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WO2004072056A1 - 医薬組成物 - Google Patents

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Publication number
WO2004072056A1
WO2004072056A1 PCT/JP2004/001623 JP2004001623W WO2004072056A1 WO 2004072056 A1 WO2004072056 A1 WO 2004072056A1 JP 2004001623 W JP2004001623 W JP 2004001623W WO 2004072056 A1 WO2004072056 A1 WO 2004072056A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
represented
compound
group
dhm2eq
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/001623
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuo Umezawa
Kuniki Kato
Yoshikazu Suzuki
Yutaka Horiguchi
Jun Nakashima
Hiroyuki Hata
Hiroyuki Namba
Izumi Takei
Ryouichi Horie
Original Assignee
Keio University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Keio University filed Critical Keio University
Priority to AU2004210789A priority Critical patent/AU2004210789A1/en
Priority to US10/545,234 priority patent/US20060167086A1/en
Priority to JP2005505017A priority patent/JPWO2004072056A1/ja
Priority to CA002515658A priority patent/CA2515658A1/en
Priority to EP04711505A priority patent/EP1600445A4/en
Publication of WO2004072056A1 publication Critical patent/WO2004072056A1/ja

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D303/00—Compounds containing three-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition, a tumor cell growth inhibitor, a cell adhesion inhibitor, an apoptosis inducer, an obesity preventive / inhibitor, a blood sugar lowering agent, a drug which releases the inhibition of differentiation induction, and a pharmaceutical composition thereof.
  • the present invention relates to a method for directly resolving an optically active compound of a compound having an optical activity, that is, 5-dehydroxymethylepoxyquinomicin C, which is contained as an active ingredient in a drug, and a therapeutic method.
  • DHM2EQ they tumor cells, such as specific I 1 production is high and low toxicity. Therefore, DHM2EQ is expected to play a role as a novel antitumor and anti-inflammatory agent.
  • FIG. 1 shows a conventional method for producing an optically active form of DH EQ.
  • a compound (formula (16)) in which the phenolic hydroxyl group of racemic DHM2EQ (formula (2)) is protected with a silyl group is separated by a chiral column to obtain an optically active compound (formula (17) and Formula (18)) is obtained, and then deprotection of each yields the desired optically active (-)-DHM2EQ (formula (2)) and (+)-DHM2EQ (formula (4)).
  • this method has a problem of loss of yield due to the length of the process (N. Matsumoto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000).
  • the present invention provides a method for rapidly and in a high yield of a compound having excellent pharmacological action and having high specificity for inclusion in a medicament or composition as an active ingredient.
  • the main purpose is to Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition containing the compound as an active ingredient. Disclosure of the invention
  • an optically active compound (formula (2), formula (4)) that is superior to the racemic form of the compound represented by formula (3) in inhibiting the adhesion of vascular endothelial cells to the compound.
  • human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and human acute myeloid leukemia cells HL were used using the compounds represented by formulas (2), (3) and (4), respectively.
  • -Adhesion with 60 was prepared.
  • the compound represented by the formula (2) exhibited a more excellent adhesion inhibitory effect on vascular endothelial cells than the compounds represented by the formulas (3) and (4).
  • the present inventors have found that the compound represented by the formula (2) suppresses the growth of tumor cells such as multiple myeloma and thyroid cancer.
  • the present inventors have been able to treat hypertrophic fat cells with the compound represented by the formula (2). As a result, they found that apoptosis was induced in hypertrophic adipocytes.
  • the present inventors have found that the compound represented by the formula (2) suppresses an increase in body weight due to a high fat diet load in an obese type 2 diabetes model animal.
  • the present inventors have found that the compound represented by the formula (2) releases inhibition of differentiation induction from myoblasts to myocytes in cultured cells. Thus, the present inventors have completed the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention contains an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient, and activates NF- ⁇ . It is characterized by improving symptoms accompanied by
  • R 1 is a hydrogen atom or a C 2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group examples include an acetyl group, a propioyl group, a butanol group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is characterized in that at least one symptom is improved by causing apoptosis of a tumor cell, and the apoptosis of the tumor cell is not contributing to at least one symptom caused by the tumor cell. It is characterized by improving symptoms.
  • the condition associated with NF- activation may be, for example, due to tumor cells.
  • the above condition is improved by inhibiting the growth of the tumor cells.
  • the above condition is improved by inhibiting adhesion between tumor cells and vascular endothelial cells.
  • the symptom is selected from the group consisting of, for example, an immune disease, an allergic disease, an inflammatory disease, a tumor metastasis, a malignant substance, arteriosclerosis, an angiogenic disease (angiogenic disease in fl sever), and leukemia Symptoms.
  • tumor examples include myeloma, thyroid cancer, breast cancer, knee cancer, malignant tumor, and prostate cancer.
  • composition according to the present invention can increase the effect of the treatment by inhibiting the activation of F-KB by the treatment of activating NF- ⁇ , the following general formula (1) ) Or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, and a ptanoyl group, and isomer groups thereof, and an acetyl group is particularly preferable. .
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the treatment for activating NF- ⁇ B may be treatment using an antitumor agent or treatment by irradiation of tumor cells.
  • the pharmaceutical composition and the antitumor agent may be contained as active ingredients.
  • the antitumor agent is, for example, camptothecin or daunorubicin.
  • composition according to the present invention comprises an optically active compound represented by the following general formula (1).
  • the compound or a pharmacologically acceptable salt thereof is contained as an active ingredient, and is characterized by ameliorating a disease caused by T F -H.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C 24 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, a peptanoyl group, and isomers thereof, with an acetyl group being particularly preferred.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the disease caused by the TNF-o may be, for example, a disease associated with insulin resistance, a disease caused by diabetes, a muscular dystrophy, and the like.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition is characterized in that it contains a (-)-form compound having an excellent pharmacological action as an active ingredient, but does not substantially contain a (+)-form compound.
  • a (-)-form compound having an excellent pharmacological action as an active ingredient, but does not substantially contain a (+)-form compound.
  • the tumor cell growth inhibitor according to the present invention for inhibiting the growth of J3 sever cells is an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof. It is characterized by containing as a component.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C 24 alkanoyl group
  • Examples of the group include an acetyl group, a propionyl group, a butanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the tumor cell growth inhibitor for inhibiting the growth of tumor cells according to the present invention is characterized by containing a (-)-body compound having excellent pharmacological action as an active ingredient. Particularly, those containing no (+)-compound are particularly preferable.
  • the compound may be represented by the following formula (2).
  • the adhesion molecule expression inhibitor for suppressing the expression of adhesion molecules of vascular endothelial cells is an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof: As an active ingredient.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group. Examples of the alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, a butanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable. .
  • adhesion molecule expression inhibitor for suppressing the expression of adhesion molecules of vascular endothelial cells is characterized by containing a (-)-isomer compound having excellent pharmacological action as an active ingredient.
  • a (-)-isomer compound having excellent pharmacological action as an active ingredient.
  • those containing substantially no (+)-compound are particularly preferable.
  • the apoptosis-inducing agent for inducing apoptosis of tumor cells contains an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is characterized by the following.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group, and examples of the alkanoyl group include an acetyl group, a propioyl group, a butanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable. .
  • the apoptosis-inducing agent for inducing apoptosis of fl sever cells is characterized by containing a (-)-compound having an excellent pharmacological action as an active ingredient. Those containing substantially no (+)-form compound are particularly preferred.
  • the compound may be represented by the following formula (2).
  • the inducer for inducing apoptosis of hypertrophic adipocytes comprises, as an active ingredient, an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof. It is characterized by containing.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C 2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, a ptanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the inducer for inducing apoptosis of hypertrophic adipocytes according to the present invention is characterized by containing a (-)-body compound having excellent pharmacological action as an active ingredient. Particularly, those containing no (+)-compound are particularly preferable. Further, the inducer for inducing apoptosis of hypertrophic adipocytes according to the present invention may further contain TNF- a as an active ingredient.
  • the anti-obesity agent according to the present invention is characterized by containing an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group, and examples of the alkanoyl group include an acetyl group, a propioyl group, a butanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the compound has the following formula (2) 4 001623
  • the agent for preventing and preventing obesity according to the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a (-)-compound having excellent pharmacological action. Those containing no compound are particularly preferred.
  • the blood sugar lowering agent according to the present invention is characterized by containing an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, a butanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the blood sugar lowering agent according to the present invention is characterized by containing a (-)-form compound having an excellent pharmacological action as an active ingredient, but substantially comprises a (+)-form compound. Those not containing are particularly preferred.
  • the agent for releasing the inhibition of cell differentiation induction comprises, as an active ingredient, an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof. 01623
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propioyl group, a butanol group, and an isomer group thereof, and particularly, an acetyl group. preferable.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the inhibition of cell differentiation induction may be, for example, suppression of muscle cell differentiation by TNF- ⁇ .
  • the drug of the present invention which releases the inhibition of cell differentiation induction, is characterized by containing as an active ingredient a (-)-body compound having excellent pharmacological action, but substantially comprises (+) Those which do not contain a compound of the form are particularly preferred. Also, the present invention provides a method of formula (3):
  • the optical resolution may use an optically active column.
  • the optically active ram may be a ram filled with a separating agent containing an aromatic olebamate derivative of a polysaccharide substituted with a group represented by the following formula (5) as an active ingredient.
  • R 3 to R 7 may be a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 14 carbon atoms, or It may be a halogen atom or the like.
  • the aromatic carbamate derivative of the polysaccharide may be amylose tris (3,5-dimethylfurylcarbamate) or cellulose tris (3,5-dimethylfuelcarbamate).
  • amylose tris (3,5-dimethylfurylcarbamate)
  • cellulose tris (3,5-dimethylfuelcarbamate).
  • DAICEL CHIRALPAK AD Daicel Chemical Industry Co., Ltd.
  • a separating agent containing amylose tris (3,5-dimethylphenylcarbamate) as an active ingredient is preferable.
  • optically active DHMEQ can be efficiently produced in large quantities.
  • optically active DHMEQ represented by the formula (2) or (4) can be produced by the method of the present invention.
  • the compound represented by the formula (2) is more preferable. It is shown in Examples below that the compound has higher biological activity (pharmacological activity) than the compound represented by the formula (4).
  • racemate of the compound represented by the formula is directly optically resolved by a separating agent containing as an active ingredient an aromatic rubamate derivative of a polysaccharide substituted with a group represented by the following formula (5).
  • R 3 to R 7 may be a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 8 carbon atoms, an aromatic group having 6 to 14 carbon atoms, or It may be a halogen atom or the like.
  • the aromatic carbamate derivative of the polysaccharide may be amylose tris (3,5-dimethylphenylcarbamate) or cellulose tris (3,5-dimethylphenylcarbamate).
  • the therapeutic method according to the present invention includes an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof for improving a symptom accompanied by activation of NF- ⁇ B. Shall be used.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propionyl group, a butanoinole group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable. .
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the treatment method according to the present invention may improve at least one symptom by causing apoptosis of the tumor cells, or at least one of the apoptosis of the JK ulcer cells may not be attributable to the apoptosis of the tumor cells.
  • One of the symptoms may be improved.
  • condition associated with the activation of NF- ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ may be, for example, due to tumor cells.
  • the symptom may be improved by inhibiting the proliferation of the tumor cell, or the symptom may be improved by inhibiting adhesion between the tumor cell and the vascular endothelial cell.
  • the symptom is selected from the group consisting of, for example, an immune disease, an allergic disease, an inflammatory disease, metastasis of fl inflammation, a malignant substance, arteriosclerosis, an angiogenic disease (angiogenic disease in a tumor), and leukemia. Symptoms.
  • tumor examples include myeloma, thyroid cancer, breast cancer, knee cancer, malignant tumor, and prostate cancer.
  • the treatment method according to the present invention can increase the effect of the treatment by inhibiting the activation of NF- ⁇ by treatment that activates F- ⁇ , and can increase the effect of the treatment.
  • a pharmaceutical composition containing the optically active compound represented by 1) or a pharmacologically acceptable salt thereof as an active ingredient will be used.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group
  • the a / recanoyl group includes an acetyl group, a propionyl group, a butanol group, and a An isomer group is exemplified, and an acetyl group is particularly preferred.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the treatment for activating F- ⁇ B may be treatment using an antitumor agent or treatment by irradiation of tumor cells.
  • the pharmaceutical composition and the antitumor agent may be contained as active ingredients.
  • the antitumor agent is, for example, camptothecin or daunorubicin.
  • an optically active compound represented by the following general formula (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof is used in order to improve a disease caused by TNF- a . It shall be. ⁇
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • alkanoyl group include an acetyl group, a propioyl group, a ptanoyl group, and isomers thereof, and an acetyl group is particularly preferable.
  • the compound is preferably represented by the following formula (2).
  • the disease caused by the TF-string may be, for example, a disease associated with insulin resistance, a disease caused by diabetes, a muscular dystrophy, and the like.
  • the above-mentioned treatment method uses (-)-compounds that have excellent pharmacological action. 15
  • FIG. 1 is a diagram showing a reaction scheme of a conventional method for producing an optically active form of DHM2EQ.
  • FIG. 2 is a diagram showing a reaction scheme of the method for producing the optically active DHM2EQ (Equations (2) and (4)) of the present invention.
  • FIG. 3 shows the HPLC profiles of ( ⁇ )-DHM2EQ and (+)-DHM2EQ.
  • FIG. 4 is a graph showing the inhibitory effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on the adhesion between HUVEC and HL-60 cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the antitumor effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on myeloma model mice.
  • FIG. 6 shows the antitumor effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on thyroid cancer model mice.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of analysis of the apoptosis-inducing effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on hypertrophic adipocytes.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on weight gain in obesity-type diabetes model mice.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of ( ⁇ )-DHM2EQ on releasing inhibition of differentiation induction from myoblasts into myocytes.
  • NF- / cB is a central transcription factor involved in the host defense response.
  • Genes induced by NF-zcB are not only immunoglobulins but also cytokines (IL (interleukin) -1, IL-2, IL- 6, IL-8, TF (tumor necrosis factor) - ⁇ , etc.), cell adhesion factors ( ⁇ -selectin, ICAM (intercellular adhesion molecule) -1, VCAM (vascular cell adhesion molecule) -1, etc.), It is known that many are closely related to immune response and inflammatory response such as nitric oxide (NO) synthase and Fas ligand (Cell, 87, 13-20, 1996).
  • NO nitric oxide
  • the above salicylic acid amide derivative was newly designed based on the structure of a non-toxic antibiotic epoxyquinomicin.
  • the present inventors have found that the racemic form of this compound Anti-inflammatory action, immunosuppressive action, anti-tumor activity, anti-atherosclerotic action, tumor metastasis inhibitory action, anti-pestrum action, anti-allergic action And have an angiogenesis inhibitory effect.
  • the racemic form contains two enantiomers ((+)-and (-)-), and in general, these enantiomers have almost the same physical properties such as boiling point and melting point.
  • (+)-and (-)-compounds usually have different effects on living organisms. For example, as in "thalidomide tragedy", it is known that one enantiomer has a sleep effect and a sedative effect, while the other enantiomer has a teratogenic effect (fetal malformation-inducing effect). .
  • a drug containing one of the enantiomers as an active ingredient rather than the racemic form, more excellent effects can be obtained and side effects are reduced. Therefore, it is extremely important to prepare optically pure compounds for pharmaceuticals and the like.
  • a racemic form of the compound can be directly converted into a (-)-form and a (+)-form compound. I found that it can be split optically.
