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WO2004016280A1 - 組換えｂｃｇワクチン - Google Patents

組換えｂｃｇワクチン Download PDF

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Publication number
WO2004016280A1
WO2004016280A1 PCT/JP2003/010303 JP0310303W WO2004016280A1 WO 2004016280 A1 WO2004016280 A1 WO 2004016280A1 JP 0310303 W JP0310303 W JP 0310303W WO 2004016280 A1 WO2004016280 A1 WO 2004016280A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rbcg
codon
recombinant
bcg
bcg vaccine
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/010303
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mitsuo Honda
Kazuhiro Matsuo
Masaru Kanekiyo
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Infectious Diseases
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency, Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Infectious Diseases filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to DE60322070T priority Critical patent/DE60322070D1/de
Priority to EP03788098A priority patent/EP1535627B1/en
Priority to US10/524,586 priority patent/US7638133B2/en
Priority to JP2004528872A priority patent/JP5145492B2/ja
Publication of WO2004016280A1 publication Critical patent/WO2004016280A1/ja
Priority to US12/230,847 priority patent/US7670610B2/en

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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16211—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV gagpol
    • C12N2740/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention of this application relates to a recombinant BCG vaccine. More specifically, the invention of this application relates to a recombinant BCG vaccine that can induce a sufficient immune response against a foreign antigen protein at a small dose.
  • Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium bovis BCG
  • Mycobacterium bovis BCG Mycobacterium bovis BCG
  • HAV human immunodeficiency virus
  • SIV monkey immunoimmune deficiency virus
  • the BCG strain is a candidate for an excellent recombinant actin in terms of its safety and ease of supply.
  • conventional recombinant BCG vaccines have not always been sufficient in terms of their ability to induce immunity against targeted infectious diseases and cancer.
  • using recombinant BCG vaccine targeting HIV-1 When immunization is performed on the mot, it is necessary to administer 10 to 100 times the amount of normal BCG vaccine used in humans (0.05 to 0.1 mg) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 10698-10697, 1995).
  • codon optimization has been attempted as a means of imparting high immunogenicity to foreign antigen proteins.
  • the invention of this application is, as an invention for solving the above-mentioned problem, a recombinant BCG vaccine transformed by an expression vector having a polynucleotide encoding a foreign antigenic protein, The third base in each codon of the polynucleotide was replaced with G or C without changing the amino acid type
  • a recombinant BCG vaccine which is a modified polynucleotide.
  • One preferred embodiment of this recombinant BCG vaccine is that all bases of each codon of the modified polynucleotide are substituted so as to be rich in G or C without changing the type of amino acid. .
  • polynucleotide refers to a phosphoric acid ester of a nucleoside in which a purine or pyrimidine is linked to a sugar] 3 -N-glycoside (ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) Means a bound molecule.
  • ATP phosphoric acid ester of a nucleoside in which a purine or pyrimidine is linked to a sugar] 3 -N-glycoside
  • ATP phosphoric acid ester of a nucleoside in which a purine or pyrimidine is linked to a sugar] 3 -N-glycoside
  • ATP ATP, GTP, CTP, UTP; or dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • Protein and “peptide” mean a molecule composed of a plurality of amino acid residues linked to each other by an amide bond (peptide bond).
  • FIG. 1 shows the deduced nucleotide sequence of the p24 gene derived from pNL4-3 and the nucleotide sequence of the synthetic HIV-1 gag p24 gene having the optimal codon of mycobacteria. BamHI and Apal recognition sites were added to the 5 'and 3' ends of this DNA fragment for cloning into the pUC-hspK vector. An asterisk indicates the same sequence as the pNL4-3 p24 gene.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the structure of the expression vectors pSO-p24Mu and pSO-p24WT. It is.
  • A is a schematic diagram of the expression unit of HIV-1 p24. Each arrow and solid square indicate the direction of transcription of the hsp60 promoter and terminator. The gray, black, and white bars indicate the mycobacterial DNA fragment, the modified p24 gene, and the PCR fragment of the p24 gene, respectively.
  • FIG. 3 shows the results of comparing the p24 expression level and the growth rate of rBCG-p24Mu and rBCG-p24Wt.
  • proteins reacting with the anti-p24 monoclonal antibody (V107) were visualized by Western blot.
  • Lane 1 rBCG- lysates of P 24 wt, lane 2 lysates of rBCG-p24Mu, lane 3 is a lysate of rBCG containing PS0246 (negative control).
  • B Comparison of p24 concentration in whole cell lysates of rBCG-p24Mu and rBCG-p24Wt.
  • RBCG cells were periodically harvested from 1 ml of each culture, sonicated and tested with the commercial p24 antigen EIA. Black and white squares indicate rBCG-p24Mu and -p24Wt, respectively. De overnight shows the mean ⁇ sd of different clones.
  • C shows the growth rate dynamics of the recombinant clone. 1 ml of each culture was collected periodically, the OD at 470 nm was measured, and the cell density was calculated from the absorbance as shown below;
  • Density (g / ml) absorbance at 470 nm X 1412.3 + 73.063
  • Cfu was converted from density and plotted. Black squares, white squares, and white circles indicate rBCG-p24Mu> -p24Wt and pS0246, respectively. De overnight shows the average soil s.'d. Of different clones.
  • FIG. 4 shows cellular and humoral immune responses in mice immunized with rBCGs.
  • A Lymphocyte proliferation to Gag p24 overlapping peptide. Proliferative activity was indicated by stimulus index (SI).
  • SI stimulus index
  • the black and white columns show the SI values of mice immunized with rBCG-p24Mu and -p24Wt, respectively. Data show the mean SI value of each group of mice + sd.
  • An asterisk indicates a statistically significant difference (* indicates ⁇ ⁇ 0.02, ** indicates ⁇ ⁇ 0.002).
  • ⁇ Measurement of antigen-specific IFN-7 "secreting cells by ELISPOT ATSSE.
  • Black, white and gray columns show the SFC counts of mice immunized with rBCG-p24Mu, -p24Wt and pS0246, respectively. shows the average number + sd group of SFCs / 10 6 cells. asterisks statistical significance (* is p ⁇ 0.05 against rBCG-P24Wt immunized mice) shows the. (C) were immunized with each rBCG Anti-p24 specific antibody and anti-PPD specific IgG antibody in mouse plasma. The black, white and gray columns are the reciprocal titers of log2 of mice immunized with rBCG-p24Mu, -p24Wt and pS0246, respectively. Titers were determined by endpoint ELISA. Data show the mean titer of each group of mice + sd.
  • the recombinant BCG vaccine of the present invention contains, as an active ingredient, a recombinant BCG transformed by an expression vector having a polynucleotide encoding a foreign antigenic protein. Then, the third nucleotide of the codon encoding each amino acid residue is provided that the polynucleotide encoding the foreign antigenic protein does not change the type of amino acid residue in the amino acid sequence of the antigenic protein to be encoded. It is characterized in that it is a modified polynucleotide in which the second base is substituted with G (guanine) or C (cytosine).
