comprises a solenoid reading cell (1) sensitive from 0 to 20000 hertz, placed on a table made of insulating material.
  • Said solenoid used in step (ii) comprises a coil having a soft iron core. This coil has an impedance of 300 ohms, an inside diameter of 6 mm, an outside diameter of 16 mm, a length of 6 mm.
  • the soft iron magnetic core is placed in contact with the outer walls of the tube comprising the dilution to be analyzed.
  • the diluted samples to be read are distributed in 1.5 milliliter Eppendorf (commercial name) conical plastic tubes (2).
  • the volume of liquid is usually 1 milliliter.
  • the characteristic electrical signal acquisition is performed for a predetermined period, for example between 1 and 60 s. In this example, each sample is read for 6 seconds, twice in succession.
  • the electrical signals delivered by the solenoid are amplified and converted into analog-digital signals by means of a signal acquisition card (sound card) (4) comprising a computer-integrated analog-digital converter (3).
  • Said analog-to-digital converter has a sampling frequency that is twice the maximum frequency that it is desired to be able to digitize, for example 44 kHz.
  • the digital file corresponding to said converted electrical signal is recorded in a mass memory, in the form of a sound file in WAV format, for example.
  • the recorded digital file can optionally be digitally processed, such as digital amplification for signal level calibration, filtering for the elimination of unwanted frequencies, calculation of the spectral power distribution (PSD), and then Spectral power is truncated by keeping only the frequency band ranging for example from 140 Hz to 20 kHz (Matlab), or is transformed into frequency components by Fourier transform (SigView).
  • PSD spectral power distribution
  • a closed tube is placed side by side containing an aliquot of the 10 "3 dilution of
  • This control series consists of a tube containing an aliquot of the sample diluted to 10 "3 E. coli and another containing an aliquot of the sample diluted to 10" 8 E. coli are treated in the same way, but in separate mumetal® enclosures that are distant from each other. The placement in a mumetal® enclosure eliminates the very low frequencies (5 to 100 Hertz) of excitation but not the higher frequencies that could come from ambient electromagnetic noise.
  • the tubes containing the diluted samples are again analyzed as described above, revealing that the tube containing an aliquot of T sample diluted to 10 "8 attached to the tube containing an aliquot of the sample diluted to 10" 3 no longer emits electromagnetic signals, or much weaker.
  • the tubes of the control series remained identical; the tube containing an aliquot of the diluted sample to 10 "8" protected "from contact with the tube containing an aliquot of the sample diluted to 10" 3 remained positive for the emission of electromagnetic signals.
  • An important feature of the invention is that the negativising effect observed is specific, that is to say that the non-emitting lightly diluted sample and the highly diluted electromagnetic signal emitter must come from the same species of microorganism.
  • diluted E. coli emitting samples are "negative” only by a non-emitting diluted E. coli sample and not by a non-emitting low-dilution Streptococcus or Staphylococcal sample.
  • a diluted sample of Staphylococcus emitter is "negative” only by a non-emitting diluted Staphylococcal sample, and not by a non-emitting diluted non-emissive Streptococcus or E. coli sample.
  • EXAMPLE 2 RAPID AND NON-INVASIVE METHOD OF DETECTING INFECTIONS IN HUMANS AND ANIMALS
  • a blood sample, taken by anticoagulant, preferably heparin, from a patient suffering from neurological damage following a bacterial infection and suspension culture in LB (Luria broth) of Escherichia coli Kl (E. coli) are centrifuged to remove the cells.
  • the bacterial supernatant and / or the plasma harvested are then diluted with ICT 2 in RPMI medium.
  • the solutions are filtered through a 0.45 ⁇ Millipore PEVD filter and the filtrate is then filtered again on Whatman 0.02 ⁇ m filter or Millipore 0.1 ⁇ m filter. From the filtrates of the plasma of the infected individual and the culture of E. coli.
  • coli Kl a series of diluted samples corresponding to increasing dilution levels, up to 10 15 , are prepared by carrying out dilutions of 10 to 10 in water for injection in a laminar flow hood. Successive dilutions are shaken vigorously with a vortex for 15 seconds between each dilution. The diluted samples are then dispensed into 1.5 milliliter Eppendorf conical plastic tubes. The volume of liquid is usually 1 milliliter.
  • the selection of diluted samples emitting characteristic signals, signals whose amplitude is at least 1.5 times greater than the signals of the background noise and / or have a higher frequency than the background noise, is carried out identically to what is described above in Example 1, Chapter 2.
  • the method described and the material is identical to that described above.
  • the method comprises a step that is intended to transform the electromagnetic field from different dilutions into a signal, including an electrical signal, by means of a solenoid sensing said electromagnetic field.
