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WO2005106472A1 - バイオチップの製造方法、バイオチップ、バイオチップ解析装置、バイオチップ解析方法 - Google Patents

バイオチップの製造方法、バイオチップ、バイオチップ解析装置、バイオチップ解析方法 Download PDF

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Publication number
WO2005106472A1
WO2005106472A1 PCT/JP2005/008312 JP2005008312W WO2005106472A1 WO 2005106472 A1 WO2005106472 A1 WO 2005106472A1 JP 2005008312 W JP2005008312 W JP 2005008312W WO 2005106472 A1 WO2005106472 A1 WO 2005106472A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biochip
infrared light
active layer
probe
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/008312
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tsuneo Urisu
Kouichi Suzui
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to US11/578,081 priority Critical patent/US20080304068A1/en
Priority to JP2006512864A priority patent/JP4302735B2/ja
Priority to EP05736647A priority patent/EP1742054A4/en
Publication of WO2005106472A1 publication Critical patent/WO2005106472A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a biochip for detecting the presence or absence of a test substance in a sample. More specifically, the present invention relates to a novel biochip manufacturing method, an excellent biochip manufactured by the method, a biochip analysis device formed by incorporating such a biochip, and a biochip analysis device using the biochip analysis device. And the method of analyzing the photos.
  • the “biochip” is typically exemplified by a protein chip, a nucleic acid chip (DNA chip), a cell chip and the like.
  • a method of analyzing a protein chip includes a method of analyzing a protein chip surface by a reaction between the protein on the protein chip surface and the test substance.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • Reference 1 below describes an example of the surface plasmon resonance method.
  • FIG. 2 discloses an example of an antibody chip by Fourier transform reflection infrared spectroscopy.
  • a self-assembled monolayer SAM is formed on a surface-treated gold-coated glass slide, on which a specific antibody is immobilized.
  • the first problem is the inactivation of functional proteins immobilized as probes on the surface of gold and the inactivation (or death) of cell activity.
  • active functional proteins and live cells come into direct contact with gold, which inactivates or inactivates cellular activities. Or it will no longer function as a probe.
  • the second problem is more essential and difficult to overcome. That is, according to the experience of the inventor of the present application, it is difficult to configure the flatness of the gold surface such that the height difference is several tens nm or less as long as the conventional chip manufacturing method is followed. In contrast, normal functional proteins are often less than 10 nm in size, for example, the diameter of serum albumin is about 5 nm. Nucleic acids for general probes are even smaller. As a result, the probe is immobilized on a base with surface irregularities that are much larger than its size, and the orientation and attitude during the immobilization are significantly random. Therefore, the reliability is low in the sense that the binding efficiency of the probe to the sample is low and the binding efficiency varies for each chip product.
  • (1) a metal layer is formed on a solid base, and (2) a nonmetallic material is deposited on the metal layer by vapor deposition, sputtering or chemical vapor deposition (CVD).
  • annealing is performed to form an active layer made of a nonmetallic material having a thickness smaller than the wavelength of the infrared light and a flatness of the surface is 5 nm or less, and (3) the surface of the active layer.
  • the active layer made of a nonmetallic material is formed on the metal layer, the protein, the living cell, and the like as the probe do not come into direct contact with the metal such as gold, and the probe as the probe. Less likely to inactivate proteins or inactivate the activity of cells as probes.
  • the metal layer and the active layer thereabove are formed extremely flat. Its flatness is usually less than 5 nm. In particular, when an amorphous nonmetallic material is deposited on the metal layer, the height difference can be made 1 nm or less.
  • the probe immobilized on the surface of the active layer ( ⁇ ) is immobilized in a fixed orientation and posture with almost no restrictions due to the unevenness of the immobilized surface. It is highly reliable in that it combines with high efficiency and stabilizes the binding efficiency of each biochip.
  • the constituent material of the metal layer is not particularly limited.
  • cobalt Co
  • cobalt silicide platinum
  • gold silver
  • an alloy thereof can be used.
  • Cobalt is particularly preferred.
  • a metal material other than cobalt, such as gold or silver is used, the original function of the metal layer is not hindered, but it may be easy to separate from the non-metal material layer during annealing.
  • a second metal layer such as Cr between the metal layer and the non-metal material layer, it is possible to improve the problem of easy peeling.
  • the annealing according to the first invention is performed at a temperature of 300 ° C. to 800 ° C. in an inert gas atmosphere.
  • the annealing conditions are as follows: under an inert gas atmosphere, at 300 ° C.
  • the condition of 800 ° C. is particularly preferred. If annealing is performed under aerobic conditions, there is a concern that large irregularities are likely to be generated on the surface (fixed surface) of the active layer. If the annealing is performed at a temperature lower than 300 ° C., the metal layer and the active layer (nonmetallic material layer) become fragile, and there is a concern that the metal layer and the active layer may be easily separated in a subsequent chemical treatment step. On the other hand, when the annealing under the condition of more than 8 0 0 ° C, breaking of the metal layer and the active layer are concerned.
  • a semiconductor material or an electrically insulating material is used as the nonmetallic material according to the first invention or the second invention.
  • the type of nonmetallic material (preferably, amorphous nonmetallic material) constituting the active layer is not limited, but it is possible to prevent the deactivation of the probe, the ease of chemical treatment for fixing the probe, and the use of chemicals in the active layer itself. It is preferable to use a semiconductor material or an electrically insulating material from the viewpoint that the resistance of the material is required.
  • the fourth invention of the present application is directed to a non-metallic material having a metal layer on a solid base, having a film thickness smaller than the wavelength of infrared light on the metal layer, and having a surface flatness with a height difference of 5 nm or less.
  • a biochip having an active layer and having a probe immobilized on the surface of the active layer.
  • the biochip of the fourth invention has a non-metallic active layer on the metal layer to inactivate proteins as probes and inactivate cell activities as probes.
  • the active layer has a very flat surface, the binding efficiency of the immobilized probe to the test substance is high, and the binding efficiency of each biochip is constant and reliable. High re ,.
  • the biochip of the fourth invention is a chip for performing infrared reflection absorption spectroscopy analysis, wherein the test substance is identified from the contrast of the infrared reflection absorption spectrum before and after the probe binds to the test substance.
  • the active layer is formed to a thickness smaller than the wavelength of the infrared light, and more preferably to a sufficiently small thickness, and a metal layer is buried under the active layer, the chip becomes a metal layer against the infrared light. This means that infrared reflection absorption spectroscopy analysis can be performed effectively.
  • the probe according to the fourth invention is a protein, a polynucleotide, a sugar chain or a cell.
  • the biochip of the present invention include a protein chip, a nucleic acid chip (DNA chip), a sugar chain chip, and a cell chip as in the fifth invention.
  • the type of “protein” is not limited, but includes proteins that are antigens or antibodies, proteins that are receptors, and more broadly, proteins that can specifically bind to specific ligands. included.
  • the term “ligand” is a concept including various organic or inorganic chemical substances, proteins, and various cells such as cancer cells. Polynucleotides include DNA and RNA, which are not limited to single strands. Living cells are particularly useful as the cells.
  • the active layer according to the fourth invention or the fifth invention is made of a semiconductor material or an electrically insulating material.
  • the constituent material of the active layer is not particularly limited as long as it is a nonmetallic material.
  • a semiconductor material or an electrically insulating material is particularly preferable for the reason described above with respect to the third invention.
  • the active layer of the fourth invention to the sixth invention according to the present invention has a B-thickness of 200 nm or less in a type corresponding to the use of infrared light of p-polarized light.
  • the thickness is 600 nm or more for the type that uses s-polarized infrared light.
  • the active layer has a thickness smaller than the wavelength of the infrared light.
  • the phase shift between the incident light and the reflected light is detected at zero or a value close to 2 ⁇ on the fixed surface of the protein. Because of the higher sensitivity, a protein chip that uses ⁇ -polarized infrared light has a thickness of 200 nm or less, and a protein chip that uses s-polarized infrared light has a thickness of 600 nm. It is preferable that the film thickness is not less than nm.
  • a modified layer having a reactive group is formed on the surface layer of the active layer according to any of the fourth to seventh inventions, and a chemical reaction with the reactive group is performed. Probe is immobilized by binding.
  • the method for immobilizing the probe protein on the surface of the active layer is not necessarily limited, but one preferable method is a chemical modification method. In other words, this is a method in which a modified layer having a reactive group is formed on the surface of the active layer, and the probe protein is immobilized by a chemical bond with the reactive group.
  • a ninth invention of the present application in the case where the probe according to the fourth invention to the eighth invention is a protein, a lipid bilayer is formed on the surface of the active layer, The probe is fixed while being buried in the double membrane.
  • a method for immobilizing the probe protein on the surface of the active layer a method in which a lipid bilayer is formed on the surface of the active layer and the probe protein is immobilized in a state buried in the lipid bilayer is also mentioned.
  • the orientation of the immobilized probe protein can be controlled by embedding the hydrophobic region of the probe protein in the lipid bilayer in a state of penetrating the lipid membrane.
  • This method is particularly suitable for immobilizing proteins that are complex in structure and easily transactivate, such as ion channels and receptor proteins, which are transmembrane.
  • a method using such a lipid bilayer membrane has been conventionally proposed as an excellent method capable of immobilizing a probe protein in a fixed orientation or posture.
  • the lipid bilayer is necessarily formed with large irregularities.
  • a spacer layer having a further space for forming a liquid reservoir is provided on the active layer according to any of the fourth to ninth inventions.
  • test substance eg, protein
  • the probe is brought into contact with a probe and subjected to infrared reflection absorption spectroscopy analysis.
  • the spacer layer according to the tenth invention has a constant thickness in the range of 0.2 to 100; um.
