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WO2003011315A1 - Composition pour inhiber l'activite tyrosine kinase des proteines src - Google Patents

Composition pour inhiber l'activite tyrosine kinase des proteines src Download PDF

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Publication number
WO2003011315A1
WO2003011315A1 PCT/FR2002/002735 FR0202735W WO03011315A1 WO 2003011315 A1 WO2003011315 A1 WO 2003011315A1 FR 0202735 W FR0202735 W FR 0202735W WO 03011315 A1 WO03011315 A1 WO 03011315A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
apr04
src
proline
pharmaceutical composition
Prior art date
Application number
PCT/FR2002/002735
Other languages
English (en)
Inventor
Zohra Rahmani
Original Assignee
Institut Necker
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Necker filed Critical Institut Necker
Publication of WO2003011315A1 publication Critical patent/WO2003011315A1/fr

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Definitions

  • the present invention relates to the field of biology. It relates more particularly to the negative regulation of the tyrosine kinase enzymatic activity of the proteins Src and the like, and the applications of this negative regulation to the sub-regulation of the proliferation, differentiation and / or transformation of cells in vivo or ex vivo, in particular for an improved treatment of cancers, osteoporosis and derived bone diseases, as well as cerebral and myocardial ischemia, among others.
  • the protein tyrosine kinase Src plays an important role in multiple signaling pathways regulating several different cellular functions, including cell proliferation, differentiation and transformation.
  • the catalytic activity of the protein Src is. tightly regulated in vivo and can be modulated by the interactions of its SH2 and SH3 domains with high affinity ligands.
  • the Src family protein tyrosine kinases were originally discovered in tumors in the viral form of an oncogenic retrovirus, the Rous sarcoma virus. This form, called v-Src, is constitutively active and represents a mutated form of a cellular protein, c-Src, expressed ubiquitously and very conserved during evolution.
  • the search for homologous protein kinases made it possible to isolate 10 members of the Src family: Src, Fyn, Yes, Yrk, Blk, Fgr, Yck, Lck, Lyn and Frk.
  • proteins have a very similar molecular structure with several structural domains important for their functions: an SH2 domain which interacts with protein sequences containing a phosphorylated tyrosine, an SH3 domain which interacts with proline-rich protein sequences, a catalytic tyrosine kinase domain, a C-terminal domain containing a phosphorylated tyrosine which negatively regulates tyrosine activity kinase (1).
  • a proline-rich sequence is defined by the presence of one or more motifs-PX- ⁇ -P type motifs for which the two ⁇ -P residues ( ⁇ representing a hydrophobic amino acid) will form a hydrophobic zone called a helix. polyproline II able to bind to the hydrophobic region of the SH3 domain (2,3).
  • the Src protein the Src protein proper
  • the Src proteins the proteins of the above-mentioned Src family or any one of them.
  • the Src protein has been implicated in a large number of different signal transduction pathways leading to cell proliferation or cell differentiation depending on the type of cell involved (1).
  • the constitutively active oncogenic form v-Src induces the differentiation of PC12 cells into neuron-like cells (4), while the v-Src protein blocks the differentiation of chondroblasts into chondrocytes (5), which suggests that the Src protein plays an important role in the differentiation of neuronal cells and chondrocytes.
  • high tyrosine kinase activity of the Src protein has been associated with cell transformation (6).
  • the Src protein also plays an important role in cell cycle regulation, cell adhesion and migration, cell survival and angiogenesis (1,7), suggesting that the Src protein plays a critical role in normal cell functioning and that its activity needs to be tightly regulated.
  • the Src protein is composed of two peptide modules, called SH2 and SH3 domains (for Src homology 2 and 3), a catalytic domain, and a regulatory C-terminal region containing a tyrosine residue (Y529) negatively regulating the activity of the protein Src.
  • the enzymatic activity of the protein Src is regulated by intramolecular associations on the one hand between the SH2 domain and the phosphorylated C-terminal tyrosine and on the other hand between the SH3 domain and a small region which binds the SH2 domain to the domain kinase to give an inactive "closed" enzyme conformation (8).
  • the catalytic activity of the Src protein can be modulated by three factors, which are: phosphorylation / dephosphorylation of C-terminal tyrosine; competition for the SH2 domain by a ligand containing a phosphotyrosine of high affinity; and competition for the SH3 domain by a proline-rich ligand with high affinity (8).
  • APRO for "antiproliferatives" constitute a family of genes comprising, according to current knowledge, at least eight members in vertebrates: APROl (BTG2 / TIS21 / PC3), APR02 (BTG1), APR03 (PC3B), APR04 (BTG3 / ANA), APR05 (Tob2), APR06 (Tob), B9.10, and B9.15 (9-17).
  • APR04 gene has hitherto been called ANA (for Abundant in the Neuroepithelium Area).
  • BTG-2 (ATTC filing number: 97025) and BTG-3 (ATCC filing number: 97010) from the APRO family of proteins.
  • the BTG-2 sequence corresponds to the Tob protein (APR06) and the BTG-3 sequence corresponds to the Tob2 protein (APR05).
  • Tob (APR06) codes for a protein of 345 amino acids including a leader sequence of approximately 25 amino acids
  • Tob2 (APR05) codes for a protein of 344 amino acids including a leader sequence of approximately 18 acids amines.
  • the isolated nucleic acid molecules envisaged in this document must have an identity of at least 95% with these sequences.
  • the peptide sequence of the Tob protein has a sequence identity in the N-terminal region (amino acids 1 to 115) of only 31% relative to the protein APR04 and that for the protein Tob2 l the sequence identity in the N-terminal region is only 16%.
  • Tob and Tob2 have a proline and glutamine-rich sequence, which does not does not correspond to a proline-rich sequence in the sense that it is understood here.
  • the proline and glutamine-rich sequences cannot interact with SH3 domains of the Src proteins.
  • the protein APR04 the structure of which is described in the literature
  • APR04 code for a protein of 252 amino acids.
  • the amino-terminal part of the APR04 protein is homologous to the APRO proteins previously characterized, while its C-terminal part contains a proline-rich region (13,14).
  • the APR04 protein although ubiquitously expressed, is very strongly expressed in neuroepithelial cells in the ventricular zone of the developing central nervous system, as well as in embryonic cartilage, suggesting that the APR04 protein play a role in neurogenesis and in the proliferation and / or differentiation of chondrocytes (14).
  • An objective of the present invention is therefore to provide new means of prevention and / or treatment of cell proliferation, differentiation and / or transformation, in particular with a view to better prevention and / or improved treatment of cancers, in particularly colon, pancreatic and breast cancers, osteoporosis and related bone diseases and cerebral and myocardial ischemia.
  • a biological material having a proline-rich C-terminal region or part in particular a biological material comprising a specific APRO type protein, provides functionalities allowing its use in the prevention and / or the treatment of the states having for cause or for factors of development a proliferation, a differentiation and / or a cellular transformation due to an increase in the tyrosine kinase activity of the protein Src.
  • the present invention also provides means of prevention and / or treatment based on such biological material, in particular on such an appropriate protein or protein fraction, defined below.
  • Fig. 1 shows the in vitro and in vivo interaction of Flag-APR04 with Src wt .
  • Fig. 2 represents the results of tests for identification of the binding sites for APR04 and Src.
  • Fig. 3 represents the suppression of the tyrosine kinase activity of Src and of the Ras / MAP kinase signaling in NIH 3T3 cells by overexpression of APR04.
  • Fig. 4 shows the inhibition of the differentiation of PC12 cells mediated by NGF by overexpression of APR04.
  • Fig. 5 shows the activation of Ras / MAP kinase signaling and the differentiation of PC12 cells by subregulation of endogenous APR04 protein.
  • FIG. 1 breaks down as follows: a. Binding of Flag-APR04, Flag-APR04 ⁇ C, and Flag-APR04 ⁇ N proteins translated in vitro in the presence of methionine [] to GST- constructs SH3-SH2, GST-SH3 and GST-SH2. Amount used: 100% of the respective proteins used in the binding reactions; GST: GST (Glutathione S-transferase) beads. b. Co-immunoprecipitation of Src wt with Flag-APR04 in NIH 3T3 cells co-expressing Src wt and Flag-APR04. The immunoprecipitates (IP) were analyzed by immunoblotting (IB) with the anti-Src or anti-Flag antibodies. The data shown are representative of three independent experiments.
  • Fig. 2 breaks down as follows: a, b. X-APR04 ⁇ N interacted with the Src protein wt (a), while Flag-APR04 ⁇ C did not interact (b). CD. Flag-APR04 interacted in vivo with the mutant ⁇ I296T of the protein Src (c), the inactivated kinase form of the protein Src (K297M) (d), the constitutively active form of the protein Src (Y529F) (d) and the form dominant negative of the protein Src (K297M Y529F) (d).
  • the data are representative of three independent experiments.
  • - Fig. 4 breaks down as follows: at. Co-immunoprecipitation of the endogenous APR04 protein with the endogenous Src protein in PC12 cells. Normal mouse antiserum does not give immunoprecipitate with the protein APR04. b. Co-localization of Src and APR04 in PC12 cells by confocal microscopy. The co-localization areas are the union of the respective localization areas of the Src protein and the APR04 protein.
  • CD Inhibition of the differentiation of PC12 cells mediated by NGF (c) and of the kinase activity of the protein Src (d) by overexpression of the protein APR04. The activity of the endogenous Src protein was tested as described above.
  • the data are representative of three independent experiments, e. Inhibition of Ras / MAP kinase signaling by overexpression of the APR04 protein.
  • PC12 cells were co-transfected with 1 ⁇ g of 5x-Gal4-TATA / luciferase, 200 ng of Gal4-Elk-1 (Elk / gal), 1 ⁇ g of CMV- ⁇ Gal and the expression plasmids indicated, and have either left without stimulation or stimulated with NGF (100 ng / ml) for 6 hours.
  • the data are representative of three independent experiments. - Fig.
  • 5 breaks down as follows: a. Sub-regulation of the endogenous APR04 protein by antisense vector, pAS-APR04. PC12 cells were transiently transfected with pAS-APR04 and 200 ⁇ g of whole cell lysates were analyzed by immunoblotting with the antibodies indicated. b. Stimulation of the kinase activity of the protein Src in PC12 cells transiently transfected with pAS-APR04. The data are representative of three independent experiments. vs. Activation of the transcription of the Elk-1 protein by inhibition of expression of the endogenous APR04 protein.
  • PC12 cells were transiently co-transfected with 1 ⁇ g of 5x-Gal4-TATA / luciferase, 200 ng of Gal4-Elk-1 (Elk / gal), 1 ⁇ g of CMV- ⁇ Gal, and pAS-APR04 or a blank vector witness.
  • the transcriptional activation of the Elk-1 protein reflected by the luciferase activity and normalized with respect to the ⁇ Gal activity is indicated as an increase factor.
  • the data are representative of four independent experiments.
  • d Induction of PC12 cell differentiation by inhibition of expression of the endogenous APR04 protein.
  • the cells were cotransfected with pAS-APR04 and a reporter plasmid CMV- ⁇ Gal and stained for expression of the lacZ gene after 6 days. Developments which corresponded to a size greater than two diameters of the cell body were counted as neurites. The data are representative of four independent experiments.
  • composition useful for inducing a conformational modification of Src proteins comprising at least one biological material comprising a C-terminal region or part rich in proline.
  • biological material comprising a C-terminal region or part rich in proline.
  • the APR04 protein is considered below.
  • An object of the present invention is thus to provide a pharmaceutical composition which is useful, in particular in the applications mentioned above.
  • Another object of the present invention is to provide a composition useful for inducing a conformational modification of the Src proteins.
  • Yet another object of the invention is to provide a pharmaceutical composition capable of exerting a sub-regulation of the tyrosine kinase activity of the proteins Src and the like.
  • the SH3 / SH2 domains of the protein c-Src were expressed in bacteria in the form of fusion proteins with the GST protein (Genbank No U13852) (Glutathione-S-transferase), purified to homogeneity on glutathione-agarose beads, and tested for their ability to fix the Flag-APR04 protein translated in vitro in a rabbit reticulocyte protein expression system (TNT® coupled reticulocyte lysate Systems, from Promega) of methionine [ ⁇ S] (see Fig. la).
  • the association of the protein APR04 required both the SH2 domains and the SH3 domains, which suggested that the binding site was probably conformational and involved the entire protein structure.
  • a mutated form of the protein APR04 lacking the proline-rich carboxy-terminal domain did not bind to the SH3-SH2 domains, while the mutated form of 1 ⁇ PR04 lacking the N-terminal domain (X-APR04 ⁇ N) but less strongly bound to the SH3-SH2 domains of the Src protein.