  • the codon substitution is specifically as shown in Table 1 (column of “optimal codon”). That is, for example, there are four types of codons encoding glycine (Gly), GGT, GGC, GGA and GGG, and the Gly codon meeting the above criteria is GGC or GGG. Thus, if the Gly codon in the amino acid sequence of any antigenic protein is GGT or GGA, the third T (thymine) or A (adenine) is replaced by C or G.
  • the BCG genome consists of DNA having a high G + C content, and that the third position of the codon strongly favors the GC pair (J. Virol. 75: 9201-9209, 2001; Infect. Immun. 57: 283-288, 1989).
  • accumulated information on the BCG gene (Nucl. Acids Res. 28: 292, 2000). Force, et al., AGA codon of Arg and TTA codon of Leu. It is also known that it is used very rarely (0.9% and 1.6% of all codons).
  • HIV-1 is known to favor the AT pair at the third position of the codon.
  • the codon usage frequency particularly preferred in BCG cells that is, the third base of the codon matches G or (: further, a codon containing as much G or C as possible)
  • the known Kunkel method Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985 and Methods in Enzymology 154: 367, 1987
  • a method using a mutation kit, etc. or a mutagenesis type PCR method.
  • a vector for BCG for example, plasmid PS0246 or the like
  • An expression vector can be constructed by inserting a polynucleotide encoding any foreign (ie, other than BCG) antigenic protein into this vector cloning site.
  • a foreign antigenic protein may be referred to as “foreign polypeptide”, and a polynucleotide encoding the same may be referred to as “foreign polynucleotide”.
  • the foreign polynucleotide includes any promoter and evening terminator sequence derived from the BCG strain (for example, the promoter of the heat shock protein (Hsp60) derived from the BCG strain).
  • Hsp60 heat shock protein
  • the foreign polynucleotide is a polynucleotide (for example, a cDNA fragment) encoding an antigenic protein other than the BCG strain, and the foreign polypeptide may be any as long as it induces an antigen-antibody reaction in vivo.
  • human immunodeficiency virus the virus responsible for human acquired immunodeficiency syndrome (AIDS)
  • HIV gag precursor p55 or p24 protein, env protein gpl20 or gpl60, poll precursor protein, nef protein, tat protein and the like can be targeted.
  • Similar antigenic polypeptides derived from simian immunodeficiency virus (SIV) can also be used.
  • pathogens other pathogenic viruses or bacteria
  • polynucleotides encoding antigenic proteins of cancer cells can be used.
  • a polynucleotide which is a substantial sequence, may be cut out from a plasmid into which a genomic gene encoding a foreign polypeptide or its cDNA has been cloned, using an appropriate restriction enzyme, or an appropriate sequence.
  • Amplification may be performed by polymerase chain reaction (PCR) using the above primer. Amplify the DNA fragment by the above PCR method using the genomic DNA of the bacterium or animal carrying the gene if it has not been cloned, or the DNA or RNA from animal cells infected with the virus if it is a virus.
  • the expression vector constructed in this manner is introduced into a BCG strain by a known method such as a calcium chloride method or an electroporation method, and the expression of the foreign polypeptide of the transformed bacterium is analyzed by Western blotting.
  • the recombinant BCG of the present invention can be prepared by confirming with a mouse or a known immunoassay (for example, ELISA).
  • a recombinant BCG vaccine can be prepared by suspending the recombinant BCG thus prepared in a liquid carrier similar to a normal BCG vaccine.
  • rBCG a BCG Tokyo vaccine strain was used.
  • the medium for culturing the recombinant BCG (rBCG) was a DNA encoding the hsp60 gene of BCG using Middlebrook 7H9 broth (7H9-ADC; BBL Microbiology System, Cockeyville, MD-) containing the albumin dextrose complex.
  • the fragment (Infect. Immun. 55: 1466-75, 1987) was cloned into the Smal-Sall site of pUC18 (pUC-hsp60).
  • the multi-cloning site and the synthetic DNA fragment corresponding to the evening and the evening region of the hsp60 gene were cloned into the Munl-Kpnl site of pUC-hsp60, and then the Kpnl linker was inserted into the EcoRI site, and pUC- hspK vector — was constructed.
  • Gag P 24 gene subtype B viruses, pNL4-3 plasmid (J. Virol 59:. 284-291, 1986) was PCR amplified from. The following PCR primers were used.
  • This PCR product (wild-type p24 gene) was cloned by matching the translation frame to the BamHI-Apal site of pUC-hspK to construct pUC-hspK-p24Wt.
  • a synthetic DNA fragment was prepared using a known synthesis method so that the entire nucleotide sequence of the p24 gene would be the optimal codon in BCG, and this synthetic DNA fragment (modified p24 gene) was inserted into the pUC-hspK vector.
  • PUC-hspK-p24Mu The wild-type and modified p24 sequences from pNL4-3 are as shown in Figure 1.
  • These recombinant vectors were digested with Kpnl and the small fragments containing the ⁇ 24 expression units (hps-p24Wt and hps-p24Mu, Figure 2A) were transformed into the stable E. coli-mycobacterial shuttle vector pS0246 (FEMS Microbiol.
  • Transformants of rBCG were grown in 7H10-ADC broth for 2 weeks. A portion of the medium is collected periodically, sonicated, and sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (SDS-PAGE) using Multi Gel 4/20 (Daiichi Pure Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan). It was subjected to electrophoresis. The fractionated protein is electroblotted on a nitrocellulose filter and reacted with the V107 monoclonal antibody (J. Gen. Virol. 73: 2445-2450, 1992).
  • Transformants of rBCG were grown in 7H9-ADC broth for 2 weeks. Portions of the medium were collected periodically and sonicated.
  • the p24 antigen concentration in the cell extract was determined by a commercial -antigen EIA (HIVAG-1MC, Abott Laboratories, Abott Park, IL).
  • p24 protein expression was expressed as p24 protein concentration per 108 colony-forming units (cfu) of the fungus.
  • DTH Delayed type hypersensitivity
  • rBCG 0.1-5 mg / 0.1 ml saline
  • Physiological saline was used for negative control. Twenty-four hours later, skin reactions were measured.
  • mice 6-8 week old female BALB / c (H-2d) mice were purchased from Charles River Japan Inc. (Yokohama, Japan). Mice were acclimated to the animal experimental facility for at least one week before use in the experiment, and were kept in the facility under SPF conditions according to the guidelines of the Japan Institute of Infectious Diseases. The experiments were performed under the approval of the Institute's committee on biosafety and biosafety level 2 based on the provisions of the International Health Organization (WHO).
  • WHO International Health Organization
  • mice All mice were sacrificed 10 weeks after intradermal inoculation and cell filtration filters (Becton Single cells from spleen were isolated via Dickinson, Franklin Lakes, NJ). After hemolysis, cells were harvested in complete medium (CM; containing 10% heat-inactivated FCS, 5.5 ⁇ 10-5 Mj3-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin and 50 g / ml streptomycin. RPMI 1640).
