WO2005037316A1 - セクレターゼ活性を抑制する方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method and a pharmaceutical composition for suppressing secretase activity. Specifically, a method of suppressing secretase activity by suppressing the expression of synoviolin to promote sensitivity of a secretase inhibitor, a method of suppressing secretase activity by binding synoviolin to Herp, and a method of secretase
- the present invention relates to a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits activity.
- Synoviolin is a novel protein discovered as a membrane protein present in synovial cells from rheumatic patients (WO02 / 05207). Synoviolin has activity that contributes to normal bone formation or limb development, as studies using genetically modified animals have shown that these factors are directly involved in bone and joint development and the development of arthropathy. Is considered to be a protein having
- synoviolin expression is found ubiquitously throughout the body, not just in bones and joints. Therefore, in order to analyze the function of synoviolin in vivo, searching for a factor that binds to synoviolin is a powerful method. In particular, detection of the synoviolin substrate protein may be an important factor in identifying the intracellular signal transduction pathway involving synoviolin.
- the present inventors searched for a factor that binds to Synoviolin by the Yeast Two Hybrid method using Synoviolin as a Bait in order to elucidate what intracellular signaling pathway is involved in Synoviolin.
- a protein called Herp homocysteine "lndusiole endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1
- Herp homocysteine "lndusiole endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1
- Product of a homocystin-responsive gene Koreane K, Kato H, Miyata T. Homocysteine-respondent Genes in Vascular Endothelial Cells Identified by Differential Display Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22; 271 (47): 29659- 29665).
- Herp is a membrane protein whose expression is induced by endoplasmic reticulum stress and which has a structurally ubiquitin-like domain (UBL) at the N-terminal side (Kokame K Agarwala KL, Kato H, Miyata T. Herp, a New Ubiquitin-like Membrane Protein Induced by Endoplasmic Reticulum Stress. J. Biol. Chem. 2000 Oct 20; 275 (42): 32846-32853).
- UDL structurally ubiquitin-like domain
- PS presenilin
- FAD familial Alzheimer's disease
- A a proteolytic enzyme involved in the transmembrane cleavage of / 3-amyloid protein
- Alzheimer's disease is one of the diseases of great interest in an aging society. Its most important feature is the observation of senile plaques, or fibrous -amyloid protein (A i3) deposits, in the brain.
- the protein is a protein produced by the cleavage of the amyloid precursor protein ( ⁇ ) by j8-secretase and ⁇ -secretase, and this excision is increasing in Alzheimer's disease patients.
- the present invention relates to a drug useful for treating cranial nerve diseases, particularly Alzheimer's disease.
- the purpose is to provide an agent.
- the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, focused on a substance that suppresses secretase activity, and using this substance, it was possible to suppress the accumulation of A / 3 and treat Alzheimer's disease.
- the inventor has found the findings and has completed the present invention.
- the present invention is as follows.
- a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits secretase activity (1) A pharmaceutical composition containing a substance that inhibits secretase activity.
- composition according to (1) or (2), wherein the substance that inhibits secretase activity is a substance that promotes the sensitivity of a secretase inhibitor.
- synoviolin includes, for example, those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
- a secretase inhibitor which enhances the sensitivity of a secretase inhibitor.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing the full-length structure of Synoviolin and the structures of Synod TM and Syno Ring used for bait.
- FIG. 2 is a schematic diagram showing the full-length structure of Herp and the structure of fragmented Herp.
- FIG. 3 is a view showing the results of a binding experiment of Flag-Syno dTM and each of Herp constructs with a GST fusion protein.
- FIG. 4 is a diagram showing the results of immunoprecipitation experiments between HA / Syno and Flag / Herp.
- FIG. 5 is a graph showing the effect of a ⁇ -secretase inhibitor on wild-type and ⁇ -sinopiolin-deficient mouse fetal fibroblasts.
- FIG. 6 is a diagram showing the relationship between Synoviolin and Herp in the pull down assay.
- FIG. 7 is a diagram showing a binding region between Synoviolin and Herp in vivo.
- FIG. 8A is a diagram showing Herp expression in MEF cells.
- FIG. 8B is a diagram showing ubiquitination of Herp.
- FIG. 8C is a diagram showing constructs used for Herp analysis.
- Figure 9 is a diagram showing a ⁇ - secretase activity in MEF ( BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
- the present inventors have focused on the possibility that synopiolin is involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease, and have clarified that the sensitivity of a secretase inhibitor increases in cells in which synoviolin expression is knocked out. This means that the sensitivity of the secretase inhibitor is promoted in a state in which the expression of synoviolin is inhibited, indicating that the sensitivity of the secretase inhibitor is promoted through the deletion of synoviolin. Things. He demonstrated that the use of substances that enhance the sensitivity of secretase inhibitors could lead to the treatment of Alzheimer's disease.
- the present invention has found that when synoviolin is bound to Herp protein, the Herp protein is ubiquitidized and degraded, and as a result, secretase activity is reduced.
- ⁇ ⁇ ⁇ is cut out by secretase (eg, secretase activity), and is accumulated to form senile plaques. Therefore, the present inventor paid attention to the fact that secretase is involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease, and considered the construction of a process for suppressing accumulation and senile plaque formation by suppressing secretase activity.
- secretase eg, secretase activity
- the present invention is characterized in that accumulation of ⁇ ] 3 is suppressed by suppressing secretase activity.
- accumulation of ⁇ ] 3 it is possible to suppress the formation of senile plaques and to treat Alzheimer's disease.
- Synoviolin is a protein that is expressed throughout the body, and has been shown to control essential functions in living organisms. Therefore, it has been required to elucidate the function of synoviolin in vivo. In general, searching for a factor that binds to Synoviolin is one of the most effective methods for clarifying the function of a protein.In particular, detecting a Synoviolin substrate protein is important in cells involved in Synoviolin. Considered to be an important clue to the identification of signaling pathways available.
- Synoviolin was considered to be involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease, especially in secretase activity.
- the mechanism for suppressing the activity of secretase is considered to be the case where the sensitivity of the secretase inhibitor is promoted or the case where synoviolin is bound to Herp protein (hereinafter, also simply referred to as “Herp”).
- Herp Herp protein
- the former suppresses secretase activity and promotes the accumulation of Ai3 by promoting the sensitivity of secretase inhibitors.
- the latter binds synoviolin to Herp, causing Herp ubiquitination and Is to reduce the accumulation of Ai3.
- the present inventors focused on the sensitivity of a secretase inhibitor, and considered the construction of a process for suppressing the accumulation of Ai3 and the formation of senile plaques by increasing the sensitivity of the inhibitor. Then, she argued that synoviolin might be involved in the pathogenesis of Alzheimer's disease, and expressed cells that knocked out synoviolin expression. Clarified that the sensitivity of secretase inhibitors was increased. This means that when synoviolin expression is inhibited, the sensitivity of the secretase inhibitor is promoted, and the sensitivity of the secretase inhibitor is promoted through synoviolin deletion. It indicates that. He demonstrated that the use of substances that enhance the sensitivity of secretase inhibitors could lead to the treatment of Alzheimer's disease.
- promoting the sensitivity of the secretase inhibitor means to enhance the drug effect of the secretase inhibitor so that it functions effectively.
- RNA interference can be used. RNAi can be induced by designing and synthesizing siRNA (small interfering RNA) for the synoviolin gene and introducing it into cells. '
- RNAi is a phenomenon in which dsRNA (double-strand RNA) binds specifically and selectively to a target gene, and the expression of the target gene is efficiently inhibited by cleaving the target gene.
- dsRNA double-strand RNA
- RNAi double-strand RNA
- siRNA The design of siRNA can be performed as follows.
- the gene is not particularly limited as long as it is a gene encoding synoviolin, and any arbitrary region can be used as a candidate.
- any region of GenBank Accession number AB024690 SEQ ID NO: 1 can be a candidate.
- a sequence starting with AA is selected from the selected region, and the length of the sequence is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.
- the sequence should have a GC content of, for example, 40-60%.
- a DNA containing the following nucleotide sequence can be used as a target sequence of the siRNA.
- siRNA synthesized in vitro a method of linking siRNA synthesized in vitro to plasmid DNA and introducing this into cells, a method of annealing two RNAs, and the like can be employed.
- shRNA is an RNA molecule having a stem-loop structure because a part of a single strand forms a complementary strand with another area, which is called a short hairpin RNA (short hairpin RNA).
- shRNAs can be designed such that a portion forms a stem-loop structure. For example, assuming that the sequence of a certain region is sequence A and the complementary strand to sequence A is sequence B, these sequences are present in one sequence such that sequence A, spacer, and sequence B are present; So that the total length is 45-60 bases.
- Sequence A is a sequence of a partial region of the target Synoviolin gene (SEQ ID NO: 1), and the target region is not particularly limited. In addition, any area can be used as a candidate.
- the length of sequence A is 19-25 bases, preferably 19-21 bases.