  • NIH 3T3 ⁇ p ⁇ Q ⁇ a stable NIH 3T3 cell line was established, overexpressing the APR04 protein (NIH 3T3 ⁇ p ⁇ Q ⁇ ) and immunoprecipitates of Src were tested. endogenous from protein lysates of NIH 3T3 and NIH cells for the kinase activity of the protein Src in vitro in the presence of and enolase. The APR04 protein very strongly reduced the catalytic activity of the Src protein. An immunoblot test with the antibody against the Src protein confirmed for control that equivalent amounts of Src proteins were present in the two immunoprecipitation reactions (see FIG. 3a).
  • the protein Src is required for mitogenesis induced by the growth factor EGF (Epidermal Growth Factor) and leads to the activation of the Ras / Raf / MEK / ERK cascade (21).
  • EGF Epimal Growth Factor
  • the activation of the ERKs proteins was tested indirectly, by measuring the transactivation of the reporter gene for luciferase 5x-Gal4-TATA. / luciferase by a Gal4-Elkl (Elk / gal) construct containing the transactivation domain of the Elk-1 protein.
  • Elk-1 a member of the Ets family of transcription factors, is an important physiological substrate for ERKs proteins. Transcriptional activation of the Src-dependent Elk-1 protein was inhibited by the APR04 protein in a dose-dependent manner (see Fig. 3b). As the hypothesis formed suggested, the APR04 ⁇ C protein did not inhibit the transcriptional activation of the Elk-1 protein, while the APR04 ⁇ N protein inhibited it, which confirmed that the inhibition was due to the proline-rich domain of the APR04 protein.
  • Cyclin Dl plays a well-established role in regulating progression in the Gl phase of the cell cycle and in promoting cell proliferation. Its level of expression has been shown to be modulated by the Ras / Raf / MEK / ERK signaling pathway (22).
  • Ras / Raf / MEK / ERK signaling pathway 212.
  • transient expression studies were carried out using the human cyclin Dl promoter linked to the reporter gene for luciferase.
  • the APR04 protein significantly downregulated the activity of the cyclin D1 promoter in a dose-dependent manner (see Fig. 3c).
  • Immunoprecipitates of endogenous Src and normal mouse antiserum derived from protein lysates of PC12 cells were analyzed by immunoblotting with a specific antibody affinity purified, generated against a GST-APR04 fusion protein containing the C-terminal domain of the human APR04 protein. Both Src and APR04 proteins were present in Src immunoprecipitates, while mouse antiserum did not immunoprecipitate APR04 protein (see Fig. 4a).
  • a confocal microscopy study revealed extensive cytoplasmic colocalization between the proteins Src and APR04 in PC12 cells (see Fig. 4b).
  • PC12 cells are a model system for studying the differentiation of neuronal cells.
  • the PC12 cell line responds to the Nerve Growth Factor (NGF) by extending neurites and developing many other properties similar to those of sympathetic neurons (23).
  • NGF Nerve Growth Factor
  • PC12 J ⁇ - ⁇ Q ⁇ a stable line of PC12 cells overexpressing the APR04 protein
  • PC12 J ⁇ - ⁇ Q ⁇ was established.
  • PC12 PRQ4 cells did not differentiate (see Fig. 4c), which suggests that overexpression of the APR04 protein could affect the signal cascade mediated by the NGF.
  • the expression of the constitutively active oncogenic form, i.e. v-Src is known to induce the growth of neurites in PC12 cells (4), the sub-regulation of the activity of the Src protein could have an effect on the differentiation of PC12 cells.
  • Src, endogenous Src immunoprecipitates from protein lysates from PC12 and PC12APRQ4 cells were tested for the catalytic activity of the Src protein in vitro, in the presence of enolase.
  • the APR04 protein reduced the catalytic activity of the Src protein (see Fig. 4d).
  • An immunoblot test with the antibody against the Src protein confirmed for control that equivalent quantities of Src proteins were present in the two reactions (see FIG. 4d).
  • the endogenous expression of the APR04 protein was inhibited by expression of an antisense vector (pAS-APR04).
  • the PC12 cells were transiently transfected with the plasmid ⁇ AS-APR04 and the cell lysates were analyzed by imrnunoblotting with an antibody directed against the affinity purified protein APR04.
  • This vector significantly reduced the level of expression of the APR04 protein without affecting the expression of the Src protein (see FIG. 5a).
  • PC12 cells were transiently transfected with pAS-APR04 and tested for their tyrosine kinase activity.
  • the catalytic activity of the Src protein was increased in the PC 12 cells transfected with pAS-APR04 compared to the PC12 control cells (see FIG. 5b).
  • PC12 cells were co-transfected with pAS-APR04, a Gal4-Elk-1 transactivation construct, and the reporter gene of luciferase 5x-Gal4-TATA / luciferase and tested for their transcriptional activity of the protein Elk-1.
  • the transcriptional activity of the Elk-1 protein was substantially increased in the PC12 cells transfected with the plasmid pAS-APR04 compared to the PC12 control cells (see FIG. 5c), which confirmed that the APR04 protein regulated the Ras signaling pathway.
  • MAP kinase by sub-regulating the tyrosine kinase activity of the protein Src.
  • the plasmid pAS-APR04 was co-transfected with a CMV- ⁇ Gal reporter plasmid in PC12 cells.
  • the plasmid CMV- ⁇ Gal makes it possible to detect the transfected cells which express the lacZ gene by a staining reaction in the presence of X-Gal.
  • 70% of PC12 cells co-transfected with CMV- ⁇ Gal and ⁇ AS-APR04 developed neurites after 6 days (see Fig. 5d), while none of the PC12 cells co-transfected with CMV- ⁇ Gal and the non-recombinant control vector did not develop neurites (data not shown).
  • Caveolin a 22 kDa integral membrane protein, which is a major component of the structural regulation of caveolae membranes, has been shown to bind to and suppress the tyrosine kinase activity of the protein Src (25). Caveolin also interacts with the H-Ras and G ⁇ subunits and suppresses the GTPase activity of G ⁇ (25). More recently, it has been shown that RACK1 (receptor for activated protein kinase C) and a homolog of the ⁇ subunit of G proteins binds to the SH2 domain of Src and inhibits its catalytic activity (26).
  • the expression of the APR04 protein has also been shown to be dependent on the cell cycle (13,14), suggesting that the APR04 protein may also be involved in the negative control of the cell cycle by modulation of the catalytic activity of the protein Src. Based on the physiological data provided here, it is believed that, in the cell, the APR04 protein is linked to the Src protein and protects it against non-specific activation, maintaining it in a conformation where the SH2 and SH3 domains are inaccessible. . The APR04 protein could thus act as a conformational regulator of the activity of the Src protein.
  • the results presented here show that the APR04 protein implements in vivo or ex vivo an essential negative regulatory mechanism for the signaling pathways involving the Src protein. Since the Src protein is involved in many biological responses such as transformation, mitogenesis and differentiation, the APR04 protein can exert a marked effect on these physiological processes.
  • the first object of the invention is thus a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one biological material comprising a C-terminal region or part rich in proline, in particular a protein and / or a protein fraction having a C-terminal region rich in proline, preferably an APR04 protein, optionally in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • said protein or protein fraction having a proline-rich C-terminal region is advantageously present in a therapeutically effective amount for the down regulation of the tyrosine kinase activity of the Src proteins.
  • Such a protein or protein fraction having a C-terminal domain rich in proline can be of natural origin, and come for example from plant extracts, yeasts, tissues or secretions of animal origin, cell cultures or else microbial fermentation media. It can also be treated according to techniques known to a person skilled in the art to be made more suitable for its therapeutic use, or synthesized from host cells, of animal origin or from insects, bacteria, transformed yeasts, who produce so stable by genetic engineering the APR04 protein or an analogue of the recombinant APR04 protein.
  • analogue is understood here to mean any protein or protein fraction whose amino acid sequence contains a proline-rich C-terminal sequence conserved from a phylogenetic point of view and having the characteristics described above with reference to the data in the literature (2,3 ). Those skilled in the art can verify this analogy by conventional searches in databases using appropriate bioinformatics programs.
  • the invention relates to the use of a biological material as described above, in particular the APR04 protein and / or an analog of the recombinant APR04 protein, for the preparation of a pharmaceutical composition useful for providing in warm-blooded animals, including humans, under-regulation of the activity of the enzyme tyrosine kinase Src.
  • this use is aimed at the treatment and / or prevention of the conditions chosen from cancers, osteoporosis, bone diseases derived from osteoporosis, and cerebral and myocardial ischaemias.
  • the protein Src is indeed involved in the development and progression of certain types of human cancers, in particular but not exclusively cancers of the colon, pancreas and breast (28). The decrease in the tyrosine kinase activity of the protein Src thus constitutes a therapeutic target for these types of cancers, among others. Although expressed ubiquitously, the Src protein is also very strongly expressed in osteoclasts. Osteoclasts are giant multinucleated cells involved in normal and pathological bone resorption (29).
  • Osteoporosis results from an imbalance between bone formation and resorption. This imbalance can come either from a decrease in bone formation due to age, or from a decoupling of the resorption / bone formation balance (32).
  • One way to control the disease, as well as related bone diseases, is to control the activity of osteoclasts by inhibiting the tyrosine kinase activity of the protein Src.
  • VEGF Vascular endothelial growth factor
  • the protein Src has been shown to regulate VEGF-mediated vascular permeability in the brain of mice after a stroke.
  • the suppression of the tyrosine kinase activity of the Src protein observed in mice invalidated for the Src protein is at the origin of a reduction in vascular permeability and consequently of a reduction in brain damage ( 34).
  • the subject of the invention can take different embodiments.
  • its subject is a vector construct for inhibiting the tyrosine kinase activity of the protein Src, said vector construct comprising a viral material, not having a pathogenic character or inactivated, that is to say in practice modified and / or attenuated, of a type preferably chosen from recombinant retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV) and lentiviruses, and containing either all of the sequence coding for the APR04 protein, ie the C-terminal part coding for the domain rich in proline residues of the APR04 protein or its analogs.
  • a viral material not having a pathogenic character or inactivated, that is to say in practice modified and / or attenuated, of a type preferably chosen from recombinant retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses (AAV) and lentiviruses, and containing either all of the sequence coding for the APR04
  • the subject of the invention is a plasmid construct or construction product for the treatment of a tissue, said construct containing either the entire sequence coding for the APR04 protein or its analogs, or part C -terminal coding for the domain rich in proline residues of the protein APR04 or its analogues, advantageously under the control of a specific promoter of the tissue to be treated.
  • hALA alpha-lactalbumin
  • oBLG beta-lactoglobulin
  • pCEA pancreatitis-associated protein I
  • most solid tumors exhibit tissue hypoxia due to aberrant vascularization of the tumor tissue (40).
  • a promoter combining not only regulatory sequences dependent on estrogen, but also regulatory sequences of hypoxia will allow to selectively induce (by estrogenic and hypoxic agents) the expression of the APR04 gene or of its analogues in breast cancer cells.
  • the present invention consists in the use of molecules, advantageously peptide molecules, which mimic the APR04-Src interaction and which can be chosen from molecules chemically synthesized from the C-terminal protein sequence rich in proline defined above, or can be produced by recombination using a protein expression vector containing the sequence coding for the C-terminal domain of the APR04 protein or its analogs, and expressed in different expression systems, such as for example bacteria, yeasts or insects.
  • these peptides can, optionally, contain modified type D amino acids, such as ⁇ -alanine, diiodotyrosine, ornithine, hydroxyproline and ⁇ -naphthylalanine , which unlike natural amino acids type L are not recognized by proteolytic enzymes.
  • modified type D amino acids such as ⁇ -alanine, diiodotyrosine, ornithine, hydroxyproline and ⁇ -naphthylalanine , which unlike natural amino acids type L are not recognized by proteolytic enzymes.
  • These peptides can optionally also be chosen, in part or in whole, by screening combinatorial libraries of peptides or molecules by the so-called phage display technique (41).
  • screenings of agonist molecules are carried out by the technique known as USPS (Ubiquitin-based split-protein sensor), described by Johnsson et al. (42).
  • ubiquitin which is a protein of 76 amino acids containing a single protein domain
  • USB for Ubiquitin specifies protease
  • a C-terminal fragment of ubiquitin (Cub) is expressed in fusion with a reporter gene, dihydrofolate reductase (DHFR), and linked to the C-terminal domain of the protein APR04 (Cub-APR04c-term).
  • An expression library encoding randomly translated sequences is fused to the N-terminal fragment of ubiquitin (Nub) and screened using Cub-APR04c-term for eukaryotic cells which express the active DHFR reporter gene. This technique can be applied both in specific cell types and in yeast.