  • the thickness of the spacer layer (the depth of the liquid reservoir) is preferably in the range of 0.2 to 100 m, more preferably in the range of 0.2 to 10 ⁇ . If the thickness exceeds 100 1m, infrared light will be absorbed by the water in the reservoir, and the noise near 170 cm- 1 , which is important for proteins, will increase, making measurement difficult. is there. If the thickness is less than 0.2 ⁇ , the flow of the sample liquid in the liquid reservoir may be hindered.
  • the 12th invention of the present application is directed to a biochip according to any one of the 4th to 11th inventions, a flow-through means for supplying a sample liquid containing a test substance to the biochip, And a optics system for receiving infrared light and detecting the reflected infrared light.
  • the biochip analyzer of the 12th invention comprises a biochip, a liquid passing means, and an optical system, it is a troublesome and expensive reaction analysis system such as one utilizing a color reaction or a chemical reaction. And the ability to obtain measurement and analysis results quickly.
  • the optical system according to the twenty-second invention further includes a prism installed on a biochip.
  • the biochip analyzing apparatus of the above-mentioned 12th invention preferably includes a prism installed on the biochip.
  • the biochip according to the 12th invention or the 13th invention is installed in a space capable of realizing a substantially empty state.
  • the liquid passage means includes a liquid reservoir in a biochip provided with a spacer layer, and a liquid reservoir in the biochip. And a flow passage structure provided with a flow passage through which the sample liquid flows in and out.
  • the configuration of the liquid passing means provided in the biochip analyzer is not limited, but preferably, as in the fifteenth invention, a liquid reservoir formed by one spacer of the biochip, and a sample liquid stored in the liquid reservoir. And a flow-through structure provided with a flow-through path for inflow and outflow.
  • a sixteenth invention of the present application is a biochip analysis method comprising performing at least the following steps (1) to (3) using the biopsy analysis device according to any one of the twelve to fifteenth inventions. It is.
  • the sample liquid is supplied to the biochip, the test substance in the sample liquid is brought into contact with the probe to be adsorbed, and then infrared light is incident on the biochip, and the reflected infrared light is transmitted to the biochip.
  • the biochip analysis method of the sixteenth aspect of the present invention provides a method for analyzing a test substance from a spectrum having a ratio of the infrared reflection absorption spectrum as a packed ground in (1) and the infrared reflection absorption spectrum as a signal in (2). Since the identification is performed, the analysis is easy and quick, and the adsorption reaction that is not the target of detection can be excluded, so the analysis is accurate.
  • the incidence of infrared light and the collection of reflected infrared light according to (1) and (2) according to the sixteenth invention are performed via the prism.
  • the incidence of infrared light on the measurement target and the collection of reflected infrared light be performed via a prism.
  • the incident angle of infrared light incident on the biochip according to the sixteenth invention or the seventeenth invention is set to an oblique incidence of 60 ° or more.
  • the incident angle of the infrared light on the biochip is preferably set to an oblique incidence of 60 ° or more. If the incident angle is too large when using a prism, infrared light may be reflected at the bottom of the prism, and the infrared light reaching the biochip may be weakened, resulting in reduced sensitivity.
  • the supply of the sample liquid according to any one of the sixteenth invention to the eighteenth invention is performed with respect to a liquid reservoir in a biochip provided with a spacer layer. When it is performed, it is incident on the liquid reservoir and reflected by the biochip. The process of guiding the infrared light further to the liquid reservoir and reflecting the infrared light on the biochip is repeated at least once.
  • the means for further guiding the reflected infrared light according to the 19th invention to the liquid reservoir is a prism provided on a biochip.
  • FIG. 1 shows an embodiment of a protein chip as an example of a biochip.
  • FIG. 2 shows the degree of unevenness on the surface of the active layer of the biochip manufactured in the example.
  • FIG. 3 shows an infrared absorption spectrum diagram of avidin.
  • FIG. 4 shows an atomic force microscope image of the surface of a biochip on which avidin is immobilized. 5 and 6 show the dependence of the sensitivity of the infrared reflection absorption spectrum measurement of the biochip on the thickness of the active layer.
  • FIG. 7 shows an embodiment of the sample holder.
  • FIG. 8 is a plan view of FIG.
  • FIG. 9 shows an embodiment of a biochip analyzer.
  • FIG. 10 is a plan view of FIG.
  • FIG. 11 shows another embodiment of the biochip.
  • FIG. 12 shows a preferred embodiment of the biochip analysis method.
  • the term “the present invention” simply refers to a group of corresponding inventions among the first invention to the twentyth invention.
  • a metal layer 2 is provided on a solid base 1, and a thin-film active layer 3 made of a nonmetallic material is provided on the metal layer 2.
  • a modified layer 4 described later is formed on the surface of the active layer 3, and a probe protein 5 capable of adsorbing a test substance (for example, a test protein) 6 is immobilized on the modified layer 4.
  • a probe protein 5 capable of adsorbing a test substance (for example, a test protein) 6 is immobilized on the modified layer 4.
  • the major feature of this protein chip is that it can be used for infrared reflection absorption spectroscopy analysis due to the above configuration.
  • the shape and size of the solid base is not limited. Although solid base of the material can be arbitrarily selected, for example S i, S i 0 2, quartz, ceramic box of titania is preferably exemplified.
  • the constituent material of the metal layer is not particularly limited.
  • cobalt, chromium, cobalt silicide, platinum, gold, silver, or the like can be used, or a combination thereof, or an alloy thereof can be used.
  • the thickness of the metal layer may be set arbitrarily, and may be, for example, about 0.5 to 1 ⁇ .
  • a known method such as a vapor deposition method—sputtering or chemical vapor deposition (CVD) can be used.
  • the active layer has a thickness smaller than the wavelength of the infrared light, and more preferably a thickness sufficiently smaller than the wavelength of the infrared light.
  • the preferred thickness of the active layer is different depending on the infrared light used. The thickness of 200 nm or less for the type that uses polarized infrared light, and the thickness of 200 nm or less for the type that uses s-polarized infrared light. A thickness of at least 600 nm is preferred.
  • the type of the nonmetallic material forming the active layer is not particularly limited, but more preferably, a semiconductor material or an electrically insulating material is used.
  • the semiconductor material include silicon, gallium arsenide, and germanium.
  • the electrically insulating material include various ceramics such as silica and alumina, and polymer materials.
  • methods such as vapor deposition, sputtering, and CVD can be used.
  • the active layer preferably has a highly flat surface, for example, a flatness with a height difference of 5 nm or less.
  • the surface of the active layer has a role of immobilizing the probe protein.
  • the surface layer of the active layer may be a modified layer having a reactive group as described above, A self-organized organic monomolecular film can be formed on the surface.
  • a reactive group such as a carboxyl group or a amino group is added to the surface layer of the active layer by various known chemical modification methods. Although various such chemical modification methods are known, the description of each specific method is omitted.
  • the probe protein can be immobilized by a chemical bond with these reactive groups.
  • avidin (avidin) is once bound to the reactive group, and biotin is introduced into the probe protein, and the probe protein can be immobilized by avidin-biotin binding.
  • avidin-biotin binding Such a method itself is known for a protein chip or the like, but this method complicates the process, but has a great effect of preventing denaturation of the probe protein, and furthermore, the orientation of the immobilized probe protein. Can be controlled to sharpen the adsorption effect on the test protein.
  • a case where a lipid bilayer is formed is preferably exemplified.
  • a method for forming a lipid bilayer in such a case for example, a method described in the following “Reference 5” can be exemplified.
  • This method also complicates the process, but has a great effect of preventing the deformation of the probe protein, and controls the orientation of the immobilized probe protein to sharpen the adsorption effect on the test substance. Can be.
  • a silane coupling agent is allowed to react on the surface of the active layer, and a hydrolysis reaction or the like is further applied to form a modified layer having a reactive group such as a carboxyl group or a amino group on the surface.
  • a hydrolysis reaction or the like is further applied to form a modified layer having a reactive group such as a carboxyl group or a amino group on the surface.
  • the surface of the active layer obtained as described above has a flatness of 5 nm or less in height difference.
  • an amorphous nonmetallic material is deposited on a metal layer, it is not particularly difficult to reduce the flatness to a height difference of Inm or less.
  • a probe can be fixed on the surface of such an active layer by an appropriate method.
  • copanoleto is deposited to a thickness of about 20 to 100 nm on the surface of the clay-based solid base by sputtering, and an amorphous Si0 2 active layer is deposited thereon by sputtering to form a layer of 100 to 25 nm.
  • This is deposited to a thickness of O nm and annealed in a nitrogen atmosphere at 300 to 800 ° C. for 30 minutes to 1 hour.
  • FIG. 2 shows the degree of unevenness of the surface of an example of the active layer thus obtained. The difference in height is not more than 1 nm, and the flatness is surprising.
  • FIG. Figure 9 shows the infrared absorption spectrum of avidin.
  • the spectrum lines a and b are the measurement results according to the present example.
  • the spectrum lines c and d are the measurement results according to the comparative example in which avidin was adsorbed by mere physical adsorption, regardless of the chemical modification as in the case of the spectrum lines a and b.
  • the spectral lines a and c are infrared absorption spectra for vertically polarized light, and the spectral lines b and d are infrared absorption spectra for horizontally polarized light.
  • “Absorbance” in the vertical direction indicates the scale of Absorbance, a unit that indicates the degree of light absorption by a substance.
  • FIG. 4 shows an atomic force microscope image of the surface of the above-mentioned Pyo chip immobilized with Rvidin.
  • Avidin which is several nanometers in size, is imaged as a white spot on a black background, one molecule at a time. This figure is, as far as the inventor knows, the first image in the world of one protein molecule measured on a substrate capable of measuring an infrared reflection absorption spectrum.
  • a method comprising the following first step and second step is particularly excellent.
