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WO2002040507A2 - Nouveaux composes pour des applications a la radioimmunoscintigraphie et/ou a la radioimmunotherapie des cancers - Google Patents

Nouveaux composes pour des applications a la radioimmunoscintigraphie et/ou a la radioimmunotherapie des cancers Download PDF

Info

Publication number
WO2002040507A2
WO2002040507A2 PCT/FR2001/003616 FR0103616W WO0240507A2 WO 2002040507 A2 WO2002040507 A2 WO 2002040507A2 FR 0103616 W FR0103616 W FR 0103616W WO 0240507 A2 WO0240507 A2 WO 0240507A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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group
formula
integer
compound
represent
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/003616
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English (en)
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WO2002040507A3 (fr
Inventor
Laurence Morandeau
Patricia Remaud
Alain Faivre-Chauvet
Jean-François GESTIN
Original Assignee
Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) filed Critical Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale)
Publication of WO2002040507A2 publication Critical patent/WO2002040507A2/fr
Publication of WO2002040507A3 publication Critical patent/WO2002040507A3/fr

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    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
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    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
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    • C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
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    • C07K5/022—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -X-C(=O)-(C)n-N-C-C(=O)-Y-; X and Y being heteroatoms; n being 1 or 2
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    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala

Definitions

  • the subject of the invention is new compounds which can be used in the field of radioimmunoscintigraphy, radioimmunotherapy, in particular cancers, the treatment of radioactive waste, the assay or purification of radionuclides and metals, as well as the methods of preparation of these compounds.
  • the objective of radioimmunotherapy is to destroy malignant target cells through the use of a radionuclide associated with an antibody.
  • Two main techniques are used: the first known as one time, uses a radiolabelled antibody as a therapeutic agent. However, this technique poses significant non-specific fixation problems, particularly in the liver and kidneys.
  • the second called in two stages (1 "2) (AES system) overcomes these non-specific fixation problems: it consists first of injecting a bispecific antibody, then after a period of two to three days (necessary to elimination of unbound antibodies), an immunospecific molecule (bivalent heteropeptide), vector of the radionuclide ( Figure 1).
  • bivalent heteropeptide diffuses rapidly towards the tumor target and the proportion of the radiolabelled heteropeptide unbound is quickly eliminated from the body.
  • diDTPA-TL Diagram 1 radiolabeled with 1 " 31 I or with nl In. This the latter, however, does not allow the coupling of a bifunctional chelating agent (BCA) complexing other radionuclides.
  • BCA bifunctional chelating agent
  • Peptide 740 has two HSGL motifs, responsible for the recognition properties vis-à-vis the bispecific antibody F6-679, linked together by a tyrosine and a Gly-Gly-Gly side chain.
  • the presence of the two HSGL motifs makes it possible to establish a bridge between two antibodies previously fixed on the tumor and gives the system better stability of the radioimmunoconjugate on the target tumor cell.
  • the aromatic nucleus of tyrosine authorizes direct radiolabelling at 131 I and possibly at P 211 At.
  • the present invention follows from the discovery by the Inventors of the fact that it is possible to obtain new stable compounds comprising both a bivalent heteropeptide of the HSGL type, and one or more BCAs capable of complexing radionuclides (advantageously of large sizes), if the BCA (s) in question are separated by a cycle, in particular by the phenyl cycle in the case of the peptide 740 and its derivative AG 8-0 mentioned above.
  • One of the aims of the present invention is to provide new compounds for radiotherapy, or in vitro diagnosis of pathologies such as cancer, in particular by radioimmunoscmtigraphy, or treatment of radioactive waste, or assay or purification of radionuclides or metals.
  • TJ represents a group comprising at least one chelating agent capable of fixing at least one radionuclide
  • U ' represents a group comprising at least one chelating agent as defined above , identical or different from the aforementioned group U, and R is as defined above,
  • - Y represents a metabolizable link in the liver or in the kidneys, such as - (CH 2 -SS-CH 2 ) -, - (CH 2 -O-CH 2 ) -, - (CH 2 ) n -, n being an integer between 1 and
  • - R represents NH, NHCS, NHCOCH 2 , or an NHCO-W-CO group in which W represents - (CH 2 ) p , p being an integer between 1 and 12, or W represents a group Y as defined above -above,
  • - A represents a ring, aromatic or not, optionally substituted, in particular by one or two hydroxyl groups, comprising approximately 5 to approximately 10 carbon atoms in the ring, and, where appropriate approximately 1 to 2 nitrogen atoms, and / or sulfur, and / or oxygen in the ring, such as a phenyl, furan, thiophene, pyrrole, naphthalene, quinoline, pyrimidine, or quinolaxine group,
  • n t and n 2 independently of one another, represent 0, or an integer between 1 and 6,
  • V 2! independently of each other, represent CO, ⁇ H, ⁇ H-CO, or CO- H,
  • L. and L 2 identical or different, represent a motif, in particular a heteropeptide or peptide sequence, capable of specifically recognizing determined antibodies, and of which the proximal part, namely that located near V] or V 2 respectively, is, where appropriate, substituted by a group of formula
  • U- (B) b - (Y) a -RA- (CH 2 ) m - in which U, B, b, Y, R, A, a, and m are as defined above, provided that when k represents 0, at least one of L ⁇ or L 2 , is substituted by a group mentioned above of formula U- (B) b - (Y) a -RA- (CH 2 ) m -.
  • U in the above compounds represents a group comprising at least one chelating agent capable of fixing at least one radionuclide chosen from the following: 213 Bi, 225 Ac, 2U At, 153 Sm, 186 Re, 18S Re, 90 Y , 167 Ho, I77 Lu, 99m Tc, __n, 131 I.
  • the compounds defined above are characterized in that U represents a group comprising at least one chelating agent chosen from the following families of compounds:
  • - rigid macrocyclic chelating agents such as polyaza polyaminocarboxylic and / or polyaminophosphonic compounds, said compounds being chosen in particular from those described in A. Ouadi, and A Loussouarn (7)
  • - linear chelating agents such as polyaminocarboxylic compounds and / or polyaminophosphonic compounds, said compounds being chosen in particular from those described in
  • - or semi-rigid chelating agents such as the compounds derived from trans-1,2-cyclohexane polyaminocarboxylic and / or polyamino phosphonic, said compounds being chosen in particular from those described in the international application
  • R u represents NH, NHCS, NHCOCH 2 ,
  • Z3 and Z independently of each other, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3, - Ri, R2, R3 and R4, independently of each other, represent - COOH, or
  • n5 represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • R5 represents -COOH, or -PO (OH) 2
  • Y represents H or a group - (CH 2 ) ng -Rg in which ng represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • Rg represents
  • R ⁇ , R2, R3 or R4 representing of; preferably a group of formula:
  • R u represents NH, NHCS, NHCOCH 2.
