WO2007083693A1

WO2007083693A1 - ピロリン酸センサおよびそれを用いたｓｎｐタイピングセンサ

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Publication number: WO2007083693A1
Application number: PCT/JP2007/050679
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Yukimasa; Hiroaki Oka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2006-01-23
Filing date: 2007-01-18
Publication date: 2007-07-26
Also published as: US7632392B2; CN101360993A; JP4202407B2; CN101360993B; JPWO2007083693A1; US20080293128A1

Abstract

　プライマー伸長反応を利用したＳＮＰタイピングにおけるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサを提供する。　絶縁性の基板１と、その上に形成された測定極２と対極３からなる電極系と、前記基板１上に設けられたピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、前記酵素を含む反応試薬層３６と前記緩衝液成分を含む反応試薬層３５が分離されているピロリン酸センサであって、グリセルアルデヒド－３－リン酸を含む反応試薬層３７が、緩衝液成分を含む反応試薬層３５から分離されていることを特徴とする。

Description

明細書

ピロリン酸センサおよびそれを用いた SNPタイピングセンサ

技術分野

[0001] 本発明は、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いた SNPタイピングセンサに関する。

背景技術

[0002] ピロリン酸は、細胞内における酵素反応に深く関与していることが知られている。例えば、蛋白質の合成過程において、アミノ酸がアミノアシルアデ-ル酸を経由してアミノアシル tRNAを形成する反応においてピロリン酸が生成される。また、例えば、植物などに見られるデンプン合成の過程では、グルコース 1 リン酸と ATPとの反応によって ADP グルコースが生成される際に、ピロリン酸が生成される。これら以外にも、種々の酵素反応においてピロリン酸が関与していることが知られている。従って、ピ口リン酸を定量的に検出する技術は、細胞状態、あるいは上記の酵素反応等を解析する上で重要な技術である。

[0003] 従来のピロリン酸測定方法として、 Grindleyらの化学的方法 (非特許文献 1参照が知られている。しかし、この方法では濃硫酸を用いるので、好ましくない。

[0004] 特許文献 1では、濃硫酸などの薬品を用いずに、酵素を利用した三種類のピロリン酸測定方法が開示されている。それらに関して以下に説明する。

[0005] 第 1の方法は、ピロリン酸をホスホェノールピルビン酸およびアデノシン一リン酸の存在下で、ピルべ一トオルソホスフェートジキナーゼを作用させる方法である。この反応によってピルビン酸が生成されるので、ピルビン酸の量を測定することによってピロリン酸の量を算出することができる。なお、ピルビン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。 1つは、ラタテートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してピルビン酸を NADHで還元する際に、 NADHの減少を比色定量する方法である。もう 1つは、生成したピルビン酸にピルべートォキシダーゼを作用させて生成する過酸ィ匕水素を色素に導くことによって比色定量する方法である。

[0006] 第 2の方法は、ピロリン酸をシチジン二リングリセロールの存在下でグリセロール 3 ホスフェートシチジルトランスフェラーゼに作用させる方法である。この反応によつてグリセロール三リン酸が生成される。従って、グリセロール三リン酸の生成量を測定することでピロリン酸の量を算出することができる。グリセロール三リン酸の量を測定する方法は二種類の方法が提案されている。 1つは、グリセロールー3 ホスフェートデヒドロゲナーゼの触媒作用を利用してグリセロール三リン酸を NAD (P) +で酸ィ匕する際に、

NAD (P) Hの増加を比色定量する方法である。もう 1つは、生成したグリセロール三リン酸にグリセロールー3—ホスフェートォキシダーゼを作用させて生成する過酸ィ匕水素を色素に導きこれを比色定量する方法である。

[0007] 第 3の方法は、ピロリン酸をシチジン二リン酸リビトールの存在下でリビトールー 5— ホスフェートシチジルトランスフェラーゼを作用させる方法である。この反応によって D ーリビトールー 5—リン酸が生成されるため、その生成量を測定することでピロリン酸量を測定することができる。 D リビトールー 5—リン酸を測定する方法は、 NAD+(または NADP+)の存在下でリビトールー 5—ホスフェートデヒドロゲナーゼを作用させて NADH (または NADPH)の増加を比色定量する方法が提案されてヽる。

[0008] その他にも特許文献 2には、ピロホスファターゼによりピロリン酸をリン酸に加水分解した後、プリンヌクレオシドホスホリラーゼによりリン酸をイノシンまたはキサントシンと反応させ、生じたヒポキサンチンをキサンチンォキシダーゼにより酸ィ匕してキサンチンとし、さらに酸ィ匕して尿酸を生成させ、このキサンチンォキシダーゼによる酸ィ匕過程で生じる過酸ィ匕水素をペルォキシダーゼを用いて発色剤を発色させる方法が示されている。