- the present inventors use an evaluation system in which cells are treated with a secretase inhibitor and the proliferation activity of the cells is used as an indicator of secretase inhibition.
- the type of secretase is not particularly limited, and includes J3-secretase and ⁇ -secretase. Therefore, the secretase inhibitor may be either a secretase inhibitor or a ⁇ -secretase inhibitor.
- secretase inhibitor examples include, but are not limited to, L-685,458 (Peptide Research Laboratories), (3,5-Difluorophenylacetyl) -Ala-Phg-OBut [DAPT] ((Co.) Peptide Research Laboratories), Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-SerGlu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe (Peptide Research Laboratories), Z-Leu-Leu-Nle-CHO (Wako).
- DAPT fetal fibroblasts
- synoviolin-deficient cells As a result of examining the effect of the inhibitor using the above-mentioned synoviolin-deficient cells, it was found that the cells deficient in synoviolin had a lower cell proliferation than the wild-type cells having synoviolin. In other words, it means that the deletion of Synoviolin promoted the sensitivity of the secretase inhibitor.
- the shRNA or siRNA produced in the present invention is a substance that suppresses the expression of Synoviolin, and is a pharmaceutical composition containing a substance that promotes the sensitivity of a secretase inhibitor (particularly, a gene therapy agent for brain and nervous system diseases such as Alzheimer's disease).
- a pharmaceutical composition of the present invention is used as a gene therapy agent for cerebral nervous system diseases, it is applied to the central nervous system such as the moon (cerebrum, diencephalon, midbrain, cerebellum), medulla oblongata, and spinal cord.
- the above cerebral nervous system diseases may be used alone or in combination.
- the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is used as a gene therapy agent, there are mentioned a method of directly administering the pharmaceutical composition of the present invention by injection, and a method of administering a vector into which a nucleic acid has been incorporated.
- the above vectors include adenovirus vectors, adeno-associated vinores vector, henore virus vector, vaccinia vinores vector, letro vinores vector, lentiwi / res vector, etc., and these virus vectors are used. By doing so, it can be administered efficiently.
- the pharmaceutical composition of the present invention into phospholipid vesicles such as ribosomes and administer the vesicles.
- the endoplasmic reticulum retaining the siRNA or shRNA is introduced into predetermined cells by the lipofection method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, into a vein, an artery or the like. It can also be administered locally to the brain and the like.
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptoms, administration route, administration frequency, and dosage form.
- the dosage is 10 6 per day: L 0 13 About 1 to 8 weeks.
- a commercially available gene introduction kit for example, AdenoExpress: Clontech
- AdenoExpress: Clontech a commercially available gene introduction kit
- Herp is induced by endoplasmic reticulum stress and is structurally a transmembrane endoplasmic reticulum protein with a UBL at the N-terminal side, and Herp endogenous to the cell is polyubiquitinated.
- the present inventors focused on this Herp, decomposed the Herp, suppressed the ⁇ -secretase activity and suppressed the intramembrane cleavage of A j3, and thereby accumulated and accumulated A. We considered the construction of a process to suppress the formation of eclipse.
- the minimum binding site between Synoviolin and Herp can be determined by using various cleavage fragments of Herp and performing a binding test between the fragment and Synoviolin.
- the minimum binding site of Herp to Synoviolin was determined to be the amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) encoded by the human Herp gene (SEQ ID NO: 17). This region corresponds to the 40th amino acid residue at positions 161 to 200 (the following sequence).
- the Synoviolin used in the present invention may have the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by SEQ ID NO: 1;
- An amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added in the sequence may have an activity of degrading Herp by ubiquitination.
- the introduction of the mutation such as the deletion or substitution can be performed by a known site-directed mutagenesis method (for example, GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen), TaKaRa Site-Directed). Mutagenesis System (MutarrK, Mutan-Super Express Km, etc. (Takara)) can be used.
- Herp (-bind) gene in which the above-mentioned 40 amino acid residue region was deleted was prepared, and this gene was inserted into an appropriate vector to obtain HEK293T.
- the Hei'p (-bind) is labeled with an HA tag at the N-terminus.
- the synoviolin label may be labeled with a FLAG tag.
- Analysis of the results may be performed by extracting whole cell extract (WCE) after strong expression, confirming protein expression, and performing immunoprecipitation with an anti-HA antibody or anti-FLAG antibody.
- WCE whole cell extract
- Herp binds to synoviolin
- Herp (-bind) does not bind to synoviolin. It is found that 19) is essential for binding to synoviolin.
- Herp is degraded by ubiquitination by binding to synoviolin. Therefore, whether Herp is a substrate for Synoviolin can be confirmed by polyubiquitination of Herp. That is, in HEK293T cells, a Herp mutant in which a FLAG tag is added and a part of amino acid residues are mutated is produced to express HA-Ubiquitin and synoviolin. After extracting cell extract (WCE) and confirming the expression of each protein by Western blotting, immunoprecipitation with anti-HA antibody allows Herp to express poly-Ubiquitin (Ub) in cells. Check whether it has been implemented.
- WCE cell extract
- Ub poly-Ubiquitin
- Herp (-UBL) from which the ubiquitin and synoviolin have been strongly expressed at the same time, the Herb (-UBL) ubiquitinated band has a higher deletion rate than the case where only ubiquitin is strongly expressed. Is strong.
- Synoviolin is involved in Alzheimer's disease by using y-secretase activity in wild-type cells (eg, MEF (syno (+ / +)) using synoviolin knockout cells (eg, MEF (syno (-/-))).
- MEF synoviolin knockout cells
- the MEF cells are treated with a lysis buffer to prepare a cell lysate, and then a reaction buffer and a fluorescently-labeled substrate are added to perform an enzyme reaction.
- a reaction buffer and a fluorescently-labeled substrate are added to perform an enzyme reaction.
- synoviolin when synoviolin is bound to Herp or Herp-PS complex, it causes the degradation of Herp by ubiquitination, and eventually suppresses the accumulation of synovio, which is a cause of Alhaimai disease.
- Phosphorus is a substance involved in suppressing secretase activity, and can be used as a pharmaceutical composition for treating cerebral nervous system diseases such as Alzheimer's disease.
- the pharmaceutical composition of the present invention When used as a therapeutic agent for a cerebral nervous system disease, (Cerebrum, diencephalon, midbrain, cerebellum), central nervous system such as medulla oblongata and spinal cord.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be applied to the affected part as it is, or by any known method, for example, injection such as intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous, or inhalation from the nasal cavity, oral cavity or lung, oral It can also be introduced into target cells or organs by administration, intravascular administration using a catheter, or the like.
- a known pharmaceutically acceptable carrier such as an excipient, a bulking agent, a binder, a lubricant, a known additive (buffer, isotonicity, etc.) Agents, chelating agents, coloring agents, preservatives, flavoring agents, flavoring agents, sweetening agents, etc.).
- the pharmaceutical composition of the present invention includes tablets, capsules, powders, granules, pills, liquids, syrups, and other oral administrations, injections, external preparations, suppositories, eye drops, and other parenteral administrations. Depending on the form, it can be administered orally or parenterally. Preferably, local injection into muscle, abdominal cavity, etc., injection into vein and the like are exemplified.
- the dose is appropriately selected depending on the type of the active ingredient, the route of administration, the administration subject, the age, weight, sex, symptoms and other conditions of the patient. 100 mg, preferably 0.1 mg to 10 mg, more preferably 0.1 mg to 1.0 mg. Synoviolin can be administered once daily or in several divided doses.
- the pharmaceutical composition (Sinoviolin) of the present invention When the pharmaceutical composition (Sinoviolin) of the present invention is used by expressing the gene in vivo (in the case of gene therapy), a method of directly administering the Synoviolin gene by injection in the same manner as described for the gene therapy agent is used. In addition, there is a method of administering a vector into which the synoviolin gene has been incorporated.
- the vector include an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a herpes innores vector, a vaccinia winores vector, a retroinores vector, a lentivirus vector, and the like. These virus vectors are used. By doing so, it can be administered efficiently.
- the Synoviolin gene used in the present invention is not limited to the one having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, but hybridizes with a sequence complementary to the nucleotide sequence under stringent conditions. , And, It also includes a gene encoding a protein having a binding activity to Herp.
- Salt concentration during washing is 100-500 mM, preferably 150-300 mM, and the temperature is 50-70 ° C, preferably 55-65 ° C in the hybridization. Means the condition.
- synoviolin gene into phospholipid vesicles such as ribosomes and administer the vesicles.
- the endoplasmic reticulum retaining the above gene is introduced into predetermined cells by the lipofection method. Then, the obtained cells are systemically administered, for example, into a vein or an artery. It can also be administered locally to the brain and the like.
- the dose of Synoviolin gene varies depending on age, gender, symptoms, route of administration, frequency of administration, and dosage form. For example, in the case of adenovirus, the dose per day is about 10 6 to 13 It is administered every 1 to 8 weeks.