  • mji, m2, and m n independently of one another, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3,
  • - Ri independently of one another, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3, - Ri, and R n , independently of one another, represent -COOH, or -PO (OH) 2, or a group of formula:
  • n5 represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • R5 represents -COOH, or -PO (OH) 2
  • Y represents H or a group - (CH-) ng- Rg in which ng represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • Rg represents
  • - Xi represents an integer from 3 to 12, preferably from 4 to 6.
  • the invention more particularly relates to compounds as defined above, characterized in that U represents a group of formula:
  • - W represents a group - (CH 2 ) z2 -R 2 , in which z 2 and R 2 are as defined below, or a group of formula
  • - z, z 2 , Z3, Z4, Z5, and zg independently of each other, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3,
  • R 2 , R3, R 4 , R s , and Rg independently of each other, represent
  • n represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • R7 represents -COOH, or -PO (OH)
  • Y represents H or a group - (CH 2 ) ng-Rg in which ng represents an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3
  • Rg represents
  • R ⁇ R 2 , R3,, R $, or Rg preferably representing a group of formula: (CH 2 ) n 7 -R 7
  • .- a ⁇ and a 2 independently of one another, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3,
  • . b 0 or 1
  • B represents a group of formula:
  • the invention more particularly relates to compounds as defined above, characterized in that U represents a group of formula:
  • R_ is as defined above.
  • the invention relates more particularly to the above-mentioned compounds, characterized in that U represents a group of formula: in which 1 ⁇ is as defined above.
  • the invention also relates to the above-mentioned compounds, characterized in that U represents a group of formula: -R u -C 6 H 4 - (CH 2 ) bl -CH- (CH 2 ) b2 -U 2
  • b, and b 2 independently of one another, represent an integer from 1 to 5, preferably from 1 to 3,
  • U, and U 2 independently of one another, represent a chelating agent as defined above.
  • a more particular subject of the invention is the compounds as defined above, characterized in that A represents a phenyl group.
  • the invention also relates to the compounds as defined above, characterized in that L : and L 2 are chosen from motifs, in particular heteropeptide or peptide sequences, capable of specifically recognizing determined antibodies. By way of illustration, such patterns are described in Morel A. M and
  • Delaage M. A (l ⁇ ) and in Morel AM, Darmon M., and Delaage MA ( ⁇ ) .
  • L. and L 2 are chosen from the molecules of general formula (L) below:
  • - X represents NH, CO, NH-CO, or CO-NH
  • R b represents an alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, such as an ethyl group
  • a -CONH 2 group .
  • the invention relates more particularly to the compounds as defined above, of general formula (EL) below:
  • the compounds defined above of the present invention are such that L1 and L2 represent the tetrapeptide HSGL, namely a group of formula:
  • the invention more particularly relates to the compounds as defined above, of formula
  • R, and U are as defined above.
  • the compounds defined above of the invention are such that R represents -CS-NH-, and R-, in the definition of U represents -NH-.
  • the invention also relates to the compounds as defined above, corresponding to the following formula:
  • the invention more particularly relates to the following compounds:
  • the subject of the invention is also the complexes between a compound as defined above, and a radioactive element (also designated above and below radionuclide).
  • a radioactive element also designated above and below radionuclide.
  • the radionuclide is linked, in particular by ionic bonds, to at least one chelating agent of group U defined above, in particular with the COOH and / or PO (OH) 2 groups and the nitrogen atoms of said group U, in the above complexes.
  • the aforementioned radionuclides are more particularly the radiometric transmitters ⁇ , ⁇ or ⁇ , preferably from the group of actinides or lanthanides.
  • a more particular subject of the invention is the use of a compound as defined above, for:
  • medicaments for radiotherapy and more particularly radioimmunotherapy, or for radioimmunoscmtigraphy, in particular in the context of the treatment of cancers, or of the treatment or prevention against metastatic proliferation,
  • coated solid phases in order to purify or select antibodies from a bank or a reaction mixture (coated tubes, magnetic beads, etc.),
  • the invention also relates to the methods for treating radioactive waste, said methods comprising a step of bringing a compound of the invention as defined above into contact with a medium containing radioactive waste.
  • the radioactive elements constituting the waste of the medium in question are chelated by the chelating agent (s) of the group or groups U defined above, the medium is then purified on a column making it possible to separate the compounds according to their molar mass.
  • the invention also relates to the methods for assaying or purifying radionuclides or metals, said methods being carried out in the same manner as in the case of the preceding method.
  • the purification is in this case carried out using a column comprising antibodies directed against the above-mentioned patterns L1 and L2 of the compounds used defined above.
  • the radionuclides or metals present in the medium bind to the compounds of the invention, then are retained on the aforementioned column, which makes it possible to separate them from the other constituents of the medium and to purify and / or quantify them.
  • a more particular subject of the invention is the use of a complex as defined above, for:
  • the complexes used for the preparation of a medicament are those comprising one or more radionuclides chosen from the following: 2l3 Bi, 225 Ac, 2 ⁇ At, 153 Sm, 18ô Re, ls8 Re, 90 Y, 167 Ho, 177 Lu , 99m Tc, In, 131 I.
  • the complexes used for the diagnosis are those comprising one or more radionuclides chosen from the following: 99m Tc, lu In, 131 I.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising at least one complex as defined above, in combination with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions which are particularly preferred in the context of the present invention are presented in forms which can be administered intravenously or intraperitoneally, preferably in an amount of from about 0.1 mg to about 1 mg.
  • the invention also relates to any composition comprising at least one complex as defined above, in association with bispecific antibodies, namely antibodies which specifically recognize, on the one hand, the organs or tissues or cells to be treated using said compound. , and on the other hand, the patterns L1 and L2 of said complex, as a combination product for simultaneous use or spread over time in the context of the treatment of the pathologies defined above, or of imaging, in particular by immunoscintigraphy.
  • a more particular subject of the invention is any composition as defined above, characterized in that the bispecific antibodies are chosen from the Ac F6 anti anti embryonic adenocarcino antibodies, coupled to the Ac 679 anti HSGL antibodies, these antibodies being described in particular in K BOSSLET and A. STEINSTRAESSER (15) .
  • the dosage of bispecific antibodies in said compositions is approximately 50 to 100 mg per injection in the context of the treatment of the abovementioned pathologies, and approximately 1 mg per injection in the context of the in vivo diagnosis of said pathologies.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the implementation of a method of treatment by radiotherapy, or of diagnosis, or of treatment of radioactive waste, or of assay or purification of radionuclides or of metals, defined below. - above, characterized in that it comprises: - at least one compound or complex as defined above,
  • bispecific antibodies as defined above.
