[go: up one dir, main page]

WO2005044847A1 - アルツハイマー病のマーカーペプチド - Google Patents

アルツハイマー病のマーカーペプチド Download PDF

Info

Publication number
WO2005044847A1
WO2005044847A1 PCT/JP2004/016209 JP2004016209W WO2005044847A1 WO 2005044847 A1 WO2005044847 A1 WO 2005044847A1 JP 2004016209 W JP2004016209 W JP 2004016209W WO 2005044847 A1 WO2005044847 A1 WO 2005044847A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
disease
antibody
amino acid
ale
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/016209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshiharu Suzuki
Yoichi Araki
Naomi Miyagi
Haruyasu Yamaguchi
Masaki Nishimura
Kazuo Yamamoto
Original Assignee
Toshiharu Suzuki
Yoichi Araki
Naomi Miyagi
Haruyasu Yamaguchi
Masaki Nishimura
Kazuo Yamamoto
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toshiharu Suzuki, Yoichi Araki, Naomi Miyagi, Haruyasu Yamaguchi, Masaki Nishimura, Kazuo Yamamoto filed Critical Toshiharu Suzuki
Priority to AT04799415T priority Critical patent/ATE551357T1/de
Priority to US10/577,008 priority patent/US7807777B2/en
Priority to JP2005515282A priority patent/JP5574559B2/ja
Priority to EP04799415A priority patent/EP1690870B1/en
Publication of WO2005044847A1 publication Critical patent/WO2005044847A1/ja
Priority to US12/859,950 priority patent/US20110014635A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the present invention relates to a peptide that serves as a diagnostic marker for Alzheimer's disease, a method for diagnosing Alzheimer's disease using the peptide, a method for collecting data for diagnosing Alzheimer's disease using the peptide, The present invention relates to a method for screening for a therapeutic agent for Alnoma and Ima disease using the same, an antibody against the peptide, and a diagnostic agent for Alzheimer disease including the antibody.
  • Alzheimer's disease is diagnosed by interviewing a specialist or observing the state of brain atrophy by MRI or the like.
  • it is difficult to obtain an objective and accurate diagnosis result by diagnosis only by interview, and it is impossible to find a so-called spare patient group before onset.
  • MRI and other equipment are expensive and cannot be used unless they are in a large specialized hospital.
  • Tau protein is a protein constituting microtubules in nerve cells. When nerve cells are destroyed due to the onset of Alzheimer's disease, they leak out of the cells and are detected in cerebrospinal fluid. Tau protein is one of the useful marker substances and is not detected unless the progression of the power disease is progressed, and the amount of tau leaked is small, so that it is difficult to measure in body fluids other than cerebrospinal fluid (eg, blood).
  • cerebrospinal fluid eg, blood
  • Non-Patent Document 1 "Decreased beta-amyloid 1-42 and increased tau levels in
  • Non-Patent Document 2 'Cerebrospinal fluid biomarkers for disease stage ana intensity in cognitively impaired patients: Wahlund, L.O., and Blennow, K. Neurosci. Lett.
  • the present invention has been made under the above-mentioned technical background, and has as its object to provide a means for easily and accurately diagnosing Alzheimer's disease.
  • the present invention provides the following (1)-(14).
  • Peptides that can serve as diagnostic markers for Ima disease hereinafter, these peptides may be simply referred to as “peptides of the present invention”.
  • [0015] (4) A peptide generated by cleavage and removal of the ⁇ -terminal fragment and the C-terminal fragment from the alkydin oc, wherein the ⁇ ⁇ ⁇ -terminal fragment is cleaved and removed. Between the amino acid corresponding to position 815 and the amino acid corresponding to position 816 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, between the amino acid corresponding to position 820 and the amino acid corresponding to position 821, or at position 838. The peptide according to (1), which is between the corresponding amino acid and the amino acid corresponding to position 839.
  • a peptide generated by cleavage and removal of the ⁇ -terminal fragment and the C-terminal fragment from the al terminal oc, wherein the site at which the C-terminal fragment is removed is Between the amino acid corresponding to position 842 and the amino acid corresponding to position 843 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, between the amino acid corresponding to position 843 and the amino acid corresponding to position 844, or at position 851.
  • Body fluid power The method for collecting data for diagnosing Aluno or Ima disease according to (7), which is blood or cerebrospinal fluid.
  • the ratio of the high molecular weight peptide to the detected or quantified peptide is used as an index.
  • a test substance is brought into contact with a cell that secretes the peptide according to any one of (1) to (6) to change the amount of secretion of the peptide or to determine the molecular species of the peptide to be secreted.
  • a method for screening for a therapeutic agent for Alzheimer's disease characterized by examining a change.
  • a diagnostic agent for Alzheimer's disease comprising the antibody according to (14).
  • FIG. 1 shows the results of Western blot of proteins separated by density gradient centrifugation.
  • FIG. 5 is a diagram schematically showing generation of ⁇
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of a Western plot of a cell lysate using an anti-III antibody.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of a Western blot of a cell lysate using an anti-Ale antibody and a medium using an anti-FLAG antibody.
  • FIG. 8 is a view showing the result of a Western plot of a membrane fraction using an anti-Ale antibody.
  • FIG. 9 is a view showing a structure of Alco; ⁇ .
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of a Western plot of a cell lysate using an anti-FLAG antibody and a medium.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of Western blot of lysates of cells expressing APP or Alea and BACE1.
  • FIG. 12 is a diagram schematically showing a method for preparing ⁇ -Alea having a FLAG sequence (a peptide generated by cleavage of N-terminal and C-terminal fragments from Alea).
  • Estanplaza shows the results of blotting of Ale alpha delta E expression immunoprecipitates extract and culture medium of the cells with the anti-FLAG antibody.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of mass spectrometry of ⁇ -Alea secreted from Alc ⁇ ⁇ -expressing cells.
  • FIG. 15 is a view showing the secondary cleavage site of Alea determined by the MALDI-TOFMS method.
  • FIG. 16 is a view showing a cleavage site of human APP695.
  • FIG. 17 is a view showing the result of electrophoresis of a C-terminal fragment generated by primary cleavage of Alca1.
  • FIG. 18 is a view showing a cutting site of Alca.
  • FIG. 19 is a view showing the results of Western blot of cells expressing various mutant PS1 and Ale ⁇ .
  • FIG. 20 shows the results of Western blot of cells expressing various mutant PS1 (including L166P mutant PS1) and Ale ⁇ .
  • FIG. 21 shows the results of mass spectrometry of / 3-Ale generated by wild-type PS1 or L166P mutant PS1.
  • FIG. 22 is a view showing a cutting position of ⁇ -Ale.
  • FIG. 23 is a diagram schematically showing molecular species of ⁇ -Ale.
  • the peptide of the present invention is also a peptide that is produced by the cleavage of the ⁇ -terminal fragment and the C-terminal fragment by removing the alpindin ⁇ , the alpindin ⁇ , or the alpindin ⁇ force. It is a peptide that can be a diagnostic marker.
  • Al power din includes Al power din ⁇ (hereinafter, “Alc a”), Al power din j8 (hereinafter, “ Ale j8 ”), and Alcyan ⁇ (hereinafter“ Alcy ”).
  • Alca is the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • AlciS is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • Ale ⁇ is a protein represented by SEQ ID NO: 3.
  • Ale ⁇ , Ale j8, and Ale y are cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, -bird, egret, pig, sheep, pigeon, monkey, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, Nerve cells, glial cells, spleen j8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerno's cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, Immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, Osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells,
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3 is about 50% or more, preferably about 60% or more as the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. More preferably, the amino acid sequence has about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
  • a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: for example, a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: A protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: is preferred.
  • substantially the same activity examples include binding activity with the PI domain of X11L.
  • Substantially homogenous indicates that the properties are homogenous (eg, physiologically or pharmacologically). Therefore, it is preferable that the above activities are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of the protein and the molecular weight of the protein are different.
  • 8, or Aley includes, for example, (ii) one or more (preferably about one to thirty, preferably one to three) amino acids in the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: An amino acid sequence in which about 10 amino acids have been deleted, more preferably a number (115), and one or two or more amino acids (preferably Amino acid sequence, preferably about 110 amino acids, more preferably about 110 amino acids, and more preferably about 115 amino acids, and (c) one or more amino acids (preferably Is an amino acid sequence into which about 110, preferably about 110, and more preferably about (115) amino acids have been inserted, and (2) an amino acid represented by each SEQ ID NO.
  • muteins such as proteins containing an amino acid sequence in which a number (115) of amino acids are substituted with other amino acids, or (e) a protein containing an amino acid sequence obtained by combining them are also included.
  • the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of the insertion, deletion or substitution is not particularly limited as long as the activity is not lost.
  • Al dydin a has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and 10 amino acids are inserted at the 71st and 72nd positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Al power din a 2 exists.
  • the site at which the N-terminal fragment is cleaved off is not particularly limited as long as the generated peptide can be a diagnostic marker for Alzheimer's disease, but may be a site in the N-terminal extracellular domain. preferable. In the case of Alea, such a site is usually located between the amino acids corresponding to positions 815 and 816 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and between the amino acids corresponding to position 820 and 821 in the amino acid sequence. Between the amino acids corresponding to the 8th amino acid sequence, or between the amino acids corresponding to the 838th amino acid sequence and the amino acid sequence corresponding to the 839th amino acid sequence, or in the vicinity thereof.
  • Al-dydin has another site where the fragment on the ⁇ terminal side is cleaved and removed. Alea is also cleaved extracellularly by BACE, which cleaves at the ⁇ -site of APP.
  • Such a site is usually between or near the amino acid corresponding to position 708 and the amino acid corresponding to position 709 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the site where the C-terminal fragment is cleaved off is not particularly limited as long as the resulting peptide can be a diagnostic marker for Alzheimer's disease, but a site cleaved by preserin is preferred.
  • a site cleaved by preserin is preferred.
  • such a site usually corresponds to a region between the amino acids corresponding to positions 842 and 843 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and corresponds to the amino acids corresponding to positions 843 and 844.
  • amino acids corresponding to the amino acid sequence, or between the amino acids corresponding to the 851-position and the amino acid corresponding to the 852-position, or in the vicinity thereof, and in the case of Ale ⁇ it is usually at the 875-position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • “near” refers to a range of usually 10 amino acids or less, preferably 5 amino acids or less from the cleavage site.
  • the peptide of the present invention there can be mentioned the peptides having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 12.
  • the peptide of the present invention can be used as a diagnostic marker for Alzheimer's disease for the following reasons.
  • Al dydin forms a complex with ⁇ and X11L (Araki, Y. et al., (2003) J. Biol. Chem. 278, 49448-49548, JP-A-2003-164298). Al dydin also shows the same distribution as APP in the brain of Alzheimer's disease patients (Examples 2 and 3).
  • the peptide of the present invention is produced by cleavage with preserine as in A
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ has an oc-helical structure on the N-terminal side and a ⁇ -sheet structure on the C-terminal side.
  • ⁇ has a ⁇ -turn structure because the sequence from the 26th amino acid to the 29th amino acid in the center has a ⁇ -turn structure. End and C-end make anti-parallel ⁇ -sheet structure. It is understood that this triggers aggregation of ⁇ (“Oligomerization and fibril assembly of the amyloid ⁇ -protein” by Roher, A. E et al, Biochem. Biophy. Act. [2000] 1502, 31-43.).
  • the peptide of the present invention has a helix-helix structure on the N-terminal side and a ⁇ -sheet structure on the C-terminal side, and has the same basic structure as ⁇
  • the ⁇ -helix does not show cohesiveness.
  • diagnosis of Alzheimer's disease and data for diagnosis can be collected.
  • diagnosis and diagnostic data can be collected by detecting or quantifying the peptide of the present invention in a body fluid or tissue collected from an animal.
  • the peptide of the present invention contains a large amount of a high molecular weight peptide in the peptide of the present invention to be detected or quantified in which the presence of peptides of various molecular weights is present, Alzheimer's disease develops or develops. It is likely to be in the previous stage. This is also the power to increase the amount of the high molecular weight peptide of the present invention when the amount of the high molecular weight type A ( ⁇
  • the diagnosis of Aluno and Ima diseases can be performed by using the ratio of the high molecular weight peptide in the total amount of the peptide of the present invention as an index, not only in determining whether the peptide of the present invention is present in a certain amount in a body fluid or the like. it can.
  • the term “high molecular weight peptide” as used herein means that the cleavage at the ⁇ -terminal side occurs at a site closer to the ⁇ -terminal, or the cleavage at the C-terminal side occurs at a site closer to the C-terminal. Peptide produced by force or a combination of both.
  • a molecular species in which the cleavage site is shifted to the N-terminus or C-terminus or to both the N-terminus and the C-terminus relative to each j8-Ale molecular species shown in Table 1 described below It is not a peptide shown by specific numerical values.
  • the primary cleavage site in Table 1 is ⁇ 1 and the secondary cleavage site is ⁇ 3
  • the force that is expected to produce a peptide of 36 amino acids with a molecular weight of about 4000 is shifted due to the shift of the ⁇ ⁇ ⁇ -terminal or C-terminal cleavage site.
  • J8-Ale whose molecular weight is higher than that of the peptide, falls under the “high molecular weight peptide” described above.
  • the primary cleavage site in Table 1 is ⁇ 3 and the secondary cleavage site is ⁇ 1
  • the production of a peptide having 4 amino acids and a molecular weight of 5-600 is expected, but the ⁇ ⁇ ⁇ -terminal or C-terminal cleavage site or J8-Ale, whose molecular weight is higher than that of this peptide due to the shift of both cleavage sites, falls under the aforementioned “high molecular weight peptide” even if its molecular weight is about 1000.
  • Examples of animals from which body fluids are collected include humans.
  • Powered warm-blooded animals other than humans such as guinea pigs, rats, mice, chickens, porpies, pigs, sheep, wedges, monkeys, monkeys, etc. Is also good.
  • Examples of the body fluid and tissue include blood, plasma, serum, cerebrospinal fluid, and brain tissue. Among them, blood and cerebrospinal fluid are preferable.
  • the method for detecting or quantifying the peptide is not particularly limited, and a method using an antibody, for example, mass spectrometry using Western blot, dot blot, ELISA, sandwich ELISA, radioimmunoassay, immunoprecipitation, MALDI-TOF / MS, etc. Or any combination of these methods.
  • sandwich ELISA is the most preferred.
  • the sandwich ELISA is described, for example, in a paper by Tomita et al. (“Cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein (APP) by secretases occurs after O-glycosylation of APP in the protein secretory pathway” Tomita, S., Kirino, Y., and Suzuki , T.
  • the antibodies of the present invention also include monoclonal antibodies and polyclonal antibodies.
  • Monoclonal antibodies can be prepared, for example, according to the method described in the aforementioned Tomita et al. Specifically, (1) administering the peptide of the present invention to an animal, (2) collecting antibody-producing cells from the animal, and (3) fusing the antibody-producing cell with myeloma cells. And (4) selecting a hybridoma that produces the antibody of the present invention from the hybridomas, and (5) separating and purifying the antibody in the culture supernatant of the antibody-producing hybridoma. A monoclonal antibody can be obtained.
  • the peptide of the present invention to be administered to an animal may be the whole peptide or a part thereof.
  • the partial peptide to be administered is not particularly limited.
  • the amino acid corresponding to the 816, 821, or 839 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is defined as the ⁇ ⁇ -terminal
