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WO2007119685A1 - β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬 - Google Patents

β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬 Download PDF

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WO2007119685A1
WO2007119685A1 PCT/JP2007/057663 JP2007057663W WO2007119685A1 WO 2007119685 A1 WO2007119685 A1 WO 2007119685A1 JP 2007057663 W JP2007057663 W JP 2007057663W WO 2007119685 A1 WO2007119685 A1 WO 2007119685A1
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WO
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antibody
blood
sample
peptide
amyloid
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/057663
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English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeo Takayama
Original Assignee
Sanko Junyaku Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanko Junyaku Co., Ltd. filed Critical Sanko Junyaku Co., Ltd.
Priority to US12/226,148 priority Critical patent/US20090291453A1/en
Priority to JP2008510925A priority patent/JP4790013B2/ja
Priority to ES07741099T priority patent/ES2409058T3/es
Priority to EP07741099A priority patent/EP2006392B1/en
Publication of WO2007119685A1 publication Critical patent/WO2007119685A1/ja
Priority to US13/162,969 priority patent/US20110244495A1/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying a disease associated with ⁇ -amyloid, such as Arnotno's disease, by measuring the degradation rate of ⁇ -amyloid in a sample blood.
  • a disease associated with ⁇ -amyloid such as Arnotno's disease
  • ⁇ -amyloid (hereinafter referred to as ⁇ ) is a major component of amyloid plaques that are characteristically found in the brains of patients with Algno-Ima disease (AD).
  • APP Protein
  • a j8 The molecular species of A j8 is known to have various molecular weight sizes, the best known force associated with neurotoxicity among them is also the power of 42 amino acids A
  • 8 1-42 has the property of easily fibrotic and is known to deposit from the early stages of AD to form amyloid plaques, and is considered to be one of the causative agents of AD development. RU
  • a ⁇ 1-42 is closely related to the onset of AD! /, So there is an attempt to use A ⁇ 1-42 as a disease marker for the diagnosis of AD patients.
  • cerebrospinal fluid is used as a specimen because the physical burden on the patient at the time of specimen collection is high and the risk of physical function damage is high, so it is practically impossible to use cerebrospinal fluid as a specimen. In general, it is widespread, and it is the current situation.
  • Non-patent Document 8 The fact that it is impossible to diagnose blood samples as in vitro diagnostics is a major issue at present in AD diagnostic research.
  • Non-Patent Document 2 Shirotani K, et al., J. Biol. Chem. 2001 276 (24); 21895-901.
  • Non-Patent Document 3 Iwata N, et al., Science. 2001 292 (5521); 1550-2.
  • Non-Patent Document 4 Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci. 1997; 148: 41-45.
  • Non-Patent Document 5 Andreasen N, et al., Arch. Neurol. 1999; 56: 673-680.
  • Non-Patent Document 6 Galasko D, et al, Arch. Neurol. 1998; 55: 937-945.
  • Non-Patent Document 7 Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38: 643-648.
  • Non-Patent Document 8 Tamaoka A, et al., J. Neurol. Sci. 1996; 141: 65-68.
  • Non-patent document 9 Namba et al., Examination of highly sensitive immunoassay by electrochemiluminescence (ECL), Journal of Japan Society for Clinical Laboratory Automation CFJCLA), 1996, Vol. 21 No. 5.
  • Non-Patent Document 10 Nature, 256, 459-497 (1975)
  • the present invention resides in application to AD diagnosis by a method for measuring the degradation rate of A ⁇ peptide added to a sample blood.
  • the method for assaying Arno-iuma Ima disease of the present invention is characterized in that the A ⁇ degradation activity of a sample blood component is measured.
  • 8 Degradation activity is measured by adding A
  • a method is mentioned.
  • 8 peptide to be added to the specimen is not particularly limited as long as it includes the cleavage site of A ⁇ peptide in vivo due to the degradation enzyme neprilysin or the like, and preferably A j8 Peptide 1-42 can be mentioned.
  • the method for measuring the residual amount of the Aj8 peptide added is not particularly limited as long as it is a technique that can quantify the peptide, but an immunological measurement method that is excellent in sensitivity and convenience is particularly preferred.
  • a two-antibody sandwich immunoassay method using an antibody recognizing the N-terminal portion and an antibody recognizing the C-terminal portion is preferred.
  • the sample blood is preferably serum or plasma.
  • the AD diagnostic reagent of the present invention essentially comprises A ⁇ peptide added to the sample blood, an antibody that recognizes the ⁇ -terminal portion of the ⁇ peptide, and an antibody that recognizes the C-terminal portion of the ⁇ peptide. And measuring the remaining amount of A
  • the diagnostic reagent has a different force depending on the immunoassay method to be used and the type of A
  • 8 1-42 C-terminal part recognition antibody labeled with a labeling substance are the components.
  • 81-42 end-terminal recognition antibody and a ⁇ 42 end-terminal recognition antibody labeled with a label may be used as components.
  • the antibody that recognizes the C-terminal portion of 1-42 is not particularly limited, but 21F12 is preferred.
  • the assay method and reagent of the present invention either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used as the antibody.
  • 81-42 C-terminal partial recognition antibody is preferably a highly specific antibody for A ⁇ 144, but is not limited thereto.
  • the blood sample is preferably serum or plasma, but whole blood can also be used.
  • the labeling substance include fluorescent substances, enzymes, dyes, and luminescent substances, and are not particularly limited, but ruthenium complexes are preferred.
  • the support to be immobilized is not particularly limited, and is preferably a magnetic bead.
  • 8 peptide is not limited to the above-described two-antibody sandwich immunoassay method.
  • an A ⁇ synthetic peptide labeled with a luminescent substance or a fluorescent substance is prepared and added to the blood.
  • 8 Measure changes in luminescence and fluorescence due to peptide degradation
  • the gist of the present invention is to measure the A-decomposing activity of a sample blood component.
  • it is a method of assaying AD by measuring protease activity or amount in the sample blood.
  • One method is to use it for AD diagnosis by measuring the degradation rate of A ⁇ peptide added to the sample blood, that is, the activity of ⁇ -degrading enzyme in the blood.
  • Another method for measuring the activity of ⁇ -degrading enzyme in blood is to use ⁇
  • 8 is labeled with a fluorescent substance, added to the blood to be tested, and analyzed with an HPLC analyzer having a fluorescence detector after a certain period of time. Measure the time to be played.
  • an HPLC analyzer having a fluorescence detector after a certain period of time.
  • the present invention uses a two-antibody sandwich immunoassay that uses an antibody that specifically recognizes A ⁇ peptide, and the degree of degradation of ⁇ synthetic peptide added to a blood sample! By measuring sputum, it is possible to confirm the strength of peptidase activity and to diagnose AD. According to the present invention, AD can be diagnosed with blood samples such as plasma and serum.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Experimental Example 1.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Experimental Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Example 1.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Example 2.