  • the invention will be further illustrated with the aid of the following detailed description of the synthesis of the compounds of the invention, and of the evaluation of their immunospecific properties.
  • Z protective group of ainate function such as: tBoc (tertiobutoxycarbonyl), Z (benzyloxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), phthalimido.
  • the liquid phase synthesis method makes it possible to obtain large quantities of heteropeptides compared to synthesis on a solid support.
  • the first step in this work was to synthesize in sufficient liquid the HSGL motif 8) .
  • heteropeptide 740 is formed from the association of two HSGL motifs via a binding agent, the inventors have sought to redefine the very nature of this agent in order to be able to introduce indirect labeling properties. This involves having a function authorizing the coupling of any bifunctional chelating agent (BCA).
  • BCA bifunctional chelating agent
  • the inventors have developed the synthesis of several binding agents capable of coupling two HSGL motifs and having a masked aromatic amine function for the coupling of BCA.
  • the pKa of the aromatic amine different from that of histamine makes it possible to avoid any reactivity with histamine functions during coupling reactions with BCA.
  • HSGL was carried out on ethyl glycinate in order to select the best candidate.
  • a heteropeptide hapten was finally synthesized. It has been successfully subjected to an evaluation of the recognition properties with respect to the specific antibody 679
  • the first step in this synthesis is the esterification of N ⁇ (Z) Lysine.
  • Compound 2 ethyl N- (Boc) glycylN ⁇ (Z) lysinate
  • the amine function of compound 2 protected by the Boc group is released in a strong acid medium (CF 3 CO 2 H).
  • compound 3bis is synthesized; it results from the nucleophilic addition of the rhistamine amine to the carbonyl of succinic anhydride.
  • Compound 4 is obtained after activation of compound 3 bis by paranitrophenol then coupling with compound 3.
  • Cleavage of the group Z of compound 4 is carried out by catalytic hydrogenation (H 2 , Pd / C).
  • Compound 5bis is obtained after saponification of the ester function and then acidification.
  • n 1 to 6
  • V -CO 2 H and / or -NH 2 .
  • the original heteropeptide 740 is immunospecific for antibody 679. Competition tests make it possible to compare the affinity of a synthesized heteropeptide, with respect to the reference antibody, to that of the original heteropeptide.
  • the heteropeptide synthesized has shown excellent conservation of the recognition properties with respect to the antibody 679 (FIG. 2). 3- Indirect labeling of the synthesized heteropeptide
  • heteropeptide 11 after transformation of the terminal amino function into isothiocyanate, was coupled with 4-aminobenzyidiethylenetriaminepentaacetic acid, radiolabeled with m In and purified on a Sep-Pa column.
  • Identical tests carried out with heteropeptide 740 on the same series of coated tubes lead to a calculated immunoreactivity of 80%.
  • the indirect labeling of the synthesized heteropeptide therefore retains immunoreactivity with respect to the antibody 679.
  • the thiophosgene (15.3 mg, 133 ⁇ moles) is diluted in 1 ml of chloroform.
  • Compound 11 (14 mg, 13.3 ⁇ moles) dissolved in 1 ml of 0.5M HCl is added slowly, with vigorous stirring to the organic phase. The reaction continues overnight at room temperature. The aqueous phase is washed several times with 2 ml of chloroform.
  • Compound 12 is stored in the 0.5M HCl solution.
  • Isothiocyanate 12 is dissolved in 1 ml of anhydrous DMF, the solution is placed under a stream of nitrogen. At the same time, BzDTPA is dissolved in 3 ml of
  • the radioimmunoconjugate obtained is then deposited on two tubes coated with antibody 679. After one hour of incubation at 37 ° C, the radioactivity is measured (T). The tubes are then washed to remove the radioimmunoconjugate which is not attached to the antibody. The radioactivity after washing is again measured (B).
  • the LM085 peptide corresponds to compound 11.
  • BCA j and BCA 2 are identical or different and correspond to a group U as defined above.
  • the steps of the process shown above are the following:
  • the first step in this synthesis is the esterification of paranitrophenylalanine by the action of HClg in MeOH.
  • the compound 13 obtained is treated with gaseous ammonia to yield amidel4; the latter is then reduced by treatment with BH 3 / THF leading to diamine 15.
  • the amino functions are then protected by a Boc group (tertiobutoxycarbonyl).
  • the aromatic nitro function of the compound 16 obtained is reduced by catalytic hydrogenation in the presence of palladium on carbon.
  • the aromatic amine of compound 17 is protected by an Fmoc group (9-fluorenylmethoxycarbonyl).
  • Diamine 19 is obtained after treatment with 3M HCl and then basic washing.
  • Compound 20 results from successive couplings of different BCAs or simultaneous identical BCAs.
  • the aromatic amine of compound 21 is deprotected by treatment with diethyleneamine in DMF.
  • Isothiocyanate 22 is then formed by the action of thiophosgene on the aromatic amine.
  • the coupling of compound 22 and compound 11 in DMF in the presence of triethylamine makes it possible to obtain compound 23.
  • the steps of the process shown above are as follows:
  • the first step of this synthesis is the amide coupling of the N ⁇ (Boc) N (Z) Lysine and of the compound 25 (N 4 (Fmoc) 4-aminobenzylamine) .
  • the amine located in ⁇ is then deprotected with 3M HCl, then released from its salt by basic washes.
  • Compound 27 is then coupled with N (Boc) paranitrophenol glycinate to lead to compound 28.
  • the release of "the amino function of compound 28 protected by the Boc group is carried out in a strong acid medium (CF 3 CO 2 H).
  • compound 3bis is synthesized, it results from the nucleophilic addition of the amine of rhistamine to the carbonyl of succinic anhydride.
  • the amide coupling of compounds 3bis and 29 is carried out in the presence of DCC / NHS.
  • group Z of compound 30 results from a catalytic hydrogenation (H 2 , Pd / C) to lead to the production of compound 31 (HSGL 1 ) b - Synthesis of bivalent peptides 34 and 35
  • BCA ! , BCA 2 and BCA 3 are identical or different, and correspond to a group U as defined above.
  • the steps of the process schematized above are as follows:
  • the lateral aromatic amino functions of compound 35 are deprotected by treatment with diethylenamine in DMF.
  • the aromatic NO 2 function is hydrogenated in the presence of palladium on carbon; the aromatic amine obtained is coupled with the isothiocyanate of BCA 3 in order to obtain compound 37.
  • an aromatic amine as a coupling site on the heteropeptide presents a double advantage: it allows on the one hand the coupling with different activated functions (activated esters, anhydrides, isothiocyanates, isocyanates ...) present on BCA coupling candidates. It can also be easily transformed into isothiocyanate, a reactive function vis-à-vis primary aliphatic and aromatic amines optionally carried by the B.C.A.
