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WO2007108505A1 - エリスロポエチン溶液製剤 - Google Patents

エリスロポエチン溶液製剤 Download PDF

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Publication number
WO2007108505A1
WO2007108505A1 PCT/JP2007/055860 JP2007055860W WO2007108505A1 WO 2007108505 A1 WO2007108505 A1 WO 2007108505A1 JP 2007055860 W JP2007055860 W JP 2007055860W WO 2007108505 A1 WO2007108505 A1 WO 2007108505A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
epo
protein
erythropoietin
preparation
solution
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/055860
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hidefumi Mizushima
Takayuki Yoshimori
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha filed Critical Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority to US12/293,493 priority Critical patent/US8546329B2/en
Priority to JP2008506332A priority patent/JP5553506B2/ja
Priority to EP07739303A priority patent/EP1997505A4/en
Publication of WO2007108505A1 publication Critical patent/WO2007108505A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Definitions

  • the present invention relates to an erythropoietin-containing solution formulation, and in particular, the formation of a dimer with little loss of an active ingredient and the generation of a degradation product are significantly suppressed even after long-term storage, and pain during use is reduced. It relates to an erythropoietin-containing solution formulation.
  • the present invention further relates to a method for quantifying a trace amount of protein useful for the quantification and purity test of the erythropoietin-containing solution preparation.
  • Erythropoietin an acidic glycoprotein hormone that promotes the differentiation and proliferation of erythroid progenitor cells (hereinafter sometimes referred to as EPO), is produced in large amounts as recombinant human EPO by genetic engineering methods. Produced, the applicant has succeeded in formulating this purified EPO, and supplies products to the market in the form of lyophilized or solution preparations as renal anemia ameliorating agents.
  • the formulation design for supplying stable EPO solution preparations to the plant includes leucine, tryptophan, serine, gnoretamic acid, arginine, histidine and lysine and their salt strength as a stabilizing agent.
  • An EPO solution formulation has been proposed (Japanese Patent Application No. 11-52314).
  • EP ⁇ is known to be acidic and stable around pH 6.0.
  • a weakly acidic pH 6.0 product that is slightly separated from in-vivo pH is supplied to the market as an EP 0 solution formulation that is stable even after long-term storage.
  • subcutaneous injection of weakly acidic solution preparations is expected to cause pain, and there is a need to develop EPO solution preparations that improve usability and are stable for long-term storage.
  • the present inventors have used poxsummer as a surfactant, and are stable for a long period of time even when the pH is about 7.0, and injection.
  • the present invention has been completed by finding that it can be an erythropoietin-containing solution preparation with reduced pain upon administration.
  • the present invention provides the following.
  • a method for suppressing the formation of an erythropoietin dimer after long-term storage of an erythropoietin-containing solution preparation which comprises adding poloxamers.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of measuring the EPO concentration and EPO dimer at various concentrations, creating a calibration curve, and confirming the detection limit.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the hPM-1 and hPM-1 dimers at various concentrations, creating a calibration curve, and confirming the detection limit.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of a purity test method in which EPO was measured using fluorescent dyes Cy5, Alexa 647 and HiLyte Fluor 647.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of a purity test method in which BSA was measured using fluorescent dyes Cy5, Alexa 647 and HiLyte Fluor 647.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of a purity test method in which BSA was measured with a microelectrophoresis system using the fluorescent dye Cy5.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of a purity test method in which BSA was measured with a microelectrophoresis system using the fluorescent dye Alexa 647.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of a purity test method in which BSA was measured with a microelectrophoresis system using a fluorescent dye HiLyte Fluor 647.
  • the EPO used in the preparation of the present invention is a force that can be used in any EPO, preferably a highly purified EPO, and more specifically, a mammalian EPO, particularly a human EPO. Have the same biological activity.
  • the EPO used in the present invention may be produced by any method, for example, natural human EPO (JP-B 1-38800, etc.) obtained by purifying from human-derived extracts, ,Ah Alternatively, it can be produced by genetic engineering techniques in E. coli, yeast, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), C127 cells, COS cells, myeloma cells, BHK cells, insect cells, etc., and extracted, separated and purified by various methods. Human EPO etc. can be used. EPO used in the present invention is preferably EPO produced using mammalian cells (especially CHO cells) preferred by EPO produced by genetic engineering techniques (for example, Japanese Patent Publication No. 1-44317). Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810 (1985)).
  • EPO obtained by the genetic recombination method has the same amino acid sequence as naturally-occurring EPO, or one or a plurality of amino acids in the amino acid sequence deleted, substituted, attached, etc. It may have the same biological activity as naturally occurring EPO.
  • Amino acid deletion, substitution, addition and the like can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, those skilled in the art will recognize site-directed mutagenesis (Gotoh, T. et al. (1995) Gene
  • amino acid side chain properties include hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), amino acids having aliphatic side chains (G, A, V, L, I, P), amino acids having hydroxyl-containing side chains (S, T, ⁇ ), sulfur atom-containing side chains Amino acids with amino acids (C, M), amino acids with carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids with side chains containing bases (R, K, ⁇ ), aromatics Amino acids having side chains (H, F, Y, W) can be listed (the parentheses indicate single letter amino acids).
  • a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by one or more amino acid residues to a certain amino acid sequence does not retain its biological activity.
  • sugar chains such as NESP (Novel Erythropoietin Stimulating Protein: W085 / 02610, W091 / 05867, WO95 / 05465, etc.), which is a sugar chain modified EP0 with sialic acid attached to the N-terminus of EP0 It may be a modified EP 0 analog.
  • NESP Novel Erythropoietin Stimulating Protein: W085 / 02610, W091 / 05867, WO95 / 05465, etc.
  • a fusion protein of EPO and another protein it is also possible to use a fusion protein of EPO and another protein.
  • DNA encoding EPO and DNA encoding another protein are linked so that the frames coincide with each other, introduced into an expression vector, and expressed in a host.
  • Other proteins that are subjected to fusion with the EPO of the present invention are not particularly limited.
  • chemically modified EPO examples include, for example, EPO to which a compound such as polyethylene glycol 'vitamin B 12 or the like, or an inorganic or organic compound is bound. Specific examples include polyethylene glycolated EPO described in JP-A-2001-64300.
  • EPO-containing solution preparation of the present invention by adding poloxamers, an erythropoietin-containing solution preparation that is stable for a long period of time even when the pH is about 7.0, and pain during injection administration is reduced. can do.
  • EPO-containing solution preparation of the present invention having a pH of about 7.0 to which poloxamers are added, as shown in the examples described later, it has become clear that pain is suppressed without the addition of saccharides such as mannitol. It was.
  • Poloxamers are non-ionic surfactants that are used in protein solution formulations and as anti-adsorption agents for containers.
  • a copolymer of ethylene oxide and propylene oxide is used. means. Specific examples include a series of block copolymers of ethylene oxide and propylene oxide having the following general formula: HO (C H O) (C H O) (C H O) H
  • Poloxamer is listed in USP (US Pharmacopeia) 124, 188, 237, 338, 407 force.