  • a peptide having a C-terminal amino acid corresponding to the 842, 843, or 851 position of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
  • a peptide having an amino acid sequence corresponding to the 826th position and the 845th position in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferred.
  • the amino acid represented by SEQ ID NO: 3 Peptides with amino acids corresponding to positions 805 to 824 of the sequence are preferred.
  • the peptide may be administered together with complete or incomplete Freund's adjuvant in order to enhance the antibody-producing ability.
  • the animal to be administered is not particularly limited, and for example, monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, -birds and the like can be used.
  • the administration interval and the number of administrations of the peptide are not particularly limited. Usually, the administration is performed about 2 to 10 times every 2 to 6 weeks.
  • Antibody-producing cells can be obtained, for example, by collecting animal spleen or lymph nodes 2 to 5 days after the final immunization.
  • the myeloma cells to be used are not particularly limited, and for example, NS-1, P3U1, SP2 / 0, AP-1 and the like can be used.
  • Cell fusion is usually performed using polyethylene glycol or Sendai virus. It can be done according to law.
  • Hybridomas producing the antibody of the present invention can be selected, for example, by adding the culture supernatant of the hybridoma to a microplate or the like to which the peptide of the present invention has been adsorbed, and then using an anti-IgG antibody or the like labeled with an enzyme or the like.
  • the detection can be performed by adding and detecting the anti-IgG antibody bound to the microplate or the like.
  • the antibodies of the present invention can be separated by methods commonly used for the separation and purification of immunoglobulins, such as salting out, alcohol precipitation, isoelectric point precipitation, electrophoresis, and ion exchange. It can be carried out by a body adsorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, or the like.
  • Polyclonal antibodies are also described, for example, in the article by Araki et al. (Araki, Y., et al., [2003] J. Biol. Chem. 278, 49448-49458; Araki, Y "et al [2004] J. Biol. Chem. 279, 24343-24354.) Etc. Specifically, (1) the peptide of the present invention is administered to an animal, and (2) the animal power The desired polyclonal antibody can be obtained by collecting and (3) separating and purifying the antibody from the blood, etc. The administration of the peptide and the separation and purification of the antibody can be performed in the same manner as in the monoclonal antibody.
  • the diagnostic agent of the present invention is usually prepared by adding the above-described antibody of the present invention to an appropriate buffer or the like.
  • concentration of the antibody, the type of the buffer, and the like are not particularly limited, and may be appropriately determined according to the method for detecting or quantifying the peptide of the present invention.
  • the diagnostic agent may contain a component other than the antibody of the present invention. Examples of such a component include an enzyme-labeled secondary antibody and a coloring agent.
  • the peptide of the present invention and its precursor, alkydin, are similar in many respects to A ⁇ and ⁇ . Therefore, the substance that suppresses the production of the peptide of the present invention is likely to suppress the production of ⁇
  • a substance that changes the molecular species of the peptide of the present invention from a high molecular weight type to a low molecular weight type also has a highly toxic high molecular weight type A ⁇ molecular species. It is highly possible to change to the type.
  • a test substance is brought into contact with cells that secrete the peptide of the present invention, and a change in the amount of the peptide secreted or a change in the molecular species of the secreted peptide is examined, thereby screening for a therapeutic agent for Aluno and Ima disease. It is thought that can be performed.
  • Cells that secrete the peptide of the present invention may be cells that secrete the peptide of the present invention.
  • cells that secrete the peptide of the present invention by gene transfer may be used.
  • the former cells include, for example, fibroblasts (Araki, Y., et al [2004] J. Biol. Chem. 279, 24343-24354.), HEK293 (in the examples, the alkindin gene was introduced into these cells). Even if it is not introduced, endogenous al-dydin is expressed.)
  • the latter cell can be prepared, for example, by introducing into the cell a DNA encoding the full-length or the first cleavage product (or a construct that mimics this product) of the alludin gene.
  • cells that secrete a high-molecular-weight peptide of the present invention can be introduced into cells so as to stably express the gene for mutant presenilin (I143F, 278T, 434C, L35F, etc.), as shown in Examples 11 and 12 below.
  • the method of contacting a test substance with a test substance is not particularly limited as long as the test substance acts on cells, and for example, a method of directly inoculating cells. For example, a method of adding to a medium in which cells are cultured can be exemplified.
  • the change in the amount of secreted peptide and the change in the molecular species of the secreted peptide can be examined according to the method for detecting and quantifying the peptide of the present invention described above. If the change in peptide secretion is examined and the secretion is reduced, the test substance can be a candidate for a therapeutic drug for Alzheimer's disease. In addition, if the molecular species of the peptide is examined and the molecular species is changed from a high molecular weight type to a low molecular weight type as a result of examining the change! / ⁇ , the test substance can be a candidate for a therapeutic drug for Alzheimer's disease.
  • therapeutic drug includes not only drugs that treat the onset Alzheimer's disease, but also drugs that have preventive effects such as suppressing the onset or delaying the onset time.
  • the brains of five 8-week-old C57BL6 mice were mixed with 30 ml of ice-cold buffer A (10 mM pH 7.4, 10 strokes with a loose-fit 'Teflon' homogenizer (clearance: 0.12 ⁇ m) in 0.32 M sucrose, 5 ⁇ g / ml chymostatin, 5 ⁇ g / ml leptin, 5 ⁇ g / ml peptatin) To homogenize. The homogenate was centrifuged (100 ⁇ g, 100 min) to remove unbroken cells and nuclei to obtain a lysate of enucleated cells.
  • ice-cold buffer A 10 mM pH 7.4, 10 strokes with a loose-fit 'Teflon' homogenizer (clearance: 0.12 ⁇ m) in 0.32 M sucrose, 5 ⁇ g / ml chymostatin, 5 ⁇ g / ml leptin, 5 ⁇
  • This nucleated cell lysate was further centrifuged (100,000 g, 60 min) to obtain a membrane fraction as a pellet.
  • the membrane fraction was added to 2 ml of buffer A and resuspended.
  • a tube for Beckman SW41 put a solution (10 ml) of 0-28% iodixanol in buffer A, and resuspend 2 ml of the membrane fraction on the tube so as not to disturb the interface. It was quietly layered. This was centrifuged at 41000 rpm, 115 min, 4 ° C. After centrifugation, 13 fractions of 900 ml were collected from the bottom of the tube.
  • Antibodies include anti-APP cytoplasmic domain antibody (which can detect both full-length APP and C-terminal fragments), anti-X11L antibody, anti-Ale antibody, anti-protein disulfide isomerase (PDI) antibody, and anti-Golgi 130 kDa matrix protein (GM -130) Antibodies, anti-synaptotagmin (SYT) antibodies, anti-mouse kinesin heavy chain (KHC) antibodies, and anti-presenilin 1 (PS1) C-terminal fragment antibodies were used.
  • SYT anti-synaptotagmin
  • KHC anti-mouse kinesin heavy chain
  • PS1 anti-presenilin 1
  • anti-X11L antibody mint2, BD Biosciences
  • anti-PDI antibody (1D3, Stressgen Biotechnologies
  • anti-GM130 antibody #1 35, BD Biosciences
  • anti-SYT antibody # 41, BD Biosciences
  • anti-KHC antibody H2, CHEMICON International
  • anti-PS1 C-terminal fragment antibodies PS1-CTF, CHEMICON International
  • G369 was used for the anti-APP cytoplasmic region antibody, and UT83 was used for the anti-Ale antibody.
  • G369 was prepared according to the method described in Oishi, M. et al., (1997) Mol. Med. 3, 11-113.
  • UT83 is a polyclonal antibody derived from a egret using a peptide obtained by adding Cys to the C-terminal peptide (amino acids 954 to 971) of human Ale ⁇ 1 (Araki Y., et al.
  • FIG. 1 shows the results of the Western blot.
  • fraction 8 APP, X11L, Ale Then, 500 1 of this fraction force was collected and added to an equal volume of a double concentration CHAPS buffer solution (20 mM CHAPS, 20 mM sodium phosphate pH 7.4, 280 mM sodium chloride), and the membrane components were dissolved.
  • Conjugate immunoprecipitation was performed with G369 (anti-APP cytoplasmic domain antibody).
  • G369 was added to the solubilized membrane components, reacted at 4 ° C for 1 hour, and then 30 ⁇ l of 50% protein G-Sepharose equilibrated with 2x CHAPS buffer was added to the gel. ⁇ ⁇ The reaction was performed at 4 ° C for 1 hour. Wash the beads after this reaction with 800 1 double concentration CHAPS buffer, and mix 451 sample buffer mixture (30 ⁇ l of 5 times concentration SDS sample buffer and 15 ⁇ l of 8 1 urea solution) was added and the mixture was boiled for 5 minutes to dissolve the components attached to the beads. After performing SDS-PAGE on the 8% gel, the Western blot was performed in the same manner as described above.
  • the antibody against the IgG heavy chain (IgG (H) was used in addition to the anti-cytoplasmic region antibody, anti-X11L antibody, anti-Ale antibody, and anti-SYT antibody used above.
  • conjugate immunoprecipitation was performed using an equal amount of non-immune egret serum instead of G369, and the resulting components were also subjected to Western plot. Further, Western plots were similarly performed on the soluble membrane components before performing conjugate immunoprecipitation. The result is shown in FIG.
  • the components obtained by conjugate immunoprecipitation with G369 contained XI 1L and Ale ⁇ that could not only be APP. This suggests that ⁇ binds to X11L and Ale ⁇ to form a three-membered complex.
  • the power of five patients with Alzheimer's disease The collected frontal lobe tissues were fixed with Kryofix (a mixture of ethanol, polyethylene glycol and water, Merck) for 17 days, and then embedded in paraffin. The embedded tissue was sectioned, and a continuous section having a thickness of 4 m was prepared. The sections were deparaffinized and immunostained with ABC elite kit (Vector Laboratory).
  • Kryofix a mixture of ethanol, polyethylene glycol and water, Merck
  • the sections were incubated with an anti-Alea antibody (UT83) solution (0.8 ⁇ g / ml) or an anti-APP extracellular region antibody (22C11, Roche Diagnostics) solution (0.5 g / ml) and reacted with the secondary antibody. Thereafter, peroxidase activity was visualized with a diaminobenzidine monoperoxide solution.
  • UT83 anti-Alea antibody
  • 22C11 anti-APP extracellular region antibody
  • a diaminobenzidine monoperoxide solution As a control, sections were incubated with a non-immunized egret IgG solution (0.8 g / ml) and immunostained in the same manner.
  • the sections were incubated in a solution containing an anti-Ale ⁇ antibody and an antigen peptide (40 ⁇ ) against this antibody, and immunostaining was performed in the same manner. went.
  • FIG. 3-1 The results obtained when anti-Alea antibody, anti-APP extracellular region antibody, and non-immunized egret IgG were used are shown in FIG. 3-1, FIG. 3-2, and FIG. 3-3, respectively.
  • Example 2 After deparaffinizing the section prepared in Example 2, a solution containing an anti-Alea antibody (0.8 ⁇ g / ml) and an anti-APP extracellular region antibody (0.5 ⁇ g / ml), or an anti-Alea antibody ( (0.8 ⁇ g / ml) and an anti- ⁇ antibody (used at a dilution of 1/1000). 4G8 (Signet Lab) was used as the anti- ⁇ antibody.
  • Example 4 DNA encoding Ale a, Ale j8, Ale ⁇ , or APP695 (isoform of human APP consisting of 695 amino acids) was inserted into mammalian cell expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen).
  • HEK293 cells were seeded in a 6-well culture dish (bottom area 10 cm 2 ) containing DMEM (Sigma D5796) containing 10% fetal bovine serum, and the expression vector prepared above was transfected with the gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, (Invitrogen). As a control, pcDNA3.1 without any insertion was similarly introduced into HEK293 cells.
  • a DMSO solution ImM of the preserine inhibitor L-685,458 (Calbiochem)
  • L-685,458 the preserine inhibitor L-685,458 (Calbiochem)
  • the medium was collected.
  • an equivalent amount of DMSO was added instead of the L-685,458 solution, and cultivation was carried out in the same manner to collect a medium.
  • the collected medium was mixed with 1 ml of HBST buffer (10 mM solution pH 7.4, 150 mM sodium chloride, 0.5% TritonX-100, 5 ⁇ g / ml chymostatin, 5 ⁇ g / ml leptin, 5 ⁇ g / ml peptatin) to extract the protein in the cells.
  • HBST buffer 10 mM solution pH 7.4, 150 mM sodium chloride, 0.5% TritonX-100, 5 ⁇ g / ml chymostatin, 5 ⁇ g / ml leptin, 5 ⁇ g / ml
  • the solubilized cells were centrifuged (12000 ⁇ g, 10 min), the supernatant was collected, and the soluble component was recovered.
  • 7.5 ⁇ l of the solubilized component 7.5 ⁇ l of a sample buffer mixture (a mixture of 5 ⁇ l of a 5-fold concentration SDS sample buffer and 2.5 / zl of an 8 ⁇ urea solution) was added and boiled for 5 minutes. This sample was subjected to SDS-PAGE on an 8/15% two-step gel, and the protein was transferred to a -trocellulose membrane, followed by Western blot. SDS-PAGE followed Lammli's standard method.
  • Primary antibodies include anti-APP cytoplasmic domain antibody (diluted to G369, 1/2000), anti-Ale a antibody (UT83, 0.3 ⁇ g / ml), anti-Ale ⁇ antibody (UT99, 0.5 ⁇ g / ml), Detection was performed using an ECL kit (Pharmacia) using an anti-Aley antibody (UT105, diluted to 1/500).
  • UT99 and UT105 are antibodies that recognize the C-terminal of Ale ⁇ and Aley, respectively. The results are shown in FIGS. 6 and 7A to 7C.
  • the C-terminal fragment generated by the first cleavage of APP undergoes a second cleavage by preserin, and the cleaved fragment is secreted extracellularly (FIG. 5).
  • the second cleavage does not occur, and the C-terminal fragment of APP accumulates in the cell.
  • FIG. 6 the fact that the C-terminal fragment (CTF a) is more frequently detected in the cell lysate only when the preserine inhibitor (L-685,458) is purified, reflects this fact.
  • a DNA encoding proteins (FLAG-Alea, FLAG-Ale ⁇ , and FLAG-Aley) having a FLAG tag sequence inserted after the N-terminal signal sequence of Ale ⁇ , Alej8, and Ale ⁇ , They were inserted into the mammalian cell expression vector pcDNA3.1 (Invitrogen).
  • HEK293 cells were seeded in a 6-well culture dish (bottom area 10 cm 2 ) containing DMEM (Sigma D5796) containing 10% fetal bovine serum, and the expression vector prepared above was transfected with the gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, (Invitrogen). As a control, pcDNA3.1 without any insertion was similarly introduced into HEK293 cells.
  • buffer B (7.7% SDS, 16.7 mM Tris-HC1 pH 7.4, 0.3 mg / ml chymostatin, 0.3 mg / ml leuptin, 0.3 mg / ml pepstatin) was added to 1 ml of the culture medium. Boiled for a minute to denature the protein components. Then, 3.75 ml of Buffer C (6.7% NP-40, 0.4 M NaCl, 26 mM EDTA, 200 mM Tris-HC1 pH 7.4), 1,75 ml of enzyme inhibition solution
  • TritonX-100 1M sodium chloride, 20mM Tris-HC1 pH7.4), wash buffer ⁇ (0.05% Washed sequentially with SDS, 1% TritonX-100, 5 mM EDTA, 150 mM sodium chloride, 50 mM Tris-HCl pH 7.4) and a rinse buffer. Then add 30 1 sample buffer mixture (mixture of 5 times the concentration of SDS sample buffer of 201 and 10 1 8M urea solution) to the resin, stir, boil for 5 minutes, and Was dissolved. After centrifugation, the supernatant component was subjected to SDS-PAGE using a 6% gel, and then the protein was transferred to a nitrocellulose membrane, followed by Western plot. SDS-PAGE followed Lammli's standard method. The primary antibody used was an anti-FLAG antibody (M2, SIGMA), and the detection was performed using an ECL kit. The results are shown in Figure 7D-F.
  • M2, SIGMA anti-FLAG antibody
  • the fragments recognized by the anti-FLAG antibody were detected in the medium even for Ale ⁇ , Ale j8, and Ale !. Since the FLAG tag sequence binds to the ⁇ -terminal of mature Ale ⁇ , Ale ⁇ , and Ale ⁇ , this indicates that the ⁇ -terminal fragment generated by the first cleavage of Ale ⁇ , Ale j8, and Ale ⁇ is extracellular. It is thought to be secreted into. (Example 6)
  • HEK293 cells are seeded on a 10 cm culture dish (bottom area 60 cm 2 ) containing DMEM containing 10% fetal calf serum, and the expression vector prepared above is transfected with the gene transfer reagent (
  • 201 was sampled and incubated at 37 ° C for 1 or 3 hours.
  • a sample was prepared by adding a preserine inhibitor (L-685,458) to a final concentration of 1.
  • the reaction was stopped by adding 20 1 sample buffer mixture (mixture of SDS sample buffer 5 times 13.4 1 and 6M 8M urea solution) to each sample, and boiling for 5 minutes, followed by 8/15%
  • sample buffer mixture mixture of SDS sample buffer 5 times 13.4 1 and 6M 8M urea solution
  • an anti-Alea antibody As the primary antibody, an anti-Alea antibody (UT83), an anti-Ale ⁇ antibody (UT99), and an anti-Aley antibody (UT105) were used, and detection was performed using an ECL kit (Pharmacia). The result is shown in FIG. 8A.
  • the fragment containing the C-terminal region of each Ale was obtained by incubating the membrane fraction even for Ale ⁇ , Ale j8, and Ale! Etc.) were detected. Such fragments were undetectable when the preserine inhibitor was added. From the above, it is considered that fragments containing the C-terminal region such as Ale ⁇ are excised by preserin.
  • Ale ⁇ was obtained by removing the fragment between the signal peptide and the first cleavage site ( ⁇ in the figure), and adding FLAG to the C-terminal side of the signal peptide.