  • the heteropeptide synthesized can either be coupled to a B.C.A previously activated, or activated in isothiocyanate and coupled to B.C.A.
  • the heteropeptide LM085 was coupled to p.isothiocyanatobenzylHEHA under the same conditions as above. Monitoring by analytical HPLC and then purification on a semi-preparative column enabled us to isolate the expected compound 15. IV - Results relating to a new heteropeptide, heteropeptide LM218 (compound 16).
  • Serum stability tests are based on the same principle as competition curves; it is a question here of verifying the preservation of the immunoreactivity over time of the heteropeptide to be tested, in serum medium, in comparison with the heteropeptide AG 8.1 or peptide 740. These tests are carried out in the same way in coated tubes. by antibody-679 and always using as a tracer a constant amount of heteropeptide AG 8.1 radiolabelled with iodine-125.
  • the heteropeptide LM218 was coupled to p.isothiocyanatobenzylDTPA, p.isothiocyanatobenzylTTHA and CHXA "DTPA.
  • the isothiocyanate of BCA is reacted with heteropeptide LM218 in anhydrous DMF in the presence of triethylamine.
  • . 17, 18 and 19 were purified by semi-preparative HPLC The synthesis of these compounds is shown below.:
  • Compound 13 is purified by semi-preparative HPLC on the same type of column.
  • Figure 2 Comparison of the displacement curves of peptide 740 and of the heteropeptide synthesized. The concentrations are indicated on the abscissa, and the radioactivities measured are indicated on the ordinate. The curve delimited by squares corresponds to that measured in the case of peptide 740, and that delimited by diamonds corresponds to that measured in the case of the heteropeptide synthesized.
  • FIG. 3 Tests of competition of the heteropeptides LM218 and AG 8.1 with respect to the antibody-679,
  • Figure 4 Serum stability tests of heteropeptide LM218 in comparison with heteropeptide AG 8.1.

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Abstract

La présente invention a pour objet des composés de formule générale (I), dans laquelle U représente un agent chélatant capable de fixer au moins un radionucléide, B représente un groupe de formule (II), Y représente un chaînon métabolisable dans le foie ou dans les reins, R représente NH, NHCS, NHCOCH2, ou un groupe NHCO-W-CO, A représente un cycle, aromatique ou non, le cas échéant substitué, X représente N ou CH, V1 et V2, représentent CO, NH, NH-CO, ou CO-NH, L1 et L2 représentent un motif, notamment un enchaînement hétéropeptidique, ou peptidique, capable de reconnaître spécifiquement des anticorps déterminés. L'invention concerne également l'utilisation d'un composé susmentionné ou d'un complexe entre ce composé et un radionucléide, pour la préparation d'un médicament pour la radiothérapie, le diagnostic de pathologies telles que les cancers, le traitement des déchets radioactifs, ou le dosage ou la purification de radionucléides ou de métaux.

Description

NOUVEAUX COMPOSES POUR DES APPLICATIONS A LA RADIOIMMUNOSCINTIGRAPHIE ET/OU A LA RADIOIMMUNOTHERAPIE DES CANCERS
L'invention a pour objet de nouveaux composés utilisables dans le domaine de la radioimmunoscintigraphie, de la radioimmunothérapie, notamment des cancers, du traitement des déchets radioactifs, du dosage ou de la purification des radionucléides et des métaux, ainsi que les procédés de préparation de ces composés.
L'objectif de la radioimmunothérapie (RIT) est de détruire des cellules cibles malignes grâce à l'utilisation d'un radionucléide associé à un anticorps. Deux principales techniques sont utilisées: la première dite en un temps, utilise comme agent thérapeutique un anticorps radiomarqué. Cette technique pose cependant des problèmes de fixation non-spécifique importants notamment au niveau du foie et des reins. La seconde dite en deux temps (1"2) (système A.E.S.) permet de palier ces problèmes de fixation non-spécifique : elle consiste dans un premier temps à injecter un anticorps bispécifique, puis après un délai de deux à trois jours (nécessaire à l'élimination des anticorps non fixés), une molécule immunospécifique (hétéropeptide bivalent), vectrice du radionucléide (figure 1). Du fait de sa petite taille, l'hétéropeptide bivalent diffuse rapidement vers la cible tumorale et la proportion de l'hétéropeptide radiomarqué non fixé est rapidement éliminée de l'organisme. Le système en deux temps a fait l'objet d'applications cliniques avec un hétéropeptide bivalent nommé diDTPA-TL (Schéma 1) radiomarqué par 1"31I ou par l'n lIn. Ce dernier ne permet cependant pas le couplage d'un agent chélatant bifonctionnel (BCA) complexant d'autres radionucléides.
Il est maintenant clairement démontré qu'un des paramètres fondamentaux qui va influencer l'efficacité de la RIT est le choix du radioélément (3). En effet, les données xadiobiologiques caractéristiques de chaque radionucléide comme le transfert d'énergie linéique et le parcours moyen dans la matière doivent être pris en compte de façon à délivrer une dose maximale dans la cible et minimale en dehors.
Figure imgf000004_0001
diDTPA -TL Schéma 1
Trois précédents brevets (4,5,6) décrivent le peptide 740 et son dérivé AG 8-0 (schémas 2 et 3) synthétisés sur support solide. Le peptide 740 comporte deux motifs HSGL, responsables des propriétés de' reconnaissance vis-à-vis de l'anticorps bispécifîque F6-679, reliés entre eux par une tyrosine et une chaîne latérale Gly-Gly- Gly. La présence des deux motifs HSGL permet d'établir un pont entre deux anticorps préalablement fixés sur la tumeur et confère au système une meilleure stabilité du radioimmunoconjugué sur la cellule cible tumorale . Le noyau aromatique de la tyrosine autorise un radiomarquage direct à l'131I et éventuellement à P211At.
Cependant, les Inventeurs ont mis en évidence que le couplage d'un BCA, complexant des radionucléides, sur la chaîne Gly-Gly-Gly entraîne une interaction non désirable entre l'histamitie et le BCA. En effet les pKa proches de l'aminé terminale de la glycine et de l'histamine ne permettent pas d'introduire une sélectivité de couplage. A ce jour, seuls le 188Re et le 99mTc ont pu être fixés sur le peptide AG 8-0 (schéma 3) avec une sélectivité de marquage non satisfaisante en ce qui concerne le 188Re, résultant en une instabilité in-vivo non négligeable.
Figure imgf000005_0001
Peptide 740 Peptide AG 8-0 Schéma 2 Schéma 3
La présente invention découle de la mise en évidence par les Inventeurs du fait qu'il est possible d'obtenir de nouveaux composés stables comportant à la fois un hétéropeptide bivalent du type HSGL, et un ou plusieurs BCA capables de complexer des radionucléides (avantageusement de grandes tailles), si le ou les BCA en question sont séparés par un cycle, notamment par le cycle phényle dans le cas du peptide 740 et de son dérivé AG 8-0 susmentionnés.