[0009] し力しながら、これらのピロリン酸の測定方法ではサンプルの吸光度もしくは発色を測定するため、光学系を含む比較的大きな装置を用いる必要がある。

[0010] 一方、核酸の伸長反応もピロリン酸が関与する重要な生体反応の一種である。

[0011] 近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となつてきた。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されてヽる。

[0012] これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の 1%以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなぐ様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。

[0013] この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されて、るのが SNP (Single nucleotid e polymorphism)である。 SNPは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。 SNPはヒトゲノム DNA内に 2〜3百万あると言われており、遺伝子多型のマーカーとして利用しやすぐ臨床への応用が期待されている。現在では、 SNP関連技術として、ゲノム中の SNPの位置同定および SNP と疾患との関連性等の研究とともに、 SNP部位の塩基を判別する SNPタイピング技術の開発が行われている。

[0014] SNPタイピングの技術は、ノ、イブリダィズを利用したもの、制限酵素を利用したもの、リガーゼ等の酵素を利用したもの等様々な種類のものがある。それらの技術のうち、最も簡便な技術としてプライマー伸長反応を利用するものがある。この技術では、プライマー伸長反応が起こる力否かを判定することによって、 SNPタイピングを行なう。

[0015] プライマー伸長反応を利用した SNPタイピング技術の検出には、実際の DNAの増幅産物を蛍光色素を用いて検出する方法や、固定化プローブを用いる方法の他に、 DNAポリメラーゼによる核酸合成の副産物であるピロリン酸を検出する方法も考案されている。この方法では、伸長反応の進行の差を検出するために、プライマー伸長反応の進行に伴って生成されるピロリン酸を ATPに変換し、その後ルシフェラーゼ反応を利用してピロリン酸の量を測定する方法を用いて、る（非特許文献 2を参照)。

[0016] さらに特許文献 3には、ピロリン酸を測定することによって、試料液中の目的核酸を高感度で測定する方法や、 SNPを簡便にタイピングする方法が開示されている。特許文献 3によると、 DNAの SNP配列に相補的な配列を持ち、かつ SNP部位を有する DNAプローブと、 DNAポリメラーゼ、デォキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供して、 PCR (Polymerase Chain Reaction)反応によって、 DNAプローブを伸長させ、 DNAプローブの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸をピロホスファタ一ゼによって無機リン酸へと変換し、さらにダリセルアルデヒド一 3—リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼおよび電子メディエータとしてフェリシアン化カリウムを含む測定系を用いて、最終的には電極で電流値を測定することによって、 DNAの SNP配列をタイピングする方法が示されている。この方法によれば、ピロリン酸を含む試料を測定系に加えてから、 100秒以内に SNP配列が判別可能であることが述べられている。

[0017] この方法では、ピロリン酸の測定および SNPのタイピングは、電子メデイエ一タの酸化還元反応を電気化学的に測定することによって可能であり、光学系を必要としない簡便かつ高感度な方法として開示されて!ヽる。

[0018] このようなピロリン酸の測定および SNPのタイピングでは、センサ基板上に必要な試薬を乾燥担持しておくことによって、センサチップを小型化することができ、さらには非常に簡便な操作で測定が可能となる。

[0019] 特許文献 4には、試薬乾燥担持型のバイオセンサにおいて、緩衝剤成分と酵素を同時に担持する場合、それぞれを分離して配置することによって、酵素活性の低下を防ぐことが可能であることが開示されている。

特許文献 1：特開昭 61— 12300号公報

特許文献 2：特開 2002— 369698号公報

特許文献 3：国際公開第 03Z078655号パンフレット

特許文献 4：特開平 7— 83872号公報

非特許文献 1 : G. B. Grindley and C.A. Nichel, Anal. Biochem,.vol33.pl l 4 (1970)

非特許文献 2 : ImmunologicalMethod, 156, 55-60, 1992

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0020] し力しながら、上述したピロリン酸の測定およびそれを用いた SNPタイピングでは、さらに多くの試薬を用いるため、緩衝液成分と酵素を分離して配置し乾燥担持するだけでは、安定した特性がでな、と、う課題を有して、た。

[0021] 本発明は上記課題を解決するためになされたものであり、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で検出するセンサおよびそれを用いた SNPタイピングセンサを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0022] 上記目的を達成するために、本発明は以下の構成を有する。すなわち、本発明は絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極力ゝらなる電極系と、前記基板上に設けられたピロホスファターゼ、ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼ、グリセルアルデヒド 3—リン酸、酸化型-コチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されて、るピロリン酸センサであって、ダリセルアルデヒドー 3—リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されて、ることを特徴とするピロリン酸センサを提供する。

