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WO2007142202A1 - ヌクレオチド鎖修飾方法 - Google Patents

ヌクレオチド鎖修飾方法 Download PDF

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Publication number
WO2007142202A1
WO2007142202A1 PCT/JP2007/061309 JP2007061309W WO2007142202A1 WO 2007142202 A1 WO2007142202 A1 WO 2007142202A1 JP 2007061309 W JP2007061309 W JP 2007061309W WO 2007142202 A1 WO2007142202 A1 WO 2007142202A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleotide
nucleotide chain
modifying
substance
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/061309
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeki Joko
Original Assignee
Panasonic Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Corporation filed Critical Panasonic Corporation
Priority to CN200780020081XA priority Critical patent/CN101460619B/zh
Priority to US12/303,313 priority patent/US8129115B2/en
Priority to JP2008520567A priority patent/JP4823310B2/ja
Priority to EP07744668.0A priority patent/EP2028272B1/en
Publication of WO2007142202A1 publication Critical patent/WO2007142202A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to a method for modifying a nucleotide chain, and more particularly to a method for labeling, labeling, and immobilizing a nucleotide chain by directly modifying the terminal end of the nucleotide chain with a modifying substance.
  • radioactive isotopes have been adopted as modifiers for labeling and labeling nucleotide chains such as DNA, RNA, oligonucleotides, and nucleic acids. Due to the limitation of the handling period due to the half-life, the restriction of the place of handling, the problem of exposure, the problem of disposal, etc., its use is decreasing. In recent years, fluorescent substances such as fluorescein or piotin have come to be widely used as modifiers to replace radioisotopes.
  • alkaline phosphatase has the property of inducing dephosphorylation of the ⁇ -terminal of the nucleotide chain, it is often used as a modified substance. Nucleotide chain forces will be dissociated, and alkaline phosphatase cannot be used for nucleotide chains modified at the 5 'end.
  • a nucleotide chain modified with a modifying substance is obtained by incorporating a nucleotide modified in advance using a nucleotide chain replication reaction or transcription reaction.
  • a method has also been proposed.
  • labeling with a radioisotope by conventional force, nick translation method, random primer method, primer extension method, etc., which are adopted in labeling, are exemplified.
  • Deoxyribonucleotides that have been modified with a modifying substance in advance ⁇ Triphosphate is incorporated using the replication reaction of DNA polymerase, and in the transcription reaction, ribonucleotides that have been modified with a modifying substance in advance Triphosphate is incorporated using the transcription reaction of RNA polymerase (for example, Patent Documents 5 to 8 and Non-Patent Documents 6 and 8 to 9).
  • These modification methods are suitable for gene analysis because they have the advantages of easy operation, high modification amount of the nucleotide chain, stability of the modification substance, and that the modification substance is not dissociated by alkaline phosphatase. It is widely used as a method.
  • modification methods can be used in combination with the polymerase chain reaction, so-called PCR method or RNA amplification reaction, to simultaneously realize a gene amplification reaction, labeling, and labeling reaction (for example, Non-Patent Documents 10 to 12). ), And comprehensive analysis of genes generically called DNA microarrays (for example, Patent Documents 9 to 10 and Non-Patent Documents 13 to 15).
  • the modification method by replication reaction or transcription reaction described above is a method of incorporating a nucleotide that has been modified with a modifying substance in advance, that is, a pseudo nucleotide, so that the incorporation efficiency is lower than that of the original nucleotide.
  • a modifying substance for example, Patent Document 8 and Non-Patent Document 16
  • the amount of modified substance incorporation is random at 12-25 molecules per nucleotide chain molecule.
  • Yes for example, Non-Patent Document 17
  • a nucleotide chain that is in the form of a saddle is required as in the modification method using the above-described replication reaction or transcription reaction.
  • There is also a method of modifying For example, at the end of the nucleotide chain, there is a deoxyribonucleotide ⁇ triphosphate that has been previously modified with a modifier using terminal deoxynucleotidyl transferase, or a dideoxyribonucleotide ⁇ triphosphate.
  • an acid tailing method for example, non-patent documents 19 to 21
  • RNA ligase for example, RNA ligase.
  • tailing bisphosphate for example, Patent Document 11 and Non-Patent Document 22.
  • the method of tailing dideoxyribonucleotide 5'-triphosphate or the method of tailing ribonucleotide-3 5'-bisphosphate is a modifier for one molecule of the nucleotide chain.
  • the method of tailing deoxyribonucleotide ⁇ triphosphate that has been modified in advance with a modifying substance can be modified with a multimolecular modifying substance for one molecule of the nucleotide chain.
  • nucleotides modified with a modifying substance in advance are not easily synthesized by anyone, and as a result, the types of modifying substances are limited.
  • the modification of the nucleotide chain is performed not only for labeling and labeling but also for immobilizing the nucleotide chain on the substrate.
  • hydrophobic substrates have been used as fixed substrates.
  • substrates such as nitrocellulose, nylon, and polyvinylidene fluoride that have been processed to have a positive charge are used, and the hydrophobic bond between the nucleotide chain and the substrate, and the phosphate group of the nucleotide chain (negative The nucleotide chain was immobilized on the substrate by electrostatic coupling between the substrate and the positively charged substrate.
  • the nucleotide chain can be immobilized more stably and firmly than the conventional hydrophobic bond and electrostatic bond.
  • the functional group and the linking group amino group-carboxyl group, amino group-isothiocyanate group, amino group-aldehyde group, amino group-succinimide group, amino group-epoxy group, etc. are used.
  • the ⁇ -terminus of the nucleotide chain is modified with a modifying substance having a functional group, it is via a phosphate group, and the nucleotide chain is dissociated by the above problem, that is, phosphatase. Therefore, there arises a problem that detection by a luminescent reaction is difficult. Even when the ⁇ -terminus of the nucleotide chain is modified with a modifying substance having a functional group, the length of the nucleotide chain is limited in order to obtain the above-mentioned problem, that is, chemical synthesis and sufficient yield. The problem occurs.
  • a tailing method in which a nucleotide previously modified with a modifying substance is added forms an unnecessary nucleotide sequence.
  • Patent Document 10 can directly modify the nucleotide side of the nucleotide chain, which is related to the length of the nucleotide chain, with an arbitrary modifying substance.
  • an addition reaction, a decomposition reaction, and a modification reaction are possible. In each case, it was necessary to recover the sample by changing the reaction conditions and ethanol precipitation, and it took more than 10 hours to complete the modification reaction.
  • the present invention solves the above problems, and aims to minimize the change in reaction conditions and shorten the time required for directly modifying the ⁇ -terminus of a nucleotide chain with a modifying substance. To do.
  • the nucleotide modification method of the present invention includes a nucleotide chain to be modified and a nucleotide having a specific base different from the base constituting the nucleotide chain in a buffer.
  • an enzyme that catalyzes the addition of the nucleotide to the ⁇ -terminus of the nucleotide chain a degradation enzyme that specifically acts on the nucleotide, and a desired modifying substance that modifies the nucleotide chain coexist.
  • the nucleotide is added to the ⁇ terminus of the nucleotide chain, and the sequence of the added nucleotide is decomposed to form a functional group having binding ability to the modifying substance at the ⁇ terminus of the nucleotide chain.
  • the end of the nucleotide chain on which the functional group is formed is directly modified with the modifying substance.
  • a series of reactions are performed without separating the reaction products in the mixed solution in the middle, and the nucleotide chain is directly modified with a modifying substance. This simplifies the operation and shortens the time. Convenient because it is not related to chain length.
  • the nucleotide chain to be modified, the nucleotide, the modifying substance, and both enzymes may be mixed first to cause an addition reaction, a decomposition reaction, and a modification reaction in parallel;
  • the addition chain and nucleotide and both enzymes may be mixed to cause an addition reaction and a decomposition reaction in parallel, and a modifying substance may be added to the mixed solution after the decomposition reaction to cause a modification reaction.
  • an activator that activates an enzyme that catalyzes an addition reaction an activator that does not inhibit the modification reaction of the modifying substance is added. This is because it is desirable that the reaction mixture does not contain a reaction inhibitor in the three-stage reaction and has a composition.
  • the reaction mixture is characterized by containing a buffer component that moderates the reaction activity of the enzyme that catalyzes the addition reaction. This is to prevent excessive addition of a nucleotide having a specific base at the terminus of the nucleotide chain and facilitate the subsequent degradation reaction that degrades the sequence of the added nucleotide.
  • a divalent metal cation other than cobalt ion can be used as an activity factor.
  • a divalent metal cation other than cobalt ion can be used as an activity factor.
  • the cobalt ion even when the modifying substance has the above-mentioned group, it is also capable of preventing precipitation.
  • Manganese ions or magnesium ions can be preferably used.
  • the enzyme catalyzing the addition reaction is terminal deoxynucleotidyl transferase
  • 4- (2-hydroxyethyl) piperazine 1-ethane sulfonic acid, 2-morpholino ethane sulfone is used as a buffer component.
  • An acid or 3,3-dimethyldaltaric acid can be preferably used.
  • the specific base of the nucleotide to be added is not a base included in the original (natural) nucleotide chain, that is, adenine, guanine, cytosine and thymine, and these bases are alkylated. It may be a mutated base which has been deaminated, halogenated, hydroxylated or acidified. In the case of a nucleotide having such a specific base, the nucleotide chain itself to be modified itself can maintain the initial state when a specific degrading enzyme acts on it.
  • a DNA glycosylase or a DNA repair enzyme can be used as a degrading enzyme.
  • a DNA glycosylase or a DNA repair enzyme can be used as a result, in the sequence of the added nucleotide, elimination of the base, ring opening of the doxyribose and dissociation of the tertiary phosphate group occur, and an aldehyde group is formed at the ⁇ terminal of the nucleotide chain.
  • the nucleotide to be added is 2'-deoxyuridine ⁇ monophosphate.
  • uracil DNA glycosylase can be preferably used as a degrading enzyme.
  • the modifying substance may be a substance having -NH.
  • NH present in the modifier is
  • the modifying substance is a substance that labels and labels the nucleotide chain.
  • a decorating substance may be a fluorescent substance, a vitamin, a lipid, an amino acid, an oligopeptide, a protein, or an exogenous substance! /.
  • the modifying substance may be an intervening substance for binding the nucleotide chain to the substrate.
  • the potent modifier may be a compound having an amino group and a thiol group. Further, it may be a compound having an amino group and an alkoxysilyl group that forms a silanol group by hydrolysis.
  • the nucleotide chain having an arbitrary base sequence, the nucleotide having a specific base, and the end of the nucleotide chain are described above.
  • An enzyme that catalyzes the addition reaction of nucleotides a degrading enzyme that acts on the nucleotide, such as a DNA glycosylase or a DNA repair enzyme, and a nucleotide added by the enzyme is decomposed by the decomposing enzyme, whereby the end of the nucleotide chain A modifying substance having a binding ability to the aldehyde group formed at the end can be mixed.