Un des buts de la présente invention est de fournir de nouveaux composés pour la radiothérapie, ou de diagnostic in vitro de pathologies telles que les cancers, notamment par radioimmunoscmtigraphie, ou de traitement des déchets radioactifs, ou de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux.
La présente invention a pour objet des composés de formule générale (I)
Figure imgf000005_0002
dans laquelle : - TJ représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant capable de fixer au moins un radionucléide,
- B représente un groupe de formule :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle b^, et b2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, U' représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant tel que défini ci-dessus, identique ou différent du groupe U susmentionné, et R est tel que défini ci-dessus,
- b représente 0 ou 1,
- Y représente un chaînon métabolisable dans le foie ou dans les reins, tel que -(CH2-S-S-CH2)-, -(CH2-O-CH2)-, -(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 1 et
12, -(CO-O)-,
- a représente 0 ou 1,
- R représente NH, NHCS, NHCOCH2, ou un groupe NHCO-W-CO dans lequel W représente -(CH2)p, p étant un nombre entier compris entre 1 et 12, ou W représente un groupe Y tel que défini ci-dessus,
- A représente un cycle, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment par un ou deux groupes hydroxyle, comprenant environ 5 à environ 10 atomes de carbone dans le cycle, et, le cas échéant environ 1 à 2 atomes d'azote, et/ou de soufre, et/ou d'oxygène dans le cycle, tel qu'un groupe phényle, furane, thiophène, pyrrole, naphtalène, quinoline, pyrimidine, ou quinolaxine,
- m représente 0, ou un nombre entier compris entre 1 et, 6,
- k représente 0 ou 1,
- X représente N ou CH lorsque k = 1, ou X représente NH ou CH2 lorsque k = 0,
- nt et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent 0, ou un nombre entier compris entre 1 et 6,
- N. et V2! indépendamment l'un de l'autre, représentent CO, ΝH, ΝH-CO, ou CO- H,
- L. et L2, identiques ou différents, représentent un motif, notamment un enchaînement hétéropeptidique, ou peptidique, capable de reconnaître spécifiquement des anticorps déterminés, et dont la partie proximale, à savoir celle située à proximité de V] ou de V2 respectivement, est, le cas échéant, substituée par un groupe de formule
U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-, dans lequel U, B, b, Y, R, A, a, et m sont tels que définis ci- dessus, sous réserve que lorsque k représente 0, l'un au moins de Lλ ou L2, est substitué par un groupe susmentionné de formule U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-.
L'invention a plus particulièrement pour objet des composés susmentionnés, de formule (Ibis) suivante :
^CH2)nl-VrL, U-(Y)a-R-A-(CH2)ra-X (Ibis)
Figure imgf000007_0001
dans laquelle U, Y, R, A, a, m, n-, n2, V,, N2, L. et L2 sont tels que définis ci- dessus. Avantageusement U dans les composés ci-dessus, représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant capable de fixer au moins un radionucléide choisi parmi les suivants : 213Bi, 225Ac, 2UAt, 153Sm, 186Re, 18SRe, 90Y, 167Ho, I77Lu, 99mTc, __n, 131I.
De préférence, les composés définis ci-dessus, sont caractérisés en ce que U représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant choisi parmi les familles de composés suivants :
- les agents chélatants macrocycliques rigides, tels que les composés polyaza polyaminocarboxyliques et/ou polyaminophosphoniques, lesdits composés étant notamment choisis parmi ceux décrits dans A. Ouadi, et A Loussouarn (7), - les agents chélatants linéaires, tels que les composé polyaminocarboxyliques et/ou polyaminophosphoniques, lesdits composés étant choisis notamment parmi ceux décrits dans
- ou les agents chélatants semi-rigides, tels que les composés dérivés du trans- 1,2-cyclohexane polyaminocarboxylique et/ou polyamino phosphonique, lesdits composés étant notamment choisis parmi ceux décrits dans la demande internationale
WO 00/24751, ou dans la demande de brevet européen n° 98 402648.4,
- ou les salens du type Ν2S2, lesdits composés étant notamment choisis parmi ceux décrits dans TISATO F. et MAZZI U. J. (9), COULAIS Y. et GROS G. (10), COULAIS Y. et GROS G. (11), ADELAERE B. m, ADELAERE B. et GUEMAS J.P. (13), CHARBONNEL-JOBIC G. et GUE AS J.P. (U).
Des composés particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000008_0001
dans laquelle :
- Ru représente NH, NHCS, NHCOCH2,
- z\, %2, Z3 et Z , indépendamment les uns des autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, - Ri , R2, R3 et R4, indépendamment les uns des autres, représentent —COOH, ou
-PO(OH)2, ou un groupe de formule :
(CH2)n5-R5
V Y ... dans laquelle n5 représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R5 représente -COOH, ou -PO(OH)2, et Y représente H ou un groupe -(CH2)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2, l'un au moins de R\, R2, R3 ou R4 représentant de ; préférence un groupe de formule:
(CH2)n5- 5
Y tel que défini ci-dessus. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000009_0001
dans laquelle Ru est tel que défini ci-dessus.
D'autres corûpOSés particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000009_0002
dans laquelle :
- Ru représente NH, NHCS, NHCOCH2.
- mo, mji , m2, et mn, indépendamment les uns les autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
- a^ et an, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, - Ri, et Rn, indépendamment l'un de l'autre, représentent -COOH, ou -PO(OH)2, ou un groupe de formule :
(CH2)r-5-R5
-N / S Y dans laquelle n5 représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R5 représente -COOH, ou -PO(OH)2, et Y représente H ou un groupe -(CH-)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2,
- Xi, représente un nombre entier de 3 à 12, de préférence de 4 à 6.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000010_0001
dans laquelle Ru est tel que défini ci-dessus.
D'autres composés encore particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention sont caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle :
- R„ représente NH, NHCS, NHCOCH25
- W représente un groupe -(CH2)z2-R2, dans lequel z2 et R2 sont tels que définis ci- après, ou un groupe de formule
Figure imgf000011_0002
dans lequel Z5, zg, R5, et Re sont tels que définis ci-après,
- z , z2, Z3, Z4, Z5, et zg, indépendamment les uns des autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
- R , R2, R3, R4, Rs, et Rg, indépendamment les uns des autres, représentent
-COOH, ou -PO(OH)2, ou un groupe de formule : (CH2)n7-R7
-N χ
Y dans laquelle n représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R7 représente -COOH, ou -PO(OH) , et Y représente H ou un groupe -(CH2)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2, l'un au moins de R^ R2, R3, , R$, ou Rg représentant de préférence un groupe de formule: (CH2)n7-R7
- / Y tel que défini ci-dessus, .- a^ et a2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
. b représente 0 ou 1, . B représente un groupe de formule :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle bi, et b2> indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, U' représente un agent chélatant tel que défini ci- dessus, et R est tel que défini ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet des composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000012_0002
dans laquelle R_, est tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement, les composés susmentionnés caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000013_0001
dans laquelle 1^ est tel que défini ci-dessus.