  • the transformation of the electromagnetic field from the analyzed dilution into an electrical signal is carried out as follows: (i) submission of the diluted sample under verification to an excitation field of electrical, magnetic and / or electromagnetic nature;
  • the diluted samples selected in the previous step (item (iii), from the plasma filtrate of the infected individual, the E. coli culture filtrate, i.e. the filtered sample dilutions exhibiting a characteristic electrical signal, are distributed in plastic tubes Eppendorf, at a rate of 1 ml per tube and stored at + 4 ° C.
  • the diluted emitting samples of SEM thus distributed in aliquots are protected from external influences by being placed in an enclosure to away from electromagnetic fields
  • the enclosure is surrounded by a magnetic shield made of mumetal isolating the enclosure parasitic fields of very low frequencies from the environment.
  • One of the diluted SEM emitting samples, from the plasma filtrate of the infected individual, the E. coli culture filtrate, coli, is distributed volume by volume in two tubes, one, Tl, remaining in a protective enclosure protecting said diluted samples from interference from external electromagnetic fields, which tube will serve as a reference solution, the other, the T2 tube which will be subsequently submitted to the patient is also placed in a protective enclosure.
  • Said protective enclosure preferably being surrounded by a shield made of mumetal ®
  • FIG. 2 diagrammatically represents the steps to be performed during the search for the inhibitory effect.
  • the search for the inhibitory effect is carried out as follows: a) the Tl tube containing the reference solution remains stored in a chamber (3) surrounded by a magnetic shield made of mumetal ® , the Tl tube is thus located free from the potential alterations of the individual to be examined ( 4) while the T2 tube is subjected to the influence of the infected individual to be examined (4) whose plasma present in the tubes T1 and T2 is derived, said individual holds T2 in his hand (5) for a determined period for example 5 minutes;
  • the tube T2 is placed in an equipment for receiving electromagnetic signals, preferably a solenoid reading cell as previously described in chapter 2 of this example; c) the electrical signals are then amplified, processed, converted to analog-digital signals as previously described in Chapter 2; d) said analog-digital signals are optionally decomposed into harmonics by Fourier transform.
  • the signals corresponding to the tube T1 and those corresponding to the tube T2, as well as the signals corresponding to the tube T3 containing water (background noise) are compared.
  • FIG. 3 represents a three-dimensional histogram (Matlab) of the electrical signals detected by the solenoid in the presence of the T3 tube; (background noise);
  • FIG. 4 represents a three-dimensional histogram of the frequency spectrum detected by the solenoid in the presence of the tube 1;
  • FIG. 5 represents a three-dimensional histogram of the frequency spectrum detected by the solenoid in the presence of the tube 2;
  • FIG. 6 represents a Fourier analysis (SigView) of the same background noise (unfiltered electric power supply harmonics);
  • FIG. 7 represents a Fourier analysis of the signal detected by the solenoid in the presence of the tube 1;
  • FIG. 8 represents a Fourier analysis of the frequency spectrum detected by the solenoid in the presence of the tube 2 manipulated by the individual to be examined.
  • this inhibitory power relates both to the emitting structures of its own plasma, but also to those of E. CoIi, which suggests that the individual is infected with a nanostructure producing agent close to those of E. coli. .

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de réactifs destinés à un test de détection de microorganismes et notamment d'infection chez l'être humain ou l'animal caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) la centrifugation d'un milieu liquide biologique ou artificiel contenant un microorganisme spécifique sélectionné; b) la fïltration du surnageant obtenu à l'étape (a); c) la préparation d'une série d'échantillons dilués correspondant à des dilutions croissantes du filtrat obtenu à l'étape (b), jusqu'à une dilution du filtrat d'un facteur 10-15 au moins; d) la soumission des échantillons dilués obtenus à l'étape (c) à un champ d'excitation de nature électrique, magnétique et/ou électromagnétique; e) l'analyse des signaux électriques détectés au moyen d'un solénoïde et l'enregistrement numérique dudit signal électrique après conversion analogique/numérique dudit signal; f) la sélection des échantillons dilués avec lesquels des signaux électriques caractéristiques sont obtenus en (e), c'est-à-dire des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers de valeurs supérieures; g) l'introduction des échantillons dilués sélectionnés à l'étape (f) dans des enceintes protectrices, lesquelles protègent lesdites dilutions des champs électromagnétiques extérieurs; h) la répartition de l'un desdits échantillons dilués de l'étape (g) volume à volume dans deux tubes, l'un, Tl, restant dans une enceinte protectrice protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs, tube qui servira de solution de référence, l'autre, T2, également placées dans une enceinte protectrice, tube qui sera ultérieurement soumis à la présence ou au contact d'un échantillon suspecté de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné.

Description

PROCÉDÉ DE DÉTECTION DE MICROORGANISME AU SEIN D'UN
ÉCHANTILLON
La présente invention a pour objet la mise en évidence des infections latentes chez l'homme et l'animal, par mise en évidence de l'inhibition, par l'individu à examiner, des signaux électromagnétiques générés par un microorganisme.