  • poloxamer 188 described in USP has a of 80, b of 27, The average molecular weight is 7680-9510, and poloxamer 188 described in BP (British Pharmacopoeia) has an a of about 75, b of about 30, and an average molecular weight of 8350.
  • poloxamers 182, 184 and 331 are described in EP (European Pharmacopoeia).
  • Poloxamer 108, 335, 403, etc. can also be used.
  • Pluronic (Trademark of BASF Corporation of Poloxamer) includes Pluronic L35, L43, L44, L61, L62, L64, F68, L81, P84, P85, F87, F88, L92, F98, L101, P103, P104, There are P105, F108, L121, P123, F127 force S, and these are also included in the poloxamer in the present invention.
  • the number of a and b in the above structural formula is generally a combination of 2 to 128 and 16 to 67, preferably a combination of 11 to 100 and 16 to 67, and more preferably 50 to 100, 20 to There are 40 combinations.
  • the average molecular weight is generally 1000 to 15000, preferably 200 to 10,000, and more preferably 700 to 10,000.
  • EPO after long-term storage is longer than the formulation using polyoxyethylene hydrogenated castor oil or polysorbate as a surfactant in any formulation using a poloxamer surfactant. Dimer formation was suppressed and found to be stable.
  • Preferred poloxamers are poloxamers 108, 124, 188, 335, and 403, and poloxamers 188 are the most preferred.
  • the amount of poloxamer added varies depending on the type of poloxamer used. Generally, it is 0.0001 to 10%, preferably 0.001 to 0.5%, more preferably 0.005 to 0.1%.
  • the weight ratio of cocoon / poloxamer 188 is 0.001 to 5, preferably 0.017 to 1.2.
  • soot-containing solution preparation of the present invention by using a poloxamer as a surfactant, it is stable even in the vicinity of ⁇ 7.0, that is, the residual rate of soot is high even after long-term storage.
  • amino acid may be added as a stabilizer to the protein-containing preparation of the present invention.
  • Amino acids added as stabilizers include free amino acids, salts such as sodium salts, potassium salts and hydrochlorides thereof. Amino acids can be added by combining one or more amino acids.
  • the amino acid added as a stabilizer is not particularly limited, but a preferred amino acid is used. Preferred examples of the nonacid include leucine, tryptophan, serine, gnoretamic acid, anoleginine, histidine, and lysine.
  • the amino acid is histidine, arginine, or a salt thereof.
  • amino acids are L-amino acid power S-preferred. The most preferred amino acid is L histidine.
  • the preferred amount of amino acid added can be determined depending on the type of amino acid used. Generally 0.0001-5%, preferably 0.01-4% for arginine, more preferably 0.1-1%, preferably 0.05-1% for histidine, more preferably 0.05-0.5%, most preferably 0.05-0.2%.
  • the ⁇ ⁇ of the protein preparation of the present invention is ⁇ 6.5 to 7.5, preferably ⁇ 6.8 to 7.2, and most preferably ⁇ is about 7.0.
  • the solution-containing solution preparation of the present invention is preferably substantially free of proteins such as human serum albumin and purified gelatin as a stabilizer.
  • proteins such as human serum albumin and purified gelatin as stabilizers.
  • proteins such as human serum albumin or purified gelatin as stabilizers to suppress chemical and physical changes in the protein.
  • the addition of protein as a stabilizer has problems such as requiring a very complicated process for removing viral contamination.
  • the amount of soot contained in the solution preparation of the present invention is generally 100 to 500,000 IU / ml, preferably 200 to 200,000 IU / ml, more preferably 750 to 108000 IU / ml, most preferably 1500 to: 108000 IU / ml.
  • the EPO solution preparation of the present invention has an EPO content of 3 ⁇ 48000 IU / mL
  • the EPO residual rate after an accelerated test at 35 ° C for one month is 95% or more, preferably 97% or more.
  • the rate of formation of the polymer is 1.0% or less, preferably 0.7% or less, or the EP0 residual rate after the accelerated test at 35 ° C—3 months is 93% or more, preferably 95% or more.
  • the dimer production rate is 1.2% or less, preferably 1.0% or less.
  • the therapeutic agent of the present invention includes, as necessary, a suspending agent, a solubilizing agent, a stabilizer, an isotonic agent, a preservative, an adsorption inhibitor, a diluent, an excipient, and a pH adjuster. Further, a soothing agent, a buffering agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like can be appropriately added.
  • suspending agents include methyl cellulose, polysonolebate 80, hydroxyethyl cell mouth Sugar, gum arabic, tragacanth powder, sodium carboxymethylcellulose, polyoxy
  • solution auxiliary examples include polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polysorbate 80, nicotinic acid amide, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, tuna gol, castor oil fatty acid ethyl ester, and the like.
  • Examples of the stabilizer include dextran 40, methylcellulose, gelatin, sodium sulfite, and sodium metasulfite.
  • Examples of the isotonic agent include D-mannitol, sorbitol, sodium chloride and the like.
  • Examples of the preservative include methyl noroxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, sorbic acid, phenol, cresol, black mouth talesol and the like.
  • adsorption inhibitor in addition to poloxamers, for example, human serum anolebumin, lecithin, dextran, hydroxypropylcellulose, methylcellulose, polyoxyethylene hardened castor oil, polyethylene glycol and the like may be added.
  • sulfur-containing reducing agent examples include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocysteine, thiotate acid, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycolic acid and its salts, thio Examples thereof include those having a sulfhydryl group such as sodium sulfate, dartathione, and thioalkanoic acids having 1 to 7 carbon atoms.
  • Antioxidants include, for example, erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, ptylhydroxyesol, ⁇ -tocopherol, tocopherol acetate, L-ascorbic acid and its salts, L-ascorbyl palmitate, L-ascorbic acid stearate, hydrogen sulfite
  • the chelating agent include sodium, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate, or disodium ethylenediamine tetraacetate (EDTA), sodium pyrophosphate, and sodium metaphosphate.
  • inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, sodium phosphate, potassium phosphate, sodium bicarbonate; organic salts such as sodium citrate, potassium citrate, sodium acetate, etc. Usually added components may be included.
  • a phosphate buffer preferably monohydrogen phosphate
  • a solution formulation is prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulations such as sodium dihydrogen phosphate and / or citrate buffer (preferably sodium citrate buffer).
  • the EP 0 solution formulation of the present invention is usually contained in a sealed or sterilized plastic or glass container, for example.
  • the container can be supplied in a prescribed dosage form such as an ampoule, vial or disposable syringe, or it can be provided in a large dosage form such as an injection bag or bottle. It is convenient to provide it in the form of a prefilled syringe.
  • the stabilized protein preparation of the present invention is usually administered by a parenteral administration route such as injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc. Oral administration is also possible.