  • the tag sequence is inserted.
  • HEK293 cells were seeded on a 10 cm culture dish (bottom area 60 cm 2 ) containing DMEM containing 10% fetal calf serum, and the expression vector prepared above was introduced into the cells using a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, Invitrogen). did.
  • pcDNA3.1 without any insertion was similarly introduced into HEK293 cells.
  • the recovered medium was subjected to immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody (M2, SIGMA) and Western blotting to detect the N-terminal product cleaved by preserin. Specifically, 4 ⁇ l of the anti-FLAG antibody was reacted with the recovered medium at 4 ° C. for 1 hour. Then, add 30 ⁇ l of a rinse buffer (0.1% TrotonX-100, ImM EDTA, 150 mM NaCl, lOmM Tris-HC1 pH 7.4) containing 50% Gin Sepharose, and further at 4 ° C. After reacting for 1 hour, the beads were collected.
  • a rinse buffer (0.1% TrotonX-100, ImM EDTA, 150 mM NaCl, lOmM Tris-HC1 pH 7.4
  • the beads were washed sequentially with 800 1 of washing buffer 1 (composition described in Example 5), washing buffer ⁇ (composition described in Example 5), and rinsing buffer (composition described above). , 30 ⁇ l of 2x Tricine sample buffer (900 mM Tris-HC1 pH 8.45, 24% glycerol, 8% SDS, 0.005% Kumashii 'Brilliant' Blue), boil for 5 minutes The attached components were soluble. After the soluble component was separated on a 15% Tris-Toricin gel (by the standard method of Schagger & von Jagow), Western blotting was performed using an anti-FLAG antibody (diluted to 1/2000) and an anti-Ale ⁇ antibody (UT83). Blots were performed, and the cleavage product of preserin ( ⁇ -like fragment) and Ale ⁇ were detected with an ECL kit (Pharmacia).
  • 2x Tricine sample buffer 900 mM Tris-HC1 pH 8.45, 24% glycerol, 8% SDS,
  • the proteins in the cells were extracted from the cells in 4 ml of HBST buffer (composition described in Example 4).
  • the soluble cells were centrifuged (12000 ⁇ g, 10 min), and the supernatant was collected to collect the soluble components.
  • HBST buffer containing 50% protein G-Sepharose 1 and react at 4 ° C for 1 hour. Collected.
  • sample buffer mixture a mixture of 30 ⁇ l of 5 times concentration SDS sample buffer and 15 ⁇ l of 8 ⁇ urea solution.
  • the transfected Ale ⁇ was detected in the cell lysate, but the cleavage product (/ 3 Ale a) was detected only once in the medium by the preniserin, and was detected in the cell lysate. No power was detected. From this, the fragment digested by preserin is A
  • DNA encoding Ale a or APP695 can be expressed in mammalian cell expression vector
  • the DNA was inserted into pcDNA3.1 (Invitrogen), and the DNA encoding human BACE1 (provided by Dr. Doms) was inserted into the mammalian expression vector pcDNA3.1Zeo (+) (Invitrogen).
  • HEK293 cells were seeded in a 6-well culture dish (bottom area 10 cm 2 ) containing DMEM (Sigma D5796) containing 10% fetal bovine serum, and the expression vector prepared above was transfected with the gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, (Invitrogen).
  • the combinations of the introduced DNAs are as described in FIG.
  • FIGS. 11A and 11B show the results of Western blotting using the anti-APP antibody and using the anti-Alea antibody, respectively.
  • CTF ⁇ a cleavage product of ⁇ site
  • the bands corresponding to # 695 are only two bands indicated by arrows, and the two bands detected near these bands correspond to endogenous APPs (# 770 and # 751).
  • CTF1 a fragment (CTF1) was mainly detected at the position of 30 kDa. Since the molecular weight of this fragment is almost identical to the molecular weight of Ale ⁇ expressed in Example 7, the cleavage site is near the 815th Met and the 816th Ala, and the number of amino acids is about 156. It is assumed that On the other hand, in cells expressing both Alea and BACE1 (the sixth lane from the left), a fragment having a larger molecular weight than this fragment was detected in addition to CTF1 (CTF
  • the cleavage site of Alea by y-secretase was identified by the following procedure.
  • a cDNA construct (FIG. 9) that expresses the Ale protein ⁇ E was prepared.
  • cells into which this cDNA construct has been introduced produce and secrete j8-Alea having a FLAG tag sequence.
  • the j8-Ale ⁇ secreted from the cells was recovered by immunoprecipitation using a FLAG-tag antibody, and the immunoprecipitate was analyzed by MALDI-TOF / MS to determine the molecular weight. From this molecular weight, the site of cleavage by ⁇ -secretase was identified.
  • an Alca ⁇ expression vector (pcDNA3-FLAG-hAlc ⁇ ) was introduced into a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, Invitrogen). Introduced using a CO incubator
  • a DMSO solution (ImM) of ⁇ -secretase inhibitor L-685,458 manufactured by Riki Biochem
  • 21 ml of a DMSO solution (ImM) of ⁇ -secretase inhibitor L-685,458 was added to 1 ml of the medium.
  • cells that had only DMSO were used.
  • 6 ml of the culture solution was collected and centrifuged (15000 rpm, 5 min, using a micro high-speed cooling centrifuge manufactured by Tommy) and 1 / 1000-fold volume of the enzyme inhibitor solution (5 mg / ml leptin, 5 mg / ml ⁇ pstatin A, DMSO solution containing 5 mg / ml chymostatin) was used as a sample for immunoprecipitation.
  • 61 anti-FLAG antibody solution (M2, manufactured by Sigma) was added and mixed by inversion at 4 ° C for 1 hour. Then, add 50 1 of a rinse buffer containing 25% protein G-sepharose (10 mM Tris-HCl pH 7.4, ImM EDTA, 0.1% Triton X-100, 150 mM sodium chloride), and mix by inversion at 4 ° C for 1 hour. To allow the antigen-antibody reaction to proceed. The beads after the reaction are precipitated and collected by centrifugation (3000 rpm, 5 min, 4 ° C, micro high-speed cooling centrifuge manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.) and washed with washing buffer 1 (1 M sodium chloride, 20 mM Tris-HCl pH7).
  • ice-cold PBS ice-cold PBS
  • the cells were peeled off by pipetting, and placed in an eppendorf tube.
  • the cells were collected by centrifugation (6000 rpm, 5 min, using a micro high-speed centrifugal separator made of Tommy Fine Energy), and 0.9 ml of HBST buffer (composition described in Example 4) was added to the cell pellet.
  • the protein in the cells was extracted by inverting and mixing at 4 ° C for 1 hour.
  • the soluble cells were centrifuged (15000 rpm, 15 min, 4 ° C, using a micro high-speed centrifuge manufactured by Tommy Seiko), and the supernatant was recovered as a soluble component.
  • An Alc a ⁇ expression vector (pcDNA3-FLAF-hAlc ⁇ ⁇ ) was introduced into HEK293 cells using a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, manufactured by Invitrogen) to stably transform Ale ⁇ ⁇ with FLAG sequence.
  • An expressing cell line was established. The established cell line cells were inoculated into a 225 cm 2 flask, and after reaching confluence, the culture solution was replaced with 40 ml of DMEM medium (Sigma D5796) containing 10% fetal bovine serum, and cultured in a CO incubator for 24 hours. this
  • ⁇ -secretase inhibitor L-685,458 manufactured by Calbiochem
  • the liquid (1 mM) was added with L1.
  • a cell prepared with only DMSO was also used.
  • the culture medium was collected and centrifuged (10,000 xg, 5 min, using a high-speed cooling centrifuge manufactured by Beckman) and the supernatant was added to a 1 / 1000-fold volume of the enzyme inhibitor solution (5 mg / ml leuptin, 5 mg / ml).
  • a DMSO solution containing 5 mg / ml chymostatin) and 1 / 1000-fold volume of a 10% aqueous sodium azide solution were used as samples for immunoprecipitation.
  • To 20 ml of this sample add 20 ⁇ l of agarose beads (Sigma A2220) conjugated with 50% (v / v) FLAG antibody (M2), and mix by inverting overnight (about 12 hours) in a low-temperature room (4 ° C). Then, the antigen-antibody reaction was advanced. The beads after the reaction were precipitated and recovered by centrifugation (3000 rpm, 5 min, 4 ° C, low-speed cooling centrifuge manufactured by Beckman).
  • the collected beads were washed with 800 1 of washing buffer 1 (0.1% N-octylglucoside, 140 mM sodium chloride, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.025% sodium azide) to remove non-specific binding.
  • the plate was washed twice with washing buffer 2 (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.025% sodium azide) twice.
  • washing buffer 2 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.025% sodium azide
  • the beads were saturated with 101 matrix solution (sinapic acid (Applied Biosystems), trifluoroacetic acid (Wako Pure Chemical Industries) Zacetonitrile (Sigma) Z water (1:20:20 )) was added, and after stirring, the components bound to the beads were eluted.
  • the eluted components were put on a spin column (Amersham's Bioscience), and only the eluted components were separated by centrifugation. Of the eluted components, 21 was placed on a sample plate (manufactured by Applied Biosystems), dried, and analyzed by MALDHTOF / MS (manufactured by Perspective Biosystems).
  • Cleavage sites corresponding to these molecular weights are indicated by arrows in FIG.
  • the transmembrane region that can be assumed from the amino acid sequence is indicated by a solid line, and the region likely to be a transmembrane region is indicated by a broken line. Since the cleavage sites determined from the molecular weights of 5359.85, 5507.02, and 6233.83 are located in the transmembrane region and the region having a high possibility of being transmembrane, it can be determined to be a cleavage region by ⁇ -secretase.
  • the cleavage site determined from the molecular weight of 3619.96 is clearly located in the extracellular domain of Ale ⁇ , it is a degradation product of ⁇ -Alea generated by cleavage at the ⁇ -site. Probability is high. Thus, there are at least three sites for the second cleavage of Ale a by ⁇ -secretase. This is consistent with the fact that ⁇ has multiple ⁇ -sites and generates and secretes ⁇ ⁇
  • Figure 16 shows the known cleavage site of APP (human APP695) and the products generated by the cleavage. (The numbers in the figure are the amino acid numbers in the human APP695 isoform.)
  • the primary cleavage site is Cleavage sites a-site and j8-site, secondary cleavage site ⁇ -site, recently identified ⁇ -site (Gu, Y., Misonou, H., Sato, T., Dohmae, N., Takio, K., and Ihara, Y. (2002) J. Biol. Chem. 276, 35235-35238).
  • Products include the major A ⁇ species ⁇ 40 and ⁇ 42, and the p3 peptide, the product of a-site cleavage.
  • the primary cleavage site was identified by determining the N-terminal amino acid sequence of the C-terminal fragment (CTF) generated by the primary cleavage of Ale a.
  • CTF C-terminal fragment
  • it is difficult to recover enough protein from cell extracts to determine the N-terminal sequence because CTF is susceptible to continuous secondary cleavage. Therefore, the dominant negative protein, in which the active site of presenilin (PS), the catalytic subunit of ⁇ -secretase, is mutated, is stably expressed in 293 cells, and the resulting Ale CTF is secondary.
  • PS presenilin
  • a system that does not undergo cleavage was constructed.
  • An Ale a1 FLAG expression vector (pcDNA3-hAlca 1-FLAG) with a FLAG tag at the C-terminus of Ale ⁇ was further introduced into this cell line using a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, Invitrogen). Then, a cell line stably expressing Ale a1 FLAG was established.
  • LipofectAMINE2000 manufactured by Invitrogen
  • This cell line Ale a FLAG of the calling expression vector (p C DNA3-hAlc a 1 -FLAG) a transfection reagent (LipofectAMINE2000, in Bitorojiwen Co.) were stably expressed with.
  • the cells co into four 10cm dishes Nfuruento (per dish, about lxl0 8 cells) was cultured to reached.
  • a HBST solution (10 mM Hepes pH7) containing an enzyme inhibitor solution (DMSO solution containing 5 ⁇ g / ml leptin ⁇ , 5 ⁇ g / ml pepstatin ⁇ ⁇ , and 5 ⁇ g / ml chymostatin) 15 ml of .4, 150 mM NaCl, 0.5% Trition X-100) was mixed and the mixture was inverted and stirred at 4 ° C.
  • DMSO solution containing 5 ⁇ g / ml leptin ⁇ , 5 ⁇ g / ml pepstatin ⁇ ⁇ , and 5 ⁇ g / ml chymostatin
  • the beads after the reaction were precipitated and recovered by centrifugation (3000 rpm, 5 min, 4 ° C, low-speed cooling centrifuge manufactured by Beckman). After washing the beads three times with 1 ml of HBST, 2 mg / ml HBST containing FLAG-peptide (301) was added thereto, and the immunoprecipitate was competitively eluted.
  • the molecular weight of CTF1 of Alea is around 30 kDa, and antigen is eluted under mild conditions in order to avoid contamination of the immunoglobulin light chain (30 kDa) as much as possible.
  • the eluate was centrifuged (12000 xg, 10 min, 4 ° C, using a micro high-speed centrifuge made by Tommy Energy), and 1/5 volume of 5-fold concentration SDS sample buffer was added to the supernatant. Then, atalylamido gel electrophoresis was performed according to the lammini standard method. The separated protein was transferred to an Immobilon-PSQ (Millipore) membrane and stained with Coomassie brilliant blue (CBB) dye to detect the protein (FIG. 17).
  • Immobilon-PSQ Micropore
  • CBB Coomassie brilliant blue
  • proteins indicated by CTFls Two types were detected around 30 kDa.
  • the amino acid sequences of these proteins were determined using gas phase protein sequencer 492HT (manufactured by Applied Biosystems). As a result, there are two types of proteins on the high molecular weight side.
  • the amino acid sequence was included.
  • the primary cleavage sites assumed from these sequences are between the 815th Met and the 816th Ala (this cleavage site is referred to as “ ⁇ 1”) and between the 820th Gin and the 821st Phe ( This cutting site is called “ ⁇ 2” (Fig. 18).
  • ⁇ 1 matched the site determined in Example 8.
  • ⁇ 2 is a new primary cutting site.
  • the protein on the low molecular weight side of CTFls contained one type of amino acid sequence.
  • the primary cleavage site assumed for this sequence is between Ala at position 838 and Asn at position 839 (this cleavage site is called “ ⁇ 3”) (Fig. 18).
  • Ale ⁇ has three primary cutting sites ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3) and three secondary cutting sites ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3).
  • ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 three secondary cutting sites
  • J8-Ale ⁇ are produced from humans (Table 1).
  • AD Alzheimer's disease
  • I143F (143th lie mutated to Phe), R278T (278th Arg force Thr mutated), A434C (434th Ala mutated to Cys), L435F (435th Leu mutated to Cys) Phe (mutated to Phe) 4 types of mutant PS1 expression vector (pcDNA3-PSlI143F,
  • pcDNA3-PSlR278T pcDNA3-PS1A434C
  • pcDNA3-PS1L435F pcDNA3-PS1L435F
  • pcDNA3-APPC99 an APP C99 / CTF expression vector
  • Each cell was seeded on a 10-cm dish (Corning), and after reaching confluence, pcDNA3-FLAG-hAlc a ⁇ was introduced using a gene introduction reagent (LipofectAMINE2000, Invitrogen), and Alcadein a CTF1 was transiently expressed.
  • pcDNA3-FLAG-hAlc a ⁇ was introduced using a gene introduction reagent (LipofectAMINE2000, Invitrogen), and Alcadein a CTF1 was transiently expressed.
  • vectors expressing normal PS1 (wt) and inactive PS1 (D385A, in which Asp at the catalytic site of PS1 is replaced with Ala and does not show ⁇ -secretase activity).
  • pcDNA3-PSID385A was prepared, and introduced into HEK293 cells using a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, Invitrigen) to establish a cell line stably expressing PS1.
  • pcDNA3-APPC99 and pcDNA3-FLAG-hAlc ⁇ were introduced using a gene transfer reagent (LipofectAMINE2000, manufactured by Invitrogen). Then, CTF of ⁇ and CTF1 of Alcadein a were transiently expressed.
  • the culture broth was collected and centrifuged (15000 rpm, 5 min, 4 ° C, using a high-speed cooling centrifuge manufactured by Beckman), and 7.5 ml of the supernatant was added to the enzyme inhibitor solution (5 mg / ml leptin). , 5 mg / ml ⁇ pstatin A and a 5 mg / ml DMSO solution containing chymostatin) 7.51 to obtain a sample. To this sample, an anti-FLAG antibody solution (M2, Sigma lot 103k6043) was added at 6 / z1, and the mixture was inverted and mixed at 4 ° C for 1 hour.
  • an anti-FLAG antibody solution M2, Sigma lot 103k6043
  • wash buffer 1 (1 M sodium chloride, 20 mM Tris-HC1 pH 7.4, 0.1% Triton X-100), wash buffer Solution 2 (150 mM sodium chloride, 5 mM EDTA, 50 mM Tris-HC1 pH7.4, 1% TritonX-100, 0.05% SDS)
  • SRinse buffer 10 mM Tris-HC1 pH7.4, ImM EDTA, 0.1% TritonX-100, Washed sequentially with 150 mM sodium chloride. Then add 20 1 sample buffer mixture to the beads
  • Figure 19 shows the results of Western blotting, the ratio of Long ⁇ -Ale in total ⁇ -Ale production (1.0), and the ratio of ⁇
  • Example 11 In order to determine the C-terminal cleavage site of 13-Ale shown in Fig. 19 using MALDI-TOF / MS, in order to find a PS1 mutation that produces more high molecular weight i8-Ale, Example 11 was used. The same experiment as was conducted diligently. As a result, as shown in FIG. 20, in cells expressing the L166P (Leu at position 166 of PS1 mutated to Pro) mutant PS1, high-molecular-weight j8-Ale was present in the medium in a higher amount than in other PS1 mutations. Was found to be secreted.
  • ⁇ -Ale produced and secreted by the normal PS1 and L166P mutant PS1 was subjected to mass spectrometry to determine the molecular weight.
  • the results are shown in FIG.
  • short j8-Ale is reduced in cells expressing L166P mutant PS1 compared to cells expressing normal PS1 (indicated by a thick arrow pointing down).
  • the medium jS-Alc increased in calories (indicated by a thick arrow pointing upward).
  • long j8-Ale which could not be detected in cells expressing normal PS1, appeared.
  • FIG. 22 shows the cutting position of / 3 -Ale where the force was also found as a result of FIG. 21. Dashed arrows indicate sites cleaved in cells expressing normal PS1, and solid arrows indicate sites cleaved in cells expressing L166P mutant PS1. In the L166P mutant PS1, it was revealed that the cleavage site of
  • Figure 23 shows the cleavage site and mutant PS1 at three sites at the C-terminal side ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3), along with three N-terminal sites ( ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3) of