Il est connu d'après les travaux du Docteur Jacques BENVENISTE et la demande de Brevet WO 00/17637, d'enregistrer et de numériser, après conversion analogique-numérique à l'aide d'une carte-son d'ordinateur, un signal électrique caractéristique d'une molécule possédant une activité biologique.
Il est également connu dans l'art antérieur (WO 09417406), un procédé et un dispositif utilisé pour transmettre l'activité biologique d'une première matière dite porteuse à une seconde matière dite cible, exempte de toutes traces de ladite matière porteuse et physiquement séparée de cette dernière, la cible ne présentant pas initialement ladite activité biologique. La méthode consiste à (i) exposer la matière porteuse de l'activité biologique d'intérêt à un capteur de signaux électriques ou électromagnétiques, (ii) amplifier les signaux électromagnétiques ou électriques caractéristiques de la manifestation de l'activité biologique émis puis (iii) exposer la matière cible à un émetteur de signaux électriques ou électromagnétiques, ledit l'émetteur étant relié audit capteur par l'intermédiaire d'un circuit de transmission et d'amplification, afin de transmettre le signal caractéristique de l'activité biologique à ladite cible. Dans une précédente demande de brevet français 05/12686 déposée le
14/12/2005, non publiée à ce jour, l'inventeur de la présente invention décrivait un procédé de caractérisation d'éléments biochimiques présentant une activité biologique, dans le cas présent des microorganismes, par analyse des signaux électromagnétiques de basses fréquences, ledit procédé apportant des améliorations aux techniques de l'art antérieur. Ledit procédé concerne également l'analyse biologique consistant à enregistrer les « signatures » électromagnétiques ou électriques correspondant à des éléments biochimiques connus, et à comparer lesdites « signatures » préalablement enregistrées à celle d'un élément biochimique à caractériser. Ledit procédé implique des étapes de filtration et dilution afin d'éliminer les microorganismes et les cellules présents au sein de l'échantillon de départ, les dilutions les plus élevées générant le plus de signaux électriques ou électromagnétiques alors que les échantillons les moins dilués ne présentent, la plupart du temps, pas de signaux électriques ou électromagnétiques. L'inventeur a également montré que des microorganismes de nature différente, tels que des bactéries et des virus, produisent des « nanostructures » qui persistent dans les solutions aqueuses, et que ce sont ces « nanostructures » qui émettent les signaux électromagnétiques. Lesdites « nanostructures » se comportent comme des polymères ayant une taille inférieure à 0,02μm pour les virus, et inférieur à 0,1 μm pour les bactéries de taille classique et présentent une densité située entre 1,12 et 1,30 g/ml.
Le procédé décrit dans la présente demande est basé sur l'observation étonnante qu'en absence de contact physique, le simple voisinage d'un tube fermé contenant un échantillon d'un filtrat bactérien ou viral faiblement dilué et négatif en ce qui concerne l'émission de signaux électriques ou électromagnétiques inhibe les signaux produits par un échantillon plus fortement dilué du même filtrat initialement positif en ce qui concerne l'émission de signaux électriques ou électromagnétiques. Dans la présente demande, cette inhibition sera nommée indistinctement « effet inhibiteur » ou bien « effet négativant ». De la même manière, dans la présente demande, « inhiber » et « négativer » seront utilisés indistinctement et ont une signification similaire. Cette observation a conduit l'inventeur à rechercher le même phénomène inhibiteur à partir de l'être humain infecté. Il a été observé chez un patient souffrant d'une microvascularite auto-immunitaire d'origine infectieuse que les échantillons dilués de son plasma avaient un effet inhibiteur sur des filtrats dilués d'E. coli émetteurs de signaux électromagnétiques (ci-après SEM), suggérant que le patient souffrait d'une infection chronique par ce germe ou un germe apparenté. Il s'est également avéré que le patient souffrant de microvascularite, cité dans l'exemple précédent, inhibe lui-même les SEM émises dans son plasma filtré et dilué, et inhibe également les SEM émises par un échantillon de culture d'E. coli filtré et dilué présent dans un tube fermé. Dans ce cas, un contact de 5 minutes d'une dilution positive dans la main du patient, ou bien de 10 minutes jusqu'à une distance de 50 cm sont suffisants pour observer l'effet inhibiteur.
Ce pouvoir inhibiteur porte donc à la fois sur les structures émettrices de son propre plasma, mais aussi sur celles d'un germe bactérien spécifique, ce qui permettrait d'utiliser ce dernier comme système d'identification universelle. L'invention peut donc permettre de cerner une origine bactérienne ou virale dans les maladies où ces germes n'ont pas été identifiés.