  • parenteral administration route such as injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, etc.), transdermal, transmucosal, nasal, transpulmonary, etc.
  • Oral administration is also possible.
  • the present invention further provides a method for quantifying a trace amount of protein useful for the quantification and purity test of the EPO-containing solution preparation of the present invention.
  • the present invention provides a qualitative, quantitative, and purity test method for trace proteins that is as sensitive as immunostaining and is versatile.
  • the trace protein quantification method of the present invention includes the following steps:
  • a fluorescent reagent is used in order to increase sensitivity.
  • Fluorescent gel staining reagents for fluorescent staining of electrophoresed gels include Ruby stain and SYPRO orange. Power Although these are more quantitative than the silver staining method, they have poor detection sensitivity, and are post-electrophoresis staining similar to silver staining, and therefore require complicated staining procedures.
  • the fluorescent reagent Cyanine Dye used this time is not suitable for post-electrophoresis staining, but it has a strong covalent bond with proteins via NHS (N-hydroxysuccinimide) or maleimide. Proteins can be stained before.
  • the desired analyte in the above step 2) is a conjugate of a protein and a fluorescent dye, and includes those bound via NHS, Maleimide or the like.
  • any method can be used as long as it is a method of chemically binding a fluorescent dye to an NH group or SH group of a general protein. But you can also follow the instructions for each high-intensity fluorescent dye on the market.
  • the reaction temperature is usually within the range of 0 ° C to 50 ° C, and specifically, the reaction temperature described in each instruction of the commercially available high-intensity fluorescent dye may be used.
  • the sample in order to stain the protein of the sample uniformly, the sample is not frozen in a low temperature condition, preferably 0 ° C to 10 ° C, more preferably 0 ° C to 5 ° C. It may be performed at ° C, most preferably at about 1 ° C.
  • Cyanine Dye enables detection of several tens of pg / band, which is equivalent to or higher than immunostaining, and can be used for qualitative tests. Furthermore, it is possible to quantify trace protein solutions using standard calibration curves and internal standard substances. In addition, it has a quantitative range (several tens of pg to 100 ng / band) on the order of 10 4 and accurately evaluates the content of impurities such as aggregates of 0.1% or less as a purity test without using standard products. It is possible.
  • fluorescent dye of the present invention directly or NHS, strongly covalently bonded and protein via a Maleimide, if a fluorescent dye having a 10 4 or more wide range of quantification (dynamic range) Anything can be used, for example, Cy3, Cy3.5, Cy5, and Cy5.5 M Cyanin e Dye dyes such as ono-reactive Dye (NHS type and Maleimide type) (manufactured by GE Healthcare) can be used, and NH3 type of Cy3 Mono-reactive Dye is preferred
  • High-sensitivity fluorescent dyes of the present invention include Sulfonated Coumarin and Sulfonated rhodamine Dye, Alexa Fluor 350, 405, 430, 488, 532, 546, 555, 568, 594, 63 3, 647, 680, 700, and 750 protein labeling kits (Molecular Probes) and HiLyte Fluor 555, 647 and other protein labeling kits (Doujin Chemical) can also be used.
  • means for appropriately separating a desired analyte from a sample include general electrophoresis methods such as SDS-PAGE, capillary electrophoresis, and microchip electrophoresis, and gel filtration chromatography using HP LC. Can be separated by chromatography, ion-exchange chromatography, reversed-phase chromatography, etc., preferably by electrophoresis or HPLC separation means
  • EPO in an EPO-containing solution preparation could be quantified with high sensitivity.
  • the quantification method of the present invention can be used for quantification of proteins other than EPO.
  • a good calibration curve was obtained with various concentrations of protein in the quantification of the antibody protein hPM_l, which is a humanized anti-IL_6 receptor antibody, and BSA (usi serum albumin). In any condition, it was possible to detect with very high sensitivity. Therefore, the method of the present invention is extremely excellent as a method for quantifying a minute amount of protein solution, and its application range is wide.
  • EPO sample genetically modified EP 0 (manufactured by Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) using CHO cells was used.
  • Example 1 Prescription pain comparison test
  • Formula 4 has a higher EPO residual rate than Formula 3, and the formation of dimers and degradation products are significantly suppressed, confirming that Formula 4 is stable.
  • DMSO in which a fluorescent reagent (NH3 type of Cy3 Mono-reactive Dye) is dissolved is added to the sample diluted to EPO concentration 1250IU.
  • sample buffer containing SDS is added and heated at 50 ° C for 15 minutes A 15 zL sample was tested by electrophoresis. The electrophoresed gel was read with an image analyzer, and the peak area% of the dimer was calculated.
  • a sample buffer containing SDS and mercaptoethanol was added to a sample diluted to an EPO concentration of 3000 IU and heated at 50 ° C for 15 minutes, and then 7.5 ⁇ L was tested by electrophoresis. Detection was performed by Western plotting using an anti-epileptic antibody, and the amount of low molecular weight degradation product of the sample was also calculated with a calibration linear force of 25 to 500 ng / mL degradation product.
  • Formulations 10 to 14 using poloxamer as a surfactant produce dimers in an accelerated test at 35 ° C _ 3 months compared to a formulation using polyoxyethylene hydrogenated castor oil or polysorbate as a surfactant. t was significantly less stable. Poloxama A series of surfactants all inhibited the formation of EPO dimers.
  • a formulation with pH 7.0 and poloxamer 188 as a surfactant was subjected to a stability test to confirm the effect of the EPO content on the stability.
  • Example 5 Examination of EPO purity test method using Cyanine Dye (Cy3)
  • EPO standard addition EPO concentration lmg / mL
  • Polys orbate80 pH 7 4
  • dilution buffer to a respective content of EPO A solution was prepared.
  • EPO dimer is added to 1250 IU / mL EPO solution, 0.094-2.256% of EPO
  • the antibody protein hPM-1 used in the following tests is a humanized anti-IL-6 receptor antibody (see International Patent Application Publication No. W092-19759).
  • hPM-1 1.25 ⁇ g / mL to 40 ⁇ g / mL and hPM-1 dimer concentration 2.5 ng / mL to 1280 ng / mL in 60 zL Cy3 stock solution (Cy3 Mono-reactive Dye NHS type 1 vial Was dissolved in 100 zL DMSO) and reacted at about 1 ° C for 4 hours. After completion of the reaction, 24 ⁇ L of sample buffer containing SDS was added and heated at 50 ° C. for 15 minutes, and then 15 ⁇ L was subjected to electrophoresis. Using a fluorescent image analyzer, the gel was read, a calibration curve was created, and the detection limit was confirmed. Figure 2 shows the results obtained.
  • the peak could not be detected at 5 ng / mL, with a solution of 1013 ⁇ 4 / 111 to 128013 ⁇ 4 / 111 (1 ⁇ ⁇ 11 conversion: 107 ⁇ to 1 3.7 ng).