- This example is an example of Herp screening using the Yeast Two Hybrid system.
- the Yeast Two Hybrid system was performed by the yeast transformation method (Pro. Natl. Aca. Sci. USA, 88: 9578_9582, 1991) using the MATCHMAKER system (CLONTECH).
- the library used for Her screening was a human cartilage-derived cDNA inserted into the pACT2 vector (pACT2-Y). After a heat shock of 42 ° (: 15 minutes), pGBT9-Syno dTM or pGBT9_Syno Ringte.O / z g) and pACT2-Y (20 / g) were introduced into yeast strain Y190.
- Escherichia coli strain HB101 was transformed with the extracted plasmid DNA, spread on an M9 plate (-Leu), and cultured at 37 ° C for 2 days. The appearing colonies were cultured in a 20 g / ml LB medium with shaking at 37 ° (16 hours), and plasmid DNA was extracted by Al-Li-SDS method.
- This example is an example in which Synoviolin and Herp are bound in vitro.
- a pcDNA3-Flag-Syno dTM in which 1854 bp was inserted from 706b of TNT-coupled Translation System (Promega) and Synoviolin was prepared.
- in vitro translation was performed, and (i) Flag-Syno dTM fusion protein, (ii) A GST fusion protein of Herp and (iii) a fragmented GST fusion protein of Herp were prepared (Fig. 2).
- “aa” indicates the position number of the amino acid sequence
- UBQ indicates the ubiquitin domain.
- fusion proteins and (iv) the GST protein as a control 20mM Hepes (pH7.9), lOOmM NaCl , ImM EDTA, 0.05% Tween, 5% Glycerol, ImM DTT, 0.2mM NaV0 4, 5mM NaF, a ImM PMSF
- the reaction was performed at 4 ° C for 16 hours.
- the reaction product was subjected to SDS-PAGE, and radioactivity was detected with an image analyzer (BAS2000, Fujix).
- This example is an example in which Synoviolin and Herp are bound in vivo.
- the gene was transfected by g.
- Cells were collected 24 hours after gene transfer, dissolved in Lysis buffer, and immunoprecipitated with anti-HA and anti-Flag antibodies at 4 ° C overnight.
- the bound and free proteins were separated by centrifugation and detected by Western blotting.
- Anti-HA and anti-Flag antibodies were used for detection.
- This example is an example in which the influence of a ⁇ -secretase inhibitor on the cell growth activity of synoviolin-deficient cells was confirmed.
- Synoviolin transgenic mice wild type mice
- synoviolin gene fetal fibroblasts obtained from deficient mice (MEFs)
- MEFs deficient mice
- the cultured cells were treated with a ⁇ -secretase inhibitor (Z-Leu-Leu-Nle_CHO, Wako), cultured for 24 hours, added with Alamer Blue, and measured for absorbance after 2 hours.
- Figure 5 shows the results.
- the black column shows cells derived from wild-type mice
- the white column shows cells derived from Synoviolin-deficient mice.
- the effect of the T / -secretase inhibitor is more pronounced than in cells from wild-type mice.
- Tuni Represents tunicamycin.
- FIG. 5 shows that synoviolin-deficient mouse fetal fibroblasts (Syno- ⁇ ), which inhibited ⁇ -secretase activity, suppressed cell proliferation activity compared to synoviolin mouse fetal fibroblasts (Syno + / +).
- Syno- ⁇ synoviolin-deficient mouse fetal fibroblasts
- Syno + / + synoviolin mouse fetal fibroblasts
- the minimum binding site to Synoviolin was determined for the Synoviolin substrate candidate molecule Herp obtained from the human cartilage cDNA library by Yeast Two Hybrid Screening using Synoviolin as the Bait. That is, fragmented inserts were produced by PCR using pcDNA3 Flag or Herp incorporated in the HA vector as type III. For the purpose of GST Pull Down assay, Synoviolin and Herp were fragmented and inserted into pGEX and pcDNA3 vector.
- Herp was shown to bind to Synoviolin, and the identification of the region (between 16 :! and 200 in the amino acid sequence) that binds Synoviolin on the Herp protein was in progress. In this example, the following experiment was performed to determine what effect the deletion of this region would have on the binding between Herp and Synoviolin.
- the portion encoding the amino acids 161 to 200 on the Herp gene was deleted by PCR to produce the Herp (-bind) gene (FIG. 7, top). Then, an HA tag was added to the N-terminus of this gene and inserted into the pcDNA3 vector. Subsequently, in HEK293T cells, Herp with HA tag, Herp (-bind), and empty vector were each strongly expressed with synoviolin with FLAG tag. Twenty-four hours later, whole cell extract (WCE) was extracted, the expression of each protein was confirmed, and immunoprecipitation was performed with an anti-HA antibody or an anti-FLAG antibody.
- WCE whole cell extract
- Herp was examined as a substrate for Synoviolin.
- the experimental method is as follows.
- Herp has been shown to bind intracellularly to synoviolin in yeast two-hybrid and GST-pull down experiments.
- Herp is an endoplasmic reticulum transmembrane protein with UBL at the N-terminus, and it has been reported that Herp expressed in cells is polyubiquitinated (Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocystei ne-respondent Genes in Vascular Endothelial Cells Identified by Differential Display Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22; 271 (47): 29659.29 665). It was also observed that Herp protein in Synoviolin () MEF cells was more accumulated than in Synoviolin (+ / +) MEF cells (Fig. 8A). Therefore, Herp was considered to be a possible substrate for Synoviolin.
- amino acid sequence consisting of LKAHLSRVYPERPR (SEQ ID NO: 20), which is the 37th to 50th region of the amino acid sequence of Herp, was used as the recognition site of the anti-Herp (N) antibody.
- Herp is a substrate for synoviolin and is converted to autoubiquitination.
- HA-Ubiquitin / pcDNA3 or Synoviolin / pcDNA3 were used, respectively, using various Herp mutant constructs with FLAG tag (Fig.8C). Strongly expressed.
- WCE whole cell extract
- Herp wild-type when ubiquitin alone was strongly expressed, or when ubiquitin and synopiolin were simultaneously overexpressed, a band of polyubiquitination was observed. In addition, when ubiquitin and synoviolin were overexpressed simultaneously, the ubiquitin of Herp became weaker than when ubiquitin alone was overexpressed, indicating that the degradation of ubiquitinated Herp was enhanced. Was. On the other hand, in Herp (-bind), no ubiquitin band was detected when either ubiquitin was overexpressed or when ubiquitin and synoviolin were overexpressed simultaneously.
- Herp the ubiquitin and synoviolin simultaneously strongly expressed the Herb (-UBL) Ub band more strongly than the case where ubiquitin alone was strongly expressed (FIG. 8B). Therefore, the Herp UBL region was thought to be essential for synoviolin binding to synoviolin, but not for ubiquitination but for degradation.
- the present invention provides a method for suppressing secretase activity.
- the present invention provides a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits secretase activity.
- the pharmaceutical composition of the present invention is useful as an agent for treating a cerebral nervous system disease such as Alzheimer's disease.