  • the substituent may change the shape of the molecule, or the combination of the physical and chemical properties of the substituent itself and the electronic influence of the substituent on the ⁇ -electron system of the aromatic ring may be complicated. Therefore, taking into account the relationship between remarkable changes in the characteristics of separation and adsorption and displacement, the following general formula (5) 1623
  • R 3 , 1 R 4 , 1 R 5 , 1 R 6 , and 1 R 7 may be a hydrogen atom or an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, It may be an 8 alkoxy group, an aromatic group having 6 to 14 carbon atoms, or a halogen atom.
  • the polysaccharide used as the raw material of the aromatic dirubmate derivative of the polysaccharide may be any one of a synthetic polysaccharide, a natural polysaccharide, and a natural modified polysaccharide, but a polysaccharide having optical activity is preferable, and amylose from which a high-purity polysaccharide can be easily obtained. And cellulose are more preferred.
  • high-purity polysaccharides can be easily obtained by using 1,4-chitosan, chitin, 0-1,4-mannan,] 3-1,4-xylan, inulin, curdlan, etc. as raw materials. You may do it.
  • amylose tris (3,5-dimethylphenylcarbamate) was used as the aromatic carbamate derivative of the polysaccharide, and the cellulose cellulose tris (3, 5-dimethylfurcarbamate) may be applied.
  • polysaccharide derivative contained in the separating agent as an active ingredient, but other polysaccharide derivatives such as ester derivatives, ether derivatives, and carbamate derivatives other than aromatic carbamates may be used. .
  • an organic carrier or an inorganic carrier is generally used, but an inorganic carrier is more preferred.
  • examples of such an inorganic carrier include silica gel, alumina, magnesia, titanium oxide, glass, silicate, and kaolin.
  • the particle size of the carrier varies depending on the size of the column to be used, but it is generally 0.5 Aim ⁇ : 10 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , preferably 1111 ⁇ 300111, more preferably 5 ⁇ m ⁇ 20 m.
  • the properties are preferably porous, and in that case, the average pore diameter of the pores is preferably from 10 to 100 ⁇ m, and more preferably from 50 to 50,000 A.
  • a dope is prepared by dissolving the aromatic sugar baubamate derivative of the polysaccharide in a solvent, and the dope is slowly added dropwise to the carrier with stirring. And a general method such as a method of coating uniformly. Further, by applying the above direct resolution method, it is also possible to easily produce optically active compounds (formulas (2) and (4)) from the racemate of the compound represented by formula (3). is there. Hereinafter, the manufacturing method will be described in detail.
  • R 1 is a hydrogen atom or a C2-4 alkanoyl group.
  • the alkanoyl group include an acetyl group, a propioyl group, a butanol group, and an isomer group thereof.
  • An acetyl group is preferred.
  • R 2 is a C 1-4 alkyl group; examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group and isomers thereof, and a methyl group and an ethyl group are preferred; A methyl group is particularly preferred.
  • X is a halogen atom. Examples of the halogen atom include fluorine, chlorine, bromine, and iodine atoms. A chlorine atom and a bromine atom are preferable, and a chlorine atom is particularly preferable.
  • 2,5-Dimethoxyaniline is dissolved in a solvent (eg, pyridine), and the solution is added at a temperature of 178 to 50 ° (preferably under ice-cooling, and the O-alkanoylsalicyloylhayl compound of the formula (7) is removed.
  • the reaction was stopped by adding water, and the reaction was stopped by adding water.Ethyl acetate was added, and the mixture was washed successively with hydrochloric acid, water, aqueous sodium hydrogen carbonate and water, dried, and concentrated under reduced pressure. After drying under vacuum, an N- (2-alkanolbenzoyl) -12,5-dimethoxyaniline compound represented by the formula (8) is obtained, which can be used in the next step without purification.
  • a solvent eg, pyridine
  • the compound of formula (8) obtained above is dissolved in a solvent (for example, methanol, ethanol, etc.), and diacetoxedobenzene is added at 120 to 50 ° C, preferably under permanent cooling.
  • a solvent for example, methanol, ethanol, etc.
  • the reaction is carried out with stirring at room temperature.
  • ethyl acetate was added, washed successively with aqueous sodium bicarbonate and brine, and the solvent layer was concentrated under reduced pressure.
  • the resulting residue was purified by column chromatography to give the compound represented by the formula (9).
  • — (O-alkanoylresalicyloylamide) 1,4,4-dianolecoxy-1,2,5-cyclohexadienone compound is obtained.
  • the compound of the formula (9) is dissolved in a solvent (eg, tetrahydrofuran, methanol, etc.), and hydrogen peroxide solution and sodium hydroxide are added at 120 to 50 ° C., preferably under ice-cooling. React with stirring. Ethyl acetate is added to the reaction solution, and the mixture is washed sequentially with a hydrochloric acid solution, an aqueous solution of sodium thiosulfate, and brine, dried in the air, and then dried in vacuo. To remove the remaining starting compounds, the residue is dissolved in acetone, P-toluenesulfonic acid is added, and the mixture is stirred at room temperature to decompose the starting compounds.
  • a solvent eg, tetrahydrofuran, methanol, etc.
  • a Plemido-2-cyclohexenone compound is obtained.
  • the compound of formula (10) is dissolved in a solvent (eg, methylene chloride), and an organic acid or organic acid (eg, boron trifluoride getyl ether complex) is added under ice-cooling, and the mixture is reacted with stirring. .
  • a solvent eg, ethyl acetate, etc.
  • a solvent is added to the reaction solution, washed with water, the solvent layer is concentrated, and the obtained residue is washed with methanol, and the 5,6-epoxy-2-hydroxyalkyl group represented by the formula (11) is added.
  • —Alkanoylesalicyloylamide 2-cyclohexene-1,4-dione compound is obtained.
  • the compound of formula (11) is suspended in a solvent (eg, methanol, ethanol, THF, etc.) and reduced at a temperature of 178 to 50 ° C., preferably under ice-cooling, for example, sodium borohydride or the like. And react.
  • a solvent eg, ethyl acetate, methylene chloride, etc.
  • the solvent layer is dried, concentrated under reduced pressure, suspended in methanol, stirred, and washed. 5,6-Epoxy-4-hydroxy-31-alcohol, shown in (12), yields xenon.
  • Optical resolution of the compound of the formula (3) is performed by high performance liquid chromatography (HPLC) using an optically active column.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • an optically active column a separating agent containing, as an active ingredient, an aromatic carbamate derivative of a polysaccharide substituted with a group represented by the general formula (5), for example, MICEL CHIRALPAK AD (10 mm id x 250 mm) Can be.
  • MICEL CHIRALPAK AD 10 mm id x 250 mm
  • DAICEL CHIRALPAK AD use 0.1 to 0.9 v / v% acetic acid-added methanol as the mobile phase (eg, flow rate: 0.5 to 2.5 ml / min). 2004/001623
  • the optical purity can be calculated by measuring the degree of light emission of the compounds of the formulas (2) and (4) with a JASCO DIP-360 polarimeter. Since the optical rotation of the compound represented by the formula (2) is levorotatory, this is described as (-)-form. Since the optical rotation of the compound represented by the formula (4) is dextrorotatory, this is described as (+)-form.
  • (-)-DHM2EQ is caused by symptoms associated with NF- / cB activation, specifically, tumor cells such as breast cancer, ⁇ cancer, lymphoid malignancy, prostate cancer, thyroid cancer, and myeloma Symptoms, immunological diseases, allergic diseases, inflammatory diseases, tumor metastases, malignant substances, atherosclerosis, vascular neoplastic diseases (especially angiogenic diseases in tumors), leukemia (especially adult T cell leukemia) leukemia)), diseases associated with insulin resistance, diseases caused by urine, and muscular dystrophy (including prevention and suppression of progression), and have superior effects to (Sat) -DHM2EQ .
  • tumor cells such as breast cancer, ⁇ cancer, lymphoid malignancy, prostate cancer, thyroid cancer, and myeloma Symptoms, immunological diseases, allergic diseases, inflammatory diseases, tumor metastases, malignant substances, atherosclerosis, vascular neoplastic diseases (especially angiogenic diseases in tumors), leukemia (especially adult T
  • (-)-DHM2EQ is a tumor cell growth inhibitor, adhesion molecule expression inhibitor, apoptosis inducing agent, obesity prevention / prevention agent, blood sugar lowering agent, drug that releases inhibition of differentiation induction, etc.
  • (Sat) -D is more useful than KEQ.
  • apoptosis of tumor cells may or may not contribute to amelioration of symptoms caused by tumor cells.
  • the cases where apoptosis does not contribute include, for example, inhibition of tumor metastasis by inhibiting cell adhesion, inhibition of tumor growth without apoptosis, improvement of cancer malignancy, and tumor cell necrosis by inhibition of angiogenesis. It is not limited.
  • the fact that apoptosis of tumor cells does not contribute means that even if (-)-DHM2EQ is administered to an affected area, its effect does not depend on apoptosis of tumor cells in the affected area, but apoptosis depends Apart from the effects that do not, tumor cell apoptosis can occur.
  • vascular endothelial cells When inflammatory or physical stimuli are applied to vascular endothelial cells, Increased expression of cell adhesion molecules causes leukocytes to adhere to the surface of vascular endothelial cells and move out of blood vessels. This is because activation of the transcription factor NF- ⁇ in vascular endothelial cells increases the expression of adhesion molecules such as ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin. Since the adhesion of leukocytes to the blood vessel wall induces arteriosclerosis through the accumulation of lipids, conventionally, if it is possible to inhibit the adhesion between leukocytes and vascular endothelial cells, it is thought that this would lead to prevention of arteriosclerosis and suppression of Z I have been.
  • adhesion molecules such as ICAM-1, VCAM-1, and E-selectin
  • (-)-DHM2EQ When the effect of each compound on the adhesion between vascular endothelial cells and tumor cells stimulated by TF- ⁇ was examined, (-)-DHM2EQ was about 10 times stronger than (+)-DHM2EQ, and (Sat) -DHM2EQ inhibited adhesion between vascular endothelial cells and tumor cells about 3 times stronger than DHM2EQ. (-)-DHM2EQ has a superior vascular endothelial cell adhesion inhibitory effect than (Sat) -DHM2EQ.
  • (-)-DHM2EQ is more useful as a vascular endothelial cell adhesion inhibitor than (Sat) -DHM2EQ
  • the present inventors administered (Sat) -DHM2EQ to a rheumatoid arthritis model mouse in which arthritis was induced by type II collagen, and observed the symptoms.
  • (Sat) -DHM2EQ was effective in suppressing the symptoms of arthritis. It is clear that. This is Raku-shi-DHM2EQ is thought to be effective through the inhibition of NF- ⁇ ⁇ ⁇ activity. Power (Sat)-Several times higher than DHM2EQ-> More than h times more potent (-)-DHM2EQ However, it is considered to be more effective as an anti-inflammatory agent for the prevention and suppression of arthritis symptoms.
  • (-)-DHM2EQ can be expected to be a useful immunological disease suppressant and anti-inflammatory agent for symptoms such as immunological diseases and inflammatory diseases (including allergic inflammatory diseases).
  • (Sat) -DHM2EQ suppresses the proliferation of human breast cancer cells in vitro and in vivo in an apoptosis-independent manner. Based on this, (Sat) -DHM2EQ is considered to be useful as a prophylactic and therapeutic agent for breast cancer.
  • ( ⁇ )-DHM2EQ suppresses tumor growth in myeloma model mice (see Example 3). Multiple myeloma is painful, severely painful, and there is currently no cure for it. Therefore, (-)-DHM2EQ can be expected as an antitumor agent for myeloma such as multiple myeloma.
  • (-)-DHM2EQ force inhibits tumor growth in thyroid cancer model mice (see Example 4).
  • Thyroid cancer is a refractory cancer, and there is no effective treatment at present. Therefore, (-)-DHM2EQ can be expected as an antitumor agent for thyroid cancer.
  • tumor cells applied to the present invention include thyroid cancer cells, prostate cancer cells, breast cancer cells, malignant tumor cells, and knee cancer cells, but are not particularly limited thereto. 04 001623
  • any fl-heavy cells in which F- ⁇ B is activated may be used.
  • the malignant tumor cells are preferably lymphoid malignant tumor cells to be treated, and Hodgkin lymphoma cells and myeloma cells are particularly preferable. This is a significant advantage over hormone therapy because hormone-insensitive tumors that are not targeted for hormone therapy can also be treated.
  • the apoptosis-inducing agent according to the present invention can be suitably used for inducing apoptosis of malignant lymphoma cells, leukemia cells or myeloma cells, and has high specificity for malignant lymphomas, leukemias or myeloma.
  • the therapeutic effect can be expected.
  • the lymphatic malignant tumor to be treated includes malignant lymphoma, leukemia or myeloma.
  • the malignant lymphoma includes non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, etc.
  • myeloma includes plasma cell tumors such as multiple myeloma, etc.
  • leukemia includes acute lymphocytic leukemia, adult T cells. Includes leukemia lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, etc.
  • (-)-DHM2EQ can be used as an apoptosis inducer for inducing apoptosis of hypertrophic adipocytes.
  • TNF-a an inflammatory cytokine
  • This TF-hi is signaled through the insulin receptor.
  • inhibition of the transmission system causes insulin resistance (decrease in insulin sensitivity).
  • the signal transduction system through the insulin receptor rapidly moves the sugar transporter (GLUT), which normally exists in skeletal muscle cells, onto the cell membrane, and converts sugar (such as glucose) into skeletal muscle cells.
  • GLUT sugar transporter
  • One of the causes of insulin resistance is that it inhibits the uptake of sugar into cells by inhibiting the transport of sugar transporters onto cell membranes, as it also has the function of promoting uptake. Is considered.
  • (-)-DHM2EQ induces apoptosis of hypertrophic adipocytes
  • the amount of TNF- ⁇ secreted from adipocytes into the blood decreases, preventing the inhibition of sugar uptake by cells. It is not only effective as an agent for preventing and preventing obesity and as a blood sugar lowering agent, but also improves symptoms such as diseases associated with insulin resistance or diseases caused by diabetes.
  • Diseases associated with insulin resistance include, for example, type 2 diabetes mellitus, hyperinsulinemia, dyslipidemia, obesity, hypertension, and atherosclerotic diseases.Diseases caused by diabetes include, for example, There are diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, etc., and (-)-DHM2EQ can be expected to have an excellent therapeutic effect on these symptoms.
  • the present inventors examined the effect of (Sat) -DHM2EQ on the activation of F- ⁇ in adult T-cell leukemia lymphoma (ATL) cells. It was shown to inhibit the activation of NF- ⁇ .
  • (Sat) -DHM2EQ did not inhibit normal cell growth but specifically inhibited ATL cell growth. Clarified what can be done.
  • (Sat) -DHM2EQ can induce ATL cell apoptosis without inducing normal cell apoptosis. From these facts, it is considered that (HI) -DHM2EQ has anti-ATL activity (action).
  • Pests are anorexia, progressive weight loss, anemia, dry skin, and edema in chronic diseases such as malignant tumors, tuberculosis, diabetes, blood disorders, endocrine and metabolic disorders. It is a disease that presents as a general symptom with main symptoms such as This is a common symptom, especially in terminally ill patients with malignant tumors, and shows a decrease in systemic functions, especially weight loss and anemia.
  • cachexia also referred to as cachexia
  • Steroid administration is effective in suppressing the symptoms in these malignancies.