Un premier objet de l'invention concerne un procédé de préparation de réactifs destinés à un test de détection de microorganismes et notamment d'infection chez l'être humain ou l'animal. Selon son acception la plus générale, le procédé comporte les étapes suivantes : a) la centrifugation d'un milieu liquide biologique ou artificiel contenant un microorganisme spécifique sélectionné; b) la fïltration du surnageant obtenu à l'étape (a) ; c) la préparation d'une série d'échantillons dilués correspondant à des dilutions croissantes du filtrat obtenu à l'étape (b), jusqu'à une dilution du filtrat d'un facteur 10" 15 au moins ; d) la soumission des échantillons dilués obtenus à l'étape (c) à un champ d'excitation de nature électrique, magnétique et/ou électromagnétique ; e) l'analyse des signaux électriques détectés au moyen d'un solénoïde et l'enregistrement numérique dudit signal électrique après conversion analogique/numérique dudit signal ; f) la sélection des échantillons dilués avec lesquels des signaux électriques caractéristiques sont obtenus en (e), par signaux caractéristiques on entend des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers des valeurs supérieures ; g) l'introduction des échantillons dilués sélectionnés à l'étape (f) dans des enceintes protectrices, lesquelles protègent lesdites dilutions des champs électromagnétiques extérieurs de très basses fréquences; h) la répartition de l'un desdits échantillons dilués de l'étape (g) volume à volume dans deux tubes, l'un, Tl, restant dans une enceinte protectrice protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs, tube qui servira de solution de référence, l'autre, T2, également placées dans une enceinte protectrice, tube qui sera ultérieurement soumis à la présence ou au contact d'un échantillon suspecté de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné.
Par « un échantillon à tester, pour la présence ou l'absence dudit microorganisme spécifique sélectionné » on entend (i) un individu humain ou animal suspecter d'être infecté par ledit microorganisme spécifique sélectionné, ou (ii) un prélèvement biologique ou bien un liquide biologique ou artificiel suspecter de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné, ou (iii) une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique susceptible de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné. Par liquides biologiques, on entend tout liquide provenant de l'homme ou de l'animal, par exemple le sang, l'urine, les diverses sécrétions. Par liquide artificiel, on entend tout liquide reconstitué permettant la culture de microorganismes, par exemple les divers bouillons de culture pour bactéries, levures et moisissures, et les milieux de cultures de cellules infectées par un virus.
Un autre objet de l'invention concerne un système de détection de microorganisme au sein d'un échantillon. Ce système comprend : a) un tube Tl qui contient un échantillon de référence émetteur de signaux électromagnétiques caractéristiques, par signaux caractéristiques on entend des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers des valeurs supérieures ; b) un tube T2 qui contient un échantillon émetteur de signaux électromagnétiques caractéristiques, ledit échantillon étant identique à celui contenu dans le tube Tl ; c) une enceinte protectrice protégeant les tubes Tl et T2 des champs électromagnétiques extérieurs de très basses fréquences; d) un tube T3 qui contient une solution témoin ne présentant pas d'émission de signaux électromagnétiques ; e) un équipement de réception des signaux électromagnétiques.
Lors de la détection, le tube sera T2 mis en présence ou en contact avec l'échantillon X à tester pour la présence ou l'absence d'un microorganisme spécifique sélectionné.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection de microorganisme au sein d'un échantillon, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) un échantillon X pour lequel la présence d'un microorganisme suspecté, par exemple E. coli, doit être établi, est mis en présence d'un échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) étant une dilution issue du filtrat d'une culture ou d'un milieu biologique qui contenait ledit microorganisme suspecté d'être présent dans l'échantillon X ; b) la comparaison du signal électromagnétique émis par l'échantillon X mis en présence de l'échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f), obtenu à l'étape (a), avec le signal électromagnétique émis pas un aliquote du même échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) non soumis à l'échantillon X.
Par « un échantillon X», on entend (i) un individu humain ou animal suspecter d'être infecté par ledit microorganisme spécifique sélectionné, ou (ii) un prélèvement biologique ou bien un liquide biologique ou artificiel suspecter de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné, ou (iii) une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique susceptible de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné.
Les procédés selon l'invention permettent (i) la préparation de réactifs destinés à un test de détection de microorganismes impliqués dans des maladies chroniques et/ou destinés à détecter des infections latentes systémiques dans des circonstances où une réponse rapide et non invasive est nécessaire, comme c'est le cas par exemple en ce qui concerne la détection de virus de la grippe aviaire, (ii) l'identification d'une infection chez l'homme ou l'animal.
Une fois le microorganisme responsable identifié, il est alors possible de confirmer la présence de ce germe en réalisant des PCR ultrasensibles à l'aide d'amorces oligonucléotidiques spécifiques de ce microorganisme.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, exposant de façon non limitative des exemples de mise en œuvre de procédés selon l'invention.
