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WO2005034990A1 - アンチトロンビンｉｉｉ含有止血用組成物 - Google Patents

アンチトロンビンｉｉｉ含有止血用組成物 Download PDF

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WO2005034990A1
WO2005034990A1 PCT/JP2004/014731 JP2004014731W WO2005034990A1 WO 2005034990 A1 WO2005034990 A1 WO 2005034990A1 JP 2004014731 W JP2004014731 W JP 2004014731W WO 2005034990 A1 WO2005034990 A1 WO 2005034990A1
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WO
WIPO (PCT)
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fviia
composition
solution
iii
hemostatic
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/014731
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tatsuya Araki
Kazuhiko Tomokiyo
Yasushi Nakatomi
Tomohiro Nakagaki
Yoichi Ogata
Original Assignee
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute filed Critical Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority to JP2005514578A priority Critical patent/JP4613133B2/ja
Publication of WO2005034990A1 publication Critical patent/WO2005034990A1/ja

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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
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    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Definitions

  • the present invention relates to the field of prescription drugs, and relates to a novel hemostatic composition and formulation containing a plasma protein.
  • activated blood coagulation factor VII hereinafter sometimes referred to as “FVIIa”
  • blood coagulation factor X hereinafter sometimes referred to as “FX”
  • AT-III an antithrombin II
  • the present invention relates to a method for stabilizing a solution-like hemostatic composition, which comprises adding AT-III to a solution-like hemostatic composition containing FVIIa and FX mixed in the same container. .
  • An active prothrombin complex preparation (APC C preparation), a recombinant activated blood coagulation factor VII preparation (rFVIIa preparation), and the like are used for controlling hemostasis of hemophilia inhibitor patients.
  • APC C preparation active prothrombin complex preparation
  • rFVIIa preparation recombinant activated blood coagulation factor VII preparation
  • the present inventors have developed a pharmaceutical composition comprising FVIIa and FX as a hemostatic agent to compensate for these disadvantages. (See Patent Document 1).
  • compositions containing a protein as a main component used for hemostatic control are most suitable for intravenous administration, and are in a form suitable for use as a dosage form enclosed in a container such as an ampoule, a syringe or a vial. Supplied. More generally, a set comprising a container containing a protein as a lyophilized product and a container containing a solution suitable for dissolving the lyophilized product is used. Protein concentrates related to blood coagulation factors have been formulated as drugs derived from plasma or prepared using genetic recombination techniques, but most of them consist of lyophilized powder and lysate as described above. Supplied as!
  • FVIIa and FX are in a relationship between an enzyme and a substrate.
  • FVIIa forms a complex with tissue factor that appears at the site of vascular injury in the presence of phospholipids and Ca2 +.
  • the resulting FXa provokes a subsequent enzymatic reaction, ultimately leading to hemostasis by forming insoluble fibrin.
  • FXa is an effective factor showing a hemostatic effect when produced locally at a bleeding site such as a site of vascular injury.
  • Non-Patent Document 1 Not only is it reported to induce coagulation (see Non-Patent Document 1), but it also contributes to the induction of inflammation through activation of vascular endothelial cells and glomerular stromal cells (Non-Patent Document 1). (See Reference 2 and Non-Patent Reference 3).
  • the present invention relates to a mixed liquid composition of FVIIa and FX and a lyophilized preparation of the composition, wherein FVIIa is prepared in an acidic region (pH 5.0-6.5) outside its optimum pH of PH6.5-10.0. ) Is characterized by being mixed with FX. That is, it is intended to reduce the production of FXa by controlling the hydrolysis activity of FVIIa itself.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-181204
  • Patent Document 2 International Publication No. 03Z006054 pamphlet
  • Non-Patent Document 1 Giles, A.R., et al., British Journal of Haematology, 1988, 69: p.491-497.
  • Non-Patent Document 4 Bajaj, S.P., et al., The Journal of Biological Chemistry, 1973, 248: p.7729-7741
  • the present inventors have developed a dosage form that can mix an enzyme, FVIIa, and a substrate, FX, at an extremely high concentration, encapsulate them in a single container, and maintain an extremely stable state.
  • FXa produced by adding antithrombin ⁇ (AT-III) to a very high concentration mixture of FVIIa and FX specifically inhibited FXa.