  • steroids are administered to patients with harmful substances, the metabolic abnormalities of cancer harmful substances are corrected by the action of steroids to suppress the immune response and the resulting anti-inflammatory action, as well as the action to suppress the production of plasmon-inducing cytotoxicity, resulting in weight loss and anorexia.
  • Reduces and improves catastrophic symptoms such as lethargy, malaise, and anemia.
  • long-term use of steroids is a serious problem because of its serious side effects. Since steroids are hormones that are originally possessed by themselves, ingested steroids have the same effect as excess hormones.For example, edema and hypertension appear as side effects by participating in re-absorption of salt in the kidney. Sometimes.
  • omega-3 unsaturated fatty acids suppress the production of inflammatory cytokines such as IL-6 and affect the synthesis of acute phase response proteins
  • Administration of (eicosapentaenoic acid) has been shown to have a certain effect on the improvement of pollutants.
  • such nutritional products are unlikely to produce significant and reliable effects because of their indirect effects.
  • ( ⁇ ) -DHM2EQ can inhibit the activation of NF- ⁇ , thus inhibiting the gene expression of cyclooxygenase-2 (C0X-2) caused by the activation of NF- ⁇ It is thought that it is possible. In addition, by inhibiting the gene expression of cyclooxygenase-12, it is thought that the synthesis of prostaglandin downstream of C0X-2 can also be inhibited. In tumors, NF- ⁇ activation actively promotes angiogenesis through promotion of prostaglandin synthesis, but (Sat) -DHM2EQ is activated by prostaglandin through inhibition of F-fcB activation. It is thought that the promoted neovascularization of tumor blood vessels can be inhibited. Therefore, (Sat) -DHM2EQ is considered to be also useful as a cancer therapeutic agent that exhibits an antitumor effect by inhibiting angiogenesis in tumors and inhibiting the supply of oxygen and nutrients to tumors.
  • ( ⁇ )-DHM2EQ can release the inhibition of differentiation induction from myoblasts to myocytes. Therefore, (-)-DHM2EQ can be used as a drug that releases the inhibition of differentiation induction from myoblasts to myocytes. In addition, (-)-DHM2EQ is useful for ameliorating muscular dystrophy caused by inhibiting the induction of differentiation of myoblasts into myocytes, and is expected to have an excellent therapeutic effect. I can wait.
  • chemotherapy or radiation therapy has been known as a method for treating fl swelling.
  • the use of chemotherapy and radiation therapy activates F- ⁇ in tumor cells, reducing the efficacy of cancer treatment (J. Clin. Invest. 107, 241-246, 2001).
  • radiation therapy is used to kill tumor cells, but oxidative stress from radiation activates NF-KB, making tumor cells less resistant to apoptosis and resistant to radiation therapy. .
  • the radiation may gradually become less effective. Therefore, development of a method for eliminating such resistance to cancer treatment is desired.
  • (-)-DHM2EQ which has a stronger inhibitory effect on F- ⁇ activation than (Sat) -DHM2EQ, can be used in combination with NF- / cB-activating treatment, such as chemotherapy or radiation therapy. It is believed to be useful to further enhance the effects of this treatment.
  • the antitumor agent used in the above chemotherapy may be any one that activates at least F- ⁇ , such as camptothecin (CPT) or daunomycin (component name: daunorubicin; DNR or DM) and other antitumor agents.
  • CPT camptothecin
  • daunomycin component name: daunorubicin; DNR or DM
  • the drug used in combination with (-)-DHM2EQ is not limited to an anticancer drug, and any drug can be used as long as it activates NF-8 and thus causes resistance to treatment.
  • (-)-DHM2EQ can be used for infectious diseases, allergic diseases, immune diseases, inflammatory diseases, tumor metastases, bad malignancies, atherosclerosis, angiogenic diseases (especially angiogenic diseases in tumors), leukemia (In particular, it can be expected to increase the effect of treatment by using it in combination with the treatment used for diseases such as adult T cell leukemia).
  • (-)-DHM2EQ may be administered at the same time as the treatment to activate F- ⁇ , but after the treatment to activate NF- ⁇ , the activation of NF- ⁇ It may be used to inhibit the above. In addition, it may be administered in advance to inhibit the activation of F- ⁇ .
  • the target of treatment may be a mammal other than human and human with the above-mentioned disease.
  • R 2 is a C 1-4 alkyl group, and examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group and isomers thereof, and a methyl group, An ethyl group is preferred, and a methyl group is particularly preferred.
  • the compound of formula (17) is dissolved in a solvent (eg, acetone), p-toluenesulfonic acid is added, and the mixture is reacted at room temperature with stirring.
  • a solvent such as ethyl acetate
  • Tyrone rheamide 2-cyclohexenone (DHM3 EQ) can be obtained.
  • the (Sat) -DHM3EQ thus produced is also an optically active column packed with a separating agent containing an aromatic carbamate derivative of a polysaccharide substituted with a group represented by the formula (5) as an active ingredient.
  • a separating agent containing an aromatic carbamate derivative of a polysaccharide substituted with a group represented by the formula (5) as an active ingredient.
  • the optically active column it is preferable to use a column that can directly optically resolve (Sat) -DHM2EQ into (+)-DHM2EQ and ( ⁇ )-DHM2EQ. - the DHM2EQ (+) - DHM 2 EQ and (-) - DHM2EQ directly to, arbitrary preferable to use a separating agent capable of optical resolution.
  • R 1 is a hydrogen atom, a propionyl group, or a butanol group, or an isomer thereof is also described as having the same pharmacological action. Conceivable.
  • the compound of the present invention may be in the form of a pharmacologically acceptable salt, for example, an organic salt such as a quaternary ammonium salt, or a metal salt such as an alkali metal.
  • a pharmacologically acceptable salt for example, an organic salt such as a quaternary ammonium salt, or a metal salt such as an alkali metal.
  • Such a salt of the compound can be produced by a known method.
  • ( ⁇ ) -5-dehydroxymethylepoxyquinomycin C (DHM2EQ) was synthesized.
  • the optical resolution of the obtained (sat) -DHM2EQ was determined by using DAICEL CHIRALPAK AD (10 ⁇ id X 250 ⁇ ) with 0.5v / v% acetic acid-added methanol as the mobile phase (flow rate: l. Oml / rain).
  • High-performance liquid chromatography (HPLC) detection wavelength: 315nraUV, force ram temperature: 0 ° C was used.
  • Human acute promyelocytic leukemia cell line the HL- 60 cells (Japanese Collection of Research Bioresources) is inactivated and the RPMI1640 medium containing 10% FBS (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan) using a 3 7 ° C, and cultured in 5% C0 2 in Inkyubeta one inside.
  • each well was washed twice with PBS (phosphate buffered saline) warmed to 37 ° C, and a new medium was added to each well (200 / zl / well). Then, plated at a concentration of the HL- 60 cells per Ueru 6. 0 X 10 4 cells / Ueru (20 ⁇ ⁇ / Ueru) and incubated for 1 hour at 37 ° C, 5% C0 2 . Next, each well was washed three times with PBS warmed to 37 ° C to remove non-adhered HL-60 cells, and a fresh medium (200 ⁇ l / well) was added.
  • PBS phosphate buffered saline
  • HL-60 cells adhered to HUVEC were confirmed under a microscope, and the cell adhesion ability was evaluated by measuring the number of adherent cells in the visual field of the microscope.
  • Fig. 4 shows the results. Incidentally, showing the IC 5 0 when using the respective DHM2EQ in FIG. As shown in FIG. 4, it became clear that (-)-DHM2EQ had a 10-fold and 3-fold stronger cell adhesion inhibitory activity than (+)-DHM2EQ and (Sat) -DHM2EQ, respectively.
  • the anti-tumor effect of (-)-DHM2EQ on human thyroid cancer was examined.
  • the medium was replaced with a medium containing ⁇ ⁇ ⁇ (3-isobutylyl-1-methylxanthine), ⁇ ⁇ (dexamethasone), and 1 ig / ml insulin.
  • the medium was replaced with a medium containing lzg / ml insulin, followed by culturing for 3 days, and then replaced with a normal medium (DMEM containing 10% FBS). Thereafter, the medium was changed every three days until 50 days.
  • (-)-DHM2EQ is associated with insulin resistance syndrome caused by hypertrophic adipocytes secreting TNF-Q! (Eg, type 2 diabetes, hyperinsulinemia, lipid metabolism disorder, obesity, hypertension) It is considered useful for the improvement (including prevention and treatment) of atherosclerotic diseases.
  • (-)-DHM2EQ is also considered to be useful as an obesity preventive agent, a diet agent, and a blood sugar lowering agent.
  • (-)-DHM2EQ is considered to be useful for the improvement (including prevention and treatment) of diabetes-related diseases (eg, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, etc.).
  • diabetes-related diseases eg, diabetic nephropathy, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, etc.