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

　アルカディンα、アルカディンβ、又はアルカディンγからN末端側の断片とC末端側の断片が切断除去されることによって生成するペプチドであって、アルツハイマー病の診断マーカーとなり得るペプチドを提供する。このペプチドを診断マーカーとすることにより、被検者に負担をかけず、初期段階でアルツハイマー病を発見することが可能になる。

Description

明 細 書
ァノレツハイマー病のマーカーペプチド
技術分野
[0001] 本発明は、アルツハイマー病の診断マーカーとなるペプチド、前記ペプチドを用い たアルツハイマー病の診断方法、前記ペプチドを用いたアルッノヽイマ一病の診断の ためのデータを収集する方法、前記ペプチドを用いたアルッノ、イマ一病の治療薬の スクリーニング方法、前記ペプチドに対する抗体、及び前記抗体を含むアルッハイマ 一病の診断薬に関する。
背景技術
[0002] 現在、アルツハイマー病の診断は、専門医による問診や脳の萎縮状態を MRI等に よって観察することなどにより行われている。しかし、問診のみによる診断では客観的 かつ正確な診断結果を得るのは困難であり、発症前のいわゆる患者予備群の発見 は不可能である。また、 MRI等の機器は高価であるため、大規模な専門病院でなけ れば使用することができない。
[0003] このような現状から、簡易かつ客観的な診断方法として、マーカー物質を用いた生 化学的な診断方法が注目されている。現在、アルツハイマー病のマーカー物質とし ては、主なものとして、細胞内タウタンパク質と j8—アミロイド（以下、「Α |8」という）が知 られている (非特許文献 1、非特許文献 2)。
[0004] タウタンパク質は神経細胞中の微小管を構成するタンパク質であり、アルッハイマ 一病の発症により神経細胞が破壊されると細胞外に漏出し、脳脊髄液中に検出され るようになる。タウタンパク質は有用なマーカー物質の一つではある力 病状が進行 しないと検出されず、また、漏出する量が少ないため脳脊髄液以外の体液 (例えば、 血液)では測定が困難である。
[0005] Α βは、アルッノ、イマ一病発症の原因物質であるため、もし、この生成の量的（生成 量の増加)もしくは質的変化 (凝集性の高 、Α β種の割合の増力!])を正確に測定でき れば最も有効なマーカー物質となり得る。しかし、 Α |8は凝集性があるため、患者脳 髄液中の A |8検出量は健常者よりもむしろ低い値を示してしまう。 [0006] 非特許文献 1： "Decreased beta-amyloid 1-42 and increased tau levels in
cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer disease"; Sunderland, T., Linker, G., Mirza, N, Putnam, K.T., Friedman, D. L., Kimmel, L. H., Bergeson, J., Manetti, G. J., Zimmermann, M., Tang, B., Bartko, J. J. and Cohen, R. M. JAMA[2003] 289, 2094-2103.
非特許文献 2： 'Cerebrospinal fluid biomarkers for disease stage ana intensity in cognitively impaired patients ： Wahlund, L. O., and Blennow, K. Neurosci. Lett.
[2003] 339, 99-102.
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 以上のように、現在知られて!/、るマーカー物質による診断方法では、アルッハイマ 一病を初期段階で発見することが難しぐまた、血液検査のような被検者に負担の少 ない方法で診断することも困難である。
[0008] 本発明は、上記のような技術的背景の下になされたものであり、簡易かつ正確にァ ルツハイマー病を診断する手段を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、アル力ディン（
Alcadein) t ヽぅタンパク質力 A βの前駆体（以下、「APP」 t 、う）を切断する酵素と 同じ酵素によって切断され、 A |8と同様に細胞外へ分泌されることを見出した。アル力 ディンが、 X11L及び APPと三者複合体を形成し、その複合体の形成が A |8の生成を 抑制することは既に報告されていたが（Araki, Y. et al.， (2003) J. Biol. Chem. 278, 49448-49458、特開平 2003-164298号公報）、 APPと同じ酵素によって切断され、 A j8 と同じようにペプチドが細胞外へ分泌されると 、うことは全く新 、知見である。また、 本発明者は、凝集性が高く神経毒性も高い高分子量型の A が増加する条件では、 アル力ディンカゝら切り出されるペプチドも高分子量型のものが増加すると ヽぅ知見も得 た。
[0010] 本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。
[0011] 即ち、本発明は、以下の（1)一（14)を提供するものである。 [0012] (1)アル力ディン oc、アル力ディン β、又はアル力ディン γから Ν末端側の断片と C末 端側の断片が切断除去されることによって生成するペプチドであって、アルッノヽイマ 一病の診断マーカーとなり得るペプチド (以下、このペプチドを単に「本発明のぺプ チド」という場合がある。）。
[0013] (2)切断除去される Ν末端側の断片が、 Ν末端側の細胞外ドメインの一部である、 (1) 記載のペプチド。
[0014] (3)切断除去される C末端側の断片が、プレセ二リンによって切断除去される断片で ある、（1)又は（2)記載のペプチド。
[0015] (4)アル力ディン ocから Ν末端側の断片と C末端側の断片が切断除去されることによ つて生成するペプチドであって、 Ν末端側の断片の切断除去される部位が、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列の 815番目に対応するアミノ酸と 816番目に対応するァミノ 酸の間、 820番目に対応するアミノ酸と 821番目に対応するアミノ酸の間、又は 838番 目に対応するアミノ酸と 839番目に対応するアミノ酸の間である、（1)記載のペプチド
[0016] (5)アル力ディン ocから Ν末端側の断片と C末端側の断片が切断除去されることによ つて生成するペプチドであって、 C末端側の断片の切断除去される部位が、配列番 号 1で表されるアミノ酸配列の 842番目に対応するアミノ酸と 843番目に対応するァミノ 酸の間、 843番目に対応するアミノ酸と 844番目に対応するアミノ酸の間、又は 851番 目に対応するアミノ酸と 852番目に対応するアミノ酸の間である、（1)又は（2)記載の ペプチド。
[0017] (6)ペプチドが、配列番号 4乃至配列番号 12の 、ずれかに記載されたアミノ酸配列 からなるペプチドである、（1)記載のペプチド。
[0018] (7)動物から採取した体液又は組織における（1)乃至（6)の 、ずれか記載のぺプチ ドの検出又は定量を行う工程を含むアルッノヽイマ一病の診断のためのデータを収集 する方法。
[0019] (8)体液力 血液又は脳髄液である、（7)記載のアルッノ、イマ一病の診断のための データを収集する方法。
[0020] (9)検出又は定量されたペプチドにおける高分子量型のペプチドの比率を指標とし てアルッノ、イマ一病の診断を行う、 (7)又は（8)記載のアルッノ、イマ一病の診断のた めのデータを収集する方法。
[0021] (10)動物力 採取した体液又は組織における（1)乃至（6)の 、ずれか記載のぺプ チドの検出又は定量を行う工程を含むアルツハイマー病の診断方法。
[0022] (11)体液が、血液又は脳髄液である、 (10)記載のアルッノ、イマ一病の診断方法。
[0023] (12)検出又は定量されたペプチドにおける高分子量型のペプチドの比率を指標と してアルッノ、イマ一病の診断を行う、 (10)又は（11)記載のアルッノ、イマ一病の診断 方法。
[0024] (13) (1)乃至（6)の 、ずれか記載のペプチドを分泌する細胞に被験物質を接触さ せ、前記ペプチドの分泌量の変化、又は分泌される前記ペプチドの分子種の変化を 調べることを特徴とするアルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
[0025] (14) (1)乃至（6)のいずれか記載のペプチドに対する抗体。
[0026] (15) (14)記載の抗体を含有するアルッノヽイマ一病の診断薬。
発明の効果
[0027] 本発明のペプチドを利用することにより、被検者に負担の力からない簡易な手段で 、アルッノ、イマ一病を発症前または発症初期段階で発見できるようになる。
図面の簡単な説明
[0028] [図 1]密度勾配遠心によって分けられたタンパク質のウェスタンブロットの結果を示す
[図 2]免疫沈降によって回収されたタンパク質のウェスタンプロットの結果を示す写真
[図 3]アルツハイマー病患者の脳切片の免疫染色写真 (Ale aと APPを検出）。
[図 4]アルツハイマー病患者の脳切片の免疫染色写真 (Ale αと A |8を検出）。
[図 5]APPからの Α |8生成を模式的に表した図。
[図 6]抗 ΑΡΡ抗体を用いた細胞ライセートのウェスタンプロットの結果を示す図。
[図 7]抗 Ale抗体を用いた細胞ライセートと抗 FLAG抗体を用いた培地のウェスタンブ ロットの結果を示す図。
[図 8]抗 Ale抗体を用いた膜画分のウェスタンプロットの結果を示す図。 [図 9]Alc o; Δ Εの構造を示す図。
[図 10]抗 FLAG抗体を用いた細胞ライセートと培地のウェスタンプロットの結果を示す 図。
[図 11]APPまたは Ale a及び BACE1を発現させた細胞のライセートのウェスタンブロッ トの結果を示す図。
[図 12]FLAG配列を持つ β -Ale a (Ale aから N末端側と C末端側の断片が切断除去 されることによって生成するペプチド)の調製法を模式的に表した図。
[図 13]抗 FLAG抗体を用いた Ale α Δ Ε発現細胞の抽出液と培地の免疫沈降物のゥ エスタンブロットの結果を示す図。
[図 14]Alc α Δ Ε発現細胞から分泌された β -Ale aの質量分析結果を示す図。
[図 15]MALDI-TOFMS法によって決定された Ale aの二次切断サイトを示す図。
[図 16]ヒト APP695の切断サイトを示す図。
[図 17]Alc a 1の一次切断によって生じた C末端断片の電気泳動の結果を示す図。
[図 18]Alc aの切断サイトを示す図。
[図 19]種々の変異型 PS1と Ale α Δ Εを発現させた細胞のウェスタンブロットの結果を 示す図。
[図 20]種々の変異型 PS1 (L166P変異型 PS1を含む）と Ale α Δ Εを発現させた細胞の ウェスタンブロットの結果を示す図。
[図 21]野生型 PS1又は L166P変異型 PS1によって生成する /3 -Aleの質量分析結果を 示す図。
[図 22] β -Aleの切断位置を示す図。
[図 23] β -Aleの分子種を模式的に示した図。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のペプチドは、アル力ディン α、アル力ディン β、又はアル力ディン γ力も Ν 末端側の断片と C末端側の断片が切断除去されることによって生成するペプチドであ つて、アルツハイマー病の診断マーカーとなり得るペプチドである。
アル力ディンには、アル力ディン α (以下、「Alc a」という）、アル力ディン j8 (以下、「 Ale j8」という）、アル力ディン γ (以下、「Alc y」という）の 3種類があり、 Alc aとは、配 列番号 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質であり、 Alc iSとは、配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質であり、 Ale γとは、配列番号 3で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク 質である。
Ale α、 Ale j8、 Ale yは、ヒトゃ温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、 -ヮトリ 、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、サルなど）の細胞 (例えば、肝細胞、脾細胞、神経細胞 、グリア細胞、脾臓 j8細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルノヽンス細胞、表皮 細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞 、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細 胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の 前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など)もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組 織、例えば、脳、脳の各部位 (例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下 部、大脳皮質、延髄、小脳)、脊髄、下垂体、胃、脾臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺 、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管 (例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺 、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など に由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよ 、。
配列番号 1、配列番号 2、又は配列番号 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ酸配列としては、各配列番号で表わされるアミノ酸配列と約 50%以上、好ま しくは約 60%以上、さらに好ましくは約 70%以上、より好ましくは約 80%以上、特に 好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列 などが挙げられる。各配列番号で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有するタンパク質としては、例えば、各配列番号で表されるアミノ酸配列と実 質的に同一のアミノ酸配列を含有し、各配列番号で表されるアミノ酸配列を含有する タンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
実質的に同質の活性としては、 X11Lの PIドメインとの結合活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、それらの性質が性質的に (例、生理学的に、または薬理学的に） 同質であることを示す。したがって、上記の活性が同等 (例、約 0. 01— 100倍、好ま しくは約 0. 1— 10倍、より好ましくは 0. 5— 2倍)であることが好ましいが、これらの活 性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なって 、てもよ 、。
また、 Ale a、 Ale |8、又は Ale yとしては、例えば、（ィ）各配列番号で表されるァミノ 酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1一 30個程度、好ましくは 1一 10個程度、 さらに好ましくは数（ 1一 5)個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（口）各配列番号で 表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1一 30個程度、好ましくは 1一 10個程度、さらに好ましくは数（1一 5)個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ハ）各 配列番号で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 (好ましくは、 1一 30個程度、好 ましくは 1一 10個程度、さらに好ましくは数（1一 5)個）のアミノ酸が挿入されたァミノ 酸配列、（二)各配列番号で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは、 1一 30個程度、好ましくは 1一 10個程度、さらに好ましくは数（1一 5)個）のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または (ホ)それらを組み合わせたアミノ酸配 列を含有するタンパク質などの ヽゎゆるムテイン (mutein)も含まれる。上記のようにァ ミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位 置としては、活性が消失しない限り、特に限定されない。具体的には、アル力ディン aには、配列番号 1で表されるアミノ酸配列を有するアル力ディン a 1と配列番号 1で 表されるアミノ酸配列の第 71番目と 72番目に 10アミノ酸が挿入されたアル力ディン a 2が存在する。
N末端側の断片が切断除去される部位は、生成するペプチドがアルツハイマー病 の診断マーカーとなり得る部位であれば特に制限はな 、が、 N末端側の細胞外ドメイ ン中の部位であることが好ましい。このような部位は、 Ale aの場合、通常、配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の 815番目に対応するアミノ酸と 816番目に対応するアミノ酸 の間、アミノ酸配列の 820番目に対応するアミノ酸と 821番目に対応するアミノ酸の間、 若しくはアミノ酸配列の 838番目に対応するアミノ酸と 839番目に対応するアミノ酸の 間、又はそれらの近傍であり、 Ale |8の場合、通常、配列番号 2で表されるアミノ酸配 列の 825番目に対応するアミノ酸と 826番目に対応するアミノ酸の間又はその近傍で あり、 Ale γの場合、通常、配列番号 3で表されるアミノ酸配列の 804番目に対応する アミノ酸と 805番目に対応するアミノ酸の間又はその近傍である。
さらに、アル力ディンは ΑΡΡと同様に、 Ν末端側の断片が切断除去される部位は、も う一箇所存在する。 Ale aは APPの β -サイトでの切断を行う BACEによっても細胞外 で切断される。このような部位は、通常、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 708番 目に対応するアミノ酸と 709番目に対応するアミノ酸の間またはその近傍である。
C末端側の断片が切断除去される部位も生成するペプチドがアルツハイマー病の 診断マーカーとなり得る部位であれば特に制限はないが、プレセ-リンによって切断 される部位が好ましい。このような部位は、 Ale αの場合、通常、配列番号 1で表され るアミノ酸配列の 842番目に対応するアミノ酸と 843番目に対応するアミノ酸の間、 843 番目に対応するアミノ酸と 844番目に対応するアミノ酸の間、若しくは 851番目に対応 するアミノ酸と 852番目に対応するアミノ酸の間、又はそれらの近傍であり、 Ale βの場 合、通常、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 875番目に対応するアミノ酸と 876番 目に対応するアミノ酸の間又はその近傍であり、 Ale γの場合、通常、配列番号 3で 表されるアミノ酸配列の 847番目に対応するアミノ酸と 848番目に対応するアミノ酸の 間又はその近傍である。なお、ここで「近傍」とは、切断部位から通常 10個以内のアミ ノ酸の範囲をいい、好ましくは 5個以内のアミノ酸の範囲をいう。本発明のペプチドの 具体例としては、配列番号 4乃至配列番号 12の 、ずれかに記載されたアミノ酸配列 力もなるペプチドを挙げることができる。
本発明のペプチドは、以下の理由から、アルツハイマー病の診断マーカーとして利 用することができると考えられる。
( 1)本発明のペプチドはアル力ディンから生成する力 アル力ディンは、 ΑΡΡ及び X11Lの三者で複合体を形成する（Araki, Y. et al.， (2003) J. Biol. Chem. 278, 49448-49548、特開平 2003-164298号公報）。また、アル力ディンは、アルツハイマー 病患者の脳で APPと同じ分布を示す (実施例 2及び 3)。
(2)アル力ディンは APPと同じく BACEによって切断される（実施例 8)。
(3)本発明のペプチドは、 A |8と同じくプレセ-リンによって切断されることによって生 じる（実施例 4、 6、及び 7)。また、本発明のペプチドは、 A |8と同様に細胞外に分泌 される（実施例 7)。さらに本発明のペプチドは、 A |8の分子種が病的に変化した時に 、同じように生成する分子種が変化する（実施例 11)。これらの事実から、本発明のぺ プチドの産生量から Α |8の産生量を予測することが可能であり、また、本発明のぺプ チドの質的変化から A βの質的変化を予測することも可能であると考えられる。