[0023] 本発明はさらに、前記ダリセルアルデヒド 3 リン酸を含む反応試薬層が、さらに酵素を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。本発明はさらに、前記酸ィ匕型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層力 S、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記ダリセルアルデヒド 3— リン酸を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする。

[0024] 本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の分離された部分にそれぞれ形成されて!ヽることを特徴とする。

[0025] 本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記絶縁性基板上の同一の部分に積層されて形成されてヽることを特徴とする。

[0026] 本発明はさらに、前記反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されていることを特徴とする。

[0027] 絶縁性の基板と、前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キヤビティと、前記基板上に設置された反応キヤビティと、前記測定キヤビティと前記反応キヤビティを繋ぐ流路を含み、前記測定キヤビティ内にピロホスファターゼ、ダリセルアルデヒドー3 リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼ、グリセルアルデヒド 3—リン酸、酸化型- コチンアミドアデニンジヌクレオチド、電子メディエータ、マグネシウム塩および緩衝液成分からなる複数の反応試薬層を具備し、かつ前記酵素を含む反応試薬層と前記緩衝液成分を含む反応試薬層が分離されている SNPタイピングセンサセンサであつて、ダリセルアルデヒド 3—リン酸を含む反応試薬層が、緩衝液成分を含む反応試薬層から分離されていることを特徴とする SNPタイピングセンサを提供する。

[0028] 本発明はまた、前記ダリセルアルデヒド 3 リン酸を含む反応試薬層力さらに酵素を含む反応試薬層から分離されて!ヽることを特徴とする。

[0029] 本発明はまた、前記酸ィ匕型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを含む反応試薬層が、前記酵素を含む反応試薬層、前記緩衝液成分を含む反応試薬層、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸を含む反応試薬層から分離されて!ヽることを特徴とする。

[0030] 本発明はさらに、前記反応キヤビティにおいて、 DNA増幅反応を行うことを特徴とする。

[0031] 本発明はさらに、前記 DNA増幅反応が、 PCR反応であることを特徴とする。

発明の効果

[0032] 本発明のピロリン酸センサによれば、試料溶液中のピロリン酸を簡便かつ高感度で測定するセンサ、ならびにそれを用いた SNPタイピングセンサを提供することができる。

図面の簡単な説明

[0033] [図 1]本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図

[図 2]本発明の一実施の形態に係る電極基板の構造を示す斜視図

[図 3]本発明の一実施の形態に係るハウジング基板の構造を示す斜視図

[図 4]本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す斜視図

[図 5]本発明の一実施の形態に係るピロリン酸センサの構造を示す断面図

[図 6]本発明の一実施の形態に係る SNPタイピングセンサの構造を示す斜視図

[図 7]本発明の一実施の形態の結果を示すグラフ符号の説明

[0034] 1 絶縁基板

2 測定電極

3 対極

4 参照電極

5 導電性パターン

6 端子部

7 電極基板

21 絶縁膜

31 ハウジング基板

32 キヤビティ

33 注入孔

34 空気孔

35 第 1の反応試薬層

36 第 2の反応試薬層

37 第 3の反応試薬層

38 第 4の反応試薬層

41 測定キヤビティ

42 PCRキヤビティ

43 流路

発明を実施するための最良の形態

[0035] 以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

[0036] (実施の形態 1)

図 1は、本発明の一実施の形態を示す電極基板の斜視図である。絶縁基板 1上には、測定極 2、対極 3、参照極 4が形成されている。それぞれの電極は、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなど力選択することが可能であるが、表面状態の安定性などの観点力も金を選択することが望まし、。

[0037] 参照極 4は、溶液中における電位の安定性から、不分極性を示す照合電極を用いることがさらに望ましぐ取り扱いの簡便性等から、銀'塩ィ匕銀電極を選択することが好ましい。銀'塩化銀電極の形成方法は、金や白金などで形成された電極パターンの参照極 4部位上に、銀メツキを施し、塩ィ匕ナトリウム水溶液中で電圧を印加して表面を塩化銀化する方法、銀'塩化銀ペースト材料で電極本体を構成する方法、銀べ一ストの表面を次亜塩素酸ナトリウム等の水溶液と接触させる方法、等を挙げることができる。