Les figures annexées correspondent à des exemples non limitatifs de réalisation.
EXEMPLE 1 : UNE CULTURE BACTÉRIENNE FAIBLEMENT DILUÉE ET NON-ÉMETTRICE DE SIGNAUX ÉLECTROMAGNÉTIQUES « NÉGATIVE » LES SIGNA UX ÉLECTROMAGNÉTIQUES ÉMIS PAR UNE FORTE DILUTION ISSUE DE LA MÊME CULTURE
1) Préparation d'échantillons
Une culture de bactéries Escherichia coli (E. coli) en milieu LB (Luria broth) est centrifugée à 8000 rpm pendant 15 minutes afin d'éliminer les cellules. Le surnageant bactérien est alors filtré sur filtre Millipore PEVD de porosité 0,45 μm puis le filtrat est filtré à nouveau sur filtre Millipore de porosité 0,1 μm. À partir du filtrat de la culture d'E. coli résultant, qui est totalement stérile, on prépare une série d'échantillons dilués en diluant le filtrat de 10 en 10 dans de l'eau pour préparation injectable jusqu'à 10"15. Les dilutions successives sont agitées fortement avec un vortex, pendant 15 secondes, entre chaque dilution.
Les échantillons dilués sont distribués dans des tubes en plastique coniques Eppendorf de 1,5 millilitre. Le volume de liquide est en général de 1 millilitre.
2) Sélection des échantillons dilués générant des signaux électromagnétiques.
Chaque échantillon dilué est testé pour l'émission de signaux électromagnétiques de base fréquence.
Le procédé pour détecter les SEM comporte une étape qui a pour objet de transformer le champ électromagnétique provenant de différents échantillons dilués, en un signal, notamment un signal électrique, au moyen d'un solénoïde captant ledit champ électromagnétique. La transformation du champ électromagnétique provenant de l'échantillon dilué analysé en un signal électrique est effectuée comme suit :
(i) Soumission de l'échantillon dilué en cours de vérification à un champ d'excitation de nature électrique, magnétique et/ou électromagnétique ;
(ii) Analyse des signaux électriques détectés au moyen d'un solénoïde et enregistrement numérique dudit signal électrique après conversion analogique/numérique dudit signal ;
(iii) Sélection des échantillons dilués générant des signaux électriques caractéristiques, on entend par caractéristiques des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers de valeurs supérieures, sont placées dans des enceintes protectrices en mumétal® protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs.
La détection des signaux est réalisée avec un équipement représenté schématiquement dans la figure 1. L'équipement comprend une cellule solénoïde de lecture (1) sensible de 0 à 20000 hertz, placée sur une table en matière isolante. Ledit solénoïde utilisé lors de l'étape (ii) comporte une bobine ayant un noyau en fer doux. Cette bobine a une impédance de 300 ohms, un diamètre intérieur de 6 mm, un diamètre extérieur de 16 mm, une longueur de 6 mm. Le noyau magnétique en fer doux est placé au contact des parois extérieures du tube comportant la dilution à analyser.
Les échantillons dilués à lire sont distribués dans des tubes en plastique (2) coniques Eppendorf (nom commercial) de 1,5 millilitre. Le volume de liquide est en général de 1 millilitre. L'acquisition de signal électrique caractéristique est réalisée pendant une durée déterminée, par exemple comprise entre 1 et 60 s. Dans le présent exemple, chaque échantillon est lu pendant 6 secondes, deux fois de suite.
Les signaux électriques délivrés par le solénoïde sont amplifiés et convertis en signaux analogiques-numériques grâce à une carte d'acquisition de signal (carte son) (4) comportant un convertisseur analogique-numérique intégré à un ordinateur (3). Ledit convertisseur analogique-numérique a une fréquence d'échantillonnage double de la fréquence maximale que l'on veut pouvoir numériser, par exemple 44 kHz.
Le fichier numérique correspondant audit signal électrique converti est enregistré dans une mémoire de masse, sous la forme d'un fichier son au format WAV par exemple.
Pour le traitement du signal électrique caractéristique, on utilise à titre d'exemple deux logiciels Matlab et SigView (noms commerciaux). Le fichier numérique enregistré peut éventuellement subir un traitement numérique, comme par exemple une amplification numérique pour calibrage du niveau de signal, un filtrage pour l'élimination de fréquences non désirées, un calcul de la répartition de la puissance spectrale (PSD), puis cette puissance spectrale est tronquée en ne conservant que la bande des fréquences allant par exemple de 140 Hz à 20 kHz (Matlab), ou est transformée en composantes de fréquence par transformation de Fourier (SigView). δ
3) Évaluation de l'activité inhibitrice d'une faible dilution non-émettrice sur l'émission de signaux électromagnétiques générée par une dilution active.