  • (-)-DHM2EQ is considered to be useful as an anti-obesity agent (anti-obesity prevention 'inhibitor (including dietetic agent)) and an anti-diabetic agent.
  • the mouse skeletal muscle-derived myoblast cell line C2C12 (purchased from RIKEN Cell Bank) was adjusted to 7.5 x 10 4 cells / ml using DMEM (culture medium) containing 10% FBS. 1 ml was inoculated in each well of a plastic 12-well plate laid with (Matsunami Glass Industry Co., Ltd., Osaka, Japan). Then, when the cells grew to confluence in each well, the medium was replaced with DMEM (differentiation medium) containing 2% heat-inactivated horse serum. For TNF- ⁇ (1 ng / ml) and / or (-)-DHMEQ (3 / zg / ml), each drug was added at this time. Six days later, the medium was removed after confirming the appearance of multinucleated myocytes, an indicator of myocyte differentiation. As a control, cells cultured in a culture medium were prepared so as to be just a confection on the sixth day.
  • the sample prepared as described above was placed on a slide glass, and a photograph was taken at a magnification of 400 ⁇ using a fluorescence microscope (Nikon UFX-DX; set to a 40 ⁇ objective lens for phase contrast, Ph2). Taken.
  • a fluorescence microscope Nekon UFX-DX; set to a 40 ⁇ objective lens for phase contrast, Ph2.
  • the 1 ng / rnl TNF - a is inhibited induction of differentiation from myoblasts into muscle cells, for 1 ⁇ 3 ⁇ g / m l ( -) - DHM2EQ this It was revealed that the inhibition of differentiation induction was released.
  • the differentiation rate of C2C12 cells that had not been induced to differentiate was 0%.
  • a pharmaceutical composition useful for conditions such as an immune disease, an allergic disease, an inflammatory disease, tumor metastasis, a malignant substance, and atherosclerosis, and an optically active compound contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition are provided. Manufacturing methods and direct splitting methods can be provided.

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Abstract

抗腫瘍剤や抗炎症剤として有用な(-)-DHM2EQは、例えば、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）を有効成分とする分離剤が充填されている光学活性カラムを用いることにより、(±)-DHM2EQから直接、光学分割することができる。前記光学活性カラムを用いた光学分割により得られた(-)-DHM2EQまたはその薬理学的に許容される塩は様々な症状を改善するための医薬組成物として有用である。

Description

明 細 書 医薬組成物 関連文献とのクロスリファレンス
本願は、 2003年 2月 14日付けで出願した日本国特願 2003— 3716 7号、 2003年 2月 1 8日付けで出願した日本国特願 2003-39098号、 及ぴ 2003年 8月 6曰付けで出願した日本国特願 2003— 28828 1号 に基づく優先権を主張する。 これらの文献を本明細書に援用する。 技術分野
本発明は、 医薬組成物、 腫瘍細胞増殖阻害剤、 細胞接着阻害剤、 アポトーシス 誘導剤、 肥満予防 ·Ρ方止剤、 血糖値低下剤、 分化誘導の阻害を解除する薬剤、 及 びこれらの医薬組成物■薬剤に有効成分として含有する光学活性を有する化合物、 すなわち、 5—デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン Cの光学活性体の直接 分割方法、 及び治療方法に関する。 背景技術
癌や白血病、 およびリュウマチ、 脖炎、 肝炎、 消化器系炎症などの炎症性疾患 には効果的な治療薬がなく、 新しい機構で働く新規化学療法が期待されている。 また、 その他、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 腫瘍転移、 悪疫質、 動脈硬化、 血 管新生性疾患などにおいても新しい機構で働く新規化学療法が期待されている。 近年 NF- κ Βは腫瘍や炎症部位で活性化されることが明らかとなってきた。 そして 最近発見された F - κΒ阻害剤 5—デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン C( 通称 dehydroxymethylepoxyquinomicin (DHMEQ) )は細胞レべノレで強く NF- κ Bを阻 害し（A, Ariga et al.， J. Biol. Chera. 277, 24625-24630, 2002)、 動物の個 体レベルでも前立腺癌（Cancer Res. 2003, Jan 1； 63(1)： 107- 10)や乳癌（2002 年度日本癌学会総会記事， P157)の増大を強く抑制し、 リュウマチのモデルマウ スにおける症状も抑制する（N. Matsumoto et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, T JP2004/001623
2
865-869, 2000)。 DHM2EQは、 それら腫瘍細胞等に特異 I1生が高く、 毒性が低い。 そ こで DHM2EQは新規の抗腫瘍剤、 抗炎症剤としての役割が期待されている。
DH EQの光学活性体の従来の製造法を図 1に示す。まず、ラセミ体の DHM2EQ (式 (2) )のフエノール性水酸基をー且シリル基で保護した化合物 （式 (16) ) をキラル カラムにより分割して光学活性体の化合物 （式 (17)及ぴ式 (18) ) を得、 ついでそ れぞれを脱保護することにより目的とした光学活性な (-) - DHM2EQ (式 (2) )と（+) - DHM2EQ (式（4) ) を得ている。 しかし本方法では工程の長さによる収率の損失と いう問題が指摘されている（N. Matsumoto et al. , Bioorg. Med. Chem. Lett. 10， 865-869, 2000)。
そこで、 本発明は、 医薬,組成物に有効成分として含有させるための、 優れた薬 理作用を有し、 かつ特異性の高い化合物を、 迅速かつ高い収率で得ることができ る方法を提供することを主たる目的とする。 また、 本発明は、 前記化合物を有効 成分とする医薬組成物を提供することも目的とする。 発明の開示
本発明者らは、 上記問題点を克服するべく鋭意検討した結果、 式 (5)で表され る基で置換された多糖の芳香族力ルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を 充填した光学活性な力ラムを用い、高速液体ク口マトグラフィー（HPLC)により、 式 (3)で表される化合物のラセミ体を光学活性な化合物（式 (2)， 式 (4) ) に直接、 光学分割できることを見出した （図 2 )。
また、 本発明者らは、 式 (3)で表される化合物のラセミ体が有する血管内皮細 胞の接着阻害作用より優れた作用を光学活性な化合物 （式 (2)， 式 (4) ) が有する か否かを調べるため、式 (2)、式 (3)、式 (4)で表される化合物をそれぞれ用いて、 ヒ ト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) とヒト急性骨髄性白血病細胞 HL - 60との接着を調 ベた。 その結果、 式 (2)で表される化合物が、 式 (3)及ぴ式 (4)で表される化合物 より優れた血管内皮細胞の接着阻害作用を示すことを見出した。
さらに、 本発明者らは、 式 (2)で表される化合物が、 多発性骨髄腫、 甲状腺癌 などの腫瘍細胞の増殖を抑制することを見出した。
また、 本発明者らは、 肥大化脂肪細胞を式 (2)で表される化合物で処理するこ とにより、 肥大化脂肪細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出した。
さらに、 本発明者らは、 肥満 ' 2型糖尿病モデル動物において、 式 (2)で表さ れる化合物が、 高脂肪食負荷による体重の増加を抑制することを見出した。
また、本発明者らは、培養細胞における筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻 害を式 (2)で表される化合物が解除することを見出した。 このようにして、 本発 明者らは本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明に係る医薬組成物は、 下記の一般式 (1)で表される光学活性 な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、 NF - κ Βの 活性化を伴う症状を改善することを特徴とする。
Figure imgf000005_0001
式中、 R 1は水素原子または C 2 ~ 4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオュル基、 及びブタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
また、 前記化合物が次式 (2)であることが好ましい。
Figure imgf000005_0002
本発明に係る医薬糸且成物は、 腫瘍細胞にアポトーシスをおこすことによって、 少なくとも 1つの症状を改善することを特徴とし、 腫瘍細胞のアポトーシスが寄 与しないで、 腫瘍細胞に起因する少なくとも 1つの症状を改善することを特徴と する。
前記 NF- の活性化を伴う症状は、 例えば、 腫瘍細胞に起因するものであつ てもよい。 前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、 前記症状を改善すること を特徴とする。 また、 腫瘍細胞と血管内皮細胞との接着を阻害することにより、 前記症状を改 善することを特徴とする。
なお、 前記症状は、 例えば、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 腫瘍 転移、 悪疫質、 動脈硬化、 血管新生性疾患 （fl重瘍内の血管新生性疾患）、 白血病 からなるグループから選ばれる症状である。
前記腫瘍としては、 例えば、 骨髄腫、 甲状腺癌、 乳癌、 膝癌、 悪性腫瘍、 前立 腺癌などである。
また、 本発明に係る医薬組成物は、 NF- κ Β を活性化させる治療による F- K B の前記活性化を阻害することにより、 前記治療の効果を増大させることができる 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有することを特徴とする。
Figure imgf000006_0001
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及ぴプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
また、 前記化合物が次式 (2)であることが好ましい。
Figure imgf000006_0002
前記 NF- κ Bを活性化させる治療は、抗腫瘍剤を用いた治療であってもよいし、 腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。 なお、 前記医薬組成物 と前記抗腫瘍剤とを有効成分として含有することとしてもよい。 前記抗腫瘍剤と は、 例えば、 カンプトテシンまたはダウノルビシンなどである。
また、 本発明に係る医薬組成物は、 下記の一般式（1)で表される光学活性な化 5
合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有し、 T F -ひによつ て引き起こされる疾患を改善することを特徴とする。
Figure imgf000007_0001
式中、 R 1は水素原子または C 2 4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及ぴプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 なお、 前記化合物は次式 (2) であることが好ましい。 一
Figure imgf000007_0002
前記 TNF- o;によって引き起こされる疾患は、例えば、インスリン抵抗性を伴う 疾患、 糖尿病に起因する疾患、 筋ジス トロフィーなどであってもよい。
なお、 上述の医薬組成物は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成 分として含有することを特徴としているが、 実質的に (+)-体の化合物を含有しな いものが特に好ましい。
本発明に係る、 J3重瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤は、 下記 の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を 有効成分として含有することを特徴とする。
Figure imgf000007_0003
式中、 R 1は水素原子または C 2 4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 6
基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及ぴプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
なお、本発明に係る、腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細胞増殖阻害剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成分として含有することを特徴 としているが、 実質的に（+) -体の化合物を含有しないものが特に好ましい。
また、 前記化合物が次式 (2)であることを特徴としてもよい。
Figure imgf000008_0001
本発明に係る、 血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分子発現 抑制剤は、 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に 許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。 一 '
Figure imgf000008_0002
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及ぴブタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
なお、 本発明に係る、 血管内皮細胞の接着分子の発現を抑制するための接着分 子発現抑制剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成分として含有 することを特徴としているが、 実質的に（+)-体の化合物を含有しないものが特に 好ましい。
また、 前記化合物が次式 (2)であることを特徴としてもよい。 T JP2004/001623
7
Figure imgf000009_0001
本発明に係る、 腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導剤 は、 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容さ れる塩を有効成分として含有することを特徴とする。
Figure imgf000009_0002
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオュル基、 及ぴプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
なお、 本発明に係る、 fl重瘍細胞のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス 誘導剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成分として含有するこ とを特徴としているが、 実質的に（+) -体の化合物を含有しないものが特に好まし い。
前記化合物が次式 (2)であることを特徴としてもよい。
Figure imgf000009_0003
本発明に係る、 肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤は、 下 記の一般式（ 1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩 を有効成分として含有することを特徴とする。
Figure imgf000010_0001
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及びプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 前記化合物は次式 (2)である ことが好ましい。
Figure imgf000010_0002
なお、 本発明に係る、 肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤 は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成分として含有することを特 徴としているが、 実質的に（+) -体の化合物を含有しないものが特に好ましい。 ま た、 本発明に係る、 肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導するための誘導剤は、 さらに、 TNF- aを有効成分として含有することとしてもよい。
本発明に係る肥満予防■防止剤は、 下記の一般式（1)で表される光学活性な化 合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴 とする。
Figure imgf000010_0003