  • serum is used as the sample blood
  • ⁇ 1 42 synthetic peptide is used as the A ⁇ peptide added to the sample serum
  • a two-antibody sandwich immunoassay is used as a method for quantifying the peptide. Described below.
  • the two-antibody sandwich immunoassay consists of two antibodies: a antibody specific to the ⁇ end part of
  • 81-42 immobilized on a magnetic bead and an antibody specific to the C-terminal part labeled with a ruthenium complex.
  • the method for measuring the amount of the remaining A ⁇ 1 42 synthetic peptide added is not limited to an immunological technique, and is not particularly limited as long as it can measure the amount of ⁇
  • the antibody used in the two-antibody sandwich immunoassay is an antibody specific for the N-terminal part of A
  • ⁇ 8 1-42 amino acid 1-5 site recognition antibody 3D6 antibody (Ingenetics Inc.), 6E10 antibody (Chemicon), which is an amino acid 10-16 site recognition antibody, and 4G8 antibody (Chemicon), an amino acid 17-24 site recognition antibody, can be used.
  • ⁇ C 1-4 terminal recognition antibody of ⁇ 1-42 is commercially available, for example, mouse monoclonal 21F12 (manufactured by Inogeneetics), 8G7 (manufactured by Nanotool), or AB5078P (manufactured by Chemicon), a rabbit antibody.
  • 8 1-40 synthetic peptides in blood samples using a two-antibody sandwich immunoassay system for A ⁇ 1-40 C-terminal partial recognition antibody and ⁇ terminal partial recognition antibody Etc. can also be used.
  • the amino acid 10-16 site-recognizing antibody 6E10 antibody is used as the N-terminal portion-recognizing antibody, the terminal portion of the A ⁇ synthetic peptide to be added can be shortened.
  • the presence or absence of degradation in a sample can also be measured by using an antibody that recognizes the degradation (cleavage) site of the synthetic peptide.
  • the A j8 synthetic peptide added to the sample blood is not limited to the A j81-42 synthetic peptide, and is not particularly limited as long as it has a length that can be degraded in blood.
  • the length of the peptide can be appropriately selected in consideration of the specificity of the recognition site of the antibody used.
  • 811-42 synthetic peptide used as a substrate can be used regardless of the manufacturer as long as it has the same amino acid sequence as human-derived A
  • the peptide can be synthesized according to a conventional method such as solid phase synthesis.
  • Examples of the material for the support on which the antibody is solid-phased include glass, plastic (for example, polystyrene, polyamide, polyethylene, polypropylene, etc.), metal, and the like.
  • the shape of the support is not particularly limited, such as a cup shape, a flat plate, or a particle. Magnetic micro beads (magnetic beads) are preferable.
  • the method of immobilizing the antibody on the support may be in accordance with a conventional method.
  • the labeling substance used in the present invention is not limited to enzymes, luminescent substances, fluorescent substances, and isotopes, and is preferably a ruthenium complex.
  • the method for preparing the labeled antibody is in accordance with a conventional method. For example, after reacting an antibody with a ruthenium complex (IGEN, ORIGEN TAG-NHS ESTER) in a buffer solution, 2M glycine is added for further reaction. Subsequently, it can prepare by refine
  • Diagnostic reagents (kits) based on the two-antibody sandwich immunoassay method of the present invention are: ⁇
  • the antibody used in the present invention can be prepared by a conventional method.
  • Monoclonal antibodies are prepared by using a peptide having the C-terminal part of A1-42 as an antigen, creating a complex with a carrier protein as necessary, and inoculating this into an animal for immunization.
  • Antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the above-mentioned immune animals are fused with myeloma cells to select hyperidomas that produce antibodies with strong specificity at the C-terminal part of A
  • a immunizing antigen can also use A ⁇ 1-42, but since the antibody of interest is an antibody having specificity for the C-terminal part of ⁇ 1-42, a peptide possessing the C-terminal part of A
  • a complex with a carrier protein is used as an antigen, and various condensing agents such as dartal aldehyde, carpositimide, maleimide active ester and the like are used for the preparation.
  • carrier protein sushi serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used, and usually a method of coupling at a ratio of 1 to 5 times is used.
  • mice and guinea pigs examples include mice and guinea pigs, and the inoculation method is subcutaneous, intramuscular or intraperitoneal.
  • complete Freund's adjuvant may be mixed with incomplete Freund's adjuvant, and usually administered once every 2 to 5 weeks.
  • the antibody-producing cells obtained from the spleen or lymph nodes of the immunized animal are fused with myeloma cells and isolated as hyperidoma.
  • myeloma cells those derived from mice, rats, humans and the like are used, and those derived from the same species as the antibody-producing cells are preferred.
  • the operation of cell fusion can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein (Non-patent Document 10).
  • fusion promoters include polyethylene glycol and Sendai virus, and are usually 20 to 50% polyethylene glycol (average fraction). 20 to 40 using a child quantity of 1000 to 4000).
  • C preferably 30-37. Under the temperature of C, the ratio of the number of antibody-producing cells to the number of myeloma cells is usually about 1: 1 to 10, and cell fusion can be carried out by reacting for about 1 to 10 minutes.
  • a variety of immunochemical methods can be used for the screening of a hyperidoma that produces an antibody having specificity for the C-terminal part of A ⁇ 1 42.
  • ELISA method Western blot method, competitive method and the like can be mentioned.
  • 8 1-40 peptide antibodies that react with A
  • the selected well force can be further cloned by, for example, limiting dilution to obtain a target clone.
  • Hypridoma selection and breeding is usually performed in animal cell culture medium (eg, RPMI1640) containing 10-20% urine fetal serum with addition of HA T (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HA T hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • the clone can be cultured, and the culture solution can be used as a raw material for antibody purification.
  • Monoclonal antibodies can be recovered by using known methods for immunoglobulin purification, such as ammonium sulfate fractionation, PEG fractionation, ethanol fractionation, the use of anion exchangers, and an affinity port. This can be achieved by means such as matography.
  • Polyclonal antibodies can also be prepared by conventional methods. Antigens can be prepared by immunizing animals such as rabbits and guinea pigs as a complex using the same method as described above, using peptides consisting mainly of the C-terminal part of ⁇
  • a polyclonal antibody can be obtained by appropriately collecting blood, measuring the antibody titer, and purifying the antibody with a high-titer serum using the above-described method as a purification source of the antibody.
  • AD diagnosis method based on synthetic peptide degradation rate measurement is an excellent method that enables AD diagnosis in blood samples, which is added to sample blood (plasma, serum) by two-antibody sandwich immunoassay, which is one of the present invention It is. Diagnosing AD using blood samples so far There is no in-vitro diagnostic agent, focusing on A ⁇ -degrading enzyme in blood, and performing AD diagnosis by measuring the degree of degradation of A j8 1-42 No attempt has been reported so far. Therefore, the method of the present invention Is useful for AD diagnosis, which was first discovered by the present inventor. The present invention proves the clinical usefulness between blood samples of AD patients and healthy individuals by measuring the degradation of Aj8 peptide, This enables diagnosis of AD blood samples. In addition, from the gist of the present invention, a method for measuring the A-degrading enzyme itself can also be adopted, and there is a possibility that it can be used for diagnosis of a disease caused by A.