  • First step The annealing-completed chip of Example 1 is immersed in a 0.5 ⁇ litter of carbomethoxyethyltrichlorosilane in a toluene solution at 18 ° C for about 1 hour, and then toluene, acetone, methanol, Wash sequentially with pure water.
  • Second step Next, immerse in concentrated hydrochloric acid solution for 3 to 8 hours to perform hydrolysis.
  • the sensitivity of infrared reflection absorption spectrum measurement: AR / R active individual layer thickness 5 and 6 show the results of calculation of the dependence on the wavelength for three types of wavelengths: 1000 cm- ', 2000 Ocm-', and 300 cm- 1 .
  • Fig. 5 shows the case of p-polarized infrared light
  • Fig. 6 shows the case of s-polarized infrared light. 5 and 6, the numbers on the horizontal axis represent the thickness of the active layer in nm.
  • the thickness of the self-assembled film corresponding to the active layer is usually as thin as several nm to several tens nm, so that it is sensitive only to p-polarized light and cannot be measured for s-polarized light.
  • the protein chip analysis device supplies at least the above-described protein chip and a sample liquid containing a test substance to the protein chip. It is configured to include a liquid passing means, and an optical system that irradiates the protein chip with infrared light and detects the reflected infrared light.
  • the above-mentioned protein chip is placed in a space capable of realizing a substantially vacuum state.
  • the above optical system preferably includes a prism installed on a protein chip, but it is also possible to use a reflecting mirror instead of a prism or use a light guide tube such as a glass fiber.
  • the liquid-passing means includes a liquid reservoir in the protein chip provided with a spacer layer, and a liquid-passing structure having a liquid passage through which a sample liquid flows into and out of the liquid reservoir. It is preferable that it is comprised by these. Needless to say, in the configuration of the connecting part of the liquid passing means, it is necessary to pay sufficient attention to securing the vacuum seal.
  • the protein chip analysis method according to the present invention is performed by using the above-described protein chip analysis device and performing at least the following steps.
  • an appropriate liquid other than the sample liquid is passed through the liquid reservoir.
  • a buffer is particularly preferable so as not to denature the probe protein.
  • the buffer may be any of a variety of buffers, such as HEPES. It optionally be selected from ⁇ , can also be used these to those with controlled C a C l 2, N a C 1 or N a OH, etc. added p H.
  • the sample liquid is supplied to the protein chip, and the test substance in the sample liquid is brought into contact with the probe protein to be adsorbed.
  • the incidence of infrared light and the collection of reflected infrared light in the above (1) and (2) be performed via a prism, and the incident angle of infrared light to the protein chip is 60 °. It is particularly preferable to set the angle of incidence at an angle of not less than °. Further, the infrared light that has been incident on the liquid reservoir of the protein chip and reflected by the protein chip is further guided to the liquid reservoir and reflected by the protein chip. It is particularly preferred that the step of repeating is repeated at least once.
  • FIGS. 7 and 8 An example of the protein chip analyzer according to the present invention will be described with reference to FIGS. 7 and 8.
  • the protein chip P is placed at a predetermined position on the sample stage 1.1, and the O-ring 10 is placed so as to surround the periphery.
  • the O-ring 10 is made of an elastically deformable material and has a larger thickness than the protein chip P.
  • an infrared light transmitting prism 7 is superimposed on the protein chip P.
  • the prism 7 is in close contact with the upper surface of the protein chip P in a state where the first ring 10 is compressed by using the holding member 8. Therefore, the protein chip P can be airtightly shielded from the outside by the sample stage 11, the prism 7, and the first ring 10.
  • a liquid reservoir 26 is formed on the active layer of the protein chip P.
  • the prism 7 and the holding member 8 are provided with a liquid passage 9 communicating with the liquid reservoir 26.
  • the sample stage 11 is supported by a column 13 on a stage 14, and a Peltier element 12 for controlling the temperature of the protein chip P together with the sample stage 11 is attached to the lower part of the sample stage 11. Have been.
  • the entire apparatus shown in FIGS. 7 and 8 is hereinafter referred to as a sample holder SH.
  • the sample holder SH is set in the main vacuum chamber 15. Then, an infrared light beam (IR) output from a Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) not shown is made incident on the surface of the protein chip P through a duct 18 through a condenser mirror 16. 19 is an exhaust duct.
  • IR infrared light beam
  • FTIR Fourier transform infrared spectroscopy
  • the incident angle of the infrared light beam is an important parameter that greatly affects the sensitivity.
  • the refractive index of water and B a F 2 at a wavelength of 6 ⁇ at the absorption peak of water is respectively Since the angles of incidence are 1.25 and 1.45, if the angle of incidence on the prism bottom is 55 degrees, .57 or 58 degrees, the angle of incidence of the infrared beam on the protein chip surface is 71.9 degrees, 76.6 degrees and 79.6 degrees respectively.
  • the incident angle of the infrared light beam on the prism bottom (e in Fig. 4) is calculated as follows. It is desirable that the temperature be on the order of degrees. If the incident angle is too large, the infrared light will be reflected at the bottom of the prism, and the infrared light reaching the protein chip will be weakened. Degree may decrease. For example, at a power of S58 degrees, the reflection loss is about 19% (calculated value) at a wavelength of 6 ⁇ m.
  • C a F 2 is more resistant to water than B a F 2
  • the C a F 2 is prismatic unless the lower limit of the measurement area is close to 100 cm 1 '.
  • the angle of incidence is also calculated and set in the same way as for B a F 2.
  • the refractive index of C a F 2 is The angle is 71 degrees because it is slightly smaller than B a F 2. In this case, the angle of incidence in water is about 83 degrees.
  • the focal length of the focusing mirror 16 is set so that infrared light is focused on the surface of the protein chip P. If necessary, a window plate 17 of B a F 2 may be attached so that the vacuum state of the main vacuum chamber 15 can be shut off from the duct 18.
  • the infrared light reflected on the protein chip P is focused on the detector 24 by the focusing mirror 23 installed in the mirror tank 22.
  • the detector 24 for example, a mercury-powered domestic telluride detector or the like is used.
  • the airlock champer 20 is connected to the main vacuum chamber 15 via an airtight valve 21 so that the sample holder SH is connected to the main vacuum chamber 1.
  • a mechanism that can reciprocate between 5 and the airlock chamber 120 may be provided. For example, if you want to assemble the sample holder SH and replace the protein chip P, etc., move the sample holder SH to the airlock chamber 20 and close the airtight valve 21 before closing the airlock chamber 20. After performing the required work after releasing the vacuum, the airlock champer 20 is closed, the hermetic valve 21 is opened, and the sample holder SH is returned to the main vacuum chamber 15 before degassing. By performing such a procedure, the time required for the main vacuum chamber 15 to reach the required degree of vacuum can be significantly reduced.
  • the upper half shows a plan view of the protein chip, and the lower half shows the front view correspondingly.
  • a spacer layer 25 having a hollow space is provided in a shape shown by a broken line.
  • a liquid reservoir 26 is formed on the active layer of the protein chip P.
  • the thickness of the spacer layer 25 (and thus the liquid reservoir 26) is an important parameter.
  • the width of the liquid flow in the liquid reservoir 26 is
  • Width L in FIG. 11 is set to 10 mm, and the absorption of infrared light by the water in the liquid reservoir 26 is evaluated.
  • Absorption coefficient at a wavelength of 6 m of the position of the absorption peak of water a 0. 2 7 4 since 2 X 1 0 4, losses due to absorption of water, 5 5 degrees incident angle of the infrared light beam to the prism surface, If the angle is 57 degrees or 58 degrees, the incident angles of the infrared light beam on the protein chip surface are 71.9 degrees, 76.6 degrees, and 79.6 degrees, respectively, so the loss is 8 3 %, 91%, and 95%.
  • the bottom surface or the liquid-passing path of the prism contacted with the sample liquid is a teflon (protein) that is difficult to adsorb proteins. It is also important to coat with a trademark.
  • the protein chip is configured as a microchannel, the structure is not limited to the simple flow path structure shown in the figure, and it is easy to adopt a structure to which other functions such as synthesis and analysis are simultaneously provided.
  • the infrared light radiated and reflected on the liquid reservoir of the protein chip P returns to the prism 7, is totally reflected by the prism 7, and is again in the liquid reservoir. , And the infrared absorption spectrum of the protein is measured several times. This method can increase the measurement sensitivity.
  • a new protein chip for infrared reflection absorption spectroscopy An analysis tool of the category is provided. Also, by using this protein chip, a general-purpose and simple protein chip analysis device and a protein chip analysis method with a small number of measurement steps and high measurement accuracy are provided.