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオュル基、 及ぴプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 前記化合物は次式 (2)である 4 001623
ことが好ましい。
Figure imgf000011_0001
なお、 本発明に係る肥満予防，防止剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化 合物を有効成分として含有することを特徴としているが、 実質的に (+) -体の化合 物を含有しないものが特に好ましい。
本発明に係る血糖値低下剤は、 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物 またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とす る。
Figure imgf000011_0002
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及びブタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 前記化合物は次式 (2)である ことが好ましい。
Figure imgf000011_0003
なお、 本宪明に係る血糖値低下剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物 を有効成分として含有することを特徴としているが、 実質的に (+)-体の化合物を 含有しないものが特に好ましい。
本発明に係る、 細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤は、 下記の一般式（1)で表 される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として 01623
10
含有するこどを特徴とする。
Figure imgf000012_0001
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオ-ル基、 及びブタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 前記化合物は次式 (2)である ことが好ましい。
Figure imgf000012_0002
なお、 前記細胞分化誘導の阻害は、 例えば、 T N F- αによる筋細胞分化の抑 制であってもよい。また、本発明に係る、細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤は、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を有効成分として含有することを特徴 としているが、 実質的に（+) -体の化合物を含有しないものが特に好ましい。 また、 本発明は、 式 (3) ：
Figure imgf000012_0003
または式 (4) ： JP2004/001623
Figure imgf000013_0001
で表される光学活性な化合物を製造する方法を提供することができる。 前記光学 分割は、 光学活性カラムを用いることとしてもよい。
前記光学活性力ラムは、 下記の式 (5)で表される基で置換された多糖の芳香族 力ルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填されているものであればよ
Figure imgf000013_0002
式中、 R 3〜R 7は、 水素原子、 または炭素数 1〜8のアルキル基であってもよ いし、 炭素数 1〜8のアルコキシ基、 炭素数 6〜1 4の芳香族基、 またはハロゲ ン原子などであってもよい。
前記多糖の芳香族力ルバメート誘導体は、 アミローストリス （3 , 5—ジメチ ルフエュルカルバメート） であることとしてもよいし、 セルローストリス （3 , 5—ジメチルフエエル力ルバメート） であることとしてもよい。 特に、 アミロー ストリス （3， 5—ジメチルフエ二ルカルバメート） を有効成分とする分離剤が 充填された DAICEL CHIRALPAK AD (ダイセル化学工業 （株）） が好ましい。
本発明の方法により、 効率よく、 大量に、 光学活性な DHMEQを製造することが できる。
本発明の方法により、 式 (2)または (4)で表される光学活性な DHMEQを製造する ことができるが、 これらの光学活性体のうち、 式 (2)で表される化合物の方が式 (4)で表される化合物より生物学的活性 （薬理活性） が高いことが後述の実施例 で示されている。
また、 本発明に係る直接分割方法は、 式 (3) P T/JP2004/001623
Figure imgf000014_0001
で表される化合物のラセミ体を、 下記の式（5)で表される基で置換された多糖の 芳香族力ルバメート誘導体を有効成分とする分離剤によって直接、 光学分割する ことを特徴としてもよレ、。
Figure imgf000014_0002
式中、 R 3〜R 7は、 水素原子、 または炭素数 1〜 8のアルキル基であってもよ いし、 炭素数 1〜8のアルコキシ基、 炭素数 6〜1 4の芳香族基、 またはハロゲ ン原子などであってもよい。
前記多糖の芳香族力ルバメート誘導体は、 アミロース トリス （3 , 5—ジメチ ルフエュルカルバメート） であることとしてもよいし、 セルローストリス （3， 5ージメチルフエ二ルカルバメート） であることとしてもよい。
本発明に係る治療方法には、 NF- κ Bの活性化を伴う症状を改善するための下記 の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を 用いることとする。
Figure imgf000014_0003
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及ぴブタノイノレ基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
また、 前記化合物は次式 (2)であることが好ましい。
Figure imgf000015_0001
本^明に係る治療方法は、 腫瘍細胞にアポトーシスを起こすことによって、 少 なくとも 1つの症状を改善することとしてもよいし、 JK瘍細胞のアポトーシスが 寄与しないで、 腫瘍細胞に起因する少なくとも 1つの症状を改善することとして もよい。
前記 NF- κ Β の活性化を伴う症状は、 例えば、 腫瘍細胞に起因するものであつ てもよい。
前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、 前記症状を改善することとしても よいし、 腫瘍細胞と血管内皮細胞との接着を阻害することにより、 前記症状を改 善することとしてもよい。
なお、 前記症状は、 例えば、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 fl重瘍 転移、 悪疫質、 動脈硬化、 血管新生性疾患 （腫瘍内の血管新生性疾患）、 白血病 からなるグループから選ばれる症状である。
前記腫瘍としては、 例えば、 骨髄腫、 甲状腺癌、 乳癌、 膝癌、 悪性腫瘍、 前立 腺癌などである。
また、 本発明に係る治療方法には、 F- κ Β を活性化させる治療による NF- Κ Β の前記活性化を阻害することにより、 前記治療の効果を増大させることができる 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される 塩を有効成分として含有すること医薬組成物を使用することとする。
Figure imgf000015_0002
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 ァ /レカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオニル基、 及びブタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。
また、 前記化合物は次式 (2)であることが好ましい。
Figure imgf000016_0001
前記 F- κ Bを活性化させる治療は、抗腫瘍剤を用いた治療であってもよいし、 腫瘍細胞に対する放射線照射による治療であってもよい。 なお、 前記医薬組成物 と前記抗腫瘍剤とを有効成分として含有することとしてもよい。 前記抗腫瘍剤と は、 例えば、 カンプトテシンまたはダウノルビシンなどである。
また、 本発明に係る治療方法には、 TNF- aによって引き起こされる疾患を改善 するために下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に 許容される塩を用いることとする。 ―
Figure imgf000016_0002
式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基であり、 アルカノィル 基としては、 ァセチル基、 プロピオュル基、 及びプタノィル基、 並びにこれらの 異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 なお、 前記化合物は次式 (2) であることが好ましい。
Figure imgf000016_0003
前記 T F-ひによって引き起こされる疾患は、例えば、インスリン抵抗性を伴う 疾患、 糖尿病に起因する疾患、 筋ジス トロフィーなどであってもよい。
なお、 上述の治療方法には、 優れた薬理作用を有する（-) -体の化合物を用いる 15
こととしているが、 実質的に（+) -体の化合物を含有しないものが特に好ましい。 図面の簡単な説明
図 1は、 DHM2EQの光学活性体の従来の製造法の反応スキームを示す図である。 図 2は、 本発明の光学活性な DHM2EQ (式 (2)， 式 (4) ) の製造方法の反応スキー ムを示す図である。
図 3は、 （-） -DHM2EQおよび（+) -DHM2EQの HPLCプロフィールを示す図である。 図 4は、（-) - DHM2EQが HUVECと HL- 60細胞の接着に及ぼす抑制効果を示す図で ある。
図 5は、（-) -DHM2EQが骨髄腫モデルマゥスに及ぼす抗腫瘍効果を示す図である。 図 6は、（-) - DHM2EQが甲状腺癌モデルマウスに及ぼす抗腫瘍効果を示す図であ る。
図 7は、（-) -DHM2EQの肥大化脂肪細胞に対するアポトーシス誘導作用の解析結 果を示す図である。
図 8は、（-) -DHM2EQが肥満型糖尿病モデルマゥスに及ぼす体重増加抑制作用を 示す図である。
図 9は、 （-) - DHM2EQ が筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を解除する効 果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、 実施例を挙げながら 詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sarabrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed. ) , Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition) , Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)； F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコ一ノレ集に記載の方法、 あるいはそれを修飾 したり、 改変した方法を用いる。 また、 市販の試薬キットや測定装置を用いてい る場合には、 特に説明が無い場合、 それらに添付のプロトコールを用いる。 JP2004/001623
16
なお、 本宪明の目的、 特徴、 利点、 及ぴそのアイデアは、 本明細書の記載によ り、 当業者には明らかであり、 本明細書の記載から、 当業者であれば、 容易に本 発明を再現できる。 以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例など は、 本宪明の好ましい実施態様を示すものであり、 例示又は説明のために示され ているのであって、 本発明をそれらに限定するものではない。 本明細書で開示さ れている本発明の意図並びに範囲内で、 本明細書の記載に基づき、 様々な改変並 びに修飾ができることは、 当業者にとって明らかである。
NF- /c B は、 生体防御反応に関与する中心的な転写因子であり、 NF- zc B により 誘導される遺伝子は免疫グロブリン以外にサイトカイン （IL (interleukin) - 1、 IL- 2、 IL- 6、 IL- 8、 T F (tumor necrosis f actor) - αなど）、 細胞接着因子 （Ε -セ レクチン、 I CAM (intercellular adhesion molecule) - 1、 VCAM (vascular cell adhesion molecule) -1 など）、 一酸化窒素 （NO) 合成酵素、 Fas リガンド等の免 疫応答や炎症反応に深く関わっているものが多いことが知られている（Cell, 87, 13-20, 1996)。 また、 膀胱癌、 乳癌、 メラノーマなどで報告されている NF - κ Β の恒常的活性化は、 アポトーシスの抑制、 細胞増殖の促進、 細胞分化の抑制等を はじめとする腫瘍形成の様々な面に関与し、 腫瘍形成を促進すると考えられてい る （J. Clin. Invest. 107, 241-246, 2001)。 一方、 F- /c Bの活性化阻害タンパ ク質 Ι κ Β の遺伝子導入により特異的に細胞死が誘導されることが報告されてい るので、 F- K Bの活性化阻害作用を有する化合物は、抗炎症作用ゃ抗腫瘍活性を 有する医薬品や薬剤として期待されている。
NF - κ Βの活性化阻害作用を有する化合物としては、従来、サリチル酸アミド誘 導体（TO01/12588 Al)、パネポキシドン （panepoxydone； Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 214-221， 1996)， シクロエポキシドン（cycloepoxydon； J. Antibiot. 51, 455-463, 1998) , SN—50 (J. Biol. Chem. 270, 14255-14258, 1995)などが 知られている。
上述のサリチル酸ァミド誘導体は、 毒性のない抗生物質エポキシクイノマイシ ン （epoxyquinomicin) の構造をもとに新しくデザインされたものであるが、 近 年、 本発明者らは、 この化合物のラセミ体が抗炎症作用、 免疫抑制作用、 抗腫瘍 活性、 抗動脈硬化作用、 腫瘍転移抑制作用、 抗悪疫質作用、 抗アレルギー作用、 及び血管新生抑制作用などを有することを明らかにしている。
ラセミ体には 2つのェナンチォマー （(+) -体及び (-） -体） が混在して、 一般 的にそれらのェナンチォマーは、 沸点、 融点などの物理的な性質がほとんど同 じである。 しかしながら、 （+) -体及び (-) -体の化合物は、 通常生体に対する作 用を異にする場合がある。 例えば、 「サリ ドマイドの悲劇」 のように、 一方の ェナンチォマーは睡眠作用や鎮静作用を有するのに対して、 もう一方のェナン チォマーは催奇作用 （胎児奇形誘発作用） を有することが知られている。 また、 医薬品や農薬などにおいては、 ラセミ体より、 一方のェナンチォマーを有効成分 として含有させた薬剤を用いることにより、 より優れた効果が得られ、 副作用が 少ないことが知られている。 従って、 医薬品等に対しては、 光学的に純粋な化合 物を調製することが極めて重要な課題となっている。
本発明者らは、 既に前記サリチル酸アミド誘導体のラセミ体を（+) -体及び (-) - 体の化合物に分割することを試みている （Bioorg. Med. Chem. Lett. 10， 865-8 69, 2000)。 しかしながら、 前記化合物の分割方法は、 前記化合物のラセミ体の フエノール性水酸基をー且シリル基で保護した化合物を作製しなければならな かった。 そこで、 本発明者らは、 様々な誘導体を有効成分とする分離剤を担持す る光学活性力ラムを用いて前記化合物のラセミ体を（-) -体及び (+) -体の化合物 に直接分割できるかどうかを調べた。 その結果、 式 (6)
Figure imgf000019_0001
で表される基で置換された多糖の芳香族力ルバメート誘導体を有効成分とする 分離剤を用いることにより、 前記化合物のラセミ体を（-) -体及ぴ (+) -体の化合物 に直接、 光学分割できることを見出した。
なお、 置換基が分子の形に変化を与えたり、 置換基自体の持つ物理的化学的特 性及び置換基が芳香族環の π電子系に与える電子的影響などが複雑に組み合わ さっていたりすることから、 分離や吸着の特性の著しい変化と置換との関係を考 慮に入れると、 下記の一般式 (5) 1623
18
Figure imgf000020_0001
で表される置換基 （一R 3、 一 R 4、 一 R 5、 一 R 6、 及び一 R 7) を水素原子、 ま たは炭素数 1〜 8のアルキル基としても、 炭素数 1〜8のアルコキシ基、 炭素数 6〜1 4の芳香族基、 またはハロゲン原子などとしてもよい。
多糖の芳香族力ルバメート誘導体の原料となる多糖は、 合成多糖、 天然多糖、 及び天然変性多糖のいずれかを問わないが、 光学活性を有する多糖が好ましく、 高純度の多糖が容易に得られるアミロースやセルロースなどがより好ましい。 そ の他、 高純度の多糖が容易に得られるものとして、 一 1， 4一キトサン、 キチ ン、 0— 1， 4一マンナン、 ]3一 1， 4ーキシラン、 ィヌリン、 カードランなど を原料とすることとしてもよい。 また、 本実施例においては、 多糖の芳香族カル パメート誘導体として、 アミローストリス （3， 5—ジメチルフエ二ルカルバメ ート）を用いて、本発明の直接分割方法を行っている力 セルローストリス （3， 5ージメチルフエュルカルバメート） を適用することとしてもよい。
ここでは、 分離剤に有効成分として含有される多糖の力ルバメート誘導体につ いて説明したが、 その他、 エステル誘導体やエーテル誘導体、 芳香族カルバメー ト以外のカルパメート誘導体などの多糖誘導体を用いることとしてもよい。
これらの分離剤を担持する担体としては、 有機担体または無機担体が一般的に 用いられるが、無機担体がより好ましい。このような無機担体としては、例えば、 シリカゲル、 アルミナ、 マグネシア、 酸化チタン、 ガラス、 ケィ酸塩、 カオリン などがある。 担体の粒径は使用するカラムのサイズにより異なるが、 一般に 0. 5 Ai m〜： 10瞧であり、 好ましくは1 111〜300 111でぁり、 より好ましくは 5 μ m〜20 m である。 また、 その性状は多孔質であることが好ましく、 その場合孔の平均細孔 径は 10Α〜100 μ mであることが好ましく、 50 A〜50000 Aであればより好ましい。 前記多糖の芳香族力ルバメート誘導体を担体に担持する方法としては、 例えば、 多糖の芳香族力ルバメート誘導体を溶剤に溶解してドープとし、 これを攪拌しな がらゆっくりと担体に滴下して、 担体に均一にコーティングさせる方法、 等の一 般的な方法を用いることができる。 また、 上記直接分割方法を適用することにより、 式 (3)で表される化合物のラ セミ体から簡便に光学活性な化合物 （式 (2)及び式 (4) ) を製造することも可能で ある。 以下、 その製造方法について詳述する。
= = =式 (2)及び式 (4)で表される化合物の製造方法 = = =
一般式（1¾で表される化合物は、 wipfらの合成法 （Synthesis, I2号， 1δ49 - 56 1頁， 1995年） に準じて製造することができる。
一般式 (12)で表される化合物の製造方法の一例を下記の反応工程式に基づい て説明する。
下記の反応工程式において、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基 であり、 アルカノィル基としては、 ァセチル基、 プロピオュル基、 及びブタノィ ル基、 並びにこれらの異性体基が挙げられ、 特にァセチル基が好ましい。 R 2は C 1〜4のアルキル基であり、 アルキル基としては、 メチル基、 ェチル基、 プロ ピル基、 プチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、 メチル基、 ェチル基が好 ましく、 メチル基が特に好ましい。 また、 Xはハロゲン原子であり、 ハロゲン原 子としては、 フッ素、 塩素、 臭素、 及びヨウ素原子が挙げられ、 塩素原子、 臭素 原子が好ましく、 塩素原子が特に好ましい。