  • the primary antibody is a 3D6 mouse monoclonal antibody that recognizes the 15 amino acid site of A ⁇ 1 42 (manufactured by Inoji NETEX), and the secondary antibody recognizes the C-terminal portion of ⁇
  • the method for preparing ruthenium-labeled antibodies is as follows: 21F12 mouse monoclonal antibody (Inodiene Takes) was diluted to a concentration of 1 mg / mL antibody with 10 mmol / L potassium phosphate buffer (pH 7.8). lmgZmL antibody 0.5 mL of lOmgZmL of ruthenium (IGEN, ORI GEN TAG-NHS ESTER) 17.6 ⁇ L C, stirred for 30 minutes. Thereafter, 30 ⁇ L of 2 mol / L glycine was added and stirred at 25 ° C. for 30 minutes.
  • ruthenium-labeled antibody solution was applied to a gel filtration column chromatography (sephadex G-25, manufactured by Amersham Biosciences) packed in a glass tube with a diameter of 1 cm and a height of 30 cm, and unlabeled ruthenium and ruthenium-labeled antibody were applied. Isolated and purified. Elution was performed with 10 mMol ZL potassium phosphate buffer (pH 6.0).
  • reaction cups 500 L polystyrene cups (hereinafter referred to as reaction cups), 200 ⁇ L each for 50 mmol ZL MOPS / 1% (W / V) Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) /0.15 mol / L NaCl / O. 01% (W / V) Tween 20/10 mmol / L EDTA2N a / 0.1% CHAPS pH 7.2 (hereinafter referred to as reaction solution) was dispensed.
  • reaction solution 500 L polystyrene cups
  • a 1-42 synthetic peptide (Peptide Institute, Inc.), ⁇ ⁇ 1 40 synthetic peptide (Peptide Institute, Inc.), A
  • a synthetic peptide (manufactured by Shidama) was diluted to 0, 1, 5, 10, 50, 100, 200, or 400 pgZmL with the reaction solution, and then 20 L each was mixed. Next, 25 ⁇ L of 3D6 antibody-bound magnetic beads diluted to 1 mgZmL concentration with the reaction solution were added and reacted at 30 ° C. for 9 minutes (first reaction).
  • washing solution 50 mmol / L TrisHCL / tween20 / 0.15 mol / L NaCl pH 7.5 (hereinafter referred to as washing solution) at 350 L
  • the magnetic beads were washed twice to remove non-specific binding substances other than the antigen-antibody reaction.
  • 200 L of ruthenium-labeled 21F12 antibody diluted with the reaction solution to a concentration of 4 gZmL was added and reacted at 30 ° C. for 9 minutes (second reaction).
  • the magnetic beads after the reaction were trapped with a magnet, and the liquid in the force reaction cup was extracted.
  • the magnetic beads were washed twice with 350 L of washing solution to remove non-specific binding substances other than the antigen-antibody reaction. Thereafter, 300 L of tributopylamine as a luminescent substrate was placed in a reaction cup and mixed with a magnetic bead. By applying electric energy in this state, ruthenium emitted light, and the emission intensity was detected by a detector. Measurement of addition of magnetic beads to the above reaction cup After the operation, the measurement was performed on a picormi 8220 (manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.), which is an automatic ruthenium luminescence measuring machine. The results are shown in Table 1 and FIG.
  • microtubes 90 ⁇ L of healthy human serum was dispensed into two microtubes (Pierce, Immuno Ware Micro Tubes, hereinafter referred to as “microtubes”). 9 ⁇ L of protein in one of the two Powered by a caseinactor kakutenore (Roche)! (Hereinafter referred to as inhibitor-added sample), and 9 ⁇ L of sterilized water was added to the other (hereinafter referred to as inhibitor-free sample). Thereafter, each tube was kept at 25 ° C.
  • Table 2 shows the measurement results of ECL emission intensity.
  • the measured value of each sample is shown as a relative ratio when the measured value immediately after preparation of the sample is 100%.
  • Figure 2 is a graph illustrating the relative ratio.
  • microtubes The required amount of microtubes was prepared, and 100 ⁇ L of 30 AD patient sera and 30 healthy human sera were dispensed. 1 ⁇ L of 400 ngZmL A ⁇ 1-42 synthetic peptide was collected in each aliquot. At the same time, instead of a serum sample, 1 L of 400 ng ZmL ⁇ ⁇ 1-42 synthetic peptide in a 100 L reaction solution was prepared as a standard product. ⁇ Serum added with ⁇ 1-42 synthetic peptide and standards were incubated at 25 ° C for 20 hours.
  • Table 3 shows the measurement results of ECL luminescence intensity of AD patients
  • Table 4 shows the measurement results of ECL luminescence intensity of healthy subjects.
  • the relative ratio of the emission intensity of each sample when the emission intensity of the standard product is 100% is shown as the residual ratio.
  • Decomposition rate (%) of ⁇ 1-42 calculated from this residual rate is shown.
  • the average value of the decomposition rate of AD patients and healthy subjects are shown in Table 3 and Table 4, respectively.
  • Fig. 3 is a graph showing the degradation rate of AD and Aj8 1-42 in healthy individuals.
  • Example 2 Electrochemiluminescence two-antibody sandwich immunoassay with 6E10 antibody and 21F12 antibody Comparison of A
  • a 6E10 mouse monoclonal antibody that recognizes the 10-16 amino acid site of A ⁇ 1-42 is used as the primary antibody, and the 21F12 mouse that recognizes the C-terminal portion of A j8 1-42 as the secondary antibody.
  • a monoclonal antibody manufactured by Inodinetics was used after being labeled with a ruthenium complex.
  • the method for preparing 6E10 antibody-bound magnetic beads, the method for preparing ruthenium complex labeled 21F12 antibody, and the two-antibody sandwich immunoassay were performed in the same manner as in Experimental Example 1. The results are shown in Tables 5 and 6 and FIG.