  • the mode of administration of the pharmaceutical composition according to the invention, and the amounts of said composition to be administered for the prevention and / or treatment of conditions for which the downregulation of the tyrosine kinase activity of the protein Src constitutes a appropriate answer, can be chosen by the skilled person in each case.
  • synthetic systems can be used which encapsulate or complex with plasmid DNA and protect it from degradation.
  • These systems are based on the use of cationic lipids or cationic polymers, such as for example PLL (poly-L-lysine) and / or PEI (polyethyleneimine), which have a hydrophilic group which interacts with DNA and a lipophilic group which allows the polymer to self-assemble into vesicles or similar structures (43).
  • PLL poly-L-lysine
  • PEI polyethyleneimine
  • NIH 3T3 cells (ATCC No CRL-1658) were cultured in Eagle medium modified by Dulbecco (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • PC12 cells (ATCC No CRL-1721) were cultured in DMEM supplemented with 10% horse serum and 5% fetal bovine serum.
  • NIH 3T3 cells and PC12 cells stably transfected with the Flag-APR04 construct (NIH 3T3A R Q 4 and PC12 A RQ 4 respectively) were maintained in the presence of G418 (400 ⁇ g / ml).
  • the human cDNA of the APR04 gene (Swissprot No Q14201) was isolated by PCR from a human brain cDNA library using a 5 'primer containing an EcoRI restriction site: 5'-ggaattcATGAAGAATGAAATTGCTGCC-3 'and a 3' primer containing a SalI restriction site:
  • the cDNA was then subcloned into the Eco ⁇ I-XhoI sites of the vector PSS-188 carrying a CMV promoter and an N-terminal flag epitope marker (small sequence of 8 amino acids which allows the detection of a given protein in vivo using an anti-Flag® antibody, see US Pat. Nos. 4,703,004 and 4,782,137) to produce the Flag-APR04 construct.
  • X-APR04 ⁇ N comprises the C-terminal domain (amino acids 145 to 252) of the protein APR04 and has been subcloned into the Eco ⁇ l-B m ⁇ I sites of the vector pcDNA3.1 / His TM (Invitrogen) containing an epitope marker Xpress (small sequence of 8 amino acids which allows the detection of a given protein in vivo using an anti-Xpress TM antibody, Invitrogen).
  • Flag-APR04 ⁇ C (amino acids 1 to 134) was isolated by excision of a DNA fragment from the A ⁇ al restriction site of the Flag-APR04 construct. ⁇ I296T, K297M, Y529F (supplied by T.
  • pAS-APR04 includes nucleotides 1-756 of the APR04 cDNA cloned into the vector pcDNA3 in an antisense orientation.
  • the GST-SH3-SH2 construct was isolated by PCR using a 5 'primer containing a B ⁇ mHI restriction site (GEXSH5):
  • GST-SH3 was constructed using a 5 'primer (GEX-SH5) and a 3' primer containing an EcoRI restriction site: 5'-ggaattcGGATGGAGTCGGAGG-3 '.
  • the GST-SH2 construct was obtained using a 5 'primer containing a BamHh 5'-cgggatccCCGACTCCATCCAGG-3' restriction site and a 3 'primer (GEX-SH3).
  • Plasmids Flag-APR04, Flag-APR04 ⁇ C and X-APR04 ⁇ N were transcribed and translated in vitro with a rabbit reticulocyte protein expression system (TNT® coupled reticulocyte lysate Systems from the company Promega) of coupled rabbit reticulocyte lysate at TNT in the presence of metMonine [- "S] in accordance with the manufacturer's instructions (Promega).
  • TNT® coupled reticulocyte lysate Systems from the company Promega
  • fusion protein-GST immobilized on glutathione-sepharose® beads were incubated with product translated in vitro in buffer B (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM PMSF) for 3 hours at 4 ° C.
  • buffer B 50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 1 mM PMSF
  • 10 'NIH 3T3 cells were transiently co-transfected using Lipofectamine TM (Life Technologies) with 8 ⁇ g of Flag-APR04 and 8 ⁇ g of the appropriate Src constructs.
  • the transfection medium was changed after 6 h and the cells were collected 48 h after transfection.
  • 5x-Gal4-TATA / luciferase and a plasmid encoding the Gal4-Elk-1 (Elk-Gal) transactivation domain (Stratagene) were used in combination with other plasmids as shown in the figures.
  • the CMV- ⁇ Gal construct was transfected as an internal control of gene expression after transfection.
  • the cells were transfected as described in culture dishes 60 mm in diameter. 48 h after transfection, the cells were deprived in serum for 20 h and either left untreated or treated with NGF (100 ng / ml) for the time indicated before being collected. Luciferase activity was detected with a luminometer using the Luciferase Assay System (Promega, see US Pat. Nos. 5,283,179, 5,641,641 and 5,650,289) and the expression of ⁇ -Gal was evaluated by absorbance at A420 The results were normalized with respect to ⁇ -Gal activity. The luciferase tests were performed in triplicate and repeated at least three times in independent transfection experiments.
  • NIH 3T3 cells were incubated in Lysis buffer L (10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM Na 3 V0 4 , 10 ⁇ g / ml of aprotinin, 10 ⁇ g / ml of leupeptin, 1 mM PMSF) for 30 min at 4 ° C.
  • Lysis buffer L 10 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM Na 3 V0 4 , 10 ⁇ g / ml of aprotinin, 10 ⁇ g / ml of leupeptin, 1 mM PMSF
  • the lysates were clarified by centrifugation at 15,000 xg for 15 min and pre-incubated by in
  • the supernatants were then incubated overnight with the appropriate antibody and the G-Sepharose® protein beads, washed three times with L buffer and then separated on an SDS-PAGE gel, followed by immunoblotting on a polyvinylidine difluoride (PVDF TM) membrane (Biorad), and treated as recommended by the manufacturer.
  • PVDF TM polyvinylidine difluoride
  • the following antibodies were used: anti-Flag® M2 (Sigma), anti-Xpress TM (Invitrogen), anti Src MAb 327 (Calbiochem).
  • a polyclonal rabbit antibody was generated against a GST-APR04 fusion protein containing the C-terminal domain of the human APR04 protein (amino acids 145 to 252). The antibody was affinity-purified first on a resin coupled to GST, then on a resin coupled to protein A. The proteins were detected by a chemiluminescence test (ECL Plus) (Amersham).
  • Endogenous anti-Src immunoprecipitates from NIH 3T3 cells and NIH cells or PC12 cells and PC12 / i L R04 cells were washed twice with kinase reaction buffer (40 mM Hepes, pH 7.4, 10 mM MC ⁇ , 3 mM MnC ⁇ ) and then incubated with 2, 5 ⁇ g of denatured rabbit muscle enolase (Sigma), 0.5 ⁇ M ATP, 1 mM DTT and 10 ⁇ Ci of [ ⁇ 2p] ATP p enc [ an t 15 min at 30 ° C.
  • the proteins were separated on an SDS-PAGE gel and visualized by autoradiography with an intensification screen.
  • the analysis by confocal microscopy was carried out on a Zeiss LSM510 device equipped with a 100 ⁇ Zeiss immersion lens.
  • PC12 cells were fixed in 3% paraformaldehyde in buffered saline (PBS) for 30 min at room temperature and were permeabilized in the presence of a PBS solution containing 0.5% Triton®-X100 for 1 min .
  • the Src protein was detected using a monoclonal anti-Src MAb 327 antibody and a secondary anti-mouse goat antibody conjugated to Alexa 488® (Molecular Probes).
  • the APR04 protein was detected using an affinity purified anti-APR04 polyclonal antibody and a Texas-Red® conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Images were collected using appropriate excitation and emission filters.
  • the invention thus described and illustrated finds an application in the treatment and / or prevention of conditions having for cause and / or development factors a proliferation, differentiation and / or cellular transformation, while said conditions are correlated with an increase in the tyrosine kinase activity of Src proteins in the body affected or likely to be affected by such a condition.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is devoid of toxicity for humans and warm-blooded animals, since the APR04 protein is present in their organisms in endogenous form.
  • the recommendations for modes of administration, quantities to be administered and unit doses can be defined in each case by the person skilled in the art, on the basis of his own knowledge and possible routine tests. They depend on the patient's condition and on the other parameters usually taken into account for the latter in medicine. It should be noted here that the quantity administered can be all the better suited to the treatment or prevention sought when the active substance of the pharmaceutical compositions according to the invention has a dose-dependent therapeutic effect.
  • Yoshida Y. et al. ANA, a novel member of Tob / BTGl family, is expressed in the ventricular zone of the developing central nervous system. Oncogene 16, 2687-2693 (1998).
  • Wilson, LK, Luttrell, DK, Parsons, JT & Parsons, SJ pp60 c'src tyrosine kinase, myristylation, and modulatory domains are required for enhanced mitogenic responsiveness to epidermal growth factor seen in cells overexpressing c-src. Mol. Cell. Biol. 9, 1536-1544 (1989).
  • pancreatitis-associated protein I promoter allows targeting to the pancreas of a foreign gene, whose expression is up- regulated during pancreatic inflammation. /. Biol. Chem. 272: 5800-5804 (1997).

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de la protéine APRO4, ou d'une protéine ou fraction protéique équivalente ayant un domaine C-terminal riche en proline, pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src, et la préparation de compositions pharmaceutiques contenant une telle protéine ou fraction protéique. Application notamment a la prévention et/ou au traitement des cancers, en particulier des cancers du côlon, du pancréas et du sein, de l'ostéoporose et des maladies osseuses dérivées, et des ischémies cérébrales et myocardiques.

Description

COMPOSITION POUR INHIBER L'ACTIVITE TYROSINE KINASE DES PROTEINES SRC.
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne le domaine de la biologie. Elle concerne plus particulièrement la régulation négative de l'activité enzymatique tyrosine kinase des protéines Src et analogues, et les applications de cette régulation négative à la sous-régulation de la prolifération, de la différenciation et/ou de la transformation des cellules in vivo ou ex vivo, en particulier pour un traitement amélioré des cancers, de l'ostéoporose et des maladies osseuses dérivées, ainsi que des ischémies cérébrales et myocardiques, entre autres.
ARRIÈRE-PLAN TECHNOLOGIQUE DE L'INVENTION
La protéine tyrosine kinase Src, joue un rôle important dans de multiples voies de signalisation régulant plusieurs fonctions cellulaires différentes, notamment la prolifération, la différenciation et la transformation des cellules. L'activité catalytique de la protéine Src est . étroitement régulée in vivo et peut être modulée par les interactions de ses domaines SH2 et SH3 avec des ligands à forte affinité.
Les protéines tyrosine kinases de la famille Src ont été initialement découvertes dans des tumeurs sous la forme virale d'un rétrovirus oncogène, le virus du sarcome de Rous. Cette forme, appelée v-Src, est constitutivement active et représente une forme mutée d'une protéine cellulaire, c-Src, exprimée ubiquitairement et très conservée au cours de l'évolution. La recherche de protéines kinases homologues a permis d'isoler 10 membres de la famille Src: Src, Fyn, Yes, Yrk, Blk, Fgr, Yck, Lck, Lyn et Frk. Ces protéines ont une structure moléculaire très similaire avec plusieurs domaines structuraux importants pour leur fonctions: un domaine SH2 qui interagit avec des séquences protéiques contenant une tyrosine phosphorylée, un domaine SH3 qui interagit avec des séquences protéiques riches en proline, un domaine catalytique tyrosine kinase, un domaine C-terminal contenant une tyrosine phosphorylée qui régule négativement l'activité tyrosine kinase (1). Conventionnellement, une séquence riche en proline est définie par la présence d'un ou plusieurs motifs de type Φ-P-X-Φ-P pour lesquels les deux résidus Φ-P (Φ représentant un acide aminé hydrophobe) vont former une zone hydrophobe appelée hélice polyproline II apte à se lier à la région hydrophobe du domaine SH3 (2,3).
Pour simplifier, on désignera dans la suite par "la protéine Src" la protéine Src proprement dite, et par "les protéines Src" les protéines de la famille Src susdite ou l'une quelconque d'entre elles.