  • AT-III antithrombin ⁇
  • they have found that an extremely stable mixed composition of an enzymatic enzyme and a substrate, which cannot be attempted with conventional active blood coagulation factor preparations, and a hemostatic preparation comprising the mixed composition can be obtained. It was completed.
  • the present invention provides a stabilized hemostatic composition obtained by mixing F-VIIa and FX in a single container and further mixing AT-III with the hemostatic composition, and It is intended to provide a therapeutic agent for hemostasis obtained by freeze-drying the composition.
  • the present invention is intended to control the amount of free FXa by specifically inhibiting the produced FXa by adding a required amount of AT-III to a hemostatic composition mixture of FVIIa and FX. It is.
  • a novel hemostatic preparation having excellent safety and efficacy, and having improved stability and convenience.
  • FIG. 1 is a diagram showing a blood coagulation cascade of two pathways relating to intrinsic coagulation and extrinsic coagulation.
  • FIG. 2 A solution composition obtained by mixing FVIIa and FX under a predetermined pH condition
  • FIG. 3 A solution composition obtained by mixing FVIIa and FX was mixed with AT-I under a predetermined pH condition.
  • FIG. 3 is a view showing the state of production of free FXa when II is added.
  • FIG. 4 is a view showing the state of free FXa generation when different concentrations of AT-III are added to a solution composition obtained by mixing FVIIa and FX.
  • the method for producing FVIIa, FX and AT-III used in the present invention is not particularly limited.
  • it can be produced by a method of separating from human blood or a method of producing by genetic recombination technology. it can.
  • Methods for producing blood-derived FVIIa include, for example, JP-A-3-155797 and JP-A-10-155797.
  • a method for producing blood-derived FX for example, fresh-frozen human plasma is subjected to cold-thawing 'centrifugation to remove cryoprecipitate from de-cryoplasma, and then crudely purified by anion-exchange chromatography. There is a method of purifying FX by affinity chromatography using a monoclonal antibody immobilized column. As described above, it is preferable that the obtained FX is free from prothrombin, thrombin, FIX and FIXa as much as possible.
  • heparin affinity chromatography is performed on fresh frozen human plasma by cold-thawing and centrifugation to remove cryoprecipitate and decryoplasma.
  • a method of producing the crude product by precipitation fractionation is performed on fresh frozen human plasma by cold-thawing and centrifugation to remove cryoprecipitate and decryoplasma.
  • the concentration at the time of adding AT-III is preferably in the range of 0.1 to 5.0 international units ZmL. At a lower concentration, a sufficient FXa inhibitory effect cannot be obtained, and the amount of free FXa Increases. In addition, if the concentration is higher than this, it is too much for the purpose of obtaining the FXa inhibitory effect. In that sense, the amount of added toner is usually 0.2-2.0 International Units ZmL, preferably 0.5-1.0 International Units ZmL. It doesn't matter.
  • the pH of the buffer solution when adding AT-III may be in the range of more than 5.0, preferably in the range of more than 5.0 and less than 7.0, more preferably in the range of 5.5 to 6.5.
  • the reaction between the enzyme FXa and its inhibitor ⁇ does not occur, and the FXa inhibitory effect cannot be obtained.
  • the temporary FXa inhibitory effect of A ⁇ is not practical because the level of increase in the force FXa is high.
  • a suitable content of the component composition used in the solution composition to which AT-III of the present invention is added is such that the concentrations of FVIIa and FX are respectively 11 ⁇ m and 5 ⁇ m to 400 ⁇ m, Further, in a preferred embodiment, 0.001-1% by weight of a nonionic surfactant and 0.01% by weight or more ⁇ , saccharides and amino acid strength Group strength The selected one or more compounds coexist, not only the storage stability of the composition, but also the dissolution during reconstitution when the liquid composition is freeze-dried To facilitate.
  • the subject of administration of the composition or the preparation for hemostasis is not particularly limited as long as the patient has various hemostatic disorders and tends to bleed.
  • each buffer solution having a predetermined pH (in the absence of CaCl, citrate buffer: 10 mM sodium citrate, 120 mM
  • FVIIa activity, FX activity and FXa activity in the samples after each standing time were measured using a system in which each factor had no effect.