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Abstract

　血清又は血漿を検体としてアルツハイマー病の検定方法を提供することにある。 　検体血液に添加したβ－アミロイドペプチドが分解することを見出し、その分解活性を健常者とアルツハイマー病患者の検体血液で比較したところ、有意に健常者血液の分解活性が強いことを見出した。

Description

明 細 書
j3—アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法 及び診断試薬
技術分野
[0001] 本発明は、検体血液中の β アミロイドの分解速度を測定することによる、アルッノヽ イマ一病など β アミロイドが関与する疾患の検定方法に関するものである。
背景技術
[0002] β—アミロイド (以下、 Α βと記す）は、アルッノヽイマ一病 (AD)患者脳に特徴的に 認められるアミロイドプラークの主な構成成分であり、 Α |8は、その前駆体タンパク質（ APP) N—末端の /3部位を切断する j8—セクレターゼと、細胞膜内に存在する APP —C—末端を切断するプレセリニンの γ—セクレターゼによって切り出されることで産 生されることが知られて ヽる。
A j8の分子種は、様々な分子量サイズのものが知られている力 それらの中で神経 細胞毒性と関連して最もよく知られているの力 42個のアミノ酸力もなる A |8 (以下、 A |8 1—42と記す)である。 A |8 1—42は、容易に繊維化する性質を持っており、 AD の早期から沈着しアミロイドプラークを形成することが知られており、 AD発症の原因 物質のひとつであると考えられて 、る。
上記のように、 A |8の合成過程及び A |8と AD発症の関係についてはこれまでにも 盛んに研究が進められている。一方、産生した A |8の分解経路についても近年にな つて徐々にではあるが解明されつつある。特に、西道らのグループは脳の神経細胞 内に特異的に局在する A |8分解酵素であるネプリライシンの存在を突き止め、この酵 素の働きが低下すると A |8の脳内沈着量が増加し、 ADを引き起こす可能性につい て示唆した (非特許文献 1〜3)。一方、 A |8は脳内で産生した後、脊髄液を経由して 最終的に血中まで移行すると考えられている力 血中を含む脳組織以外での A |8分 解に関しては、分解経路や分解酵素の存在の有無も含めて未だ不明である。
[0003] 診断の面力 ADを見ると、 A β 1—42が ADの発症と密接に関係して!/、るため、 A D患者の診断に関して A β 1—42を疾患マーカーとする試みが以前力 検討されて きた。これまでには脳脊髄液中の A |8 1—42に関して、 AD患者でその濃度が低下し ていることが報告されている（非特許文献 4〜7)。しかし脳脊髄液を検体とするのは、 検体採取時の患者への身体的負担'身体機能損傷のリスクが大きぐ実際上は脳脊 髄液を検体として使用することは現実的でな 、為、一般には普及して 、な 、のが現 状である。一方、体外診断薬として最も一般的で、且つ身体的負担 'リスクが低い検 体として、血液検体 (血清又は血漿）が考えられる。し力し血清中での A |8測定は、こ れまで行われてきた一般的測定手法、たとえば二抗体サンドイッチ免疫測定法では 血液中からはほとんど検出されておらず、臨床的有用性も見出せていない。このこと から血液検体で A β 1—42を測定することにより AD患者を診断することは非常に困 難だと考えられる (非特許文献 8)。体外診断薬として一般的な血液検体での診断が 不可能であることは ADの診断学的研究にぉ 、て、現在大きな課題となって 、る。 非特許文献 l : Takaki Y, et al.， J.Biochem(Tokyo).2000;128(6):897-902.
非特許文献 2 : Shirotani K, et al.， J. Biol.Chem.2001 276(24);21895-901.
非特許文献 3 : Iwata N, et al.， Science.2001 292(5521);1550- 2.
非特許文献 4 : Tamaoka A, et al.， J. Neurol. Sci.1997; 148:41-45.
非特許文献 5 :Andreasen N, et al.， Arch.Neurol.1999; 56:673-680.
非特許文献 6 : Galasko D, et al, Arch. Neurol. 1998; 55:937-945.
非特許文献 7 : Motter R, et al., Ann Neurol 1995; 38:643-648.
非特許文献 8 : Tamaoka A, et al., J.Neurol. Sci.1996; 141:65-68.
非特許文献 9 :難波 et al.、電気化学発光法（Electrochemiluminescence : ECL)による 高感度免疫学的測定法の検討、日本臨床検査自動化学会会誌 CFJCLA)、 1996, V ol. 21 No. 5.
非特許文献 10 : Nature, 256, 459-497(1975)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
本発明は、検体血液中に添加した A βペプチドの分解速度を測定する方法により 、 AD診断に応用することにある。
課題を解決するための手段 [0005] 上記課題を解決するために本発明者らは、ヒト血清中での A ペプチドの分解代 謝の有無を測定できるかどうかを検討した。 A |8 1—42の血中分解を確認する為、 A β 1—42合成ペプチドをヒト血清に添カ卩し、経時的に Α |8 1—42の残存量を測定し た。測定法は、一次抗体として Α 1—42の N末端部分に特異性を有する抗体、第 二抗体として A j8 1— 42の C末端部分に特異性を有する抗体を使用し、電気化学発 光法 (非特許文献 9)を利用する二抗体サンドイッチ免疫測定法にて測定した。この 方法は、全長 Α |8 1—42の測定は可能である力 分解を受けて断片化した Α |8 1 -4 2は測定が不可能である測定系である。
測定の結果、添加した A |8 1—42合成ペプチドの測定値は時間の経過とともに低 下していくことを確認した。また、 Α |8 1—42合成ペプチドを血清に添加する際に、血 清中に酵素活性を阻害するプロテアーゼインヒビターをあら力じめ投入しておくと、時 間経過による A |8 1—42測定値低下が大幅に抑えられることについても確認した。 これらの事実は、 A |8が血液中で、速やかにプロテアーゼにより分解'断片化して いることを意味しており、添加した Α |8 1—42合成ペプチドが血液中で酵素消化され 、断片化していくことで、全長 Α |8 1—42のみを測定できる二抗体サンドイッチ免疫 測定法での測定が不可能となっていくことを意味する。
[0006] 次 ヽで、 AD患者と健常人血清検体に Α β 1 42合成ペプチドを任意の量添加し 、 25°Cで 20時間保存した検体について、上記二抗体サンドイッチ免疫測定法にて 測定を行ったところ、 AD患者、健常人血清ともに A |8 1—42合成ペプチド添加直後 に測定した測定値と比べて、測定値の低下が見られ、いずれの検体についても検体 中のプロテアーゼが A |8 1—42合成ペプチドを分解していることが確認された。さら に、 AD患者と健常人の血清における測定値の低下率を比較すると、両者の間に有 意差があり、 AD診断に利用しえる可能性があることを確認し、本発明を完成するに 至った。