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Abstract

固体ベース上に金属層と、非金属材料からなると共に赤外光波長よりも薄く、かつ非常に平坦な表面を有する活性層とを設け、この活性層の表面にプローブを固定化した、赤外反射吸収分光解析用のバイオチップ。このバイオチップと、これに被検物質を含む試料液を供給する通液手段と、バイオチップに赤外光を入射し反射赤外光を検出する光学系とを含むバイオチップ解析装置。この装置を利用して行うバイオチップ解析方法。これらの発明により、赤外反射吸収分光解析に供し得る新規なバイオチップ、このバイオチップを組み込んだバイオチップ解析装置及びバイオチップ解析方法が提供される。

Description

明 細 書 バイオチップの製造方法、 バイオチップ、
'バイオチップ解析装置、 バイオチップ解析方法 技術分野
本発明は、 試料中における被検物質の存否を検出するためのバイオチップに 関する。 更に詳しくは本発明は、 バイオチップの新規な製造方法と、 この方法に より製造される優れたバイオチップと、 このようなバイォチップを組み込んで成 立するパイォチップ解析装置と、 このパイォチップ解析装置を利用するパイォチ ップ解析方法とに関する。
本発明において、 「バイオチップ」 としては、 タンパク質チップ、 核酸チッ プ （D NAチップ） 、 細胞チップ等が代表的に例示される。 背景技術
従来、 例えばタンパク質チップ （特定のタンパク質に反応する被検物質の存 否を確認するためのチップ） の解析方法としては、 タンパク質チップ表面のタン パク質と被検物質との反応によるタンパク質チップ表面の物性値の変化を参考に する表面プラズモン共鳴法 （S P R： Surface Plasraon Resonance ) や、 被検物 質との反応の結果としての蛍光や放射線の放出を検出する酵素免疫測定法 （E L I S A : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ) 等が知られている。 下記の文献 1には、 表面プラズモン共鳴法の一例が記載されている。
〔文献 1〕 「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験方法」 ― 永田和宏， 半田宏 編集、 シュプリンガー'フエアラーク東京 （株） しかしながら、 上記した従来のタンパク質チップにおける呈色反応や化学反 応を利用する検出法等は、 その全プロセスを遂行するためには手数がかかり、又、 大量に検查することも困難であった。
更に上記の表面プラズモン共鳴法や酵素免疫測定法においては、 プローブタ ンパク質と被検物質とが吸着した力否かを判定できるが、 タンパク質の分子構造 等は調べることができないため、 吸着さえ起これば、 本来は検出対象でない反応 まで検出してしまう。 そのために検出や測定の精度が悪いと言う問題があった。 又、 これらの方法でも、 その全プロセスを遂行するためには多くの手順と大がか りな装置システムを必要とし、 コスト高であった。
そこで、 赤外分光解析等の光学的技術を利用した解析が可能なように構成さ れたタンパク質チップあるいはバイオチップが注目される。 例えば、 下記の文献
2には、 フーリェ変換反射赤外分光法による抗体チップの例が開示されている。 この抗体チップにおいては、 表面処理した金コートのガラススライド上に、 自己 組織化単分子膜 （S AM : self assembled monolayer ) を形成させ、 その上に 特定の抗体を固定ィヒしている。
〔文献 2〕 日本化学会講演予稿集 第 8 4巻 第 1号 （2004) ' A - 7
「簡易診断を目指した次世代チップの開発」 竹中繁織著 更に下記の文献 3にも類似の分子ァレイの開示がある。 この分子ァレイにお いては、 基板に固定化された各種ぺプチドを生体試料中のタンパク質と相互作用 させ、 その後、 顕微フーリエ変換赤外分光測定装置にて、 カルボニル基の赤外吸 収を指針にして検出が可能である旨の記載が見られる。 又、 例えば、 金をコート したガラス基板等へ、 チオール基と金との結合を利用してタンパク質や核酸等を 固定化することも可能である旨の記載がある。
〔文献 3〕 特開 2 0 0 4— 4 5 3 9 0号公報
「分光法を利用した分子ァレイによる検体の分析方法」 上記の文献 2及ぴ文献 3に記載の技術は、 金の表面にチオール系分子の自己 組織ィ匕単分子膜を容易に堆積することができる点を利用している。 しかしながら、 最近、 この種のバイオチップにおける 1， 2の大きな問題点がバイオチップの機 能及び信頼性を低下させていることが、 当業者間に周知されつつある。
第 1の問題点は、 金の表面にプローブとして固定化された機能性タンパク質 の失活や、 細胞活動の不活性ィヒ （又は死） である。 即ち、 活性な機能性タンパク 質や生細胞が金に対して直接に接触することにより、 失活したり細胞活動が不活 性化したりして、 プローブとして機能しなくなると言う問題である。
第 2の問題点は更に本質的で、 かつ克服することが困難である。 即ち、 本願 発明者の経験によれば、 従来のチップ製造方法に従う限り、 金の表面の平坦度を その高低差が数十 n m以下であるように構成することが困難である。 これに対し て、 例えば血清アルブミンの直径が約 5 n mであるように、 通常の機能性タンパ ク質は 1 0 n m以下のサイズであることが多い。 一般的なプローブ用の核酸は更 にサイズが小さい。 その結果、 プローブが、 そのサイズよりはるかに大きい表面 凹凸を伴うベース上に固定化されるため、 その固定時の配向や姿勢が著しくラン ダムになる。 従って、 検体に対するプローブの結合効率が低く、 かつ、 個々のチ ップ製品ごとに結合効率がばらつくと言う意味で、 信頼性が低い。
そのような不具合は、 特に近年、 当該技術分野の専門家の間で注目されてい る。 例えば、 下記の文献 4における第 2 7頁の 「 1. 2. 1. 7. 2」 の項の第 2段落で は、 「· · '測定対象として酵素を含むタンパク質を測定する場合、 タンパク質 は 1 0 n mのサイズであり、 これをうまく捕捉できたとしても、 チップのような 板状の上で測定するのは非常に難しい。 何故ならば、 一般的なスライ ドグラスや プラスチックの表面は優に 1 0 0 n mを超える凹凸があり、 この上で測定対象の タンパク質は凹み部分に入り込んでしまレ、、 検出にばらつきが生じたり、 感度も 低下してしまうからである。 」 と記載されている。
〔文献 4〕 平成 1 5年 3月に財団法人 機械システム振興協会が発行 （委 託先：財団法人 バイオインダストリ一協会） した 「ナノバイオマシン創製のた めの技術及び市場性に関する報告書」 発明の開示
本発明の目的は、 上記の第 1及び第 2の問題点を解決できるバイ才チップと その製造方法を提供することである。 更に本発明の他の目的は、 このようなバイ ォチップであって、 汎用性があり、 装置の小型化が可能で測定の手数が少なく、 かつ測定の精度を確保できる各種のバイォチップと、 それらのバイォチップの解 析手段とを提供することである。 本願の第 1発明は、 （1 ) 固体ベース上に金属層を形成し、 （2 ) 金属層上 に蒸着、 スパッタリング又は化学気相堆積 ( C VD) 法によって非金属材科を堆 積させた後、 アニーリングを行って、 赤外光波長より薄い膜厚を有すると共に表 面の平坦度が高低差 5 n m以下である非金属材料製の活性層を形成し、 （3 ) 活 性層の表面にプローブを固定化する、 バイオチップの製造方法である。
上記の第 1発明によれば、金属層上に非金属材料製の活性層を形成するので、 プローブたるタンパク質や生細胞等は金等の金属に対して直接に接触することが なく、 プローブたるタンパク質の失活や、 プローブたる細胞の活動の不活性化を 起こす恐れが少ない。
又、 活性層の形成に当たり、 まず金属層上に適宜な手段によって非金属材料 を堆積させた後にァニーリングを行なうと、 金属層及びその上層の活性層が極め て平坦に形成される。 その平坦度は通常、 高低差 5 n m以下である。 特に、 金属 層上にアモルファスな非金属材料を堆積させた場合には、 高低差 1 n m以下とす ることもできる。 このような活'(~生層の表面に固定化されたプローブは、 固定化面 の凹凸による制約を殆ど受けることなく一定の配向や姿勢で固定ィ匕される。 その ため、 被検物質に対して高い効率で結合し、 しかも個々のバイオチップごとの結 合効率が安定すると言う意味で、 信頼性が高い。
なお、 金属層の構成材料も特段に限定されないが、 例えばコバルト （C o ) 、 コバルトシリサイド、 白金、 金、 銀等やこれらの合金を用いることができる。 特 にコバルトが好ましい。 コバルト以外の金属材料、 例えば金や銀を用いる場合、 金属層としての本来の機能には支障がなレ、が、 アニーリングの際に非金属材料層 と剥離し易い場合がある。 この場合、 金属層と非金属材料層との間に C r等の第 2の金属層を挿入することにより、 剥離し易いと言う問題を改善することも考え られる。 本願の第 2発明においては、 前記第 1発明に係るアニーリングを不活性ガス 雰囲気下に 3 0 0 ° C〜 8 0 0 ° Cの温度で行う。
即ち、 アニーリングの条件としては、 不活性ガスの雰囲気下、 3 0 0 ° C〜 8 0 0 ° Cと言う条件が特に好ましい。 ァニーリングを好気的な条件下で行うと、 活性層の表面 （固定化面） により大きな凹凸を発生し易くなることが懸念される。 アニーリングを 3 0 0 ° C未満の条件で行うと、 金属層や活性層 （非金属材料層） が脆弱となり、 その後の化学処理工程で剥離し易くなることが懸念される。 一方、 アニーリングを 8 0 0 ° Cを超える条件で行うと、 金属層や活性層の破壊が懸念 される。 本願の第 3発明においては、 前記第 1発明又は第 2発明に係る非金属材料と して半導体材料又は電気絶縁性材料を用いる。