La protéine Src a été impliquée dans un grand nombre de voies différentes de transduction de signaux conduisant à une prolifération cellulaire ou à une différenciation cellulaire selon le type de cellule concerné (1). Par exemple, la forme oncogénique v-Src, constitutivement active, induit la différenciation de cellules PC12 en cellules analogues à des neurones (4), tandis que la protéine v-Src bloque la différenciation des chondroblastes en chondrocytes (5), ce qui suggère que la protéine Src joue un rôle important dans la différenciation des cellules neuronales et des chondrocytes. En outre, une activité tyrosine kinase élevée de la protéine Src a été associée à une transformation cellulaire (6). La protéine Src exerce également un rôle important dans la régulation du cycle cellulaire, l'adhésion et la migration des cellules, la survie des cellules et l'angiogenèse (1,7), ce qui suggère que la protéine Src joue un rôle critique dans le fonctionnement normal des cellules et que son activité a besoin d'être étroitement régulée. La protéine Src est composée de deux modules peptidiques, appelés domaines SH2 et SH3 (pour Src homology 2 et 3), d'un domaine catalytique, et d'une région C- terminale régulatrice contenant un résidu tyrosine (Y529) régulant négativement l'activité de la protéine Src. L'activité, enzymatique de la protéine Src est régulée par des associations intramoléculaires d'une part entre le domaine SH2 et la tyrosine phosphorylée C-terminale et d'autre part entre le domaine SH3 et une petite région qui lie le domaine SH2 au domaine kinase pour donner une conformation enzymatique inactive "fermée" (8). L'activité catalytique de la protéine Src peut être modulée par trois facteurs, qui sont: la phosphorylation/déphosphorylation de la tyrosine C-terminale; la compétition pour le domaine SH2 par un ligand contenant une phosphotyrosine de forte affinité; et la compétition pour le domaine SH3 par un ligand riche en proline de forte affinité (8). Les protéines dénommées APRO (pour "antiprolifératives") constituent une famille de gènes comportant, selon les connaissances actuelles, au moins huit membres chez les vertébrés: APROl (BTG2/TIS21/PC3), APR02 (BTG1), APR03 (PC3B), APR04 (BTG3/ANA), APR05 (Tob2), APR06 (Tob), B9.10, et B9.15 (9-17). Le gène APR04 était dénommé jusqu'ici ANA (pour Abundant in the Neuroepithelium Area).
Tous ces gènes contiennent deux petits domaines conservés dans leur partie N-terminale (boîte A et boîte B), séparés par une séquence de 20-25 acides aminés non-conservés. Les fonctions biologiques des protéines de la famille APRO susdite sont encore peu claires. Toutefois, plusieurs publications ont montré que, dans des cellules de fibroblastes murins NIH 3T3 (ATCC N° CRL-1658) , leur surexpression conduit à l'inhibition de la prolifération cellulaire (10,12-18), suggérant que les protéines APRO peuvent être impliquées dans la régulation négative du cycle cellulaire. Egalement, plus récemment, il a été montré que la protéine APR06 (Tob) régulait négativement la prolifération et la différenciation des ostéoblastes par suppression de l'activité des protéines Smad régulées par le récepteur BMP (Bone Morphogenetic Factor) (19). En particulier dans le document WO-A-98 12204, on décrit les deux séquences nucléotidiques et polypeptidiques appelées BTG-2 (No. de dépôt à l'ATTC: 97025) et BTG-3 (No. de dépôt à l'ATCC: 97010) de la famille des protéines APRO. La séquence BTG-2 correspond à la protéine Tob (APR06) et la séquence BTG-3 correspond à la protéine Tob2 (APR05). Or, Tob (APR06) code pour une protéine de 345 acides aminés incluant une séquence de tête d'environ 25 acides aminés, tandis que Tob2 (APR05) code pour une protéine de 344 acides aminés incluant une séquence de tête d'environ 18 acides aminés. Les molécules d'acide nucléique isolées envisagées dans ce document doivent présenter une identité d'au moins 95 % avec ces séquences. Or, il a pu être établi que la séquence peptidique de la protéine Tob présente une identité de séquence dans la région N-terminale (acides aminés 1 à 115) de seulement 31 % par rapport à la protéine APR04 et que pour la protéine Tob2 l'identité de séquence dans la région N- terminale n'est que de 16 %. En ce qui concerne la séquence C-terminale, Tob et Tob2 possèdent une séquence riche en proline et en glutamine, qui ne correspond pas à une séquence riche en proline au sens où on l'entend ici. Or, il s'est avéré que, contrairement aux séquences riches en proline au sens de la présente invention, les séquences riches en proline et en glutamine ne peuvent pas interagir avec des domaines SH3 des protéines Src. La protéine APR04, dont la structure est décrite dans la littérature
(13,14), code pour une protéine de 252 acides aminés. La partie amino- terminale de la protéine APR04 est homologue aux protéines APRO caractérisées précédemment, tandis que sa partie C-terminale contient une région riche en proline (13,14). De plus, la protéine APR04, bien qu'étant exprimée de manière ubiquitaire, est très fortement exprimée dans les cellules neuroépithéliales de la zone ventriculaire du système nerveux central en développement, ainsi que dans les cartilages embryonnaires, ce qui suggère que la protéine APR04 pourrait jouer un rôle dans la neurogenèse et dans la prolifération et/ ou la différenciation des chondrocytes (14).
L'homme du métier n'était pas pour autant renseigné ou même guidé vers une utilisation, plus spécialement de l'une ou l'autre des protéines APRO susmentionnées. En effet, les résultats jusqu'alors publiés ne faisaient état d'aucune fonction connue pour le domaine C-terminal riche en proline de la protéine APR04, domaine qui fait d'ailleurs la spécificité de la protéine APR04 puisque non présent dans les autres protéines APRO. L'attention s'était jusqu'alors focalisée sur la région N-terminale des différentes protéines APRO, puisqu'elle était commune aux différents membres de la famille APRO et qu'il avait déjà été montré qu'elle pouvait avoir un rôle négatif sur la prolifération cellulaire notamment dans le cas de la protéine APROl (20).
Or, il existe encore de nos jours un besoin pour des moyens plus performants de prévention et/ou de traitement des cancers et plus généralement de tous types de prolifération, différenciation et/ou transformation des cellules qui, si elles ne sont pas souhaitées, constituent des dérèglements auxquels il est important de porter remède.
Un objectif de la présente invention est par conséquent de procurer de nouveaux moyens de prévention et/ou de traitement des proliférations, différenciations et/ou transformations cellulaires, notamment en vue d'une meilleure prévention et/ou d'un traitement amélioré des cancers, en particulier des cancers du côlon, du pancréas et du sein, des ostéoporoses et des maladies osseuses dérivées et des ischémies cérébrales et myocardiques.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION Conformément à la présente invention on a maintenant déterminé qu'un matériel biologique ayant une région ou partie C-terminale riche en proline, notamment un matériel biologique comprenant une protéine de type APRO spécifique, procure des fonctionnalités permettant son utilisation dans la prévention et/ou le traitement des états ayant pour cause ou pour facteurs de développement une prolifération, une différenciation et/ ou une transformation cellulaires dues à une augmentation de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src. La présente invention procure également des moyens de prévention et/ ou de traitement fondés sur un tel matériel biologique, en particulier sur une telle protéine ou fraction protéique appropriée, définie plus loin.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention sera mieux comprise en référence aux dessins annexés, qui illustrent certains résultats ayant trait aux moyens préconisés selon l'invention et aux résultats obtenus par leur mise en oeuvre, et dans lesquels:
Fig. 1 montre l'interaction in vitro et in vivo de Flag-APR04 avec Srcwt.
Fig. 2 représente les résultats d'essais d'identification des sites de liaison pour APR04 et Src.
Fig. 3 représente la suppression de l'activité tyrosine kinase de Src et de la signalisation Ras /MAP kinase dans des cellules NIH 3T3 par surexpression d'APR04.
Fig. 4 représente rinhibition de la différenciation de cellules PC12 médiée par le NGF par surexpression d'APR04.
Fig. 5 représente l'activation de la signalisation Ras/MAP kinase et de la différenciation de cellules PC12 par sous-régulation de protéine APR04 endogène.
Dans ces figures annexées: - la Fig. 1 se décompose ainsi: a. Liaison des protéines Flag-APR04, Flag-APR04ΔC, et Flag-APR04ΔN traduites in vitro en présence de méthionine [ ] à des constructions GST- SH3-SH2, GST-SH3 et GST-SH2. Quantité utilisée: 100% des protéines respectives utilisées dans les réactions de liaison; GST: billes de GST (Glutathion S-transférase). b. Co-immunoprécipitation de Srcwt avec Flag-APR04 dans des cellules NIH 3T3 co-exprimant Srcwt et Flag-APR04. Les immunoprécipités (IP) ont été analysés par immunoblotting (IB) avec les anticorps anti-Src ou anti-Flag. Les données indiquées sont représentatives de trois expériences indépendantes.
- la Fig. 2 se décompose comme suit: a,b. X-APR04ΔN interagissait avec la protéine Srcwt (a), tandis que Flag- APR04ΔC n'interagissait pas (b). c,d. Flag-APR04 interagissait in vivo avec le mutant ΔI296T de la protéine Src (c), la forme kinase inactivée de la protéine Src (K297M) (d), la forme constitutivement active de la protéine Src (Y529F) (d) et la forme dominante négative de la protéine Src (K297M Y529F) (d).
Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.
- la Fig. 3 se décompose en: a. Des essais sur des cellules NIH 3T3 et NIH 3T3AÏ>RQ4 pour l'activité kinase de la protéine Src endogène. b. Des essais sur des cellules NIH 3T3 co-transfectées avec 1 μg de 5x- Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de Gal4-Elkl (Elk/gal), 1 μg de CMV-βGal et les plasmides d'expression indiqués. L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 est reflétée par l'activité luciférase normalisée par rapport à l'activité βGal et a été rapportée en facteur de diminution de l'activité. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. c. Des quantités croissantes de plasmides APR04 ont été co-transfectées dans des cellules NIH 3T3 avec 1 μg de construction -1745 CD1LUC et 1 μg de construction CMV-βGal. L'activité luciférase normalisée par rapport à l'activité βGal a été rapportée en facteur de diminution de l'activité par rapport à l'activité basale. La construction -22 CD1LUC a été utilisée comme témoin négatif. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes.
- la Fig. 4 se décompose comme suit: a. Co-immunoprécipitation de la protéine APR04 endogène avec la protéine Src endogène dans des cellules PC12. L' antisérum de souris normal ne donne pas d'immunoprécipité avec la protéine APR04. b. Co-localisation de Src et d'APR04 dans des cellules PC12 par microscopie confocale. Les aires de co-localisation sont la réunion des aires respectives de localisation de la protéine Src et de la protéine APR04. c,d. Inhibition de la différenciation de cellules PC12 médiée par le NGF (c) et de l'activité kinase de la protéine Src (d) par surexpression de la protéine APR04. L'activité de la protéine Src endogène a été testée comme décrit plus haut. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes, e. Inhibition de la signalisation Ras/MAP kinase par surexpression de la protéine APR04. Des cellules PC12 ont été co-transfectées avec 1 μg de 5x- Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de Gal4-Elk-1 (Elk/gal), 1 μg de CMV-βGal et les plasmides d'expression indiqués, et ont été soit laissées sans stimulation, soit stimulées avec du NGF (100 ng/ml) pendant 6 heures. L'activité luciférase, normalisée par rapport à l'activité βGal, a été rapportée en facteur de diminution. L'écart type est indiqué (n=3). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. - la Fig. 5 se décompose ainsi: a. Sous-régulation de la protéine APR04 endogène par vecteur antisens, pAS-APR04. Des cellules PC12 ont été transfectées de manière transitoire avec pAS-APR04 et 200 μg de lysats de cellules entières ont été analysés par immunoblot avec les anticorps indiqués. b. Stimulation de l'activité kinase de la protéine Src dans des cellules PC12 transfectées de manière transitoire avec pAS-APR04. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. c. Activation de la transcription de la protéine Elk-1 par inhibition d'expression de la protéine APR04 endogène. Des cellules PC12 ont été co- transfectées de manière transitoire avec 1 μg de 5x-Gal4-TATA/luciférase, 200 ng de Gal4-Elk-1 (Elk/gal), 1 μg de CMV-βGal, et pAS-APR04 ou un vecteur vide témoin. L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 reflétée par l'activité luciférase et normalisée par rapport à l'activité βGal est indiquée en facteur d'augmentation. L'écart type est mentionné (n=4). Les données sont représentatives de quatre expériences indépendantes. d. Induction de la différenciation de cellules PC12 par inhibition d'expression de la protéine APR04 endogène. Les cellules ont été co- transfectées avec pAS-APR04 et un plasmide rapporteur CMV-βGal et colorées pour l'expression du gène lacZ après 6 jours. On a compté comme neurites les développements qui correspondaient à une taille supérieure à deux diamètres du corps cellulaire. Les données sont représentatives de quatre expériences indépendantes.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION On a maintenant trouvé de manière inattendue que l'on peut réaliser une composition pharmaceutique utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src, ladite composition comportant au moins un matériel biologique comprenant une région ou partie C-terminale riche en proline. A titre d'exemple non-limitatif d'un tel matériel biologique, on considère dans la suite la protéine APR04.