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Abstract
本発明は、セクレターゼ活性を抑制する方法を提供する。セクレターゼ活性を抑制するには、セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する方法、又はシノビオリンをHerp(homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1)と結合させる方法などが採用される。
Description
明 細 書 セクレターゼ活性を抑制する方法 技術分野
本発明は、 セクレターゼ活性を抑制する方法および医薬組成物に関する。 具体的には、 シノビオリンの発現を抑制してセクレターゼ阻害剤の感受性を 促進することによりセクレターゼ活性を抑制する方法、 及ぴシノビォリンを Herpと結合させることによりセクレターゼ活性を抑制する方法、 並びに、 セ クレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物に関する。 背景技術
シノビォリンは、 リゥマチ患者由来滑膜細胞に存在する膜タンパク質とし て発見された新規タンパク質である （WO02/05207) 。 遺伝子改変動物を用 いた研究により、 骨 ·関節の発生および関節症の発症に同因子が直接関与す ることが明らかとなったことから、 シノビオリンは正常な骨形成又は四肢の 発達に貢献する活性を有するタンパク質であると考えられる。
シノビオリンの発現は、 骨 ·関節にとどまらず全身にュビキタスにみられ るため、 シノビオリンの生体内での機能を解析するためには、 シノビオリン と結合する因子の探索が有力な手法となる。 特に、 シノビォリンの基質タン パク質を検出することは、 シノビオリンが関与する細胞内シグナル伝達経路 の同定に重要な手係りになると考えられる。
そこで、 本発明者は、 シノビオリンがどのような細胞内シグナル伝達経路 に関わっているかを解明するために、 シノビオリンを Bait とした Yeast Two Hybrid法によりシノビオリンと結合する因子の探索を行なった。 その 結果、 Herp (homocysteine "lndusiole endoplasmic reticulum stress- indusible ubiquitin-like domain member 1)と呼ばれるタンパク質がシノビ ォリンと相互作用をもつ分子として同定された。 Herp とは、 1996 年に Miyata らによって血管内皮細胞のホモシスティン応答性遺伝子の産物とし
て発見されたタ ンパク質である （ Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocysteine-respondent Genes in Vascular Endothelial Cells Identified by Differential Display Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22； 271(47): 29659-29665) 。
その後の研究によって、 Herp は、 小胞体ストレスによって発現が誘導さ れ、 構造的には N末端側に ubiquitin-like domain (UBL) をもつ膜タンパ ク質であることが明らかとなった （Kokame K, Agarwala KL, Kato H, Miyata T. Herp, a New Ubiquitin-like Membrane Protein Induced by Endoplasmic Reticulum Stress. J. Biol. Chem. 2000 Oct 20; 275(42): 32846-32853) 。 また、 Herp は、 家族性アルツハイマー病 (FAD) の原因 遺伝子とされているプレセニリン （PS) と相互作用をもち /3 -アミロイ ドタ ンパク質 (A ） の膜内切断に関わるタンパク質分解酵素である γ -セクレタ ーゼ （ 0/ -secretase ) の活性を上昇させるという ことが報告されている (Sai X， awamura Y, Kokame K， Yamaguchi H, Shiraishi H， Suzuki R, Suzuki T， Kawaichi M, Miyata T， Kitamura T, Strooper BD, Yanagisawa K, Komano H. J. Biol. Chem. 277(15):12915'12920) 。
アルツハイマー病は、 高齢化が進む現代において高い関心が払われている 疾患の一つである。 その最も重要な特徴は、 脳に老人斑、 すなわち繊維状の -アミロイ ドタンパク質 （A i3 ) の沈着が観察されることである。 そして、 タンパク質は、 アミロイ ド前駆体タンパク質 （ΑΡΡ) が j8 -セクレターゼ と γ -セクレターゼによって切断されることにより生じるタンパク質であり、 アルツハイマー病患者では、 この切り出しが増加している。
従って、 セクレターゼの酵素活性を阻害する物質は、 アルツハイマー病の 治療薬として注目され、 世界中でスクリーニングが行われている。
しかし、 候補物質は幾つか得られているものの、 未だにセクレターゼ阻害 剤の開発は成功していない。 発明の開示
本発明は、 脳神経疾患、 特にアルツハイマー病を治療するために有用な薬
剤を提供することを目的とする。
本発明者は、 上記課題を解決するため鋭意研究を行なった結果、 セクレタ ーゼ活性を抑制する物質に着目し、 当該物質を用いると、 A/3の蓄積を抑制 してアルツハイマー病を治療し得る知見を見出し、 本発明を完成するに至つ た。
すなわち、 本発明は、 以下の通りである。
(1) セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物。
(2) セクレターゼが j8 -セクレターゼ又は γ-セクレターゼである （1) 記 載の医薬組成物。
(3) セクレターゼ活性を抑制する物質が、 セクレターゼ阻害剤の感受性を 促進する物質である、 （1) 又は （2) 記載の医薬組成物。
(4) セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質が、 シノビォリンの発現 抑制物質である （3) 記載の医薬組成物。
(5) シノビオリンの発現抑制物質が、 シノビオリンをコ一ドする遺伝子に 対する siRNA又は shRNAである （ 4 ) 記載の医薬組成物。
(6) シノビオリンをコードする遺伝子が、 配列番号 1に示される塩基配列 を含むものである （5) 記載の医薬組成物。
( 7 ) siRNA 力 S、 配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とす るものである （5) 記載の医薬組成物。
(8) 一部の配列が、 配列番号 3〜 16に示す塩基配列から選ばれる少なく とも 1つである （7) 記載の医薬組成物。
(9) セクレターゼ活性を抑制する物質がシノビオリンである （1) 又は （ 2) 記載の医薬組成物。 シノビオリンとしては、 例えば配列番号 2に示さ れるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
(10) 脳神経系疾患を治療するための （1) 〜 （9) のいずれか 1項に記 載の医薬組成物。
(1 1) 脳神経系疾患がアルツハイマー病である （10) 記載の医薬組成物。
(12) セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することを特徴とする、 セレク
ターゼ活性を抑制する方法。
(1 3) セクレターゼ阻害剤の感受性の促進が、 シノビォリンの発現を抑制 することによるものである、 （1 2) 記載の方法。
(14) シノビオリンを Herp と結合させることを特徴とする、 セレクタ一 ゼ活性を抑制する方法。
( 1 5) Herp のシノビォリ ンとの結合領域が、 Herp のアミノ酸配列の 161~200 番目のアミノ酸残基で示される領域である、 （1 4) 記載の 方法。
(1 6) セクレタ一ゼが ]3-セクレターゼ又は γ-セクレターゼである ( 1 2 ) 〜 （1 5) のいずれか 1項に記載の方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 シノビオリンの全長構造と baitに用いた Syno dTM及ぴ Syno Ring の構造を示す模式図である。
図 2は、 Herpの全長構造と断片化した Herpの構造を示す模式図である。 図 3は、 Flag-Syno dTMと Herp各コンストラクトとの GST融合タンパク質 との結合実験の結果を示す図である。
図 4は、 HA/Synoと Flag/Herpとの免疫沈降実験の結果を示す図である。 図 5は、 野生型及'ぴシノピオリン欠損マウス胎児繊維芽細胞における γ -セ クレターゼ阻害剤の効果を示す図である。
図 6は、 Pull down assay におけるシノビォリンと Herpとの関係を示す図 である。
図 7は、 in vivoにおけるシノビオリンと Herpとの結合領域を示す図である 図 8 Aは、 MEF細胞における Herpの発現を示す図である。
図 8 Bは、 Herpのュビキチン化を示す図である。
図 8 Cは、 Herpの解析に用いた constructsを示す図である。
図 9は、 MEFにおける γ-セクレターゼ活性を示す図である (
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明者は、 シノピオリンがアルツハイマー病の発症機序に関与する可能 性に着目し、 シノビォリンの発現をノックアウトした細胞において、 セクレ ターゼ阻害剤の感受性が高まることを明らかにした。 このことは、 シノビォ リンの発現を阻害させた状態において、 セクレターゼ阻害剤の感受性が促進 されることを意味しており、 シノビオリンの欠失を介してセクレターゼ阻害 剤の感受性が促進されることを示すものである。 そして、 セクレターゼ阻害 剤の感受性を促進する物質を用いることが、 アルツハイマー病の治療につな がることを実証した。
また、 本発明は、 シノビオリンを Herp蛋白質と結合させると、 Herp蛋白質 がュビキチジ化されて分解され、 その結果、 セクレターゼ活性が低下するこ とを見出した。 1 . 概要
前述の通り、 アルツハイマー病においては、 セクレターゼ （例えば セ クレターゼ活性） によって ΑΡΡ が切り出され、 が蓄積して老人斑が形 成される。 そこで本発明者は、 セクレターゼがアルツハイマー病の発症機序 に関与する点に着目し、 セクレターゼ活性を抑制することによって の蓄 積並びに老人斑の形成を抑制するというプロセスの構築を考えた。