  • uracil A modified product containing HN in the reaction mixture after mixing with DNA glycosylase and heat-treating or alkali-treating the reaction mixture is added.
  • the nucleotide chain can be modified with a desired modified substance simply and in a short time while maintaining the original state, that is, without adding extra nucleotides. Can do. Also involved in the force of a single-stranded nucleotide chain Not.
  • FIG.1 Schematic diagram showing the principle of the nucleotide chain modification method of the present invention.
  • FIG. 2 Schematic diagram showing the process of labeling and labeling nucleotide chains using the reaction of Fig. 1.
  • FIG. 3 Schematic diagram showing the process of immobilizing a nucleotide chain on a noble metal substrate using the reaction of Fig. 1.
  • FIG. 4 A polyacrylamide gel electrophoresis diagram showing the reaction status in each reaction process of the nucleotide chain modification method of the present invention.
  • FIG. 5 Polyacrylamide gel electrophoresis showing the effect of enzyme activity factor in the nucleotide chain modification method of the present invention.
  • FIG. 6 Polyacrylamide gel electrophoresis showing the effects of enzyme activity factor and buffer component in tailing reaction in the nucleotide chain modification method of the present invention.
  • FIG. X in the figure represents an arbitrary base of adenine, guanine, thymine, and cytosine, and U represents a uracil base.
  • n represents an arbitrary natural number
  • m represents 0 or an arbitrary natural number.
  • dUTP 2'-deoxyuridine ⁇ triphosphate
  • TdT terminal deoxynucleotidyl transferase
  • UDG uracil-DNA glycosylase
  • an activity factor that activates TdT it is desirable to use magnesium ions or manganese ions which are divalent cations.
  • TdT's polymerase action causes the following expression at the 3 'end of the nucleotide chain (I):
  • 2-Deoxyuridine 5 monophosphate (hereinafter abbreviated as “dUMP”) is tailored in a linear chain to produce a nucleotide chain (II).
  • dUMP diphosphate
  • the uracil base of tailed dUMP is dissociated by the action of UDG, and the glycosidic bond of deoxyribose is hydrolyzed to form a nucleotide chain (III) with an aldehyde group.
  • the reaction mixture containing the generated nucleotide chain (III) is heated at 90 to: L00 ° C for 5 to 15 minutes, or sodium hydroxide solution or water is added to the reaction mixture.
  • An alkali treatment is performed by dropping a strong alkali solution such as a potassium oxide solution. From this, the decomposed tailing moiety is dissociated to obtain a nucleotide chain (IV) in which an aldehyde group is directly formed at the end of the starting nucleotide chain (I).
  • ⁇ in the middle represents a compound, molecule, or the remainder of the substance constituting the modifying substance). This makes it possible to form NH at the end of NH
  • a Schiff base is formed between NH and the aldehyde group, and the 3 'end is directly modified with a modifying substance. Including the extra nucleotides decorated, a nucleotide chain (V) is obtained.
  • Cobalt ions As an active factor of TdT described above, cobalt ions have been frequently used. Cobalt ions have NHs that modify nucleotide chains in this way.
  • the magnesium ion and manganese ion which are preferably used as an active factor of TdT, do not form an insoluble precipitate with the modifying substance.
  • Magnesium ions and manganese ions have lower enzyme activity than cobalt ions, but by using such ions, the amount of tailing of dUMP by TdT can be limited, so nucleotide chains It is possible to facilitate the progress of the reaction by UDG using dUMP tailored to the substrate, that is, to rapidly digest the substrate by UDG.
  • dUMP can act as a substrate for uracil DNA glycosylase by tailing at least two or more of the nucleotide strands to be modified in a linear chain.
  • the method for modifying a nucleotide chain of the present invention is not a method for incorporating a modifying substance using a replication reaction or a transcription reaction. It does not depend on the length.
  • the modification time can be significantly reduced compared to the method of modifying the end by a cross-linking condensation reaction (for example, Nucleic Acids Res. 13-1529 1985).
  • a cross-linking condensation reaction for example, Nucleic Acids Res. 13-1529 1985.
  • nucleotide chain has a length of several tens of nucleotides that can be chemically synthesized
  • a nucleotide chain having a specific base sequence is synthesized in advance, whereby the first stage reaction (nucleotide chain It is also possible to omit (I) ⁇ nucleotide chain (II).
  • aminooxybiotin aminooxymethylcarbohydrazino-one D-piotin
  • V nucleotide chain in which piotin is directly bonded to the 3 ′ end. it can.
  • the nucleotide chain labeled with thiotin can be suitably used as a probe or target for gene analysis such as hybridization.
  • a thiol having an amino group such as 8-amino- A modified nucleotide chain in which 8 amino-1 octanethiol (residue) is bonded directly to the ⁇ terminal of the nucleotide chain by causing condensation between the aldehyde group and the amino group by reacting with 1 octanethiol (B). Get (V).
  • the nucleotide chain (V) having the thiol group is brought into contact with a noble metal substrate (C) such as gold by a dropping method to form a strong covalent bond between the thiol group and the noble metal.
  • a noble metal substrate (C) such as gold
  • the nucleotide chain (V) can be immobilized on the substrate (C).
  • a metal substrate such as a precious metal or a glass with a metal thin film
  • a metal thin film is used as a plastic support, it is bonded to a thiol group having a binding property to the metal substrate or the metal thin film and a nucleotide chain.
  • 1-NH with both properties
  • Aminoalkanethiols such as No 1 octanethiol can be used as modifiers.
  • a silanol group having a bonding property to glass has a bonding property to an alkoxysilyl group such as a methoxysilyl group or an ethoxysilyl group generated by carohydrolysis and a nucleotide chain. 1 Gamma amino where both NHs exist
  • Silane coupling compounds such as propyltriethoxysilane can be used as modifiers.
  • tailing dUMP having a uracil base and decomposing it by acting UDG have been described.
  • adenine, guanine, and cytosine contained in natural nucleotide chains.
  • nucleotides with bases i.e., 2'-deoxyadenosine
  • resulting from mutations such as alkylation, deamination, halogenation, hydroxylation or acidation of thymine.
  • Monophosphate 2'-deoxycytidine 5'-monophosphate, 2'-deoxyguanosine ⁇ monophosphate and 2monodeoxythymidine ⁇ other than monophosphate, 2'-deoxyribonucleotide ⁇ (Monophosphoric acid) may be used.
  • the above-mentioned uracil is obtained by deaminating the amino group present in the carbon at the 4-position of cytosine and mutating it to a carbo group.
  • hypoxanthine is obtained by deaminating the amine present in the carbon at the 6th position of adenine and mutating it to a carboxylic group; 3-methyl is obtained by mutating the nitrogen at the 3rd position of adenine. It is adenine; the 8th carbon of guanine is acidified and the carbonyl group is mutated to 8-oxoguanine (the encoding of each base is from the International Pure and Applied Chemistry Union (IUPAC)). According to standards.
  • IUPAC International Pure and Applied Chemistry Union
  • nucleotide chain remains in the state of the initial nucleotide chain structure and configuration before the modification reaction.
  • the guanine-noguanine mismatch modifier should have a binding group for the functional group formed on the nucleotide chain.
  • the functional group is an aldehyde as described above, a group containing HN—, for example
  • Mino group (H N—), hydrazino group (H NHN—), aminooxy group (H NO—), etc. are suitable.
  • the modifying substances for labeling and labeling include fluorescein, Texas red, rhodamine, Cy3, which are fluorescent substances having an aminooxy group, A cyanine compound typified by Cy5 or non-fluorescent digigosigenin can be used. Modification of the nucleotide chain with a fluorescent substance is useful for gene analysis, especially Fluorescence in situ Hybridization (FISH method). Biotin is an example of vitamin and digigosigenin is an example of lipid.
  • Amino acids, oligopeptides, and proteins can also be used because they have amino groups.
  • amino acids phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be preferably used because they have fluorescence.
  • Non-fluorescent amino acids, peptides, and the like can also be used by binding fluorescein or the like (hereinafter referred to as a labeled compound) to the side chain.
  • a peptide has a side chain corresponding to the number of amino acids constituting the peptide, a plurality of labeled compounds can be bound.
  • trilysine in which three lysines are linked has three amino groups in the side chain, so that a total of three labeling compounds having a carboxyl group, a succinimide group, etc. can be modified.
  • proteins examples include alkaline phosphatase, peroxidase, colored and fluorescent phycoerythrin, transferrin, hemoglobin, green fluorescent protein, blue fluorescent protein, and equorin.
  • peptides including proteins
  • nucleotide chains using a substance obtained by modifying a hydrocarbon such as an amino-containing alkyl, aryl, cycloalkane, aromatic, saccharide or the like with a labeling compound. Can also be modified.
  • exogenous substances such as gold colloids with amino groups formed on the surface, noble metal colloids such as silver colloids, magnetic fine particles, and fine particles typified by polymer fine particles such as polystyrene beads also modify nucleotide chains. It can be used as a substance.
  • the modifying substance used for binding to the substrate may have a binding group for the functional group formed on the nucleotide chain and a binding group for the substrate, for example, an amino group and a thiol group.
  • a binding group for the functional group formed on the nucleotide chain and a binding group for the substrate, for example, an amino group and a thiol group.
  • an amino group and a thiol group As long as it has a compound, it can be used without any particular limitation.
  • the above-mentioned aminoalkanethiol is a specific example.
  • the hydrocarbon residue between the amino group and the thiol group may be in various forms such as straight chain, branched chain, cyclocyclic, aryl chain, aromatic ring, etc., its carbon number, position of amino group, etc. Can be changed.
  • a gold substrate is generally used in a crystal oscillator microbalance method, a surface plasmon resonance method, or the like, but is not limited thereto, and in addition to gold, noble metals such as platinum and silver, copper, palladium, indium Nickel, iron, aluminum, and alloys thereof are also used.
  • a silane coupling compound having an amino group may be used as a modifying substance, whereby glass, silicon, silica, alumina, My strength, and high molecular weight resin such as polystyrene, nylon, epoxy, etc. It is possible to fix the nucleotide chain to the substrate, and it can be applied to various conventional gene analysis techniques.
  • silane coupling compound is a compound having an amino group and an alkoxysilyl group (for example, a methoxysilyl group, an ethoxysilyl group, etc.), the structure and the like are not particularly limited as in the case of alkanethiol. Is possible.
  • silane coupling compounds that can be used include gamma-aminopropyltriethoxysilane, N-beta (aminoethyl) -1-gamma-aminopropylmethyldimethoxysilane, N-beta (aminoethyl) -1-gamma-aminopropyl. Trimethoxysilane, N beta (aminoethyl) 1 gamma 1 aminopropyltriethoxysilane, gamma aminopropyltrimethoxysilane and the like.
  • Substances that originally do not have an amino group, an aminooxy group, or a hydrazine group can also modify the nucleotide chain through an appropriate spacer having these bonding groups.