活性層を構成する非金属材料 （好ましくは、 アモルファスな非金属材料） の 種類は限定されないが、 プローブの失活防止、 プローブ固定のための化学処理の し易さ、 活性層自体に化学薬品への耐性が要求される点、 等の理由から、 半導体 材料又は電気絶縁性材料を用いることが好ましい。 本願の第 4発明は、 固体ベース上に金属層を有し、 金属層上には赤外光波長 より薄い膜厚を有すると共に表面の平坦度が高低差 5 n m以下である非金属材料 製の活性層を有し、 かつ活性層の表面にはプローブを固定ィ匕した、 バイオチップ である。
第 4発明のバイオチップは、 第 1発明に関して上記したように、 金属層上に 非金属材料製の活性層を持つことによって、 プローブたるタンパク質の失活や、 プローブたる細胞の活動の不活性化を有効に防止でき、 又、 活性層の表面が極め て平坦であるため、 固定化されたプローブの被検物質に対する結合効率が高く、 かつ個々のバイォチップにおける結合効率が一定していて信頼性が高レ、。
又、 第 4発明のバイオチップは、 赤外反射吸収分光解析を行うチップであつ て、 プローブが被検物質に結合する前後の赤外反射吸収スぺクトルの対比から被 検物質を同定することができる。 従って、 従来型の呈色反応や化学反応を利用す るバイオチップに比較して、 測定の手数が少なく簡易である。 しかも、 被検物質 を同定できるために、 検出や測定の精度が良い。 更に、 活性層を赤外光波長よりも薄い膜厚、 より好ましくは十分に薄い膜厚に 形成し、 かつその下層に金属層を埋め込み型に設けると、 赤外光に対してチップ が金属層の†生質を示し、 赤外反射吸収分光解析を有効に行うことができる。
このバイォチップはプリズムに比較して著しく安価に構成できる。 従ってパイ ォチップを利用する赤外反射吸収分光解析装置の光学系に.高価なプリズムを組み 込むとしても、 プリズムは 1個あれば良く、 安価なバイオチップを多数使用する ことで多くの被検物質解析を行うことができる。 本願の第 5発明においては、 前記第 4発明に係るプローブが、 タンパク質、 ポリヌクレオチド、 糖鎖あるいは細胞である。
本発明のバイオチップとしては、 第 5発明のように、 タンパク質チップ、 核 酸チップ （D NAチップ） 、 糖鎖チップ及び細胞チップが好ましく例示される。 この第 5発明において、 「タンパク質」 の種類は限定されないが、 抗原又は抗体 であるタンパク質、 レセプターであるタンパク質等が含まれ、 より広義には、 特 定のリガンドと特異的に結合し得るタンパク質が含まれる。 ここに 「リガンド」 とは、 有機又は無機の各種の化学物質、 タンパク質、 癌細胞等の各種の細胞も含 む概念である。 ポリヌクレ才チドとしては 1本鎖に限定されない D N Aや R N A が含まれる。 細胞としては、 特に生細胞が有用である。 本願の第 6発明においては、 前記第 4発明又は第 5発明に係る活性層が、 半 導体材料又は電気絶縁性材料からなる。
即ち、 活性層の構成材料は、 非金属材料である限りにおいて特段に限定され ないが、 第 3発明に関して前記した理由から、 半導体材料又は電気絶縁性材料が 特に好ましい。 本願の第 7発明においては、 前記第 4発明〜第 6発明の!/、ずれかに係る活性 層が、 p偏光の赤外光使用対応型においては 2 0 0 n m以下の B莫厚であり、 s偏 光の赤外光使用対応型においては 6 0 0 n m以上の膜厚である。 活性層は赤外光波長よりも薄い膜厚とされるが、 より具体的には、 入射光と 反射光の位相シフトがタンパク質の固定ィ匕された表面でゼロ又は 2 πに近い値で 検出感度が高くなると言う理由から、 ρ偏光の赤外光使用に対応するタンパク質 チップにおいては 2 0 0 n m以下の膜厚、 s偏光の赤外光使用に対応するタンパ ク質チップにおいては 6 0 0 n m以上の膜厚であることが好ましい。
又、 異なる見地から言えば、 本発明のバイオチップは活性層の厚みを 6 0 0 n m以上とすることは容易であるため、後述の実施例 3で具体的に述べるように、 s偏光でのスぺクトル測定も可能となり、 タンパク質等のより精度の高い同定が 可能となる。 本願の第 8発明にお!/、ては、 前記第 4発明〜第 7発明のいずれかに係る活性 層の表層部には反応基を持つ修飾層が構成され、 この反応基との化学的結合によ つてプローブが固定化されている。
活性層の表面にプローブタンパク質を固定ィ匕する方法は必ずしも限定されな いが、 一つの好ましい方法が化学修飾法である。 即ち、 活性層の表面に反応基を 持つ修飾層を構成し、 この反応基との化学的結合によってプローブタンパク質を 固定化する方法である。 本願の第 9発明においては、 前記第 4発明〜第 8発明のレ、ずれかに係るプロ ーブがタンパク質である場合において、 前記活性層の表面に脂質二重膜が構成さ れ、 この脂質二重膜に埋設された状態でプ口ーブが固定化されている。
活性層の表面にプローブタンパク質を固定化する好ましい方法として、 活性 層の表面に脂質二重膜を構成し、 この脂質二重膜に埋設された状態でプローブタ ンパク質を固定ィヒする方法も挙げられる。 この方法による場合、 プローブタンパ ク質の疎水性領域を脂質膜貫通状態で脂質二重膜に埋設させることにより、 固定 化されたプローブタンパク質の配向を制御することが可能である。 この方法は、 特に、 構造が複雑で失活し易いイオンチャンネルや受容体タンパク質等の脂質膜 貫通型のタンパク質を固定ィヒするのに適している。 このような脂質二重膜を利用する方法は、 プローブタンパク質を一定した配 向又は姿勢で固定化できる優れた方法として従来から提案されている。 し力 し、 従来のタンパク質チップにおいては、 前記したように、 脂質二重膜のベース層の 表面が大きな凹凸を伴うため、 脂質二重膜も必然的に大きな凹凸を伴って形成さ れる。 このような脂質二重膜では、 プローブタンパク質を一定した配向あるいは 姿勢で固定化することは困難である。 本願の第 1 0発明においては、 前記第 4発明〜第 9発明のいずれかに係る活 性層上に、 更に液溜部形成用のスペースをくり抜いたスぺーサ一層を設けた。
活性層上に更に液溜部形成用のスペースをくり抜いたスぺーサ一層を設けた バイオチップを用いる場合、 被検物質 （例えば、 タンパク質） を変性し難い試料 液の状態で液溜部に導入してプローブと接触させ、 かつ赤外反射吸収分光解析に 供することができる。
本願の第 1 1発明においては、 前記第 1 0発明に係るスぺーサ一層が 0 . 2 〜1 0 0； u mの範囲内の一定の厚さである。
スぺーサ一層の厚さ （液溜部の深さ） は 0 . 2〜1 0 0 mの範囲內、 より 好ましくは 0 . 2〜1 0 μ πιの範囲内であることが好ましい。 厚さが 1 0 0〃 m を超えると赤外光が液溜部の水に吸収され、 タンパク質にとって重要な 1 7 0 0 c m—1付近のノイズが大きくなつて、 測定が困難となる恐れがある。 厚さが 0 . 2 μ ηι未満であると、 液溜部の試料液の流動に支障を来す恐れがある。 本願の第 1 2発明は、 第 4発明〜第 1 1発明のいずれかに係るバイオチップ と、 このバイオチップに対して被検物質を含む試料液を供給する通液手段と、 前 記バイオチップに赤外光を入射すると共にその反射赤外光を検出する光学系とを 含む、 バイオチップ解析装置である。
第 1 2発明のバイオチップ解析装置は、 バイオチップと、 通液手段と、 光学 系とからなるので、 呈色反応や化学反応等を利用する場合のような面倒で高価な 反応'分析系システムを必要とせず、 かつ、 測定及び解析の結果を迅速に得るこ とができる 本願の第 1 3発明においては、 前記第 1 2発明に係る光学系が、 更にバイオ チップ上に設置されるプリズムを含む。
上記した第 1 2発明のバイオチップ解析装置においては、 詳しくは後述する ように、 バイオチップ上に設置されるプリズムを含むことが好ましい。 本願の第 1 4発明においては、 前記第 1 2発明又は第 1 3発明に係るバイオ チップが、 実質的に寘空状態を実現できる空間に設置されている。
バイオチップを実質的な真空状態に設置することにより、 大気中の水や炭酸 ガス等の影響を受けることなく赤外吸収スぺク トルを測定でき、 より感度の高い 測定が可能となる。 また、 物質による吸収が大きいためプリズム等を用いること ができない、 テラへルツ領域等の数百 c π ι以下の低周波領域の分光も可能とな る。 本願の第 1 5発明においては、 前記第 1 2発明〜第 1 4発明のいずれかに係 る通液手段が、 スぺーサ一層を設けたバイオチップにおける液溜部と、 この液溜 部に対して試料液を流入及び流出させる通液路を設けた通液構造体とによつて構 成されている。
バイオチップ解析装置に設ける通液手段の構成は限定されないが、 好ましく は、 第 1 5発明のように、 バイオチップのスぺーサ一層により形成される液溜部 と、 液溜部に試料液を流入及び流出させる通液路を設けた通液構造体とによって 構成される。 本願の第 1 6発明は、 第 1 2発明〜第 1 5発明のいずれかに係るパイォチッ プ解析装置を用いて、 少なくとも以下の （1 ) 〜 （3 ) の工程を行う、 バイオチ ップ解析方法である。
( 1 ) 未だ被検物質と接触していないパイォチップに対して前記光学系により赤 外光を入射し、 その反射赤外光を赤外反射吸収スぺク トルのバックグラウンドと して測定する工程。