L'invention concerne également les composés susmentionnés caractérisés en ce que U représente un groupe de formule : -Ru-C6H4-(CH2)bl-CH-(CH2)b2-U2
dans laquelle b , et b2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, „ est tel que défini ci-dessus, et U, et U2, identiques ou différents, représentent un agent chélatant tel que défini ci-dessus.
L'invention a plus particulièrement pour objet les composés tels que définis ci- dessus, caractérisés en ce que A représente un groupe phényle.
L'invention concerne également les composés tels que définis ci-dessus, caractérisés en que L: et L2 sont choisis parmi les motifs, notamment les enchaînements hétéropeptidiques, ou peptidiques, capables de reconnaître spécifiquement des anticorps déterminés. A titre d'illustration, de tels motifs sont décrits dans Morel A. M et
Delaage M. A (lδ), et dans Morel A.M, Darmon M., et Delaage M.A (π).
L'invention a plus particulièrement pour objet les composés tels que définis ci- dessus, caractérisés en que L. et L2 sont choisis parmi les molécules de formule générale (L) suivante :
Figure imgf000013_0002
dans laquelle :
- X, représente NH, CO, NH-CO, ou CO-NH,
- X2 représente un groupe CHRg, dans lequel R. représente :
. un groupe -COORb dans lequel Rb représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, tel qu'un groupe éthyle,
. un groupe -CONH2, . un groupe -NHZ dans lequel Z représente un groupement protecteur des fonctions aminés, tel qu'un groupement tertiobutyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, ou acétamide,
. ou un groupe de formule U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-NH-CO-, dans lequel U, B, b, Y, R, A, a, et m sont tels que définis ci-dessus.
L'invention concerne plus particulièrement les composés tels que définis ci- dessus, de formule générale (EL) suivante :
(O^VrXrX^C-^^ ^
U-R-C6H4-(CH2)m-X
(C---^VrXr_X^<C^ \
dans laquelle U, R, m, X, nl5 n2, V^ et V2, Xt et X2 sont tels que définis ci-dessus. A ce titre, l'invention concerne plus particulièrement les composés tels que définis ci-dessus, caractérisés par les formules suivantes :
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Ç yOuNiMHi-122 π H _ J L — -O
Figure imgf000016_0002
dans lesquelles n^ n2, m, X, R, et U sont tels que définis ci-dessus, et Z représente un groupe protecteur des fonctions aminés tel que défini ci-dessus. Avantageusement, les composés définis ci-dessus de la présente invention sont tels que Ll et L2 représentent le tétrapeptide HSGL, à savoir un groupe de formule :
_- NH -NH-CHRa-(CH2)4-NH-CO-CH2-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)2 /
^ N dans laquelle J^ représente un groupe -CONH-, ou -COOC2H5. L'invention a plus particulièrement pour objet les composés tels que définis ci- dessus de formule
Figure imgf000017_0001
dans laquelle R, et U sont tels que définis ci-dessus.
Des composés particulièrement préférés de l'invention sont ceux pour lesquels R^ représente un groupe -CONH2 dans la définition susmentionnée de Ll et L2.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les composés tels que définis ci-dessus, de formule
Figure imgf000017_0002
dans laquelle R, et U sont tels que définis ci-dessus. Avantageusement les composés définis ci-dessus de l'invention sont tels que R représente -CS-NH-, et R-, dans la définition de U représente -NH-.
Des composés particulièrement préférés dans le cadre de la présente invention, sont les suivants :
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
L'invention concerne également les composés tels que définis ci-dessus, répondant à la formule suivante :
Figure imgf000021_0001
dans laquelle Uls U2, et U3, identiques ou différents, correspondent à un groupe U tel que défini ci-dessus.
L'invention a également pour objet les composés de formule (I) définie ci-dessus, et répondant à la formule suivante :
Figure imgf000021_0002
dans laquelle ~ et L2 sont tels que définis c -dessus, et U, et U2, identiques ou différents, correspondent à un groupe U défini ci-dessus. A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les composés de formule suivante :
Figure imgf000022_0001
dans laquelle U, et U2 sont tels que définis ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet les composés suivants :
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000023_0002
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000024_0001
L'invention a également pour objet les complexes entre un composé tel que défini ci-dessus, et un élément radioactif (encore désigné ci-dessus et ci-après radionucléide). Avantageusement, le radionucléide est lié, notamment par liaisons ioniques, à au moins un agent chélatant du groupe U défini ci-dessus, notamment avec les groupes COOH et/ou PO(OH)2 et les atomes d'azote dudit groupe U, dans les complexes susmentionnés.
Les radionucléides susmentionnés sont plus particulièrement les radiométaux émetteurs α, β ou γ, de préférence du groupe des actinides ou des lanthanides.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un composé tel que défini ci-dessus, pour :
- la préparation de complexes avec des radionucléides, tels que définis ci-dessus, utilisables :
. en tant que médicaments pour la radiothérapie, et plus particulièrement la radioimmunothérapie, ou pour la radioimmunoscmtigraphie, notamment dans le cadre du traitement de cancers, ou du traitement ou de la prévention contre la prolifération métastatique,
. ou pour la mise en œuvre de méthodes de diagnostic in vivo ou in vitro de pathologies telles que les cancers, notamment par ra 'oimmunoscintigraphie, - la mise en œuvre d'une méthode de traitement des déchets radioactifs,
- la mise en œuvre d'une méthode de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux,
- la préparation de phases solides revêtues afin de purifier ou sélectionner des anticorps à partir d'une banque ou d'un mélange réactiormel (tubes revêtus, billes aimantées....),
- la préparation de phases solides revêtues pour tests d'immunoréactivité (tubes revêtus...),
- la vectorisation d'un principe actif dans un milieu biologique, ou au travers d'une membrane biologique.
L'invention concerne également les méthodes de traitement des déchets radioactifs, lesdites méthodes comprenant une étape de mise en présence d'un composé de l'invention tel que défini ci-dessus, avec un milieu contenant des déchets radioactifs. Les éléments radioactifs constituant les déchets du milieu en question, sont chélatés par le ou les agents chélatants du ou des groupes U définis ci-dessus, le milieu est ensuite purifié sur une colonne permettant de séparer les composés en fonction de leur masse molaire.