[0007] すなわち本発明のアルッノヽイマ一病の検定方法は、検体血液成分の、 A β分解活 性を測定することを特徴とする。 Α |8分解活性を測定する方法としては、検体血液に A |8ペプチドを添加して、一定時間経過後、該ペプチドを分解する活性を測定して、 健常者血液の該分解活性と比較する方法が挙げられる。 検体に添加する A |8ペプチドは、分解酵素ネプリライシンなどによる生体内での A βペプチドの切断部位を考慮して、その切断部位を含むペプチドであれば特に限定 はされず、好ましくは、 A j8ペプチド 1—42が挙げられる。添カ卩した A j8ペプチドの残 存量の測定方法は、該ペプチドを定量できる手法であれば特に限定はされな 、が、 感度、簡便性に優れる免疫学的測定方法が好ましぐ特に該ペプチドの N末端部分 を認識する抗体と C末端部分を認識する抗体を使用した二抗体サンドイッチ免疫測 定法が好ましい。検体血液は、血清又は血漿が好ましい。
[0008] 本発明の AD診断試薬は、検体血液に添加する A βペプチド、該 Α βペプチドの Ν 末端部分を認識する抗体及び該 Α βペプチドの C末端部分を認識する抗体を必須 の構成成分とし、検体血液に添加した A |8ペプチドの残存量を測定することにより、 検体血液の A ペプチド分解酵素活性を測定することを特徴とする。該診断試薬は 、採用する免疫測定方法及び添加する A |8ペプチドの種類により試薬の構成は異な る力 例えば、 Α |8 1— 42ペプチド及び二抗体サンドイッチ免疫測定法を採用した場 合は、固相化した Α |8 1—42の Ν末端部分認識抗体と標識物で標識した Α |8 1—42 の C末端部分認識抗体を構成成分とする。あるいは固相化した A |8 1—42のじ末端 部分認識抗体と標識物で標識した A β 1 42の Ν末端部分認識抗体を構成成分と してもよい。 Α |8 1—42の C末端部分認識抗体は特に限定されないが、 21F12が好 ましい。
[0009] 本発明の検定方法及び試薬にお!ヽて、前記抗体として、ポリクローナル抗体又は モノクローナル抗体いずれも用いることができる。また前記抗体のうち、 A |8 1—42の C末端部分認識抗体に関しては A β 1 42に特異性の高 ヽ抗体であることが好まし いが、この限りではない。なお、前記血液検体が血清または血漿であることが好適で あるが、全血を使用することもできる。標識物質として、蛍光物質、酵素、色素、発光 物質などが挙げられ特に限定されないが、ルテニウム錯体が好ましい。固定化する 支持体も特に限定されず、好ましくは磁気ビーズである。
なお、添加した Α |8ペプチドの残存量の測定方法は上記の二抗体サンドイッチ免 疫測定法に限らず、例えば発光物質や蛍光物質を標識した A β合成ペプチドを作 製して血中に添加し、添加 Α |8ペプチド分解による発光、蛍光量の変化を測定する 方法などを使用することも可能であり、本発明の趣旨は、検体血液成分の A 分解 活性を測定することにある。言い換えれば、検体血液に含まれるプロテアーゼ活性又 は量を測定して ADを検定する方法である。その一つの手法として、検体血液に添加 した A βペプチドの分解速度、つまり血液中での Α β分解酵素の活性を測定すること により AD診断に利用することにある。
[0010] 血液中の Α β分解酵素の活性を測定する別法は、放射性同位元素や蛍光物質等 で標識した Α |8ペプチドを使う方法である。具体的には、例えば、 A |8の特定の部位 を蛍光物質で標識して被検血液に添加し、一定時間後に蛍光検出器を有する HPL C分析器にて分析して、蛍光物質が溶出される時間を測定する。分解されていない 蛍光標識 A βペプチドのピークとは異なる溶出時間に検出される、蛍光標識 Α βぺ プチド断片のピークを検出することにより、 A |8ペプチドの分解を測定することができ る。
本発明方法によれば、複数の A ペプチドの分解物が存在した場合でも、 ADに特 異的に現れるピークを測定することにより、より特異的な診断が可能になる。また、 A Dに特異的に現れるピークが特定できれば、 AD特異的な A |8ペプチドの切断位置 を特定することができ、より特異的な AD診断薬の開発につなげることが可能となる。 発明の効果
[0011] 本発明は、 A βペプチドを特異的に認識する抗体を用いる二抗体サンドイッチ免疫 測定法を用いて、血液検体に添加した Α β合成ペプチドの分解度合！ヽを測定するこ とにより、 Α ペプチド分解酵素活性の強弱を確認し、 ADを診断することを可能とし たものである。本発明によれば、血漿や血清などの血液検体にて ADを診断すること が可能となる。
図面の簡単な説明
[0012] [図 1]実験例 1の結果を示すグラフである。
[図 2]実験例 2の結果を示すグラフである。
[図 3]実施例 1の結果を示すグラフである。
[図 4]実施例 2の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態 [0013] 以下に本発明の実施の形態を説明するが、本発明の技術思想カゝら逸脱しない限り 、様々な変形が可能であることは 、うまでもな 、。
[0014] 検体血液として血清を用い、検体血清に添加する A βペプチドとして Α β 1 42合 成ペプチドを使用し、該ペプチドの定量法として二抗体サンドイッチ免疫測定法を採 用した場合を一例として以下に記載する。
検体血清に Α |8 1—42合成ペプチドを添加して 25°Cで保温した後、その一定量を 分取して残存する A β 1 42合成ペプチドを二抗体サンドイッチ免疫測定法にて定 量し、検体血清の該ペプチド分解活性を算定する。この値と健常者血清の分解活性 とを比較することにより、 ADの疾患の有無を検定するものである。
二抗体サンドイッチ免疫測定法は、 Α |8 1—42の Ν末端部分に特異的な抗体を磁 気ビーズに固相化したものと、ルテニウム錯体で標識した C末端部分に特異的な抗 体を使用し、手法は常法に準ずる。すなわち、分取したサンプルと、抗体を固相化し た磁気ビーズを反応させて、 A β 1—42合成ペプチドを結合させた後洗浄する（BF 分離)。次いで標識した二次抗体を反応させて、磁気ビーズに結合した Α |8 1 -42 合成ペプチドと結合させた後洗浄し、最後に、磁気ビーズに結合している標識物質 ルテニウム錯体の量を、トリプトピルアミン存在下で電気エネルギーをカ卩えて発光させ
、発光の強度を測定する方法である。
[0015] 添加した A β 1 42合成ペプチド残存量の測定法としては、免疫学的手法に限ら れず、 Α |8 1— 42量を測定することができる方法であれば特に限定されない。
前記二抗体サンドイッチ免疫測定法に用いられる抗体は、 A |8 1—42の N末端部 分に特異的な抗体と、 C末端部分に特異的な抗体であれば、モノクローナル抗体及 びポリクローナル抗体いずれも使用することが可能である。
Α β 1—42の Ν末端部分認識抗体に関しては、必ずしも最 Ν末端部である必要は なぐ市販品としては、例えば、 Α |8 1—42のアミノ酸 1—5部位認識抗体である 3D6 抗体 (イノジ ネテイクス社製)やアミノ酸 10— 16部位認識抗体である 6E10抗体 (ケ ミコン社製)、アミノ酸 17— 24部位認識抗体である 4G8抗体 (ケミコン社製)などが使 用可能である。