Un objet de la présente invention est ainsi de procurer une composition pharmaceutique utile, notamment dans les applications mentionnées plus haut.
Un autre objet de la présente invention est de procurer une composition utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src.
Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à agir comme un régulateur co formationnel de l'activité des protéines Src. Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à s'associer aux deux domaines SH2 et SH3 des protéines Src.
Encore un autre objet de l'invention est de procurer une composition pharmaceutique apte à exercer une sous-régulation de l'activité tyrosine kinase des protéines Src et analogues.
D'autres objets, avantages et caractéristiques remarquables de l'invention apparaîtront mieux à la lumière de la description détaillée ci- après qui, considérée conjointement avec les figures annexées, décrit des modes de réalisation préférés, mais non-limitatifs, de l'invention. Face aux mdéterminations, au stade actuel des connaissances de l'homme du métier, sur les fonctionnalités et les spécificités éventuelles des différentes protéines de la famille APRO susmentionnée, on a maintenant procédé à des investigations et à des travaux de recherche, qui seront relatés ci-après.
Pour déterminer si la protéine APR04 s'associait avec la protéine c- Src, on a effectué des expériences de liaison in vitro (voir détails dans la partie expérimentale, plus loin). Les domaines SH3/SH2 de la protéine c-Src (Swissprot No P12931) ont été exprimés dans des bactéries sous forme de protéines de fusion avec la protéine GST (Genbank No U13852) (Glutathion- S-transférase), purifiés jusqu'à homogénéité sur des billes de glutathion- agarose, et testés quant à leur aptitude à fixer la protéine Flag-APR04 traduite in vitro dans un système d'expression protéique de réticulocyte de lapin (TNT® coupled réticulocyte lysate Systems, de la société Promega) en présence de méthionine [^S] (voir Fig. la). L'association de la protéine APR04 nécessitait tant les domaines SH2 que les domaines SH3, ce qui suggérait que le site de liaison était probablement conformationnel et faisait intervenir la totalité de la structure protéique. Une forme mutée de la protéine APR04 dépourvue du domaine carboxy-terminal riche en proline (Flag-APR04ΔC) ne se fixait pas aux domaines SH3-SH2, alors que la forme mutée de 1ΑPR04 dépourvue du domaine N-terminal (X-APR04ΔN) se liait, mais moins fortement aux domaines SH3-SH2 de la protéine Src. Ces résultats indiquaient que l'interaction entre les protéines APR04 et Src était médiée par la région riche en proline de la protéine APR04, mais que la totalité de la protéine était nécessaire pour une association stable. Cette interaction a également été établie in vivo dans des cellules NIH 3T3, caractérisées par une expression endogène à peine détectable des protéines APR04 et de Src, par co-expression de la protéine APR04 et de la protéine Srcwt et co-immunoprécipitation, suivies par un immunoblotting des protéines avec des anticorps spécifiques dirigés contre les protéines Flag- APR04 et Src (voir Fig. lb).
Pour mieux déterminer quels domaines de Src et d'APR04 étaient impliqués dans l'association, on a analysé plusieurs mutants de la protéine Src par co-immunoprécipitation et réalisation d'immunoblot de protéines avec des anticorps spécifiques pour les protéines APR04 et Src. En premier lieu, la co-expression des protéines X-APR04ΔN et Srcwt dans des cellules NIH 3T3 a confirmé les données obtenues in vitro, montrant que la région riche en proline de la protéine APR04 était requise pour l'interaction avec la protéine Src (voir Fig. 2a). Comme on le pensait, on a vérifié que la protéine Flag-APR04ΔC ne se fixait pas à la protéine Src (voir Fig. 2b), ce qui indiquait que, contrairement à APROl (PC3), qui s'est avérée inhiber la croissance cellulaire par le biais de la région N-terminale conservée (20), la protéine APR04 peut exercer un effet antiprolifératif par un mécanisme différent. On pense que ce mécanisme est le suivant: Un fragment de Src N- terminal de 298 acides aminés (ΔI296T) se liait à la protéine APR04, indiquant que le domaine kinase de la protéine Src n'était pas nécessaire pour que l'interaction ait lieu (voir Fig. 2c).
Des mutants du domaine catalytique de la protéine Src ont également été co-exprimés et analysés par co-immunoprécipitation. Les résultats ont montré que la protéine APR04 se liait non seulement au mutant kinase inactive (K297M) de la protéine Src (mutation dans le site de liaison de l'ATP qui a pour effet d'inactiver l'enzyme) (voir Fig. 2d), au mutant dominant négatif (K297M Y529F) de la protéine Src (l'enzyme inactivée par la présence d'une mutation dans le domaine de liaison de l'ATP a une conformation « ouverte » due à la mutation de la tyrosine Y529) (voir Fig. 2d) mais aussi à la forme constitutivement active de la protéine Src (Y529F) (voir Fig. 2d). Ces données indiquaient que la protéine APR04 interagissait aussi bien avec la forme kinase inactive de la protéine Src qu'avec la forme constitutivement active et que cette interaction pouvait par conséquent avoir un effet sur son activité catalytique.
Pour établir l'effet de la protéine APR04 sur l'activité de la protéine Src, on a établi une lignée de cellules NIH 3T3 stable, surexprimant la protéine APR04 (NIH 3T3 ^p^Q^) et on a testé des imrnunoprécipités de Src endogènes provenant de lysats protéiques de cellules NIH 3T3 et NIH pour l'activité kinase de la protéine Src in vitro en présence de
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et d'énolase. La protéine APR04 réduisait très fortement l'activité catalytique de la protéine Src. Un essai par immunoblot avec l'anticorps dirigé contre la protéine Src a confirmé pour contrôle que des quantités équivalentes de protéines Src étaient présentes dans les deux réactions d'immunoprécipitation (voir Fig. 3a). On a pu montrer que la protéine Src est requise pour la mitogenèse induite par le facteur de croissance EGF (Epidermal Growth Factor) et conduit à l' activation de la cascade Ras/Raf/MEK/ERK (21). Afin d'effectuer des investigations sur l'effet de la protéine APR04 sur la voie de signalisation Ras/MAP kinase, on a testé l'activation des protéines ERKs indirectement, en mesurant la transactivation du gène rapporteur de la luciférase 5x-Gal4-TATA /luciférase par une construction de Gal4-Elkl (Elk/gal) contenant le domaine de transactivation de la protéine Elk-1. Elk-1, un membre de la famille Ets de facteurs de transcription, est un substrat physiologique important des protéines ERKs. Une activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 dépendante de Src a été inhibée par la protéine APR04 d'une manière dose-dépendante (voir Fig. 3b). Comme l'hypothèse formée le laissait penser, la protéine APR04ΔC n'inhibait pas l'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1, alors que la protéine APR04ΔN l'inhibait, ce qui confirmait que l'inhibition était due au domaine riche en proline de la protéine APR04.
La cycline Dl joue un rôle bien établi dans la régulation de la progression dans la phase Gl du cycle cellulaire et dans la promotion de la prolifération cellulaire. Son niveau d'expression s'est avéré être modulé par la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK (22). Afin de déterminer si le promoteur du gène de cycline Dl était affecté par la surexpression de la protéine APR04, on a effectué des études d'expression transitoire en utilisant le promoteur de cycline Dl humain lié au gène rapporteur de la luciférase. La protéine APR04 régulait négativement de façon significative l'activité du promoteur de cycline Dl, et ce d'une manière dose-dépendante (voir Fig. 3c). Ces résultats indiquaient donc que la protéine APR04 inhibait la prolifération des cellules NIH 3T3 en sous-régulant la transcription de cycline Dl par le biais d'une régulation négative de la voie Ras/Raf/MEK/ERK. Pour déterminer si cette interaction pouvait être observée entre protéines mammaliennes endogènes, on a utilisé des cellules PC12 de phéochromocytome de rat (ATCC No CRL-1721), eu égard au constat selon lequel, contrairement aux cellules NIH 3T3, les niveaux d'expression de la protéine APR04 pouvaient être détectés par la technique d'irnmunioblotting. Des immunoprécipités de Src endogène et d'antisérum de souris normale issus de lysats protéiques de cellules PC12 ont été analysés par immunoblotting avec un anticorps spécifique purifié par affinité, généré contre une protéine de fusion GST-APR04 contenant le domaine C-terminal de la protéine APR04 humaine. Les deux protéines Src et APR04 étaient présentes dans les immunoprécipités de Src, tandis que l'antisérum de souris n'immunoprécipitait pas la protéine APR04 (voir Fig. 4a). En outre, une étude par microscopie confocale a révélé une colocalisation cytoplasmique extensive entre les protéines Src et APR04 dans des cellules PC12 (voir Fig. 4b). Les cellules PC12 constituent un système modèle pour l'étude de la différenciation des cellules neuronales. La lignée cellulaire PC12 répond au facteur de croissance des cellules nerveuses (NGF) (Nerve Growth Factor) en étendant des neurites et en développant de nombreuses autres propriétés semblables à celles des neurones sympathiques (23). Afin d'analyser l'effet de la protéine APR04 sur la différenciation des cellules PC12, on a établi une lignée stable de cellules PC12 surexprimant la protéine APR04 (PC12 J^-^Q^). Après 8 jours d'exposition au NGF, les cellules PC12 développaient de nombreuses neurites, alors que les cellules PC12 PRQ4 ne se différenciaient pas (voir Fig. 4c), ce qui suggère que la surexpression de la protéine APR04 pourrait affecter la cascade de signaux médiés par le NGF. Etant donné que l'expression de la forme oncogène constitutivement active, c'est-à-dire v-Src, est connue pour induire la pousse de neurites dans des cellules PC12 (4), la sous-régulation de l'activité de la protéine Src pourrait avoir un effet sur la différenciation des cellules PC12. Afin d'évaluer l'effet de la protéine APR04 sur l'activité de la protéine
Src, on a testé des immunoprécipités de Src endogène provenant de lysats protéiques de cellules PC12 et PC12APRQ4 pour l'activité catalytique de la protéine Src in vitro, en présence d'énolase. La protéine APR04 réduisait l'activité catalytique de la protéine Src (voir Fig. 4d). Un essai par immunoblot avec l'anticorps dirigé contre la protéine Src a confirmé pour contrôle que des quantités équivalentes de protéines Src étaient présentes dans les deux réactions (voir Fig. 4d).
La différenciation des cellules PC12 médiée par le NGF a été corrélée à une forte activation de la voie de signalisation Ras/MAP kinase (24). Par conséquent, pour étudier plus avant si la surexpression de la protéine APR04 dans des cellules PC12 affectait l'activation médiée par le NGF de la voie de signalisation Ras/MAP kinase, on a traité des cellules PC12 transfectées avec du NGF pendant 6 heures et mesuré l'activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1 comme décrit précédemment. L'activation transcriptionnelle de la protéine Elk-1 dépendante de la la protéine Src était réprimée par la protéine APR04 dans les cellules PC12 traitées avec du NGF (voir Fig. 4e). Ces résultats indiquaient que la surexpression de la protéine APR04 inhibait la différenciation des cellules PC12 médiée par le NGF en sous-régulant la voie de signalisation Ras/MAP kinase.
Pour rechercher l'importance physiologique de cette interaction dans des cellules PC12, on a inhibé l'expression endogène de la protéine APR04 par expression d'un vecteur antisens (pAS-APR04). Les cellules PC12 ont été transfectées de façon transitoire avec le plasmide ρAS-APR04 et les lysats cellulaires ont été analysés par imrnunoblotting avec un anticorps dirigé contre la protéine APR04 purifié par affinité. Ce vecteur réduisait significativement le niveau d'expression de la protéine APR04 sans affecter l'expression de la protéine Src (voir Fig. 5a). Pour analyser l'effet de la sous- régulation de la protéine APR04 sur l'activité catalytique de la protéine Src, des cellules PC12 ont été transfectées de façon transitoire avec pAS-APR04 et testées pour leur activité tyrosine kinase. L'activité catalytique de la protéine Src était augmentée dans les cellules PC 12 transfectées avec pAS- APR04 par rapport aux cellules témoins PC12 (voir Fig. 5b). Pour poursuivre les investigations sur l'effet de la protéine APR04 endogène sur la voie de signalisation Ras/MAP kinase, des cellules PC12 ont été co- transfectées avec pAS-APR04, une construction de transactivation Gal4-Elk- 1, et le gène rapporteur de la luciférase 5x-Gal4-TATA/ luciférase et testées pour leur activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1. L'activité transcriptionnelle de la protéine Elk-1 était substantiellement accrue dans les cellules PC12 transfectées avec le plasmide pAS-APR04 par rapport aux cellules témoins PC12 (voir Fig. 5c), ce qui confirmait que la protéine APR04 régulait la voie de signalisation Ras/MAP kinase en sous-régulant l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.