L'invention concerne également les méthodes de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux, lesdites méthodes étant effectuées de la même manière que dans le cas de la méthode précédente. Avantageusement, la purification est dans ce cas effectuée à l'aide d'une colonne comportant des anticorps dirigés contre les motifs Ll et L2 susmentionnés des composés utilisés définis ci-dessus. Les radionucléides ou métaux présents dans le milieu se lient aux composés de l'invention, puis sont retenus sur la colonne susmentionnée, ce qui permet de les séparer des autres constituants du milieu et de les purifier et/ou quantifier.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation d'un complexe tel que défini ci-dessus, pour :
- la préparation d'un médicament pour la radiothérapie, et plus particulièrement la radioimmunothérapie, ou pour la radioimmunoscintigraphie, notamment dans le cadre du traitement de cancers, ou du traitement ou de la prévention contre la prolifération métastatique,
- la mise en œuvre d'une méthode, de diagnostic in vivo ou in vitro de pathologies telles que les cancers, notamment par radioimmunoscintigraphie. Avantageusement les complexes utilisés pour la préparation d'un médicament, sont ceux comprenant un ou plusieurs radionucléides choisis parmi les suivants : 2l3Bi, 225Ac, 2πAt, 153Sm, 18ôRe, ls8Re, 90Y, 167Ho, 177Lu, 99mTc, In, 131I.
Avantageusement encore, les complexes utilisés pour le diagnostic, sont ceux comprenant un ou plusieurs radionucléides choisis parmi les suivants : 99mTc, luIn, 131I.
L'invention concerne également les compositions pharmaceutiques comprenant au moins un complexe tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Des compositions pharmaceutiques particulièrement préférées dans le cadre de la présente invention, se présentent sous des formes administrables par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, de préférence à raison d'environ 0,1 mg à environ 1 mg.
L'invention concerne également toute composition comprenant au moins un complexe tel que défini ci-dessus, en association avec des anticorps bispécifiques, à savoir des anticorps reconnaissant spécifiquement d'une part les organes ou tissus ou cellules à traiter à l'aide dudit composé, et d'autre part, les motifs Ll et L2 dudit complexe, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée ou étalée dans le temps dans le cadre du traitement des pathologies définies ci-dessus, ou de l'imagerie, notamment par immunoscintigraphie.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute composition telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que les anticorps bispécifiques sont choisis parmi les anticorps Ac F6 anti adénocarcino embryonnaire, couplés aux anticorps Ac 679 anti HSGL, ces anticorps étant décrits notamment dans K. BOSSLET et A. STEINSTRAESSER (15). Avantageusement, la posologie en anticorps bispécifiques dans lesdites compositions est d'environ 50 à 100 mg par injection dans le cadre du traitement des pathologies susmentionnées, et d'environ 1 mg par injection dans le cadre du diagnostic in vivo desdites pathologies.
Parmi les cancers susceptibles d'être traités dans le cadre de la présente invention, on peut citer plus particulièrement le cancer du poumon à petites cellules, myélomes multiples, lymphomes, cancers hématologiques. L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement par radiothérapie, ou de diagnostic, ou de traitement des déchets radioactifs, ou de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux, définies ci- dessus, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un composé ou complexe tel que défini ci-dessus,
- et, le cas échéant, des anticorps bispécifiques tels que définis ci-dessus. L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la synthèse des composés de l'invention, et de l'évaluation de leurs propriétés immunospécifiques.
I) SYNTHESE DE L'HETEROPEPTIDE 740 FORME DE L'ASSOCIATION DE DEUX MOTIFS HSGL
HSGL :
Figure imgf000027_0001
Z = groupe protecteur de fonction a iné tel que : tBoc (tertiobutoxycarbonyl), Z (benzyloxycarbonyl), Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl), phtalimido.
METHODE
La méthode de synthèse en phase liquide permet d'obtenir des quantités importantes d'hétéropeptides comparée à la synthèse sur support solide. La première étape de ce travail a été de synthétiser en phase liquide le motif HSGL 8) en quantité suffisante. L'hétéropeptide 740 étant formé de l'association de deux motifs HSGL par l'intermédiaire d'un agent de liaison, les inventeurs ont cherché à redéfinir la nature même de cet agent afin de pouvoir introduire des propriétés de marquage indirect. Il s'agit de disposer d'une fonction autorisant le couplage de n'importe quel agent chélatant bifonctionnel (BCA).
Les inventeurs ont mis au point la synthèse de plusieurs agents de liaison capables de coupler deux motifs HSGL et présentant une fonction aminé aromatique masquée en vue du couplage de BCA. Le pKa de l'aminé aromatique différent de celui de l'histamine permet d'éviter toute réactivité avec les fonctions histamine lors des réactions de couplage avec le BCA. La mise au point des couplages des deux chaînons
HSGL a été réalisée sur le glycinate d'éthyle afin de sélectionner le meilleur candidat.
Un haptène hétéropeptidique a finalement été synthétisé. Il a été soumis avec succès à une évaluation des propriétés de reconnaissance vis à vis de l'anticorps spécifique 679
(tests d'immunoréactivité, tests de compétition vis à vis du peptide commercial 740). La dernière étape a consisté à radiomarquer cet hétéropeptide avec différents radionucléides après couplage du BCA correspondant.
RESULTATS
1- Description des voies de synthèse
1-1- Synthèse du motif HSGL
La première étape de cette synthèse est l'estérification de la Nα(Z)Lysine. Le composé 2 (N-(Boc)glycylNα(Z) lysinate d'éthyle) est obtenu par couplage amidique du composé 1 et du NQBoc) glycinate de paranitrophénol. La libération de la fonction aminé du composé 2 protégée par le groupement Boc est réalisée en milieu acide fort (CF3CO2H). Parallèlement, le composé 3bis est synthétisé; il résulte de l'addition nucléophile de l'aminé de rhistamine sur le carbonyle de l'anhydride succinique. Le composé 4 est obtenu après activation du composé 3 bis par le paranitrophénol puis couplage avec le composé 3. Le clivage du groupement Z du composé 4 est réalisé par hydrogénation catalytique (H2, Pd/C). Le composé 5bis est obtenu après saponification de la fonction ester puis acidification.
Figure imgf000029_0001
1-2- Synthèse de l'hétéropeptide bivalent à partir de l'acide N'(Fmoc- paraminobenzylamino)-N,N-diacétique.