  • a substance having a carboxyl group can modify a nucleotide chain by interposing a substance having a diamino structure such as 1,2 diaminoethane or 1,6 diaminohexane as a spacer.
  • a substance having a cyano group or a substance having halogenomagnesium such as a Grignard reagent can be used as the modifying substance.
  • nucleotide chain to be modified a single-stranded chemically synthesized oligonucleotide having 25 nucleotides (commissioned to Sigma-Aldrich Japan) was used.
  • This nucleotide chain The nucleotide sequence of 5TA is CTTATGATTTTTGTGTGAACCTCCC from the 5 ′ end, and DNA base sequence 5786-5810 of human skeletal muscle myosin heavy chain 1 (National Biotechnology Information Center, GenBank, Internet website (http: //www.n cbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), accession number: NM — 005963 (as of February 2004)).
  • A, G, T, and C represent zanin, guanine, thymine, and cytosine, respectively.
  • aminooxybiotin (Dojindo Laboratories) was added to 2 mM, and the reaction mixture was diluted so that the nucleotide chain to be modified was 2 M, and then at 37 ° C for 1 hour. Reacted. Magnesium chloride is added because a divalent metal cation is required as an active factor of TdT.
  • Lane 1 is a molecular weight marker (Promega)
  • Lane 2 is an untreated nucleotide chain
  • Lane 3 is a nucleotide chain after 2 hours of reaction at 37 ° C
  • Lane 4 is 100 ° C for 15 minutes.
  • Lane 5 shows the electrophoresis pattern of the nucleotide chain after modification with piotin.
  • the molecular weight marker in lane 1 contains a nucleotide chain of 10 nt to 100 nt (every 10 nt interval, 10 nt indicates 10 nucleotides), and the arrows in the figure are 100 nt, 80 nt, 50 nt, 30 nt, 20 nt And lOnt electrophoretic migration positions are shown.
  • the untreated nucleotide chain shown in lane 2 is 25 nt.
  • the nucleotide chain is about 27-30 nt.
  • TdT and UDG Coexistence in the reaction mixture shows that the dUMP tailing reaction to the nucleotide chain and the tailing dUMP decomposition reaction proceeded sequentially.
  • nucleotide sequence configuration, chain length, type of modifying substance, reaction conditions, reaction composition (buffer solution, etc.) shown in Example 1 above are merely examples of the present invention. Any modification can be made without limitation.
  • Lane 1 is the same molecular weight marker as in Example 1, and the arrows attached to the side of Lane 1 indicate the electrophoretic migration positions of 100 nt, 50 nt, 30 nt, 20 nt, and 10 nt, respectively.
  • Lane 2 shows an untreated nucleotide chain
  • lane 3 shows a modified nucleotide chain.
  • No difference in electrophoretic mobility is observed between the nucleotide chains shown in lane 2 and lane 3.
  • the nucleotide chain in lane 3 was not modified with piotin,
  • reaction mixture composition is not replaced by the recovery of the nucleotide chain by ethanol precipitation or gel filtration. Immediate modification with mixing of modifying substances It is possible to migrate.
  • a dUMP was tailed to the nucleotide chain in the same manner as in Example 1 except that various buffers (total amount: 50 ⁇ 1) containing the following active factor were used.
  • Buffer 1 50 mM 4- (2 hydroxyethyl) piperazine 1-ethanesulfonic acid monobasic potassium chloride buffer (pH 7.2) containing 2 mM magnesium chloride (hereinafter referred to as magnesium) Containing sulfonate buffer solution)
  • Buffer 2 50 mM 4- (2 Hydroxyethyl) piperazine 1-ethanesulfonic acid monohydrate-potassium potassium phosphate buffer (PH7.2) containing 2 mM manganese chloride (hereinafter referred to as manganese-containing sulfonic acid buffer) Called)
  • Buffer 3 0.1M potassium potassium codylate buffer (pH 7.2) containing 2mM cobalt chloride (hereinafter referred to as cobalt-containing potassium codylate buffer)
  • Lane 1 is the same molecular weight marker as in Example 1, and the arrows attached to the side of Lane 1 indicate the electrophoretic migration positions of 100 nt, 50 nt, 30 nt, 20 nt and lOnt, respectively. Lane 2 shows the untreated nucleotide chain.
  • Lanes 3 to 6 show the time course of the nucleotide chain (30 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 120 minutes) when using a magnesium-containing sulfonate buffer
  • Lanes 7 to 10 show the time course of nucleotide chains (30 minutes, 60 minutes, 90 minutes, 120 minutes) when using manganese-containing sulfonate buffer
  • Lanes 11 to 14 show the time course of the nucleotide chain (30 minutes, 60 minutes, 90 minutes, and 120 minutes) when using a cobalt-containing codylate buffer, respectively.
  • the tailing reaction efficiency of dUMP is the highest when manganese-containing sulfonate buffer is used when cobalt-containing codylate buffer is used, followed by magnesium-containing sulfonate buffer. The lowest is when liquid is used.
  • the combination of cobalt ion and codylate buffer has the highest reaction activity for TdT reaction. (For example, Bollum FJ, The Enzymes 10 ⁇ 145 1974 Academic Press) and the results are in agreement.
  • the lower reaction efficiency of TdT is rather the decomposition reaction in UDG that is a subsequent reaction. This is desirable because the base mass for is reduced. This is to prevent excessive addition of nucleotides such as dUMP and facilitate the subsequent reaction to decompose the added nucleotides.
  • the combination of cobalt ion and a strong codylic acid buffer solution is used from the viewpoint of the reaction efficiency of TdT, and from the viewpoint that cobalt ions are a factor for precipitating the modifying substance. If it is an arsenic compound! /, It is desirable to avoid it from the viewpoint.
  • TdT when used as an enzyme that catalyzes an addition reaction, it is desirable to use a divalent metal cation other than cobalt ion, such as manganese ion or magnesium ion, as its activity factor. This can prevent precipitation of the modifying substance. It is also desirable to use a buffer component that moderates the TdT reaction activity, such as 4- (2-hydroxychetyl) piperazine 1-ethanesulfonic acid. Good buffers such as 2-morpholinoethanesulfonic acid or 3,3-dimethyldaltaric acid may be used.
  • a buffer component that moderates the TdT reaction activity such as 4- (2-hydroxychetyl) piperazine 1-ethanesulfonic acid.
  • Good buffers such as 2-morpholinoethanesulfonic acid or 3,3-dimethyldaltaric acid may be used.
  • buffering agents do not have an amino group in their chemical structure, and therefore, such as 2-amino-1,2-hydroxymethyl-1,1,3-propanediol (commonly known as Tris), which is widely used as a buffering agent. It becomes possible to avoid the inhibition of the modification reaction caused by the buffer having one NH.
  • the nucleotide chain obtained by chemical synthesis or replication reaction contains natural nucleotides. Not present in leotide, nucleotides with the bases shown in Table 1 may be formed in the sequence. For example, if there are many guanine cytosines in the nucleotide sequence of the nucleotide chain during the replication reaction of the nucleotide chain, incorporation of guanine-containing nucleotides in the replication reaction causes a reduction in replication efficiency. Instead of this, a nucleotide having hypoxanthine is used (for example, Nucleic Acids Res. 21-4427 1993). Thus, the nucleotide chain obtained by the replication reaction contains hypoxanthine in the sequence.
  • This nucleotide chain is also decomposed by the subsequent decomposition reaction.
  • a nucleotide having a base other than hypoxanthine may be appropriately selected and a tailing reaction may be performed. Since the DNA glycosylase or DNA repair enzyme used in the subsequent degradation reaction has specificity for nucleotides having bases serving as substrates, it is possible to avoid degradation of the nucleotide chain to be modified. .
  • the method for modifying a nucleotide chain according to the present invention allows the 3 ′ end of the nucleotide chain to be modified to be quantitatively measured with any modifying substance while maintaining the original state of the nucleotide chain regardless of the length of the nucleotide chain. Since it can be stably and simply modified in a short time, it is useful for gene analysis that requires labeling, labeling, or immobilization of nucleotide chains.