(7)
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
1623
20
工程（a ) : N— ( 2—アルカノィルベンゾィル） 一 2 , 5—ジメトキシァニリン の調製
2， 5—ジメトキシァニリンを溶媒 （例えば、 ピリジンなど） に溶解させ、 一 7 8〜 5 0 ° (：、 好ましくは氷冷下で、 式（7)の O—アルカノィルサリチロイルハ ライドの酢酸ェチノレ溶液を加えて、 攪拌しながら反応させる。 水を加えて反応を 停止させた後、酢酸ェチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、 減圧濃縮、 及ぴ真空乾燥することにより式 (8)で示される N— （2—アルカノィ ルベンゾィル） 一 2， 5—ジメトキシァニリン化合物が得られる。 この化合物は 精製せず、 次の工程に使用できる。
工程（b ) : 3— (O—アルカノィルサリチロイルアミド） 一 4， 4—ジアルコキ シー 2， 5—シクロへキサジェノン化合物の調製
上記で得られた式 (8)の化合物を溶媒 （例えば、 メタノール、 エタノールなど） に溶解させ、 一 2 0〜 5 0 °C、 好ましくは永冷下で、 ジァセトキショードベンゼ ンを加え、 室温で攪拌しながら反応させる。 減圧濃縮後、 酢酸ェチルを加え、 重 曹水、 食塩水で順次洗浄し、 溶媒層を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマ トグラフィ一にて精製することにより、 式 (9)で示される 3— ( O—アルカノィ ノレサリチロイルアミド） 一4， 4ージァノレコキシ一 2， 5—シクロへキサジエノ ン化合物が得られる。
工程（c ) ： 5 , 6—エポキシ一 4， 4—ジアルコキシ一 3—アルカノィルサリチ ロイルアミドー 2—シクロへキセノン化合物の調製
式 (9)の化合物を溶剤 （例えば、 テトラヒドロフラン、 メタノールなど） に溶 解させ、 一 2 0 ~ 5 0 °C、 好ましくは氷冷下で、 過酸化水素水及び水酸化ナトリ ゥムを加え、 攪拌しながら反応させる。 反応液に酢酸ェチルを加え、 塩酸溶液、 チォ硫酸ナトリウム水溶液、 食塩水で順次洗浄し、 大気中で乾燥した後、 真空乾 燥する。 残存する原料化合物を除去するため、 残渣をアセトンに溶解させ、 P— トルエンスルホン酸を加え、 室温で攪拌して原料化合物を分解する。 メタノール を減圧留去して得られた残渣に酢酸ェチルを加え、 水で洗浄する。 酢酸ェチル層 を乾燥して得られた残留物を力ラムクロマトグラフィ一で精製して、 式 (10)で示 される 5， 6—エポキシ一 4 , 4—ジアルコキシ一 3—アルカノィルサリチロイ 2004/001623
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ルアミドー 2—シクロへキセノン化合物が得られる。
工程（d )： 5， 6—エポキシ一 2—アルカノィルサリチロイルアミドー 2—シク 口へキセン一 1， 4ージオンの調製
式（10)の化合物を溶剤 （例えば、 塩化メチレンなど） に溶解させ、 氷冷下で無 機酸または有機酸（例えば、三フッ化ホウ素ジェチルエーテル錯体など）を加え、 攪拌しながら反応させる。 反応液に溶剤 （例えば、 酢酸ェチルなど） を加え、 水 で洗浄し、 溶剤層を濃縮した後、 得られた残渣をメタノールで洗浄して式 (11)で 示される 5， 6—エポキシ一 2—アルカノィルサリチロイルアミ ドー 2—シクロ へキセン一 1 , 4ージオン化合物が得られる。
工程（e )： 5， 6—エポキシ一 4—ヒドロキシー 3—アルカノィルサリチロイル アミドー 2—シクロへキセノンの調製
式（11)の化合物を、 溶媒 （例えば、 メタノール、 エタノール、 T H Fなど） に 懸濁し、 一 7 8〜5 0 °C、 好ましくは氷冷下で、 還元剤 （例えば、 水素化ホウ素 ナトリウムなど） を加えて反応させる。 反応液に溶剤 （例えば、'酢酸ェチル、 塩 化メチレンなど） を加え、 塩酸、 水で順次洗浄し、 溶剤層を乾燥後、 減圧濃縮し て、 メタノールで懸濁、 攪拌、 洗浄して、 式（12)で示される 5， 6—エポキシ一 4—ヒドロキシ一 3一アル力ノィルサリチロイルァミ ドー 2—シク口へキセノ ンが得られる。
なお、 式 (7) の O—アルカノィルサリチロイルハライドとして、 O—ァセチル サリチ口イルク口リ ドを用い、 工程（b )において式（8)の化合物を溶解させる溶 媒と して、 メタノールを用いることによ り、 式（3)で表される化合物 ( (土）- DHM2EQ；なお、 「DHM2Et！」 を 「DHMEQ」 と称する場合がある。） を製造する ことができる。
式 (3)の化合物の光学分割は、 光学活性カラムを用いた高速液体クロマトグラ フィー（HPLC)によりおこなう。 これにより、 式（2)及び (4)の化合物が得られる。 光学活性カラムとして、 一般式 (5)で表される基で置換された多糖の芳香族カル バメート誘導体を有効成分とする分離剤、 例えば、 MICEL CHIRALPAK AD (10 mm i. d. x 250 mm)を用いることができる。 DAICEL CHIRALPAK ADを用いる場合、 0. 1〜0. 9v/v%酢酸添加メタノールを移動相 （例えば、 流速： 0. 5〜2. 5ml/min) にし 2004/001623
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て、 式 (3)の化合物のメタノール溶液 （例えば、 濃度 5〜20mg/ml) を調製し、 こ れを 50〜200 μ 1ずつ、 5〜20回にわけてインジエタトし、式（2)及び（4)の化合物 を分取するとよい。
式 (2)及び (4)の化合物の施光度を JASCO DIP- 360旋光計で測定することにより、 光学純度を算出することができる。 なお、 式 (2)に示される化合物の旋光性は左 旋性であるので、 これを（-) -体と記載する。 また、 式 (4)に示される化合物の旋 光性は右旋性であるので、 これを (+)-体と記載する。
= = =式 (2)で表される化合物の薬理作用について = = =
(-) -DHM2EQ は、 NF- /c B の活性化を伴う症状、 具体的には、 乳癌、 脖癌、 リン パ系悪性腫瘍、 前立腺癌、 甲状腺癌、 骨髄腫等の腫瘍細胞に起因する症状や、 免 疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 腫瘍転移、 悪疫質、 動脈硬化、 血管新 生性疾患（特に腫瘍内の血管新生性疾患）、 白血病（特に成人 T細胞白血病 (Adult T cell leukemia) ) などの症状、 インスリン抵抗性を伴う疾患、 尿 に ¾因す る疾患、及び筋ジストロフィーを改善（予防や進行抑制を含む）することができ、 (土）- DHM2EQより優れた効果を有する。
従って、 （-) - DHM2EQは、 腫瘍細胞増殖阻害剤、 接着分子の発現抑制剤、 アポト 一シス誘導剤、 肥満予防 ·防止剤、 血糖値低下剤、 分化誘導の阻害を解除する薬 剤などに用いられる際、 （土）- D KEQより有用である。
また、 腫瘍細胞に起因する症状の改善には、 腫瘍細胞のアポトーシスが寄与し ても寄与しなくてもよい。 アポトーシスが寄与しない場合とは、 例えば、 細胞接 着阻害による腫瘍転移阻害、 アポトーシスを伴わない腫瘍増殖阻害、 がん悪疫質 改善、 血管新生阻害による腫瘍細胞壊死などを挙げることができるが、 これらに 限定されるものではない。 なお、腫瘍細胞のアポトーシスが寄与しないとは、 （-) -DHM2EQを患部に投与しても、 その効果が、 その患部における腫瘍細胞のアポト 一シスに依存しないことを意味するが、 アポトーシスが依存しない効果とは別に、 腫瘍細胞のアポトーシスが生じていてもかまわない。
以下、 （-) - DHM2EQの各作用効果に付き、 詳細に説明する。
<細胞接着阻害作用 >
炎症性刺激や物理的刺激などが血管内皮細胞に加わると、 血管内皮細胞膜上の 細胞接着分子の発現が増強し、 白血球が血管内皮細胞表面上に接着し、 血管外へ 移動する。 これは、 血管内皮細胞内で、 転写因子である NF- κ Βが活性化されるこ とにより、 ICAM - 1、 VCAM- 1、 E -セレクチンなどの接着分子の発現を高めるからで ある。 白血球の血管壁への接着は脂質の蓄積などを介して動脈硬化を誘導するた め、 従来、 白血球と血管内皮細胞との接着を阻害することができれば、 動脈硬化 の予防 Z抑制につながると考えられてきた。
また、 fl重瘍細胞の接着は血管からの浸出、 転移を引き起こすことが知られてい る。 例えば、 転移能の高い大腸癌では E-セレクチンのリガンドであるシァリルル ィス一 Xが高発現していることが報告されており、 血管内皮細胞で NF- κ Bが活性 化されると、 血管内皮細胞膜上での E -セレクチンの発現が増強し、 大腸癌細胞が 血管内皮細胞表面上に接着して血管外へ浸出しゃすくなり、 転移が促進されると 考えられている。
もし、 血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することができれば、 動脈硬化や腫 瘍転移の予防や抑制につながる可能性があり、 そのような F- K B阻害剤は動脈硬 化や腫瘍細胞の転移の予防や抑制に有用であり得ると考えられる。
そこで、本発明者らは、上記製造方法により得られた、式 (2)の化合物 （以下、 「（-） - DHM2EQ」と称する。）及び式 (4)の化合物（以下、「（+) - DHM2EQJと称する。）、 並びに式 (3)の化合物 （以下、 「（土） - DHM2EQJ ) を用いて、 それらの化合物がヒ ト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) の細胞接着活性に与える影響を調べた。 T F- αに より刺激した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着に与える各化合物の影響を調べ たところ、 （-） - DHM2EQは（+) - DHM2EQより約 1 0倍強く、 また、 （土）- DHM2EQに比 ベて約 3倍強く、 血管内皮細胞と腫瘍細胞との接着を阻害した。 こうして、 （-) - DHM2EQは（土）- DHM2EQより優れた血管内皮細胞接着阻害作用を有することが明 らかとなつた。 従って、 （-) - DHM2EQは（土）- DHM2EQより血管内皮細胞接着阻害剤 としてより有用であり、 抗動脈硬化剤や腫瘍転移抑制剤としてもより有用である。 ぐ抗炎症作用及び免疫疾患抑制作用 >
本発明者らは、 タイプ IIコラーゲンにより関節炎を誘発させた慢性関節リゥマ チモデルマウスに（土）- DHM2EQを投与し、 症状を観察したところ、 （土）- DHM2EQ が関節炎の症状の抑制に有効であることを明らかにしている。 このことは、 おそ らく（士） - DHM2EQが NF - κ Βの活性阻害を通じて効果を示していると考えられる 力 （土）- DHM2EQより数倍〜" h数倍以上強い活性阻害効果を有する（-) - DHM2EQは、 関節炎の症状に対して抗炎症剤としてさらに予防 抑制に有効であると考えら れる。
以上のことから、 （-) - DHM2EQは、 免疫疾患、 炎症性疾患 （アレルギー性炎症疾 患も含む） などの症状に対して有用な免疫疾患抑制剤及び抗 症剤であると期待 できる。
ぐ腫瘍細胞増殖阻害作用及び抗腫瘍作用 >
近年、 本発明者らは、 （土）- DHM2EQ ί NF- κ Β が活性化しているホジキンリ ンパ腫細胞の増殖は阻害する力 NF- κ Βが活性化していない骨髄球系の白血病細 胞の増殖は阻害しないことを明らかにしている。 このことから、 （土） -DHM2EQ は NF- κ Β の活性化している腫瘍細胞の増殖阻害剤として有用であり、 NF- K B の抑 制を通じて作用すると考えられる。
また、 本発明者らは、 （土）- DHM2EQが in vitroおよび in vivoでアポトーシス 非依存的にヒト乳癌細胞の増殖を抑制することを明らかにしている。 このことか ら、 （土） - DHM2EQは、 乳癌の予防 ·治療剤として有用であると考えられる。
また、本発明者らは、 （-) - DHM2EQが、 骨髄腫モデルマウスに対して腫瘍の増殖 を抑制することを明らかにしている （実施例 3参照）。 多発性骨髄腫は、 骨破壌 による痛みを伴い、 苦痛が激しく、 現在においては根本的な治療法がない。 従つ て、 （-) -DHM2EQは、 多発性骨髄腫などの骨髄腫に対する抗腫瘍剤として期待でき る。
さらに、 本発明者らは、 （-) - DHM2EQ力 甲状腺癌モデルマウスに対して腫瘍の 増殖を阻害することを明らかにしている （実施例 4参照）。 甲状腺癌は難治性の がんの一^ 3で、 現在のところ効果的な治療方法は全くない。 従って、 （-) - DHM2EQ は、 甲状腺癌に対する抗腫瘍剤として期待できる。
以上のことから、（土） - DHM2EQより NF- κ Βの活性化阻害効果の強い（-) - DHM2EQ は、 より優れた腫瘍細胞増殖阻害剤として期待することができる。 なお、 本発明 に適用される腫瘍細胞としては、 例えば、 甲状腺癌細胞、 前立腺癌細胞、 乳癌細 胞、 悪性腫瘍細胞、 膝癌細胞などを挙げることができるが、 特にこれらに限定さ 04 001623
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れるものではなく、 F- κ Bが活性化している fl重瘍細胞であれば何でもよい。なお、 前記悪性腫瘍細胞としてはリンパ系悪性腫瘍細胞が治療対象として好ましく、 そ の中でもホジキンリンパ腫細胞、 骨髄腫細胞が特に好ましい。 また、 ホルモン療 法を対象としないホルモン非感受性の腫瘍も治療の対象になり得ることから、 こ の点はホルモン療法に比べ大きな利点となる。
くアポトーシス誘導作用、 並びに、 抗肥満作用及び抗インスリン抵抗性作用 > 近年、 本発明者らは、 （土） - DHM2EQ 力 NF- rc B が活性化している白血病細胞 のアポトーシスを誘導することを明らかにしている。 このことから、 F- zc Bの活 性化阻害効果の強い（-） - DHM2EQ は（土）- DHM2EQ に比べ、 より優れたアポトーシ ス誘導作用を有することが期待できる。
従来の化学療法は細胞に普遍的な増殖機構を広く標的としているため、 腫瘍細 胞のみならず正常細胞に対する影響も大きく、 必ずしも有効な治療手段となって いなかった。 しかしながら、 本発明者らは、 （土）- DHM2EQが白血病細胞のアポト 一シスを誘導するのと同じ濃度でヒ ト正常白血球のアポトーシスを全く誘導し ないという実験結果を得ており、 腫瘍細胞に対する特異性が高いことを明らかに した。 従って、 さらに比活性の高い（-) -DHM2EQは、 白血病細胞などのリンパ系悪 性腫瘍細胞に対する特異性がさらに高く、 正常細胞に対する副作用はさらに少な いと考えられる。 このように、 本発明に係るアポトーシス誘導剤は、 悪性リンパ 腫細胞、 白血病細胞又は骨髄腫細胞のアポトーシス誘導に好適に使用でき、 悪性 リンパ腫、 白血病又は骨髄腫に対して特異性が高いため、 優れた治療効果が期待 できる。
なお、 治療対象となるリンパ系悪性腫瘍としては、 悪性リンパ腫、 白血病又は 骨髄腫などが挙げられる。 前記悪性リンパ腫には、 非ホジキンリンパ腫、 ホジキ ンリンパ腫等が含まれ、 骨髄腫には、 多発性骨髄腫等の形質細胞性腫瘍等が含ま れ、 白血病には、 急性リンパ性白血病、 成人 T細胞白血病リンパ腫、 慢性リンパ 性白血病等が含まれる。
また、 （-) - DHM2EQで肥大化脂肪細胞を処理すると、 アポトーシスを誘導するこ とができる。 従って、 （-) - DHM2EQは、 肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導する ためのアポトーシス誘導剤として用いることができる。 04 001623
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一方、 詳細なメカュズムはまだ明らかでないが、 肥満などにより肥大 （大型） 化した脂肪細胞から血液中に炎症性サイトカインである TNF - aが分泌され、この T F-ひがインスリン受容体を通じたシグナル伝達系を阻害することにより、 イン スリン抵抗性 （インスリン感受性の低下） が生じることが知られている。 インス リン受容体を通じたシグナル伝達系は、 普段は骨格筋細胞内に存在している糖輸 送担体 （GLUT) を急速に細胞膜上に移動させ、 骨格筋細胞内への糖 （グルコース など） の取り込みを促進する機能も有するため、 インスリン抵抗性を生じる一つ の原因として、 T F-ひが、糖輸送担体の細胞膜上への移動を阻害することにより、 糖の細胞内取り込みを阻害することが考えられている。
従って、 （-)- DHM2EQが肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導すると、脂肪細胞 から血液中に分泌される TNF- αの量が減少し、糖の細胞内取り込み作用の阻害を 防止すること等により、 肥満予防 ·防止剤、 血糖値低下剤として有効であるばか りでなく、 インスリン抵抗性を伴う疾患、 あるいは糖尿病に起因する疾患などの 症状の改善がもたらされる。 インスリン抵抗性を伴う疾患には、 例えば、 2型糖 尿病、 高インスリン血症、 脂質代謝異常、 肥満、 高血圧、 動脈硬化性疾患などが あり、 また、 糖尿病に起因する疾患としては、 例えば、 糖尿病性腎症、 糖尿病性 網膜症、糖尿病性神経障害などがあるが、 （-) - DHM2EQには、 これらの症状に対し て優れた治療効果が期待できる。
< ¾ ATL作用〉
本発明者らは、 （土）- DHM2EQを用いて、 成人 T細胞白血病リンパ腫 （ATL) 細胞 の F- κ Βの活性化に与える影響を調べたところ、（土）- DHM2EQは、 ATL細胞の NF - κ Βの活性化を阻害することを明らかにした。 また、 （土） - DHM2EQを用いて、 ATL 細胞の増殖に与える影響を調べたところ、 （土） -DHM2EQ は、 正常細胞の増殖を阻 害することはなく、 ATL細胞の増殖を特異的に阻害できることを明らかにした。 さらに、 ATL 細胞のアポトーシスの誘導に与える影響を調べたところ、 (土）- DHM2EQは正常細胞のアポトーシスは誘導せずに ATL細胞のアポトーシスを 誘導できることを明らかにしている。 これらのことから、 （士） - DHM2EQ は抗 ATL 活性 （作用） を有するものと考えられる。
以上のことから、（土） - DHM2EQより NF - κ Bの活性化阻害効果の強い（-) - DHM2EQ 4 001623
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は、 抗 ATL剤としてより有用であると考えられる。
<抗悪疫質作用 >
悪疫質 （cachexia；悪液質とも表記される。） は、 悪性腫瘍、 結核、 糖尿病、 血液疾患、 内分泌 ·代謝疾患などの慢性病において、 食欲不振、 進行する体重減 少、 貧血、 皮膚乾燥、 浮腫などを主症状とする全身不良を呈する疾患である。 特 に悪性腫瘍の末期患者などに、 よくみられる症状であり、 体重の減少 ·貧血など を中心とした全身機能の低下を示す。 癌患者が悪疫質を発症すると、 合併症のリ スクが高くなり、化学療法に対する反応が悪くなる。さらに、全身の衰弱のため、 癌に対する化学療法や放射線治療の副作用も大きくなり、 悪疫質のため死に至る こともある。
これまで、 悪疫質が発症する詳細なメカニズムは、 完全には解明されていない 力 近年になって、 インターロイキン 6 (IL-6) や J3重瘍壌死因子 α (TNF- α ) な ど、 幾つかのサイト力インの関与を含め、 ようやく、 そのメカニズムに関する手 がかりが得られるようになつてきた（最新医学 1999年 54卷 10号 2502-2507 頁)。 例えば、 癌悪疫質における様々な症状の発現機序としては、 悪疫質によつ て発現が誘導され過剰発現したサイトカインが、中枢神経系に作用し、摂食減少、 発熱、 低血圧、 無気力状態などの症状を引き起こし、 また糖質、 タンパク質、 脂 質の異化の亢進状態を招くとされる。