Les échantillons dilués présentant des signaux électriques caractéristiques sont les échantillons dilués à 10"8, 10"9, 10'10. Les dilutions 10"2 à 10"6 sont négatives (Fig.2).
On place côte à côte un tube fermé contenant un aliquote de la dilution 10"3 de
E. coli et un tube fermé contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"8 de E. coli dans une enceinte entourée d'un blindage magnétique en mumétal® et laissés 24 heures à la température ordinaire. En parallèle, une série témoin est réalisée. Cette série témoin est constituée d'un tube contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"3 de E. coli et d'un autre contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"8 de E. coli qui sont traités de la même façon, mais dans des enceintes de mumétal® distinctes et éloignées l'une de l'autre. Le placement dans une enceinte de mumétal® élimine les très basses fréquences (5 à 100 Hertz) d'excitation mais pas des fréquences supérieures qui pourraient provenir d'un bruit électromagnétique ambiant.
Après 24 heures, les tubes contenant les échantillons dilués à sont à nouveau analysés comme décrit ci-dessus, révélant que le tube contenant un aliquote de T échantillon dilué à 10"8 accolé au tube contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"3 n'émet plus de signaux électromagnétiques, ou beaucoup plus faiblement. En revanche, les tubes de la série témoin sont restés identiques ; le tube contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"8 « protégé » du contact avec le tube contenant un aliquote de l'échantillon dilué à 10"3 est resté positif pour l'émission de signaux électromagnétiques.
Une particularité importante de l'invention est que l'effet négativant observé est spécifique, c'est-à-dire que l'échantillon faiblement dilué non-émetteur et l'échantillon fortement dilué émetteur de signaux électromagnétiques doivent provenir de la même espèce de microorganisme.
Ainsi, les échantillons dilués de E.coli émetteurs ne sont « négatives » que par un échantillon de E. coli faiblement dilué non-émetteur et non par un échantillon de Streptocoque ou de Staphylocoque faiblement dilué non-émetteur. De la même façon, un échantillon dilué de Staphylocoque émetteur n'est « négative » que par un échantillon de Staphylocoque faiblement dilué non-émetteur et non par un échantillon de Streptocoque ou de E.coli faiblement dilué non-émetteur. EXEMPLE 2 : PROCEDE RAPIDE ET NON INVASIF DE DETECTION D 'INFECTIONS CHEZ L 'HOMME ETL 'ANIMAL
1) Préparations d'échantillons de liquides biologiques et artificiels contenant des microorganismes.
Un échantillon de sang, prélevé sous anticoagulant, de préférence l'héparine, d'un patient souffrant d'une atteinte neurologique consécutive à une infection bactérienne et une culture en suspension en milieu LB (Luria broth) de bactéries Escherichia coli Kl (E. coli) sont centrifugés afin d'éliminer les cellules. Le surnageant bactérien et /ou le plasma récoltés sont alors dilués à ICT2 en milieu RPMI. Les solutions sont filtrées sur filtre Millipore PEVD 0,45 μ puis le filtrat est filtré à nouveau sur filtre Whatman 0,02μm ou Millipore 0,1 μm. À partir des filtrats du plasma de l'individu infecté et de la culture d'E. coli Kl, on prépare une série échantillons dilués correspondant à des niveaux croissants de dilution, jusqu'à 10'15, en effectuant des dilutions de 10 en 10 dans de l'eau pour préparation injectable sous hotte à flux laminaire. Les dilutions successives sont agitées fortement avec un vortex, pendant 15 secondes, entre chaque dilution. Les échantillons dilués sont ensuite distribués dans des tubes en plastique coniques Eppendorf de 1,5 millilitre. Le volume de liquide est en général de 1 millilitre.
2) Sélection des échantillons dilués générant des signaux électromagnétiques.
La sélection des échantillons dilués émettant des signaux caractéristiques, signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond et/ou sont de fréquence supérieure au bruit de fond, est réalisée de façon identique à ce qui est décrit ci-dessus dans l'exemple 1, chapitre 2. La méthode décrite ainsi que le matériel est identique à ce qui est décrit ci-dessus. Ainsi, la méthode comporte une étape qui a pour objet de transformer le champ électromagnétique provenant de différentes dilutions, en un signal, notamment un signal électrique, au moyen d'un solénoïde captant ledit champ électromagnétique.
La transformation du champ électromagnétique provenant de la dilution analysée en un signal électrique est effectuée comme suit : (i) Soumission de l'échantillon dilué en cours de vérification à un champ d'excitation de nature électrique, magnétique et/ou électromagnétique ;
(ii) Analyse des signaux électriques détectés au moyen d'un solénoïde et enregistrement numérique dudit signal électrique après conversion analogique/numérique dudit signal ;
(iii) Sélection des échantillons dilués présentant des signaux électriques caractéristiques, on entend par caractéristiques des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers de valeurs supérieures, sont placées dans des enceintes protectrices protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs.