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Abstract

　修飾対象のヌクレオチド鎖と前記ヌクレオチド鎖を構成する塩基とは異なる特定の塩基を有するヌクレオチドとを緩衝液に入れた混合液中に、前記ヌクレオチド鎖の３´末端への前記ヌクレオチドの付加を触媒する酵素と、前記ヌクレオチドに特異的に作用する分解酵素と、前記ヌクレオチド鎖を修飾する所望の修飾物質とを共存させて、前記ヌクレオチド鎖の３´末端に前記ヌクレオチドを付加するとともに、付加されたヌクレオチドの配列を分解して前記ヌクレオチド鎖の３´末端に前記修飾物質に対して結合能を有する官能基を形成し、前記官能基が形成されたヌクレオチド鎖の３´末端を直接に前記修飾物質で修飾する。混合液中で３段階の反応を連続的に進行させるものであり、操作の簡便化、短時間化を実現できる。

Description

明 細 書
ヌクレオチド鎖修飾方法
技術分野
[0001] 本発明は、ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の^末 端を修飾物質で直接的に修飾して、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化、固定化する 方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、遺伝子解析にお!ヽては、 DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌクレ ォチド鎖をラベル化、標識ィ匕するための修飾物質として放射性同位元素が採用され てきたが、半減期による取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃棄の問 題等があるため、その利用は減少傾向にある。近年では、放射性同位元素に代替す る修飾物質として、フルォレセイン等の蛍光物質あるいはピオチン等が汎用されるよ うになつている。
[0003] ヌクレオチド鎖の^末端を修飾する方法として、 5'末端のリン酸基を官能基として 化学的な架橋縮合反応により修飾物質で修飾する方法が提案されて!ヽる（例えば、 非特許文献 1〜2 (後に列挙する。以下、同様)）。またヌクレオチド鎖の化学合成の 際に修飾物質を付与したリン酸基を導入することでヌクレオチド鎖を修飾する方法も 提案され (例えば、特許文献 1〜4及び非特許文献 3〜4)、ヌクレオチド鎖の化学合 成の自動化にも対応可能であることから、繁用されている。
[0004] し力しながら、 5'末端を修飾する上記の方法では、ヌクレオチド鎖 1分子に対して 修飾物質 1分子でしか修飾できず、架橋縮合反応にも長時間を要する。ヌクレオチド 鎖の化学合成の際に修飾する方法に関しては、化学合成は最大ヌクレオチド数 130 まで可能であるとされているのである力 その合成方法は 1ヌクレオチドずつ積層重 合していくのであり、 1回の積層重合効率は最大でも 99%であるため、合成するヌク レオチド数が大きくなるほど合成収率が低下し、充分な収量を獲得するためにはヌク レオチド数を制限する必要がある (例えば、非特許文献 5)。さらに、遺伝子を検出す る際にはアルカリホスファターゼを利用した発色あるいは発光反応が高感度であるた め繁用されているのであるが（例えば非特許文献 6〜7)、アルカリホスファタ一ゼはヌ クレオチド鎖の^末端の脱リン酸化反応を引き起こす性質を有しているので、修飾物 質をヌクレオチド鎖力 解離させてしまうことになり、 5'末端を修飾したヌクレオチド鎖 に対してはアルカリホスファターゼを利用することができない。
[0005] 5,末端を修飾する方法の他に、ヌクレオチド鎖の複製反応、転写反応を利用して、 予め修飾物質で修飾したヌクレオチドを取り込むことで、修飾物質で修飾したヌクレ ォチド鎖を獲得する方法も提案されている。複製反応では、従来力ゝらの放射性同位 元素によるラベル化、標識ィ匕で採用されているニックトランスレーション法、ランダムプ ライマー法、プライマー伸張法などが例示されており、放射性同位元素に代えて、予 め修飾物質で修飾処理を施したデォキシリボヌクレオチド^ 三リン酸を DNAポリメ ラーゼの複製反応を利用して取り込み、転写反応では、予め修飾物質で修飾処理を 施したリボヌクレオチド^一三リン酸を RNAポリメラーゼの転写反応を利用して取り 込む (例えば特許文献 5〜8および非特許文献 6、 8〜9)。これらの修飾方法は、操 作の簡便、ヌクレオチド鎖の高い修飾量、修飾物質の安定性、アルカリホスファタ一 ゼにより修飾物質が解離しない、という利点を有しているため、遺伝子解析に好適な 方法として繁用されている。さらにこれらの修飾方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、いわ ゆる PCR法あるいは RNA増幅反応と併用して、遺伝子の増幅反応とラベル化、標識 化反応とを同時に実現できるため（例えば、非特許文献 10〜12)、 DNAマイクロア レイに総称される遺伝子の網羅解析 (例えば、特許文献 9〜10および非特許文献 1 3〜15)に繁用されている。
[0006] しかし上記の複製反応や転写反応による修飾方法は、予め修飾物質で修飾したヌ クレオチド、すなわち擬似のヌクレオチド、を取り込ませる方法であることから、本来の ヌクレオチドに比べて取り込み効率が悪ぐ PCR法を併用した場合も本来のヌクレオ チドに比べて増幅効率が悪く（例えば、特許文献 8および非特許文献 16)、修飾物 質の取り込み量もヌクレオチド鎖 1分子あたり 12〜25分子とランダムであり（例えば、 非特許文献 17)、修飾量の再現性に問題がある。またヌクレオチド鎖内に修飾物質 を付与するので、遺伝子解析のハイブリダィゼーシヨンの際に、つまりヌクレオチド鎖 の二本鎖形成の際に、修飾物質による立体障害は避けられない。さらに予め修飾物 質で修飾したヌクレオチドの合成は煩雑であり、誰にでも容易に合成できるものでは なく（例えば、非特許文献 8、 18)、結果として修飾物質の種類が限定される。
[0007] 他の修飾方法として、上記の複製反応あるいは転写反応を利用した修飾方法のよ うに铸型となるヌクレオチド鎖を必要とするのでなぐ铸型がない場合に、ヌクレオチド の付加反応によってヌクレオチド鎖を修飾する方法もある。たとえば、ヌクレオチド鎖 の^末端に、ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを利用して、予め 修飾物質で修飾処理を施したデォキシリボヌクレオチド^ 三リン酸ある 、はジデォ キシリボヌクレオチド^一三リン酸をテーリングさせる方法 (例えば、非特許文献 19〜 21)や、 RNAリガーゼを利用して、予め修飾物質で修飾処理を施したデォキシリボヌ クレオチドー 3', 5 '—ビスホスフェートあるいはリボヌクレオチド 3', 5 '—ビスホスフ エートをテ一リングさせる方法 (例えば、特許文献 11および非特許文献 22)がある。こ れらの内、ジデォキシリボヌクレオチド 5'—三リン酸をテーリングさせる方法、あるい はリボヌクレオチドー3 5 '—ビスホスフェートをテーリングさせる方法は、ヌクレオチ ド鎖 1分子に対して修飾物質 1分子のみ修飾可能であるが、予め修飾物質で修飾し たデォキシリボヌクレオチド^一三リン酸をテーリングさせる方法は、ヌクレオチド鎖 1 分子に対し多分子の修飾物質で修飾可能である。
[0008] しかしこのように予め修飾物質で修飾したデォキシリボヌクレオチド三リン酸をテーリ ングさせる方法は、修飾したヌクレオチドの付加数が反応条件によってランダムになり 、また不要なヌクレオチド配列も形成することになるので、遺伝子解析のハイブリダィ ゼーションの際にミスマッチの要因ともなる。また上記の複製反応ある!/、は転写反応 を利用した修飾方法でも説明したように、予め修飾物質で修飾したヌクレオチドは誰 にでも容易に合成できるものではなぐ結果として修飾物質の種類が限定される。
[0009] ヌクレオチド鎖の^末端に修飾物質を導入することは、上記のテーリングだけでな ぐ化学合成法によっても可能であり、その場合には不要なヌクレオチド配列は形成 されない。しかしィ匕学合成法について既述した収量やヌクレオチド鎖長の制限の問 題を回避することはできな 、。
[0010] ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識ィ匕のためだけでなぐヌクレオチド鎖を基 板に固定ィ匕するためにも行なわれている。固定ィ匕用の基板としては従来、疎水性お よび正電荷を有するように加工した、ニトロセルロース、ナイロン、フッ化ポリビ-リデ ン等の基板が利用されていて、ヌクレオチド鎖と基板との疎水結合、および、ヌクレオ チド鎖のリン酸基 (負に帯電)と正電荷を帯びた基板との静電結合によって、ヌクレオ チド鎖が基板に固定化されていた。
[0011] この固定ィ匕方法では、ヌクレオチド鎖長が長くなるにしたがってヌクレオチド鎖 1分 子当たりの基板占有率が高くなるため、基板単位面積当たりの固定ィ匕量が少なくなり 、基板に固定ィ匕したヌクレオチド鎖が解離するなどの問題が起こる。そこで、官能基 を持った修飾物質でヌクレオチド鎖の末端を修飾する一方で、基板表面に前記官能 基に対する結合基を形成しておき、修飾物質の官能基と基板表面の結合基とを架橋 縮合させることで、ヌクレオチド鎖を基板表面に共有結合により固定ィ匕する方法が採 用されている（例えば、特許文献 12〜 15および非特許文献 23)。従来の疎水結合 および静電結合に比べて安定かつ強固にヌクレオチド鎖を固定ィヒできる方法である 。官能基 結合基の組み合わせとしては、アミノ基ーカルボキシル基、アミノ基ーイソ チオシァネート基、アミノ基一アルデヒド基、アミノ基ースクシンイミド基、アミノ基ーェ ポキシ基などが利用されて 、る。
[0012] しカゝし官能基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖の^末端を修飾する場合には、リ ン酸基を介することになり、上述の問題、すなわち、ホスファターゼによりヌクレオチド 鎖が解離してしまうため発光反応による検出は困難であるという問題が起こる。官能 基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖の ^末端を修飾する場合も、上述の問題、す なわち、化学合成により合成可能でかつ充分な収量を獲得するためにはヌクレオチ ド鎖長が制限されるという問題が起こる。
[0013] 以上のヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定ィ匕における問題を解決するものと して、ヌクレオチド鎖の ^末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法がある (特許 文献 16参照)。この方法は、ヌクレオチド鎖の 3 則にゥラシル塩基を有するヌクレオ チドを 2つ以上付カ卩し、付カ卩したヌクレオチドをゥラシル DNAグリコシダーゼで分解し て^末端にアルデヒド基を形成し、このアルデヒド基と修飾物質が持つアミノ基との反 応で共有結合を生じさせることにより、ヌクレオチド鎖の^末端を直接に修飾物質で 修飾するというものである。 (特許文献）
1:特許 1651975号公報
2:特許 1706289号公報
3:特許 1780550号公報
4:特許 1845794号公報
5:特許 1972288号公報
6:特許 2131226号公報
7:特許 2625095号公報
8:特開昭 61-115094号公報
9:特許 3272365号公報
10：特表 2002-538836号公報
11：特開平 5-331185号公報
12：特開 2000- 63154号公報
13:特開 2001- 66304号公報
14：特開 2003-161731号公報
15：特表 2003-526078号公報
16:特開 2003-246794号公報
(非特許文献）
l:Chu B.C.Fら、 Nucleic Acids Res., 11卷、 6513頁、 1983年
2:Chollet A.ら、 Nucleic Acids Res., 13卷、 1529頁、 1985年
3:Alves A.M.ら、 Tetrahedron Letters, 30卷、 3089頁、 1989年