このような悪疫質における症状を抑制するのにステロイド投与が有効である。 悪疫質患者にステロイドを投与すると、 ステロイドの免疫反応抑制作用やそれに よる抗炎症作用、 さらに悪疫質誘導サイト力インの産生抑制作用により、 癌悪疫 質の代謝異常が是正され、 体重減少、 食欲不振、 無気力、 味覚異常、 貧血などの 悪疫質症状が軽減、 改善される。 し力 し、 ステロイドの長期服用は、 その重篤な 副作用が大きな問題となる。ステロイドは、本来自己の持つホルモンであるため、 摂取したステロイドは過剰なホルモンと同様の作用効臬を示し、 例えば、 腎臓に おける塩の再吸収に関与することにより、 副作用として 浮腫や高血圧が現われ ることがある。
一方、オメガ 3不飽和脂肪酸が、 IL- 6などの炎症性サイトカインの産生を抑制 したり、 急性期反応蛋白の合成に影響することを利用して、 E P A (eicosapentaenoic acid) の投与が悪疫質の改善に一定の効果を上げている。 し力 し、 このような栄養製剤は、 作用が間接的であるため、 顕著で確実な効果は 期待しにくい。
したがって、 ステロイ ドのような広範な作用を有する薬剤とは異なり、 悪疫質 に特異的で、 効果の顕著な薬剤の開発が求められるようになった。 このような要 請の下、 本発明者らは、 悪疫質の症状を誘発したモデルマウスに（士） - DHM2EQを 投与し、 症状を観察したところ、 （土）- DHM2EQが悪疫質の症状の予防 Z改善に有 効であることを明らかにしている。 従って、 （土） - DHM2EQより NF- κ Βの活性化 阻害効果の強い (-) - DHM2EQは、悪疫質の症状に対して予防 改善に、 より有効で あると考えられる。
<血管新生抑制作用 >
( ±) - DHM2EQは、 NF - κ Βの活性化を阻害することができるため、 NF- κ Βの活 性化により起こるシクロォキシゲナーゼー 2 (C0X-2) の遺伝子発現を阻害する ことができると考えられる。 また、 シクロォキシゲナーゼ一 2の遺伝子発現を阻 害することから、 C0X - 2 の下流にあるプロスタグランジンの合成も阻害すること ができると考えられる。腫瘍内において、 NF - κ Βの活性化はプロスタグランジン の合成促進を通じ血管新生を盛んに起こしているが、 （土）- DHM2EQは、 F- fc Bの 活性化阻害を通じ、 プロスタグランジンにより促進される腫瘍血管の新生を阻害 することができると考えられる。 従って、 （土） - DHM2EQは、 腫瘍内における血管 新生を阻害し、 腫瘍への酸素や栄養分の供給を阻害することにより抗腫瘍作用を 呈するがん治療薬としても有用であると考えられる。
以上のことから、（土） - DHM2EQより F- κ Βの活性化阻害効果の強い（-) - DHM2EQ は、 腫瘍内における血管新生の阻害剤としてより有効であると考えられる。
く抗筋ジス トロフィー作用 >
本発明者らは、 （-) - DHM2EQを用いることにより、筋芽細胞から筋細胞への分化 誘導の阻害を解除することができることを明らかにした。 従って、 （-) - DHM2EQ は、 筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害を解除する薬剤として用いること ができる。 また、 （-) - DHM2EQ は、 筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害によ り発症する筋ジストロフィーの改善に対して有用であり、 優れた治療効果が期 待できる。
<本発明に係る医薬組成物と F - κ Bを活性化させる治療との併用効果 >
従来、 fl重瘍の治療方法として化学療法や放射線療法などが知られている。 しか しながら、 化学療法や放射線療法を用いると、 腫瘍細胞において F- κ Βが活性化 され、 がん治療の効果が減少する （J. Clin. Invest. 107, 241-246, 2001)。 例 えば、 放射線治療は、 腫瘍細胞を殺すために行われるが、 放射線照射による酸化 ストレスによって NF- K Bが活性化され、 腫瘍細胞はアポトーシスを起こしにく くなつて放射線治療に抵抗するようになる。 このように、 腫瘍細胞に放射線を 照射していると、 次第に放射線が効きにくくなることがある。 従って、 このよ うながん治療に対する抵抗性を解除する方法の開発が望まれている。
近年、 本発明者らは、 化学療法や放射線療法などの NF- K Bを活性化させる腫瘍 治療に（土） - DHM2EQを用いることにより、 この腫瘍治療の効果が増大することを 明らかにしている。従って、 （土）- DHM2EQより F- κ Βの活性化阻害効果の強い（-) -DHM2EQは、 化学療法や放射線療法などの NF - / c Bを活性化させる治療と併用させ ることにより、 この治療の効果をさらに増強させるのに有用であると考えられる。 上記化学療法に用いられる抗腫瘍剤としては、 少なくとも F - κ Βを活性化させ るものであればどのようなものでもよく、 例えば、 カンプトテシン（CPT)やダウ ノマイシン（成分名：ダウノルビシン； DNRまたは DM)などの抗腫瘍剤がある。
なお、 （-) -DHM2EQと併用する薬剤は抗がん剤に限らず、 投与により NF - 8カ 活性化され、 そのため治療に対する抵抗性を生じる薬剤であれば何でもよい。 例 えば、 （-) - DHM2EQは、 感染症疾患、 アレルギー疾患、 免疫疾患、 炎症性疾患、 腫 瘍転移、 悪疫質、 動脈硬化、 血管新生性疾患 （特に腫瘍内の血管新生性疾患)、 白血病 （特に成人 T細胞白血病（Adult T cell leukemia) ) などの疾患に対して 用いられる治療と併用することにより、 治療の効果を増大させることも期待でき る。 投与の時期に関しては、 （-) -DHM2EQ は、 F- κ Β を活性化させる治療と同時 に投与してもよいが、 NF- κ Βを活性化させる治療の後に NF- κ Βの活性化を阻害 するために用いることとしてもよい。 また、 F- κ Β の活性化を阻害するために、 予め投与してもよい。 治療対象としては、 上記疾患を伴うヒト及ぴヒ ト以外の哺 乳類動物が考えられる。 = = =式 (13)で表される化合物のラセミ体の製造方法二 = =
上述においては、 式 (3)で表される化合物のラセミ体を直接分割することによ り、 光学活性な (-)体及び (+)体の化合物を製造する方法について説明したが、 式 (13)
Figure imgf000032_0001
で表される化合物のラセミ体 （（土）- DHM3EQ) も同様に直接分割して、 式 (14)
Figure imgf000032_0002
で表される（-) -体の化合物 （(-)- DHM3EQ) や式（15)
Figure imgf000032_0003
で表される（+) -体の化合物（(+) - DHM3EQ)を製造することも可能である。以下に、 式 (13)で表される化合物のラセミ体の製造方法について、 下記の反応式を用いて 説明する。 なお、 下記の反応式において、 R 2は C 1 〜 4のアルキル基であり、 アルキル基としては、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 ブチル基およびこれら の異性体基が挙げられ、 メチル基、 ェチル基が好ましく、 メチル基が特に好まし い。
Figure imgf000032_0004
工程（f ) : 3， 3—ジアルコキシ一 4， 5—エポキシ一 6—ヒドロキシ- リチロイルアミドシクロへキセンの調製
' 式（16)で示される 5 , 6—エポキシ一 4 , 4—ジアルコキシ一 3—サリチロイ ルアミドー 2—シクロへキセノン化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合 溶媒に溶解し、 — 7 8〜5 0 °C、 好ましくは氷冷下で、 還元剤 （水素化ホウ素ナ トリウムなど） を加え、 攪拌しながら反応させる。 この反応液に溶剤 （酢酸ェチ ルなど） を加え、 塩酸、 水で順次洗浄し、 溶剤層を乾燥後、 減圧濃縮、 真空乾燥 し、 カラムクロマトグラフィーなどで精製して、 式（17)で示される 3， 3—ジァ ルコキシー 4， 5—エポキシ一 6—ヒドロキシ一 2—サリチロイルアミドシクロ へキセン化合物を得る。
工程（g ) ： 5 , 6—エポキシ一 4—ヒドロキシー 2—サリチロイルアミド一 2— シクロへキセノン （式（13)， DHM3EQ) の調製
式（17)の化合物を溶剤 （アセトンなど） に溶解させ、 p—トルエンスルホン酸 を加え、 室温で攪拌しながら反応させる。 反応液に溶剤 （酢酸ェチルなど） を加 え、 水で洗浄し、 溶剤層を乾燥し、 減圧濃縮して、 精製して、 式 3)の 5， 6— エポキシ一 4—ヒ ドロキシー 2—サリチロイノレアミ ドー 2—シクロへキセノン (D HM 3 E Q) を得ることができる。
このようにして製造された（土） -DHM3EQも、 式 (5)で表される基で置換された多 糖の芳香族カルバメ一ト誘導体を有効成分とする分離剤が充填された光学活性 カラムを用いたり、 バッチ式で前記分離剤を用いたりすることにより、 （+) -DHM3 EQと（-) - DHM3EQとに直接、 光学分割することが可能である。 光学活性カラムとし ては、 （土）- DHM2EQを（+) -DHM2EQと（-) - DHM2EQとに直接、 光学分割することがで きるカラムを用いることが好ましく、 分離剤としては、 （土） - DHM2EQを（+) - DHM2E Qと（-)- DHM2EQとに直接、 光学分割することができる分離剤を用いることが好ま しい。
なお、 このようにして精製された、 （-) -DHM3EQ (式（14) ) または（+) -DHM3EQ (式 (15) ) は、 （-) -DHM2EQと同様にラセミ体の化合物より優れた薬理作用を有し、 NF - κ Βの活性化を伴う症状を改善するのにより有用であるものと考えられる。
= = =その他の実施の形態 = = =
上述においては、一般式（1)で表される化合物の R 1がァセチル基である化合物 JP2004/001623
32
の薬理作用について説明したが、 一般式（1)で表される化合物の R 1が水素原子、 プロピオニル基、 若しくはブタノィル基、 またはこれらの異性体基である化合物 も同様の薬理作用を有するものと考えられる。
なお、 本発明の化合物は、 薬理学的に許容される塩、 例えば、 第 4級アンモュ ゥム塩などの有機塩、 あるいはアルカリ金属などの金属塩、 のような形態として もよい。 このような化合物の塩は、 公知の方法で製造することができる。
ぐ実施例 1 >
上述した方法により、 （±)— 5—デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン C (dehydroxyraethyl derivatives of epoxyquinoraicin C； DHM2EQ) を合成し 7こ。 得られた（土）- DHM2EQの光学分割は、 0. 5v/v%酢酸添加メタノールを移動相 （流 速： l. Oml/rain) にして、 DAICEL CHIRALPAK AD (10瞧 i. d. X 250瞧） を用いた高 速液体ク口マトグラフィー （HPLC) (検出波長： 315nraUV、 力ラム温度： 0°C) に よりおこなった。 （土） - DHM2EQ 20ragを 2mlのメタノールに溶解し、 これを 100 μ 1ずつ 20回にわけてインジエタトし、 3. 8分と 5. 7分のピークの所を分取したと ころ、 8 5 %の回収率で（-） -DHM2EQ および（+) - DHM2EQ を得た。 分離の様子を図 3に示す。
この様にして得られた両物質の旋光度 （(-)- DHM2EQ: [ o; ]2°D — 241° (c0. 1 MeO H)， （+) - DHM2EQ : [ ]20 D +239° (c0. 1 MeOH) ) は、 文献 （Bioorg. Med. Chem. Le tt. 10, 865-869, 2000) に記載のものと一致し、 光学純度 （e e ) は 9 9 %以 上であった。
ぐ実施例 2 >
本実施例においては、 TNF - αにより刺激した血管内皮細胞と腫瘍細胞との接 着に対する（-) -及ぴ (+)- DHM2EQの効果を調べた。
( 1 ) 細胞培養
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC； Cell systems, Lake Kirland, WA) は、 I型コラーゲン （株式会社高研， Tokyo, Japan) でコートしたプラスチックフラ スコ （Costar, New York, USA) を使用し、 非働化した 10% 子牛胎児血清 （FBS； JRH BIOSCIENCES, Lenexa, KS)、 10 μ g/ml bFGF (Pepro Tech EC LTD, London, UK) を含む MCDB- 131培地 （Sigma, St. Louis, MO) を用いて、 37°C、 5 % C02のイン キュベータ一中で培養した。 ヒ ト急性前骨髄球性白血病細胞株 HL- 60 細胞 (Japanese Collection of Research Bioresources) は、 非働化した 10% FBS を含む RPMI1640培地（日水製薬株式会社， Tokyo, Japan) を用いて、 37°C、 5% C02 のィンキュベータ一中で培養した。
( 2 ) 細胞接着実験
HUVECを 48ゥエルプレート（Costar)に 4. O X 104細胞/ゥエル（500 1/ゥエル） でまきー晚培養した。翌日、培養した HUVECを、各種濃度に希釈した（-) - DHM2EQ、 (土）- DHM2EQ、 または（+) - DHM2EQで処理し、 37°C、 5% C02で 2時間インキュベー トした。 その後、 さらに 10ng/ml TNF- c¾ (Genzyme - Techne, Cambridge, MA) を 添加し、 37°C、 5% C02で 2時間ィンキュベートした（コント口ールとしては、 T F - ひ無処理とした。）。 6時間後、 37°Cに温めた PBS (phosphate buffered saline； リン酸緩衝生理食塩水） で各ゥエルを 2回洗い、 新たに培地を各ゥエルに加えた (200 /z l/ゥエル）。 続いて、 各ゥエルに HL- 60細胞を 6. 0 X 104細胞/ゥエル （20 μ ΐ/ゥエル） の濃度でまき、 37°C、 5% C02で 1時間インキュベートした。 次に、 37°Cに温めた PBSで各ゥエルを 3回洗い、 未接着の HL- 60細胞を除去し、 新たに 培地 （200 μ ΐ/ゥエル） を加えた。 その後、 HUVECに接着した HL - 60細胞を顕微鏡 で確認し、 顕微鏡視野内の接着細胞数を測定することで細胞接着能を評価した。 その結果を図 4に示す。 なお、 図中にそれぞれの DHM2EQを用いた時の I C 5 0を 示す。 図 4に示すように、 （-) - DHM2EQは、 （+) - DHM2EQ及ぴ（土）- DHM2EQより細 胞接着阻害活性がそれぞれ 1 0倍及び 3倍強いことが明らかとなつた。
<実施例 3 >
次に、 多発性骨髄腫に対する（-) - DHM2EQによる抗腫瘍効果を調べた。 4X 107個 の多発性骨髄腫細胞株 KMS- 12- PE (Ohtsuki T. et al. , Br. J. Hematol. 73, 199-204, 1989) を 0. 2mlの PBSに溶解し、 これを CB17/lcr- SCIDマウスの左背 部に皮下注射し腫瘤を形成させ、 その腫瘍片 5mm立方を 10匹のマウスに移植し た。 腫瘍を移植後、 1 6日間観察し、 腫瘍片の生着、 増殖傾向を確認後、 5匹のマ ウスに （-) - DHM2EQの溶液 （RPMI1640培地） を 8mg/kg-体重で腹腔内に投与した ( (-) - DHM2EQ)。 投与は、 14日間毎日行った。 対照群のマウス 5匹には同量の溶 媒を投与した（コント口ール)。腫瘍径の計測は、週に 2回行つた（腫瘍容量 = (短 径） 2 X (長径） X 0. 52)。 その結果、 図 5に示すように、 （-) - DHM2EQは、 コント口 ールに比べて有意に腫瘍の増殖を抑制することが明らかとなった。
<実施例 4 >
ヒト甲状腺癌に対する（-) - DHM2EQによる抗腫瘍効果を調べた。未分化のヒト甲 状腺癌細胞浮遊液 FRO (5 X 106細胞； 200 /X 1の RPMI- 1640)を 8週齢のォス BALB/c nu/nuマウス（Charles River Japan社製） の横腹に皮下注射した。 その後、 キヤ リパーを用いて腫瘍サイズを一日おきに測定し、 腫瘍容量 = ( a ；腫瘍の短径） 2 X ( b ； aに対する垂直径） X 0. 4により fl重瘍容量を算出した。 腫瘍容量が 100mm3 に達した、皮下注射から 1 4曰後を 0日として、 9匹のマウス群に（-) -DHM2EQの 溶液 （Cremophore (BASF社） ： PBS : DMS0 (2：1：1) ) を 10mg/kg-体重で腹腔内に 1 0日間毎日投与した （〇： （-) - DHM2EQ)。 対照群のマウス 9匹には同量の溶媒を 投与した （圏： コントロール)。 その結果、 図 6に示すように、 （-) -DHM2EQ は、 コントロールに比べて有意に腫瘍の増殖を阻害することが明らかとなった。
<実施例 5 >
インスリン抵抗性を伴う疾患は、 上述したように、 肥大化脂肪細胞から分泌さ れる TNF -ひに起因すると考えられている。 そこで、 （-) - DHM2EQが肥大した脂肪細 胞のアポトーシスを誘導できるかを確認するため、 前駆脂肪細胞を長期培養して 分化誘導させて得られる肥大化脂肪細胞に対する（-) - DHM2EQの影響を調べた。 前駆脂肪細胞株 3T3-L1 (7. 5 X 104細胞； 1 mlの 10% FBSを含んだ DMEM) を 1 2ゥエルプレート中の力パーグラス上に蒔き、 コンフルェントに達してから 2 , 3日後に、 δΟΟ ^ Μ ΙΒΜΧ (3-イソプチルイル- 1-メチルキサンチン）、 Ι μ Μ ϋβχ (デ キサメタゾン）、 及ぴ 1 i g/ml インスリンを含んだ培地に交換した。 3日間培養 後、 l z g/ml インスリンを含んだ培地に交換し、 更に 3日間培養して通常の培地 (10% FBS を含んだ DMEM) に交換した。 以後 3日おきに 5 0日まで、 培地交換 を続けた。
分化誘導 5 0日目に培地交換し、 2 4時間後に肥大化脂肪細胞を（-) - DHM2EQ (10 μ g/ml)で 3 0分前処理し、 続いて T F - a (10 ng/ml)をさらに添加して刺激し た （コントロールとして、 （-） - DHM2EQ無添加、 TNF- α無添加、 及び両方共無添加 の各条件で実験を行った。）。 さらに 2 4時間後、 培地を除いて、 肥大脂肪細胞を 蛍光抗体用 PBS (8g/l NaCl、 0. 45g/l Na¾P04 · 2¾0、 1. 28g/l Na2HP04) 500 1 で 3回洗浄し、 4 %パラホルムアルデヒド 500 ;z l で 4 °Cで 15分間固定した。 そ の後、 蛍光抗体用 PBS 500 ^ 1 で 3回洗浄し、 0. 2 % BSA、 及び 0. 5 % Tween-20 を含んだ蛍光抗体用 PBSで 1 5分間処理した。
その後、 500 μ ΐ 蒸留水で 3回洗浄し、遮光した 150 mm2シャーレ中のパラフィ ンシート上にカバーガラスを細胞面を上にして置いた。 また、 その上から TUNEL 溶液 （TdT buffer Π I FITC-dUTP / TdT = 45 μ 1 / 2. 5 μ 1 / 2. 5 μ 1) を 45 μ ΐずつ滴下し、 3 7 °Cで 1時間インキュベートした。 最後にカバーガラスを遮 光した 1 2ゥエルプレートに戻し、 1 mlの蛍光抗体用 PBSで 3回洗浄した後、 力 バーガラスを取り出してスライドグラスに 50 % グリセロールで固定し、 蛍光顕 微鏡で観察した。
その結果、 図 7に示すように、 あらかじめ 10 mg/ml (-) - DHM2EQで処理された 肥大化脂肪細胞は、 10 ng/ral TNF-ひの刺激により、 アポトーシスを誘導するこ とが明らかとなった。 なお、 10 ng/ml TNF-ひ又は 10 mg/ml (-) -DHM2EQ の一方 でのみ処理された肥大化脂肪細胞はアポトーシスを誘導しなかった。