  • CM complete medium
  • FCS containing 10% heat-inactivated FCS, 5.5 ⁇ 10-5 Mj3-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin and 50 g / ml streptomycin.
  • RPMI 1640 complete medium
  • the single cell suspension was adjusted to 2 ⁇ 10 6 cells / ml in CM.
  • the final cell concentration was 1 ⁇ 10 6 cells Zml.
  • the duplicated peptides used ranged from pll (LERFAVNPGLLETSE: SEQ ID NO: 4) covering the Gag p24 region to P35 (NIQGQMVHQAISPRT: SEQ ID NO: 5), and were pooled every 5 peptides. All or all pools were used for stimulation.
  • INFT secreting cells specific for HIV Gag p24 and PPD were assayed using the mouse IFN-A Development Module and the ELISPOT Blue Color Module (R & D Systems Inc., Minneapolis, MN).
  • a single cell suspension from the spleen was treated with 25 g / ml of the Gag overlapping peptide (pi 1-35), 5 g / ml of the recombinant p24 protein, or 2.5 g / ml of the purified protein of tuberculin. (PPD) is exist, or in the absence of CM, at 37, 5% C0 2, and incubated for between 48 hours in a humidified environment.
  • Plasma IgG titers specific for PPD and p24 were determined by endpoint ELISA.
  • 96 microtiter evening first plate; use (MaxiSorp TM Nunc A / S, Roskilde, Denmark) and bicarbonate buffer (35 mM NaHC0 3, 15 mM Na 2 C0 3, 0.02% NaN 3, pH9.6) and 1 wg / ml of rp24 or PPD was coated at 4 with 100 mg / ml. After blocking the wells overnight with 4 using PBS-1% BSA, the plate was washed 3 times with PBS-T.
  • the BCG transformant into which the codon-optimized HIV gag p24 gene had been inserted was approximately 200 ng of p24 antigen per 108 cfu of cells, or 200 ng of p24 antigen per mg of codon-optimized rBCG-HIV. Can be produced.
  • rBCG-p24Mu-immunized mice showed significant activity (stimulation index was higher by the pooled peptide # 2 (pl6-20) and the pooled total p24 peptide # le5 (pll-35)). 5.04 and 4.02) were obtained. At 0.1 mg of rBCG-p24Mu immunization, the lymphoproliferative response to pool # 2 and pool # 1-5 increased to 10.08 and 8.05, respectively. On the other hand, no significant virus-specific increase was detected in 0.01 mg and 0.1 mg rBCG-p24Wt immunized mice (FIG. 4A).
  • p24-specific IFN-secreting cells were measured by ELISPOT Atssey. Pooled p24 peptide (pool # 1-5) and recombinant p24-specific SCFs were detected in 0.1 mg rBCG-p24Mu and rBCG-p24Wt immunized mice, but the same amount of rBCG-pS0246 immunized It was not detected in mice ( Figure 4B).
  • the invention of the present application provides an excellent expression level of antigenic proteins, and as a result, can be used at the same amount as a normal BCG vaccine.
  • a recombinant BCG vaccine capable of inducing a sufficient immune response against cancer and the like.

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Abstract

外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換えBCGワクチンであって、ポリヌクレオチドの各コドンの第3番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなくGまたはCに置換された改変型ポリヌクレオチドである。この組換えBCGワクチンは、抗原性タンパク質の発現量に優れ、その結果として通常のBCGワクチンと同程度の使用量によっても、標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導することができる。

Description

明細書
組換え BCGワクチン
技術分野 この出願の発明は、 組換え BCG ワクチンに関するものである。 さらに詳しく は、 この出願の発明は、 少ない用量で外来性抗原タンパク質に対する十分な免疫 応答を誘導することのできる組換え BCGワクチンに関するものである。
背景技術 牛型結核菌弱毒 BCG株 （Mycobacterium bovis BCG。 以下 「BCG」 と記載 する） は、 その安全性から、 最も一般的な生バクテリアワクチンとして知られて いる。 一方、 この十数年来の遺伝子組換え技術の開発、 向上に伴い、 ウィルスや細菌 などの微生物に外来性の抗原性タンパク質を発現させるように改変して、 様々な 感染症や癌の予防および治療に対するワクチンベクタ一として応用しょうという 研究が盛んに行われて来ている。 BCG についても、 例えばヒ ト免疫不全ウィル ス （HIV) ゃサル免疫免疫不全ウィルス （SIV) を標的とする組換え BCG ワク チン力 報告されてレ る （J. Immunol. 164:4968-4978, 2000; J. Virool. 7 1 :2303-2309 , 1997 ; Infect. Immun. 57 :283-288, 1989 ) 。