3) Évaluation de l'activité inhibitrice d'un individu infecté sur l'émission de signaux électromagnétiques générée par un microorganisme. Les échantillons dilués sélectionnés à l'étape précédente (point (iii), provenant du filtrat de plasma de l'individu infecté, du filtrat de culture d'E. coli, c'est-à-dire les dilutions d'échantillon filtré présentant un signal électrique caractéristique, sont réparties dans des tubes plastiques Eppendorf, à raison de 1 ml par tube et conservés à +4°C. Les échantillons dilués émetteurs de SEM ainsi répartis en aliquotes sont protégés des influences externes en étant placés dans une enceinte à l'abri des champs électromagnétiques. De préférence, l'enceinte est entourée d'un blindage magnétique réalisé en mumétal isolant l'enceinte des champs parasites de très basses fréquences provenant de l'environnement.
L'un des échantillons dilués émetteurs de SEM, provenant du filtrat de plasma de l'individu infecté, du filtrat de culture d'E. coli, est réparti volume à volume dans deux tubes, l'un, Tl, restant dans une enceinte protectrice protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs, tube qui servira de solution de référence, l'autre, le tube T2 qui sera ultérieurement soumis au patient est également placées dans une enceinte protectrice. Ladite enceinte protectrice étant de préférence entourée d'un blindage réalisé en mumétal®
La figure 2 représente schématiquement les étapes à réaliser lors de la recherche de l'effet inhibiteur. La recherche de l'effet inhibiteur est réalisée comme suit : a) le tube Tl contenant la solution de référence reste conservée dans une enceinte (3) entourée d'un blindage magnétique réalisé en mumétal® , le tube Tl se trouve ainsi situé à l'abri des altérations potentielles de l'individu à examiner (4) alors que le tube T2 est soumis à l'influence de l'individu infecté à examiner (4) dont le plasma présent dans les tubes Tl et T2 est issu, ledit individu tient T2 dans sa main (5) pendant une période déterminée, par exemple 5 minutes ;
b) le tube T2 est placé dans un équipement de réception des signaux électromagnétiques, de préférence une cellule solénoïde de lecture comme décrit précédemment dans le chapitre 2 du présent exemple ; c) les signaux électriques sont ensuite amplifiés, traités, convertis en signaux analogiques-numériques comme décrit précédemment dans le chapitre 2 ; d) lesdits signaux analogiques-numériques sont éventuellement décomposés en harmoniques par transformée de Fourrier. Les signaux correspondant au tube Tl et ceux correspondant au tube T2, ainsi que les signaux correspondant au tube T3 contenant de l'eau (bruits de fond) sont comparés.
Les figures qui suivent représentent les résultats obtenus dans le cas où la dilution active provient du plasma de l'individu infecté examiné : - la figure 3 représente un histogramme en trois dimensions ( Matlab) des signaux électriques détectés par le solénoïde en présence du tube T3, (bruits de fond) ;
- la figure 4 représente un histogramme en trois dimensions du spectre de fréquences détecté par le solénoïde en présence du tube 1 ;
- la figure 5 représente un histogramme en trois dimensions du spectre de fréquences détecté par le solénoïde en présence du tube 2 ;
- la figure 6 représente une analyse de Fourier (SigView) du même bruit de fond (les harmoniques du courant électrique d'alimentation non filtrées) ;
- la figure 7 représente une analyse de Fourier du signal détecté par le solénoïde en présence du tube 1 ; - la figure 8 représente une analyse de Fourier du spectre de fréquences détecté par le solénoïde en présence du tube 2 manipulé par l'individu à examiner.
L'analyse par histogramme en 3 dimensions, respectivement du bruit de fond (Fig.3) et du signal obtenu en présence du tube Tl contenant la solution de référence émettrice de SEM (Fig.4), montre un déplacement vers les plus hautes fréquences. En revanche, lorsque l'on analyse le tube T2 contenant la solution soumise à l'influence de l'individu à examiner (Fig.5), on ne constate pas de déplacement vers les plus hautes fréquences ; l'histogramme 3D représentant les signaux du tube T2 est analogue à celui obtenu pour le bruit de fond.
L'analyse de Fourier des fréquences positives générées par le tube 1 (Fig7) a révélé des pics à différentes fréquences. Par ordre d'intensité décroissante du signal, les fréquences suivantes présentent des signaux : 1000, 2000, 3000, 4100, 5100 et 5500. En revanche, l'analyse de Fourier du tube T2 révèle des résultats analogues à ceux obtenus par l'analyse du bruit de fond : aucun pic significatif n'a été observé, ni pour le bruit de fond, ni pour le tube T2.