[0038] 各電極は、導電性パターン 5によって、外部回路との接続部分である端子部 6と電気的に結合されている。導電性パターン 5および端子部 6もまた、電極部分と同様の材料で形成されることが、製造工程力も見ても望ましい。絶縁基板 1上への電極および導電性パターンの形成方法としては、例えば絶縁基板 1上への導電性材料の印刷、導電性材料のスパッタリングもしくは蒸着後のフォトリソグラフィを用いたエツチングもしくはレーザーによる除去力卩ェ、マスクを用いた電極パターンの直接スパッタリング、等が考えられる。

[0039] 絶縁基板 1としては、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホゥ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、榭脂等を選択することができる力デイスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工の容易さやコスト面力考えて、榭脂材料を選択することが望ましヽ。

[0040] 榭脂材料としては、ポリカーボネート (PC)、ポリスチレン (PS)、ポリプロピレン (PP) 、ポリイミド（PI)、ポリ四フッ化工チレン（PTFE)、ポリフエ-レンサルファイド（PPS)、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK)、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリメチルメタタリレート（PMMA)、ポリエチレン 2, 6 ナフタレート（PEN)などを選択することができる。中でも、スパッタリングによる金電極形成の場合は、金との密着性の観点等から、 PETを選択することが好ましい。また絶縁基板 1の厚みとしては、取り扱いの容易さ等から、好ましくは 0. lmn！〜 2. Omm、さらに好ましくは 0. 188mn！〜 1. Om mがよい。

[0041] 電極基板 7は、このままでも使用可能である力図 2に示すように、電極部分の面積の規定および導電性パターン 5の絶縁'保護の観点から、絶縁膜 21でコーティングされていてもよい。絶縁膜 21としては、例えばポリイミド等の樹脂材料をスピンコートで成膜した後、フォトリソグラフィを用いて電極部分のみを露出させる方法や、あらかじめ電極部分に打ち抜かれた粘着シートを貼付する方法、絶縁性ペースト材料を印刷する方法等を用いることが可能である。

[0042] 電極基板 7は、絶縁膜 21の有無に関わらず、試薬の担持を行うことにより、このままでもピロリン酸センサとして使用可能である力測定溶液の乾燥ゃコンタミネーシヨンを防ぐことを目的として、次に示すようにハウジングを行っても良い。

[0043] 図 3は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの斜視図であり、図 1に示す電極基板と図 4に示すハウジング基板とからなる。本発明によるバイオセンサに用いられるハウジング基板 31は、試料液と反応しない材料を選択する必要があり、シリコン、ゲルマニウム等の半導体、石英ガラス、鉛ガラス、ホウ珪酸ガラスなどのガラス、セラミック、榭脂等を選択することができる力デイスポーザブルのバイオセンサとしての用途を考えると、加工のしゃすさやコスト面力も考えて、絶縁基板 1と同様に榭脂材料を選択することが望ましヽ。

[0044] 榭脂材料としては、ポリカーボネート (PC)、ポリスチレン (PS)、ポリプロピレン (PP) 、ポリイミド（PI)、ポリ四フッ化工チレン（PTFE)、ポリフエ-レンサルファイド（PPS)、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK)、ポリエチレンテレフタレート（PET)、ポリメチルメタタリレート（PMMA)、ポリエチレン 2, 6 ナフタレート（PEN)、環状ォレフィン共重合体 (COC)、ポリジメチルシルォキサン（PDMS)などを選択することができる。 PMMAおよび PCは、透明性がよく内部試料の状態を確認することが可能であり、微細な切削加工等が容易なため、特に好ましい。また、耐熱性が要求される場合は、特に PCが好ましい。

[0045] ノ、ウジング基板 31上に形成されるキヤビティ 33の形成方法は、ハウジング基板 31 が榭脂材料の場合、切削加工の他、金型による成型、熱転写によるエンボス加工などを用いることができる。また、貫通孔を持つシートを張り合わせることでもキヤビティ 3 3を形成することが可能である。

[0046] こうして形成したキヤビティ 33を含むハウジング基板 31は、電極基板 7と接着される力ハウジング基板 31と電極基板 7は、完全に接着もしくは密着し、キヤビティ 33内部の試料を封止することが好ましい。接着には、例えば、アクリル系やエポキシ系、シリコーンなどの接着剤、両面テープなどの粘着シート等を用いることができる。また、ポリカーボネートのように有機系溶剤に対する耐性が低ヽ材料を用いた場合、クロ口ホルム等の有機系溶剤をノヽウジング基板 31と電極基板 7の界面に流し込み、加圧すること〖こよって接着することができる。また、 PSや PMMA等の熱可塑性榭脂を用いた場合には、熱融着による方法も用いることが可能である。