  • F Vila used here is a blood-derived standard prepared by the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-155797.
  • FX used here was crudely purified from de-cryoplasma from which cryoprecipitate had been removed by cold-thawing and centrifuging fresh frozen human plasma by anion exchange chromatography, and then immobilized with anti-FX monoclonal antibody. It was a blood-derived sample produced by affinity chromatography using a Yidani column.
  • Example 1 In order to increase the stability of the FVIIaZFX mixture in the buffer solution, each p shown in Example 1 was used. Under each buffer containing H, FVIIa and FX were mixed to a final concentration of 0.6 mg ZmL and 6.0 mg ZmL, and AT-III was added to a final concentration of 1.0 international unit ZmL, and allowed to stand at room temperature. The FVIIa activity, FX activity and FXa activity in the samples after each standing time were measured using a system in which each factor had no effect. Note that FVIIa and FX used here were prepared in the same manner as in Example 1.
  • AT-III used here was crudely purified from decryoplasma from which cryoprecipitate was removed by cold thawing and centrifugation of fresh frozen human plasma by heparin affinity chromatography, followed by precipitation fractionation. It was a blood-derived standard manufactured by the company.
  • both the FVIIa and FX activities retained 90% or more of the activity after 18 hours of incubation at any pH in the buffer solution.
  • the activated coagulation factor FVIIa was not affected in the presence of AT-III 1.0 International Unit ZmL.
  • the hydrolytic activity of a specific synthetic substrate (S2765) was also calculated, and is shown in FIG. 3 as a molar ratio to FX.
  • S2765 specific synthetic substrate
  • FVIIa and FX were brought to a final concentration of 0.6 mg
  • the solution was mixed to a final concentration of 6.0 mg ZmL, and ⁇ - ⁇ was added to a final concentration of 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 international units ZmL, and allowed to stand at room temperature.
  • the FVIIa activity, FX activity and FXa activity in the sample after each standing time were measured in the same manner as in Example 1.
  • FVIIa and FX used here were prepared in the same manner as in Example 1.
  • ⁇ - ⁇ used here was prepared in the same manner as in Example 2.