En conclusion, ces analyses permettent de déduire que l'individu examiné a une capacité d'inhibition des signaux électromagnétiques émis par une dilution de son propre plasma. Des résultats analogues ont été obtenus avec la solution de référence, dérivée de
E. coli Kl.
Par conséquent, ce pouvoir inhibiteur porte à la fois sur les structures émettrices de son propre plasma, mais aussi sur celles de E. CoIi, ce qui suggère que l'individu est infecté par un agent producteur de nanostructures proches de celles de E.coli.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de préparation de réactifs destinés à un test de détection de microorganismes et notamment d'infection chez l'être humain ou ranimai caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : a) la centrifugation d'un milieu liquide biologique ou artificiel contenant un microorganisme spécifique sélectionné; b) la filtration du surnageant obtenu à l'étape (a) ; c) la préparation d'une série d'échantillons dilués correspondant à des dilutions croissantes du filtrat obtenu à l'étape (b), jusqu'à une dilution du filtrat d'un facteur 10"
15 au moins ; d) la soumission des échantillons dilués obtenus à l'étape (c) à un champ d'excitation de nature électrique, magnétique et/ou électromagnétique ; e) l'analyse des signaux électriques détectés au moyen d'un solénoïde et l'enregistrement numérique dudit signal électrique après conversion analogique/numérique dudit signal ; f) la sélection des échantillons dilués avec lesquels des signaux électriques caractéristiques sont obtenus en (e), c'est-à-dire des signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers de valeurs supérieures ; g) l'introduction des échantillons dilués sélectionnés à l'étape (f) dans des enceintes protectrices, lesquelles protègent lesdites dilutions des champs électromagnétiques extérieurs ; h) la répartition de l'un desdits échantillons dilués de l'étape (g) volume à volume dans deux tubes, l'un, Tl, restant dans une enceinte protectrice protégeant lesdits échantillons dilués des interférences des champs électromagnétiques extérieurs, tube qui servira de solution de référence, l'autre, T2, également placées dans une enceinte protectrice, tube qui sera ultérieurement soumis à la présence ou au contact d'un échantillon suspecté de contenir ledit microorganisme spécifique sélectionné.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide biologique est un liquide provenant de l'homme ou de l'animal. 3) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide artificiel est un milieu de culture de microorganismes.
4) Procédé de détection de microorganisme au sein d'un échantillon, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) un échantillon X pour lequel la présence d'un microorganisme est suspecté, par exemple E. coli, est mis en présence d'un échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, ledit échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) étant une dilution issue du filtrat d'une culture ou d'un milieu biologique qui contenait ledit microorganisme suspecté d'être présent dans l'échantillon X ; b) la comparaison du signal électromagnétique émis par l'échantillon X mis en présence de l'échantillon tel que définit à l'étape (f), obtenu à l'étape (a), avec le signal électromagnétique émis pas un aliquote du même échantillon tel qu'obtenu après l'étape (f) non soumis à l'échantillon X.
5) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit échantillon X est un individu humain ou animal.
6) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit échantillon X est un prélèvement biologique.
7) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit échantillon X est une composition alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique.
8) Système de détection de microorganisme au sein d'un échantillon: a) un tube Tl préparé selon le procédé de l'une des revendications 1 à 3 qui contient un échantillon de référence émetteur de signaux électromagnétiques caractéristiques, signaux dont l'amplitude est au moins 1,5 fois supérieure aux signaux du bruit de fond émis par l'eau et/ou qui présentent un déplacement de fréquence vers de valeurs supérieures ; b) un tube T2 préparé selon le procédé de l'une des revendications 1 à 3 qui contient un échantillon émetteur de signaux électromagnétiques caractéristiques, ledit échantillon étant identique à celui contenu dans le tube Tl ; c) une enceinte protectrice protégeant les tubes Tl et T2 des champs électromagnétiques extérieurs ; d) un tube T3 qui contient une solution témoin ne présentant pas d'émission de signaux électromagnétiques ; e) un équipement de réception des signaux électromagnétiques.
9) Système selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'équipement de réception des signaux électromagnétiques (e) comprend :
• une cellule solénoïde de lecture ; « un ordinateur muni d'une carte d'acquisition de signal (carte son), ledit ordinateur comprenant au moins un logiciel de traitement des signaux.
10) Système selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cellule solénoïde de lecture est sensible de 0 à 20000 hertz, elle comporte une bobine ayant un noyau en fer doux, ladite bobine a une impédance de 300 ohms, un diamètre intérieur de 6 mm, un diamètre extérieur de 16 mm, une longueur de 6 mm.
11) Système selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la solution témoin négatif T3 est la solution ayant été utilisée pour réaliser les dilutions des échantillons aboutissant aux réactifs Tl et T2.
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