[0047] ハウジング基板 31にはキヤビティ 32内部に試料を注入するための試料注入孔 33 が設けられている。試料注入孔 33は少なくとも 1つあれば良いが、空気の抜ける穴として空気孔 34を設けておくと、試料の注入時に使用した以外の空気孔 34がキヤビティ 32内部の空気の逃げ道として機能し、試料を速やかに注入することができるので好ましい。

[0048] 注入孔 33および空気孔 34は、キヤビティ 32に接続されてヽれば、位置は特に限定されない。キヤビティ 32内部は、既知の親水性処理が施されていると、試料がより速やかに導入され得る。注入孔 33および空気孔 34は、試料を注入した後は、粘着テープ等の方法で封止してもよいが、短時間の測定であれば開口状態でも使用され得る。

[0049] キヤビティ 32の内部には、緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩を含む第 1の反応試薬層 35、ピロホスファターゼおよびダリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼを含む第 2の反応試薬層 36、ダリセルアルデヒドー3 リン酸を含む第 3の反応試薬層 37、および酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチドを含む第 4の反応試薬層 38が担持される。

[0050] 後述する実施例からも理解されるように、ピロリン酸濃度と電流値との比例関係を発現させると共に、当該比例関係の傾きをより大きくするという点力もは、上記のように 4 つの反応試薬層 35〜38に分割することが最も好ましい（実施例のサンプル Dを参照

) o

[0051] 上記傾きは小さくなるが、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチド (第 4の反応試薬層 3 8)と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩 (第 1の反応試薬層 35)とを同一の反応試薬層に含ませても良、（実施例のサンプル Cを参照)。

[0052] 少なくとも、本発明においては、ピロホスファターゼおよびダリセルアルデヒド 3— リン酸デヒドロゲナーゼと緩衝液成分とが分離されて、るだけでなぐダリセルアルデヒド 3—リン酸と緩衝液成分とが分離されて、ればよ!/、。

[0053] 従って、実施例のサンプル Bのように、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチド (第 4の反応試薬層 38)と緩衝液成分、電子メディエータ、マグネシウム塩 (第 1の反応試薬層 35)とを同一の反応試薬層に含ませるだけでなぐダリセルアルデヒド 3—リン酸 (第 3の反応試薬層 37)と、ピロホスファターゼ、ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、およびジァホラーゼ (第 2の反応試薬層 36)とを同一の反応試薬層に含ませても良い。ただし、上記比例関係の明瞭性や上記傾きはより小さくなる傾向がある。

[0054] 電子メディエータとしては、水溶性であって酸ィ匕体で安定しているものが望ましぐ例えばフェリシアンィ匕カリウムを用いることができる。

[0055] マグネシウム塩としては、マグネシウムイオンを含み、水溶性であって pHが中性〜弱アルカリ性のものであれば良ぐ例えば塩ィ匕マグネシウムを用いることができる。

[0056] 酸化型ニコチンアミドジヌクレオチド (NAD+)に代えて、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸 (NADP+)を用いても良い。また、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチド（ NAD+)とともに、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸 (NADP+)を用いてもよい。本明細書においては、酸ィ匕型ニコチンアミドジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸、これらの組み合わせをそれぞれヌクレオチド類とも！、う。

[0057] 第 1の反応試薬層 35、第 2の反応試薬層 36、第 3の反応試薬層 37、および第 4の反応試薬層 38が担持される位置は、キヤビティ 32内部の任意の場所でよいが、第 1 の反応試薬層 35、第 2の反応試薬層 36、第 3の反応試薬層 37、および第 4の反応試薬層 38は、図 3で示すように、電極基板 7上の分離された位置に担持される。

[0058] 各反応試薬層 35〜38の担時は、所定の位置に一定量の各試薬を含む試薬溶液をそれぞれ滴下し、常温真空乾燥、温風乾燥、凍結乾燥などによって、溶媒である水分を蒸発させることによって行うことができる。

[0059] (実施の形態 2)