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Abstract

　新規な止血用組成物もしくは止血用製剤を提供する。分離精製した活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）及び血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に、さらにアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）を加えたことを特徴とする、薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。混合溶液中のＦＶＩＩａ、ＦＸ及びＡＴ−ＩＩＩの濃度は各々１～２０μＭ、５～４００μＭ及び０.１～５.０国際単位／ｍＬの範囲である。さらに、ＦＶＩＩａ及びＦＸを同一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物にＡＴ−ＩＩＩを加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法を提供する。当該溶液状止血用組成物のｐＨは、５.０を超える範囲、好ましくは５.０を超え、７.０未満、さらに好ましくは５.５以上、６.５以下である。

Description

明 細 書
アンチトロンビン in含有止血用組成物
技術分野
[0001] 本発明は医療用医薬品の分野に関し、血漿蛋白質を含有する新たな止血用組成 物及び製剤に関する。詳細には、活性化血液凝固第 VII因子 (以下、「FVIIa」と称 することがある)及び血液凝固第 X因子 (以下、「FX」と称することがある）を単一容器 内に混合して含有し、これにさらにアンチトロンビン ΠΙ (以下、「AT— III」と称すること がある）を加えたことを特徴とする治療用薬剤に関する。さらに本発明は、 FVIIa及び FXを同一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に AT— IIIをカ卩えることを 特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定ィ匕方法に関する。
背景技術
[0002] 血友病インヒビター患者の止血管理には、活性型プロトロンビン複合体製剤 (APC C製剤)や遺伝子組換え活性型血液凝固第 VII因子製剤 (rFVIIa製剤)等が用いら れている。し力しながら、前者は安全性において、後者は有効性において満足のいく ものとはいえず、本発明者等はこれらの欠点を補った止血剤として、 FVIIaと FXを複 合した医薬組成物の有用性を示した (特許文献 1参照)。
[0003] これら止血管理に用いる蛋白質を主要成分とする医薬糸且成物は、静脈内投与が最 適であり、使用に適した形態でアンプル、注射器やバイアル等の容器に封入した剤 型として供給される。より一般的には、蛋白質を凍結乾燥物として含有する容器と、そ の凍結乾燥物の溶解に適した溶液を含有する容器とからなるセットが用いられている 。血液凝固因子に関連した蛋白質濃縮物は、血漿由来もしくは遺伝子組換え技術を 用いて調製された薬剤が製剤化されているが、それらの殆どが上記のような凍結乾 燥粉末と溶解液のセットとして供給されて!、る。
[0004] FVIIaと FXを複合した製剤の剤型を考案する場合、 2つの方策がある。 1つは FVII aと FXとを別々の容器に入れて用意する方策であり、もう 1つは FVIIaと FXとを混合 して単一の容器に入れて用意する方策である。後者は混合した溶液の凍結乾燥粉 末と溶解液力もなるセットとなり、 1セット計 2個の容器で足りるのに対し、前者はそれ ぞれの因子につき凍結乾燥粉末と溶解液のセットとなり、 2セット計 4個の容器が必要 となる。加えて、前者は溶解液を凍結乾燥粉末の容器に移注する装置や操作を余分 に必要とするため、利便性の観点からも好ましくない。このように FVIIaと FXとを混合 して調製し、単一の容器に封入することができれば、薬剤本来の薬力学的な有用性 だけでなぐさらに製剤学的な利便性をも兼ね備えた製剤となり得る。
[0005] 図 1に示すように FVIIaと FXは酵素と基質の関係にあり、生理的条件下で FVIIaは 、リン脂質や Ca2+存在下に、血管傷害部位に現れる組織因子と複合体を形成して F Xを加水分解する。その結果生じた FXaは引き続き生じる酵素反応を惹起し、最終的 には、不溶性のフイブリンを形成することで止血に至る。しかしながら、この FXaは、 血管傷害部位のような出血局所にて産生される場合には、止血効果を示す有効な 因子である一方で、全身循環で過剰に存在する場合には、全身的な過凝固を誘引 することが報告されているだけでなく（非特許文献 1参照）、血管内皮細胞や糸球体 間質細胞の活性ィ匕を介した炎症の惹起にも寄与して 、る (非特許文献 2及び非特許 文献 3参照） t 、う好ましくな 、一面が示唆されて 、る。
[0006] FVIIaによる FXの加水分解は、両者が非生理的な高濃度で存在する場合には FX aの産生はもはや制御することができず、その結果、大量の FXa産生を生じる。また、 それらにより生じる FXaは、 FVIIaを基質として分解不活ィ匕してしまうために (非特許 文献 4参照）、安定な溶液として存在することは困難である。このように、不安定な状 態のままで製剤化することもできな 、し、ましてやそのような溶液を患者へ投与するこ とはできない。