従って、 本発明はセクレターゼ活性を抑制することにより、 Α ]3の蓄積を 抑えることを特徴とする。 そして、 Α ]3蓄積を抑えることで、 老人斑の形成 を抑制し、 アルツハイマー病の治療を行うことが可能となる。
シノビォリンは全身に発現が認められるタンパク質であり、 生体において 必須な機能を司ることが示されている。 このため、 シノビォリンの生体内で の機能を解明することが求められていた。 一般に、 タンパク質の機能を明ら かにするには、 シノピオリンと結合する因子の探索が有力な手法のひとつに 挙げられ、 特に、 シノビォリンの基質タンパク質を検出することは、 シノビ オリンが関与する細胞内シグナル伝達経路の同定に重要な手係りになると考
えられる。
そこで、 シノビオリンがどのような細胞内シグナル伝達経路に関わってい るかを解明するために、 本発明者は、 前述の通り、 酵母内での結合実験及び
GST Pull- down assay により、 シノビォリンと■ Herp が相互作用をもつこ とを示した。 次に細胞内での相互作用を確認するために、 シノビォリンと Herp を HEK293 細胞に共発現させ免疫沈降によって観察したところ、 酵 母内 · in vitroアツセィの結果と同様にシノビオリンと Herpの相互作用が みられた。 このことは、 シノビォリンが Herp と相互作用することを裏付け るものである。 そして、 タンパク質構造予測システムにより、 シノビオリン に RING finger モチーフの存在が示された。 このモチーフはタンパク質の 分解に関わる E3 ュビキチン-タンパク質リガーゼに存在することが知られ ている。 また： RING finger モチーフは、 E2ュビキチン結合酵素の結合部位 と考えられている。
従って、 シノビオリンは、 アルツハイマー病の発症機序、 特に、 セクレタ ーゼ活性に関与すると考えられた。
ここで、 本発明においてセクレターゼの活性を抑制するための機構として、 セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する場合と、 シノビオリンを Herpタン パク質 （以下、 単に 「Herp」 ともいう） に結合する場合が考えられる。
前者は、 セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することによりセクレターゼ の活性を抑制し、 A i3の蓄積を抑えるというものであり、 後者は、 シノビォ リンを Herp に結合させて Herp のュビキチン化を起こし、 Herp を分解さ せることにより A i3の蓄積を抑えるというものである。
以下、 それぞれの態様について説明する。 2 . セクレターゼ阻害剤の感受性の促進
本発明者は、 セクレターゼ阻害剤の感受性に着目し、 当該阻害剤の感受性 を高めることによって A i3の蓄積並びに老人斑の形成を抑制するというプロ セスの構築を考えた。 そして、 シノビォリンがアル.ッハイマー病の発症機序 に関与する可能性に着 gし、 シノビオリンの発現をノックアウトした細胞に
おいて、 セクレターゼ阻害薬の感受性が高まることを明らかにした。 このこ とは、 シノビオリンの発現を阻害させた状態では、 セクレターゼ阻害剤の感 受性が促進されることを意味しており、 シノビオリンの欠失を介してセクレ ターゼ阻害剤の感受性が促進されることを示すものである。 そして、 セクレ ターゼ阻害薬の感受性を促進する物質を用いることが、 アルツハイマー病の 治療につながることを実証した。
ここで、 「セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する」 とは、 セクレターゼ 阻害剤が有効に機能するようにその薬物効果を高めることを意味する。
( 1 ) シノビォリン発現阻害及び活性阻害
セクレターゼ阻害剤の感受性を高めるためには、 シノビォリンの発現を阻 害する方法が採用される。
シノビォリンの発現阻害には、 特に限定されるものではないが、 例えば
RNA干渉 （RNAi) を利用することができる。 シノビオリン遺伝子に対す る siRNA(small interfering RNA)を設計及び合成し、 これを細胞内に導入 させることによって、 RNAiを引き起こすことができる。 '
RNAi とは、 dsRNA(double- strand RNA)が標的遺伝子に特異的かつ選択 的に結合し、 当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害 する現象である。 例えば、 dsRNA を細胞内に導入すると、 その RNA と相 同配列の遺伝子の発現が抑制 （ノックダウン） される。
siRNAの設計は、 以下の通り行なうことができる。
(a) シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではな く、 任意の領域を全て候補にすることが可能である。 例えば、 ヒ トの場合で は、 GenBank Accession number AB024690 (配列番号 1 ) の任意の領域を 候補にすることができる。
(b) 選択した領域から、 AAで始まる配列を選択し、 その配列の長さは 19 〜25塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。 その配列の GC含量は、 例え ば 40〜60%となるものを選択するとよい。 具体的には、 配列番号 1に示さ れる塩基配列のうち、 以下の塩基配列を含む DNAを siRNAの標的配列と して使用することができる。 特に、 （i) (配列番号 3 ) 、 (ii) (配列番号
4 ) 、 (vi) (配列番号 8 ) 、 (vi i) (配列番号 9 ) 、 (vi i i) (配列番号 1 . 0 ) を標的とすることが好ましい。
(i) AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA (配列番号 3 )
(i i) AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG (配列番号 4 )
(i i i) AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT (配列番号 5 )
(iv) AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT (配列番号 6 )
(v) AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT (配列番号 Ί )
(vi) AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA (配列番号 8 )
(vi i) AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA (配列番号 9 )
(vi i i) AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG (配列番号' 1 0 )
(ix) AA CATCCACACACTGCTGGAC GC (配列番号 1 1 )
(x) AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC (配列番号 1 2 )
(xi) AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT (配列番号 1 3 )
(xi i) AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG (配列番号 1 4 )
(xi i i) AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT (配列番号 1 5 )
(xiv) AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA (配列番号 1 6 )
siRNAを細胞に導入するには、 in vitroで合成した siRNAをプラスミ ド DNA に連結してこれを細胞に導入する方法、 2本の RNA をァニールする 方法などを採用することができる。
また、 本発明は、 RNAi効果をもたらすために shRNAを使用することも できる。 shRNA とは、 ショートヘアピン RNA(short hairpin RNA)と呼ば れ、 一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ 構造を有する RNA分子である。
shRNA は、 その一部がステムループを構造を形成するように設計するこ とができる。 例えば、 ある領域の配列を配列 A とし、 配列 Aに対する相補 鎖を配列 B とすると、 配列 A、 スぺーサ一、 配列 Bの順になるようにこれ らの配列が一本の； RNA鎖に存在するようにし、 全体で 45〜60塩基の長さ となるように設計する。 配列 A は、 標的となるシノビオリン遺伝子 （配列 番号 1 ) の一部の領域の配列であり、 標的領域は特に限定されるものではな
く、 任意の領域を候補にすることが可能である。 そして配列 Aの長さは 19 〜25塩基、 好ましくは 19〜21塩基である。
( 2 ) セクレターゼ阻害活性
セクレターゼ阻害剤の感受性を評価する方法として、 アルツハイマー病患 者の脳での感受性測定実験は倫理上極めて困難であり、 他の評価系を用いる 必要がある。 そこで、 本発明者は、 細胞にセクレターゼ阻害剤を処置し、 当 該細胞の増殖活性をセクレターゼ阻害の指標とした評価系を用いる。 ここで、 セクレターゼの種類は特に限定されるものではなく、 J3 -セクレターゼ、 γ - セクレターゼが挙げられる。 従って、 セクレターゼ阻害剤は、 セクレタ ーゼ阻害剤及び γ -セクレターゼ阻害剤のいずれでもよい。 セクレターゼ阻 害剤としては、 限定されるものではないが、 例えば L-685,458 ((株)ぺプチ ド研究所） 、 （3，5-Difluorophenylacetyl)-Ala-Phg-OBut [DAPT] ((株)ぺプチ ド研究所）、 Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-SerGlu-Val-Asn-Sta-Val-Ala-Glu-Phe ((株)ペプチド研究所） 、 Z-Leu-Leu-Nle-CHO (Wako 社）などが挙げられる。 細胞の増殖活性が抑制されたときに、 セクレターゼ活性が阻害されたと判 断する。 つまり、 細胞の増殖活性がより抑制されるほど、 セクレターゼ阻害 剤の作用、 感受性が強いことになる。 細胞は、 野生型のシノビオリン遺伝子 をもつマウス、 及び、 シノビオリン遺伝子をノックアウトさせたシノビオリ ン欠損マウスの胎児繊維芽細胞 (MEF)を用いて、 シノビオリンの発現の有無 によるセクレターゼ阻害剤の感受性の変化を比較する。