4:Cocuzza A.J.、 Tetrahedron Letters, 30卷、 6287頁、 1989年
5:シグマアルドリッチ社ウェブサイト掲載、オリゴプロダクトガイド、 (http://www.sigm aaldnch.com/sigma/general%20information/oligo— brochure.pdf)、 2006年 3月 8曰 ク セス；日本特許庁ウェブサイト、資料室、その他参考情報、標準技術集、核酸の増幅 及び検出、 1-1プローブ 'プライマーとして適した配列の選択方法、（http：〃 www.jpo. go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0001.html) 2006年 3月 8日アクセス 6:Leary J.J.ら、 Proc.Natl.Acad.Sci.USAゝ 80卷、 4045頁、 1983年 7 : Bronstein I.ら、 Methods Enzymol.、 217卷、 398頁、 1993年
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
上述したように、ヌクレオチド鎖の修飾方法には様々な方法が提案されているが、 それぞれに一長一短があり、利用者は用途に応じて修飾方法を取捨選択しなけれ ばならないという負担がある。もう一度簡単に説明すると、ヌクレオチド鎖の 5'末端を リン酸基を介して修飾する方法は、安定性に問題があり、ヌクレオチド鎖の化学合成 の際に^末端あるいは^末端に修飾処理を施す方法は、ヌクレオチド鎖長の制限 および収量に問題がある。複製反応あるいは転写反応を利用する方法は、ヌクレオ チド鎖を当初より蛍光物質などの修飾物質でラベル化、標識ィ匕することに用途が限 定され、その複製効率および転写効率にも問題がある。予め修飾物質で修飾したヌ クレオチドを付加するテーリング法は、不要なヌクレオチド配列を形成してしまう。ヌク レオチド鎖を基板に固定ィ匕するためには、基板表面の結合基との間に共有結合を生 じる官能基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖を修飾することが望ましいのであるが、 その修飾の際も上記の問題は免れな 、。
[0016] 特許文献 10記載の方法は、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なぐヌクレオチド鎖の^ 側を直接的に任意の修飾物質で修飾することが可能であるが、付加反応と分解反応 と修飾反応のそれぞれで、反応条件の変更およびエタノール沈殿などによる試料の 回収をしなければならず、修飾反応までを終了するのに 10時間以上も要していた。
[0017] 本発明は上記問題を解決するもので、ヌクレオチド鎖の^末端を直接的に修飾物 質で修飾するに際し、反応条件の変更を最小限にし、所要時間を短縮することを目 的とする。
課題を解決するための手段
[0018] 上記課題を解決するために、本発明のヌクレオチド修飾方法は、修飾対象のヌクレ ォチド鎖と前記ヌクレオチド鎖を構成する塩基とは異なる特定の塩基を有するヌクレ ォチドとを緩衝液に入れた反応混合液中に、前記ヌクレオチド鎖の^末端への前記 ヌクレオチドの付加を触媒する酵素と、前記ヌクレオチドに特異的に作用する分解酵 素と、前記ヌクレオチド鎖を修飾する所望の修飾物質とを共存させて、前記ヌクレオ チド鎖の ^末端に前記ヌクレオチドを付加するとともに、付加されたヌクレオチドの配 列を分解して前記ヌクレオチド鎖の^末端に前記修飾物質に対して結合能を有する 官能基を形成し、前記官能基が形成されたヌクレオチド鎖の^末端を直接に前記修 飾物質で修飾することを特徴とする。混合液中の反応産物等を途中で分離すること なく一連の反応を行って、ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接に修飾するもので、操作 の簡便化、短時間化を実現することができ、ヌクレオチド鎖長にも関わらないため、利 便性が高い。
[0019] 修飾対象のヌクレオチド鎖とヌクレオチドと修飾物質と両酵素とを最初力 混合して 、付加反応と分解反応と修飾反応とを並行して生じさせてもよいし;修飾対象のヌクレ ォチド鎖とヌクレオチドと両酵素とを混合して付加反応と分解反応とを並行して生じさ せ、分解反応後の混合液に修飾物質を加えて修飾反応を生じさせてもよ ヽ。
[0020] 付加反応を触媒する酵素を活性化する活性化因子として、修飾物質の修飾反応を 阻害しない活性化因子を添加することを特徴とする。反応混合液は 3段階の反応に おける反応阻害因子を含まな 、組成とすることが望まし 、からである。
[0021] 反応混合液に、付加反応を触媒する酵素の反応活性を穏和にする緩衝剤成分を 含有させることを特徴とする。ヌクレオチド鎖の^末端に特定の塩基を有するヌクレオ チドが過度に付加することを防止し、付加したヌクレオチドの配列を分解する後続の 分解反応の進行を容易にするためである。
[0022] 付加反応を触媒する酵素がターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで あるときには、活性ィ匕因子としてコバルトイオン以外の 2価金属カチオンを使用するこ とができる。コバルトイオン以外であれば、修飾物質が上記の基を有している場合も 沈殿を防止することができる力もである。マンガンイオンあるいはマグネシウムイオン を好適に使用できる。
[0023] 付加反応を触媒する酵素がターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで あるときには、緩衝剤成分として、 4— (2—ヒドロキシェチル)ピぺラジン一 1—ェタン スルホン酸、 2—モルホリノエタンスルホン酸、あるいは 3, 3—ジメチルダルタル酸を 好適に使用することができる。
[0024] 付加するヌクレオチドの特定の塩基は、本来の（天然の）ヌクレオチド鎖を構成する ヌクレオチドには含まれない塩基、つまり、アデニン、グァニン、シトシンおよびチミン ではなくて、これらの塩基がアルキル化、脱ァミノ化、ハロゲン化、ヒドロキシル化ある いは酸ィ匕などされた、変異した塩基であってよい。このような特定塩基を有するヌクレ ォチドであれば、それに特異的な分解酵素が作用した際に、修飾対象のヌクレオチ ド鎖そのものは初期の状態を維持することが可能である。
[0025] 分解酵素として DNAグリコシラーゼあるいは DNA修復酵素を使用することができ る。このことにより、付加したヌクレオチドの配列において、塩基の脱離、デォキシリボ 一スの開環および 3 立のリン酸基の解離が起こり、ヌクレオチド鎖の^末端にアルデ ヒド基が形成される。付加するヌクレオチドが 2'—デォキシゥリジン^一一リン酸であ るときには、分解酵素としてゥラシル DNAグリコシラーゼを好適に使用することができ る。
[0026] 修飾物質は、 -NHを有する物質であってよい。修飾物質に存在する NHは、
2 2 アルデヒド基等と特別な触媒反応を利用しなくとも自発的に架橋結合反応が進行す る力 である。たとえば、アルデヒドと一 NHとの間でシッフ塩基を形成する。
2
[0027] 修飾物質は、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識ィ匕する物質であってょ 、。かかる修 飾物質は、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質、また は生体外因性物質であってよ!/、。
[0028] 修飾物質は、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質であってよ い。力かる修飾物質は、ァミノ基とチオール基とを有する化合物であってよい。また、 ァミノ基と加水分解によりシラノール基を形成するアルコキシシリル基とを有する化合 物であってよい。
[0029] 具体的には、本発明のヌクレオチド修飾方法にぉ 、ては、任意の塩基配列を有す るヌクレオチド鎖と、特定の塩基を有するヌクレオチドと、前記ヌクレオチド鎖の^末 端への前記ヌクレオチドの付加反応を触媒する酵素と、前記ヌクレオチドに作用する DNAグリコシラーゼあるいは DNA修復酵素である分解酵素と、前記酵素により付加 されたヌクレオチドが前記分解酵素により分解されることで前記ヌクレオチド鎖の^末 端に形成されるアルデヒド基に対して結合能を有する修飾物質とを混合することがで きる。
[0030] また、任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖が入った緩衝液に、 2'—デォキシゥ リジン 5'—三リン酸と、ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびそ の活性ィ匕因子と、ゥラシル DNAグリコシラーゼとを混合し、この反応混合液を加熱処 理あるいはアルカリ処理した後、当該処理した反応混合液に H N を有する修飾物
2
質を混合することができる。
発明の効果
[0031] 本発明のヌクレオチド鎖修飾方法によれば、ヌクレオチド鎖を本来の状態を保持し て、つまり余分なヌクレオチドを追加することなぐ簡便に、短時間で、所望の修飾物 質で修飾することができる。ヌクレオチド鎖が 1本鎖である力 2本鎖である力にも関わ らない。
図面の簡単な説明
[0032] [図 1]本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応模式図
[図 2]図 1の反応を利用してヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する過程を示す反応 模式図
[図 3]図 1の反応を利用してヌクレオチド鎖を貴金属基板に固定ィ匕する過程を示す反 応模式図
[図 4]本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の各反応過程での反応状況を示すポリアタリ ルアミドゲル電気泳動図
[図 5]本発明のヌクレオチド鎖修飾方法における酵素活性ィ匕因子の影響を示すポリ アクリルアミドゲル電気泳動図
[図 6]本発明のヌクレオチド鎖修飾方法におけるテーリング反応での酵素活性ィ匕因子 と緩衝剤成分の影響を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図
発明を実施するための最良の形態
[0033] 以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
[0034] まず、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の原理を図 1を参照して説明する。図中の Xは、アデニン、グァニン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を表し、 Uはゥラシル塩 基を表す。 nは任意の自然数を表し、 mは 0または任意の自然数を表す。
[0035] 任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖 (I)を入れた緩衝液に、次式
[0036] [化 1]
Figure imgf000013_0001
[0037] で示される 2'—デォキシゥリジン^一三リン酸（以下、 dUTPと略す）と、ターミナル デォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下、 TdTと略す）と、ゥラシルー DNAグ リコシラーゼ (以下、 UDGと略す)と、 TdTを活性ィ匕する活性ィ匕因子とを混合する。活 性化因子としては、 2価カチオンであるマグネシウムイオンあるいはマンガンイオンの 使用が望ましい。
[0038] このことにより、 TdTのポリメラーゼ作用によって、ヌクレオチド鎖 (I)の 3'末端に、次 式
[0039] [化 2]
Figure imgf000014_0001
[0040] で示される 2 —デォキシゥリジン 5 —一リン酸（以下、 dUMPと略す）が少なくとも 2 つ以上、直鎖状に連鎖的にテーリングされて、ヌクレオチド鎖 (II)が生成する。それと 同時に、 UDGの作用によって、テーリングされた dUMPのゥラシル塩基が解離され るとともに、デォキシリボースのグリコシド結合が加水分解されて、アルデヒド基を持つ たヌクレオチド鎖 (III)が生成する。酵素 TdTと酵素 UDGとを共存させておくことで、 TdTによって dUMPをテーリングさせつつ、テーリングした dUMPを UDGによって 直ちに分解する反応に移行させることができるのである。