[0007] これまで述べてきたように、精製分取された酵素と基質を混合して単一容器内に封 入するような概念の既存製剤はな力つたため、本発明者等はこれらの課題を克服す る技術の 1つを示した (特許文献 2参照)。当該発明は FVIIa及び FXの混合液状組 成物並びに当該組成物の凍結乾燥製剤に関するものであり、 FVIIaをその至適 pH である PH6.5— 10.0を外れた酸性領域下（pH5.0— 6.5)において FXと混合するこ とを特徴とするものである。すなわち、 FVIIa自体の加水分解活性を制御することによ つて FXaの産生を低下せしめようとするものである。
[0008] 特許文献 1：特開 2001— 181204号公報 特許文献 2：国際公開第 03Z006054号パンフレット
非特許文献 1 :ガイルズ（Giles, A. R.)ら、 British Journal of Haematology, 1988, 69: p.491-497
特 §午文献 2：カメラ ~~ (Camerer E.)ら、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97: p.5255— 5260
特 §午文献 3：モンノ (Monno R.)ら、 Journal of the American Society of Nephrology, 2001, 12: p.891-899
非特許文献 4 :バジャジ（Bajaj, S. P.)ら、 The Journal of Biological Chemistry, 1973, 248: p.7729-7741
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 一方、血友病と 、う患者の特殊性から、しばしば血液凝固因子製剤の投与は患者 自らもしくはその保護者による注射という方法が取られる。このような使用時の態様に 配慮した製剤化を考慮すると、製剤の投与容量は少ないほうが好ましぐすなわち酵 素 FVIIa及び基質 FXを極めて高濃度にすることが望まれる。さらに、そのような場合 であっても FXa量の増加を極力抑制することが必要である。その意味においては、先 述した国際公開第 03Z006054号パンフレットに開示された、 FVIIa及び FXの混合 溶液を酸性領域下 115.0—6.5)におくことにより FXaの産生を抑制する方法には 限界があり、極めて少量の FXa量を高感度に測定すると、それら酸性領域の緩衝液 においてさえも僅かではあるが経時的な FXa量の増大が認められる。
[0010] このように、極めて高濃度の FVIIa及び FXからなる混合溶液中に存在し、増加する FXa量を、薬剤の使用に際して必要な一定の時間、一定の濃度に制御する方法は なぐ従来、この課題に対して克服する技術がな力つた。
課題を解決するための手段
[0011] そこで、本発明者らは酵素である FVIIaと基質である FXとを極めて高濃度に混合し て単一容器内へ封入し、さらに極めて安定な状態を保持し得る剤型を開発すべく鋭 意研究した結果、驚くべきことに、 FVIIaと FXとの極めて高濃度の混合物にアンチト ロンビン ΠΙ (AT-III)をカ卩えることによって産生された FXaが特異的に阻害される結 果、従来の活性型血液凝固因子製剤では試みられることのな力つた酵素 ·基質の極 めて安定な混合組成物及び当該混合組成物からなる止血用製剤が得られることを 見出し、本発明を完成するに至った。
[0012] すなわち、本発明は、 FVIIa及び FXを単一容器内にて混合した溶液状止血用組 成物にさらに AT— IIIを混合してなる安定化された溶液状止血用組成物、及び当該 組成物を凍結乾燥して得られる止血用の治療用薬剤を提供するものである。本発明 は、 FVIIaと FXとの混合溶液状止血用組成物中に所要量の AT— IIIを加えることに より、産生された FXaを特異的に阻害させることによって、遊離 FXa量を制御するもの である。
発明の効果
[0013] 本発明により、安全性及び有効性に優れ、かつ安定性と利便性が向上した新規な 止血用製剤が提供される。
図面の簡単な説明
[0014] [図 1]内因系凝固と外因系凝固に関する二つの経路の血液凝固カスケードを示す図 である。
[0015] [図 2]FVIIa及び FXを混合してなる溶液状組成物に対し、所定の pH条件下における
FXaの生成状況を示す図である。
[0016] [図 3]FVIIa及び FXを混合してなる溶液状組成物に対し、所定の pH条件下に AT— I
IIを加えた場合の遊離 FXaの生成状況を示す図である。
[0017] [図 4]FVIIa及び FXを混合してなる溶液状組成物に対し、異なる濃度の AT— IIIを加 えた場合の遊離 FXaの生成状況を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 本発明に使用される FVIIa、 FX及び AT— IIIを製造する方法は特に限定されること はなぐ例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する 方法などによって製造することができる。