図 5は、本発明の一実施の形態を示すピロリン酸センサの断面図である。図 5に示したように、第 1の反応試薬層 35、第 2の反応試薬層 36、第 3の反応試薬層 37、および第 4の反応試薬層 38は、電極基板 7上に積層されて担持される。このとき、第 1の反応試薬層 35、第 2の反応試薬層 36、第 3の反応試薬層 37、および第 4の反応試薬層 38が混合されないようにするために、公知の技術を用いることができる。例えば、第 1の反応試薬層を形成する際に、カルボキシメチルセルロース (CMC)のような高分子材料との混合層を形成することによって、第 2の反応試薬層 36は水溶性の薄膜状とすることができる。次にポリビニルピロリドン (PVP)のような親水性高分子膜を第 2の反応試薬層 36の上に形成する。次に、第 4の反応試薬層 38を形成する際には、試薬を PVPが難溶性を示すトルエンのような溶媒に溶解させて滴下することにより、第 1の反応試薬層の成分と交じり合うことなぐ第 4の反応試薬層 38が形成される。第 3の反応試薬層 37と第 4の反応試薬層 38においても、同様のことを繰り返すことにより各反応試薬層の成分が交じり合うことなく形成できる。 PVP膜は水溶性のため、試料溶液の供給により、各反応試薬層 35〜38は速やかに混合される。

[0060] なお、図 3および図 5において、各反応試薬層 35〜38はそれぞれ電極基板 7上に担持した力キヤビティ 32内部であればどのような位置に担持されてもよぐハウジング基板 31のキヤビティ 32側に担持されてもょ、。

[0061] (実施の形態 3)

図 6は、本発明の一実施の形態を示す SNPタイピングセンサの斜視図である。図 3 と同様、電極基板 7と、ハウジング基板 31とから構成されているが、ハウジング基板 3 1には、測定キヤビティ 41の他に、 PCRキヤビティ 42、および測定キヤビティ 41と PC Rキヤビティ 42とを接続する流路 43が設けられている。注入孔 33から、 SNPタイピング測定対象の DNA試料液と共に、 DNAの SNP配列に相補的な配列を持ち、かつ SNP部位を有する DNAプローブと、 DNAポリメラーゼ、デォキシヌクレオチドを含む反応系を注入し、ヒーター等を用いて PCRキヤビティ 42で温度サイクルを実行することによって PCR反応を行うと、 SNPタイピング測定対象の DNAの SNP部位と、 SNP 部位を有する DNAプローブが相補的であった場合、 DNAプローブを伸長させるとともにピロリン酸を生成させることができる。一方、 SNPタイピング測定対象の DNAの S NP部位と、 SNP部位を有する DNAプローブが非相補的な場合、 DNAプローブの伸長は行われず、ピロリン酸は生成しない。その後、 PCR反応の終了した試料液を流路 43を介して測定キヤビティ 41に移動させると、 SNPタイプに応じたピロリン酸の定量を行うことができ、測定対象の DNAの SNPタイピングが可能となる。また、反応キヤビティ 42中に、 DNAの SNP配列に相補的な配列を持ち、かつ SNP部位を有する DNAプローブと、 DNAポリメラーゼ、デォキシヌクレオチドを含む反応系を担持しておけば、注入孔 34から SNPタイピング測定対象の DNA試料液のみを注入することによって、測定対象の DNAの SNPタイピングが可能となる。

[0062] なお、反応キヤビティ 42から流路 43を介して測定キヤビティ 41へと試料液を移動させる手段としては、シリンジポンプ、プランジャーポンプ、ペリスタポンプ等の外部ポンプ、バイオセンサ上に一体型で糸且み込むマイクロポンプ、バイオセンサ自体を回転させることによって得られる遠、力等を用いることができる。

実施例

[0063] (実施例 1)

以下、本発明のバイオセンサについてさらに具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。

[0064] 以下、一実施の形態に係る電極基板を用いて、試料溶液中のピロリン酸の測定を行った実施例について説明する。

[0065] まず、絶縁基板 1として厚さ 188 μ mのポリエチレンテレフタレートのシートに、スパッタリングによって 700オングストロームの金薄膜を形成した。次に、エッチングによつて図 1に示すごとき測定極 2、対極 3、参照極 4、導電性パターン 5、端子 6を同時に形成し、所定の大きさに切り出して、電極基板 7を作製した。測定極 2の電極面積は、

2. Omm²であった。

[0066] また、上記に従って作製した電極基板 7の参照極 4表面に、塩化銀ペースト (DB22

75 日本アチソン株式会社製)を塗布し、 80°C X 30分の条件で乾燥し、参照極 4表面に銀塩化銀電極を形成した。

[0067] 次に、測定用試薬の乾燥担持を行った。各試薬は、電極基板 7上に 2〜4箇所のスポットに分けて滴下した。各スポットに滴下した試薬とスポット位置との関係を表 1に示す。