[0041] 次に、生成したヌクレオチド鎖 (III)を含んだ反応混合液を 90〜： L00°Cで 5〜15分 間加熱処理するか、あるいは反応混合液中に水酸化ナトリウム溶液あるいは、水酸 化カリウム溶液などの強アルカリ溶液を滴下するアルカリ処理を施す。このこと〖こより、 分解されたテーリング部分が解離されて、出発物質であるヌクレオチド鎖 (I)の^末 端に直接にアルデヒド基が形成されたヌクレオチド鎖 (IV)が得られる。
[0042] 最後に、ヌクレオチド鎖 (IV)を含んだ反応混合液に H N を有する修飾物質（図
2
中の γは修飾物質を構成している化合物、分子、あるいは物質の残部を表す)を混 合する。このことにより、修飾物質に存在する NHとヌクレオチド鎖の^末端に形
2
成したアルデヒド基とが特別な触媒反応なしに自発的に架橋結合反応が進行し、
NHとアルデヒド基の間でシッフ塩基が形成され、 3'末端を修飾物質で直接的に修 飾した、余分なヌクレオチドを含んで 、な 、ヌクレオチド鎖 (V)が得られる。
[0043] なお、上述した TdTの活性ィ匕因子としては、従来、コバルトイオンが繁用されている のであるが、コバルトイオンは、このようにヌクレオチド鎖を修飾する NHを有する
2 修飾物質と不溶性の沈殿物を形成することが認められるため本発明においては避け ることが望ましい。
[0044] 本発明にお 、て TdTの活性ィ匕因子として好適に用いられる前出のマグネシウムィ オンやマンガンイオンは、修飾物質と不溶性の沈殿物を形成することがない。マグネ シゥムイオンやマンガンイオンは、コバルトイオンに比較して酵素活性ィ匕能が低 、の であるが、むしろこのようなイオンを採用することで、 TdTによる dUMPのテーリング 量を制限できるため、ヌクレオチド鎖にテーリングした dUMPを基質とする UDGによ る反応進行を容易にすること、つまり UDGにより基質を迅速に消化することが可能と なる。 dUMPは、修飾対象のヌクレオチド鎖に対し、少なくとも 2つ以上、直鎖状に連 鎖的にテーリングすることで、ゥラシル DNAグリコシラーゼの基質として作用すること が可能となる。
[0045] 以上のようにして、反応混合液中の成分や反応産物を分離することなく一連の反応 を行って、ヌクレオチド鎖の ^末端を修飾物質で直接的に修飾することができ、操作 の簡易化、短時間化を実現できる。
[0046] 従来法と比較すると、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、複製反応あるいは転写 反応を利用して修飾物質の取り込む方法ではないため、取り込み反応のように修飾 物質の修飾量力ヌクレオチド鎖の鎖長さに依存することはない。また架橋縮合反応に よる^末端を修飾する方法（例えば、 Nucleic Acids Res. 13卷 1529頁 1985年）に比 ベ、修飾時間が大幅に短縮可能である。さらにヌクレオチド鎖の化学合成の際に^ 末端に同時に修飾する方法に比べても、化学合成で課題となるヌクレオチド鎖の鎖 長、すなわちヌクレオチド数の制限 (合成収率)の問題を回避することが可能である。 これらのこと〖こより、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化等を要する遺伝子解 析などに有用である。
[0047] ヌクレオチド鎖の主鎖（3,末端以外の部分）に修飾物質が存在しな 、ので、遺伝子 解析に当たり、修飾したヌクレオチド鎖とその標的ヌクレオチド鎖の間で二本鎖を形 成する際も、修飾物質による二本鎖形成の立体障害の発生を回避することが可能で ある。
[0048] 目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖長のものであれば 、予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖を合成しておくことで、第 1段階の 反応 (ヌクレオチド鎖 (I)→ヌクレオチド鎖 (II)を省略することも可能である。
[0049] ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する目的では、たとえば図 2に示すように、ヌクレ ォチド鎖 (IV)に、修飾物質として繁用されているピオチンの末端にアミノォキシ基を 形成した N—アミノォキシメチルカルボ-ルヒドラジノ一 D—ピオチン (A) (以下、アミ ノォキシビォチンと略す)を反応させると、ヌクレオチド鎖 (V)として、 3'末端に直接的 にピオチンが結合したものを得ることができる。このようにピオチン標識したヌクレオチ ド鎖は、ハイブリダィゼーシヨンなどの遺伝子解析のためのプローブあるいはターゲッ トとして好適に利用できる。
[0050] ヌクレオチド鎖を固定ィ匕する目的では、たとえば図 3に示すように、 3'末端にアルデ ヒド基を持ったヌクレオチド鎖 (IV)に対して、アミノ基を有するチオール、たとえば 8— アミノー 1 オクタンチオール (B)を反応させることにより、アルデヒド基とアミノ基との 間で縮合を生ぜしめて、ヌクレオチド鎖の^末端に直接的に 8 アミノー 1 オクタン チオール (残基)が結合した修飾ヌクレオチド鎖 (V)を得る。
[0051] そして、このチオール基を持ったヌクレオチド鎖 (V)を金などの貴金属の基板 (C) に滴下などの方法で接触させることにより、チオール基と貴金属との強固な共有結合 を形成させて、ヌクレオチド鎖 (V)を基板 (C)に固定ィ匕することができる。このようにす ることにより、貴金属を基板として利用する電気化学的測定法、水晶発振子マイクロ バランス法、表面プラズモン共鳴法等の測定法を遺伝子解析に利用することが可能 となる。
[0052] 貴金属などの金属基板あるいは、金属薄膜を形成したガラスある ヽはプラスチック の支持体を利用する場合には、金属基板あるいは金属薄膜との結合性を有するチ オール基およびヌクレオチド鎖との結合性を有する一 NHの両者が存在する 8—アミ
2
ノー 1 オクタンチオールなどのアミノアルカンチオールを修飾物質として用いること ができる。 [0053] また、ガラス基板を利用する場合には、ガラスとの結合性を有するシラノール基をカロ 水分解により生ずるメトキシシリル基あるいはエトキシシリル基などのアルコキシシリル 基およびヌクレオチド鎖との結合性を有する一 NHの両者が存在するガンマーァミノ
2
プロピルトリエトキシシランなどのシランカップリング化合物を修飾物質として用いるこ とがでさる。
[0054] 以上、ゥラシル塩基を有する dUMPをテーリングさせ、 UDGを作用させて分解する 例について説明してきたが、以下の表 1に挙げたような、天然のヌクレオチド鎖に含ま れるアデニン、グァニン、シトシンおよびチミンのアルキル化、脱ァミノ化、ハロゲン化 、ヒドロキシルイ匕あるいは酸ィ匕などの変異により生じた、天然のヌクレオチド鎖には含 まれな 、塩基を有するヌクレオチド (すなわち 2'—デォキシアデノシン^一一リン酸 、 2'—デォキシシチジン 5'—一リン酸、 2'—デォキシグアノシン^一一リン酸および 2 一デォキシチミジン^一一リン酸以外の、 2'—デォキシリボヌクレオチド^一一リ ン酸)を用いてもよい。
[0055] より具体的に例示すると、上述したゥラシルはシトシンの 4位の炭素に存在するアミ ノ基が脱ァミノ化し、カルボ-ル基に変異したものである。同様に、アデニンの 6位の 炭素に存在するァミンが脱ァミノ化し、カルボ-ル基に変異したものがヒポキサンチン であり；アデニンの 3位の窒素がメチル化の変異をしたものが 3—メチルアデニンであ り；グァニンの 8位の炭素が酸ィ匕し、カルボ-ル基に変異をしたものが 8—ォキソグァ ニンである（各塩基の符号付けは国際純正 ·応用化学連合 (IUPAC)の基準による。
) o
[0056] これらのヌクレオチドのテーリングと同ヌクレオチドに特異的に作用する DNAグリコ シラーゼあるいは DNA修復酵素とを組み合わせても、修飾反応前の初期のヌクレオ チド鎖の構造および構成を保持した状態でヌクレオチド鎖の^末端にアルデヒド基 を形成することができ、アルデヒド基に対する結合基（一 NH基など)を持った修飾物
2
質で直接的に修飾可能である。
[0057] [表 1] ヌクレオチドの塩基 適用する DNAグリコシラーゼ■ DNA修復酵素
-ゥラシル
- 5—ヒドロキシゥラシル
' 5 , 6—ジヒドロキシゥラシル 'ゥラシル DN Aグリコシラーゼ
- 5—フル才ロウラシル
- ヒポキサンチン •ヒポキサンチン DNAグリコシラーゼ
' 3 _メチルアデニン
■ 3 _ェチルアデニン • 3—メチルアデニン DNAグリコシラーゼ |型
' 3 _メチルアデニン
- ヒポキサンチン • 3—メチルアデニン DNAグリコシラーゼ ||型
• 3—メチルグァニン
• 7—メチルダァニン
' 1 , N6—エタノアデニン
• 8—才キソグァニン
- 7—ェチノレプリン
• 3—ェチルプリン
• 7, 3—ジェチルブリン
• 1一カルボキシェチルアデニン
• 7—カルボキシェチルダァニン
• 02—メチソレピリミジン
• 7 (2—エトキシェチル） グァニン
■ 7 (2—ヒドロキシェチル） グァニン
■ 7 (2—クロロェチル） グァニン
- 1 , 2—ビス （7—グァニル） ェ夕ン
• 3—ェチルチオェチルプリン
' 2· 3—エタノグァニン
- 2· 3—ェテノグァニン
- 5—ヒドロキシメチルゥラシル
• 5—ホルミルゥラシル
- 1 , N4—ェテノシトシン
- 1， N2—ェテノグァニン
• 3， N2—ェテノグァニン
•チミングリコール
• 5, 6—ジヒドロチミン -エンドヌクレア一ゼ III
■ 5， 6—ジヒドロキシジヒドロチミン
- ヒドロキシシ卜シン
•ゥレア
• 5—ヒドロキシー 5—メチルヒダン卜イン
' 6—ヒドロキシ一 5 , 6—ジヒドロキシピリミジン
• 5—ヒドロキシゥラシル
■ 5—ヒドロキシ一 6—ヒドロチミン
• 5, 6—ジヒドロウラシル
■ゥラシルグリコール
■ 5—ヒドロキシ一 6—ヒドロウラシル
- 8—才キソグァニン
■ 7, 8—ジヒドロー 8—才キソグァニン • 8—才キソグァニン DNAグリコシラーゼ
■ 8—ォキソアデニン
■ホルムアミドグァニン
-メチルホルムアミドグァニン
• 7—メチルダァニン
■ 1， 6—ジァミノ _ 5—ホルムアミドピリミジン •ホル厶アミドピリミジン DN Aグリコシラーゼ •ホルムアミドグァニン
•メチルホルムアミドグァニン
•ホルムアミドアデニン
- 8—ォキソアデニン
- 8—才キソグァニン
- 7, 8—ジヒドロ— 8—才キソグァニン
-ヒドロキシシ卜シン
■ 5—ヒドロキシゥラシル
•アフラトキシン結合イミダゾール開琮状グァニン
'ィミダゾール開環状 N _ 2—ァミノフルオレン一 8—グァニン
- 8—才キソグァニン
■ u t Y— DNAグリコシラーゼ
-アデニン グァニンミスマッチ
• 1， N4—ェテノシ卜シン
•ミスマツチウラシル DMAグリコシラーゼ
•ゥラシル /グァニンミスマッチ
-ビリミジンダイマー •ピリミジンダイマー DNAグリコシラーゼ
-チミン/グァニンミスマッチ
-チミン DN Aグリコシラーゼ
-グァニンノグァニンミスマッチ 修飾物質は、ヌクレオチド鎖に形成される官能基に対する結合基を有して ヽればよ ぐ官能基が上記のようにアルデヒドである場合には、 H N—を含んだ基、たとえばァ
2
ミノ基 (H N—)、ヒドラジノ基 (H NHN— )あるいはアミノォキシ基 (H NO— )等が適
2 2 2
宜に利用可能である。
[0059] ラベル化、標識ィ匕のための修飾物質としては、上述したアミノォキシビォチン (ビタミ ン）の他に、アミノォキシ基を有する蛍光物質であるフルォレセイン、テキサスレッド、 ローダミン、 Cy3、 Cy5に代表されるシァニン系化合物、あるいは非蛍光性のジゴギ シゲニン等を用いることができる。蛍光性物質でヌクレオチド鎖を修飾すると、遺伝子 解析、とりわけ Fluorescence in situ Hybridization (FISH法）に有用となる。なおビォ チンはビタミン、ジゴギシゲニンは脂質の一例である。