BCG 株は、 その安全性と供給が容易であるという点において優れた組換えヮ クチンの候補である。 しかしながら、 従来の組換え BCG ワクチンの場合には、 標的となる感染症や癌等に対する免疫誘導能の点においては必ずしも十分なもの ではなかった。 例えば、 HIV- 1 を標的とする組換え BCG ワクチンを用いてモル モッ 卜に免疫誘導を行った場合には、 通常の BCG ワクチンのヒ 卜への使用量 (0.05-0. lmg) の 10〜100 倍の量を投与する必要がある （Proc. Natl. Acad. Sci. USA.92:10698-10697, 1995) 。 一方、 組換えワクチンにおいて、 外来抗原タンパク質に高い免疫原性を与える 手段として、 コ ドンの最適化が試みられている。 すなわち、 リ ステリ ア菌 、 し isteria monocytogenes ) の リ スァ リ ； リ ン ン ( losteriolysin ) 0 (J. Immunol. 161 ： 5594-5599, 1998) 、 HIV- 1 Gag (J. Virol. 75 ： 10991- 11001, 200; J. Virol. 74 ： 2628-2635, 2000) 、 Env (J. Virol. 72 ： 1497- 1503， 1998) 、 破傷風毒素 （Vaccine 19 ： 810-815, 2000) 、 ヒ トパピ口一 マウィルスの L1タンパク質 （J. Virol. 75 ： 9201-9209， 2001) 、 熱帯熱マラ リア原虫 （Plasmodium falciparum) のメロゾイ ト表面タンパク質 1 (Infect. Immun. 69 ： 7250-7253, 2001) などのコ ドン最適化が報告されている。 しか しながら、 これらのコドン最適化は、 各抗原タンパク質のアミノ酸コ ドンをヒ ト 化したものである。 また、 組換えワクチンも DNA ワクチン （naked DNA) で あり、 BCG 株等の他の組換えベクターを主成分とするワクチンにおいては、 コ ドン最適化の効果は全く報告されていない。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 抗原 性タンパク質の発現量に優れ、 その結果として通常の BCG ワクチンと同程度の 使用量によっても、 標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導する ことのできる組換え BCGワクチンを提供することを課題としている。
発明の開示 この出願の発明は、 前記の課題を解決するための発明として、 外来性の抗原性 タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質 転換された組換え BCG ワクチンであって、 前記ポリヌクレオチドの各コ ドンの 第 3番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなく G または C に置換された 改変型ポリヌクレオチドである組換え BCGワクチンを提供する。 この組換え BCG ワクチンにおいては、 改変型ポリヌクレオチドの各コ ドンの 全塩基が、 アミノ酸の種類を変化させることなく G または C を多く含むように 置換されていることを好ましい態様の一つとしている。 なおこの発明において、 「ポリヌクレオチド」 とはプリンまたはピリミジンが 糖に ]3 -N-グリ コシド結合したヌクレオシ ドのリ ン酸エステル （ ATP、 GTP、 CTP . UTP； または dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP) が結合した分子を意味する。 また、 「タンパク質」 および 「ペプチド」 とは、 アミ ド結合 （ペプチド結合） に よって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。 この発明におけるその他の用語や概念は、 発明の実施形態の説明や実施例にお いて詳しく規定する。 またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、 特 にその出典を明示した技術を除いては、 公知の文献等に基づいて当業者であれば 容易かつ確実に実施可能である。 例えば、 遺伝子工学および分子生物学的技術は Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, し old Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989 ; Ausubel, F. M . et al.， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。 -
図面の簡単な説明 図 1 は、 pNL4-3 由来の p24 遺伝子のヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸 配列、 およびマイコバクテリァの最適コ ドンをもつ合成 HIV- 1 gag p24 遺伝子の ヌク レオチド配列である。 pUC-hspK ベクターへのクロ一ニングのため、 この DNA フラグメントの 5 ' および 3 ' 末端に BamHIおよび Apal認識部位を付加し た。 星印は pNL4-3 p24遺伝子との同一配列を示す。
図 2 は、 発現べクタ一 pSO-p24Mu および pSO-p24WT の構造を示した模式図 である。 （A)は HIV- 1 p24の発現ユニットの模式図である。 それぞれの矢印および 黒四角はは、 hsp60 プロモーターおよびターミネータ一の転写方向を示している。 灰色、 黒色、 および白のバーは、 各々マイコバクテリアの DNA フラグメント、 改 変型 p24遺伝子、 および p24遺伝子の PCRフラグメントを示す。 （B)は発現べク ター PSO-p24Mu および- p24Wt の詳細である。 Ori-M および Kmrは、 各々マイ コバクテリァの複製起点およびカナマイシン耐性遺伝子を示す。
図 3は、 rBCG-p24Muおよび rBCG-p24Wtの p24発現レベルおよび増殖速度 を比較した結果である。 （A)は、 抗 p24モノクローナル抗体 （V 107) に反応する夕 ンパク質をウエスタンブロッ卜によって可視化した。 レーン 1 は rBCG-P24Wtの 溶解産物、 レーン 2 は rBCG-p24Mu の溶解産物、 レーン 3 は pS0246 を含む rBCG の溶解産物 （ネガティブコントロール） である。 （B)は rBCG-p24Mu およ び rBCG-p24Wtの全細胞溶解物における p24濃度の比較である。 1mlの各培養物 から rBCG細胞を定期的に回収し、 超音波処理し、 市販の p24抗原 EIAにより試 験した。 黒および白四角はそれぞれ rBCG-p24Muおよび- p24Wtを示す。 デ一夕 は異なるクローンの平均値 ± s.d.を示す。 （C)は組換え体クローンにおける増殖速度 の動性である。 1ml の各培養物を定期的に回収し、 470 nm における O.D.を測定 し、 以下に示したとおりに吸光度から細胞密度を計算した ；
密度 （ g/ml) = 470 nmの吸光度 X 1412.3 + 73.063
密度から cfuを変換し、 プロットした。 黒四角、 白四角、 白丸はそれぞれ、 rBCG- p24Mu> -p24Wt、 および pS0246 を示す。 デ一夕は異なるクローンの平均値土 s.'d.を示す。