以上のことから、 （-) - DHM2EQは、 TNF- Q!を分泌する肥大化脂肪細胞に起因する インスリン抵抗性症候群 （例えば、 2型糖尿病、 高インスリン血症、 脂質代謝異 常、 肥満、 高血圧、 動脈硬化性疾患など） の改善 （予防、 治療を含む） に有用で あると考えられる。 また、 （-) - DHM2EQは、 肥満予防剤、 ダイエット剤、 血糖値低 下剤としても有用であると考えられる。 さらには、 （-) - DHM2EQは、糖尿病に起因 する疾患 （例えば、 糖尿病性腎症、 糖尿病性網膜症、 糖尿病性神経障害など） の 改善 （予防、 治療を含む） にも有用であると考えられる。
ぐ実施例 6 >
次に、 肥満， 2型糖尿病モデル動物 KKAyマウスを用いて、 糖尿病に対する (-) - DHM2EQの効果を調べた。
4週齢のメスの KKAyマウスを 2群（（-；) - DHM2EQ投与群 5匹， コントロール群 4 匹） に分け、 高脂肪食 (CRF-1, オリエンタル酵母 （株)） を基本飼料として、 無 添カロ群 （〇： （-)- DHM2EQなし）、 （-) -DHM2EQ投与群 （會： (-) - DHM2EQ添加） を自 由摂取にて 4週間与え、 毎週体重を測定した。 なお、 マウスに投与の（-) -DHM2EQ は乳鉢で細かくすりつぶし、 0. 5 CMC溶液を加えて懸濁または溶解し、 これを高 脂肪食に添加した。 その結果、 図 8に示すように、 無添加群は、 高脂肪贪負荷に よって著名な体重増加を呈していたが、（-) - DHM2EQ群は高脂肪食下でも体重の増 加が抑制されていた。 以上のことから、 （-) - DHM2EQは抗肥満剤 （抗肥満予防'防 止剤 （ダイエット剤を含む））、 抗糖尿病剤として有用であると考えられる。
く実施例 7 >
デュシェンヌ型をはじめとする筋ジストロフィー患者における筋ジストロフ ィー疾患の進展は、 筋芽細胞から筋細胞への分化誘導の阻害による筋細胞の再 生不良がひとつの発症機構と考えられている （医学のあゆみ、 199 : 1045-1048, 2001) 。 デュシェンヌ型筋ジストロフィーのモデノレ動物である radxマウスは、 ヒ トのデュシェンヌ型筋ジストロフィーの患者と同様にジストロフィンの発現を 欠損しているのにも関わらず、 筋再生が活発に行われているためほとんど筋力低 下が見られない。 その理由として、 ヒ ト患者においては、 一旦破壊された筋細胞 の再生の過程で、 TNF- aなどの炎症 I1生因子が筋分化を阻害しているからであると 考えられている。
そこで、 本発明者らは、 筋芽細胞株 C2C12の分化誘導系を用いて、 （-) -DHM2EQ の添加が T F-ひによる筋分化阻害反応を解除できるかどうかを調べた。
10% FBS を含んだ DMEM (培養用培地） を用いて、 マウス骨格筋由来の筋芽細 胞株 C2C12 (理研細胞バンクから購入） を 7. 5 X 104 cells/ml に調整し、 カバー ガラス（松浪硝子工業株式会社， Osaka, Japan)を敷いたプラスチック製 1 2ゥェ ルプレートの各ゥエルにそれぞれ 1 ml ずつ播種した。 その後、 各ゥエルにおい て細胞がコンフルェントになるまで増殖した時、 培地を、 2% heat-inactivated horse serum を含んだ DMEM (分化用培地） に交換した。 TNF- α (1 ng/ml) 及び /又は (-) - DHMEQ (3 /z g/ml) を作用させるものについては、 この時点で各薬剤を 添加した。 6日後、 多核の筋細胞の出現という、 筋細胞が分化した指標を確認し て、 培地を除去した。 なお、 コントローノレとして、 6日目にちょうどコンフノレエ ントになるように、 培養用培地で培養した細胞を用意した。
これらの細胞を PBS— (Ca2+, Mg2+-free PBS； 8. Og/1 NaCl, 0. 2g/l KC1, 2. 3g/l NaHP04- 12H20, 0. 2g/l KH2P04) で 2回洗浄した後でカバーガラスをゥエルから取 3
37
り出し、 冷風ドライヤーを用いて細胞を乾燥させた。 その後、 カバーガラスを！？ ぴ 1 2ウエノレプレートのゥェ 7レに入れ、 そこに May- Griinwald液 (Merck 社， Darmstadt, Germany) を約 300 μ 1 ずつ入れてガラス上の細胞を浸し、 2〜3分 そのまま静置して固定'染色した。 2〜3分経過後、 すばやく ρΗを 6. 7に調整 した PBS—を各 wellに等量加え、 各ゥエルの溶液に空気を吹き込みながら、 細胞 をさらに 2〜 3分固定 ·染色した。 そして、 カバーガラスをゥエルから取り出し た後、 水洗し、 ドライヤーの冷風でガラスを乾燥させた。
カバーガラスを再ぴ 1 2ゥエルプレートのゥエルに入れ、 ギムザ染色液 （1 ral の PBS— (pH： 6. 7)に 45 μ 1の Giemsa液 (Merck)を加えた溶液） を入れてカバーガ ラスを浸した。 その後、 各ゥエルの溶液に再び空気を吹き込みながら、 1 0〜1 5分間核を染色した。その後、上記と同様にカバーガラスをゥエルから取り出し、 水洗し、 ドライヤーの冷風で乾燥させた。
以上のようにして作製したサンプルをスライドガラスにのせ、 蛍光顕微鏡 (Nikon UFX-DX；位相差用 4 0倍の対物レンズ， Ph2とセットした。） を用いて 4 0 0倍の倍率で写真を撮影した。 その結果、 図 9に示すように、 1 ng/rnlの TNF - aは筋芽細胞から筋細胞への分化誘導を抑制したが、 1〜 3 μ g/mlの（-) - DHM2EQ はこの分化誘導の阻害を解除することが明らかとなった。 なお、 分化誘導しなか つた C2C12細胞の分化率は 0 %であつた。
これらのことから、 デュシェンヌ型をはじめとする筋ジストロフィー患者に (-) - DHM2EQを投与することにより、 TNF-ひによる筋分化阻害を解除して筋再生を 誘導し、 筋ジストロフィー疾患を改善することが期待される。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 腫瘍転移、 悪疫 質、 動脈硬化などの症状に有用な医薬組成物、 及び医薬組成物に有効成分として 含有させる光学活性な化合物の製造方法や直接分割方法を提供することができ る。

Claims

求 の 範
1 . 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容 される塩を有効成分として含有し、 F- κ Bの活性化を伴う症状を改善することを 特徴とする医薬,祖成物。
Figure imgf000040_0001
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
2 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の 医薬組成物。
Figure imgf000040_0002
3 . 前記症状が、 腫瘍細胞に起因することを特徴とする請求の範囲第 1項また は第 2項に記載の医薬組成物。
4 . 前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、 前記症状を改善することを特 徴とする請求の範囲第 3項に記載の医薬組成物。
5 . 血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することにより、 前記症状を改善する ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の医薬組成物。
6 . 前記症状が、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 腫瘍転移、 悪疫 質、 動脈硬化、 白血病からなるグループから選ばれる症状であることを特徴とす る請求の範囲第 1項に記載の医薬組成物。
7 . F - κ Βを活性化させる治療による F - κ Βの前記活性化を阻害することに よって、 前記治療の効果を増大させることができる、 下記の一般式 (1)で表され る光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有 する医薬組成物
Figure imgf000041_0001
(式中、 R1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
8. 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 7項に記載の 医薬組成物。
Figure imgf000041_0002
9. 前記 NF-κΒ を活性化させる治療が、 抗腫瘍剤を用いた治療であることを 特徴とする請求の範囲第 7項または第 8項に記載の医薬組成物。
10. 前記 F- κΒ を活性化させる治療が、 腫瘍細胞に対する放射線照射によ る治療であることを特徴とする請求の範囲第 7項または第 8項に記載の医薬組 成物 0 ·
1 1. 前記抗腫瘍剤が、 有効成分として含有されていることを特徴とする請求 の範囲第 9項に記載の医薬組成物。
12. 前記抗腫瘍剤は、 カンプトテシンまたはダウノルビシンであることを特 徴とする請求の範囲第 9項に記載の医薬組成物。
13. 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有し、 T F- aによって引き起こされる疾患を改善 することを特徴とする医薬組成物。
Figure imgf000042_0001
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。） .
1 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求め範囲第 1 3項に記 載の医薬組成物。
Figure imgf000042_0002
1 5 . 前記 TNF-ひによって引き起こされる疾患が、 インスリン抵抗性を伴う疾 患であることを特徴とする請求の範囲第 1 3項または第 1 4項に記載の医薬組 成物。
1 6 . 前記 TNF-ひによって引き起こされる疾患が、 糖尿病に起因する疾患であ ることを特徴とする請求の範囲第 1 3項または第 1 4項に記載の医薬組成物。
1 7 . 前記 TNF- Q!によって引き起こされる疾患が、 筋ジストロフィーであるこ とを特徴とする請求の範囲第 1 3項または第 1 4項に記載の医薬組成物。
1 8 . 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する、 腫瘍細胞の増殖を阻害するための腫瘍細 胞増殖阻害剤。
Figure imgf000042_0003
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
1 9 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 1 8項【
Figure imgf000043_0001
20. 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する、 血管内皮細胞の細胞接着を阻害するため の細胞接着阻害剤。
Figure imgf000043_0002
(式中、 R1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
21. 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 20項に記 載の細胞接着阻害剤。
Figure imgf000043_0003
22. 下記の一般式 (1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する、 腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するため のアポトーシス誘導剤。
Figure imgf000043_0004
(式中、 R1は水素原子または C 2 ~4のアルカノィル基である。）
2 3 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 2 2項に記 載のアポトーシス誘導剤。
Figure imgf000044_0001
2 4 . 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する、 肥大化脂肪細胞のアポトーシスを誘導す るためのアポトーシス誘導剤。
Figure imgf000044_0002
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
2 5 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 2 4項に記 載のアポトーシス誘導剤。
Figure imgf000044_0003
2 6 . さらに、 TNF -ひを有効成分として含有することを特徴とする請求の範囲 第 2 4項または第 2 5項に記載のアポトーシス誘導剤。
2 7 . 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する肥満予防 ·防止剤。
Figure imgf000045_0001
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
2 8 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 2 7項に記 載の肥満予防 ·防止剤。
Figure imgf000045_0002
2 9 . 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する血糖値低下剤。
Figure imgf000045_0003
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
3 0 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 2 9項に記 載の血糖値低下剤。
Figure imgf000045_0004
3 1 . 下記の一般式（1)で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許 容される塩を有効成分として含有する、 細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤。
Figure imgf000046_0001
(式中、 R1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
32. 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 3 1項に記 載の細胞分化誘導の阻害を解除する薬剤。
Figure imgf000046_0002
33. 前記細胞分化誘導の阻害が、 TNF-Q!による筋細胞分化の抑制であるこ とを特徴とする請求の範囲第 3 1項または第 32項に記載の細胞分化誘導の阻 害を解除する薬剤。
34. 式（3) ：
Figure imgf000046_0003
で表される化合物のラセミ体を直接光学分割することを特徴とする、 式 (2)
Figure imgf000046_0004
または式 (4)
Figure imgf000047_0001
で表される光学活性な化合物を製造する方法。
35. 前記光学分割が光学活性カラムを用いて行われる請求の範囲第 34項に 記載の方法。 ， 36. 前記光学活性カラムは、 下記の式（5)で表される基で置換された多糖の 芳香族力ルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填されていることを特 徴とする請求の範囲第 35項に記載の方法。
Figure imgf000047_0002
(式中、 R3〜R7は、 水素原子、 炭素数 1〜8のアルキル基である。）
37. 前記多糖の芳香族力ルバメート誘導体が、 アミローストリス （3， 5— ジメチルフエ二ルカルバメート） であることを特徴とする請求の範囲第 36項に 記載の方法。
38. 式（3)
Figure imgf000047_0003
で表される化合物のラセミ体を、 下記の式（5)で表される基で置換された多糖の 芳香族力ルバメート誘導体を有効成分とする分離剤によって直接、 光学分割する ことを特徴とする直接分割方法。
Figure imgf000047_0004
(式中、 R3〜R7は、 水素原子、 炭素数 1〜8のアルキル基である。）
3 9 . 多糖の芳香族力ルバメート誘導体が、 アミロース トリス （3 , 5—ジメ チルフエ-ルカルバメート） であることを特徴とする請求の範囲第 3 8項に記載 の直接分割方法。
4 0 . F- K Bの活性化を伴う疾患を改善するために下記の一般式（1)で表され る光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いることを特徴と する治療方法。
Figure imgf000048_0001
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
4 1 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請^の範囲第 4 0項に記 載の治療方法。
Figure imgf000048_0002
4 2 . 前記症状が、 腫瘍細胞に起因することを特徴とする請求の範囲第 4 0項 または第 4 1項に記載の治療方法。
4 3 . 前記腫瘍細胞の増殖を阻害することにより、 前記疾患を改善することを 特徴とする請求の範囲第 4 2項に記載の治療方法。
4 4 . 血管内皮細胞の細胞接着活性を阻害することにより、 前記疾患を改善す ることを特徴とする請求の範囲第 4 0項に記載の治療方法。
4 5 . 前記疾患が、 免疫疾患、 アレルギー性疾患、 炎症性疾患、 腫瘍転移、 悪 疫質、 動脈硬化、 白血病からなるグループから選ばれる疾患であることを特徴と する請求の範囲第 4 0項に記載の治療方法。
4 6 . NF- /c B を活性化させる治療を行うステップと、 下記の一般式（1)で表さ れる光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含 有する医薬組成物を投与するステップとを含むことを特徴とする治療方法。
Figure imgf000049_0001
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
4 7 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 4 6項に記 載の治療方法。
Figure imgf000049_0002
4 8 . 前記 NF - κ Β を活性化させる治療が、 抗腫瘍剤の投与であることを特徴 とする請求の範囲第 4 6項または第 4 7項に記載の治療方法。
4 9 . 前記 NF- κ Β を活性化させる治療が、 腫瘍細胞に対する放射線照射によ る治療であることを特徴とする請求の範囲第 4 6項または第 4 7項に記載の治 療方法。
5 0 . TNF- aによって引き起こされる疾患を改善するために下記の一般式（1) で表される光学活性な化合物またはその薬理学的に許容される塩を用いること を特徴とする治療方法。
Figure imgf000049_0003
(式中、 R 1は水素原子または C 2〜4のアルカノィル基である。）
5 1 . 前記化合物が次式 (2)であることを特徴とする請求の範囲第 5 0項に記 載の治療方法。
Figure imgf000050_0001
5 2 . 前記 TNF- aによって引き起こされる疾患が、 インスリン抵抗性を伴う疾 患であることを特徴とする請求の範囲第 5 0項または第 5 1項に記載の治療方 法。
5 3 . 前記 TNF- aによって引き起こされる疾患が、 糖尿病に起因する疾患であ ることを特徴とする請求の範囲第 5 0項または第 5 1項に記載の治療方法。 5 4 . 前記 TNF - によって引き起こされる疾患が、筋ジストロフィーであるこ とを特徴とする請求の範囲第 5 0項または第 5 1項に記載の治療方法。
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