De plus, pour évaluer l'effet de la protéine APR04 endogène sur la différenciation de cellules PC12, le plasmide pAS-APR04 a été co-transfectée avec un plasmide rapporteur CMV-βGal dans des cellules PC12. Le plasmide CMV-βGal permet de détecter les cellules transfectées qui exprime le gène lacZ par une réaction de coloration en présence de X-Gal. 70% des cellules PC12 co-transfectées avec CMV-βGal et ρAS-APR04 développaient des neurites après 6 jours (voir Fig. 5d), tandis qu'aucune des cellules PC12 co- transfectées avec CMV-βGal et le vecteur témoin non-recombinant ne développait de neurites (données non représentées). Ces résultats indiquaient que, dans des conditions physiologiques, la protéine APR04 était associée avec la protéine Src et requise pour le maintien sous contrôle étroit de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.
Seules quelques protéines qui régulent négativement l'activité de la protéine Src ont été identifiées à ce jour. La cavéoline, une protéine membranaire intégrale de 22 kDa, qui est un composant majeur de la régulation structurale des membranes de caveolae, s'est avérée se fixer à la protéine Src et supprimer l'activité tyrosine kinase de celle-ci (25). La cavéoline interagit également avec les sous-unités H-Ras et Gα et supprime l'activité de GTPase de Gα (25). Plus récemment, il a été montré que RACK1 (récepteur pour la protéine kinase C activée) et un homologue de la sous- unité β des protéines G se fixait au domaine SH2 de la Src et inhibait son activité catalytique (26). Ces constatations ont suggéré que la cavéoline ainsi que RACK1, en tant que protéines ancrées à la membrane, peuvent non seulement restreindre la localisation sub-cellulaire de la protéine Src, mais également peuvent réduire son activité. D'une autre manière, les résultats présentés ici montrent que l'association de la protéine APR04 avec la protéine Src requiert les deux domaines SH2 et SH3, ce qui suggère que le site de liaison est probablement conformationnel et requiert la totalité de la structure protéique. En outre, la protéine APR04 n'est pas une protéine ancrée à la membrane et peut donc réguler différemment l'activité catalytique de la protéine Src. De fait, l'expression de la protéine APR04 s'est avérée être induite par des changements du potentiel redox dans plusieurs types de cellules (27), suggérant ainsi que la protéine APR04 peut jouer un rôle important durant les réponses induites lors de stress oxydatif. Il a également été montré que l'expression de la protéine APR04 est dépendante du cycle cellulaire (13,14), ce qui suggère que la protéine APR04 peut également être impliquée dans le contrôle négatif du cycle cellulaire par modulation de l'activité catalytique de la protéine Src. Sur la base des données physiologiques fournies ici, on pense que, dans la cellule, la protéine APR04 est liée à la protéine Src et la protège contre une activation non-spécifique, en la maintenant dans une conformation où les domaines SH2 et SH3 sont inaccessibles. La protéine APR04 pourrait ainsi agir comme un régulateur conformationnel de l'activité de la protéine Src. En réponse à divers stimuli extracellulaires tels que les facteurs de croissance, l'activation de la protéine Src médiée par des ligands des domaines SH3 ou SH2 à forte affinité pourrait induire une modification conformationnelle, qui pourrait ensuite conduire à la rupture du complexe Src-APR04 et à la libération de la protéine Src. Ainsi, les résultats présentés ici montrent que la protéine APR04 met en oeuvre in vivo ou ex vivo un mécanisme de régulation négative essentiel pour les voies de signalisation impliquant la protéine Src. Etant donné que la protéine Src est impliquée dans de nombreuses réponses biologiques telles que la transformation, la mitogenèse et la différenciation, la protéine APR04 peut exercer un effet marqué sur ces processus physiologiques.
L'invention a ainsi pour premier objet une composition pharmaceutique comportant au moins un matériel biologique comprenant une région ou partie C-terminale riche en proline, notamment une protéine et/ ou une fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline, de préférence une protéine APR04, éventuellement dans un support pharmaceutiquement acceptable.
Selon l'invention, ladite protéine ou fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline est avantageusement présente en une quantité thérapeutiquement efficace pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase des protéines Src.
Une telle protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline peut être d'origine naturelle, et provenir par exemple d'extraits de plantes, de levures, de tissus ou sécrétions d'origine animale, de cultures cellulaires ou encore de milieux de fermentation microbienne. Elle peut également être traitée selon des techniques connues de l'homme du métier pour être rendue plus apte à son utilisation thérapeutique, ou synthétisée à partir de cellules hôtes, d'origine animale ou provenant d'insectes, de bactéries, de levures transformées, qui produisent de façon stable par génie génétique la protéine APR04 ou un analogue de la protéine APR04 recombinante.
On entend ici par analogue toute protéine ou fraction protéique dont la séquence en acides aminés contient une séquence C-terminale riche en proline conservée d'un point de vue phylogénétique et possédant les caractéristiques décrites précédemment en référence aux données de la littérature (2,3). L'homme du métier peut vérifier ce caractère d'analogie par des recherches conventionnelles dans les bases de données à l'aide de programmes bio-informatiques appropriés. Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'un matériel biologique tel que décrit plus haut, notamment.la protéine APR04 et/ou un analogue de la protéine APR04 recombinante, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour procurer aux animaux à sang chaud, y compris l'homme, une sous-régulation de l'activité de l'enzyme tyrosine kinase Src.
Selon une forme de mise en oeuvre préférée de l'invention, cette utilisation vise le traitement et/ou la prévention des affections choisies parmi les cancers, l'ostéoporose, les maladies osseuses dérivées de l'ostéoporose, et les ischémies cérébrales et myocardiques. La protéine Src est en effet impliquée dans le développement et la progression de certains types de cancers humains, notamment mais non exclusivement les cancers du côlon, du pancréas et du sein (28). La diminution de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src constitue ainsi une cible thérapeutique pour ces types de cancers, entre autres. Bien qu'exprimée ubiquitairement, la protéine Src est également très fortement exprimée dans les ostéoclastes. Les ostéoclastes sont des cellules géantes multinucléées impliquées dans la résorption osseuse normale et pathologique (29). Des souris invalidées pour le gène Src présentent une ostéopétrose (ostéoporose généralisée) due à une déficience de l'activité des ostéoclastes dans la résorption osseuse (30,31). L'ostéoporose résulte d'un déséquilibre entre la formation et la résorption osseuse. Ce déséquilibre peut provenir soit d'une diminution de la formation osseuse due à l'âge, soit d'un découplage de l'équilibre résorption/formation osseuse (32). Un moyen pour maîtriser la maladie, ainsi que les maladies osseuses dérivées, consiste à contrôler l'activité des ostéoclastes en inhibant l'activité tyrosine kinase de la protéine Src.
Le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), qui est un facteur angiogénique produit en réponse à une ischémie cérébrale, est un médiateur de la perméabilité vasculaire qui contribue aux oedèmes cérébraux observés lors d'une ischémie cérébrale (33). Il a été montré que la protéine Src régulait la perméabilité vasculaire médiée par le VEGF dans le cerveau de souris après une attaque cérébrale. D'autre part, la suppression de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src observée chez les souris invalidées pour la protéine Src est à l'origine d'une diminution de la perméabilité vasculaire et en conséquence d'une diminution des dommages cérébraux (34). Ces résultats montrent que lors d'une ischémie cérébrale, rinhibition de la perméabilité vasculaire médiée par une inhibition de la protéine Src est responsable de l'effet protecteur observé. L'inhibition de l'activité de la protéine Src peut donc avoir un effet protecteur non seulement dans le cas d'une ischémie cérébrale, mais aussi dans le cas d'une ischémie due à un infarctus myocardique.
Pour son application aux situations et aux modalités de prévention et/ou de traitement les plus diverses, l'objet de l'invention peut prendre différentes formes de réalisation.
Selon l'une des formes de réalisation possibles de la présente invention, celle-ci a pour objet une construction vecteur pour rinhibition de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src, ladite construction vecteur comportant un matériel viral, ne présentant pas de caractère pathogène ou inactivé, c'est-à-dire en pratique modifié et/ou atténué, d'un type choisi de préférence parmi les rétrovirus recombinants, les adénovirus, les virus adéno-associés (AAV) et les lentivirus, et contenant soit la totalité de la séquence codant pour la protéine APR04, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues.
Selon une autre forme de réalisation, l'invention a pour objet une construction ou produit de construction plasmidique pour le traitement d'un tissu, ladite construction contenant soit la totalité de la séquence codant pour la protéine APR04 ou ses analogues, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues, avantageusement sous contrôle d'un promoteur spécifique du tissu à traiter. On peut citer, à titre d'exemples, le promoteur de l'alpha- lactalbumine (hALA) et de la bêta-lactoglobuline (oBLG) pour une expression exclusive dans les cellules mammaires (35), le promoteur de insuline (36), de l'amylase (37) ou encore de la PAP I (pancreatitis- associated protein I) (38) pour une expression spécifique dans les tissus pancréatiques et le promoteur de l'antigène carcino-embryonique (pCEA pour carcinoembryonic antigen promoter) (39) pour une expression spécifique dans le côlon. Par ailleurs, il a été montré que dans la plupart des cas de tumeurs du sein, les cellules cancéreuses mammaires continuaient à exprimer des récepteurs de l'œstrogène. De plus, la plupart des tumeurs solides présentent une hypoxie des tissus due à une vascularisation aberrante du tissu tumoral (40). Aussi, l'utilisation d'un promoteur combinant non seulement des séquences régulatrices dépendantes de l'œstrogène, mais aussi des séquences régulatrices de l'hypoxie permettra d'induire sélectivement (par des agents oestrogéniques et hypoxiques) l'expression du gène APR04 ou de ses analogues dans les cellules cancéreuses mammaires.
Sous un autre aspect, la présente invention consiste en l'utilisation de molécules, avantageusement de molécules peptidiques, qui miment l'interaction APR04-Src et qui peuvent être choisies parmi des molécules synthétisées chimiquement à partir de la séquence protéique C-terminale riche en proline définie précédemment, ou peuvent être produites par recombinaison à l'aide d'un vecteur d'expression protéique contenant la séquence codant pour le domaine C-terminal de la protéine APR04 ou de ses analogues, et exprimée dans différents systèmes d'expression, tels que par exemple des bactéries, des levures ou des insectes. Afin d'augmenter leur stabilité et leur résistance aux protéases, ces peptides peuvent, en option, contenir des acides aminés de type D modifiés, tels que la β-alanine, la diiodotyrosine, l'ornithine, l'hydroxyproline et la β-naphtylalanine, qui contrairement aux acides aminés naturels de type L ne sont pas reconnus par les enzymes protéolytiques. Ces peptides peuvent en option être également choisis, en partie ou en totalité, par criblage de banques combinatoires de peptides ou de molécules par la technique dite de phage display (41). Selon encore un autre aspect de la présente invention, on effectue des criblages de molécules agonistes par la technique dite USPS (Ubiquitin-based split-protein sensor), décrite par Johnsson et al. (42). La méthode est fondée sur le fait que l'ubiquitine, qui est une protéine de 76 acides aminés contenant un seul domaine protéique, est clivée in vivo par une protéase ubiquitine spécifique, dénommée USB (pour Ubiquitin spécifie protéase), qui reconnaît la conformation repliée de l'ubiquitine. Un fragment C-terminal de l'ubiquitine (Cub) est exprimé en fusion avec un gène rapporteur, la dihydrofolate réductase (DHFR), et lié au domaine C-terminal de la protéine APR04 (Cub-APR04c-term). Une banque d'expression codant pour des séquences traduites au hasard est fusionnée au fragment N-terminal de l'ubiquitine (Nub) et criblée à l'aide du Cub-APR04c-term pour des cellules eucaryotes qui expriment le gène rapporteur DHFR actif. Cette technique peut être appliquée aussi bien dans des types cellulaires spécifiques que dans la levure.
Le mode d'administration de la composition pharmaceutique selon l'invention, et les quantités de ladite composition à administrer pour la prévention et/ou le traitement d'états pour lesquels la régulation négative de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src constitue une réponse appropriée, peuvent être choisis par l'homme du métier dans chaque cas d'espèce. En particulier, mais non exclusivement, on peut préconiser une administration de l'un ou plusieurs des inhibiteurs susdits selon l'invention, par voie intraveineuse, ou bien localement (par injection directe dans le parenchyme des organes affectés ou directement dans la tumeur), ou encore par voie orale.