図 4 は、 rBCGs で免疫化したマウスにおける細胞性および体液性免疫反応であ る。 （A)は Gag p24重複ペプチドに対するリンパ球増殖である。 増殖活性は刺激指 数 (SI)で示した。 黒および白カラムはそれぞれ rBCG-p24Mu および- p24Wt で免 疫したマウスの SI値を示す。 データは各マウス群の平均 SI値 + s.d.を示す。 星印 は統計的有意差 （*は ρ<0·02、 **は ρ<0·002) を示す。 （Β)は ELISPOT アツセィ による抗原特異的 IFN- 7"分泌細胞の測定。 黒、 白および灰色カラムはそれぞれ rBCG-p24Mu、 -p24Wtおよび pS0246で免疫したマウスの SFC数を示す。 デー 夕は各マウス群の SFCs/ 106細胞の平均数 + s.d.を示す。 星印は統計的有意差 （* は rBCG-p24Wt免疫マウスに対する p<0.05) を示す。 （C)は各 rBCGで免疫した マウスの血漿中における抗 p24特異的抗体および抗 PPD特異的 IgG抗体。 黒、 白 および灰色カラムはそれぞれ rBCG-p24Mu、 -p24Wtおよび pS0246 で免疫した マウスの log2の逆数力価である。 力価は終点 ELISAにほって決定した。 データは 各マウス群の平均力価 + s.d.を示す。
発明を実施するための最良の形態 この発明の組換え BCG ワクチンは、 外来性の抗原性タンパク質をコードする ポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質転換された組換え BCG を有効成分とする。 そして、 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレ ォチドが、 コ一ドする抗原性タンパク質のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の 種類を変化させないという条件で、 各アミノ酸残基をコードするコ ドンの第 3番 目塩基が G (グァニン） または C (シトシン） に置換された改変型ポリヌクレオ チドであることを特徴としている。 コ ドンの置換は、 具体的には表 1 に示したとおりである （ 「至適コ ドン」 の 欄） 。 すなわち、 例えばグリシン （Gly) をコードするコ ドンは、 GGT、 GGC、 GGAおよび GGGの 4種類であるが、 上記の基準に合致する Glyコ ドンは GGC または GGG である。 従って、 任意の抗原性タンパク質のアミン酸配列における Gly コ ドンが GGT または GGA である場合には、 第 3番目の T (チミン） また は A (アデニン） は、 Cまたは Gに置換される。
表 1
アミノ酸 コドン 至適コドン グリシン Gly G GCT, GGC GGA GGG GGG
ァラニン Ala A OCT, GCC GCA GCG GCC GCG
バリン Val V GTT, GTC GTA CTG GTC CTG
ロイシン Leu し CTT, CTC CTA CTG TTA nG r wrln U u
イソロイシン l ie 1 ATT, ATC ATA ATC
セリン Ser S TCT, TCC TCA TCG ACT, AGC AfiC
ス ニン Thr 丁 ACT, ACC ACA ACG ACG
システィン Cys c TCT, TGC
メチ才ニン Met M ATG ATG
ァ ラギン Asn N AAT, AAC AAC
ク ^ミン Gin Q CAA CAG CAG
フェ^/レアラニン - Phe F πτ, TTC TTC
チロシン Tyr Y TAT, TAC TAC
卜リプ卜ファン Trp W TGG TGG
Asp 0 GAT, GAC GAC
グ: L ^ミ^ G!u E GAA GAG GAG
ヒスチンン His H CAT, CAC CAC
リジン Lys K AAA AAG AAG
ァノ ニン Arg R CGT, CGC CGA CGG AGA AGG CGC co AGG
リン Pro P CCT, CCC CCA CCG CCC CCG この発明においては、 各コ ドンの全ての塩基はさらに、 それがコードするアミ ノ酸残基の種類を変化させない条件で、 G または C を多く含むように置換され ていることを好ましい態様としている。 このような置換は、 具体的には、 口イシ ン （Leu) およびアルギニン （Arg) に適用される。 すなわち、 表 1に示した至 適コ ドンのうち、 Leu コ ドンとしては、 T を 2個含むコ ドン （TTG) よりも、 CTC または CTGが好ましく選択される。 また、 Argコ ドンとしては、 A を含む コ ドン （AGG) よりも、 CGCまたは CGGが好ましく選択される。 以上のとおりのコ ドン置換は、 以下の知見に基づいている。 すなわち、 BCG ゲノムは G + C含量の高い DNAから成り、 コ ドンの 3番目の位置は GCペアを 強く好むことが知られている （J. Virol. 75 :9201 -9209 , 2001 ; Infect. Immun. 57 :283-288, 1989 ) 。 また、 BCG 遺伝子についての集積された情報 （Nucl. Acids Res. 28:292 , 2000) 力、ら、 Argの AGAコ ドンおよび Leuの TTAコ ドン の使用頻度は極めて低いこと （全コ ドンの 0.9%および 1 .6%) も知られている。 一方、 例えば、 HIV- 1 はコ ドンの 3番目の位置に ATペアを好むことが知られて いる。 すなわち、 HIV- 1 p24遺伝子のコード配列においては、 1 1個の Argコ ド ンのうち 9個力 AGA を用い、 また 18個の Leu コ ドンのうち 6個が TTA を用 いている。 コ ドン使用頻度の好みは、 単細胞生物では対応するアミノアシル tRNA量と相関関係があることが一般的に知られている （Nature 325 :728-730, 1987; Mol. Biol. Evol. 2: 13-34， 1985) が、 HIV- 1 p24遺伝子において好ま れる Arg コ ドン （AGA) および Leu コ ドン （TTA) 用のアミノアシル tRNA量 は BCG細胞においては極めて低いと考えられる。 従って、 この発明においては、 BCG 細胞において特に好まれるコ ドン使用頻 度 （すなわち、 コ ドンの第 3番目塩基が G または（：、 さらには G または C をで きるだけ多く含むコ ドン） に合致した塩基配列となるように、 外来性の抗原性ポ リヌクレオチドを置換するようにしている。 各コ ドンに対応した好ましい塩基置換をポリヌクレオチドに導入するには、 公 知の Kunkel 法 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985 および Methods in Enzymology 154:367, 1987) や、 ミューテーシヨン · キッ ト等を使用する方法、 あるいは変異導入型の PCR法などを採用することができる。
BCG 株は、 結核の予防接種等に使用されている公知のものを対象とすること ができる。 また、 BCG 株に導入する発現べクタ一は、 従来の組換え BCG ワク チンの作成に使用されているような、 BCG 用べクタ一 （例えばプラスミ ド PS0246 等） を使用することができる。 このべクタ一のクローニングサイ トに、 外来性 （すなわち、 BCG 以外） の任意の抗原性タンパク質をコードするポリヌ クレオチドを挿入することによって発現ベクターを構築することができる。 なお、 以下の記載では、 外来性の抗原性タンパク質を 「外来ポリペプチド」 、 これをコ ードするポリヌクレオチドを 「外来ポリヌクレオチド」 と記載することがある。 また、 外来ポリヌクレオチドには、 BCG 株由来の任意のプロモーターおよび夕 ーミネーター配列 （例えば BCG 株由来の熱ショ ックタンパク質 (Hsp60)のプロ モーターおよび夕一ミネ一夕一配列） 等を連結することによって、 外来ポリぺプ チドを良好に発現させるようにする。 外来ポリヌクレオチドは、 BCG 株以外の抗原性タンパク質をコードするポリ ヌクレオチド （例えば、 cDNA断片） であり、 外来ポリペプチドは生体内で抗原 抗体反応を惹起するものであれば如何なるものであってもよい。 具体的にはヒ ト 後天性免疫不全症候群 （AIDS ) の原因ウィルスであるヒ ト免疫不全ウィルス