上記シノビオリン欠損細胞を用いて阻害剤の効果を調べた結果、 シノピオ リンを欠損した細胞の方が、 シノビオリンを持っている野生型の細胞に比べ 細胞増殖の低下がみられた。 すなわち、 シノビオリンを欠失すると、 セクレ ターゼ阻害剤の感受性が促進したことを意味する。
( 3 ) 医薬糸且成物
本発明において作製された shRNA、 siRNAは、 シノビオリンの発現を抑 制する物質であり、 セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質を含む医薬 組成物 （特にアルツハイマー病などの脳神経系疾患の遺伝子治療剤） として 使用することができる。
本発明の医薬組成物を脳神経系疾患の遺伝子治療剤として使用する場合は、 月 ¾ (大脳、 間脳、 中脳、 小脳） 、 延髄、 脊髄などの中枢神経系を対象として 適用される。
上記脳神経系疾患は、 単独であっても、 併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、 本発明の医薬 組成物を注射により直接投与する方法のほか、 核酸が組込まれたベクターを 投与する方法が挙げられる。 上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクタ 一、 アデノ関連ウイノレスベタター、 へノレぺスウィルスベクター、 ワクシニア ウイノレスベクター、 レ ト ロウイノレスベタター、 レンチウイ/レスべクター等が 挙げられ、 これらのウィルスベクターを用いることにより効率よく投与する ことができる。
また、 本発明の医薬組成物をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 その小胞体を投与することも可能である。 siRNAや shRNA を保持させた 小胞体をリポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られ る細胞を例えば静脈内、 動脈内等に全身投与する。 脳等に局所投与すること もできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型によって異なるが、 例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1 日 1 回 あたり 106〜： L013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
siRNA又は shRNA を目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺 伝子導入キット （例えばアデノエクスプレス ： クローンテック社） を用いる こともできる。
3 . シノピオリンと Herpとの結合
上記したように、 Herp は、 小胞体ス トレスによって発現が誘導され、 構 造的には N末端側に UBLをもつ小胞体膜貫通タンパク質であり、 細胞内在 性の Herpはポリュビキチン化されていることが分かっている。 本発明者は、 この Herp に着目し、 当該 Herp を分解することによって、 γ -セクレター ゼ活性を抑制して A j3の膜内切断を抑えることにより、 A の蓄積並びに老
人斑の形成を抑制するというプロセスの構築を考えた。
一方、 上記のように、 シノビオリンを Bait とした Yeast Two Hybrid法 によりシノビオリンと結合する因子の探索を行なったところ、 シノビオリン と Herpが相互作用をもつことが示され、 この相互作用は細胞内でも観察さ れた。 そこで、 発明者らはシノビオリンを Herpに結合させることにより、 セクレターゼ活性を抑制する方法を検討した。
( 1 ) シノビォリンと Herpの最小結合部位の決定
シノビォリンと Herp との最小結合部位は、 Herp の各種切断断片を用い て、 その断片とシノビオリンとの結合試験を行うことにより決定することが できる。 Herp を用いてシノビォリンとの結合実験を行うと、 Herp のシノ ビオリンとの最小結合部位は、 ヒ ト Herp遺伝子 （配列番号 1 7 ) によりコ ードされるアミノ酸配列 （配列番号 1 8 ) のうち第 161〜200番目の 40ァ ミノ酸残基にあたる領域である （下記配列） 。
GYTPYGWLQLSWFQQIYARQYYMQYLAATAASGAFVPPPS (配列番 号 1 9 ) ここで、 本発明において使用されるシノビオリンは、 上記配列番号 1によ りコードされるアミノ酸配列 （配列番号 2 ) を有するものであってもよく、 また、 当該アミノ酸配列において 1又は数個のアミノ酸が欠失、 置換又は付 加されたアミノ酸配列であって Herpをュビキチン化により分解させる活性 を有するものでもよい。 本発明においては、 上記欠失、 置換等の変異の導入 は、 公知の部位特異的突然変異誘発法により行うことができる （例えば GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen 社製) 、 TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System ( MutarrK、 Mutan-Super Express Km等 (Takara社製)を使用することができる。
培養細胞におけるシノビオリンとの結合に必須な Herp タンパク質領域を 同定するには、 以下の通り行うことができる。
ヒ ト Herp に関して、 上記 40 アミノ酸残基の領域を欠失させた Herp (- bind)遺伝子を作製し、 この遺伝子を適当なベクターに挿入して HEK293T
等の細胞に導入し、 シノビォリンと強発現させると、 欠失部位がシノビオリ ンと Herp との結合に必須の部位であるか否かが分かる。 免疫沈降試験を行 うためにこの Hei'p(-bind)の N端に HA tagをつけて標識し、 同様に、 シノ ビオリンの標識には、 FLAG tagをつけてもよレ、。
結果の解析は、 強発現後に whole cell extract (WCE)を抽出して、 タンパ ク質の発現を確認した上、 抗 HA抗体あるいは抗 FLAG抗体で免疫沈降を 行えばよい。 得られた免疫沈降産物をウェスタンプロット法で試験すると、 Herpはシノビォリンと結合するが、 Herp (-bind)はシノビォリンと結合しな いため、 Herpタンパク質上の 161番目から 200番目アミノ酸領域 （配列番 号 1 9 ) はシノビォリンとの結合に必須であることがわかる。
( 2 ) Herpのュビキチン化による分解の確認
Herp は、 シノビォリンと結合することによりュビキチン化されて分解す る。 従って、 Herp がシノビォリンの基質であるか否かは、 Herp のポリュ ビキチン化により確認することができる。 すなわち、 HEK293T細胞におい て、 FLAG tagをつけ、 さらにアミノ酸残基の一部を変異させた Herp変異 体を作製して、 HA-Ubiquitin およぴシノビオリンを発現させる。 その後、 細胞抽出物 （WCE)を抽出し、 ウェスタンプロット法で各タンパク質の発現 を確認した後、 抗 -HA抗体による免疫沈降を行うことにより、 Herpが細胞 内でポリュビキチン （poly-Ubiquitin； Ub) 化されているか否かを確認す る。
Herp 野生型においては、 ュビキチンだけ強発現させた場合、 またはュビ キチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合に、 ポリュビキチン化のバ ンドが観察される。 また、 ュビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた 場合は、 ュビキチンだけ強発現させた場合よりも Herp と Herp 変異体の Ub 化バンドは弱いことから、 Ub 化された Herp の分解が亢進しているこ とが分かる。 一方、 Herp(-bind)ではュビキチンだけ強発現させた場合、 お よびュビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合のいずれにおいて も、 ポリュビキチン化のバンドは検出されない。 また、 Herp からュビキチ
ン領域（UBL)を欠失させた Herp(-UBL)の場合は、 ュビキチンとシノビオリ ンを同時に強発現させた場合の方がュビキチンだけ強発現させた場合より Herp(-UBL)の Ub化バンドが強い。 これらのことから、 Herpの UBL 領域 はシノビオリンとの結合ゃシノビオリンによる Ub化に必須ではないが、 分 解に必須であることがわかる。
( 3 ) MEFにおける γ -セクレターゼ活性の比較
アルツハイマー病におけるシノビオリンの関与は、 シノビオリンをノック アウトした細胞 （例えば MEF (syno (- /- )) を用いて、 野生型細胞 （例え ば MEF (syno (+/+)) における y -セクレターゼ活性と比較することにより、 検討することができる。 すなわち、 MEF 細胞を溶解バッファーで処理して 細胞溶解液とした後、 反応バッファーと蛍光標識された基質を加えて酵素反 応を行い、 所定の ί)起波長、 測定波長で蛍光を測定すると、 MEF において γ -セクレターゼ活性の増加の有無を確認することができる。
本発明においては、 シノビオリンを Herp に結合させると、 Herp が分解 されて セクレターゼ活性を抑制することができる。 なお、 Herpは、 FAD の原因遺伝子とされているプレセ二リン （PS) と相互作用をもち、 複合体を 形成することにより、 γ ·セクレターゼの活性を上昇させることも分かって いる。 従って、 シノビオリンと Herp の結合体及びシノビオリンと Herp - PS 複合体との結合体を用いると、 アルツハイマー病の治療につながること が実証されている。
( 4 ) 医薬組成物
本発明において、 シノビォリンを Herp又は Herp - PS複合体に結合さ せると、 ュビキチン化により Herpの分解を引き起こし、 ひいてはアルッハ イマ一病の原因となる Α |3タンパク質の蓄積を抑制することから、 シノビォ リンは、 セクレターゼ活性の抑制に関与する物質であり、 アルツハイマー病 などの脳神経系疾患を治療するための医薬組成物として使用することができ る。
本発明の医薬組成物を脳神経系疾患の治療剤として使用する場合は、 脳
(大脳、 間脳、 中脳、 小脳） 、 延髄、 脊髄などの中枢神経系を対象として適 用される。 本発明の医薬組成物は、 そのまま患部に適用することもできるし, あらゆる公知の方法、 例えば、 静脈、 筋肉、 腹腔内又は皮下等の注射、 ある いは鼻腔、 口腔又は肺からの吸入、 経口投与、 カテーテルなどを用いた血管 内投与等により対象となる細胞や臓器に導入することもできる。