Α β 1—42の C末端部分認識抗体は、市販品としては、例えば、マウスモノクローナ ル抗体である 21F12 (イノジエネテイクス社製）、 8G7 (ナノツール社製）、あるいはゥ サギポリクローナル抗体である AB5078P (ケミコン社製)などが挙げられる。
A β 1—40の C末端部分認識抗体と Ν末端部分認識抗体の二抗体サンドイッチ免 疫測定系を用いて、 A |8 1— 40合成ペプチドの血液検体中での分解速度を測定す る方法などを用いる事も可能である。また、 N末端部分認識抗体として、アミノ酸 10— 16部位認識抗体 6E10抗体を使用する場合は、添加する A β合成ペプチドの Ν末 端部分を短くすることも可能である。さらに、 Α 合成ペプチドの分解 (切断)部位を 認識する抗体を用いることにより、検体中での分解の有無を測定することもできる。 このように、検体血液に添加する A j8合成ペプチドは、 A j8 1—42合成ペプチドに 限らず、血液中で分解されうる長さを有しておれば特に限定されるものではなぐ該 ペプチドの測定法として免疫学的測定法を採用した場合は、使用する抗体の認識部 位の特異性等を考慮して、ペプチドの長さは適宜選択することができる。本発明方法 において、基質として使用する A |8 1—42合成ペプチドは、ヒト由来 A |8 1— 42と同 一アミノ酸配列であれば製造メーカーを問わず使用可能である。前記ペプチドは、固 相合成法など常法に従い合成することが出来る。
[0016] 抗体を固相化する支持体の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック (例えばポリ スチレン、ポリアミド、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）、金属などが挙げられる。支持 体の形状は、カップ型、平板、粒子など、特に限定されない。好ましくは、マグネティ ックマイクロビーズ (磁気ビーズ)である。
抗体を支持体に固相化する方法は、常法に準ずればよい。支持体として磁気ビー ズを使用する場合、該ビーズと抗体を緩衝液中で反応させた後、磁気ビーズをブロッ キング剤で処理し、使用時までブロッキング剤下で保存することが好ま U、。
本発明に使用する標識物質は、酵素、発光物質、蛍光物質、同位元素などに限定 されず、好ましくはルテニウム錯体である。標識抗体の調製方法は常法に準ずる。例 えば、抗体とルテニウム錯体（IGEN社製、 ORIGEN TAG- NHS ESTER)を緩衝液中 で反応させた後、 2Mグリシンを加えてさらに反応させる。次いで、ゲルろ過カラムクロ マトグラフィ一により標識抗体を精製することにより調製できる。
[0017] 本発明の二抗体サンドイッチ免疫測定法に基づく診断試薬 (キット）は、 Α |8 1 -42 の N末端部分に特異性を有する抗体、 C末端部分に特異性を有する抗体及び A j8 1 —42合成ペプチドを必須の構成成分とするものである。なお、反応に使用する緩衝 液、測定器具などを診断試薬に添付することは自由である。なお、上記に記載したよ うに、使用する抗体の特異性に応じて、検体に添加する A |8合成ペプチドは適宜選 択することができる。
[0018] 本発明に使用する前記抗体は、常法により調製することができる。モノクローナル抗 体の調製は、 A 1—42の C末端部分を保有するペプチドを抗原として、必要に応じ てキャリアー蛋白質との複合体を作り、これを動物に接種して免疫する。上記免疫動 物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、 A |8 1 —42の C末端部分に強い特異性を示す抗体を産生するハイプリドーマを選択するこ とにより調製される。その操作は従来既知の方法に準ずればよい。
免疫抗原は A β 1—42も使用できるが、目的の抗体が Α β 1—42の C末端部分に 特異性を有する抗体であるので、 A |8 1— 42の C末端部分を保有するペプチド、例 えば、 A |8 33— 42など適宜選択することができる。通常、キャリアー蛋白質との複合 体を抗原として使用するが、その調製は種々の縮合剤、例えばダルタルアルデヒド、 カルポジイミド、マレイミド活性エステル等が使用される。キャリアー蛋白質はゥシ血清 アルブミン、サイログロブリン、へモシァニン等を使用し、通常 1〜5倍量の割合でカツ プリングさせる方法が用いられる。
免疫される動物としてはマウス、モルモットなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉 あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては、完全フロイントアジュバンドゃ不完 全フロイントアジュバンドと混和して投与してもよぐ投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ 行われる。免疫された動物の脾臓ある 、はリンパ節カゝら得られた抗体産生細胞は骨 髄腫細胞と細胞融合させられ、ハイプリドーマとして単離される。骨髄腫細胞としては マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであるこ とが好ま 、が、異種間にお 、ても可能な場合もある。
[0019] 細胞融合の操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法 (非特許文献 10)に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコールやセンダイウイ ルスなどが挙げられ、通常 20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分 子量 1000〜4000)を用いて 20〜40。C、好ましくは 30〜37。Cの温度下、抗体産生 細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1： 1〜10程度、約 1〜10分間程度反応させるこ とにより細胞融合を実施することができる。
A β 1 42の C末端部分に特異性を有する抗体を産生するハイプリドーマのスクリ 一ユングは、種々の免疫化学的方法が使用できる。例えば、 ELISA法、ウェスタン ブロット法、競合法等があげられる。また、 Α |8 1—42ペプチド及び A |8 1—40ぺプ チドを使用することにより、 A |8 1—42に反応し A |8 1—40に反応しない抗体を選択 することができる。
このように選択されたゥエル力も更に、例えば限界希釈法によってクローニングを行 い、目的とするクローンを得ることができる。ハイプリドーマの選択、育種は、通常 HA T (ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加して、 10〜20%ゥシ胎児血清を 含む動物細胞用培地（例、 RPMI1640)で行われる。このようにして得られたクロー ンは、あら力じめブリスタンを投与した BALBZCマウスの腹腔内へ移植し、 10〜14 日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とするこ とができる。また、該クローンを培養し、その培養液を抗体精製の原料とすることもで きる。モノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精製法として既知の方法を用 いればよぐ例えば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体 の利用、さらにァフィ二テイク口マトグラフィなどの手段により達成することができる。 ポリクローナル抗体も常法により調製することができる。抗原は Α |8 1—42の C末端 部分を主な構成とするペプチドを採用し、前記と同様な手法により、複合体としてゥサ ギ、モルモットなどの動物に免疫して調製することができる。適宜採血して抗体力価 を測定し、高力価の血清を抗体の精製原料として、前記の手法により精製することに よりポリクローナル抗体を得ることができる。