(HIV) の gag前駆体 p55または p24タンパク質、 envタンパク質 gp l 20また は gp l 60、 po l 前駆体タンパク質、 nef タンパク質、 tat タンパク質等を対象と することができる。 また、 サル免疫不全ウィルス （SIV) 由来の同様の抗原性ポ リペプチドを使用することもできる。 あるいは、 その他の病原体 （他の病原性ゥ ィルスや細菌） 、 もしくは癌細胞の抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチ ド等を用いることもできる。 外来ポリヌクレオチドの取得方法としては、 外来ポリペプチドをコードするゲ ノム遺伝子またはその cDNA がクローン化されたプラスミ ドからその実質的な 配列であるポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切り出すか、 適当な配列のプラ イマ一を用いた polymerase chain reaction ( PCR) により増幅すればよい。 クローン化されていない場合は、 その遺伝子を持つ細菌、 動物のゲノム DNA を， ウィルスの場合はウィルスが感染した動物細胞由来の DNA または RNA を铸型 として、 上記 PCR 法により DNA 断片を増幅することにより得ることができる < このようにして構築した発現べクタ一を、 塩化カルシウム法や電気穿孔法等の 公知に方法で BCG 株に導入し、 形質転換菌の外来ポリべプチドの発現をウェス タンブロッ 卜や公知の免疫測定法 （例えば ELISA 法等） によって確認すること によって、 この発明の組換え BCGを作成することができる。 このようにして作成した組換え BCG を、 通常の BCG ワクチンと同様の液状 担体に懸濁することによって、 組換え BCGワクチンを作成することができる。 実施例 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明す るが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
1. 材料および方法
1 . 1 . 試薬
組換え DNA のための全ての酵素および大腸菌 HB 10 1 コンビテント細胞は、 Takara Bio Inc. (東京、 日本） より購入した。 野性型 HIV- 1 p24遺伝子増幅用 のプライマ一は、 ESPEC Oligo Service Co. Ltd. (筑波、 日本）から入手した。 抗 HIV- 1 Gag p24モノクロ一ナル抗体 V 107は、 Dr. Ikuta (大阪大学） より提供 された。 ウエスタン免疫ブロッ ト分析のためのペルォキシダーゼ結合抗マウス IgGは、 New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) より購入した。
1 .2. p24発現ベクターの構築および BCGの形質転換
遺伝子操作は、 大腸菌 HB 10 1 コンビテント細胞を用いて行った。 マイコバク テリア株は、 BCG Tokyo ワクチン株を使用した。 組換え BCG (rBCG) の培養 のための培地は、 アルブミンデキストロース複合体を含む Middlebrook 7H9ブ ロス （7H9-ADC； BBL Microbiology System, Cockeyville, MD-) を使用した' BCG の hsp60 遺伝子をコードする DNA フラグメント （Infect. Immun. 55: 1466-75, 1987) を、 pUC 18の Smal-Sall部位へクロ一ニングした （pUC- hsp60) 。 マルチクローニングサイ トおよび hsp60 遺伝子の夕一ミネ一夕一領 域に相当する合成 DNA フラグメントを pUC-hsp60 の Munl-Kpnl部位にク口 —ニングし、 次いで EcoRI 部位に Kpnl リンカーを挿入し、 pUC-hspK ベクタ —を構築した。 サブタイプ B ウィルスの gag P24遺伝子は、 pNL4-3 プラスミ ド （J. Virol. 59 :284-291 , 1986) から PCR増幅した。 PCRプライマ一は以下 を使用した。
フォワード ： AATGGATCCTATAGTGCAGAACCTC (配列番号 1 ： 下線は BamHI部位）
リノ、ース ： AATGGGCCCTTACAAAACTCTTGCTTTATGG
(配列番号 2 ： 下線は Apal部位）
この PCR産物 （野生型 p24遺伝子） を、 pUC-hspK の BamHI-Apal部位に 翻訳枠を一致させてクロ一ニングし、 pUC-hspK-p24Wtを構築した。
一方、 p24 遺伝子の全塩基配列が、 BCG における至適コ ドンとなるように、 公知の合成法を用いて合成 DNA 断片を作成し、 この合成 DNA 断片 （改変型 p24 遺伝子） を pUC- hspK ベクターの前記と同一部位にクローニングした (pUC-hspK-p24Mu) 。 pNL4-3 由来の野性.型 p24 配列と改変型 p24 配列は 図 1 に示したとおりである。 これらの組換えベクターを Kpnlによって消化し、 ρ24 発現ユニッ トを含む小フラグメント （hps- p24Wt および hps- p24Mu、 図 2A) を、 安定な大腸菌一マイコバクテリアシャ トルベクターである pS0246 (FEMS Microbiol. Lett. 135:237-243, 1996) の Kpnl 部位にサブクロー二 ングし、 発現ベクター pSO-p24Wt および pSO-p24Mu をそれぞれ構築した。 発現べクタ一構築の概略は図 2B に示したとおりである。 これらの発現ベクター および p S0246 を、 文献 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6987-6991 , 1988) の記載に従って Gene-Pulser (Bio-Rad Laboratories Inc. Hercules, CA) を用いて BCG に形質導入し、 20 g/ml のカナマイシン含有の OADC 強 化剤 （BBL Microbiology Systems) を補充した Middlebrook 7H 10 寒天プレ ート上で形質転換体を選択した。 そ 結果、 pSO-p24Wt、 PSO-p24Mu および pS0246 をそれぞれ含む組換えクローン rBCG- p24Wt、 rBCG-p24Mu および rBCG-pS0246を得た。
1.3. ウエスタンブロッ ト分析
rBCG の形質転換体を、 7H 10-ADC ブロス中で 2週間増殖させた。 培地の一 部を定期的に収集 し 、 超音波処理 し、 Multi Gel 4/20 ( Daiichi Pure Chemical Co. Ltd. , 東京、 日本） を用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリ ルアミ ドゲル （SDS-PAGE) 電気泳動に供した。 分画したタンパク質をニトロ セルロースフィルタ一上にエレク トロブロッ トし、 V 107 モノクローナル抗体 (J. Gen. Virol. 73:2445-2450, 1992) と反応させ、 二次抗体としてアルカリ フォスファターゼ標識抗マウス IgG と反応させた後、 NBT (ニトロ ブル一 テ トラゾリゥム クロライ ド） / BCIP ( 5-ブロモ -4-クロ口- 3-インドリル フォス フ エ一 卜、 卜 レイ ジン塩） ¾質 oche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany) を用いて可視化した。
1.4. rBCGsにおける Gag p24抗原量の測定
rBCG の形質転換体を、 7H9-ADC ブロス中で 2週間増殖させた。 培地の一部 を定期的に収集し、 超音波処理した。 細胞抽出物中の p24 抗原濃度は、 市販の - 抗原 EIA ( HIVAG- 1MC, Abott Laboratories, Abott Park, IL) によって決定し た。 p24 タンパク質の発現は、 菌の 108 コ ロニー形成ユニッ ト （colony- forming units: cfu) 当たりの p24夕ンパク質濃度として表した。
1.5. モルモッ トにおける遅延型過敏症 （DTH) 反応