[0060] アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質もアミノ基を有するため使用可能である。ァミノ 酸の内、フエ二ルァラニン、トリプトファン、チロシンは、蛍光性を有するため好適に使 用できる。蛍光性を有しないアミノ酸やペプチド等も、側鎖にフルォレセイン等（以下 、標識ィ匕合物)を結合させることで使用可能である。
[0061] ペプチドはそれを構成するアミノ酸の数に応じた側鎖が存在するため、複数の標識 化合物を結合させることが可能となる。例えば、リシンが 3つ連鎖したトリリシンには側 鎖にアミノ基が 3つ存在するため、カルボキシル基、スクシンイミド基等を有する標識 化合物を任意に合計 3つ修飾することが可能となる。
[0062] タンパク質として例えば、アルカリホスファターゼ、ペルォキシダーゼ、有色性、蛍光 性を有するフィコエリスリン、トランスフェリン、ヘモグロビン、緑色蛍光タンパク、青色 蛍光タンパク、ェクオリン等を使用可能である。
[0063] ペプチド（タンパク質を含む）に限らず、アミノ基を有するアルキル、ァリル、シクロア ルカン、芳香族、糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾した物質を修飾物質とし て用いて、ヌクレオチド鎖を修飾することも可能である。
[0064] その他、表面にアミノ基を形成させた金コロイド、銀コロイド等の貴金属コロイド、磁 性微粒子、ポリスチレンビーズ等の高分子微粒子に代表される微粒子など生体外因 性物質も、ヌクレオチド鎖の修飾物質として使用可能である。
[0065] 基板への結合に用いる修飾物質は、ヌクレオチド鎖に形成した官能基に対する結 合基と基板に対する結合基とを有していればよぐたとえばァミノ基とチオール基とを 有する化合物であれば、特に限定なく使用することができる。上述のアミノアルカンチ オールはその具体例である。アミノ基 'チオール基間の炭化水素残基は、直鎖状、分 岐鎖状、シクロ環状、ァリル鎖状、芳香環状等、種々の形態であってよぐその炭素 数、ァミノ基の位置等、変更可能である。
[0066] 基板は、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法等では金基板が 汎用されるが、これに限定されず、金の他に、白金、銀などの貴金属、銅、パラジウム 、インジウム、ニッケル、鉄、アルミニウム、及びそれらの合金等も使用される。
[0067] 修飾物質として、アミノ基を有するシランカップリング化合物を使用してもよぐそれ により、ガラス、シリコン、シリカ、アルミナ、マイ力、及びポリスチレン、ナイロン、ェポキ シ等の高分子榭脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定ィヒすることが可能となり、従来か らの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
[0068] シランカップリングイ匕合物は、ァミノ基とアルコキシシリル基 (たとえばメトキシシリル 基、エトキシシリル基など）とを有する化合物であれば、アルカンチオールと同様に、 構造等に特に制限なく使用可能である。使用可能なシランカップリングイ匕合物はたと えば、ガンマ一ァミノプロピルトリエトキシシラン、 N ベータ（アミノエチル）一ガンマ —ァミノプロピルメチルジメトキシシラン、 N ベータ（アミノエチル）一ガンマ一ァミノ プロピルトリメトキシシラン、 N ベータ（アミノエチル）一ガンマ一ァミノプロピルトリエト キシシラン、ガンマ ァミノプロピルトリメトキシシラン等である。
[0069] 本来はアミノ基ゃアミノォキシ基ゃヒドラジン基を有しない物質も、これらの結合基を 有する適当なスぺーサーを介することで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。たとえば カルボキシル基を有する物質は、スぺーサ一として、 1, 2 ジアミノエタン、 1, 6 ジ ァミノへキサン等のジァミノ構造を有する物質を介在させることで、ヌクレオチド鎖を修 飾可能となる。さらには、シァノ基を有する物質、あるいは Grignard試薬の様にハロ ゲンィ匕マグネシウムを有する物質も、修飾物質として使用可能である。
[0070] 以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
(実施例 1)
修飾対象のヌクレオチド鎖として、ヌクレオチド数 25の 1本鎖化学合成オリゴデォキ シヌクレオチド（Sigma-Aldrich Japan社に合成を委託）を用いた。このヌクレオチド鎖 の塩基配列は、 5'末端から CTTATGATTTTTGTGTGAACCTCCCであり、ヒト 骨格筋ミオシン重鎖 1の DNA塩基配列 5786〜5810位（米国国立バイオテクノロジ 一インフォメーションセンターの GenBank、インターネットウェブサイト（http://www.n cbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html)、ァクセッション番号： NM_005963、 2004年 2月 現在）の配列に対して相補的な塩基配列である。 A、 G、 T、 Cはそれぞれ、了ザニン 、グァニン、チミン、シトシンを表す。
[0071] 上記のヌクレオチド鎖 2. 5 M、 TdT (Fermentas社製） lu (単位） Ζ μ 1、 UDG (Ne w England BioLabs社製） 0. 2u/ μ 1、 dUTPlmM、塩化マグネシウム 2mM (それぞ れの最終濃度）を、 50mM 4— (2 ヒドロキシェチル）ピぺラジン— 1—エタンスル ホン酸-水酸ィ匕カリウム緩衝液 (PH7. 2)に混和し (全量 50 1)、 37°Cで 2時間反 応させ、 100°Cで 15分間加熱処理した。次いでアミノォキシビォチン (同仁ィ匕学研究 所製)を 2mMになるように添加し、同反応混液を修飾対象のヌクレオチド鎖が 2 M になるよう希釈した後、 37°Cで 1時間反応させた。塩ィ匕マグネシウムは TdTの活性ィ匕 因子として 2価金属カチオンが要求されるため添加するものである。
[0072] このヌクレオチド修飾プロセスを 7M尿素 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Mole cular Cloning第 2版 11. 23頁 1989年）により追跡した。 7M尿素および 5%グリセリ ン含有 15%ポリアクリルアミド、緩衝液として、 89mMトリス—ホウ酸、 2mMエチレン ジァミン四酢酸ナトリウムを用いた。ヌクレオチド鎖の検出は、 SYBR Gold (lnvitrog en社製)染色で実施した。結果を図 4に示す。
[0073] レーン 1は分子量マーカー（Promega社製）、レーン 2は未処理のヌクレオチド鎖、レ ーン 3は 37°Cで 2時間の反応後のヌクレオチド鎖、レーン 4は 100°Cで 15分間の加 熱処理後のヌクレオチド鎖、レーン 5はピオチンでの修飾処理後のヌクレオチド鎖、の 電気泳動パターンをそれぞれ示して 、る。
[0074] レーン 1の分子量マーカーは、 10nt〜100nt (10nt間隔毎、 10ntはヌクレオチド 数 10を示す。）のヌクレオチド鎖を含むもので、図中の矢印は、 100nt、 80nt、 50nt 、 30nt、 20ntおよび lOntの電気泳動移動位置をそれぞれ示している。レーン 2に示 す未処理のヌクレオチド鎖は 25ntである。
[0075] レーン 3において、ヌクレオチド鎖は 27〜30nt程度となっている。 TdTと UDGとを 反応混液中に共存させたことにより、ヌクレオチド鎖への dUMPのテーリング反応と、 テーリングした dUMPの分解反応とが逐次に進行したことを示している。
[0076] レーン 4にお!/、て、ヌクレオチド鎖長が 25ntに回復して!/、る。 UDGによって分解さ れた dUMPが加熱処理で解離したことを示して 、る。
[0077] レーン 5において、レーン 2やレーン 4のヌクレオチド鎖に比べて、ヌクレオチド鎖の 移動度が遅くなつている。この結果は、ヌクレオチド鎖の 5'末端をピオチンで直接修 飾した場合に電気泳動の移動度が遅くなる（例えば、 Chollet A.ら Nucleic Acids Re s. 13卷 1529頁 1985年など）ことから、ヌクレオチド鎖がピオチンで修飾されたことを 示すものと解される。 dUMPの解離に伴ってヌクレオチド鎖の^末端にアルデヒド基 が形成されていて、そのアルデヒド基とアミノォキシ基とが反応して、特別な触媒を必 要としなくとも自発的に架橋結合反応が進行し、 -NHの一種であるアミノォキシ基
2
とアルデヒド基の間でシッフの塩基が形成することで、ヌクレオチド鎖の^末端が直 接的にピオチンで修飾されたことによる。
[0078] 以上の実施例 1に示したヌクレオチド鎖の塩基配列の構成、鎖長、修飾物質の種 類、反応条件、反応組成 (緩衝液等）は、本発明の例示にすぎず、これらに限定され ることなく任意に改変可能である。
(比較例 1)
ヌクレオチド鎖を 2. 5 M (最終濃度、以下同様）、 TdTを luZ μ 1、 UDGを 0. 2u Ζ μ 1、 dUTPを ImMにて混合するのは実施例 1と同様である力 予めアミノォキシ ピオチン ImMを添カ卩し、 TdTの活性化因子として塩化コバルト 2mMを用いて、 0. 1 M力コジル酸カリウム緩衝液 (pH7. 2)の緩衝下で、 37°Cにて 30分間保持した。
[0079] このヌクレオチド修飾プロセスを実施例 1と同様にして 7モル尿素 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法により追跡した。結果を図 5に示す。
[0080] レーン 1は実施例 1と同様の分子量マーカーであり、レーン 1の横に付した矢印は、 100nt、 50nt、 30nt、 20ntおよび 10ntの電気泳動移動位置をそれぞれ示している
[0081] レーン 2は未処理のヌクレオチド鎖を示し、レーン 3は修飾処理を施したヌクレオチ ド鎖を示している。 [0082] レーン 2およびレーン 3に示されたヌクレオチド鎖間では、電気泳動移動度の相違 は認められない。レーン 3のヌクレオチド鎖はピオチンで修飾されなかったこと、つまり
TdTのテーリング反応は生じなカゝつたことを示すものである。
[0083] 次に、ヌクレオチド鎖、付加するヌクレオチド、酵素を加えずに、修飾物質としてアミ ノォキシビォチンを用いて、活性ィ匕因子および緩衝液との組み合わせについて、適 否を調べた。結果を以下の表 2に示す。
[0084] [表 2]
アミノ才キシビ才チンとの不溶性錯体形成
Figure imgf000023_0001
(+ ) ：沈殿有
(一） ：沈殿無
[0085] 緩衝液として、上記の力コジル酸カリウムを用いたときも、実施例 1で使用した 4一 ( 2 -ヒドロキシェチル）ピぺラジン 1—エタンスルホン酸一水酸化カリゥムなどを用 ヽ たときも、活性化因子として、塩ィ匕マグネシウムあるいは塩ィ匕マンガンとアミノォキシビ ォチンを共存させても沈殿は生じず、塩ィ匕コバルトを共存させると褐色の沈殿が生じ た。コノ レトイオンとアミノォキシビォチンのアミノ基とが反応して不溶性錯体が形成さ れるためと考えられる。
[0086] この結果は、活性ィ匕因子としてコバルトイオンを採用する場合には、ヌクレオチド鎖 の^末端にアルデヒド基などの官能基を形成した後に、そのヌクレオチド鎖をェタノ ール沈殿あるいはその他の方法によりコバルトイオン力 分離する必要があり、直ち に修飾物質による修飾反応に移行することは困難であることを意味する。
[0087] これに対し、マタネシゥムイオンあるいはマンガンイオンを採用する場合には、 N Hを有する修飾物質との反応による不溶性の沈殿物が生じない。そのため、ヌクレオ
2
チド鎖の^末端にアルデヒド基などの官能基を形成した後に、エタノール沈殿などに よるヌクレオチド鎖の回収操作あるいはゲルろ過などによる反応混液組成の置換操 作をすることなぐその同一の反応混液中に修飾物質を混和して直ちに修飾反応へ と移行することが可能である。
(比較例 2)
以下に示す活性ィ匕因子を含んだ各種の緩衝液 (全量 50 μ 1)を使用すること以外は 、実施例 1と同様にして、ヌクレオチド鎖に dUMPをテーリングさせた。