また、 例えば凍結などの方法により扱いやすくした後、 そのまま若しくは 賦形剤、 増量剤、 結合剤、 滑沢剤等公知の薬学的に許容される担体、 公知の 添加剤 （緩衝剤、 等張化剤、 キレート剤、 着色剤、 保存剤、 香料、 風味剤、 甘味剤等が含まれる。 ） などと混合することができる。
本発明の医薬組成物は、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 顆粒剤、 丸剤、 液剤、 シロップ剤等の経口投与剤、 注射剤、 外用剤、 坐剤、 点眼剤等の非経口投与 剤などの形態に応じて、 経口投与又は非経口投与することができる。 好まし くは、 筋肉、 腹腔等への局部注射、 静脈への注射等が例示される。
投与量は、 有効成分の種類、 投与経路、 投与対象、 患者の年齢、 体重、 性 別、 症状その他の条件により適宜選択されるが、 一日の維持量として成人 lkg あたり約 O.lmg〜約 lOOmgであり、 好ましくは 0.1mg〜10mg、 より 好ましくは 0.1mg〜1.0mg である。 シノビオリンは、 1 日 1回投与するこ ともでき、 数回に分けて投与することもできる。
本発明の医薬組成物 （シノビオリン） を生体内で遺伝子発現させて使用す る場合 （遺伝子治療の場合） は、 前記遺伝子治療剤について述べたのと同様 に、 シノビオリン遺伝子を注射により直接投与する方法のほか、 シノビオリ ン遺伝子が組込まれたべクタ一を投与する方法が挙げられる。 上記べクタ一 としては、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ウィルスベクター、 ヘルべ スゥイノレスベクター、 ワクシニアウイノレスベタター、 レ ト ロゥイノレスべクタ —、 レンチウィルスベクター等が挙げられ、 これらのウィルスベクターを用 いることにより効率よく投与することができる。
ここで、 本発明において使用されるシノビオリン遺伝子は、 上記配列番号 1に示す塩基配列を有するものに限定されるものではなく、 当該塩基配列に 相補的な配列とス トリンジヱントな条件下でハイプリダイズし、 かつ、
Herp との結合活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
「ストリンジェントな条件」 とは、 ハイブリダィゼーシヨンにおいて洗浄時 の塩濃度が 100〜500 mM、 好ましくは 150〜300 mMであり、 温度が 50〜 70°C、 好ましくは 55〜65°Cの条件を意味する。
また、 シノビオリン遺伝子をリボソームなどのリン脂質小胞体に導入し、 その小胞体を投与することも可能である。 上記遺伝子を保持させた小胞体を リポフエクシヨン法により所定の細胞に導入する。 そして、 得られる細胞を 例えば静脈内、 動脈内等に全身投与する。 脳等に局所投与することもできる。 シノビオリン遺伝子の投与量は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型によって異なるが、 例えばアデノウイルスの場合の投与量は 1 日 1 回 あたり 106〜： L013個程度であり、 1週〜 8週間隔で投与される。
シノビオリン遺伝子を目的の組織又は器官に導入するために、 市販の遺伝 子導入キット （例えばアデノエクスプレス ： クローンテック社） を用いるこ ともできる。 以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら 実施例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
本実施例は、 Yeast Two Hybrid systemによる Herpのスクリーニングの実 施例である。
Yeast Two Hybrid systemは、 MATCHMAKER system (CLONTECH) を用い、 酵母形質転換法 (Pro.Natl.Aca.Sci.USA，88:9578_9582， 1991)で行つ た。
シノビオリン cDNAの 706bp (236番目のアミノ酸） から 1851bp(617番目の アミノ酸)又は 805bp(269番目のアミノ酸)から 1260bp(420番目のアミノ酸)の 末端を EcoR I/Xho Iとし pGBT9 vectorの EcoR I/Xho Iサイトに挿入した （ 以下、 シノビォリンの 706bp (236番目のアミノ酸） から 1851bp(617番目のァ ミノ酸)を Syno dTM、 805bp(269番目のアミノ酸)から 1260bp(420番目のアミ ノ酸)を Syno Ringとレ、う。 図 1参照。 ） 。 なお、 図 1において 「bp」 は塩基
配列の位置番号を示している。
Her のスクリ一-ングに用いるライブラリ一はヒ ト軟骨由来の cDNAを pACT2 vectorに挿入したものを用いた (pACT2-Y)。 42° (：、 15分のヒート ショ ックの後、 酵母株 Y190 に pGBT9-Syno dTM 又は pGBT9_Syno Ringte.O /z g)、 pACT2-Y(20 / g)を導入した。
各ベクターを導入した γ190を Tris_EDTA(pH7.5)緩衝液 (ΤΕ)で洗浄後、 SD-Trp-Leu-Hisプレートに TEで希釈した Y190の溶液を広げ、 30°Cで 10 日培養した。 現れてきたコロニーに対し、 0.5mg/mlの X'gal を基質とする /3ガラクトシダーゼフィルターアツセィを行い、 陽性クローンを検出した。 陽性クローンを SD-Leu-His培地にて 30°Cで 10 日震盪培養し、 アル力 リ -SDS 法 (Methods Enzymol., 194:169-182, 1991)にてプラスミ ド DNA を 抽出した。 抽出したプラスミ ド DNAを大腸菌株 HB101に形質転換し、 M9 プレート（-Leu)に広げ、 37°Cで 2 日培養した。 現れてきたコロニーを 20 g/ml LB培地で 37° (、 16時間震盪培養しアル力リ -SDS法によってプラス ミ ド DNAを抽出した。
抽出したプラスミ ド DNAに揷入されているヒ ト軟骨由来の cDNA断片の 角牟析に【ま BigDye Terminater Cycle Sequencing system Applied Biosystems) を用いた。 シークェンスの解析結果を BLAST により検索し た結果、 ホモシスティン誘導性の小胞体タンパク質 homocysteine - mdusible endoplasmic reticulum stress-md sible ubiquitm-like domain member 1 (ACCESSION No. BC032673 以下、 Herpと略す)を得た。
〔実施例 2〕
本実施例は、 in vitroにおいてシノビオリンと Herpを結合させた実施例で ある。
TNT-coupled Translation System ( Pr omega ) 及ぴシノ ビオリ ンの 706b から 1854bpを挿入した pcDNA3-Flag-Syno dTMを作製した。 これ を用いて in vitro translationを行い、 (i) Flag- Sy no dTM融合タンパク質、
(ii) Herp の GST融合タンパク質、 （iii) 断片化した Herp の GST融合タン パク質を作製した （図 2) 。 図 2において、 「a.a.」 はアミノ酸配列の位置 番号を示し、 UBQはュビキチンドメインを示している。
これらの融合タンパク質及び (iv)対照としての GST タンパク質を 20mM Hepes(pH7.9), lOOmM NaCl, ImM EDTA, 0.05% Tween, 5% Glycerol, ImM DTT, 0.2mM NaV04, 5mM NaF, ImM PMSFを含む結合バッファー に加え、 4°Cで 16時間反応させた。 その反応物について SDS-PAGEを行い、 ィメージアナライザー （BAS2000, Fujix) で放射活性を検出した。
その結果、 Herp-M と Herp-C の GST融合タンパク質と [35S] pcDNA3- Flag-Syno dTMの結合が観察された。
コントロールである GSTと pcDNA3-Flag-Syno dTMとの結合は認められな かった （図 3 ) 。 この結果から、 シノビォリンと Herpは、 タンパク質の相互 作用により結合することが推測された。 〔実施例 3〕
本実施例は、 in vivoにおいてシノビオリンと Herpを結合させた実施例であ る。
HEK293細胞を 10cm dishに 2 X 106cells蒔き、 24時間培養後、 シノビ オリンの lbp から 1854bp を挿入した pcDNA3-HA/Syno、 及ぴ Herp の lb から 1176bpを揷入した pcDNA3_Flag/Herpを、 各 3 μ gずつ遺伝子導 入した。 遺伝子導入して 24時間後細胞を回収し、 Lysis bufferに溶解後、 抗 HA及ぴ抗 Flag抗体で 4°C下終夜免疫沈降を行った。 遠心操作により結 合タンパク質と遊離タンパク質を分け、 ウェスタンプロット法により検出し た。 検出には抗 HA及ぴ抗 Flag抗体を用いた。
その結果、 シノビオリン及び Herpを共発現した細胞では、 抗 HA抗体を 用いて免疫沈降後、 抗 Flag抗体で検出すると Flag-Herpのバンドを確認す ることができた。 また、 抗 Flag抗体を用いて免疫沈降した後、 抗 HA抗体 で検出すると HA-シノビォリンのバンドを確認することができた。 この結 果より、 in vitro条件下と同様にシノビオリンと Herpは、 タンパク質の相
互作用により結合することが推測された （図 4) 。 なお、 図 4において、 IP は免疫沈降に用いた抗体の種類を示し、 WBはゥヱスタンプ口ットに用いた 抗体の種類を示す。 *印は IgG HC (IgG heavy chain, 重鎖） を示してい る。
〔実施例 4〕
本実施例は、 シノビォリン欠失細胞での細胞増殖活性における γ -セクレタ 一ゼ阻害剤の影響を確認した実施例である。
シノビオリン遺伝子導入マウス （野生型マウス） 及びシノビオリン遺伝子 欠損マウスから得られた胎児繊維芽細胞 （MEFs) を、 96well plateに 1 X 103Cells/well になるようにまき、 終夜培養した。 培養後の細胞に γ -セクレ ターゼ阻害剤 （Z-Leu-Leu-Nle_CHO、 Wako) を処理し、 24 時間培養した 後に Alamer Blueを加え、 2時間後に吸光度を測定した。