  • a good calibration curve (R 2 0.9963) was obtained, and it was possible to detect with extremely high sensitivity of 107 pg per lWell.
  • the maximum C.V. is about 7%, confirming that the accuracy is good.
  • Cy5 stock solution (Cy5 Mono-reactive Dye NHS type 1 vial dissolved in 100 ⁇ L of DMSO) in ⁇ L
  • Alexa 647 stock solution (10 ⁇ L of Alexa 647 NHS type 1 vial) 1 ⁇ L or 1 ⁇ L of HiLyte Fluor 647 stock solution (1 mL of HiLyte Fluor 647 NHS type 1 vial dissolved in 10 ⁇ L DMSO).
  • C was allowed to react for 18 hours.
  • dilution buffer (0.005% Polysorbate80 containing 0 • 1M phosphate buffer ( ⁇ 7.4)) with a common ratio of 6 concentrations from 0.046 ng / mL to l l.
  • Example 8 High sensitivity study by prestin in micro-electrophoresis system (1) Confirmation of detection limit

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Abstract

　本発明は、ポロクサマー類を含み、ｐHが6.5～7.5である、エリスロポエチン含有溶液製剤に関する。本発明はまた、以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法に関する： １）タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる； ２）得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する； ３）所望の分析物を定量して、その量からタンパク質の量を換算する。                                                                               

Description

明 細 書
エリスロポエチン溶液製剤
技術分野
[0001] 本発明はエリスロポエチン含有溶液製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分 の損失が少なぐ二量体の生成、分解物の生成が顕著に抑制され、かつ使用時の疼 痛を軽減することができる、エリスロポエチン含有溶液製剤に関する。
[0002] 本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な 微量タンパク質の定量方法にも関する。
背景技術
[0003] 赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであるエリス ロポェチン (以下において EPOと記載することもある）は、遺伝子工学的方法によつ て組換えヒト EPOとして大量に生産され、本願出願人はこの精製した EPOの製剤化 に成功し、腎性貧血改善剤などとして、凍結乾燥製剤または溶液製剤の形で市場に 製品を供給している。
[0004] 安定な EPO溶液製剤を巿場に供給するための処方設計では、ロイシン、トリプトフ アン、セリン、グノレタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩力 選 択されるアミノ酸を安定化剤として含む EPO溶液製剤が提案されている（特願平 11 — 52314号）。
[0005] 生理活性タンパク質溶液の安定性はその溶液の pHに大きく依存し、酸性の方が比 較的安定である。 EP〇では pH6. 0付近の酸性で安定であることが知られている。長 期間保存しても安定な EP〇溶液製剤として、現在市場に供給されているのは、生体 内 pHからやや離れた弱酸性の pH6. 0の製品である。しかし、弱酸性の溶液製剤を 皮下注射すると疼痛を伴うことが予測され、さらに使用性を改善し、かつ長期間保存 にも安定な EPO溶液製剤の開発が求められている。
[0006] 注射用製剤の投与時の疼痛を軽減する方法としてマンニトールなどの糖類を添カロ することが提案されている（WO 02/11753)。
[0007] また、界面活性剤としてポロクサマーを含有する抗体製剤が報告されている (WO 2 004/075913)が、 EPOを含む溶液製剤の安定性や、注射時の疼痛については記載 がない。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の目的は、注射時の疼痛を軽減し、し力も長期の保存にも安定な EPO溶液 製剤を提供することである。本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の 定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法を提供することも目的とする。 課題を解決するための手段
[0009] 上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは界面活性剤としてポ 口クサマーを使用することにより、 pHが約 7. 0であっても長期間安定で、かつ注射投 与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン含有溶液製剤となしうることを見いだし本 発明を完成した。
[0010] すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)ポロクサマー類を含み、 pHが 6.5〜7.5である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
(2)ポロクサマーがポロクサマー 188である（1)記載の製剤。
(3)さらに、安定化剤としてアミノ酸又はその塩を含む（1)記載の製剤。
(4)アミノ酸がヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である（3)記載の製剤。
(5) pHが、 6·8〜7·2である、（1)〜（4)のいずれかに記載の製剤。
(6)ポロクサマー類を含み、安定化剤として L ヒスチジンを含み、かつ pH力 ¾.8〜7. 2である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
(7)安定化剤としてのタンパク質を含まない、請求項（1)〜（6)のいずれかに記載の 製剤。
(8)安定化剤として糖類を含まない、 （1)〜（7)のいずれかに記載の製剤。
(9)ポロクサマー類を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保 存後におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。
(10)以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法：
1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；
2)得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する； 3)所望の分析物を定量して、その量力 タンパク質の量を換算する。
(11)高輝度蛍光色素が Cyanine Dye系色素である（10)記載の方法。
(12)高輝度蛍光色素が Cy3である（11)記載の方法。
(13)分離手段が電気泳動または高速液体クロマトグラフィー (HPLC)である（10)〜 (12)のいずれかに記載の方法。
(14)微量タンパク質がエリスロポエチンである（10)〜（： 13)のいずれかに記載の方 法。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]図 1は、 EPO濃度及び EPO二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し 、検出限界を確認した結果を示す図である。
[図 2]図 2は、 hPM-1及び hPM-1二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し、 検出限界を確認した結果を示す図である。
[図 3]図 3は、 EPOを蛍光色素 Cy5、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いて測定 した純度試験法の結果を示すグラフである。
[図 4]図 4は、 BSAを蛍光色素 Cy5、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いて測定し た純度試験法の結果を示すグラフである。
[図 5]図 5は、 BSAを蛍光色素 Cy5を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純 度試験法の結果を示すグラフである。
[図 6]図 6は、 BSAを蛍光色素 Alexa 647を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定 した純度試験法の結果を示すグラフである。
[図 7]図 7は、 BSAを蛍光色素 HiLyte Fluor 647を用いて、マイクロ電気泳動システム で測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の製剤に使用する EPOは、どのような EPOでも用いることができる力 好ま しくは高度に精製された EPOであり、より具体的には、哺乳動物 EPO、特にヒト EPO と実質的に同じ生物学的活性を有するものである。