(4) Α |8は凝集性を持っため、アルッノヽイマ一病の診断マーカーとして定量的に利 用できな ヽ。 N末端側に oc -ヘリックス構造、 C末端側に β -シート構造を持つ Α βは、 中央部の 26番目のアミノ酸から 29番目のアミノ酸力 なる配列が β -ターン構造を取 るため、 Ν-末と C-末が逆平行 β -シート構造を作る。これが引き金となって Α βの凝 集を引き起こすと理解されている（"Oligomerization and fibril assembly of the amyloid β -protein" by Roher, A. E et al, Biochem. Biophy. Act. [2000] 1502, 31-43.)。一方、本発明のペプチドは、 N末端側にひ-ヘリックス構造、 C末端側に β - シート構造を取り、基本構造は Α |8と同じであるが、 j8 -ターン構造をとる配列はない ため、 α -ヘリックスが j8 -シート構造に変換されることがないと予想できるため、凝集 性を示さないと考えられる。
本発明のペプチドをアルツハイマー病の診断マーカーとして利用し、アルッハイマ 一病の診断や診断のためのデータを収集することができる。具体的には、動物から 採取した体液又は組織における本発明のペプチドの検出又は定量を行うことにより 診断や診断データを収集できる。
また、本発明のペプチドには、種々の分子量のペプチドが存在する力 検出又は 定量される本発明のペプチド中に高分子量型のペプチドが多く含まれる場合には、 アルツハイマー病を発症、又は発症の前段階にある可能性が高い。これは、凝集性 が高く毒性の強い高分子量型 A (Α |8 42)の生成量が増加する条件では、高分子 量型の本発明のペプチドの生成量も増加する力もである（実施例 11および 12)。従 つて、本発明のペプチドが体液中等に一定量存在するかどうかだけではなぐ本発 明のペプチド全量中の高分子量型ペプチドの比率を指標としても、アルッノ、イマ一 病の診断を行うことができる。なお、ここでいう「高分子量型ペプチド」とは、 Ν-末端側 の切断がより Ν-末端に近いサイトで起きる力、若しくは C-末端側の切断がより C-末端 に近 、サイトで起きる力、又はその両者の組み合わせによって生成するペプチドであ り、例えば、後述する表 1で示す各 j8 -Ale分子種よりも N-末若しくは C-末側、又は N- 末と C-末側の両方に切断サイトがシフトした分子種を示し、分子量的に具体的数値 で示されるペプチドではない。表 1の一次切断サイトが ζ 1で二次切断サイトが γ 3の 場合、 36アミノ酸の分子量 4000程度のペプチドの生成が予想される力 Ν-末もしくは C-末の切断サイトのシフトにより、このペプチドよりも分子量が高くなる j8 -Aleは、上 述した「高分子量型ペプチド」に該当する。一方、表 1の一次切断サイトが ζ 3で二次 切断サイトが γ 1の場合、 4アミノ酸で分子量 5-600のペプチドの生成が予想されるが 、 Ν-末もしくは C-末の切断サイトもしくはその両方の切断サイトのシフトにより、このべ プチドよりも分子量が高くなる j8 -Aleは、たとえ分子量が 1000程度であっても、上述し た「高分子量型ペプチド」に該当する。
体液等の採取対象とする動物としては、ヒトを挙げることができる力 ヒト以外の温血 動物、例えば、モルモット、ラット、マウス、ニヮトリ、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、サルな どを対象としてもよい。
体液及び組織としては、血液、血漿、血清、脳髄液、脳組織などを例示でき、これら の中でも血液、脳髄液が好適である。
ペプチドの検出又は定量を行う方法は特に限定されないが、抗体を用いる方法、 例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、 ELISA、サンドイッチ ELISA、ラジオィムノア ッセィ、免疫沈降法、 MALDI-TOF/MS等を用いた質量分析法、および、これらのい ずれかの組み合わせ方法でもよ 、。これらの中でもサンドイッチ ELISAが最も好まし い。サンドイッチ ELISAは、例えば、 Tomitaらの論文（"Cleavage of Alzheimer' s amyloid precursor protein (APP) by secretases occurs after O-glycosylation of APP in the protein secretory pathway" Tomita, S., Kirino, Y., and Suzuki, T. [1998] J, Biol. Chem. 273, 6277-6284)に記載された方法に従って行うことができる。具体的に は、（1)本発明のペプチドに対する特異的な抗体を固相に結合させ、（2)そこに試料 溶液を加え、（3)固相を洗浄し、（4)本発明のペプチドに対する別の特異的な抗体 を加え、（5)前記抗体に対する抗体 (抗 IgG抗体)であって、酵素で標識されている抗 体を加え、（6)前記酵素に対する基質を加え、発色等を指標として、試料溶液中の 本発明のペプチドの検出又は定量を行うことができる。ここで、本発明のペプチドに 対する特異的な抗体は、後述する方法によって作製することができる。抗 IgG抗体は 、市販のものを使用することができる。固相としては、マイクロタイターゥエル、ラテック ス粒子などを使用でき、標識酵素としては、西洋ヮサビ由来のペルォキシダーゼ、ァ ルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼなどを使用できる。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の ヽずれも含まれ る。
モノクローナル抗体は、例えば、前述の Tomitaらの文献に記載されている方法に従 つて作製することができる。具体的には、（1)本発明のペプチドを動物に投与し、 (2) 前記動物から抗体産生細胞を採取し、 (3)前記抗体産生細胞と骨髄腫細胞を融合さ せ、ノ、イブリドーマを作製し、（4)前記ハイプリドーマの中から本発明の抗体を産生す るハイプリドーマを選択し、 (5)前記抗体産生ハイプリドーマの培養上清力 抗体を 分離精製することにより、 目的のモノクローナル抗体を得ることができる。
動物に投与する本発明のペプチドは、ペプチド全体でもよいが、その一部分であつ てもよい。投与する部分ペプチドは特に限定されないが、例えば Ale α由来のぺプチ ドの場合、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 816番目、 821番目、若しくは 839番目 に対応するアミノ酸を Ν-末端とし、配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 842番目、 843番目、若しくは 851番目に対応するアミノ酸を C-末端とするペプチドが好ましい。 Alc jS由来のペプチドの場合、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 826番目力 845 番目に相当するアミノ酸力 なるペプチドが好ましぐ Alc y由来のペプチドの場合、 配列番号 3で表されるアミノ酸配列の 805番目から 824番目に相当するアミノ酸力 な るペプチドが好ましい。また、ペプチドは、抗体産生能を高めるために完全又は不完 全フロイントアジュバントと共に投与してもよい。投与対象とする動物は特に限定され ず、例えば、サル、ゥサギ、ィヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒッジ、ャギ、 -ヮトリなど を用いることができる。ペプチドの投与間隔及び回数は特に限定されないが、通常、 2— 6週ごとに、 2— 10回程度投与する。抗体産生細胞は、例えば、最終免疫の 2— 5日後に動物力 脾臓又はリンパ節を採取し、それらから得ることができる。使用する 骨髄腫細胞は特に限定されず、例えば、 NS-1、 P3U1、 SP2/0、 AP-1等を使用するこ とができる。細胞融合は、ポリエチレングリコールやセンダイウィルスなどを用いて常 法に従って行うことができる。本発明の抗体を産生するハイブリドーマの選択は、例え ば、本発明のペプチドを吸着させたマイクロプレート等にハイプリドーマの培養上清 を添加し、次いで、酵素等で標識された抗 IgG抗体などを添加し、マイクロプレート等 に結合した抗 IgG抗体を検出することにより行うことができる。ノ、イブリドーマの培養上 清力も本発明の抗体の分離は、免疫グロブリンの分離精製に常用される方法、例え ば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体による 吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法などにより行うことができる。
ポリクローナル抗体も、例えば、 Arakiらの論文（Araki, Y., et al.， [2003] J. Biol. Chem. 278, 49448-49458; Araki, Y" et al [2004] J. Biol. Chem. 279, 24343-24354. )などに記載されている方法に従って作製することができる。具体的には、（1)本発明 のペプチドを動物に投与し、（2)前記動物力 血液、腹水等を採取し、（3)前記血液 等から抗体を分離精製することにより、 目的のポリクローナル抗体を得ることができる 。ペプチドの投与及び抗体の分離精製は、上記モノクローナル抗体と同様に行うこと ができる。
本発明の診断薬は、通常、上述した本発明の抗体を適当な緩衝液等に添加するこ とにより調製される。抗体の濃度、緩衝液等の種類は特に限定されず、本発明のぺ プチドを検出又は定量する方法に応じて適宜決めればよい。また、診断薬中には、 本発明の抗体以外の成分を含んでもよぐそのような成分としては、酵素標識二次抗 体、発色剤などを例示できる。
本発明のペプチド及びその前駆体であるアル力ディンは、様々な点で A β及び ΑΡΡ と類似している。従って、本発明のペプチドの産生を抑制する物質は、 Α |8の産生も 抑制する可能性が高い。また、本発明のペプチドの分子種を高分子量型から低分子 量型 (高分子量型以外の本発明のペプチド)へ変化される物質は、 A βの分子種も 毒性の強い高分子量型力 他のタイプへ変化させる可能性が高い。よって、本発明 のペプチドを分泌する細胞に被験物質を接触させ、前記ペプチドの分泌量の変化、 又は分泌される前記ペプチドの分子種の変化を調べることによりアルッノ、イマ一病の 治療薬のスクリーニングを行うことができると考えられる。
本発明のペプチドを分泌する細胞は、元力 本発明のペプチドを分泌する細胞を 用いてもよぐまた、遺伝子導入によって本発明のペプチドを分泌するようになった細 胞を用いてもよい。前者の細胞としては、例えば、繊維芽細胞 (Araki, Y., et al [2004 ] J. Biol. Chem. 279, 24343-24354.)、 HEK293 (実施例ではこの細胞にアル力ディン 遺伝子を導入している力 導入しなくても、内在性のアル力ディンが発現している。 ) などを使用することができる。後者の細胞は、例えば、細胞にアル力ディン遺伝子の 全長又は一回目の切断産物 (もしくはこれを摸したコンストラクト）をコードする DNAを 導入することによって作製することができる。また、本発明のペプチドの分子種の変 化を調べる場合には、高分子型の本発明のペプチドを分泌する細胞を用いることが 好ましい。このような細胞は、後述する実施例 11及び 12に示すように、変異型プレセ 二リン（I143F、 278T、 434C、 L35Fなど）の遺伝子を安定的に発現するように細胞に導 入することや、アル力ディン遺伝子に変異を加えることによって作製することができる 被験物質との接触方法は、被験物質が細胞に対して作用する方法であれば特に 限定されず、例えば、細胞に直接接種する方法、細胞を培養している培地に添加す る方法などを例示できる。
ペプチドの分泌量の変化及び分泌されるペプチドの分子種の変化は、前述した本 発明のペプチドの検出及び定量方法に従って、調べることができる。ペプチドの分泌 量の変化を調べた結果、分泌量が減少していた場合、被験物質はアルツハイマー病 の治療薬の候補となり得る。また、ペプチドの分子種の変化を調べた結果、分子種が 高分子量型から低分子量型へ変化して!/ヽた場合も、被験物質はアルツハイマー病 の治療薬の候補となり得る。
なお、ここでいう「治療薬」には、発症したアルツハイマー病を治療する薬剤のみな らず、発症を抑制する、あるいは発症時期を遅らせるといった予防的な効果を持つ薬 剤も含まれる。
実施例
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
〔実施例 1〕
8週令の C57BL6マウス 5匹の脳を、氷冷した 30mlの緩衝液 A(10mMへぺス pH7.4, 0.32Mスクロース， 5 μ g/mlキモスタチン， 5 μ g/mlロイぺプチン， 5 μ g/mlぺプスタ チン)中でルーズフィット'テフロン'ホモジナイザー (クリアランス： 0.12 μ m)で 10スト口 ークすることによりホモジナイズした。このホモジネートを遠心処理（lOOOxg, lOmin)す ることにより未破壊細胞及び核を除き、除核細胞破砕液を得た。この除核細胞破砕 液をさらに遠心処理（lOOOOOxg, 60min)して、ペレットとして膜画分を得た。膜画分を 2mlの緩衝液 Aに加え、再懸濁した。 Beckman SW41用チューブの中に、緩衝液 A中 に 0-28%のィォジキサノール密度勾配をかけた溶液 (10ml)を入れ、その上に再懸濁 した 2mlの膜画分を境界面を乱さないように静か〖こ重層した。これを 41000rpm, 115min, 4°Cで遠心処理した。遠心処理後、チューブの底から 900mlづっ 13フラクショ ン採取した。各フラクション 7.5 μ 1に、 5 μ 1の 5倍濃度 SDS試料緩衝液 (43%グリセロー ル (Wako), 16%SDS(Wako), 64ng/mlブロモフエノールブルー (Wako), 5mM EDTA, 0.22M Tris-HCl pH6.8)及び 2.5 1の 8M尿素溶液をカ卩え、 5分間煮沸した後、 8%ゲ ルを用い、 Lammliの方法に従い、 SDS-PAGEを行った。ゲル上のタンパク質を-トロ セルロースメンブレンに転写し、ウェスタンブロットを行った。検出は ECL
kit(Pharmacia)を用いて行った。抗体は、抗 APP細胞質領域抗体 (全長 APPと C末端 断片を両方検出できる）、抗 X11L抗体、抗 Aleひ抗体、抗プロテインジスルフイドイソメ ラーゼ（PDI)抗体、抗ゴルジ体 130kDaマトリックスタンパク質（GM- 130)抗体、抗シナ プトタグミン（SYT)抗体、抗マウスキネシン重鎖（KHC)抗体、及び抗プレセニリン 1 ( PS1) C末端断片抗体を用いた。このうち、抗 X11L抗体（mint2, BD Biosciences)、抗 PDI抗体（1D3, Stressgen Biotechnologies)、抗 GM 130抗体（#35, BD Biosciences) , 抗 SYT抗体（#41, BD Biosciences)、抗 KHC抗体（H2, CHEMICON International) , 及び抗 PS1C末端断片抗体（PS1- CTF, CHEMICON International)は市販のものを 使用した。抗 APP細胞質領域抗体は G369、抗 Aleひ抗体は UT83を使用した。 G369 は、 Oishi, M. et al.， (1997) Mol. med.3, 11-113に記載された方法に従って作製され たものである。 UT83は、ヒト Ale α 1の C末端ペプチド（954から 971のアミノ酸）に Cysを 加えたペプチドを抗原としたゥサギ由来のポリクローナル抗体である (Araki Y., et al.
[2003] J. Biol. Chem. 278, 49448-49458.)。ウェスタンブロットの結果を図 1に示す。 ウェスタンブロットの結果、フラクション 8に APP、 X11L、 Aleが多く含まれていたので 、このフラクション力 500 1採取し、これを等量の 2倍濃度 CHAPS緩衝液 (20mM CHAPS, 20mMリン酸ナトリウム pH7.4, 280mM塩化ナトリウム)に加えて、膜成分を 可溶ィ匕した後、 G369(抗 APP細胞質領域抗体)で共役免疫沈降を行った。具体的に は、可溶化した膜成分に、 G369 を加え、 4°Cで 1時間反応させた後、 2倍濃度 CHAPS緩衝液で平衡化した 30 μ 1の 50%プロテイン G-セファロースをカ卩ぇ 4°Cで 1時 間反応させた。この反応後のビーズを 800 1の 2倍濃度 CHAPS緩衝液で洗い、 45 1の試料緩衝液混合物 (30 μ 1の 5倍濃度 SDS試料緩衝液と 15 μ 1の 8Μ尿素溶液の混 合物)を加え、 5分間煮沸してビーズに付いている成分を可溶ィ匕した。この可溶ィ匕成 分を 8%ゲルで SDS-PAGEを行った後、上記と同様にウェスタンブロットを行った。抗 体は、上記で用いた抗 ΑΡΡ細胞質領域抗体、抗 X11L抗体、抗 Aleひ抗体、抗 SYT抗 体のほか、 IgG重鎖 (IgG(H))に対する抗体も用いた。また、対照として、 G369の代わ りに等量の非免疫ゥサギ血清を用いて共役免疫沈降を行 、、それによつて得られた 成分についてもウェスタンプロットを行った。更に、共役免疫沈降を行う前の可溶ィ匕 膜成分についても同様にウェスタンプロットを行った。この結果を図 2に示す。
図 2に示すように、 G369による共役免疫沈降によって得られた成分の中には、 APP だけでなぐ XI 1Lや Ale αも含まれていた。このことから、 ΑΡΡは、 X11Lと Ale αと結合 し、三者による複合体を形成すると考えられる。
〔実施例 2〕
5人のアルッノヽイマ一病患者力 採取した前頭葉の組織を Kryofix (エタノール、ポリ エチレングリコール及び水の混合物、 Merck)で 1一 7日固定後、パラフィンに包埋し た。包埋した組織を薄切し、厚さ 4 mの連続切片を作製した。切片を脱パラフィンィ匕 した後、 ABC elite kit(Vector Laboratory)で免疫染色した。
免疫染色は、切片を抗 Ale a抗体 (UT83)溶液 (0.8 μ g/ml)又は抗 APP細胞外領域 抗体 (22C11 , Roche Diagnostics)溶液（0.5 g/ml)でインキュベートし、二次抗体反 応後、ペルォキシターゼ活性をジァミノべンジジン一過酸ィ匕水素溶液で可視化するこ とにより行った。対照として、免疫していないゥサギ IgG溶液 (0.8 g/ml)で切片をイン キュペートし、同様に免疫染色を行った。また、抗 Ale α抗体と、この抗体に対する抗 原ペプチド (40ηΜ)が共存する溶液中で切片をインキュベートし、同様に免疫染色を 行った。
抗 Ale a抗体、抗 APP細胞外領域抗体、及び免疫していないゥサギ IgGを使用した 場合の結果をそれぞれ図 3—1、図 3— 2、図 3— 3に示す。
これらの図に示すように、 Alc aと APPは、アルツハイマー患者の脳内において同じ ような部位に検出される。なお、抗 Ale a抗体に対する抗原ペプチドを共存させた場 合の結果は図に示していないが、図 3— 3と同様に何も検出されな力つた。
〔実施例 3〕
実施例 2で作製した切片を脱パラフィン化した後、抗 Ale a抗体 (0.8 μ g/ml)と抗 APP細胞外領域抗体 (0.5 μ g/ml)とを含む溶液、又は抗 Ale a抗体 (0.8 μ g/ml)と抗 Α β抗体 (1/1000に希釈して使用)とを含む溶液でインキュベートした。抗 Α β抗体は、 4G8 (Signet Lab)を使用した。
次に、それぞれの抗体の組み合わせでインキュベートした切片を、ャギ由来 FITC 標識抗ゥサギ IgG抗体 (Jacson immunoreaserch lab, 1/30に希釈して使用）とャギ由 来 Cy3標識抗マウス IgG抗体 (Jacson immunoreaserch lab、 1/50に希釈して使用）とを 含む溶液でインキュベートした。なお、リポフスチン顆粒の自家蛍光は、免疫反応前 にスダンブラック B染色により消失処理を行つた。
一次抗体として抗 Ale a抗体と抗 APP細胞外領域抗体を使用した場合の結果を図 3 4 (FITCのみを検出）、図 3— 5 (Cy3のみを検出）、及び図 3— 6 (FITCと Cy3の両者を 検出）に示す。また、一次抗体として抗 Ale a抗体と抗 Α β抗体を使用した場合の結 果を図 4—1 (FITCのみを検出）、図 4—2 (Cy3のみを検出）、及び図 4 3 (FITCと Cy3 の両者を検出）に示す。
図 3— 4、図 3—5、及び図 3—6に示すように、 Alc aと APPは、アルツハイマー患者の 脳内において同じような部位に検出される。この結果は、実施例 2の結果とも合致す る。また、図 4 1、図 4 2及び図 4 3に示すように、 APPは、 Α |8が蓄積して老人斑が 形成されている部位の周辺に検出される。
以上の結果から、アルツハイマー病の発症過程で、 ΑΡΡと Ale αが挙動を同じくして いることが示唆される。
〔実施例 4〕 Ale a、 Ale j8、 Ale γ、又は APP695 (695個のアミノ酸からなるヒト APPのァイソフォー ム）をコードする DNAを哺乳類細胞用発現ベクター pcDNA3.1 (Invitrogen)に挿入した
10%牛胎児血清を含む DMEM (シグマ社 D5796)の入った 6穴培養皿（底面積 10cm2 )に HEK293細胞を播き、この細胞に上記で作製した発現ベクターを、遺伝子導入試 薬（LipofectAMINE2000, Invitrogen)を用いて導入した。対照として何も挿入していな い pcDNA3.1も同様に HEK293細胞に導入した。