[0068] [表 1] Λ B C D

Bu f f e r ① ① ① ①

M g C 1₂ ① ① ① ①

K₃ F e CN) ① ① ① ①

NAD + ① ① ① ④

GAP ① ② ③ ③

P P a s e ② ② ② ②

GAPDH ② ② ② ②

D P ② ② ② ②

B u f f e r ： 1 M トリシン緩衝液（ p H 8. 0 ) 1 μ 1

Mg C 1 ： 1 OmM 塩化マグネシウム 3. 2 1

K₃F e (CN) ₆ ： 10 OmM フェリシアン化カリウム 0. 2 1 GAP : 3 OmM グリセルアルデヒド 3 リン酸 0. 7 μ 1

NAD⁺ ： 1 OmM 酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド 2 μ 1

PP a s e ： 200 U/m 1 ピロホスファターゼ 0. 5 μ 1

GAPDH： 80 OU/m 1 グリセルアルデヒド— 3 リン酸デヒドロゲナ

0. 8 1

DP ： 1 00 OU/m 1 ジァホラーゼ 0. 2 1

①：第 1の反応試桀層 35

②：第 2の反応試薬層 36

③：第 3の反応試薬層 37

④：第 4の反応試薬層 38

[0069] このように、試薬スポットを形成した電極基板 7を真空チャンバ一内に静置して、室温で 30分間真空乾燥を行った。このようにしてピロリン酸センサ A〜Dを作製した。

[0070] ここで試料溶液として、 0 M、 50 Mおよび 100 μ Μ ピロリン酸水溶液をそれぞれの電極基板上に 20 1滴下し、ピペッティングを行った後、 30°C5分間の条件でィンキュベートを行い、参照電極 4に対して 600mVの電位を測定電極 2に印加し、そのとき測定電極 2に流れた電流値を測定した。

[0071] 各ピロリン酸濃度における電位印加 60秒後の電流値をグラフにしたものを図 7に示す。

[0072] センサとして利用するためには、それぞれのグラフの傾きが大きぐ直線性が良いほうが好まし、ことは言うまでもな！/、。

[0073] 酵素と、その他の試薬を分離しただけのピロリン酸センサ A (2スポット）では、ノックグランドが高く、定量性が得られな力た。

[0074] GAPを酵素と同じスポットに滴下したピロリン酸センサ B (2スポット）では、ピロリン酸の濃度に応じた電流値が観察された。

[0075] GAPを単独スポットとしたピロリン酸センサ C (3スポット）では、グラフの傾きが大きくなった。 [0076] さらに NAD+を単独スポットとしたピロリン酸センサ D (4スポット）では、ヽっそう傾きが大きくなり、直線性も増した。

[0077] (実施例 2)

以下、一実施の形態に係る SNPタイピングセンサを用いて、試料溶液中の DNAの

SNPタイピングを行った実施例について説明する。

[0078] まず、実施例 1と同様に、ピロリン酸センサ Gを作製した。

[0079] ただし、ハウジング基板 31として、図 6に示すごとぐ測定キヤビティ 41の他に、 PC Rキヤビティ 42、および測定キヤビティ 41と PCRキヤビティ 42とを接続する流路 42が設けられているものを使用した。反応試薬層の配置は、実施例 1のサンプル C (3スポットタイプ）と同一である。

[0080] SNPタイピングのモデルとして、テンプレートとして Control Template ( λ DNA)

(寳酒造製）を用い、完全マッチプライマーとして TaKaRa PCR Amplification Kit (寳酒造製）の Control Primer 1 (5，一 GATGAGTTCGTGTCCGTACAA CT- 3'：配列番号 1)および Primer3 ( 5 ' - GGTTATCGAAATCAGCCACAG CGCC— 3'：配列番号 2)、一塩基ミスマッチプライマーとして、改変 Primerl' (5'— G ATG AGTTCGTGTCCGTAC AAC A - 3'：配列番号 3)および Primer3を用いて測定を行った（500bp増幅用）。

[0081] 注入孔 33から、蒸留水 12. 4 1、 10 X Z— Taq™Buffer 2. 0 1、 2. 5mM e ach dNTP Mixture 1. 6 1、 25 g/ 1 BSA 0. 8 μ \, 2. 5U/ μ \ TaK aRa Z-Taq™ 0. 2 1、および 20pmolZ 1 Primer 1および Primer 3各 1. 0 1、 1 g/ml λ DNA 1. Ο μ 1およびをカ卩えた（総量 20 μ 1)センサを SNPタイピングセンサ X、 Primerlの代わりに Primer 1'をカ卩えたセンサを SNPタイピングセンサ Yとして、 PCR反応を、 98°C1秒、 55°C1秒、 72°C 10秒の条件で 30サイクル行った。 PCR反応が終了した溶液を、 PCRキヤビティ 42から流路 42を通して測定キャビティ 41へと送液し、実施例 2と同様に測定した結果を表 2に示す。