[0013] 本発明で用いる EPOは、いかなる方法で製造されたものでもよぐ例えば、ヒト由来 の抽出物から精製して得られた天然のヒト EPO (特公平 1-38800号公報、など）や、あ るいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細 胞（CHO細胞）、 C127細胞、 COS細胞、ミエローマ細胞、 BHK細胞、昆虫細胞、な どに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒト EPOなどを用いることができ る。本発明において用いられる EP〇は、遺伝子工学的手法により製造された EPOが 好ましぐ哺乳動物細胞（特に CHO細胞）を用いて製造された EPOが好ましい（例え ば、特公平 1-44317号公報、 Kenneth Jacobs et al.， Nature, 313 806-810 (1985)、な ど)。
遺伝子組換え法により得られる EP〇には、天然由来の EP〇とアミノ酸配列が同じ であるもの、あるいは該アミノ酸配列中の 1または複数のアミノ酸を欠失、置換、付カロ 等したもので、天然由来の EPOと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよ レ、。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能であ る。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene
152， 271-275 ;Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100， 468-500 ; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 ; Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350- 367 ; Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 82， 488-492 ; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85， 2763-2766)などを用 いて、 EPOのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、 EPOと機能的に同等なポリ ペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。 一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されてい る別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎 水性アミノ酸 (A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水性アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、脂肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側 鎖を有するアミノ酸（S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボ ン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミ ノ離 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることがで きる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。あるアミノ酸配列に対する 1 又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修 飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはす でに知られている（Mark, D.F. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81 , 5662-56 66 ; Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487-6500 ; Wang, A . et al. , Science 224, 1431-1433； Dalbadie-McFarland, G. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413)。また、 EP〇の N末端にシアル酸が付着した糖鎖改 変体 EP〇である NESP (Novel Erythropoietin Stimulating Protein: W〇85/02610、 W 091/05867、 WO95/05465等に記載）などの糖鎖の改変された EP〇類似体であつ てもよい。
[0015] 又、 EPOと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリ ペプチドを作製するには、例えば、 EPOをコードする DNAと他のタンパク質をコード する DNAをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で 発現させればよい。本発明の EPOとの融合に付される他のタンパク質としては、特に 限定されない。
[0016] 又、化学修飾した EPOを用いることも可能である。化学修飾した EPOの例としては 、例えば、ポリエチレングリコール 'ビタミン B 12等、無機あるいは有機化合物等の化 合物を結合させた EPOなどを挙げることができる。具体的には、特開 2001-64300な どに記載のポリエチレングリコール化 EPOなどを挙げることができる。
[0017] 本発明の EPO含有溶液製剤では、ポロクサマー類を添加することにより、 pHが約 7 . 0であっても長期間安定で、かつ注射投与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン 含有溶液製剤とすることができる。ポロクサマー類を添加した pHが約 7. 0の本発明 の EPO含有溶液製剤では、後述する実施例に示すように、マンニトールなどの糖類 を添加しなくても疼痛が抑制されることが明らかとなった。
[0018] ポロクサマーは非イオン性の界面活性剤であって、タンパク質溶液製剤にぉレ、ては 容器への吸着防止剤としても使用され、一般的にはエチレンオキサイドとプロピレン オキサイドの共重合体を意味する。具体的には、以下の一般式を有するエチレンォ キサイドとプロピレンオキサイドのブロック共重合体のシリーズなどが挙げられる： HO (C H O) (C H O) (C H O) H
2 4 a 3 6 b 2 4 a
ポロクサマーに fまポロクサマー 124、 188、 237、 338、 407力 USP (米国薬局方） に収載されている。 USP記載のポロクサマー 188は上記式における aが 80、 bが 27、 平均分子量が 7680— 9510であり、 BP (英国薬局方）記載のポロクサマー 188は上 記式における aが約 75、 bが約 30、平均分子量が 8350である。さらに、 EP (欧州薬 局方）にはこれ以外に、ポロクサマー 182、 184、 331が記載されている。これら以外 に、ポロクサマー 108、 335、 403なども使用できる。また、 Pluronic (ポロクサマーの B ASF社の商標）としては、 Pluronic L35, L43、 L44、 L61, L62, L64, F68、 L81、 P84、 P85、 F87、 F88、 L92、 F98、 L101、 P103、 P104、 P105、 F108、 L121 , P123、 F127力 Sあり、これらのものも本発明におけるポロクサマーに含まれる。上記 構造式における a、 bの数は一般的に 2〜128、 16〜67の組み合わせであり、好ましく は、 11〜100、 16〜67の組み合わせであり、さらに好ましくは、 50〜100、 20〜40の組 み合わせである。また、平均分子量は一般的に 1000〜 15000であり、好ましくは、 200 0〜10000であり、さらに好ましくは、 7000〜10000である。
[0019] 後述する実施例に示すように、ポロクサマー系の界面活性剤を用いた処方ではい ずれも、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油やポリソルベートを界面活性剤として用いた 処方よりも長期保存後の EPO二量体の生成が抑制され、安定であることが判明した 。好ましレヽポロクサマー ίまポロクサマー 108、 124、 188、 335、 403であり、最も好ま しいのはポロクサマー 188である。
[0020] ポロクサマーの添加量は使用するポロクサマーの種類により異なる力 一般には 0.0 001〜10%であり、好ましくは 0.001〜0.5%であり、さらに好ましくは 0·005〜0· 1%であり、 また、 ΕΡΟ/ポロクサマー 188の重量比率としては、 0.001〜5であり、好ましくは 0.017 〜1.2である。
[0021] 本発明の ΕΡΟ含有溶液製剤では、界面活性剤としてポロクサマーを使用すること により、 ρΗ7. 0付近でも安定、すなわち長期間保存した後にも ΕΡΟの残存率が高く 、二量体や分解物の生成が抑制され、かつ疼痛の軽減された ΕΡ〇含有溶液製剤と すること力 Sできた。