培地 lmlに、プレセ-リン阻害剤 L- 685,458(Calbiochem)の DMSO溶液（ImM)を 1 μ 1 添加し、 24時間培養した後、培地を採取した。対照として、 L-685,458溶液の代わり〖こ 等量の DMSOを添カ卩し、同様に培養を行い、培地を採取した。採取した培地を、 lml の HBST緩衝液 (10mMへぺス pH7.4, 150mM塩ィ匕ナトリウム， 0.5% TritonX- 100, 5 μ g/mlキモスタチン， 5 μ g/mlロイぺプチン， 5 μ g/mlぺプスタチン)中で細胞中のタ ンパク質を抽出した。可溶化した細胞を遠心処理（12000xg, lOmin)し、上清を集め、 可溶ィ匕成分を回収した。可溶化成分 7.5 μ 1に対し、 7.5 μ 1の試料緩衝液混合物 (5 μ 1 の 5倍濃度 SDS試料緩衝液と 2.5 /z lの 8Μ尿素溶液の混合物)をカ卩え、 5分間煮沸した 。このサンプルを、 8/15%の 2段ゲルで SDS-PAGEを行った後、タンパク質を-トロセ ルロースメンブレンに転写し、ウェスタンブロットを行った。 SDS-PAGEは Lammliの常 法に従った。一次抗体は、抗 APP細胞質領域抗体 (G369, 1/2000に希釈して使用）、 抗 Ale a抗体 (UT83, 0.3 μ g/ml),抗 Ale β抗体 (UT99, 0.5 μ g/ml),及び抗 Ale y抗体 (UT105, 1/500に希釈して使用）を用い、検出は ECL kit(Pharmacia)を用いて行った 。なお、 UT99及び UT105はそれぞれ Ale β及び Ale yの C末端を認識する抗体である 。この結果を図 6及び図 7A— Cに示す。
APPの一回目の切断によって生じる C末端側断片は、プレセ-リンによって二回目 の切断を受け、その切断断片は細胞外に分泌される（図 5)。このとき、プレセ-リン阻 害剤を添加すると、二回目の切断は起きず、 APPの C末端側断片は細胞内に蓄積す る。図 6において、プレセ-リン阻害剤（L- 685,458)をカ卩えた場合にのみ C末端側断 片（CTF a )が細胞ライセート中により多く検出されるのはこの事実を反映して 、る。
Ale α及び Ale γも、 APPと同様に、プレセリニン阻害剤を加えた場合にのみ細胞ラ イセート中に C末端側断片（CTF1)が検出されている（図 7A及び C)。このことから、 Ale a及び Ale yの C末端側断片も APPのそれと同様にプレセ-リンによって切断され ると考えられる。なお、 Ale |8については、プレセリニン阻害剤をカ卩えない場合にも C 末端側断片が検出されているおり（図 7B)、この実験からは、 C末端側断片がプレセ 二リンによって切断されるかどうかはわ力 な 、。
〔実施例 5〕
Ale α、 Ale j8、及び Ale γの N末端シグナル配列の後に FLAGタグ配列が挿入され たタンパク質（FLAG- Ale a、 FLAG- Ale β、及び FLAG- Ale y )をコードする DNAを作 製し、それらを哺乳類細胞用発現ベクター pcDNA3.1(Invitrogen)に挿入した。
10%牛胎児血清を含む DMEM (シグマ社 D5796)の入った 6穴培養皿（底面積 10cm2 )に HEK293細胞を播き、この細胞に上記で作製した発現ベクターを、遺伝子導入試 薬（LipofectAMINE2000, Invitrogen)を用いて導入した。対照として何も挿入していな い pcDNA3.1も同様に HEK293細胞に導入した。
培地 lmlに、プレセ-リン阻害剤 L- 685,458(Calbiochem)の DMSO溶液（ImM)を 1 μ 1 添加し、 24時間培養した後、培地を採取した。対照として、 L-685,458溶液の代わり〖こ 等量の DMSOを添加し、同様に培養を行い、培地を採取した。
培地 lmlに対して、 150 の緩衝液 B (7.7% SDS, 16.7mM Tris- HC1 pH7.4, 0.3mg/mlキモスタチン， 0.3mg/mlロイぺプチン， 0.3mg/mlぺプスタチン）を加え、 5 分間煮沸し、タンパク成分を変性させた。その後、 3.75mlの緩衝液 C(6.7% NP-40, 0.4M NaCl, 26mM EDTA, 200mM Tris- HC1 pH7.4)、 1 ,75mlの酵素阻害溶液
(10ng/mlロイぺプチン， 10ng/mlぺプスタチン A,, 10ng/mlキモスタチンを含む蒸留 水）を順次カ卩えた後、抗 FLAG抗体 (SIGMA社) 2 μ 1を加え、低温室内（4°C)で 8時間 チューブを転倒混和し、抗原抗体反応を進行させた。その後、 50 1の 25%プロティ ン G-セファロース/ 25%セファロース- 4B(Pharmacia Biotech)を含むリンス緩衝液 ( 0.1 %TrotonX-100, ImM EDTA, 150mM NaCl, lOmM Tris- HC1 pH7.4)をカ卩え、 4。C 、 3時間回転させた。榭脂成分を遠心処理 (3000rpm, 5min, 4°C)により沈澱させ、回 収した。回収した榭脂は非特異的結合を除く目的で、洗浄緩衝液 1(0.1 %
TritonX- 100, 1M塩化ナトリウム， 20mM Tris- HC1 pH7.4)、洗浄緩衝液 Π(0.05% SDS, l%TritonX-100, 5mM EDTA, 150mM塩ィ匕ナトリウム， 50mM Tris— HCl pH7.4) 、リンス緩衝液で、順次洗浄した。その後榭脂に 30 1の試料緩衝液混合物 (20 1の 5 倍濃度 SDS試料緩衝液と 10 1の 8M尿素溶液の混合物)を加え、攪拌後、 5分間煮 沸して、榭脂についている成分を可溶ィ匕した。遠心後、この上清成分を 6%ゲルを用 い、 SDS-PAGEを行った後、ニトロセルロースメンブレンにタンパク質を転写し、ウェス タンプロットを行った。 SDS-PAGEは Lammliの常法に従った。一次抗体は、抗 FLAG 抗体 (M2, SIGMA)を用い、検出は ECL kitを用いて行った。この結果を図 7D— Fに示 す。
これらの図に示すように、 Ale α、 Ale j8、 Ale yの!、ずれにつ 、ても、培地中に抗 FLAG抗体によって認識される断片が検出された。 FLAGタグ配列は成熟 Ale α、 Ale β、 Ale γの Ν末端に結合しているので、このことから、 Ale α、 Ale j8、 Ale γの一回目 の切断によって生じる Ν末端側の断片は細胞外に分泌されていると考えられる。 〔実施例 6〕
Ale α、 Ale j8、 Ale yをコードする DNAを哺乳類細胞用発現ベクター
pcDNA3.1 (Invitrogen)に挿入した。
10%牛胎児血清を含む DMEMの入った 10cm培養皿（底面積 60cm2)に HEK293細胞 を播き、この細胞に上記で作製した発現ベクターを、遺伝子導入試薬（
LipofectAMINE2000, Invitrogen)を用いて導入した。対照として何も挿入していない pcDNA3.1も同様に HEK293細胞に導入した。
24時間培養した後、培地を捨て氷冷 PBSにて細胞を洗った。 10ml PBSを再度カロえ、 ピペッティングで細胞を剥がし、 15mlファルコンチューブへ入れた。遠心処理（ 1500rpm, lOmin,ベックマン社製低速冷却遠心機を使用）により細胞を集め、細胞の ペレットに対し、 1mlの緩衝液 D(0.25Mスクロース， 10mMトリエタノールァミン-酢酸 PH7.8, 5 μ g/mlキモスタチン， 5 μ g/mlロイぺプチン， 5 μ g/mlぺプスタチン)をカロえ 、 27Gの針を 12回通すことにより細胞を破砕した。破砕した細胞はトミー社 TMA6 rotarで 3000rpm(1000x g) lOmin 4°C遠心し、未破壊細胞と核を除き、除核細胞破砕 液を得た。この除核細胞破砕液を Beckmann社 TLA45 rotarで 45000rpm(100000xg) 60min 4°Cにて遠心し、上清 (細胞質画分)と沈澱 (膜画分)を得た。この膜画分を 100 μ 1の緩衝液 Dに再懸濁した。
再懸濁した膜画分力も 20 1をサンプルとして採取し、 37°Cで 1又は 3時間インキュ ペートした。また、最終濃度 1 になるように、プレセ-リン阻害剤（L-685,458)を添カロ したサンプルも用意した。各サンプルに 20 1の試料緩衝液混合物 (13.4 1の 5倍濃 度 SDS試料緩衝液と 6.6 1の 8M尿素溶液の混合物)を加えて反応を停止させ、 5分 間煮沸したのち 8/ 15 %の 2段ゲルで SDS-PAGEを行つた後、ニトロセルロースメンブ レンにタンパク質を転写し、ウェスタンブロットを行った。 SDS-PAGEは Lammliの常法 に従った。一次抗体は、抗 Ale a抗体 (UT83)、抗 Ale β抗体 (UT99)、抗 Ale y抗体 (UT105)を用い、検出は ECL kit(Pharmacia)を用いて行った。この結果を図 8A— こ 示す。
これらの図に示すように、 Ale α、 Ale j8、 Ale yの!、ずれにつ 、ても、膜画分をイン キュペートすることにより、各 Aleの C末端領域を含む断片 (Ale a -ICD等）が検出され た。このような断片はプレセ-リン阻害剤を加えた場合には検出されな力つた。以上 のことから、プレセ-リンによって Ale α等の C末端領域を含む断片が切り出されると 考えられる。
〔実施例 7〕
Ale aの二回目の切断産物 (A β様断片）を効率よく検出するため、 Ale α Δ Εをコー ドする DNAを作製した。図 9に示すように、 Ale α Δ Εは、シグナルペプチドと一回目の 切断部位（図中の δ )との間の断片が取り除かれており、また、シグナルペプチドの C 末端側には、 FLAGタグ配列が挿入されて 、る。
Ale α Δ Εをコードする DNAを哺乳類細胞用発現ベクター pcDNA3.1(Invitrogen)に 挿入した。 10%牛胎児血清を含む DMEMの入った 10cm培養皿（底面積 60 cm2)に HEK293細胞を播き、この細胞に上記で作製した発現ベクターを、遺伝子導入試薬（ LipofectAMINE2000, Invitrogen)を用いて導入した。対照として何も挿入していない pcDNA3.1も同様に HEK293細胞に導入した。培地 lmlに、 10 M LLnL(Calbiochem) 、 1 M DAPT(Calbiochem)、又は 1 μ M L- 685,458(Calbiochem)の DMSO溶液をそれ ぞれ最終濃度が 1 μ Μになるように添加し (これらはいずれもプレセ-リン阻害剤であ る。）、 24時間培養した後、培地を採取した。対照として、 L-685,458溶液等の代わり に等量の DMSOを添加し、同様に培養を行い、培地を採取した。
回収した培地に対し、抗 FLAG抗体 (M2, SIGMA)よる免疫沈降及びウェスタンブロ ットを行い、プレセ-リンで切断される N末端側の産物を検出した。具体的には回収し た培地に 4 μ 1の抗 FLAG抗体をカ卩ぇ 4°Cで 1時間反応させた。その後、 30 μ 1の 50%プ 口ティン G-セファロースを含むリンス緩衝液 (0.1 %TrotonX- 100, ImM EDTA, 150mM NaCl, lOmM Tris- HC1 pH7.4)をカ卩え、さらに 4°Cで 1時間反応させた後、ビー ズを回収した。このビーズを、各 800 1の洗浄緩衝液 1 (組成は実施例 5に記載）、洗 浄緩衝液 Π (組成は実施例 5に記載）、リンス緩衝液 (組成は前述)で順次洗った後、 30 μ 1の 2倍濃度トリシン試料緩衝液 (900mM Tris- HC1 pH8.45, 24%グリセロール， 8 %SDS, 0.005%クマシ一'ブリリアント 'ブルー)をカ卩え、 5分間煮沸し、ビーズに付い ている成分を可溶ィ匕した。この可溶ィ匕成分を 15%トリスートリシンゲル (Schagger & von Jagowの定法による）で分離した後、抗 FLAG抗体（1/2000に希釈)及び抗 Ale α抗 体 (UT83)を用いてウェスタンブロットを行 、、プレセ-リンによる切断産物 (Α β様断 片）及び Ale α Δ Εを ECL kit(Pharmacia)で検出した。
一方、細胞に対しても免疫沈降及びウェスタンプロットを行った。具体的には、細胞 を 4mlの HBST緩衝液 (組成は実施例 4に記載）中で細胞中のタンパク質を抽出した。 可溶ィ匕した細胞を遠心処理（12000xg, lOmin)し、上清を集め可溶ィ匕成分を回収した 。可溶化成分 lmlに対し、抗 FLAG抗体 2 1をカ卩ぇ 1時間反応させた後、 1の 50% プロテイン G-セファロースを含む HBST緩衝液を加え 4°C 1時間反応させた後、ビーズ を回収した。このビーズを 800 μ 1の HBST緩衝液で 3回洗った後、 45 μ 1の試料緩衝液 混合物 (30 μ 1の 5倍濃度 SDS試料緩衝液と 15 μ 1の 8Μ尿素溶液の混合物)を加え、 5 分間煮沸してビーズに付 、て 、る成分を可溶ィ匕した。この可溶ィ匕成分を 15%トリスー グリシンゲル (Lamiliの定法にしたがった)で分離した後、抗 FLAG抗体（1/2000に希釈 )及び抗 Ale a抗体（UT83)を用いてウェスタンブロットを行った。以上の結果を図 10 に示す。
図 10に示すように、遺伝子導入した Ale Δ Εは細胞のライセート中に検出されたが、 プレニセリンにより切断産物（ /3 Ale a )は培地中にぉ 、てのみ検出され、細胞のラ イセート中には検出されな力つた。このことから、プレセ-リンによる切断断片は、 A |8 同様、大部分が培地中に放出される性質を持つと考えられる。
〔実施例 8〕
Ale a又は APP695をコードする DNAを哺乳類細胞用発現ベクター
pcDNA3.1 (Invitrogen)に挿入し、また、ヒト BACE1をコードする DNA (Doms博士より供 与）を哺乳類発現ベクター pcDNA3.1Zeo(+)(Invitrogen)に挿入した。
10%牛胎児血清を含む DMEM (シグマ社 D5796)の入った 6穴培養皿（底面積 10cm 2)に HEK293細胞を播き、この細胞に上記で作製した発現ベクターを、遺伝子導入試 薬（LipofectAMINE2000, Invitrogen)を用いて導入した。導入した DNAの組み合わせ は図 11の記載の通りである。
各細胞を 24時間培養後、細胞を HBST緩衝液 (組成は実施例 4に記載）中でタンパ ク質を可溶化し、 8/15%ゲルで SDS-PAGEを行った。ゲル上のタンパク質を-トロセ ルロースメンブレンに転写し、抗 APP抗体 (APP/c, SIGMA)及び抗 Alc a抗体（UT83 抗体)を用いてウェスタンプロットを行った。抗 APP抗体を用いた場合及び抗 Ale a抗 体を用いた場合のウェスタンブロットの結果をそれぞれ図 11A及び Bに示す。
図 11Aに示すように、 BACE1を発現させて!/ヽな 、細胞（左から 3番目のレーン）では 、主に α サイトの切断産物である CTF o;が検出された力 BACE1を発現させた細胞 (左から 4番目のレーン)では β サイトの切断産物である CTF βも検出された。なお 、 ΑΡΡ695に対応するバンドは矢印で示した二本のバンドだけであり、これらの近傍に 検出される二本のバンドは内在性の APP (ΑΡΡ770及び ΑΡΡ751 )に対応するものであ る。
図 11Bに示すように、 Ale αを発現させ、 BACE1を発現させていない細胞（左から 5 番目のレーン)では、主に 30kDaの位置に断片（CTF1)が検出された。この断片の分 子量は、実施例 7で発現させた Ale α Δ Εの分子量とほぼ一致するので、切断サイト は 815番目の Metと 816番目の Alaの間付近であり、アミノ酸数は約 156であると推測さ れる。一方、 Ale aと BACE1の両者を発現させた細胞（左から 6番目のレーン）では、 CTF1の他に、この断片よりも分子量の大きい断片が検出された (CTF |8、分子量から 判断して約 280アミノ酸からなるものと推測される。 ) oこの断片は、 Alc a力 ¾ACE1に よって切断されたことによって生じたものであると考えられる。即ち、 Alc o;は、 APPと 同様に BACE1によって切断されると考えられる。なお、図 11中で Ale αは二本のバン ドとして検出されている力 これは糖鎖修飾によるものである。
〔実施例 9〕
y -セクリターゼによる Ale aの切断部位を以下の手順で同定した。まず、 Aleひ Δ E タンパク質を発現するような cDNAコンストラタト（図 9)を作製した。図 12に示すように 、この cDNAコンストラクトが導入された細胞は、 FLAGタグ配列を持つ j8 -Ale aを生 成'分泌する。細胞カゝら分泌された j8 -Ale αを、 FLAGタグ抗体を用いた免疫沈降法 により回収し、免疫沈降物を MALDI-TOF/MSで解析し、分子量を決定した。この分 子量から、 γ -セクリターゼによる切断部位を同定した。以下、その詳細を説明する。 (1) FLAG配列を持つ β -Ale aのウェスタンブロット法による解析
10 cmディッシュ（コ一-ング社製）に HEK293細胞を播き、コンフルェントに達した 後 Alc a Δ Εの発現ベクター（pcDNA3- FLAG- hAlc α Δ Ε)を遺伝子導入試薬 (LipofectAMINE2000, インビトロジェン社製)を用いて導入し、 COインキュベーター
2
で 24時間細胞を培養した。この際、培地 lmlに γ -セクリターゼ阻害剤 L-685,458(力 ルバイオケム社製)の DMSO溶液 (ImM)を 2 1添カ卩した。対照実験として、 DMSOだけ をカロえた細胞も用いた。培養液 6mlを回収し、遠心処理（15000rpm, 5min,トミー社製 微量高速冷却遠心分離機を使用）した上清に 1/1000倍容量の酵素阻害溶液 (5 mg/mlロイぺプチン、 5 mg/mlぺプスタチン A、 5 mg/mlキモスタチンを含む DMSO溶 液）をカ卩えて免疫沈降用サンプルとした。このサンプルに抗 FLAG抗体溶液 (M2,シグ マ社製)を 6 1加えて 1時間、 4°Cで転倒混和した。その後、 25%プロテイン G-セファロ ースを含むリンス緩衝液 (10mM Tris-HCl pH7.4, ImM EDTA, 0.1% TritonX- 100, 150mM塩化ナトリウム )50 1加え、 4°Cで 1時間転倒混和して抗原抗体反応を進行さ せた。反応後のビーズを遠心処理 (3000rpm, 5min, 4°C、トミー精工社製微量高速冷 却遠心分離機）により沈殿させ回収し、洗浄緩衝液 1 (1M塩ィ匕ナトリウム， 20mM Tris-HCl pH7.4, 0.1% TritonX- 100)、洗浄緩衝液 2 (150mM塩化ナトリウム， 5mM EDTA, 50mM Tris-HCl pH7.4, 1% TritonX- 100, 0.05% SDS)、リンス緩衝液で順次洗 浄した。その後ビーズに 20 1の試料緩衝液混合物（2倍濃度 SDS試料緩衝液 10 1 と 8M尿素溶液 10 1の混合物)を加え、攪拌後、 5分間煮沸してビーズに吸着してい た成分を溶出した。これを遠心処理し、その上清成分を 20%アクリルアミドゲルトリス- トリシン電気泳動法を用いて分離した後、抗 FLAG抗体 (M2,シグマ社製)を用いゥェ スタンプロットを行った。反応した FLAGタグの付いた j8 -Aleは ECLキット（フアルマシ ァ社製)を用いて検出した。
培地を取り除いた後の細胞は、 1.5mlの氷冷 PBSをカ卩え、ピペッティングで細胞を剥 がし、エツペンドルフチューブに入れた。遠心処理 (6000rpm, 5min,トミー精エネ土製微 量高速冷却遠心分離機を使用)により細胞を集め、細胞のペレットに対し、 HBST緩 衝液 (組成は、実施例 4に記載) 0.9mlをカ卩え、 4°Cで 1時間転倒混和することにより細 胞中のタンパク質を抽出した。可溶ィ匕した細胞を遠心処理（15000rpm, 15 min, 4°C, トミー精工社製微量高速遠心分離機を使用）し、上清を可溶性成分として回収した。 可溶化成分 5 μ 1〖こ 10 μ 1の 2倍濃度 SDS試料緩衝液と 1% SDS 5 μ 1を加え、 5分間煮沸 した。この可溶ィ匕成分を 20%アクリルアミドゲルのトリス-トリシン電気泳動システムで分 離した後、ニトロセルロース膜 (S&S社製)に転写し、抗 FLAG抗体 (Μ2、シグマ社)と 反応後、反応物を ECLキット (フアルマシア社製)を用いてフィルム上で検出した。 以上のウェスタンブロットの結果を図 13に示す。培地の免疫沈降物をサンプルとし た場合、 5kDa付近に、主に 2本のバンドとして FLAG配列を持つ j8 -Ale aが検出され た（下段、右レーン)。しかし、細胞培養液に γ—セクリターゼの阻害剤である
L-685.458をカ卩えた場合は、免疫沈降物中に /3 -Ale aは検出されな力つた（下段、 左レーン）。この実験から抗 -FLAG抗体により FLAG配列を持つ β -Ale aが回収され ることが明らかになり、これは γ -セクリターゼによる切断産物であることが確認できた
(2) FLAG配列を持つ 13 -Ale aの MALDI- TOF/MSを用いた質量分析
HEK293細胞に Alc a Δ Εの発現ベクター（pcDNA3- FLAF- hAlc α Δ Ε)を、遺伝子 導入試薬 (LipofectAMINE2000,インビトロジェン社製)を用いて導入し、 FLAG配列を 持つ Ale α Δ Εを安定的に発現する細胞株を榭立した。 225cm2のフラスコに榭立細胞 株細胞を播き、コンフルェントに達した後培養液を 40mlの 10%ゥシ胎児血清を含む DMEM培地 (シグマ社 D5796)と交換し、 COインキュベーターで 24時間培養した。この
2
際、培地 lmlに、 γ -セクリターゼ阻害剤 L-685,458(カルバイオケム社製)の DMSO溶 液 (1 mM)を: L 1添カ卩した。対照として、 DMSOだけをカ卩えた細胞も用いた。培地を回 収し、遠心処理（10,000xg, 5min,ベックマン社製高速冷却遠心分離機を使用）した 上清に 1/1000倍容量の酵素阻害溶液（5 mg/mlロイぺプチン、 5 mg/mlぺプスタチン A、 5 mg/mlキモスタチンを含む DMSO溶液）と 1/1000倍容量の 10%アジ化ナトリウム水 溶液をカ卩えて免疫沈降用サンプルとした。このサンプル 20mlに対し、 50% (v/v) FLAG 抗体 (M2)を結合したァガロースビーズ（シグマ社 A2220)を 20 μ 1加え、低温室内（4 °C)で一晩 (約 12時間)転倒混和し、抗原抗体反応を進行させた。反応後のビーズを 遠心処理 (3000rpm, 5min, 4°C、ベックマン社製低速冷却遠心分離器）により沈殿さ せ、回収した。