En variante, on peut utiliser des systèmes synthétiques qui encapsulent l'ADN plasmidique ou se complexent avec lui, et le protègent d'une dégradation. Ces systèmes sont fondés sur l'utilisation de lipides cationiques ou de polymères cationiques, tels que par exemple la PLL (poly- L-lysine)et/ou la PEI (polyéthylèneimine), qui possèdent un groupement hydrophile qui interagit avec l'ADN et un groupement lipophile qui permet au polymère de s'auto-assembler en vésicules ou en structures similaires (43).
L'invention est décrite plus en détail ci-après, en référence à des modes opératoires utilisés pour les expérimentations effectuées tant à des fins d'investigation que pour la réalisation d'essais in vitro et pour l'élaboration de constructions et de plasmides comportant de la protéine APR04 conformément à l'invention.
Modes opératoires
Culture des cellules
Des cellules NIH 3T3 (ATCC No CRL-1658) ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) complété avec 10% de sérum bovin foetal. Des cellules PC12 (ATCC No CRL-1721) ont été cultivées dans du DMEM complété avec 10% de sérum de cheval et 5% de sérum bovin foetal. Les cellules NIH 3T3 et les cellules PC12 transfectées de manière stable avec la construction Flag-APR04 (NIH 3T3A RQ4 et PC12A RQ4 respectivement) ont été maintenues en présence de G418 (400 μg/ml).
Plasmides et expression de protéines
L'ADNc humain du gène APR04 (Swissprot No Q14201) a été isolé par PCR à partir d'une banque d'ADNc de cerveau humain au moyen d'une amorce 5' contenant un site de restriction EcoRI: 5'-ggaattcATGAAGAATGAAATTGCTGCC-3' et une amorce 3' contenant un site de restriction Sali:
5'-acgcgtcgacTAGTGAGGTGCTAACATGTG-3'. L'ADNc a ensuite été sous- cloné dans les sites EcoΕI-XhoI du vecteur PSS-188 portant un promoteur CMV et un marqueur d'épitope Flag N-terminal (petite séquence de 8 acides aminés qui permet la détection d'une protéine donnée in- vivo à l'aide d'un anticorps anti-Flag®, voir brevets US Nos 4,703,004 et 4,782,137) pour produire la construction Flag-APR04. X-APR04ΔN comprend le domaine C- terminal (acides aminés 145 à 252) de la protéine APR04 et a été sous-cloné dans les sites EcoΕl-B mΗI du vecteur pcDNA3.1/His™ (Invitrogen) contenant un marqueur d'épitope Xpress (petite séquence de 8 acides aminés qui permet la détection d'une protéine donnée in vivo à l'aide d'un anticorps anti-Xpress™, Invitrogen). Flag-APR04ΔC (acides aminés 1 à 134) a été isolé par excision d'un fragment d'ADN du site de restriction Aγal de la construction Flag-APR04. ΔI296T, K297M, Y529F (fournis par T. Hunter), Srcwt (Swissprot N° P12931), (fourni par J. Sap), K297M Y529F (fourni par S. Roche) et des constructions du promoteur de la cycline Dl (fourmes par C. Albanese et R. Pestell) ont été décrits précédemment (44,45). pAS-APR04 englobe les nucléotides 1-756 de l'ADNc APR04 clones dans le vecteur pcDNA3 dans une orientation antisens. La construction GST-SH3-SH2 a été isolée par PCR au moyen d'une amorce 5' contenant un site de restriction BαmHI (GEXSH5):
5'-cgggatccTGACCACCTTTGTGG-3' et une amorce 3' contenant un site de restriction EcoRI (GEX-SH3): 5'-ggaattcGGGGCACACGGTGGTG-3'. GST-SH3 a été construit au moyen d'une amorce 5' (GEX-SH5) et d'une amorce 3' contenant un site de restriction EcoRI: 5'-ggaattcGGATGGAGTCGGAGG-3'. La construction GST- SH2 a été obtenue au moyen d'une amorce 5' contenant un site de restriction BamHh 5'-cgggatccCCGACTCCATCCAGG-3' et d'une amorce 3' (GEX-SH3). Toutes les constructions ont ensuite été sous-clonées dans les sites Bamrll- EcoRI du vecteur pGEX-3X (Pharmacia, Genbank No U13852) et séquencées. Les constructions GST ont été introduites dans des bactéries DH5α et l'expression des protéines a été induite avec de l'isopropyl-β-D- thiogalactoside 0,5 mM (IPTG) à 37°C pendant 3 h. Les bactéries ont été lysées dans une solution de PBS contenant 1% de Triton®-X100 et de l'EDTA 50 mM. Les lysats ont été soumis à un traitement sonique. Après centrifugation, les lysats devenus limpides ont été incubés avec des billes de glutathion-agarose®(Pharmacia) pendant 2 h à 4°C sous agitation. Les billes ont été lavées quatre fois avec une solution de PBS contenant 1% de Triton®- X100 et les protéines ont été éluées conformément aux instructions du fabricant.
Traduction in vitro et réaction de liaison avec les protéines de fusion GST
Des plasmides Flag-APR04, Flag-APR04ΔC et X-APR04ΔN ont été transcrits et traduits in vitro avec un système d'expression protéique de réticulocyte de lapin (TNT® coupled réticulocyte lysate Systems de la société Promega) de lysat de réticulocyte de lapin couplé à TNT en présence de métMonine [-"S] conformément aux instructions du fabricant (Promega). 5 μg de protéine de fusion-GST immobilisés sur des billes de glutathion- sépharose® ont été incubées avec du produit traduit in vitro dans du tampon B (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% de NP-40, 1 mM EDTA, 10% de glycérol, 1 mM PMSF) pendant 3 heures à 4°C. Les complexes protéiques ont été lavés quatre fois dans du tampon B et les protéines fixées ont été éluées et analysées par un gel SDS-PAGE et autoradiographie.
Transfection
10' cellules NIH 3T3 ont été co-transfectées de façon transitoire en utilisant de la Lipofectamine™ (Life Technologies) avec 8 μg de Flag-APR04 et 8 μg des constructions de Src appropriées. Le milieu de transfection a été changé après 6 h et les cellules ont été recueillies 48 h après transfection. Pour les essais de mesure d'activité du gène rapporteur, on a utilisé 5x-Gal4- TATA/luciférase et un plasmide codant pour le domaine de transactivation Gal4-Elk-1 (Elk-Gal) (Stratagene) en combinaison avec d'autres plasmides comme indiqué sur les figures. La construction CMV-βGal a été transfectée en tant que contrôle interne de l'expression génique après transfection. Les cellules ont été transfectées comme décrit dans des boîtes de culture de 60 mm de diamètre. 48 h après transfection, les cellules ont été déprivées en sérum pendant 20 h et soit laissées non-traitées, soit traitées avec du NGF (100 ng/ml) pendant la durée indiquée avant d'être recueillies. L'activité de luciférase a été détectée avec un luminomètre à l'aide du système Luciférase Assay System (Promega, voir brevets US Nos 5,283,179, 5,641,641 et 5,650,289) et l'expression de β-Gal a été évaluée par absorbance à A420 Les résultats ont été normalisés par rapport à l'activité de β-Gal. Les essais de luciférase ont été réalisés en triple et répétés au moins trois fois dans des expériences de transfection indépendantes.
Immunoprécipitation et immunoblotting
48 h après transfection, on a incubé des cellules NIH 3T3 dans du tampon de lyse L (10 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,5% de NP-40, 10% de glycérol, 1 mM EDTA, 2 mM NaF, 2 mM Na3V04, 10 μg/ml d'aprotinine, 10 μg/ml de leupeptine, 1 mM PMSF) pendant 30 min à 4°C. Les lysats ont été clarifiés par centrifugation à 15.000 x g pendant 15 min et pré-incubés par incubation avec des billes de protéines G-sépharose® (Pharmacia) pendant 1 h à 4°C. Les surnageants ont ensuite été incubés pendant une nuit avec l'anticorps approprié et les billes de protéines G-sépharose®, lavés trois fois avec du tampon L et ensuite séparés sur un gel SDS-PAGE, suivi d'un immunoblotting sur une membrane de difluorure de polyvinylidine (PVDF™) (Biorad), et traité comme préconisé par le fabricant. Les anticorps ci-après ont été utilisés: anti-Flag® M2 (Sigma), anti-Xpress™ (Invitrogen), anti Src MAb 327 (Calbiochem). Un anticorps de lapin polyclonal a été généré contre une protéine de fusion GST-APR04 contenant le domaine C- terminal de la protéine APR04 humaine (acides aminés 145 à 252). L'anticorps a été purifié par affinité d'abord sur une résine couplée au GST, puis sur une résine couplée à la protéine A. Les protéines ont été détectées par un test de chimioluminescence (ECL Plus) (Amersham).
Mesure de l'activité kinase in vitro
Des immunoprécipités d'anti-Src endogène de cellules NIH 3T3 et de cellules NIH
Figure imgf000024_0001
ou de cellules PC12 et de cellules PC12/iL R04 ont été lavés deux fois avec du tampon de réaction de kinase (40 mM Hepes, pH 7,4, 10 mM M C^, 3 mM MnC^) et ensuite incubés avec 2,5 μg d'énolase de muscle de lapin dénaturée (Sigma), 0,5 μM ATP, 1 mM DTT et 10 μCi de [γ 2p]ATP penc[ant 15 min à 30°C. Les protéines ont été séparées sur un gel SDS-PAGE et visualisées par autoradiographie avec un écran d'intensification.
Marquage par immunofluorescence et microscopie confocale
L'analyse par microscopie confocale a été réalisée sur un appareil Zeiss LSM510 équipé d'une lentille à immersion lOOx Zeiss. Des cellules PC12 ont été fixées dans 3% de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée (PBS) pendant 30 min à température ambiante et ont été perméabilisées en présence d'une solution de PBS contenant 0,5% de Triton®-X100 pendant 1 min. La protéine Src a été détectée à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-Src MAb 327 et un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à l'Alexa 488® (Molecular Probes). La protéine APR04 a été détectée à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-APR04 purifié par affinité et un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué au Texas- Red® (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Les images ont été recueillies en utilisant des filtres d'excitation et d'émission appropriés. L'invention ainsi décrite et illustrée trouve une application dans le traitement et/ou la prévention d'états ayant pour cause et/ou pour facteurs de développement une prolifération, une différenciation et/ ou une transformation cellulaires, tandis que lesdits états sont corrélés avec une augmentation de l'activité tyrosine kinase des protéines Src de l'organisme affecté ou susceptible d'être affecté par un tel état.
La composition pharmaceutique selon l'invention est dénuée de toxicité pour l'homme et les animaux à sang chaud, étant donné que la protéine APR04 est présente dans leurs organismes sous forme endogène. Les préconisations de modes d'administration, de quantités à administrer et de doses unitaires peuvent être définies dans chaque cas d'espèce par l'homme du métier, sur la base de ses connaissances propres et d'éventuels essais de routine. Elles dépendent de l'état du patient et des autres paramètres habituellement pris en compte pour celui-ci en médecine. H convient de noter ici que la quantité administrée peut être d'autant mieux adaptée au traitement ou à la prévention recherchés que la substance active des compositions pharmaceutiques selon l'invention présente un effet thérapeutique dose-dépendant.
BIBLIOGRAPHIE
1. Thomas, S.M. & Brugge, J.S. Cellular functions regulated by Src family kinases. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 13, 513-609 (1997).
2. Ren, R., Mayer, B.J., Cicchetti, P. & Baltimore, D. Identification of a 10- amino acid proline-rich SH3 binding site. Science 259, 1157-1161 (1993).
3. Kay, B.K., Williamson, M.P. & Sudol, M. The importance of being proline: the interaction of proline-rich motifs in signalling proteins with their cognate domains. FASEB J. 14, 231-241 (2000).
4. Alema, S., Cassalbore, P., Agostini, E. & Tato, F. Differentiation of PC12 pheochromocytoma cells induced by v-src oncogene. Nature 316, 557-559 (1985).
5. Muto, M., Yoshimura, M., Okayama, M. & Kaji, A. Cellular transformation and differentiation. Effect of Rous sarcoma virus transformation on sulfated proteoglycan synthesis by chicken chondrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 4173-4177 (1977).
6. Hunter, T. & Sefton, B.M. Transforming gène product of Rous sarcoma virus phosphorylates tyrosine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 1311-1315 (1980).
7. Schlessinger, J. New rôles for Src kinases in control of cell survival and angiogenesis. Cell 100, 293-296 (2000).
8. Cooper, J.A. & Howell, B. The when and how of Src régulation. Cell 73, 1051-1054 (1993).
9. Bradbury, A., Possenti, R., Shooter, E.M. & Tirone, F. Molecular cloning of PC3, a putatively secreted protein whose mRNA is induced by nerve growth factor and depolarization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3353-3357 (1991). 10. Rouault, J-P. et al. BTG1, a member of a new family of antiproliferative gènes. EMBO J. 11, 1663-1670 (1992).