[0022] 本発明のタンパク質含有製剤には安定化剤としてアミノ酸を添加してもよい。安定 化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩 酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は 1種又は 2種以上を組み合わせて添カ卩する こと力 Sできる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されなレ、が、好ましいアミ ノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グノレタミン酸、ァノレギニン、ヒスチジン、 リジンを挙げることができる好ましレ、アミノ酸はヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩 である。また、アミノ酸は L アミノ酸力 S好ましレ、。最も好ましいアミノ酸は L ヒスチジ ンである。
[0023] アミノ酸の添加量は、使用するアミノ酸の種類により、好ましい範囲を定めることがで きる。一般には 0.0001〜5%、アルギニンでは好ましくは 0.01〜4%、さらに好ましくは 0.1 〜1%であり、ヒスチジンでは好ましくは 0.05〜1%、さらに好ましくは 0·05〜0·5%、最も 好ましくは 0.05〜0.2%である。
[0024] 本発明のタンパク質製剤の ρΗは、 ρΗ6. 5〜7. 5であり、好ましくは ρΗ6. 8〜7. 2 であり、最も好ましくは ρΗが約 7. 0である。
[0025] 本発明の ΕΡ〇含有溶液製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精 製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。現在市場に供給されているタンパ ク質製剤には、タンパク質の化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤としてヒ ト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある 。しカゝしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコン タミを除去するために非常に煩雑な工程を必要とすることになるなどの問題がある。
[0026] 本発明の溶液製剤に中に含まれる ΕΡΟの量は、一般には 100〜500000IU/ml 、好ましくは 200〜200000IU/ml、さらに好ましくは 750〜： 108000IU/ml、最も 好ましくは 1500〜： 108000IU/mlである。
[0027] 本発明の EPO溶液製剤は、 EPO含量力 ¾8000IU/mLである場合、 35°C— 1ケ 月間の加速試験後における EPO残存率が 95%以上、好ましくは 97%以上であり、 二量体生成率が 1. 0%以下、好ましくは 0. 7%以下であるか、 35°C— 3ヶ月の加速 試験後における EP〇残存率が 93%以上、好ましくは 95%以上であり、二量体生成 率が 1. 2%以下、好ましくは 1. 0%以下である。
[0028] 本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤 、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、 pH調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元 剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。
[0029] 懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソノレべート 80、ヒドロキシェチルセル口 ース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシ
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[0030] 溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート 80、ニコチ ン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪 酸ェチルエステル等を挙げることができる。
[0031] 安定化剤としては、デキストラン 40、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム 、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。
[0032] 等張化剤としては例えば、 D—マンニトール、ソルビート、塩化ナトリウム等を挙げる こと力 Sできる。
[0033] 保存剤としては例えば、ノ ラオキシ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、 ソルビン酸、フエノール、クレゾール、クロ口タレゾール等を挙げることができる。
[0034] 吸着防止剤としてはポロクサマー類以外に、例えば、ヒト血清ァノレブミン、レシチン、 デキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬 化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を加えてもよレ、。
[0035] 含硫還元剤としては例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセチルホモシスティン 、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリセロール、チォソルビ トール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、ダルタチオン、炭素原子 数 1〜 7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。
[0036] 酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、プチルヒ ドロキシァエソール、 α—トコフエロール、酢酸トコフエロール、 L—ァスコルビン酸及 びその塩、 Lーァスコルビン酸パルミテート、 Lーァスコルビン酸ステアレート、亜硫酸 水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食子酸プロピルあるいはェ チレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム 等のキレート剤が挙げられる。
[0037] さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩ィ匕カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸力 リウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩;クェン酸ナトリウム、クェン酸カリウム、酢酸 ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。
[0038] 本発明の ΕΡ〇溶液製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液 (好ましくはリン酸一水素 ナトリウム リン酸二水素ナトリウム系）及び/又はクェン酸緩衝液 (好ましくはクェン 酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解すること によって溶液製剤を調製する。
[0039] 本発明の EP〇溶液製剤は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス 容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはデイスポーザブル注射器 のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のよう な大用量の形状で供給することもできる。プレフィルドシリンジの形で提供することが 便利である。
[0040] 本発明の安定化されたタンパク質製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（ 皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投 与も可能である。
[0041] 本発明はさらに、本発明の EP〇含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タ ンパク質の定量方法を提供する。
[0042] 従来、タンパク質溶液中の不純物量を求める時には分離能に優れるゲル電気泳動 法がよく用いられるが、検出感度は、汎用される高感度染色法である銀染色法にお いて 0.6〜 1.2ng /band程度と良好な感度を有するものの定量性が乏しいため定量法 に用いることは不可能である。一方、さらなる感度向上に対しては、 RI標識、及び膜 転写後に免疫染色を行う方法があるが、前者については放射能汚染が危惧され、汎 用性に乏しいこと、後者については、最高 pgオーダーまで感度は上昇するが、操作 の煩雑性によりバラツキを生じ、定量には向かない。
[0043] そこで、本発明は免疫染色と同程度の感度を持ち、且つ汎用性のある微量タンパ ク質の定性、定量、純度試験法を提供する。
[0044] 本発明の微量タンパク質の定量方法は以下のステップを含む：
1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；
2)得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；
3)所望の分析物を定量して、その量力 タンパク質の量を換算する。