( 2 ) バイオチップに対して試料液を供給し、 試料液中の被検物質をプローブと 接触させて吸着させた後、 バイオチップに対して赤外光を入射し、 その反射赤外 光を赤外反射吸収スぺク トルのシグナルとして測定する工程。
( 3 ) 前記シグナルとバックグラウンドとの比のスペク トルを求め、 これを被検 物質の赤外反射吸収スぺク トルとして被検物質を同定する工程。
第 1 6発明のバイォチップ解析方法は、 （ 1 ) のパックグラゥンドとしての 赤外反射吸収スペク トルと、 （2 ) のシグナルとしての赤外反射吸収スペク トル との比のスぺクトルから被検物質を同定するので、 その解析が容易かつ迅速であ り、 検出対象でない吸着反応は排除できるので解析が正確である。 本願の第 1 7発明においては、 前記第 1 6発明に係る （1 ) 及び （2 ) の赤 外光の入射と反射赤外光の集光とを、 前記プリズムを経由して行う。
上記したパイォチップ解析方法において、 測定対象に対する赤外光の入射と 反射赤外光の集光とを、 プリズムを経由して行うことが好ましい。 本願の第 1 8発明においては、 前記第 1 6発明又は第 1 7発明に係るバイオ チップに対する赤外光の入射における入射角度を、 6 0 ° 以上の斜入射に設定す る。
バイオチップに対する赤外光の入射角度は、 6 0 ° 以上の斜入射に設定する ことが好ましい。 プリズムの使用において入射角度が過剰に大きいと、 赤外光が プリズム底面で反射してしまレ、、 バイオチップに到達する赤外光が弱くなつて、 感度が低下する恐れがある。 本願の第 1 9発明においては、 前記第 1 6発明〜第 1 8発明のいずれかに係 る （2 ) の試料液の供給がスぺーサ一層を設けたバイオチップにおける液溜部に 対して行われる場合において、 液溜部に入射されてバイオチップにより反射され た赤外光を、 更に液溜部に導いてバイオチップにより反射させる過程を少なくと も一回繰り返させる。
第 1 9発明のように赤外光反射を繰り返させることにより、 吸収スぺクトル 力 S強くなって測定感度を高めることができる。 本願の第 2 0発明においては、 前記第 1 9発明に係る反射赤外光を更に液溜 部に導く手段が、 バイォチップ上に設置されたプリズムである。
上記した第 1 9発明のような赤外光反射の繰り返しは、 バイオチップ上に設 置されたプリズムによって行うことができる。 図面の簡単な説明
第 1図はバイオチップの例示としてのタンパク質チップの実施形態を示す。 第 2図は実施例で製造したバイオチップの活性層表面の凹凸の程度を示す。 第 3 図はアビジンの赤外吸収スぺクトル図を示す。 第 4図はアビジンを固定化したバ ィォチップの表面の原子間力顕微鏡像を示す。 第 5図及び第 6図はバイォチップ の赤外反射吸収スぺクトル測定の感度の活性層厚みに対する依存性を示す。 第 7 図は試料ホルダーの実施形態を示す。 第 8図は第 7図の平面図である。 第 9図は バイオチップ解析装置の実施形態を示す。 第 1 0図は第 9図の平面図である。 第 1 1図はバイオチップの他の実施形態を示す。 第 1 2図はバイオチップ解析方法 の好ましい実施形態を示す。 発明を実施するための最良の形態及び実施例
次に本願の第 1発明〜第 2 0発明の実施形態及び実施例を、 その最良の実施 形態及び実施例を含めて説明する。 以下において単に 「本発明」 と言う時は第 1 発明〜第 2 0発明の内の該当する発明群を一括して指している。
〔実施形態 1 ：タンパク質チップ〕
本発明に係るタンパク質チップの一例を第 1図に基づいて説明する。 このタ ンパク質チップにおいては、 固体ベース 1上に金属層 2を設け、 この金属層 2上 に非金属材料からなる薄膜の活性層 3を設けている。 この活性層 3の表層部には 後述の修飾層 4が形成され、 この修飾層 4に対して、 被検物質 （例えば、 被検タ ンパク質） 6を吸着し得るプローブタンパク質 5が固定ィ匕されている。 このタン パク質チップは、 以上の構成により、 赤外反射吸収分光解析用として利用できる 点に大きな特徴がある。
固体ベースの形状及びサイズは限定されない。 固体ベースの構成材料も任意 に選択することができるが、 例えば S i、 S i 0 2 、 石英、 チタニア等のセラミ ックスが好ましく例示される。
金属層の構成材料も特段に限定されないが、 例えばコバルト、 クロム、 コバ ルトシリサイド、 白金、 金、 銀等を用い、 又はこれらを組み合わせて用い、 ある いはこれらの合金を用いることができる。 金属層の厚さは任意に設定すれば良い が、 例えば 0 . 5〜1 μ ιη程度とすることができる。 固体ベース上に金属層を設 けるにあたっては、 例えば公知の蒸着法ゃスパッタリングあるいは化学気相堆積 (C V D) 等の方法を利用することができる。
活性層は、 赤外光波長よりも薄い膜厚、 より好ましくは赤外光波長よりも十 分に薄い膜厚とされる。使用する赤外光に対応して活性層の好適な膜厚が異なり、 偏光の赤外光使用対応型においては 2 0 0 n m以下の膜厚が、 s偏光の赤外光 使用対応型においては 6 0 0 n m以上の膜厚が、 それぞれ好ましい。
活性層を構成する非金属材料の種類は特段に限定されないが、 より好ましく は、 半導体材料又は電気絶縁性材料が用いられる。 半導体材料としては、 ケィ素、 ガリウム砒素、 ゲルマニウム等が例示される。 電気絶縁性材料としては、 シリカ、 アルミナ等の各種セラミックス、 高分子材料等が例示される。 金属層上に活性層 を設けるにあたつても、 例えば蒸着、 スパッタリング、 C VD等の方法を利用で きる。 活'生層は、 その表面が高度に平坦であること、 例えば高低差が 5 n m以下 の平坦度であることが好ましい。
活性層の表面にはプローブタンパク質を固定化する役割があり、そのために、 例えば活性層の表層部を前記のように反応基を持つ修飾層としたり、 活性層の 表面に自已組織化した有機単分子膜を形成したりすることができる。 上記の修飾層を構成する場合、 活性層の表層部に、 公知の各種の化学修飾法 によってカルボキシル基ゃァミノ基等の反応基を付加する。 このような化学修飾 法は種々知られているが、 個々の具体的な方法の記载は省略する。 これらの反応 基との化学結合により、 プローブタンパク質を固定ィ匕することができる。
修飾層において、 反応基に対して一旦アビジン （avidin) を結合させ、 プロ ーブタンパク質にはピオチンを導入しておいて、 ァビジン一ピオチン結合によつ てプローブタンパク質を固定化することもできる。 このような手法自体はタンパ ク質チップ等において公知であるが、 この方法による場合、 プロセスは複雑化す るが、 プローブタンパク質の変性を防止する効果が大きく、 更に固定化されたプ ローブタンパク質の配向を制御して被検タンパク質に対する吸着効果を鋭敏にす ることができる。
活性層の表面に上記の 「自己組織化した有機単分子膜」 を構成する場合とし て、 脂質二重膜を構成する場合が好ましく例示される。 このような場合における 脂質二重膜の形成方法としては、 例えば下記の 「文献 5」 に記載された方法を例 示することができる。
〔文献 5〕 Discrete membrane arrays Y. Cheng, S. D. Ogier, R. J. Bushby, S. D. Evans, Molecular Biotechnology 74 (2000) 159-174
この方法による場合も、 プロセスは複雑化するが、 プローブタンパク質の変 性を防止する効果が大きく、 更に固定ィヒされたプローブタンパク質の配向を制御 して被検物質に対する吸着効果を鋭敏にすることができる。
〔実施例 1〕
次に、 本発明者が特に工夫した化学修飾法 （金属層及ぴ活性層の構成方法） によるバイオチップ製造の実施例を述べる。
即ち、 （1 ) 固体ベース上に金属層を形成し、 （2 ) 金属層上に蒸着、 スパ ッタリング又は化学気相堆積 (CVD) 法によって非金属材料を堆積させた後、 アニーリングを行って、 赤外光波長より薄い膜厚を有すると共に表面の平坦度が 高低差 5 n m以下である非金属材料製の活性層を形成し、 （3 ) 次いで活性層の 表面にプローブを固定化する。 プローブの固定化に当り、 例えば活性層の表面に シランカップリング剤を反応させ、 更に加水分解反応等を加えて、 表面にカルボ キシル基ゃァミノ基等の反応基を付加した修飾層とすることができる。
上記のようにして得られる活性層の表面は、 平坦度が高低差 5 n m以下であ る。 金属層上にアモルファスな非金属材料を堆積させた場合、 その平坦度を高低 差 I n m以下とすることも特段に困難ではない。 このような活性層の表面に、 適 宜な方法でプロ一ブを固定ィ匕することができる。
この実施例の具体的な一例として、 次のケースを挙げることができる。 即ち、 ケィ素質の固体ベースの表面に、 スパッタリングによって、 コパノレトを 2 0〜1 0 0 n m程度の厚さに堆積させ、 その上にスパッタリングによってアモルファス S i 02 活性層を 1 0 0〜2 5 O n mの厚さに堆積させ、 これを窒素雰囲気下、 3 0 0〜8 0 0 ° Cにて 3 0分〜 1時間アニーリングする。 こうして得られた活 性層の一例について、 表面の凹凸の程度を第 2図に示すが、 高低差が優に l n m 以下であって、 驚異的な平坦度である。
更に、 実施例 1により製造したバイオチップ （活性層の表面をカルボキシル 化した後、 そのカルボキシル基に対するァミノ基の反応により、 プローブタンパ ク質としてのアビジンを固定ィ匕したもの） について、 第 3図にアビジンの赤外吸 収スペク トル図を示す。 第 3図において、 スペク トル線 a， bは本実施例に係る 測定結果である。 スぺク トル線 c， dは、 スぺクトル線 a， bの場合のような化 学修飾によらず、 単なる物理吸着によりァビジンを吸着させた比較例に係る測定 結果である。 そして、 スペク トル線 a , cは垂直偏光に対する赤外吸収スぺクト ル、 スペク トル線 b， dは水平偏光に対する赤外吸収スペク トルである。 図中、 縦方向の 「Absorbance」 は、 物質による光吸収の強さの程度を表す単位であるァ ブソーバンスのスケールを表している。