[0088] 緩衝液 1： 2mM塩化マグネシウムを含んだ、 50mM 4—（2 ヒドロキシェチル）ピ ペラジン一 1—エタンスルホン酸一水酸ィ匕カリウム緩衝液 (pH7. 2) (以下、マグネシ ゥム含有スルホン酸緩衝液と 、う）
緩衝液 2： 2mM塩化マンガンを含んだ、 50mM 4—（2 ヒドロキシェチル）ピペラ ジン一 1—エタンスルホン酸一水酸ィ匕カリウム緩衝液 (PH7. 2) (以下、マンガン含有 スルホン酸緩衝液という）
緩衝液 3 : 2mM塩化コバルトを含んだ、 0. 1M力コジル酸カリウム緩衝液 (pH7. 2 ) (以下、コバルト含有力コジル酸緩衝液という）
各緩衝液を用いた反応混液の 30分毎の経時変化（30分、 60分、 90分、 120分)を 、実施例 1と同様にして、 7モル尿素 ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により追跡し た。結果を図 6に示す。
[0089] レーン 1は実施例 1と同様の分子量マーカーであり、レーン 1の横に付した矢印は、 100nt、 50nt、 30nt、 20ntおよび lOntの電気泳動移動位置をそれぞれ示している 。レーン 2は未処理のヌクレオチド鎖を示している。
[0090] レーン 3〜6はそれぞれ、マグネシウム含有スルホン酸緩衝液を用いたときのヌクレ ォチド鎖の経時変化（30分、 60分、 90分、 120分)を示し、
レーン 7〜10はそれぞれ、マンガン含有スルホン酸緩衝液を用いたときのヌクレオ チド鎖の経時変化（30分、 60分、 90分、 120分)を示し、
レーン 11〜14はそれぞれ、コバルト含有力コジル酸緩衝液を用いたときのヌクレオ チド鎖の経時変化（30分、 60分、 90分、 120分)を示している。
[0091] 図 6に示すとおり、 dUMPのテーリング反応効率は、コバルト含有力コジル酸緩衝 液を用いた場合に最も高ぐマンガン含有スルホン酸緩衝液を用いた場合がそれに 続き、マグネシウム含有スルホン酸緩衝液を用いた場合が最も低い。従来より、 TdT の反応にはコバルトイオン一力コジル酸緩衝液の組み合わせが最も反応活性が高い ことが示されており（例えば、 Bollum F.J.著 The Enzymes 10卷 145頁 1974年 Acade mic Press)、それに一致する結果である。
[0092] しかし本発明方法のようにヌクレオチド鎖の^末端にアルデヒド基等の官能基を形 成する目的であれば、むしろ TdTの反応効率が低い方が、後続反応となる UDGで の分解反応のための基質量が少なくなるため望ましい。 dUMPのようなヌクレオチド が過度に付加することを防止し、付加したヌクレオチドを分解する後続反応の進行を 容易とするためである。
[0093] このため、コバルトイオン一力コジル酸緩衝液の組み合わせは、 TdTの反応効率の 観点から、またコバルトイオンが修飾物質を沈殿させる要因であるという観点から、さ らには力コジル酸自体がヒ素化合物であると!/、う観点から、避けるのが望ま 、。
[0094] したがって、付加反応を触媒する酵素として TdTを使用する場合には、その活性ィ匕 因子としてコバルトイオン以外の 2価金属カチオン、たとえばマンガンイオンあるいは マグネシウムイオンを使用するのが望ましぐそれにより修飾物質の沈殿を防止するこ とができる。また TdTの反応活性を穏和にする緩衝剤成分、たとえば 4— (2—ヒドロ キシェチル）ピぺラジン一 1—エタンスルホン酸を使用するのが望まし ヽ。 2—モルホ リノエタンスルホン酸などのグッドの緩衝剤、あるいは 3, 3—ジメチルダルタル酸など を使用してもよい。
[0095] これらの緩衝剤は、その化学構造にアミノ基を有しな 、ため、緩衝剤として汎用され る 2—ァミノ一 2—ヒドロキシメチル一1, 3—プロパンジオール（通称トリス）のような一 NHを有する緩衝剤により生じる修飾反応の阻害を回避することが可能となる。
2
[0096] 以上の実施例においては、 dUMPのテーリング反応を例にとって、 TdTに対する 酵素活性ィ匕能があまり良好でない活性ィ匕因子と、反応を穏和に進行させる緩衝液成 分との組み合わせを例示したが、本発明に用いられる緩衝液成分と TdT活性ィ匕因子 との組み合わせはこれに限定されるものでない。表 1に示した塩基を有する 2'—デォ キシヌクレオチド^一一リン酸のテーリング反応において、テーリング反応の進行が 穏和な緩衝液成分とコバルトイオンを除く TdT活性ィ匕因子の組み合わせが適宜、採 用可能である。
[0097] また、化学合成あるいは複製反応により獲得されるヌクレオチド鎖には、天然のヌク レオチドには存在しな 、表 1に示した塩基を有するヌクレオチドをその配列中に形成 することがある。たとえば、ヌクレオチド鎖の複製反応の際にそのヌクレオチド鎖の塩 基配列中にグァニンゃシトシンが多数存在する場合、グァニンを有するヌクレオチド を複製反応で取り込ませることは複製効率低下の要因となるため、グァニンの代わり にヒポキサンチンを有するヌクレオチドを利用する（例えば、 Nucleic Acids Res. 21卷 4427頁 1993年)。このように複製反応により獲得されたヌクレオチド鎖には、その配 列中にヒポキサンチンが存在することになり、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法で例 示したヒポキサンチンを有するヌクレオチドをテーリングすると、修飾対象のヌクレオチ ド鎖も後続の分解反応により分解されることになる。このような場合は、ヒポキサンチン 以外の塩基を有するヌクレオチドを適宜選択し、テーリング反応すればよい。後続の 分解反応に利用する DNAグリコシラーゼあるいは DNA修復酵素は、その基質とな る塩基を有するヌクレオチドに特異性を有して 、るため、修飾対象のヌクレオチド鎖 の分解を回避することが可能となる。
産業上の利用可能性
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、修飾対象のヌクレオチド鎖の 3'末端を、ヌク レオチド鎖の鎖長に関わらずまたヌクレオチド鎖の本来の状態を保持して、任意の修 飾物質で定量的に安定的に、かつ、簡便に短時間で修飾することが可能なので、ヌ クレオチド鎖のラベル化、標識化、固定ィ匕等を要する遺伝子解析などに有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 修飾対象のヌクレオチド鎖と前記ヌクレオチド鎖を構成する塩基とは異なる特定の 塩基を有するヌクレオチドとを緩衝液に入れた反応混合液中に、前記ヌクレオチド鎖 の^末端への前記ヌクレオチドの付加を触媒する酵素と、前記ヌクレオチドに特異的 に作用する分解酵素と、前記ヌクレオチド鎖を修飾する所望の修飾物質とを共存さ せて、前記ヌクレオチド鎖の^末端に前記ヌクレオチドを付加するとともに、付加され たヌクレオチドの配列を分解して前記ヌクレオチド鎖の^末端に前記修飾物質に対 して結合能を有する官能基を形成し、前記官能基が形成されたヌクレオチド鎖の^ 末端を直接に前記修飾物質で修飾するヌクレオチド鎖修飾方法。
[2] 付加反応を触媒する酵素を活性化する活性化因子として、修飾物質の修飾反応を 阻害しない活性ィ匕因子を添加する請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[3] 反応混合液に、付加反応を触媒する酵素の反応活性を穏和にする緩衝剤成分を 含有させる請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[4] 付加反応を触媒する酵素がターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで あるときに、活性ィ匕因子としてコバルトイオン以外の 2価金属カチオンを使用する請求 項 2記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[5] 活性化因子が、マンガンイオンあるいはマグネシウムイオンである請求項 4記載のヌ クレオチド鎖修飾方法。
[6] 付加反応を触媒する酵素がターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼで あるときに、緩衝剤成分として、 4— (2—ヒドロキシェチル)ピぺラジン一 1—エタンス ルホン酸、 2—モルホリノエタンスルホン酸、あるいは 3, 3—ジメチルダルタル酸を使 用する請求項 3記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[7] 付加するヌクレオチドの特定の塩基力 アデニン、グァニン、シトシンまたはチミンが アルキル化、脱ァミノ化、ハロゲン化、ヒドロキシルイ匕あるいは酸ィ匕された、変異した 塩基であることを特徴とする請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[8] 分解酵素が DNAグリコシラーゼあるいは DNA修復酵素であり、それにより形成さ れる官能基がアルデヒド基である請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[9] 付加するヌクレオチドが 2'—デォキシゥリジン^一一リン酸であるときに、分解酵素 としてゥラシル DNAグリコシラーゼを使用する請求項 7記載のヌクレオチド鎖修飾方 法。
[10] 修飾物質が NHを有している請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
2
[11] 修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識ィ匕する物質である請求項 1または請 求項 9のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[12] 修飾物質が、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質ま たは、生体外因性物質である請求項 10記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[13] 修飾物質が、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質である請求 項 1または請求項 9のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[14] 修飾物質が、ァミノ基とチオール基とを有する化合物である請求項 12記載のヌクレ ォチド鎖修飾方法。
[15] 修飾物質が、ァミノ基と加水分解によりシラノール基を形成するアルコキシシリル基 を有する化合物である請求項 13記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[16] 任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖と特定の塩基を有するヌクレオチドと、前記 ヌクレオチド鎖の^末端への前記ヌクレオチドの付加を触媒する酵素と前記ヌクレオ チドに作用する DNAグリコシラーゼある 、は DNA修復酵素である分解酵素と、前記 酵素により付加されたヌクレオチドが前記分解酵素により分解されることで前記ヌクレ ォチド鎖の^末端に形成されるアルデヒド基に対して結合能を有する修飾物質とを 混合する請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
[17] 任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖が入った緩衝液に 2'—デォキシゥリジン 5 一三リン酸と、ターミナルデォキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびその活性 化因子とゥラシル DNAグリコシラーゼとを混合し、この反応混合液を加熱処理ある!/ヽ はアルカリ処理した後、当該処理した反応混合液に H N を有する修飾物質を混合
2
する請求項 1記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
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