[0019] 血液由来の FVIIaの製法としては、例えば、特開平 3— 155797号公報、特開平 10
-059866号公報及び特開平 10-059867号公報に示される方法がある。また、新 鮮凍結ヒト血漿を冷融解'遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿か ら、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗 FVIIモノクローナル抗体固定 化カラムを用いてのァフィユティークロマトグラフィーによって FVIIを精製した後、他 の血漿蛋白質、例えば活性ィ匕血液凝固第 ΧΠ因子、 FXaなどにより FVIIを FVIIaに 活性化する方法がある。なお得られる FVIIaは、プロトロンビン、トロンビン、 FIX及び FIXaを可能な限り伴なわな 、方が好ま 、。
[0020] 血液由来の FXの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解'遠心処理して クリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより 粗精製後、抗 FXモノクローナル抗体固定ィ匕カラムを用いてのァフィユティークロマト グラフィ一によつて FXを精製する方法がある。前記と同様、得られる FXは、プロトロン ビン、トロンビン、 FIX及び FIXaを可能な限り伴なわない方が好ましい。
[0021] 血液由来の AT— IIIの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解'遠心処 理してクリオプレシピテートを除 、た脱クリオ血漿から、へパリンァフィユティークロマト グラフィ一により粗精製後、沈殿分画により製する方法がある。
[0022] AT— IIIを添加する際の濃度は 0.1— 5.0国際単位 ZmLの範囲であることが好適 であり、これより低濃度では十分な FXa阻害効果を得ることができず、遊離の FXa量 は増加する。また、これより高濃度では FXa阻害効果を得るという目的に対し過剰量 過ぎる。その意味で添力卩量は通常 0.2— 2.0国際単位 ZmL、好ましくは 0.5— 1.0国 際単位 ZmLが用いられ、その範囲では FVIIa及び FX各々の成分の活性低下や遊 離 FXa量の増加は全く問題にならない。
[0023] AT— IIIを添加する際の緩衝液の pHは、 5.0を超える範囲、好ましくは 5.0を超え、 7.0未満の酸性領域、さらに好ましくは 5.5以上、 6.5以下の酸性領域であればよい。 PH5.0以下の酸性領域では酵素である FXaとその阻害剤である ΑΤΠΙの反応が起こ らなくなり、 FXa阻害効果を得ることができない。一方、 pH7.0以上の pH領域でも A ΤΙΠによる一応の FXa阻害効果は得られる力 FXaの増加水準が高いため実用的で はない。
[0024] 本発明の AT— IIIを添加する溶液状組成物に使用される成分組成の、好適な含量 は、 FVIIa及び FXの濃度が各々 1一 20 μ Μ、 5— 400 μ Μであり、さらに、好ましい 態様として、 0.001— 1重量％の非イオン性界面活性剤並びに 0.01重量％以上のァ '、糖類及びアミノ酸力 なる群力 選ばれた 1種または 2種以上の化合物の 共存により、組成物の保存安定性のみならず、当該液状組成物を凍結乾燥した場合 はその再構成時の溶解を容易にする。
[0025] 当該組成物もしくは止血用製剤の投与対象は、様々な止血障害を有し出血傾向に ある患者であれば特に限定されることはない。
[0026] 以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これらは本発明の範囲 を何ら限定するものではな 、。
実施例 1
[0027] AT— III不在下での游離 FXaの牛.成
FVIIaZFX混合物の緩衝溶液中の安定性を調べる目的で、所定の pHを有する 各々の緩衝液 (CaCl非存在下、クェン酸緩衝液： 10mMクェン酸ナトリウム、 120m
2
M NaCl、 0.5%グリシン、 2%アルブミン、 50ppmツイーン 80)下に、 FVIIa及び FX を終濃度 0.6mg/mL (約 M)及び 6.0mg/mL (約 100 /z M)になるよう混合し、 室温で放置した。各放置時間後のサンプル中の FVIIa活性、 FX活性及び FXa活性 はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いた F Vilaは、特開平 3— 155797号公報に記載の方法による血液由来の標品である。ま た、ここで用いた FXは、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解'遠心処理してクリオプレシピテー トを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗 FX モノクローナル抗体固定ィ匕カラムを用いてのァフィユティークロマトグラフィーによって 製された血液由来の標品であった。
[0028] その結果、 FVIIa及び FXの両活性ともに、緩衝溶液中どの pHにおいても 18時間 のインキュベーションにおいて 90%以上の活性を保持していた。 FXa含量は、特異 的な合成基質 (S2765)水解活性カゝら算出し、 FXとのモル比として図 2に示した。そ の結果、図 2に示すように高感度の測定系を用いて FXa量を定量することにより、 pH 6.0及び pH5.5の溶液中においても僅かではあるが FXa量の増加が認められた。 実施例 2