回収したビーズは、非特異的結合を除く目的で、 800 1の洗浄緩衝液 1(0.1% N-octylglucoside, 140mM塩ィ匕ナトリウム， 10mM Tris— HCl pH8.0, 0.025%アジ化ナト リウム)で 2回、洗浄緩衝液 2 (10mM Tris- HCl pH8.0, 0.025%アジ化ナトリウム)で 2回 順次洗浄した。その後ビーズに 10 1のマトリックス溶液 (シナピン酸 (アプライド 'バイ ォシステム社製)を飽和させた、トリフルォロ酢酸 (和光純薬社製) Zァセトニトリル (シグ マ社製) Z水（1 :20:20))を加え、攪拌後、ビーズに結合している成分を溶出した。ビ ーズを完全に取り除くために溶出成分をスピンカラム (アマシャム'バイオサイエンス社 製)に乗せ、遠心により溶出成分だけを分離した。溶出成分うち 2 1をサンプルプレ ート (アプライドバイォシステムズ社製)に乗せ、乾燥させた後 MALDHTOF/MS (パー スぺクティブ ·バイオシステムズ社製)解析を行った。
Ale α Δ Εを発現して ヽな 、細胞の細胞培養液力も得たシグナルをバックグランドと して、 FLAG配列を持つ 13 -Ale aとして分子量 3619.96、 5359.85、 5507.02、 6233.83 のペプチドを同定した（図 14)。
これらの分子量に一致する切断サイトを図 15中に矢印で示した。アミノ酸配列から 想定できる膜貫通領域を実線で、膜貫通領域である可能性の高!ヽ領域を破線で示 す。分子量 5359.85、 5507.02、 6233.83から決定された切断サイトは膜貫通領域およ びその可能性の高い領域に位置することから、 γーセクリターゼによる切断領域と判 断できる。一方、分子量 3619.96から決定された切断サイトは、明らかに Ale αの細胞 外ドメインに位置するため、 γ—サイトで切断して生じた β -Ale aの分解産物である 可能性が高い。従って、 Ale aの γ -セクリターゼによる二回目の切断サイトは、少なく とも 3力所ある。これは、 ΑΡΡが複数の γ -サイトを持ち、多様性のある Α |8を生成 '分 泌する事実 (図 16参照）と一致する。
〔実施例 10〕
図 16に、判明している APP (ヒト APP695)の切断サイトと切断によって生じる生成物 を示す（図中の番号はヒト APP695ァイソフォームにおけるアミノ酸番号である。 ) o切 断サイトとしては、一次切断サイトである a -サイトと j8 -サイト、二次切断サイトである Ύ—サイト、最近同定された ε—サイト（Gu, Y., Misonou, H.， Sato, T.， Dohmae, N.， Takio, K., and Ihara, Y. (2002) J. Biol. Chem. 276, 35235- 35238)などがある。生成 物としては、主要 A β種である Α β 40と Α β 42、および a -サイト切断の生成物である p 3ペプチドなどがある。
Ale aは多くの点で APPとの類似性を示すことから、 Ale aにも複数の一次切断サイ トが存在する可能性が高い。そこで、 Ale aの一次切断で生じた C-末端断片 (CTF) の N末端のアミノ酸配列を決定することにより、一次切断サイトを同定することとした。 しかし、 CTFは連続した二次切断を受けやすいため、 N-末端配列を決定するのに十 分量のタンパク質を細胞抽出液から回収することは難しい。このため、 γ -セクリタ一 ゼの触媒サブユニットであるプレセ二リン (PS)の活性サイトに変異を導入したドミナント ネガティブタンパク質を ΗΕΚ293細胞に安定的に発現させ、生じた Ale aの CTFが二 次切断を受けない系を構築した。この細胞株に、さらに Ale αの C-末端に FLAGタグ を付けた Ale a 1 FLAGの発現ベクター（pcDNA3- hAlc a 1- FLAG)を、遺伝子導入 試薬 (LipofectAMINE2000,インビトロジェン社製)を用いて導入し、 Ale a 1 FLAGを安 定的に発現する細胞株を榭立した。
この細胞抽出液から、一次切断によって生成した CTF a l-FLAGを免疫沈降し、沈 降物を 8% (上段)/ 15% (下段)アクリルアミドゲルカもなる非連続 SDS電気泳動で 分離後、 PVDF(Immobilon-PSQ,ミリポア社製)膜に転写してクーマジ一ブリリアントブ ルー染色で検出した。抗体特異的に検出された 30kDa付近の 2種類のタンパク質を ガスフェーズプロテインシーケンサーで解析し、 3種類の Ale α 1由来のアミノ酸配列を 決定した。以下にその詳細を説明する。 プレセ-リン 1(PS1)の 385番目のァスパラギン酸をァラニンに置換した PS1(D385A) 変異体タンパク質の発現ベクター (pCDNA3-PSlD385A)を、遺伝子導入試薬
(LipofectAMINE2000,インビトロジェン社製)を用いて HEK293細胞に導入し、 PS D385A)を安定的に発現する細胞株を榭立した。この細胞株に Ale a FLAGの発 現ベクター (pCDNA3-hAlc a 1-FLAG)を遺伝子導入試薬 (LipofectAMINE2000,イン ビトロジヱン社製)を用いて安定的に発現させた。
この細胞 (hAlc a 1FLAG/PS1D385A- 293cellと表記する)を 10cmディッシュ 4枚にコ ンフルェント (ディッシュあたり、約 lxl08cells)に達するまで培養した。細胞を氷冷 PBS で洗浄後、酵素阻害溶液 (5 μ g/mlロイぺプチン、 5 μ g/mlぺプスタチン Α、 5 μ g/mlキモスタチンを含む DMSO溶液）を含む HBST溶液 (10mM Hepes pH7.4, 150mM NaCl, 0.5% Trition X- 100 )15mlをカ卩え、 4°Cで 0.5時間、転倒撹拌することで 可溶ィ匕した。可溶ィ匕した細胞を遠心処理（12000 xg, 10 min, 4°C,トミー精エネ土製微 量高速遠心分離機を使用）し、上清を可溶性成分として回収した。可溶化成分 15 ml に対し、 50% (v/v) FLAG抗体（M2)を結合したァガロースビーズ（シグマ社 A2220)を 30 μ 1加え、低温室内 (4°C)で一晩 (約 12時間)転倒混和し、抗原抗体反応を進行さ せた。反応後のビーズを遠心処理 (3000rpm, 5min, 4°C、ベックマン社製低速冷却遠 心分離機）により沈殿させ、回収した。このビーズを lmlの HBSTにて 3回洗った後、 2mg/ml FLAG- peptide含有 HBST (30 1)を加え、免疫沈降物を競合溶出した。これ は Ale aの CTF1の分子量力 30kDa前後であり、ィムノグロブリン軽鎖（一 30kDa)の混 入をできるだけ避けるために穏和な条件で抗原溶出を行う方法である。溶出液を遠 心処理（12000 xg, 10 min, 4°C,トミー精エネ土製微量高速遠心分離機を使用）し、上 清に 1/5倍容量の 5倍濃度 SDS試料緩衝液をカ卩え、 lamminiの定法に従って、アタリ ルアミドゲル電気泳動を行った。分離したしたタンパク質を Immobilon-PSQ (ミリポア 社製)膜に転写し、クーマジ一ブリリアントブルー (CBB )色素を用いて染色を行いタン パク質を検出した (図 17)。
30kDa付近に 2種類のタンパク質 (CTFlsで示したタンパク質）が検出された。これら のタンパク質のアミノ酸配列を gas phase protein sequencer 492HT (アプライドバイオ システム社製)を用いて決定した。この結果、高分子量側のタンパク質には 2種類のァ ミノ酸配列が含まれていた。これらの配列から想定される一次切断サイトは、 815番目 の Metと 816番目の Alaとの間（この切断サイトを「 ζ 1」と 、う）及び 820番目の Ginと 821 番目の Pheの間（この切断サイトを「ζ 2」という）である（図 18)。 ζ 1は、実施例 8で決 定したサイトに一致した。 ζ 2は新規な一次切断サイトである。また、 CTFlsの低分子 量側のタンパク質には 1種類のアミノ酸配列が含まれて 、た。この配列力 想定され る一次切断サイトは、 838番目の Alaと 839番目の Asnの間（この切断サイトを「ζ 3」とい う）である（図 18)。
以上のように Ale αは、 3力所の一次切断サイト（ζ 1, ζ 2, ζ 3)と 3力所の二次切断サ イト（Ύ 1, Ύ 2, γ 3)を持つ。この結果、ヒトからは、少なくとも 9種類の J8 - Ale αが生成 する (表 1)。
[表 1]
Figure imgf000030_0001
複数の β -Ale aが生成することは、同調して代謝を受ける APPから複数の A βが生 成してくる事実とよく一致する。
〔実施例 11〕
アルツハイマー病 (AD)では、 A j8の生成量が増加するだけでなぐ A j8の分子種に も変化が認められる。 AD患者では、全 A |8生成量における凝集性の高い A |8 42の割 合が増加していることが報告されている。 A |8 42の比率の上昇は、発病に大きく関わ つていると考えられている。例えば、プレセ-リン遺伝子に変異を持つ家族性ァルツ ノヽイマ一病 (FAD)患者では、 A |8 42の割合が顕著に増加することが知られている。 Ale aは、様々な点で APPとの類似性を示すことから、 Ale αにおいても、 APP同様、プレ セ-リンの変異により生成する — Aleの分子種が変化する可能性がある。そこで、こ の点を確認するために、以下の実験を行った。
AD患者から見出された I143F (143番目の lieが Pheに変異）、 R278T (278番目の Arg 力 Thrに変異）、 A434C (434番目の Alaが Cysに変異）、 L435F (435番目の Leuが Phe に変異）の 4種類の変異型 PS1を発現するベクター (pcDNA3-PSlI143F,
pcDNA3-PSlR278T, pcDNA3- PS1A434C, pcDNA3- PS1L435F)を作製し、これらの ベクターと APPの C99/CTFの発現ベクター（pcDNA3- APPC99)を、遺伝子導入試薬 (LipofectAMINE2000,インビトロジェン社製)を用いて HEK293細胞に導入し、両タン パク質を安定的に発現する細胞株を榭立した。各細胞を 10 cmディッシュ（コーニン グ社製）に播き、コンフルェントに達した後、遺伝子導入試薬 (LipofectAMINE2000,ィ ンビトロジェン社製)を用いて pcDNA3- FLAG- hAlc a Δ Εを導入し、 Alcadein aの CTF1を一過的に発現させた。
一方、正常型 PS1 (wt)及び不活性型 PS1 (D385A、 PS1の触媒サイトの Aspを Alaに置 換しており、 γ -セクリターゼ活性を示さない。）を発現するベクター (pcDNA3-PSl及 び pcDNA3-PSlD385A)を作製し、遺伝子導入試薬 (LipofectAMINE2000, Invitrigen) を用いて HEK293細胞に導入し、 PS1を安定的に発現する細胞株を榭立した。各細胞 を 10 cmディッシュ（コ一-ング社製）に播き、コンフノレェントに達した後、遺伝子導入 試薬 (LipofectAMINE2000,インビトロジェン社製)を用いて pcDNA3-APPC99及び pcDNA3- FLAG- hAlc α Δ Εを導入し、 ΑΡΡの CTF及び Alcadein aの CTF1を一過的 に発現させた。
以上のような遺伝子導入処理を行った細胞を COインキュベーターで 24時間培養
2
した後、培養液を回収し、遠心（15000rpm, 5分 min, 4°C,ベックマン社製高速冷却遠 心分離機を使用）した上清 7.5mlに酵素阻害溶液 (5 mg/mlロイぺプチン、 5 mg/mlぺ プスタチン A、 5 mg/mlキモスタチンを含む DMSO溶液） 7.5 1を加え、サンプルとした 。このサンプルに抗 FLAG抗体溶液 (M2,シグマ社 lot 103k6043)を 6 /z 1加えて 1時間、 4°Cで転倒混和した。その後、 25%プロテイン G-セファロースを含むリンス緩衝液 50 1加え、 4°Cで一晩転倒混和して抗原抗体反応を進行させた。反応後のビーズを洗浄 緩衝液 1 (1M塩化ナトリウム， 20mM Tris- HC1 pH7.4, 0.1% TritonX- 100)、洗浄緩衝 液 2 (150mM塩化ナトリウム， 5mM EDTA, 50mM Tris- HC1 pH7.4, 1% TritonX- 100, 0.05% SDS)ゝリンス緩衝液 (lOmM Tris- HC1 pH7.4, ImM EDTA, 0.1% TritonX- 100, 150mM塩ィ匕ナトリウム)で順次洗浄した。その後ビーズに 20 1の試料緩衝液混合物
(2倍濃度 SDS試料緩衝液 10 1と 8M尿素溶液 10 1の混合物)を加え、攪拌後、 5 分間煮沸してビーズに吸着して 、た成分を溶出した。これを遠心した上清成分を 20% アクリルアミドゲルトリス-トリシン電気泳動法を用いて分離した後、抗 FLAG抗体溶液 (M2,シグマ社製）を用いウェスタンブロットを行った。反応した FLAGタグの付いた j8 - Aleは ECLキット（フアルマシア社製)を用いて検出し、 NIHイメージソフトウェアを用 いて定量した。一方、培地中の A j8 40および A j8 42は、 Tomitaら (J. Biol. Chem.
[1998] 273, 6277-6284)の方法に従い、 sELISA法で定量した。図 19にウェスタンブロ ットの結果、並びに全 β -Ale生成量（1.0)における Long β -Aleの割合及び全 Α β生 成量（1.0)における Α |8の割合を示す。なお、図中の N.D.は検出限界以下であったこ とを示す。
正常型 PS1を発現する細胞では、 2種類の j8 -Ale (図中 short β -Ale, medium β -Aleと表示)を主に検出した力 FAD変異を持つ PS1を発現している細胞では、より高 分子量の j8 -Alcdong β -Aleと表示)が増加した。 long β -Aleの割合は、変異型 PS1 を発現する細胞で増加しており、これは A |8 42の割合が増加することと同じ傾向を示 した。すなわち、 j8 -Aleの質的変化は A |8の質的変化を反映するものであることが明 らかになつた。患者脳脊髄液および血中の β -Aleの質的変化 (long β -Aleの割合の 増加等）は、 A |8の質的変化を反映するものであり、凝集性の高い A |8 42の検出を行 う代わりに β -Aleの検出を行うことで、質的変化を捉えにくい発症初期患者もしくは発 症前患者予備群を見いだすことが可能になる。
〔実施例 12〕
図 19で示した 13 -Aleの C-末端側の切断サイトを MALDI-TOF/MSを用いて決定す る目的で、高分子量 i8 -Aleをより多く生成する PS1変異を探すため、実施例 11と同様 の実験を鋭意行った。その結果、図 20で示すように、 L166P(PS1の 166番目の Leuが Proに変異)変異 PS1を発現する細胞において、培地中に高分子量 j8 -Aleが他の PS1 変異と比較して多量に分泌されることを見出した。そこで、実施例 9の方法に従い、正 常型 PS1および L166P変異型 PS1によって生成 '分泌される β -Aleの質量分析を行い 、分子量を決定した。その結果を図 21に示す。図 20のウェスタンプロット解析結果か らも明らかなように、 L166P変異型 PS1を発現する細胞では正常型 PS1を発現する細 胞に比べて、 short j8 -Aleが減少（下向きの太矢印で示す）し、 medium jS -Alcが増 カロ（上向きの太矢印で示す)した。さらに、正常型 PS1を発現する細胞では検出できな かった long j8 - Aleが出現した。
図 21の結果力も判明した /3 -Aleの切断位置を図 22に示す。破線の矢印は正常型 PS1を発現する細胞で切断されたサイト、実線の矢印は L166P変異型 PS1を発現する 細胞で切断されたサイトを示す。 L166P変異型 PS1では、 |8 -Aleの切断サイトが、より C-末端側に移動していることが明らかになった。これは家族性アルッノヽイマ一病の 変異型 PS1が A βの C-末端側の切断サイトをより C-末端側へ移動させる事実とよく一 致する。図 23に |8 -Aleの N末端側 3箇所（ζ 1、 ζ 2、 ζ 3)と共に、 C-末端側の 3箇 所（γ 1、 γ 2、 γ 3)の切断サイトおよび変異型 PS1により C-末端側へ移動した γ -切 断サイトから生成してくる β -Aleの分子種を模式的に示す (実施例 12の実験では、 y 1サイトの切断サイトは検出できていない。 )
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願 (特願 2003-3753630号） の明細書および Zまたは図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引 用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入 れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] アル力ディン a、アル力ディン β、又はアル力ディン γ力も Ν末端側の断片と。末端 側の断片が切断除去されることによって生成するペプチドであって、アルッノヽイマ一 病の診断マーカーとなり得るペプチド。
[2] 切断除去される Ν末端側の断片が、 Ν末端側の細胞外ドメインの一部である、請求 項 1記載のペプチド。
[3] 切断除去される C末端側の断片が、プレセ二リンによって切断除去される断片であ る、請求項 1又は 2記載のペプチド。
[4] アル力ディン ocから Ν末端側の断片と C末端側の断片が切断除去されることによつ て生成するペプチドであって、 Ν末端側の断片の切断除去される部位が、配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の 815番目に対応するアミノ酸と 816番目に対応するアミノ酸 の間、 820番目に対応するアミノ酸と 821番目に対応するアミノ酸の間、又は 838番目 に対応するアミノ酸と 839番目に対応するアミノ酸の間である、請求項 1記載のぺプチ ド、。
[5] アル力ディン ocから Ν末端側の断片と C末端側の断片が切断除去されることによつ て生成するペプチドであって、 C末端側の断片の切断除去される部位が、配列番号 1 で表されるアミノ酸配列の 842番目に対応するアミノ酸と 843番目に対応するアミノ酸 の間、 843番目に対応するアミノ酸と 844番目に対応するアミノ酸の間、又は 851番目 に対応するアミノ酸と 852番目に対応するアミノ酸の間である、請求項 1又は 2記載の ペプチド。
[6] ペプチドが、配列番号 4乃至 12のいずれかに記載されたアミノ酸配列力もなるぺプ チドである、請求項 1記載のペプチド。
[7] 動物力 採取した体液又は組織における請求項 1乃至 6の 、ずれか一項記載のぺ プチドの検出又は定量を行う工程を含むアルッノ、イマ一病の診断のためのデータを 収集する方法。
[8] 体液が、血液又は脳髄液である、請求項 7記載のアルッノ、イマ一病の診断のため のデータを収集する方法。
[9] 検出又は定量されたペプチドにおける高分子量型のペプチドの比率を指標として アルッノ、イマ一病の診断を行う、請求項 7又は 8記載のアルツハイマー病の診断のた めのデータを収集する方法。
[10] 動物力 採取した体液又は組織における請求項 1乃至 6のいずれか一項記載のぺ プチドの検出又は定量を行う工程を含むアルッノヽイマ一病の診断方法。
[11] 体液が、血液又は脳髄液である、請求項 10記載のアルッノヽイマ一病の診断方法。
[12] 検出又は定量されたペプチドにおける高分子量型のペプチドの比率を指標として アルッノ、イマ一病の診断を行う、請求項 10又は 11記載のアルッノ、イマ一病の診断 方法。
[13] 請求項 1乃至 6の 、ずれか一項記載のペプチドを分泌する細胞に被験物質を接触 させ、前記ペプチドの分泌量の変化、又は分泌される前記ペプチドの分子種の変化 を調べることを特徴とするアルツハイマー病の治療薬のスクリーニング方法。
[14] 請求項 1乃至 6のいずれか一項記載のペプチドに対する抗体。
[15] 請求項 14記載の抗体を含有するアルツハイマー病の診断薬。
PCT/JP2004/016209 2003-11-05 2004-11-01 アルツハイマー病のマーカーペプチド WO2005044847A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT04799415T ATE551357T1 (de) 2003-11-05 2004-11-01 Markerpeptid für die alzheimer-krankheit
US10/577,008 US7807777B2 (en) 2003-11-05 2004-11-01 Marker peptide for alzheimer's disease
JP2005515282A JP5574559B2 (ja) 2003-11-05 2004-11-01 アルツハイマー病のマーカーペプチド
EP04799415A EP1690870B1 (en) 2003-11-05 2004-11-01 Marker peptide for alzheimer's disease
US12/859,950 US20110014635A1 (en) 2003-11-05 2010-08-20 Marker peptide for alzheimer's disease