11. Rouault, J-P. et al. Identification of BTG2, an antiproliferative p53- dependent component of the DNA damage cellular response pathway. Nat Genêt. 14, 482-486 (1996).
12. Matsuda, S. et al. Tob, a novel protein that interacts with pl85ex"°^, is associated with antiproliferative activity. Oncogene 12, 705-713 (1996).
13. Guéhenneux, F. et al. Cloning of the mouse BTG3 gène and définition of a new gène family (the BTG family) involved in the négative control of the cell cycle. Leukemia 11, 370-375 (1997).
14. Yoshida, Y. et al. ANA, a novel member of Tob/BTGl family, is expressed in the ventricular zone of the developing central nervous system. Oncogene 16, 2687-2693 (1998).
15. Ikematsu, N. et al. Tob2, a novel anti-proliferative Tob/BTGl family member, associâtes with a component of the CCR4 transcriptional regulatory complex capable of binding cyclin-dependent kinases. Oncogene 18, 7432-7441 (1999).
16. Buanne, P. et al. Cloning of PC3B, a novel member of the PC3/BTG/TOB family of growth inhibitory gènes, highly expressed in the olfactory epithelium. Genomics 68, 253-263 (2000).
17. Matsuda, S., Rouault, J-P., Magaud, J-P. & Berthet, C. In search of a function for the TIS21/PC3/BTG1/TOB family. FEBS Lett. 497, 67-72 (2001).
18. Montagnoli, A., Guardavaccaro, D., Starace, G. & Tirone, F. Overexpression of the nerve growth factor-inducible PC3 immédiate early gène associated to inhibition of cell prolifération. Cell Growth Differ. 7, 1327-1336 (1996). 19. Yoshida, Y. et al. Négative régulation of BMP/Smad signaling by Tob in osteoblasts. Cell 103, 1085-1097 (2000).
20. Guardavaccaro, D. et al. Arrest of G-j-S progression by the p53-inducible gène PC3 is Rb dépendent and relies on the inhibition of cyclin Dl transcription. Mol. Cell. Biol. 20, 1797-1815 (2000).
21. Wilson, L.K., Luttrell, D.K., Parsons, J.T. & Parsons, S.J. pp60c'src tyrosine kinase, myristylation, and modulatory domains are required for enhanced mitogenic responsiveness to epidermal growth factor seen in cells overexpressing c-src. Mol. Cell. Biol. 9, 1536-1544 (1989).
22. Liu, J-J. et al. Ras transformation results in an elevated level of cyclin Dl and accélération of G^ progression in NIH 3T3 cells. Mol. Cell. Biol. 15, 3654-3663 (1995).
23. Greene, L.A. & Tischler, A.S. Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 2424-2428 (1976).
24. Qui, M.S. & Green, S.H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and conséquent prolonged ERK activity. Neuron 9, 705-717 (1992).
25. Li, S., Couet, J. & Lisanti, M.P. Src tyrosine kinases, Galpha subunits, and H-Ras share a common membrane-anchored scaffolding protein, caveolin. Caveolin binding negatively régulâtes the auto-activation of Src tyrosine kinases. J. Biol. Chem. 271, 29182-29190 (1996).
26. Chang, B.Y., Conroy, K.B., Machleder, E.M. & Cartwright, C.A. RACKl, a receptor for activated C kinase and a homolog of the beta subunit of G proteins, inhibits activity of src tyrosine kinases and growth of NIH 3T3 cells. Mol. Cell. Biol. 18, 3245-3256 (1998). 27. Seo, M.S., Lee, M.S. & Lim, I.K. Expression of rat BTG3 Sene' Rbtg3, is regulatedby redox changes. Gène 240, 165-173 (1999).
28. Biscardi, J.S, Tice, D.A. «Se Parsons, S.J. (1999) C-Src, receptor tyrosine kinases, and human cancer. Adv. Cancer tes. 76 : 61-119 (1999).
29. Roodman, G.D. Cell biology of the osteoclast. Exp. Hematol. 17 : 1229- 1241 (1999).
30. Soriano, P., Montgomery, C, Geske, R. & Bradley, A. Targeted disruption of the c-src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. Cell 64 : 693-702 (1991).
31. Lowe, C, Yomeda, T., Boyce, B.F., Chen, H., Mundy, G.R. & Soriano, P. Osteopetrosis in Src-deficient mice is due to an autonomous defect of osteoclasts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 4485-4489 (1993).
32. Manolagas, S.C. Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. Endocr. Rev. 21 : 115-137 (2000).
33. Senger, D.R., Galli, S.J., Dvorak, A.M., Perruzzi, C.A., Harvey, V.S. & Dvorak, H.F. Tumor cells secrète a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science 219 : 983-985 (1983).
34. Paul, R., Zhang, Z.G., Eliceiri, B.P., Jiang, Q., Boccia, A.D., Zhang, R.L., Chopp, M. & Cheresh, D.A. Src deficiency or blockade of Src activity in mice providés cérébral protection following stroke. Nature Medicine 7 : 222-227 (2001).
35. Anderson, L.M., Swaminathan, S., Zackon, L, Tajuddin, A.K., Tliimmapaya, B. & Weitzman, S.A. Adenovirus-mediated tissue-targeted expression of the HSVtk gène for the treatment of breast cancer. Gène Ther. 6 : 854-864 (1999). 36. Ray, M.K., Fagan, S.P., Moldovan, S., DeMayo, FJ. & Brunicardi, F.C. Development of a transgenic mouse model using rat insulin promoter to drive the expression of CRE recombinase in a tissue-specific manner. Int. J. Pancreatol. 25 : 157-163 (1999).
37. Dematteo, R.P., McClane, S.J., Fisher, K., Yeh, H., Chu, G., Burke, C. & Râper, S.E. Engineering tissue-specific expression of a recombinant adenovirus : sélective transgene transcription in the pancréas using the amylase promoter. /. Sur g. Res. 72 : 155-161 (1997).
38. Dusetti, N.J., Vasseur, S., Ortiz, E.M., Romeo, H., Dagorn, J.C, Burrone, O. & Iovanna, J.L. The pancreatitis-associated protein I promoter allows targeting to the pancréas of a foreign gène, whose expression is up- regulated during pancreatic inflammation. /. Biol. Chem. 272 : 5800-5804 (1997).
39. Fichere, A., Michelassi, F. & Arenas, R.B. Sélective expression of carcinoembryonic antigen promoter in cancer cell lines : targeting strategy for gène therapy in colorectal cancer. Dis. Colon Rectum 41 : 747- 754 (1998).
40. Hernandez-Alcoceba, R., Pihalja, M., Nunez,. G. & Clarke, M.F. Evaluation of a new dual-specificity promoter for sélective induction of apoptosis in breast cancer cells. Cancer Gène Ther. 8 : 298-307 (2001).
41. Lowman, H.B. Bacteriophage display and discovery of peptide leads for drug development. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 : 401-424 (1997).
42. Johnsson, N. & Varshavsky, A. Split ubiquitin as a sensor of proteins interactions in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 10340-10344 (1994).
43. Schatzlein, A.G. Non-viral vectors in cancer gène therapy : principles and progress. Anti-cancer Drugs 12 : 275-304 (2001). 44. Broome, M.A. & Hunter, T. Requirement for c-src catalytic activity and the SH3 domain in platelet-derived growth factor BB and epidermal growth factor mitogenic signaling. /. Biol. Chem. 271, 16798-16806 (1996).
45. Lee, R.J. et al. pp60v_src induction of cyclin Dl requires collaborative interactions between the extracellular signal-regulated kinase, p38, and Jun kinase pathways. /. Biol. Chem. 274, 7341-7350 (1999).

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique utile pour induire une modification conformationnelle des protéines Src, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un matériel biologique comprenant une région C- terminale riche en proline, éventuellement dans un support pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit matériel biologique est une protéine et/ ou une fraction protéique ayant une région C-terminale riche en proline.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit matériel biologique comprenant une région C-terminale riche en proline est la protéine APR04.
4. Composition pharmaceutique selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite protéine et/ ou fraction protéique est présente dans ladite composition en une quantité thérapeutiquement efficace pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase des protéines Src.
5. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 2 à 4, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline est d'origine naturelle.
6. Composition pharmaceutique selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C- terminal riche en proline est choisie dans le groupe des protéines ou fractions protéiques provenant d'extraits de plantes, de levures, de tissus ou sécrétions d'origine animale, de cultures cellulaires et de milieux de fermentation microbienne.
7. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique ayant un domaine C-terminal riche en proline est obtenue par synthèse à partir de cellules hôtes, d'origine animale ou provenant d'insectes, de bactéries ou de levure transformées, produisant de façon stable par génie génétique la protéine APR04 ou un analogue de la protéine APR04 recombinante.
8. Composition pharmaceutique selon la revendication 7, caractérisée en ce que ladite protéine ou fraction protéique obtenue par synthèse, ayant un domaine C-terminal riche en proline est présente en une quantité thérapeutiquement efficace pour la régulation négative de l'activité tyrosine kinase des protéines Src.
9. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte des peptides qui miment l'interaction APR04-Src, synthétisés chimiquement à partir de la séquence protéique C-terminale de la protéine APR04.
10. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle comporte des molécules, avantageusement des molécules peptidiques, qui miment l'interaction APR04-Src, lesdites molécules étant choisies parmi des molécules synthétisées chimiquement à partir d'une séquence C-terminale riche en proline, et des molécules produites par recombinaison à l'aide d'un vecteur d'expression protéique contenant la séquence codant pour le domaine C-terminal de la protéine APR04 ou de ses analogues, et exprimée dans différents systèmes d'expression, notamment dans des bactéries, des levures et des insectes.
11. Composition pharmaceutique selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite molécule peptidique contient, en outre, des acides aminés de type D modifiés, notamment choisis parmi la β-alanine, la diiodotyrosine, l'ornithine, l'hydroxyproline et la β-naphtyl-alanine.
12. Utilisation d'un matériel biologique ayant une région C-terminale riche en proline, notamment la protéine APR04 et/ ou un analogue de la protéine APR04 recombinante, pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour procurer aux animaux à sang chaud, y compris l'homme, une sous-régulation de l'activité de l'enzyme tyrosine kinase Src.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite protéine ayant une région C-terminale riche en proline est la protéine APR04.
14. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13 pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour induire une modification conformationnelle des protéines Src.
15. Utilisation selon l'une des revendications 12 ou 13 pour la préparation d'une composition pharmaceutique apte à s'associer aux deux domaines SH2 et SH3 des protéines Src.
16. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 12 à 15 pour le traitement et/ou la prévention des affections choisies parmi les cancers, l'ostéoporose, les maladies osseuses dérivées de l'ostéoporose, et les ischémies cérébrales et myocardiques.
17. Construction vecteur pour l'inhibition de l'activité tyrosine kinase de la protéine Src, ladite construction vecteur comportant un matériel viral, ne présentant pas de caractère pathogène ou inactivé, d'un type choisi parmi les rétrovirus recombinants, les adénovirus, les virus adéno-associés et les lentivirus, et contenant soit la totalité de la séquence codant pour la protéine APR04, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues.
8. Construction ou produit de construction plasmidique pour le traitement d'un tissu, ladite construction contenant soit la totalité de la séquence codant pour la protéine APR04 ou ses analogues, soit la partie C-terminale codant pour le domaine riche en résidus proline de la protéine APR04 ou de ses analogues, de préférence sous contrôle d'un promoteur spécifique du tissu à traiter.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998012204A1 (fr) * 1996-09-18 1998-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Genes 2 et 3 de translocation de lymphocytes b humains

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998012204A1 (fr) * 1996-09-18 1998-03-26 Human Genome Sciences, Inc. Genes 2 et 3 de translocation de lymphocytes b humains

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.-S. LEE ET AL.: "Salp-alpha and Salp-beta, growth-arresting homologs of Sam68.", GENE, vol. 240, 1999, AMSTERDAM, NL, pages 133 - 147, XP002202856 *
S. MATSUDA ET AL.: "In search of a function for the TIS21/PC3/BTG1/TOB family.", FEBS LETTERS, vol. 497, no. 2,3, 25 May 2001 (2001-05-25), AMSTERDAM, NL, pages 67 - 72, XP002202854 *
T. SUZUKI ET AL.: "A serine/threonine kinase p90rsk1 phosphorylates the anti-proliferative protein Tob.", GENES TO CELLS, vol. 6, no. 2, February 2001 (2001-02-01), OXFORD, GB, pages 131 - 138, XP002202855 *

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