[0045] 本発明では感度を上昇させるために、蛍光試薬を用いた。電気泳動を行ったゲル を蛍光染色する蛍光ゲル染色試薬には、 Ruby stainや、 SYPRO orangeなどがある 力 これらは、銀染色法に比べ定量性は優れているものの検出感度は劣り、また銀染 色と同様に泳動後染色であるため、煩雑な染色操作が必要である。一方、今回用い た蛍光試薬 Cyanine Dyeは泳動後染色には向かなレ、が、 NHS (N—ヒドロキシスクシ ンイミド）、または Maleimideを介してタンパク質と強固な共有結合をすることから、電気 泳動の前にタンパク質を染色することができる。また、 Cyanine Dyeにより標識される 部位は特定位置（NHSの場合は NH基、また、 Maleimideの場合は SH基）であることか ら、 Cyanine Dyeと各タンパク質の結合性にバラツキが少なぐ定量性を確保すること が可能となった。したがって、上記ステップ 2)における所望の分析物とは、タンパク質 と蛍光色素との結合体であり、 NHS、 Maleimideなどを介して結合したものを含む。
[0046] 本発明の方法で、試料中のタンパク質と高輝度蛍光色素を結合させる方法として は、通常一般的なタンパク質の NH基や SH基に蛍光色素を化学結合させる方法であ ればいかなる方法でもよぐまた市販の各高輝度蛍光色素の Instructionに沿った方 法で行ってもよレ、。その反応温度に関しては通常 0°C〜50°Cの範囲内であればよく 、具体的には市販の高輝度蛍光色素の各 Instructionに記載してある反応温度を用 いいてもよいが、本発明のごとく試料を定量的に測定する場合は、試料のタンパク質 を均一に染色するために試料が凍らない範囲で低温条件、好ましくは 0°C〜10°C、 さらに好ましくは 0°C〜5°C、最も好ましくは約 1°Cで行うとよい。
[0047] さらに、 Cyanine Dyeを用いることで、数 10pg/bandと免疫染色と同程度以上の検 出が可能となり、定性的な試験に用いることができる。さらに、標準品の検量線や、内 標準物質を用いることで、微量タンパク質溶液の定量も可能である。また、 104オーダ 一以上の定量範囲（数 10pg〜100ng前後/ band)を有し、標準品等を用いなレ、純度 試験として 0.1%以下の会合体等の不純物含有量を正確に評価することが可能であ る。
[0048] カロえて、泳動前に染色することで、使用する試薬量を少なくでき、コストの面からも 泳動後染色を行う蛍光試薬よりも優位となった。
[0049] 本発明の高輝度蛍光色素としては、直接或いは NHS、 Maleimideなどを介してタン パク質と強固に共有結合し、 104以上の広い定量範囲 (ダイナミックレンジ)を有する 蛍光色素であればいかなるものでもよぐ例えば、 Cy3、 Cy3.5、 Cy5、そして Cy5.5 M ono-reactive Dye (NHSタイプと Maleimideタイプ）（GE Healthcare社製）などの Cyanin e Dye系の色素を用いることができ、 Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプが好ましい
[0050] またその他本発明の高感度蛍光色素としては、 Sulfonated Coumarinや Sulfonated r hodamine Dyeである、 Alexa Fluor 350、 405、 430、 488、 532、 546、 555、 568、 594、 63 3、 647、 680、 700、そして 750のタンパク質ラベリングキット（Molecular Probes社製）、 さらに HiLyte Fluor 555、 647などのタンパク質ラベリングキット（同人化学社製）などを 用レ、ることもできる。
[0051] 本発明の方法で、試料から所望の分析物を適切に分離する手段としては、 SDS-PA GE、キヤピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動など電気泳動法全般、そして HP LCによるゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトダラ フィ一などで分離することが可能で、電気泳動または HPLCでの分離手段が好ましい
[0052] 電気泳動で分離する場合、泳動イメージの取り込みについては、泳動前染色であ ることから、電気泳動後のゲルの染色操作を必要とせず、ガラスで固定化されたゲル を用いれば、泳動終了後ガラスプレートの表面を水洗後直ぐに蛍光ゲルイメージヤー による泳動イメージの取り込みが可能となった。
[0053] また、測定前に染色できることから、電気泳動に限らず、蛍光検出器を接続した HP LCなど他の分離手段にも応用可能である。
[0054] 本発明の定量方法を用いて、 EPO含有溶液製剤中の EPOを感度よく定量すること ができた。さらに、本発明の定量方法は、 EPO以外のタンパク質の定量にも使用でき る。後述する実施例に示すように、ヒト型化抗 IL_ 6レセプター抗体である抗体タンパ ク質 hPM_lや、 BSA (ゥシ血清アルブミン）の定量において、種々の濃度のタンパク 質で良好な検量線が得られ、何れの条件においても、非常に高感度で検出すること が可能であった。したがって、本発明の方法は、微量タンパク質溶液の定量方法とし て極めて優れており、その応用範囲は広い。
[0055] 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限 定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、こ れらの変更、修飾も本発明に含まれる。
[0056] なお、以下の実施例において、 EPO試料は、 CHO細胞を用いる遺伝子組換え EP 0 (中外製薬製)を用いた。
実施例
[0057] 実施例 1：処方の疼痛比較試験
二重盲検下で、同一被験者に対し以下の表 1に示す処方 1、処方 2の製剤を片腕 ずつに皮下注射した。注射時の痛みの評価を被験者自身が行った。得られた結果を 表 2に示す。
[0058] [表 1]
表 1
Figure imgf000014_0001
[0059] [表 2]
Figure imgf000015_0001
被験者内比較による痛みの評価では、処方 1が処方 2よりも痛みが強いとする被験 者が 100%であり、処方 2が有意に痛くないことが示された。
実施例 2：処方の安定性試験
以下に示す二種の処方について、安定性を比較するため、 35° C苛酷試験を実施 した。 [0060] これらの処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。 試験に用いた処方及び試験結果を表 3に示す。
[0061] [表 3] 表 3
Figure imgf000016_0001
処方 4は処方 3よりも EPOの残存率が高ぐかつ二量体の生成、分解物の生成が 顕著に抑制されており、処方 4が安定であることを確認した。
なお、上記の試験では以下の試験方法を用いた。
(1)残存率の測定
液体クロマトグラフ法により測定し、初期品に対して残存率を求めた。 使用カラム： 214TP54(Size250mmX4.6mmI.D.粒径 5 zm)： Vydac製
移動相
A:水：ァセトニトリル： TFA = 400:100:1
B：水:ァセトニトリル： TFA= 100 :400:1 A : B = 65 : 35 → A : B = 0 : 100を線形グラジェントで実施した。
(2)二量体の測定
EPO濃度 1250IUに希釈した試料に蛍光試薬（Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイ プ）を溶解した DMSOを加え、 EP〇を標識した後、 SDSを含むサンプルバッファーを 加え 50° C-15分加温したもの 15 z Lについて、電気泳動法により試験を行った。電 気泳動したゲルをイメージアナライザーで読み込み、二量体のピーク面積％を算出し た。
使用ゲル：トリスグリシンゲル 12.5%
(3)低分子量分解物の測定
EPO濃度 3000IUに希釈した試料に SDS、メルカプトエタノールを含むサンプルバッ ファーを加え 50° C-15分加温したもの 7.5 μ Lにつレ、て、電気泳動法により試験を行 つた。抗 ΕΡΟ抗体を用いたウェスタンプロット法により検出し、分解物精製品 25〜500 ng/mLの検量線力も試料の低分子量分解物量を算出した。
使用ゲル：トリスグリシンゲル 8- 16%
実施例 3：界面活性剤種の影響
界面活性剤が EPOの安定性へ与える影響を確認するため、以下の処方にて安定 性を確認した。
[0063] これら処方は調製後、無菌濾過を行い、洗浄滅菌したバイアルに充填、打栓した。
試験方法は実施例 2の二量体の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験 結果を表 4に示す。
[0064] [表 4]
Figure imgf000018_0001
ポロクサマーを界面活性剤として用いた処方 10〜14は、ポリオキシエチレン硬化ヒ マシ油またはポリソルベートを界面活性剤として用いた処方と比べ、 35°C _ 3ヶ月の 加速試験において、二量体生成 J tが顕著に少なぐ安定であった。また、ポロクサマ 一系の界面活性剤は全て EPOの二量体生成を抑制した。
実施例 4： EPO含量の安定性に及ぼす影響
pH7.0、界面活性剤としてポロクサマー 188を添カ卩した処方について、 EPO含量の 安定性への影響を確認するため安定性試験を行った。
[0065] これら処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。試 験方法は実施例 2の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験結果を表 5 に示す。
[0066] [表 5] 表 5
Figure imgf000019_0001
ΕΡΟ含量が 1500〜108000IU/mLの処方においては、少なくとも 10° C- 1年は安定 であることが確認できた。さらに、本実施例において EP〇/ポロクサマー 188の比率が 0.017〜1.2の範囲でも安定性に問題ないことが確認できた。
*EPO 180000IU = lmg
実施例 5： Cyanine Dye (Cy3)を用いた EPO純度試験法の検討 EPO溶液の調製： EPO標準品 (EPO濃度 lmg/mL)に希釈緩衝液（0.005%の Polys orbate80を含有する 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4) )を加えて、各々の含量の EPO溶液 を調製した。