結果を図 5 に示す。 なお、 図 5において、 黒いカラムは野生型マウス由 来の細胞、 白いカラムはシノビオリン欠損マウス由来の細胞を示している。 シノビオリン欠損マウス由来の細胞では、 T/ -セクレターゼ阻害剤の作用が 野生型マウス由来の細胞よりも顕著である。 なお、 Tuni. はッニカマイシン を表している。
図 5 より、 シノビオリン欠損マウス胎児繊維芽細胞 (Syno-Λ)において Ί - セクレターゼ活性を阻害したものはシノビオリンマウス胎児繊維芽細胞 (Syno + / + )と比較して細胞の増殖活性の抑制がみられた。 このことは、 シ ノビオリンの有無で細胞の γ ·セクレターゼ阻害剤への感受性が変化すると いうこと、 すなわち、 シノビオリンを欠失すると γ -セクレターゼ阻害剤の 感受性が促進されるということを意味する。 そのため、 シノビォリンの抑制 剤はアルツハイマー病の病理過程の第 1 段階とされている A i3の蓄積を調 節することにより、 ァルツハイマー病の治療薬として利用することが出来る。
〔実施例 5〕
本実施例は、 シノビオリンに対する Herpの最小結合部位を決定したもの
である。
すなわち、 シノビオリンを Baitとした Yeast Two Hybrid Screeningに より、 ヒ ト軟骨 cDNAライブラリーより得られたシノビォリンの基質候補 分子 Herpに関して、 シノビォリンとの最小結合部位を決定した。 すなわち、 pcDNA3 Flag又は HAベクターに組み込まれた Herpを銪型とした PCRに よって、 断片化したインサートの作成を行った。 GST Pull Down assayを 目的として、 シノビオリン及び Herpを断片化し、 pGEX及ぴ pcDNA3ベ クタ一に挿入した。
その結果、 Herpのァミノ酸配列番号 161-200と syno dTMが結合する ことが予想された （図 6 ) 。
〔実施例 6〕
本実施例は、 培養細胞におけるシノビオリンとの結合に必須な Herpタンパ ク質領域を同定したものである。
実施例 5の結果より、 シノビオリンと Herpの結合に必要な Herp側のァミノ 酸は 161-200の 40アミノ酸と考えることができる （図 6 ) 。 そこで、 Herpの 1 61-200の 40アミノ酸を除いた Herp(-bind)を作製し、 細胞内でのシノビオリン との結合実験を行なった。
Herpはシノビオリンと結合することが明らかにされ、 Herpタンパク質上シ ノビオリンと結合する領域（アミノ酸配列の 16：！〜 200の間）の同定も進んでい た。 本実施例では、 この領域を欠失した場合に、 Herpとシノビォリンとの結 合にどのような影響が及ぶのかについて、 以下のように実験を行った。
Herp遺伝子上、 161番目から 200番目までのアミノ酸をコードする部分を、 PCR法により欠失させ、 Herp(-bind)遺伝子を作製した （図 7上） 。 そして、 この遺伝子の N端に HA tagを付け、 pcDNA3 vectorに挿入した。 続いて、 H EK293T細胞において、 HA tag付き Herp、 Herp (-bind), 空 vectorをそれぞ れ FLAG tag付きシノビオリンと強発現させた。 24時間後に whole cell extr act (WCE)を抽出し、 各タンパク質の発現を確認した上、 抗 HA抗体或は抗 FL AG抗体で免疫沈降を行った。
150 mM NaClを含む wash bufferで洗浄した免疫沈降産物でゥヱスタンプ 口ット法を行った結果、 Herpはシノビオリンと結合するが、 Herp(-bind)はシ ノビォリンと結合しないことが分かった （図 7下） 。 従って、 Herpタンパク 質上の 161番目から 200番目アミノ酸領域はシノビオリンとの結合に必須であ ることが明らかになった。
〔実施例 7〕
本実施例は、 Herpはシノビオリンの基質であることを検討したものである 実験手法は以下の通りである。
Herpは yeast two-hybrid, GST-pull down実験により、 細胞内においてシ ノビオリンと結合することが明らかになつている。 Herpは N端に UBLを持つ 小胞体膜貫通蛋白質であり、 細胞に発現させた Herpはポリュビキチン化され ていることが報告されている （Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocystei ne-respondent Genes in Vascular Endothelial Cells Identified by Differ ential Display Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22; 271(47): 29659.29 665) 。 また、 シノビオリン （ ） MEF細胞中の Herp蛋白質は、 シノビオリ ン （+/+) MEF細胞中に比べ、 蓄積されていることも観察された （図 8 A) 。 このため、 Herpはシノビオリンの基質である可能性が十分考えられた。
なお、 上記実験において、 抗 Herp(N)抗体の認識部位として、 Herpのアミ ノ酸配列の第 37〜50番目の領域である LKAHLSRVYPERPR (配列番号 2 0 ) からなるアミノ酸配列を用いている。
し力 し、 in vitroのュビキチン反応系においては、 Herpの GST融合タンパ ク質である GST-Herpに関しては、 シノビオリン非存在下でもュビキチン化さ れるバンドが観察された。
そこで、 本実施例では、 Herpがシノビォリンの基質となり、 自己ュビキチ ン化されるのかについて検討した。
HEK293T細胞において、 FLAG tag付き各種 Herp変異 constructs (図 8 C ) を用いて、 それぞれ HA-Ubiquitin/pcDNA3またはシノビオリン /pcDNA3と
強発現させた。
強発現から 24時間後、 細胞から whole cell extract(WCE)を抽出し、 ウェス タンプロット法で各蛋白質の発現を確認した。 そして、 抗 HA抗体による免疫 沈降を行い、 抗 FLAG抗体による Herp蛋白質のポリュビキチン化の有無を検 討した。
Herp野生型においては、 ュビキチンだけ強発現させた場合、 またはュビキ チンとシノピオリンを同時に強発現させた場合、 ポリュビキチン化のバンド が観察された。 また、 ュビキチンとシノビオリンを同時に強発現させた場合 は、 ュビキチンだけ強発現させた場合よりも Herpの Ub化パンドは弱くなつた ことから、 Ub化された Herpの分解が亢進していると思われた。 これに対し、 Herp(-bind)ではュビキチンだけ強発現させた場合、 またはュビキチンとシノ ビオリンを同時に強発現させた場合のいずれも、 ポリュビキチン化のバンド が検出されなかった。 また、 Herp(-UBL)の場合、 ュビキチンとシノビオリン を同時に強発現させた場合の方がュビキチンだけ強発現させた場合より Herp (-UBL)の Ub化バンドが強かった （図 8 B) 。 従って、 Herpの UBL領域はシノ ビオリンとの結合ゃシノビオリンによる Ub化に必須ではないが、 分解に必須 であると考えられた。
〔実施例 8〕
本実施例は、 アルツハイマー病でのシノビォリンの関与を検討するため、 MEF (syno(+/+)及び (-/-)) における γ -セクレターゼ活性の比較を行なつ たものである。
MEF (syno(+/+)及ぴ (-/-)) を溶解バッファーで処理して細胞溶解液と した後、 反応バッファーと、 蛍光標識された基質である合成 APP を加えて、 3 7 °C, 2時間で酵素反応を行なった。 測定は、 励起波長 360nrn、 測定波 長 465nmで蛍光を測定することにより行なった。
その結果、 syno(+/+)に比べて、 syno (― /-)の MEFにおいて、 yセクレ ターゼ活性の増加が見られた （図 9 ) 。
産業上の利用可能性
本発明により、 セクレターゼ活性を抑制する方法が提供される。 また、 本 発明により、 セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物が提供され る。 本発明の医薬組成物は、 アルツハイマー病などの脳神経系疾患治療薬と して有用である。
Claims
1. セクレターゼ活性を抑制する物質を含む医薬組成物。
2. セクレターゼが j8-セクレターゼ又は γ-セクレターゼである請求項 1 記載の医薬組成物。
3. セクレターゼ活性を抑制する物質が、 セクレターゼ阻害剤の感受性を 促進する物質である、 請求項 1又は 2記載の医薬組成物。
4. セクレターゼ阻害剤の感受性を促進する物質が、 シノビオリンの発現 抑制物質である請求項 3記載の医薬組成物。
5. シノビオリンの発現抑制物質が、 シノビオリンをコードする遺伝子に 対する siRNA又は s RNAである請求項 4記載の医薬組成物。
6. シノビオリンをコードする遺伝子が、 配列番号 1に示される塩基配列 を含むものである請求項 5記載の医薬組成物。
7. siRNA 、 配列番号 1に示す塩基配列のうち一部の配列を標的とす るものである請求項 5記載の医薬組成物。
8. 一部の配列が、 配列番号 3〜 16に示す塩基配列から選ばれる少なく とも 1つである請求項 7記載の医薬組成物。
9. セクレターゼ活性を抑制する物質がシノビオリンである請求項 1又は 2記載の医薬組成物。
10. 脳神経系疾患を治療するための請求項 1〜 9のいずれか 1項に記載の 医薬組成物。
1 1. 脳神経系疾患がアルツハイマー病である請求項 10記載の医薬組成物 c
12. セクレターゼ阻害剤の感受性を促進することを特徴とする、 セレクタ ーゼ活性を抑制する方法。
1 3. セクレターゼ阻害剤の感受性の促進が、 シノビォリンの発現を抑制す ることによるものである、 請求項 12記載の方法。
14. シノビオリンを Herp と結合させることを特徴とする、 セレクターゼ 活性を抑制する方法。
15. Herp のシノビオリンとの結合領域が、 Herp のァミノ酸配列の 161
〜200 番目のアミノ酸残基で示される領域である、 請求項 1 4記載の方 法。
. セクレターゼが 13 -セクレターゼ又は γ■セクレターゼである請求項 1 2〜 1 5のいずれか 1項に記載の方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10/576,281 US20070275887A1 (en) | 2003-10-20 | 2004-10-20 | Method of Inhibiting Secretase Activity |
| EP04793062A EP1683527A1 (en) | 2003-10-20 | 2004-10-20 | Method of inhibiting secretase activity |
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