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2003-375363 2003-11-05
JP2003375363 2003-11-05

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/859,950 Division US20110014635A1 (en) 2003-11-05 2010-08-20 Marker peptide for alzheimer's disease

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005044847A1 true WO2005044847A1 (ja) 2005-05-19

Family

ID=34567069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/016209 WO2005044847A1 (ja) 2003-11-05 2004-11-01 アルツハイマー病のマーカーペプチド

Country Status (5)

Country Link
US (2) US7807777B2 (ja)
EP (1) EP1690870B1 (ja)
JP (1) JP5574559B2 (ja)
AT (1) ATE551357T1 (ja)
WO (1) WO2005044847A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009075084A1 (ja) 2007-12-12 2009-06-18 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. アルツハイマー病の存在又は傾向の診断薬及び診断方法
JP2010181403A (ja) * 2009-02-04 2010-08-19 Buddhist Tzu Chi General Hospital ガンの検出方法とそれに使用されるキット
WO2012137502A1 (ja) * 2011-04-04 2012-10-11 株式会社免疫生物研究所 アルカデインペプチド切断物による認知症又はアルツハイマー病の診断方法又は予後予測方法
US9895518B2 (en) 2006-10-09 2018-02-20 Neurofluidics, Inc. Cerebrospinal fluid purification system
US10632237B2 (en) 2006-10-09 2020-04-28 Minnetronix, Inc. Tangential flow filter system for the filtration of materials from biologic fluids
US10850235B2 (en) 2006-10-09 2020-12-01 Minnetronix, Inc. Method for filtering cerebrospinal fluid (CSF) including monitoring CSF flow
US11147540B2 (en) 2015-07-01 2021-10-19 Minnetronix, Inc. Introducer sheath and puncture tool for the introduction and placement of a catheter in tissue
US11577060B2 (en) 2015-12-04 2023-02-14 Minnetronix, Inc. Systems and methods for the conditioning of cerebrospinal fluid

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
BRPI0619249A2 (pt) 2005-11-30 2011-09-20 Abbott Lab anticorpos anti-globulÈmeros-aß, frações que se ligam a antìgeno destes, hibridomas correspondentes, ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras, métodos de produzir os ditos anticorpos, composições compreendendo os ditos anticorpos, usos dos ditos anticorpos e métodos de usar os ditos anticorpos
ES2453941T5 (es) 2005-11-30 2017-05-31 Abbvie Inc. Anticuerpos monoclonales contra la proteína beta amiloide y usos de los mismos
DE102006048201A1 (de) * 2006-10-11 2008-04-17 Ganymed Pharmaceuticals Ag Autoantigene zur verbesserten Diagnose, Prognose und Therapie von entzündlichen neurologischen Erkrankungen
US8455626B2 (en) 2006-11-30 2013-06-04 Abbott Laboratories Aβ conformer selective anti-aβ globulomer monoclonal antibodies
WO2008104386A2 (en) 2007-02-27 2008-09-04 Abbott Gmbh & Co. Kg Method for the treatment of amyloidoses
EP2558494B1 (en) 2010-04-15 2018-05-23 AbbVie Inc. Amyloid-beta binding proteins
EP3533803B1 (en) 2010-08-14 2021-10-27 AbbVie Inc. Anti-amyloid-beta antibodies
EP2987496B1 (en) * 2013-04-19 2018-08-08 National University Corporation Okayama University Treatment agent for cognitive disorders, induced by amyloid -protein, therapeutic agent for alzheimer's disease, and treatment method and pathological analysis method related to these
US10942190B2 (en) * 2014-01-21 2021-03-09 Shimadzu Corporation Measurement method for amyloid precursor protein cleavage peptides
CN110426264B (zh) * 2019-08-27 2022-03-22 阜阳师范大学 一种脂肪细胞的染色方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022819A2 (en) * 2000-09-14 2002-03-21 Universität Zürich Calcium binding proteins
JP2003164298A (ja) * 2001-11-30 2003-06-10 Takeda Chem Ind Ltd アミロイドβタンパク質産生阻害薬のスクリーニング方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022819A2 (en) * 2000-09-14 2002-03-21 Universität Zürich Calcium binding proteins
JP2003164298A (ja) * 2001-11-30 2003-06-10 Takeda Chem Ind Ltd アミロイドβタンパク質産生阻害薬のスクリーニング方法

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11065425B2 (en) 2006-10-09 2021-07-20 Neurofluidics, Inc. Cerebrospinal fluid purification system
US9895518B2 (en) 2006-10-09 2018-02-20 Neurofluidics, Inc. Cerebrospinal fluid purification system
US10398884B2 (en) 2006-10-09 2019-09-03 Neurofluidics, Inc. Cerebrospinal fluid purification system
US20200046954A1 (en) 2006-10-09 2020-02-13 Neurofluidics, Inc. Cerebrospinal fluid purification system
US10632237B2 (en) 2006-10-09 2020-04-28 Minnetronix, Inc. Tangential flow filter system for the filtration of materials from biologic fluids
US10850235B2 (en) 2006-10-09 2020-12-01 Minnetronix, Inc. Method for filtering cerebrospinal fluid (CSF) including monitoring CSF flow
US11529452B2 (en) 2006-10-09 2022-12-20 Minnetronix, Inc. Tangential flow filter system for the filtration of materials from biologic fluids
EP2423685A1 (en) 2007-12-12 2012-02-29 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. Agent and method for diagnosis on the occurrence of Alzheimer's disease
WO2009075084A1 (ja) 2007-12-12 2009-06-18 Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd. アルツハイマー病の存在又は傾向の診断薬及び診断方法
JP2010181403A (ja) * 2009-02-04 2010-08-19 Buddhist Tzu Chi General Hospital ガンの検出方法とそれに使用されるキット
WO2012137502A1 (ja) * 2011-04-04 2012-10-11 株式会社免疫生物研究所 アルカデインペプチド切断物による認知症又はアルツハイマー病の診断方法又は予後予測方法
US11147540B2 (en) 2015-07-01 2021-10-19 Minnetronix, Inc. Introducer sheath and puncture tool for the introduction and placement of a catheter in tissue
US11577060B2 (en) 2015-12-04 2023-02-14 Minnetronix, Inc. Systems and methods for the conditioning of cerebrospinal fluid

Also Published As

Publication number Publication date
EP1690870A1 (en) 2006-08-16
JP5574559B2 (ja) 2014-08-20
EP1690870A4 (en) 2007-08-08
EP1690870B1 (en) 2012-03-28
US20110014635A1 (en) 2011-01-20
JPWO2005044847A1 (ja) 2007-11-29
US20070111252A1 (en) 2007-05-17
ATE551357T1 (de) 2012-04-15
US7807777B2 (en) 2010-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5574559B2 (ja) アルツハイマー病のマーカーペプチド
US12117448B2 (en) Saposin-A derived peptides and uses thereof
Huang et al. Protein studies in dysferlinopathy patients using llama-derived antibody fragments selected by phage display
AU2021261975B2 (en) Saposin-a derived peptides and uses thereof
CN101606062A (zh) 用于治疗和诊断自身免疫性脑炎或癫痫的方法和组合物
JP7470041B2 (ja) アルツハイマー病の判定薬および判定方法
WO2011157905A1 (en) Polyclonal antibody binding to acetylated hmgb1
KR102245938B1 (ko) 진단 분석에 사용하기 위한 개선된 rep 단백질
EP3519592B1 (en) Materials and methods for evaluating cancer
WO2021142963A1 (zh) 用于阿尔兹海默症自身抗体检测的蛋白抗原组合及其应用
WO2019066620A2 (ko) 항 c-met 항체 및 이의 용도
CN115066610A (zh) 用于tau病变和痴呆相关疾病的确定试剂和确定方法
Zhang et al. Antibodies in cerebral cavernous malformations react with cytoskeleton autoantigens in the lesional milieu
US7906290B2 (en) Antibody for diagnosing neuropsychiatric diseases, in particular schizophrenia, depression and bipolar affective disorders
JP2022036962A (ja) 抗ｎｉｎｊ－１抗体及びその使用
Yasui et al. Detection of endogenous LRP6 expressed on human cells by monoclonal antibodies specific for the native conformation
JP7654126B2 (ja) アルツハイマー病の判定薬および判定方法
JP6943423B2 (ja) ペプチド、それを含む小胞体ストレスマーカー及びそれを用いた小胞体ストレスの測定方法
JP2024070247A (ja) 神経変性疾患の治療薬または予防薬のスクリーニング方法
CN118388658A (zh) 一种靶向nmda受体人源抗体的筛选方法
EP1790983A1 (en) Method of screening compound preventing cells from infection with hepatitis c virus (hcv)
Class et al. Patent application title: SAPOSIN-A DERIVED PEPTIDES AND USES THEREOF Inventors: Randolph Watnick (Newton, MA, US) Assignees: CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION
JP2005145936A (ja) 抗Ｋａｎｋモノクローナル抗体

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005515282

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004799415

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007111252

Country of ref document: US

Ref document number: 10577008

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004799415

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10577008

Country of ref document: US