第 3図において、 スペクトル線 c , dの間にはピークのズレが見られないが、 スペク トル線 a， bの間には明らかなピークのズレが認められる。 このことは、 偏光によりスぺクトルのピークがシフトしていること、 即ち、 固定化された多 数のプローブタンパク質の向きが揃っていることを意味する。
更に、 了ビジンを固定化した上記パイォチップの表面の原子間力顕微鏡像を 第 4図に示す。 数ナノメートルの大きさを持つアビジンが、 1分子ずつ、 黒地の 中に白く見える斑点として撮像されている。 この図は、 本発明者が知る限り、 赤 外反射吸収スぺク トルを測定できる基板上で測定されたタンパク質 1分子の世界 で最初の像である。
〔実施例 2〕
上記の実施例 1において述べた活性層表面のカルボキシル化に関して、 以下 の第 1工程及ぴ第 2工程からなる方法が特に優れている。
第 1工程：実施例 1のァニーリングを完了したチップを、 0 . 5 ηιΜΖリッ ターのカルボメトキシェチルトリクロロシランのトルエン溶液に一 8 ° Cで約 1 時間浸漬し、 次いでトルエン、 アセトン、 メタノール、 純水で順次洗浄する。
第 2工程：次に、 濃塩酸溶液に 3〜 8時間浸漬し、 加水分解を行う。
〔実施例 3〕
本願の第 7発明に関し、 上記の実施例 1のように S i O 2 の活性層を形成し たバイオチップについて、 赤外反射吸収スぺクトル測定の感度： AR/Rの活个生 層厚みに対する依存性を、 1 0 0 0 c m— '、 2 0 0 O c m―'、 3 0 0 0 c m—1の 3種類の波長について計算した結果を第 5図及び第 6図に示す。 第 5図は p偏光 の赤外光の場合であり、 第 6図は s偏光の赤外光の場合である。 第 5図及ぴ第 6 図において、 横軸の数字は n m単位で示す活性層の厚みである。
第 5図から明らかなように、 p偏光の場合、 活性層の厚みが約 2 0 0 n m以 下である限り、 全ての波長に対して高い感度での測定が可能である。 一方、 第 6 図から明らかなように、 s偏光の場合、活性層の厚みが薄いと感度はゼロであり、 これを厚くして行くと、 周期的に感度が高くなり、 かつ、 その感度のピークが波 長ごとに異なる。 し力 し、 一般的に、 数百 n m以上の厚みを 1 0 0 n mの精度で 制御することは困難であるため、 およそ 6 0 0 n m以上の厚みに設定すれば、 厚みのバラツキのため、 どの波長に対しても、 S偏光の吸収が現れることが分か る。
即ち、 従来の金基板の場合は、 活性層にあたる自己組織化膜の厚みは、 通常、 数 n m〜数十 n mと薄いので、 p偏光にしか感度がなく、 s偏光での測定はでき ない。 本発明の場合、 活性層の厚みを 6 0 0 n m以上とすることは容易であり、 s偏光での測定も可能となるため、 タンパク質等のより精度の高い同定が可能と なる。
〔実施形態 2 ：タンパク質チップ解析装置及びタンパク質チップ解析方法〕 本発明に係るタンパク質チップ解析装置は、 少なくとも、 上記したタンパク 質チップと、 このタンパク質チップに対して被検物質を含む試料液を供給する通 液手段と、 前記タンパク質チップに赤外光を入射すると共にその反射赤外光を検 出する光学系とを含んで構成される。
上記のタンパク質チップが実質的に真空状態を実現できる空間に設置されて いることが好ましい。 上記の光学系には、 タンパク質チップ上に設置されるプリ ズムを含むことが好ましいが、 プリズムに代えて反射鏡を用いたり、 グラスファ ィパ一等の導光管を使用することも可能である。 更に、 上記の通液手段が、 スぺ ーサ一層を設けたタンパク質チップにおける液溜部と、 この液溜部に対して試料 液を流入及ぴ流出させる通液路を設けた通液構造体とによつて構成されているこ とが好ましい。 言うまでもないが、 通液手段の繋ぎ部等の構成においては、 真空 シールの確保に十分に注意する必要がある。
本発明に係るタンパク質チップ解析方法は、 上記のタンパク質チップ解析装 置を用い、 少なくとも以下の工程を行うことにより行う。
( 1 ) 未だ被検物質と接触していないタンパク質チップに対して前記光学系 により赤外光を入射し、 その反射赤外光を赤外反射吸収スぺクトルのパックグラ ゥンドとして測定する工程。 この工程では、 液溜部には試料液ではない適宜な液 体を流通させて行う。 このような液体としては、 プローブタンパク質を変性させ ないように、 緩衝液が特に好ましレ、。 緩衝液は、 例えば H E P E S等の多種の緩 衝液から任意に選択できるし、 これらに C a C l 2 、 N a C 1又は N a O H等を 加えて p Hをコントロールしたものも使用できる。
( 2 ) タンパク質チップに対して試料液を供給して、 試料液中の被検物質を プローブタンパク質に接触させて吸着させた後、 タンパク質チップに対して赤外 光を入射し、 その反射赤外光を赤外反射吸収スぺク トルのシグナルとして測定す る工程。
( 3 ) 前記シグナルとバックグラウンドとの比のスペク トルを求め、 これを 被検物質の赤外反射吸収スぺクトルとして被検物質を同定する工程。
赤外反射吸収スぺク トルのバックグラウンドとシグナルとを測定して比のス ぺクトルを求め、 これから被検物質を同定する方法自体は、 赤外スぺク トルの測 定において極めて一般的に用いられる手法である。
上記の （1 ) 及び （2 ) における赤外光の入射と反射赤外光の集光とはプリ ズムを経由して行うことが特に好ましく、 タンパク質チップに対する赤外光の入 射角度は 6 0 ° 以上の斜入射に設定することが特に好ましく、 更には、 タンパク 質チップの液溜部に入射されてタンパク質チップにより反射された赤外光を、 更 に液溜部に導いてタンパク質チップにより反射させる過程を少なくとも一回繰り 返させることが、 特に好ましい。
本発明に係るタンパク質チップ解析装置の一例を、 第 7図、 第 8図に基づい て説明する。 第 7図に示すように、 タンパク質チップ Pを試料台 1. 1の所定の位 置に載置して、 その周囲を取り囲むようにして O—リング 1 0を置く。 O—リン グ 1 0は弾性変形が可能な材料からなり、 タンパク質チップ Pよりも厚みが大き い。 タンパク質チップ P上には、 赤外光透過性のプリズム 7を重ねている。
このプリズム 7は、 押さえ金具 8を用いることにより、 〇一リング 1 0を圧 縮した状態でタンパク質チップ Pの上面に密着されている。 従って、 タンパク質 チップ Pは、 試料台 1 1と、 プリズム 7と、 〇一リング 1 0とによって外界から 気密に遮断することができる。
タンパク質チップ Pの活性層上には、 第 8図において破線で示す形状にスぺ ースをく り抜いたスぺーサ一層を設けており、 このスぺーサ一層によって、 タン パク質チップ Pの活性層上には液溜部 2 6が形成されている。 そして、 プリズム 7と押さえ金具 8には、 液溜部 2 6と連通した通液路 9が設けられている。 これ らによって上記の通液手段が構成されており、 この通液手段によって、 タンパク 質チップ Pの液溜部 2 6に対して被検物質を含む試料液 （あるいは緩衝液） を流 入させ、 及び流出させることができる。
このような通液手段の構成により、 タンパク質の反応系が狭い空間に閉じ込 められた、 いわゆるマイクロチャネルの構成となる。 従って、 測定に要する試料 液が極めて少量で済むと言う利点が得られることに加えて、 更に重要なことに、 タンパク質の変性を防止できる溶液系においてタンパク質の分子認識反応を行！/、、 かつ赤外吸収スぺクトルを測定することができる。
試料台 1 1は支台 1 4上に支柱 1 3によって支持され、 かつ試料台 1 1の下 部には、 試料台 1 1と共にタンパク質チップ Pの温度を制御するためのペルチェ 素子 1 2が取り付けられている。 第 7図及び第 8図に示した装置の全体を、 以後、 試料ホルダー S Hと呼ぶ。
第 9図及び第 1 0図に示すように、 試料ホルダー S Hを主真空槽 1 5内に設 置する。 そして、 図示省略のフーリエ変換赤外分光装置 （F T I R) により出力 される赤外光ビーム （I R) を、 ダクト 1 8を通して、 集光ミラー 1 6によりタ ンパク質チップ Pの表面に入射させる。 1 9は排気ダクトである。
ここで、 赤外光ビームの入射角度は、 感度に大きく影響する重要なパラメ一 ターである。 例えば、 8 0 0 c m— '付近の低波数まで透明な B a F 2 のプリズム を用いたとすると、 水の吸収ピークの位置の波長 6 μ πιにおいて水及ぴ B a F 2 の屈折率はそれぞれ 1 . 2 5と 1 . 4 5であるので、 プリズム底面への入射角度 を 5 5度、. 5 7度あるいは 5 8度とすると、 タンパク質チップ表面への赤外光ビ ームの入射角度はそれぞれ 7 1 . 9度、 7 6 . 6度、 7 9 . 6度となる。
金属層を使用した赤外反射吸収分光では入射角度 8 0〜8 5度が望まれるこ とを考慮すると、 プリズム底面への赤外光ビームの入射角度 （第 4図の e ) を、 5 8度程度とすることが望ましい。 入射角度が過剰に大きいと、 赤外光がプリズ ム底面で反射してしまレ、、 タンパク質チップに到達する赤外光が弱くなつて、 感 度が低下する恐れがある。 例えば Θ力 S 5 8度の場合、 反射ロスは波長 6 μ mで約 1 9 % (計算値） である。