本発明の一つである二抗体サンドイッチ免疫測定法による検体血液 (血漿、血清） に添加した Α |8合成ペプチド分解速度測定による AD診断方法は、血液検体での A D診断が可能な優れた方法である。これまでに血液検体を使用して ADを診断する 体外診断薬は存在せず、血中の A β分解酵素に着目し、 A j8 1— 42の分解度合 ヽ を測定することで AD診断を行う試みはこれまでに報告がな 、。よって本発明の手法 が AD診断に有用であることは、本発明者が始めて見出したものであり、本発明は A j8ペプチドの分解測定によって AD患者と健常者の血液検体間での臨床的有用性 を証明し、 ADの血液検体での診断を可能にしたものである。また、本発明の趣旨か ら、 A 分解酵素そのものを測定する手法も採用することができ、 A が原因の一つ となる疾患の診断にも利用できる可能性がある。
実施例
[0021] 以下に実施例に基づき本発明を具体的に説明するが、本発明はその要旨を超え ない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
[0022] (実験例 1) 3D6抗体と 21F12抗体での電気化学発光二抗体サンドイッチ免疫測定 法
一次抗体として A β 1 42の 1 5アミノ酸部位を認識する 3D6マウスモノクローナ ル抗体 (イノジヱネテイクス社製)を使用し、二次抗体として Α |8 1—42の C末端部分 認識抗体である 21F12マウスモノクローナル抗体 (イノジエネテイクス社製)をルテ- ゥム錯体標識して使用した。
[0023] 以下に試薬の各構成成分の調製方法について記す。
(1) 3D6抗体結合磁気ビーズの調製方法
3D6マウスモノクローナル抗体を 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液（pH7. 8)で 1 mgZmL抗体濃度に希釈し、この抗体 0. 5mLを、 30mgZmLの磁気ビーズ（DYN AL社製、 DYNABEADS M- 450 Epoxy) 0. 5mLと混合した。混合液を 25°C、 16時間 攪拌し、磁気ビーズと抗体を結合させた。その後、この磁気ビーズ溶液より溶液のみ を抜き取ることで、溶液中に残存して ヽた磁気ビーズ未結合の遊離抗体を除去した。 次にブロッキング剤として lmLの 4%ブロックエース試薬 (大日本製薬社製)を抗体 結合磁気ビーズに加え、 25°C、 3時間攪拌した。その後、前述の 4%ブロックエース 試薬 10mLで磁気ビーズを洗浄（2mLの 4%ブロックエース /5回洗浄）した。洗浄 後の 3D6抗体結合磁気ビーズは前述の 4%ブロックエース試薬 0. 5mLと混合し、使 用時まで 4°Cで保存した。
[0024] (2)ルテニウム錯体標識 21F12抗体の調製方法
ルテニウム標識抗体の調製方法は、 21F12マウスモノクローナル抗体 (イノジエネ テイクス社製)を 10mmol/Lリン酸カリウム緩衝液 (pH7. 8)で lmg/mL抗体濃度 に希釈した。 lmgZmL抗体 0. 5mLに lOmgZmLのルテニウム（IGEN社製、 ORI GEN TAG-NHS ESTER)を 17. 6 μ： Lカロえ、 25。C、 30分間攪拌した。その後、 2mol /Lグリシンを 30 μ L添加し、 25°C、 30分間攪拌した。
次いで、直径 lcm、高さ 30cmのガラス管に充填したゲルろ過カラムクロマトグラフィ 一（アマシャム'バイオサイエンス社製、 sephadex G- 25)にルテニウム標識抗体液を アプライし、未標識のルテニウムとルテニウム標識抗体を単離精製した。溶出は 10m molZLリン酸カリウム緩衝液 (pH6. 0)にて行った。
(3)二抗体サンドイッチ免疫測定法による A β 1 42ペプチドの測定
500 L容ポリスチレンカップ (以下、反応カップと記述）を必要量用意し、それぞれ に 200 μ Lの 50mmolZL MOPS/1% (W/V)ブロックエース（大日本製薬社製 ) /0. 15mol/L NaCl/O. 01% (W/V)Tween20/10mmol/L EDTA2N a/0. 1%CHAPS pH7. 2 (以下、反応用溶液と記述）を分注した。そこに A 1— 42合成ペプチド (ペプチド研究所社製）、 Α β 1 40合成ペプチド (ペプチド研究所 社製）、 A |8 1— 11合成ペプチド (バヘム社製）、及び A β 34— 42合成ペプチド (シ ダマ社製）を反応用溶液で 0、 1、 5、 10、 50、 100、 200又は 400pgZmLに希釈し てから 20 Lずつ混合した。次に反応用溶液で lmgZmL濃度に希釈した 3D6抗 体結合磁気ビーズを 25 μ Lずつ添加し、 30°Cで 9分間反応させた (第一反応)。 その後、磁気ビーズを磁石でトラップしてお 、て力も反応カップ中の液体を抜き取り 、 50mmol/L TrisHCL/tween20/0. 15mol/L NaCl pH7. 5 (以下、洗 浄液と記述） 350 Lで 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合 物質を除去した。次に反応用溶液で 4 gZmL濃度に希釈したルテニウム標識 21F 12抗体を 200 L加えて 30°Cで 9分間反応させた (第二反応)。反応後の磁気ビー ズを磁石でトラップしておいて力 反応カップ中の液体を抜き取り、 350 Lの洗浄液 で 2回磁気ビーズを洗浄し、抗原抗体反応以外の非特異結合物質を除去した。 その後、反応カップに発光基質である 300 Lのトリブトピルアミンを入れ、磁気ビ ーズと混合した。この状態で電気エネルギーを与えることでルテニウムが発光し、そ の発光強度を検出機で検出した。なお、上記の反応カップへの磁気ビーズ添加測定 操作以降は、ルテニウム発光自動測定機であるピコルミ 8220 (三光純薬社製)上で 行った。結果を表 1及び図 1に示す。
[0026] [表 1] 実験例 1の結果
Figure imgf000014_0001
[0027] 表 1及び図 1に示した如ぐ本法での 2抗体サンドイッチ免疫測定法は、全長 A β 1
42ペプチドのみを特異的に検出可能な測定系であり、断片化 Α |8は測定不可能 な測定系であることが確認された。
[0028] (実験例 2)血清による A β 1 42合成ペプチドの酵素分解確認試験
マイクロチューブ（ピアス社製、 Immuno Ware Micro Tubes,以下マイクロチューブと 記述） 2本に、健常人の血清を 90 μ Lずつ分注した。 2本の内の 1本に 9 μ Lのプロテ ァーゼインヒビターカクテノレ（ロッシュ社製）を添力！]し（以下、インヒビター添加サンプル と表記）、他方に 9 μ L滅菌水を加えた (以下、インヒビター無しサンプルと表記)。そ の後、それぞれのチューブは 25°Cで保温した。
サンプル作製直後 (0時間）、保温開始 6時間後、及び保温開始 20時間後に各サ ンプルから 10 Lずつを抜き取り、 200 Lの反応用溶液とマイクロチューブ内で混 合した (以下、測定前希釈サンプルと表記)。測定前希釈サンプルは作製後、時間を 置かずに実験例 1と同様の方法で A β 1 42サンドイッチ免疫測定法にて測定を行 つた ο