[0082] [表 2]

S N Pタイビングセンサ X S N Pタイビングセンサ Y

6 0秒後の電流値 2 5 2 n A 7 8 n A [0083] 表 2から明らかなように、プライマーとして铸型である λ DNAの塩基配列と完全に相補的な Primerlおよび Primer3を用いた SNPタイピングセンサ Xでは、 PCRキヤビティ 42において行われた PCR反応の進行によって生成されたピロリン酸が測定キャビティ 41における電気化学測定によって検出された。一方、 SNPタイピングセンサ Yにおいては、 Primerl'の 3'末端側力铸型である λ DNAの塩基配列と相補的でないため、テンプレート λ DNAを铸型とした Primer3による伸長反応が行われただけで、 PCRによる増幅反応は進行せず、よって電流はほとんど観察されな力つた。よつて、 SNPタイピングセンサ Xおよび Yを用いることによって、 SNP部位のモデルである一塩基ミスマッチのタイピングを行うことができた。

[0084] S列表のフリーテキスト]

配列番号 1の〈223〉：プライマー

配列番号 2の〈223〉：プライマー

配列番号 3の〈223〉：プライマー

産業上の利用可能性

[0085] 本発明によれば、プライマー伸長反応を利用した方法によるピロリン酸の測定方法において、簡便かつ高感度にピロリン酸を検出することが可能であるピロリン酸センサ、および SNPタイピングセンサを提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] 絶縁性の基板と、

前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極力ゝらなる電極系とを備えピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼ、ダリセルアルデヒド— 3—リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記基板上に担持されており、

前記ピロホスファターゼが前記緩衝液成分力分離されており、

前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼが前記緩衝液成分から分離されており、

前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸が前記緩衝液成分力分離されており、前記ヌクレオチド類は、酸ィ匕型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型-コチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、またはこれらの組み合わせである、

ピロリン酸センサ。

[2] 前記ダリセルアルデヒド— 3 リン酸力前記ピロホスファターゼ力分離されており前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸が、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼカも分離されている、請求項 1記載のピロリン酸センサ。

[3] 前記ヌクレオチド類力前記ピロホスファターゼ、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸、および前記緩衝液成分の V、ずれからも分離されて!、る、請求項 2に記載のピロリン酸センサ。

[4] 第 1の反応試薬層および第 2の反応試薬層をさらに備え、

前記第 1の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、

前記第 2の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記ダリセルアルデヒド 3 リン酸デヒドロゲナーゼを含み、

前記基板の法線方向から見た場合に前記第 1の反応試薬層と前記第 2の反応試薬層とが分離されて、る、請求項 1に記載のピロリン酸センサ。

[5] 第 1の反応試薬層および第 2の反応試薬層をさらに備え、前記第 1の反応試薬層は、前記緩衝液成分を含み、

前記第 2の反応試薬層は、前記ピロホスファターゼおよび前記ダリセルアルデヒド

3 リン酸デヒドロゲナーゼを含み、

前記基板の法線方向から見た場合に前記第 1の反応試薬層と前記第 2の反応試薬層とが積層されて、る、請求項 1に記載のピロリン酸センサ。

[6] 前記第 1の反応試薬層および第 2の反応試薬層が、前記測定極上に積層されて形成されている、請求項 5記載のピロリン酸センサ。

[7] 絶縁性の基板と、

前記絶縁性の基板上に形成された少なくとも測定極と対極からなる電極系と、前記電極系を囲うように前記基板上に設置された測定キヤビティと、

前記基板上に設置された反応キヤビティと、

前記測定キヤビティと前記反応キヤビティを繋ぐ流路を含み、

ピロホスファターゼ、グリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、ジァホラーゼ

、ダリセルアルデヒド— 3—リン酸、ヌクレオチド類、電子メディエータ、および緩衝液成分が前記測定キヤビティ内に担持されており、

SNPタイピングセンサ。

[8] 前記ダリセルアルデヒド一 3—リン酸力前記ピロホスファターゼ力分離されており前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸が、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロ

、る、請求項 7記載の SNPタイピングセンサ。

[9] 前記ヌクレオチド類力前記ピロホスファターゼ、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ、前記ダリセルアルデヒド 3—リン酸、および前記緩衝液成分のいずれからも分離されている、請求項 8に記載の SNPタイピングセンサ。

[10] 前記反応キヤビティにぉ、て、 DNA増幅反応を行うことを特徴とする、請求項 7に記載の SNPタイピングセンサ。

[11] 前記 DNA増幅反応が、 PCR反応であることを特徴とする、請求項 10記載の SNP タイピングセンサ。