Hartley 系雌モルモッ ト （体重約 350g) に、 rBCG ( 0. l-5mg/ 0. lml生理食 塩水） を皮下投与して免疫した （n = 3) 。 DTH 皮膚反応を調べるため、 lOO w i の生理食塩水あたり O . l g の精製ッベルクリンタンパク質誘導体 （PPD) 、 10 < gまたは 1 gの組換え HIVntB Gag p24タンパク質 （Immuno Diagnostics, Inc. Woburn, MA) を、 rBCG 免疫化モルモッ トに各々皮内注射した。 ネガテ イブコントロールには生理食塩水を用いた。 24時間後、 皮膚反応を測定した。
1.6. マウスと免疫化
6-8 週齢の雌 BALB /c(H-2d)マウスは Charles River Japan Inc. (横浜、 日 本） から購入した。 マウスは実験に使用する前に 1 週間以上、 動物実験施設に 馴化させ、 日本感染症研究所のガイ ドラインに従って SPF 条件下の施設内で飼 育した。 実験は、 バイオセーフティーに関する研究所のコミツティーの承認およ び国際保健機構 （WHO) の規定に基づいたバイオセーフティ一レベル 2 の基で 実施した。
1.7. 単一細胞懸濁液の調製
皮内接種の 10 週後に全てのマウスを屠殺し、 細胞濾過フィルター （Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) を介して脾臓からの単一細胞を単離した。 溶 血の後、 細胞を完全培地 （CM; 10%熱不活性化 FCS、 5.5X 10-5 Mj3-メルカプ トエタノール、 50 U/ml ペニシリンおよび 50 g/ml ス トレプトマイシンを含 有する. RPMI 1640) に再懸濁した。
1.8. リ ンパ球増殖試験
単一細胞懸濁液を、 CM 中で 2X106細胞/ ml に調整した。 等量の細胞懸濁液 と CM または HIV-HXB2 Gag 重複ペプチ ド （ NIH AIDS Research & Reference Reagent Program) を 50 1/ml濃度で含む CM とを混合し、 培地 または 25 g/ml のペプチド含有培地の細胞終濃度を 1 X 106細胞 Zml とした。 使 用 し た 重 複 ペ プ チ ド は 、 Gag p24 領 域 を カ バ ー す る pll ( LERFAVNPGLLETSE： 配列番号 4) から P35 (NIQGQMVHQAISPRT： 配列 番号 5 ) までであり、 5 個のペプチド毎にプールしたもの、 または全てプールし たものを刺激に使用した。 ペプチド有りまたは無しの細胞懸濁液は、 丸底 96 穴 プレート （Corning Inc.， Corning, NY) に 3重に添加し、 37で、 5% C02、 カロ 湿した環境下で 48 時間インキュベートした。 回収の 6 時間前、 l iCi の [3Hj— チミジンを添加し、 ガラスファイバ一フィルター （GF/C; PerkinElmer Life Science Inc., Boston, MA) で回収し、 次いで液体シンチレーシヨ ンカウン夕 一 (TopCo nt; PerkinElmer Life Science Inc.) により細胞内に取り込まれた [3H]—チミジン量をカウントした。
1.9. ELISPOT検定
HIV Gag p24 および PPD に特異的な INFT分泌細胞を、 マウス IFN-ァ Development Module と ELISPOT Blue Color Module (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN) によって検定した。 すなわち、 脾臓からの単一細胞懸濁液 を、 25 g/ml の Gag 重複ペプチド （pi 1-35) 、 5 g/ml の組換え p24 タン パク質、 または 2.5 g/ml のッベルクリン精製タンパク質誘導体 （PPD) が存 在する、 または存在しない CM 中で、 37で、 5% C02、 加湿した環境下で 48時 間にわたりインキュベートした。 インキュベーション後、 細胞を RPMI1640 培 地で 1 回洗い、 CM 中に再懸濁した。 検出用の 96穴二トロセルロースプレート (Milliliter HA; Millipore Co. , Bedford, MA) を捕捉抗体でコート （4で、 ― 晚） し、 PBSで洗浄後、 CMで 3時間ブロッキングして、 100 1の刺激細胞を 様々な濃度で各ゥエルに添加し、 37で、 5% C02、 加湿した環境下で 16 時間ィ ンキュベートした。 次いで、 0.05 %の Tween 20含有の PBS (PBS-T) でプレ —トを洗浄し、 検出抗体と共にインキュベートした。 4で一晩のインキュベーシ ヨンの後、 プレートを PBS-T で洗浄し、 アルカリフォスファタ一ゼを結合した ストレプトァビジンと共に室温で 2 時間ィンキュベートした。 PBS-T で洗浄の 後、 プレートに NBT/BCIP 基質を加えて室温で可視化した。 次いで、 プレート を水で洗浄し、 乾燥させ、. スポット形成細胞 （spot forming cells; SFCs) を定 量化した。 KS ELISPOT compact system ( Carl Zeiss, Berlin, Germany) を 用いてゥエルを画像化し、 SFCsを計測した。 SFCは、 不明瞭な縁を持った暗青 色のスポッ トとして規定した （J. Virol. 76:875-884, 2002) 。 有意レベルを決 定するため、 各刺激に対する SFC の平均値および標準偏差値を用いてベースラ インとした。 この平均および 2 倍の標準偏差に対応する棄却値を次に決定した。 もし、 SFC 数が無刺激サンプルの棄却値を超えた場合には反応をポジティブと 見なした。
1. 10. ELISA
血液を 10,000 gで 5分間遠心して血漿を得た。 全てのサンプルは使用まで— 80 で貯蔵した。 PPD および p24 に特異的な血漿中 IgG の力価は終点 ELISA によって決定した。 96穴マイクロタイ夕一プレート （MaxiSorpTM; Nunc A/S, Roskilde, Denmark) を、 重炭酸緩衝液 （35 mM NaHC03， 15 mM Na2C03, 0.02% NaN3, pH9.6) を用レ 1 w g/mlの rp24または PPDを、 4でにて一晚コ —トした。 PBS- 1%BSA を用いて、 4 で一晩にわたってゥエルをブロックした 後、 PBS-T でプレートを 3 回洗浄した。 PBS- 1%BSA を用いて 1 / 24で希釈を 始め、 2倍段階希釈した希釈物を、 抗原コートしたゥエルに 100 l/wellの量加 えた。 4X:でー晚インキュベートした後、 プレートを洗浄し、 PBS- Tで 1 /2000 に希釈した西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ結合ャギ抗マウス IgG ( H + L ) ( Southern Biotechnology Associates, Inc. , Birmingham, AL) と共にイン キュペートした。 37でで 2時間のインキュベーションの後、 プレートを洗浄し、 テトラメチル -ベンジジン基質 （TMB+; DaKoCytomation A/ S, Copenhagen, Denmark) を用いて 15分間喑所室温で可視化した。 反応は、 1 M HC1, 0.5 M H2S04を用いて停止させた。 終点の力価は、 最高希釈の log2 の逆数として算出 した。 これは、 ネガティブコントロールの 450nm における吸光度 （OD450) よ り上でかつ、 吸光度 0. 100以上の OD450をもたらす。
. 口
2. 1. HIV- 1遺伝子のマイコバクテリアコ ドン最適化とその発現べクタ一の構築 合成した改変型 ρ24遺伝子を、 図 1に示したように設計した。 合成 ρ24遺伝 子のコード領域における全 G + C 含有量は 67.4%であり、 pNL4-3 由来の野性 型 p24遺伝子の 43.4%よりも高い。 これらの二つの遺伝子は最初に pUC-hspK ベクタ一にクローニングし （図 2A) 、 次いで P S0264にサブクローニングした (図 2B) 。 hsp60 プロモーターを有する各発現べクタ一は、 BCG Tokyo ワク チン株に導入し、 マイコバクテリア最適コ ドン使用頻度を有する p24 遺伝子を 含む rBCG-p24Mu と、 野性型コ ドン使用頻度を有する p24 遺伝子を含む rBCG-p24Wtをそれぞれ選択した。