[0029] ECL発光強度の測定結果を表 2に示す。表 2中、サンプル作製直後の測定値を 10 0%としたときの、各サンプルの測定値を相対比で示した。図 2はその相対比を図示 したグラフである。
[0030] [表 2] 実験例 2の結果
Figure imgf000015_0001
[0031] 表 2及び図 2に示した如ぐプロテアーゼインヒビターをカ卩えて力も A j8 1—42合成 ペプチドを添加した血清の方が、明らかに時間経過による測定値の低下を抑えられ るという結果が得られた。よって血清中には A |8 1—42を分解する酵素が存在し、添 カロした A j8 1—42合成ペプチドは時間とともに酵素分解されて断片化する為、全長 A β 1 42のみを測定可能な二抗体サンドイッチ免疫測定系では測定値が時間ととも に低下したと考えられる。一方、プロテアーゼインヒビターをカ卩えた場合は、酵素によ る Α β 1—42分解が阻害される為、 A j8 1—42がプロテアーゼインヒビターをカ卩えな い場合よりも多く残存し、結果、測定値の低下も抑えられたと示唆される。
[0032] (実施例 1) AD患者及び健常人血清の A β 1 42分解速度比較
マイクロチューブを必要量用意し、 30例の AD患者血清、及び 30例の健常人血清 を 100 μ Lずつ分注した。各分注検体に 1 μ Lの 400ngZmL A β 1—42合成ぺプ チドをカ卩えた。同時に血清検体の代わりに 100 Lの反応用溶液に 1 μ Lの 400ng ZmL Α β 1—42合成ペプチドをカ卩えたものを標準品として作製した。 Α β 1—42 合成ペプチド添加血清及び標準品は 25°Cで 20時間保温した。
保温開始 20時間後の各サンプルから 10 Lずつを抜き取り、 200 Lの反応用溶 液とマイクロチューブ内で混合し、測定前希釈サンプルとした。測定前希釈サンプル は作製後、時間を置かずに実験例 1と同様の方法で二抗体サンドイッチ免疫測定法 にて柳 j定を行った。
[0033] AD患者の ECL発光強度の測定結果を表 3に示し、健常人の ECL発光強度の測 定結果を表 4に示した。表 3及び 4中、標準品の発光強度を 100%としたときの各サ ンプルの発光強度の相対比を残存率として表示した。さらにこの残存率より算出した Α β 1— 42の分解率（％)について表示した。分解率は下記式（1)により算出される 分解率 = ( 1 サンプルの発光強度 ÷標準品の発光強度） X 100 · · · ( 1) また、 AD患者及び健常者の分解率の平均値をそれぞれ表 3及び表 4に示した。図 3は、 ADと健常人の A j8 1—42の分解率を示したグラフである。
[0034] [表 3]
実施例 1の AD患者サンプルの結果
Figure imgf000017_0001
実施例 1の健常人サンプルの結果
Figure imgf000018_0001
[0036] 表 3, 4及び図 3に示した如ぐ健常人群では A 1— 42の分解率が AD群と比較し て高いことが確認された。このことは健常人群では血液中 A |8 1—42の分解能が AD 群よりも高いことを示している。また、 t検定によると二群間には有意差があると判定さ れた (Pく 0. 01)ことから、本発明の手法は血清検体での AD診断に使用しえること が確認された。
[0037] (実施例 2) 6E10抗体と 21F12抗体での電気化学発光二抗体サンドイッチ免疫測 定法による、 AD患者及び健常人血清の A |8 1—42分解速度比較
一次抗体として A β 1—42の 10— 16アミノ酸部位を認識する 6E10マウスモノクロ ーナル抗体 (ケミコン社製)を使用し、二次抗体として A j8 1—42の C末端部分認識 抗体である 21F12マウスモノクローナル抗体 (イノジエネテイクス社製）をルテニウム 錯体標識して使用した。 6E10抗体結合磁気ビーズの調製方法、ルテニウム錯体標 識 21F12抗体の調製方法及び二抗体サンドイッチ免疫測定法は、実験例 1と同様 の方法で行った。結果を表 5, 6及び図 4に示す。
[0038] [表 5] 実施例 2の AD患者サンプルの結果
Figure imgf000019_0001
[0039] [表 6] 実施例 2の健常人サンプルの結果
Figure imgf000020_0001
[0040] 表 5, 6及び図 4に示した如ぐ健常人群では A |8 1 42の分解率が AD群と比較し て高いことが確認された。また、実施例 1と同様に、 t検定において AD患者と健常人 の二群の間には有意差があると判定された（P< 0. 01)。このことから A j8 1— 42の N末端の 1—5アミノ酸部位を認識する 3D6抗体の代わりに、 10— 16アミノ酸部位を 認識する抗体である 6E10抗体を使用してサンドイッチ測定法を行っても、 AD診断 が可能であることが確認された。
産業上の利用可能性
[0041] 血液中の A β 1 42分解酵素活性を確認できる本方法によって、血液検体 (血清 、血漿）でのアルツハイマー病を診断することにある。

Claims

請求の範囲
[1] 検体血液成分の、 β—アミロイド分解活性を測定することを特徴とするアルッノ、イマ 一病の検定方法。
[2] β—アミロイド分解活性を測定する方法が、前記検体血液に、 β—アミロイドぺプ チドを添加して、該ペプチドを分解する活性を測定し、健常者血液の該分解活性と 比較することを特徴とする、請求項 1に記載のアルツハイマー病の検定方法。
[3] 前記検体血液に添加する β アミロイドペプチドが、 β アミロイド 1—42であるこ とを特徴とする、請求項 2に記載のアルッノ、イマ一病の検定方法。
[4] 前記検体血液に添加した j8—アミロイドペプチドの残存量を免疫学的測定法により 測定して、前記検体血液の j8—アミロイドペプチドの分解活性を測定することを特徴 とする、請求項 2に記載のアルッノ、イマ一病の検定方法。
[5] 前記免疫学的測定法が、前記検体血液に添加する β アミロイドペプチドの C末 端部分を認識する抗体及び Ν末端部分を認識する抗体を使用する二抗体サンドイツ チ免疫測定法であることを特徴とする、請求項 4に記載のアルツハイマー病の検定方 法。
[6] 前記検体血液が血清又は血漿であることを特徴とする、請求項 1〜5のいずれか 1 項記載のアルツハイマー病の検定方法。
[7] 検体血液に添加する j8—アミロイドペプチド、該 j8—アミロイドペプチドの C末端部 分を認識する抗体及び該 β アミロイドペプチドの Ν末端部分を認識する抗体を必 須の構成成分とし、検体血液に添加した該 j8—アミロイドペプチドの残存量を測定す ることにより、検体血液の j8—アミロイドペプチド分解活性を測定することを特徴とす る、アルツハイマー病の診断試薬。
[8] 前記 β—アミロイドペプチドが、 β—アミロイド 1—42であることを特徴とする、請求 項 7に記載のアルッノヽイマ一病の診断試薬。
[9] 前記 β—アミロイドペプチドの C末端部分を認識する抗体が、 21F12であることを 特徴とする、請求項 8に記載のアルツハイマー病の診断試薬。
[10] 前記検体血液が血清又は血漿であることを特徴とする、請求項 7〜9のいずれか 1 項記載のアルツハイマー病の診断試薬。
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