C a F 2 が B a F 2 よりも水に対する耐 1"生が強いことから、 測定領域の下限 が 1 0 0 0 c m一'付近となることが不都合でなければ、 C a F 2 をプリズム材料 として用いることもある。入射角も B a F 2 の場合と同様に計算して設定される。 例えば、 プリズム底面への赤外光ビームの入射角度については、 C a F 2 の屈折 率は B a F 2 と比べやや小さいので、 7 1度となる。 この場合、 水中入射角度は 約 8 3度となる。
集光ミラー 1 6は、 タンパク質チップ Pの表面で赤外光が集光されるように 焦点距離を設定しておく。 必要に応じて主真空槽 1 5の真空状態をダクト 1 8か ら遮断できるように、 B a F 2 の窓板 1 7を取り付けても良い。
タンパク質チップ P上で反射した赤外光は、 ミラー槽 2 2に設置された集光 ミラー 2 3によって、 検出器 2 4に集光される。 検出器 2 4としては、 例えば水 銀力ドミゥムテルライ ド検出器等が用いられる。
第 9図を平面視した第 1 0図に示すように、 エアロックチャンパ一 2 0を気 密バルブ 2 1を介して主真空槽 1 5に接続して、 試料ホルダー S Hが、 主真空槽 1 5とエアロックチャンバ一 2 0間で往復移動できる機構を装置しても良い。 例 えば、 試料ホルダー S Hについて組み立てゃタンパク質チップ Pの取り替え等を 行いたい場合、 試料ホルダー S Hをエアロックチャンバ一 2 0に移動させて気密 バルブ 2 1を閉鎖した後に、 エアロックチャンバ一 2 0の真空を解除した所要の 作業を行い、次いでエアロックチャンパ一 2 0を密閉して気密バルブ 2 1を開き、 試料ホルダー S Hを主真空槽 1 5に戻してから脱気するのである。 このような手 順を踏むことにより、 主真空槽 1 5を必要な真空度に到達させるまでの所要時間 を大幅に短縮することができる。
〔実施形態 3 ：タンパク質チップの変更例〕
第 1 1図においては、 上半部にタンパク質チップの平面図を示し、 下半部に その正面図を対応して示す。 第 1 1図に示すタンパク質チップにおいては、 前記 第 1図に示す構成のタンパク質チップ Pの上面 （即ち、 活性層上） に、 破線で示 す形状にスペースをくり抜いたスぺーサ一層 2 5を設け、 このスぺ一サ一層 2 5 によって、 タンパク質チップ Pの活性層上には液溜部 2 6が形成されている。
第 1 1図に示すタンパク質チップの使用方法及び使用上の利点については、 第 7図及び第 8図に関して前記したところであるが、そのような使用においては、
「第 9発明の効果」 欄で前記した理由により、 スぺーサ 層 2 5 (ひいては、 液 溜部 2 6 ) の厚さが重要なパラメータである。
仮に、 スぺーサ一層 2 5の厚さを 1 mとし、 液溜部 2 6における液流の幅
(第 1 1図の幅 L ) を 1 0 mmとして、 液溜部 2 6中の水による赤外光の吸収を 評価して見る。 水の吸収ピークの位置の波長 6 mでは吸収係数 a = 0 . 2 7 4 2 X 1 0 4 なので、 水の吸収による損失は、 プリズム面への赤外光ビームの入射 角度を 5 5度、 5 7度あるいは 5 8度とすると、 タンパク質チップ表面への赤外 光ビームの入射角度はそれぞれ 7 1 . 9度、 7 6 . 6度、 7 9 . 6度となるので、 損失はそれぞれ 8 3 %、 9 1 %、 9 5 %となる。
前記第 7図及び第 8図で示した通液手段を構成する場合、 より具体的には、 試料液が接触するプリズムの底面や通液路等は、 タンパク質が吸着し難いテフ口 ン （登録商標） 等でコーティングしておくことも重要である。 又、 タンパク質チ ップをマイクロチャネルの構成にする点から、 図示のような単純な通液路構造に 限らず、 合成や分析等の他機能を同時に付与した構造とすることも容易である。
〔実施形態 4 ：タンパク質チップの変更使用例〕
第 1 2図に示す実施形態においては、 タンパク質チップ Pの液溜部に照射さ れ反射された赤外光がプリズム 7に戻り、 プリズム 7で全反射して再び液溜部中 のタンパク質チップ Pを照射し、 タンパク質の赤外吸収スぺクトルを複数回測定 している。 この方法により、 測定感度を高めることができる。 産業上の利用分野
本発明によって、 赤外反射吸収分光解析に供するタンパク質チップと言う新 たなカテゴリーの解析手段が提供される。 又、 このタンパク質チップを用いるこ とにより、 汎用的で構成の簡易なタンパク質チップ解析装置と、 測定の手数が少 なく測定精度の良いタンパク質チップ解析方法とが提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ( 1 ) 固体ベース上に金属層を形成し、 （2 ) 前記金属層上に蒸着、 ス パッタリング又は化学気相堆積（C V D) 法によって非金属材料を堆積させた後、 アニーリングを行って赤外光波長より薄い膜厚を有すると共に表面の平坦度が高 低差 5 n m以下である非金属材料製の活性層を形成し、 （3 ) 次いで前記活性層 の表面にプローブを固定ィ匕する、 バイォチップの製造方法。
2 . 前記アニーリングを不活性ガス雰囲気下に 3 0 0 ° C〜8 0 0 ° Cの温 度で行う、 請求の範囲 1項に記載のバイォチップの製造方法。
3 . 前記非金属材料として、 半導体材料又は電気絶縁性材料を用いる、 請求 の範囲 1項又は 2項に記載のパイォチップの製造方法。
4 . 固体ベース上に金属層を有し、 前記金属層上には赤外光波長より薄い膜 厚を有すると共に表面の平坦度が高低差 5 以下である非金属材料製の活性層 を有し、 力 、 前記活性層の表面にはプローブを固定化した、 バイオチップ。
5 . 前記プローブが、 タンパク質、 ポリヌクレオチド、 糖鎖あるいは細胞で ある、 請求の範囲 4項に記載のバイオチップ。
6 . 前記活性層が半導体材料又は電気絶縁性材料からなる、 請求の範囲 4項 又は 5項に記載のバイオチップ。 ―
7 . 前記活性層が、 p偏光の赤外光使用対応型においては 2 0 0 n xn以下の 膜厚であり、 s偏光の赤外光使用対応型においては 6 0 0 n m以上の膜厚である、 請求の範囲 4項〜 6項のいずれかに記載のパイォチップ。
8 . 前記活性層の表層部には反応基を持つ修飾層が構成され、 この反応基と の化学的結合によってプローブが固定化されている、 請求の範囲 4項〜 7項のい ずれかに記載のパイォチップ。
9 . 前記プローブがタンパク質である場合において、 前記活性層の表面に脂 質二重膜が構成され、 この脂質二重膜に埋設された状態でプロ一ブが固定化され ている、 請求の範囲 4項〜 8項のいずれかに記載のパイォチップ。
1 0 . 前記活性層上には、 更に、 液溜部形成用のスペースをくり抜いたスぺ ーサ一層を設けた、 請求の範囲 4項〜 9項のいずれかに記載のバイォチップ。
1 1. 前記スぺーサ一層が◦. 2〜100 jamの範囲内の一定の厚さである、 請求の範囲 10項に記載のバイォチップ。
12. 請求の範囲 4項〜 11項のいずれかに記載のバイオチップと、 このバ ィォチップに対して被検物質を含む試料液を供給する通液手段と、 前記バイォチ ップに赤外光を入射すると共にその反射赤外光を検出する光学系とを含む、 バイ ォチップ解析装置。
13. 前記光学系が、 更に、 バイオチップ上に設置されるプリズムを含む、 請求の範囲 12項に記載のパイォチップ解析装置。
14. 前記バイオチップが、 実質的に真空状態を実現できる空間に設置され ている、 請求の範囲 12項又は 13項に記載のバイオチップ解析装置。
15. 前記通液手段が、 スぺーサ一層を設けたバイオチップにおける液溜部 と、 この液溜部に対して試料液を流入及び流出させる通液路を設けた通液構造体 とによって構成されている、 請求の範囲 12項〜 14項のいずれかに記載のバイ ォチップ解析装置。
16， 請求の範囲 12項〜 15項のいずれかに記載のバイオチップ解析装置 を用いて、 少なくとも以下の工程を行う、 パイォチップ解析方法。
( 1 ) 未だ被検物質と接触していないバイォチップに対して前記光学系により赤 外光を入射し、 その反射赤外光を赤外反射吸収スぺクトルのパックグラウンドと して測定する工程。
(2) バイオチップに対して試料液を供給して、 試料液中の被検物質をプローブ 接触させて吸着させた後、 バイオチップに対して赤外光を入射し、 その反射赤外 光を赤外反射吸収スぺクトルのシグナルとして測定する工程。
(3) 前記シグナルとバックグラウンドとの比のスぺクトルを求め、 これを被検 物質の赤外反射吸収スぺクトルとして被検物質を同定する工程。
17. 前記 （1) 及び （2) の赤外光の入射と反射赤外光の集光とを、 前記 プリズムを経由して行う、 請求の範囲 16項に記載のバイォチップ解析方法。
18. 前記バイオチップに対する赤外光の入射における入射角度を 60° 以 上の斜入射に設定する、 請求の範囲 1 6項又は 1 7項に記載のバイオチップ解析 方法：
1 9 . 前記 （2 ) の試料液の供給が、 スぺーサ一層を設けたバイオチップに おける液溜部に対して行われる場合において、 液溜部に入射されてバイオチップ により反射された赤外光を、 更に液溜部に導いてバイオチップにより反射させる 過程を少なくとも一回操り返させる、 請求の範囲 1 6項〜 1 8項のいずれかに記 载のバイォチップ解析方法。
2 0 . 前記反射赤外光を更に液溜部に導く手段が、 バイオチップ上に設置さ れたプリズムである、 請求の範囲 1 9項に記載のパイォチップ解析方法。
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