2.2. コ ドン最適化 HIV遺伝子の挿入による in vitro における HIV遺伝子発 現の有意な増大
2種類の BCG-HIV組換え体の HIV- 1 gag p24遺伝子発現レベルを比較する ため、 培養 rBCG の増殖曲線の動性を調べ、 さらに p24 抗原タンパク質の検出 によって HIV 抗原の産生能を調べた （図 3) 。 2 週間の培養時点において、 rBCG-P24Muおよび- p24Wtのそれぞれの溶解物における組換え p24 夕ンパク 質はウエスタンブロッ ト分析により同じく約 24kDa の単一バンドとして検出さ れた。 rBCG-p24Mu の p24 抗原の発現レベル （菌体 108 cfu 当たり 175.0土 25. 1 ng) は rBCG-p24Wtのそれ （菌体 l〇s cfu 当たり 4.7 ± 0.3 ng) よりも 37.0 倍増加した （図 3B) 。 rBCG-p24Mu および rBCG-p24Wt の増殖曲線は' 対照の rBCG-pS0246 形質転換体と比較して正常であり、 細胞培養の 21 日目 にピークに達した （図 3C ) 。 このことは、 p24 抗原の生産は培養 rBCG- p24Mu の増殖率に相関することを示唆している。 このように、 コドンを最適化 した HIV gag p24遺伝子を挿入した BCG形質転換体は、 菌体 108 cfu当たり ほぼ 200 ngの p24抗原、 またはコドン最適化 rBCG-HIVの 1 mg当たり 200 ngの p24抗原を産生することが可能である。
2.3. モルモットにおける DTH反応
免疫応答に対する改変型 p24 の発現の効果を評価するため、 まずモルモッ ト における DTH 皮膚反応を調べた。 以前の報告 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10693- 10697, 1995) では、 V3 ェピトープ.に特異的な DTH反応を検出す るためには、 5mgを接種することが必要であった。 一方、 改変型 p24 を産生す る rBCG- p24Mu を用いた場合には、 表 2に示したように、 O. lmg 量の接種に よって、 5mgの rBCG-V3J l接種の場合と同様の p24 に対する著しい DTH反 応を検出することができた。 なお、 rBCG-p24Mu および rBCG-p24Wt でそれ ぞれ免疫化されたモルモットの間には、 何ら異なる反応性は観察されなかった。 表 2
rBCG-p24免疫化モルモッ 卜における HIV- 1 Gag抗原特異的 DTH誘導の感度 対 PPD 対 Gag抗原
免疫化 対 PBS l g 10 /x g rBCG-p24WT
0. 1 mg/ s.c. 0 15.0 0 10.0 rBCG-p24Mu
0. 1 mg/ s.c. 0 14.5 0 10.0
5mg/ s.c. 0 14.5 0 10.0 rBCG-pS0246
0. 1— mg/ s.c.― 0 15.0 0 0
2.4. ウィルス特異的な免疫反応のコドン最適化 rBCGの低投与量による誘導 コドン最適化遺伝子を伴う BCG形質転換体の低投与量免疫化の可能性を検討 した。 30匹の BALB/ cマウスを各群 10匹づっ 3群に分け、 各群の 5匹づつに 0.01および 0. 1 mgの rBCG-p24Mu、 rBCG-p24Wtおよび rBCG- pS0246を それぞれ皮下 （i.d.) 投与した。 5 匹以上のマウスには生理食塩水のみを投与し. 正常な健康コントロールとした。 投与後 10週の時点で、 免疫化動物のリンパ球 増殖と、 IFN-ァ ELISPOT 分泌細胞数を調べた。 これを 3 回繰り返し、 それら の結果を集計した。
リンパ球増殖反応において、 rBCG-p24Mu 免疫化マウスでは、 プールされた ペプチド #2 (p l6-20) およびプールされたトータル p24 ペプチド #レ5 (p l l- 35) によって有意な活性 （刺激指数は 5.04および 4.02) が得られた。 0. 1 mg の rBCG-p24Mu免疫化では、 プール #2およびプール # 1-5に対するリンパ球増 殖反応はそれぞれ 10.08 および 8.05 に増加した。 一方、 0.01 mgおよび 0. 1 mg の rBCG-p24Wt 免疫化マウスではウィルス特異的な有意増加は何ら検出さ れなかった （図 4A) 。 このような rBCG-p24Mu と rBCG-p24Wt 間における in vivo での増殖反応の違いは、 プール #2 およびプール # 1-5 について統計的に 有意であった （それぞれ p=0.0102および ρ=0·0014) 。 また、 rBCG- pS〇246 免疫化マウスでは如何なる増殖活性も検出されなかった。
さらに、 ELISPOT アツセィによって p24 特異的 IFN-ァ分泌細胞を測定した。 0. 1 mgの rBCG-p24Muおよび rBCG-p24Wt免疫化マウスにおいて、 プール された p24ペプチド （プール # 1-5) および組換え p24特異的 SCFsが検出され たが、 同量の rBCG-pS0246 免疫化マウスでは検出されなかった （図 4B) 。 rBCG-p24Mu 免疫化マウスでのこれらの反応は、 ペプチド刺激では 375 ± 202 SFC/ 106脾臓細胞であり、 組換え p24 刺激では 483土 138 SFC/ 106脾臓細胞 であ り、 rBCG-p24Wt での反応 （それぞれ 9 3 ± 25 および 227土 120 SFC/ 106 脾臓細胞） と比較してはるかに大であった。 このような rBCG- p24Mu と rBCG-p24Wt間の違いはまた、 ペプチドおよび組換え p24 について 統計的に有意であった （それぞれ p=0.033および p=0.031 ) 。 なお、 PPD特異 的な SFCs は試験した全てのマウスにおいて髙度に検出された （670 ± 180 SFC/ 106脾臓細胞） 。
0. 1 mgの rBCG-p24Mu、 rBCG-p24Wtおよび rBCG- pS0246で免疫化し た全てのマウスから得た血清について、 組換え p24および PPDに対する終点抗 体 ELISAを用いて、 投与後 10週時点での p24抗原特異的抗体の産生を調べた (図 4C) 。 rBCG-p24Mu および rBCG- p24Wt で免疫化された動物では、 rp24に対する抗体産生は一般的に低く、 rBCG-p24Muおよび rBCG-p24Wtで 免疫化されたマウス血清における抗 p24 抗体力価はそれぞれ 28および 26.75で あった。 さらに、 PPD 特異的抗体は、 免疫化動物で似たように検出され、 力価 は約 2 10であった。 以上のとおり、 ウィルス特異的な細胞性免疫が初期の免疫反 応において有意に誘導されたが、 その抗体反応は低かった。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 抗原性タンパク質の発 現量に優れ、 その結果として通常の BCG ワクチンと同程度の使用量によっても. 標的とする感染症や癌等に対して十分な免疫応答を誘導することのできる組換え BCGワクチンが提供される。

Claims

請求の範囲
1. 外来性の抗原性タンパク質をコ一ドするポリヌクレオチドを保有する発現べ クタ一によつて形質転換された組換え BCG ワクチンであって、 前記ボリヌクレ ォチドの各コ ドンの第 3番目塩基がアミノ酸の種類を変化させることなく G ま たは Cに置換された改変型ポリヌクレオチドである組換え BCG ワクチン。
2. 改変型ボリヌクレオチドの各コ ドンの全塩基が、 アミノ酸の種類を変化させ ることなく Gまたは Cを多く含むように置換されている請求項 1の組換え BCG ワクチン。
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