(1)検出限界の確認
EPO濃度 16.3ng/mL〜2083.3ng/mL及び EPO二量体濃度 2ng/mL〜128ng/mLの 溶液 60 μ Lに Cy3 stock solution (Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 1 00 z Lの DMSOで溶解）を 2 x L加え、約 1°Cで 4時間反応させた。反応終了後、 SDS を含むサンプルバッファーを 24 μ L加え 50°C- 15分加熱した後、 15 Lを電気泳動に 供した。蛍光イメージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限 界を確認した。得られた結果を図 1に示す。
[0067] EPOにおいては、 16.3ng/mL〜2083.3ng/mLの溶液（lWell換算： 174pg〜22.3ng) で、良好な検量線 (R2=0.9965)が得られた。また、 EPO二量体においては、 2ng/mL ではピークの検出ができなかったが、 41¾/111し〜1281¾/111し（1\^11換算：43 §〜1.371 g)の溶液で、良好な検量線（R2=0.9963)が得られ、 lWellあたり 43pgと非常に高感度 で検出することが可能であった。
(2)精度の確認
1250IU/mLの EPO溶液に、 EPO二量体を添加し、 EPOに対して 0.094〜2.256%の
EPO二量体を含有した溶液について、精度の確認を n=4にて実施した。得られた結 果を表 6に示す。
[0068] [表 6] 表 6
Figure imgf000020_0001
0.094%で C.V. (変動係数）が約 40%であった力 0.188%以上では 20%以下であり、良 好な精度であることが確認できた。
実施例 6： Cyanine Dye (Cy3)を用いた抗体（hPM_l)純度試験法の検討
以下の試験で用いた抗体タンパク質 hPM-1はヒト型化抗 IL— 6レセプター抗体（国 際特許出願公開番号 W092— 19759を参照）である。
(1)検出限界の確認
hPM-1 1.25 μ g/mL〜40 μ g/mL及び hPM- 1二量体濃度 2.5ng/mL〜1280ng/mLの 溶液 60 z Lに Cy3 stock solution (Cy3 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 1 00 z Lの DMSOで溶解）を 2 カロえ、約 1°Cで 4時間反応させた。反応終了後、 SDS を含むサンプルバッファーを 24 μ L加え 50°C- 15分加熱した後、 15 μ Lを電気泳動に 供した。蛍光イメージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限 界を確認した。得られた結果を図 2に示す。
[0069] hPM-1においては、 1·25 μ §/Γηί〜20 μ g/mLの溶液（lWell換算： 13.4ng〜214ng) で、良好な検量線（R2=0.9965)が得られた。また、 hPM-1二量体においては、 5ng/m Lではピークの検出ができなかった力 101¾/111し〜12801¾/111し（1\^11換算：107 §〜1 3.7ng)の溶液で、良好な検量線（R2=0.9963)が得られ、 lWellあたり 107pgと非常に高 感度で検出することが可能であった。
(2)精度の確認
hPM-1濃度を 10 /i g/mL、二量体量が 0.05〜6.4%となるように調製した溶液につい て、精度の確認を実施した。得られた結果を表 7に示す。
[0070] [表 7]
Figure imgf000022_0001
最大で C.V.が約 7%であり、良好な精度であることが確認できた。
実施例 7 : Cyanine Dye (Cy5)、 Alexa 647および HiLyte Fluor 647を用いた EPOおよ び BSAの純度試験法の検討 (1)検出限界の確認
EPO 10 μ g/mL及び BSA 10 μ g/mLの溶液（それぞれ 0.1Mの NaHCOで調製） 100
3
μ Lに Cy5 stock solution (Cy5 Mono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 100 μ L の DMSOで溶解）を 3.3 μ L、 Alexa 647 stock solution (Alexa 647の NHSタイプ 1バイ アルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ L、または HiLyte Fluor 647 stock solution (HiLy te Fluor 647の NHSタイプ 1バイアルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ Lカロえ、約 1。Cで 18時間反応させた。反応終了後、希釈緩衝液（0.005%の Polysorbate80を含有する 0 •1Mリン酸緩衝液（ρΗ7·4) )で公比 3で 6濃度 0.046ng/mL〜l l. lng/mL (0.34 pg/well 〜8·3 pg/wellに相当）に希釈した。希釈後、それぞれ 40 μ Lに SDSを含むサンプノレ バッファーを 20 z L加え 50°C_ 15分加熱した後、 10 z Lを電気泳動に供した。蛍光ィメ ージアナライザ一にて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。 EP 〇について得られた結果を図 3に、また BSAについて得られた結果を図 4に示す。 図 3、図 4から明らかなように EPOおよび BSAの両方において、 0.046ng/mL〜l l. ln g/mLの溶液（lWell換算： 0.34 pg/well〜8.3 pg/well)で、良好な検量線が得られ、何 れの条件においても、 lWellあたり 0.34pgと非常に高感度で検出することが可能であ つに。
実施例 8：マイクロ電気泳動システムにおけるプレスティンによる高感度化検討 (1)検出限界の確認
BSA lmg/mLの溶液（0.1Mの NaHCOで調製） 100 μ Lに Cy5 stock solution (Cy5 M
3
ono-reactive Dyeの NHSタイプ 1バイアルを 100 β Lの DMSOで溶解）を 3·3 β L、 Alex a 647 stock solution (Alexa 647の NHSタイプ 1バイアルを 10 β Lの DMSOで溶解）を 1 μ L、または HiLyte Fluor 647 stock solution (HiLyte Fluor 647の NHSタイプ 1バイァ ルを 10 μ Lの DMSOで溶解）を 1 μ L加え、約 1°Cで 18時間反応させた。反応終了後、 希釈緩衝液（0.005%の Polysorbate80を含有する 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4) )で公比 2で 10濃度 0.046mg/mL〜50ng/mLに希釈した。希釈後はマイクロチップ電気泳動シ ステムのプロトコールに従って測定を行レ、、同システムによって得られた値から、検量 線を作成し、検出限界を確認した。 Cy5で得られた結果を図 5に、 Alexa 647で得ら れた結果を図 6に、 HiLyte Fluor 647で得られた結果を図 7に示す。 図 5〜7から明らかなように、全てのタイプの蛍光色素において、良好な検量線が得 られた。本検討で使用したマイクロチップ電気泳動システムの測定法に従って同じ BS Aを測定した際の結果と比較して 250倍以上の高感度化を実現し得た。

Claims

請求の範囲
[I] ポロクサマー類を含み、 pHが 6·5〜7·5である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
[2] ポロクサマーがポロクサマー 188である請求項 1記載の製剤。
[3] さらに、安定化剤としてアミノ酸又はその塩を含む請求項 1記載の製剤。
[4] アミノ酸がヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である請求項 3記載の製剤。
[5] pH力 S、 6.8〜7.2である、請求項 1〜4のいずれかに記載の製剤。
[6] ポロクサマー類を含み、安定化剤として L ヒスチジンを含み、かつ pH力 ¾.8〜7.2で ある、エリスロポエチン含有溶液製剤。
[7] 安定化剤としてのタンパク質を含まなレ、、請求項 1〜6のいずれかに記載の製剤。
[8] 安定化剤として糖類を含まない、請求項 1〜7のいずれかに記載の製剤。
[9] ポロクサマー類を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保存後 におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。
[10] 以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法：
1)タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；
2)得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；
3)所望の分析物を定量して、その量力 タンパク質の量を換算する。
[II] 高輝度蛍光色素が Cyanine Dye系色素である請求項 10記載の方法。
[12] 高輝度蛍光色素が Cy3である請求項 11記載の方法。
[13] 分離手段が電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（HPLC)である請求項 10〜
12記載の方法。
[14] 微量タンパク質がエリスロポエチンである請求項 10〜： 13のいずれかに記載の方法。
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