[0029] AT— III添加による FXa阻害効果
FVIIaZFX混合物の緩衝溶液中の安定性を高める目的で、実施例 1に示した各 p Hを有する各々の緩衝液下に、 FVIIaおよび FXを終濃度 0.6mgZmL及び 6.0mg ZmLになるよう混合し、さらに AT— IIIを終濃度 1.0国際単位 ZmLになるよう添加し 、室温で放置した。各放置時間後のサンプル中の FVIIa活性、 FX活性及び FXa活 性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いた FVIIa, FXは実施例 1と同じく調製した。また、ここで用いた AT— IIIは、新鮮凍結ヒト 血漿を冷融解'遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、へパリ ンァフィ-ティークロマトグラフィーにより粗精製後、沈殿分画により製された血液由 来の標品であった。
[0030] その結果、 FVIIa及び FXの両活性ともに、緩衝溶液中どの pHにおいても 18時間 のインキュベーションにおいて 90%以上の活性を保持していた。すなわち、活性化さ れた凝固因子である FVIIaは AT— III 1.0国際単位 ZmL存在下にお ヽても何ら影 響されなかった。 FXa含量は、特異的な合成基質 (S2765)水解活性力も算出し、 F Xとのモル比として図 3に示した。図 3から明らかなように、 AT— III非存在下では著し Vヽ FXa量の増加を示す pH6.5の溶液中にお!、て、 AT— ΠΙ存在下では FXa量の増 加が顕著に抑制された。さらに、 AT— III非存在下では僅かながらも FXa量の増加を 示す PH6.0及び pH5.5の溶液中において、 AT— ΠΙ存在下では FXa量の増加は殆 ど認められな力つた。一方、 pH5.0の緩衝液では、 AT— IIIによる当該阻害効果は認 められなかった（データは示して ヽな 、）。
実施例 3
[0031] 各種濃度の AT— III添加による FXa阻害効果
FVIIaZFX混合物の緩衝溶液中の安定性を高めるために要する AT— IIIの濃度を 調べる目的で、実施例 1に示した緩衝液組成の PH5.7条件下に、 FVIIaおよび FXを 終濃度 0.6mgZmL及び 6.0mgZmLになるよう混合し、さらに ΑΤ—ΙΠを終濃度 0、 0.1、 0.2、 0.5、 1.0国際単位 ZmLになるよう添加し、室温で放置した。各放置時間 後のサンプル中の FVIIa活性、 FX活性及び FXa活性につ!ヽては実施例 1と同様の 方法にて測定した。なお、ここで用いた FVIIa、 FXは実施例 1と同じく調製した。また 、ここで用いた ΑΤ-ΙΠは、実施例 2と同じく調製した。
[0032] その結果、 FVIIa及び FXの両活性ともに、緩衝溶液中どの AT— III濃度において も 18時間のインキュベーションにおいて 90%以上の活性を保持していた。 FXa含量 は、特異的な合成基質 (S2765)水解活性力も算出し、 FXとのモル比として図 4に示 した。図 4から明らかなように、用いたどの濃度の AT— ΠΙ存在下においても FXa量の 増加は殆ど認められな力つた。また、そのときの FXa量は AT— III濃度依存的に低下 しており、その低下効果は 0.5国際単位 ZmL以上ではほぼプラトーであった。

Claims

請求の範囲
[1] 分離精製した活性ィ匕血液凝固第 VII因子 (FVIIa)及び血液凝固第 X因子 (FX)を 単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に、さらにアンチトロンビン III ( AT— III)を加えたことを特徴とする、薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。
[2] 含有される FVIIa、 FX及び AT— IIIの濃度が各々 1一 20 μ Μ、 5— 400 μ Μ及び 0
.1一 5.0国際単位 ZmLである、請求項 1記載の溶液状止血用組成物。
[3] pHが 5.0を超える範囲である、請求項 1または 2記載の溶液状止血用組成物。
[4] pHが 5.0を超え、 7.0未満の酸性領域にある、請求項 3記載の溶液状止血用組成 物。
[5] pHが 5.5以上、 6.5以下の酸性領域にある、請求項 3記載の溶液状止血用組成物
[6] 請求項 1一 5の 、ずれかに記載の溶液状止血用組成物を凍結乾燥してなる凍結乾 燥止血用製剤。
[7] FVIIa及び FXを単一容器内に混合して含有する溶液状止血用組成物に AT— III を加えることを特徴とする当該溶液状止血用組成物の安定化方法。
[8] 該組成物の pHが 5.0を超える範囲である、請求項 7記載の方法。
[9] 該組成物の pHが 5.0を超え、 7.0未満の酸性領域にある、請求項 8記載の方法。
[10] 該組成物の pHが 5.5以上、 6.5以下の酸性領域にある、請求項 8記載の方法。
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