Une hydrogénation catalytique (H2, Pd/C) . à pression atmosphérique de l'hydrochlorure de la paranitrobenzylamine nous conduit à la diamine 6 (Rdt= 97.5%). La dialkylation par le bromoacetate d'éthyle a lieu préferentiellement sur l'aminé aliphatique du fait de son caractère plus nucléophile (Rdt≈ 60%). Le composé 8 résulte de la saponification du diester par de la soude 2M (Rdt= 100%). L'aminé aromatique est alors protégée par un groupement Fmoc (Rdt= 60%). Le couplage des deux motifs HSGLNH2 a lieu simultanément après activation des fonctions acide par le carbonyldiimidazole (Rdt= 63%). Le groupement Fmoc est ensuite clivé par traitement avec de la diéthylamine (Rdt= 91%). L'isothiocyanate de l'hétéropeptide bivalent est enfin obtenu après traitement par du thiophosgène (Rdt= 100%).
Cette synthèse permet d'obtenir l'hétéropeptide bivalent répondant à nos critères avec un rendement global de synthèse de 20%.
Figure imgf000030_0001
Le composé 9 peut se présenter sous la formule générale suivante :
Figure imgf000031_0001
n= 1 à 6
X = N ou CH m = 0 à 6
V = -CO2H et/ou -NH2.
P = Fonction a iné protégée.
2- Evaluation des propriétés i munospécifiques de l'hétéropeptide synthétisé.
Principe : L'hétéropeptide 740 original est immunospécifique de l'anticorps 679. Les tests de compétition permettent de comparer l'affinité d'un hétéropeptide synthétisé, vis à vis de l'anticorps de référence, à celle de l'hétéropeptide original.
Ces tests de compétition consistent à mettre en présence dans une série de tubes revêtus par l'anticorps 679 une quantité constante de l'hétéropeptide 740 radiomarqué par l'Iode 125 et une quantité croissante d'hétéropeptide à tester (c). Après une heure d'incubation à 37°C, la radioactivité de chaque tube est mesurée (T); les tubes sont ensuite lavés afin d'éliminer l'excès d'hétéropeptide radioactif ou non, non-fixé à l'anticorps. La radioactivité de chaque tube est à nouveau mesurée (B). Le tracé des courbes B/T = f (loge) permet d'en déduire la constante d'affinité apparente de chacun des hétéropeptides vis-à-vis de l'anticorps 679.
L'hétéropeptide synthétisé a montré une excellente conservation des propriétés de reconnaissance vis à vis de l'anticorps 679 (figure 2). 3- Marquage indirect de l'hétéropeptide synthétisé
A titre d'exemple, l'hétéropeptide 11, après transformation de la fonction aminé terminale en isothiocyanate, a été couplé avec l'acide 4- aminobenzyidiéthylènetriaminepentaacétique, radiomarqué par de l'mIn et purifié sur une colonne Sep-Pa . Le radioimmunoconjugué obtenu a ensuite été déposé sur un tube revêtu par l'anticorps 679. Après une heure d'incubation à 37°C, la radioactivité a été mesurée (T). Le surnageant a été ensuite éliminé. La radioactivité fixée sur le tube a été à nouveau mesurée (B). Pour ce radioimmunoconjugué, Pimmunoréactivité calculée est égale à 75% ((B/T)x 100=75.6%). Des tests identiques effectués avec l'hétéropeptide 740 sur la même série de tubes revêtus conduisent à une immunoréactivité calculée de 80%.
Le marquage indirect de l'hétéropeptide synthétisé conserve donc l 'immunoréactivité vis-à-vis de l'anticorps 679.
CONCLUSION
Ce travail permet de disposer d'un outil thérapeutique adaptable au niveau du radionucléide utilisé et donc de l'agent chélatant, ce qui élargit considérablement le champ d'applications de la radioimmunothérapie en deux temps.
Grâce à ce nouvel hétéropeptide synthétisé, l'πιI utilisé classiquement peut être remplacé par un radionucléide émetteur α ou β possédant des caractéristiques radiobiologiques plus appropriées au type de cible tumorale. ' De plus, la possibilité d'introduire un chaînon métabolisable entre le BCA et l'hétéropeptide devrait permettre de majorer les index thérapeutiques par rapport aux techniques existantes. II) PARTIE EXPERIMENTALE DETAILLEE 1) synthèse du composé 13 de formule
Figure imgf000033_0001
a) Synthèse de Phydrochlorure de la 4-aminobenzylamme 6.
Figure imgf000033_0002
L'hydrochlorure de la paranitrobenzylamine (1.1 g, 5.8 mmoles) est dissous dans 15 ml de méthanol; le palladium sur charbon à 5% (110 mg, O.léq. en masse) est ajouté à la solution. Le milieu réactionnel est laissé 3 heures sous atmosphère d'hydrogène à pression atmosphérique. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur papier pour éliminer le Pd/C, le filtre est rincé par du méthanol (400 ml). Le filtrat est évaporé et le composé 6 est obtenu sous forme d'une poudre jaune (masse obtenue = 900 mg).
Résultats relatifs au composé 6:
^Formule brute: C7HπN2Cl *MM = 158.6 g-mol"1 *Rdt = 97.5%
*RMN'H (DMSO): 3,8 (s, 2H, H-5), 5,3 (s, 2H, H-l), 6,6 (d, 2H, H-4, 3JHH= 8,3Hz), 7,1 (d, 2H, H-3, 3JHH= 8,3Hz), 8,3 (s, 3H. H-l). b) Synthèse de la 4-amraofoenzyl_ιit_.iIo-N,N-diacétate d'éthyle 7 :
Figure imgf000034_0001
Le composé 6 (420 mg, 2.65 mmoles), N-^CO, (1.13 g, 10.6 mmoles), Kl (441 mg, 2.65 mmoles) sont placés dans 20 ml d'acétonitrile fraîchement distillé sous courant d'azote à 60- 65°C pendant une heure. Le bromoacetate d'éthyle (665 mg, 3.97 mmoles) est alors ajouté au mélange réactionnel. La réaction est maintenue à 65°C pendant 2 heures. Après refroidissement, les sels sont filtrés. Le filtrat est évaporé, repris dans du chloroforme et lavé 2 fois par de l'eau. Une colonne de silice est ensuite réalisée en AcOEt/CHCl3 (1/1). Le composé 7 est obtenu sous la forme d'une huile jaune (masse obtenue = 469 mg)
Résultats relatifs au composé 7
*Formule brute: Cι5H22N2O4 *MM = 294 g-mol"1 *Rdt = 60% *Rf = 0.45 (AcOEt 1/CHC13 1)
*RMNΗ (CDClg): 1,2 (t, 3H, H-l, V ^lHz), 3,5 (s, 4H, H-3), 3,77 (s, 2H, H-4), 4,1 (q, 2H, H-2, 3JHH=7,lHz), 6,6 (d, 2H, H-6, 3JHH=8,5HZ), 7,1 (d, 2H, H-5, 3JHH=8,5Hz). c) Synthèse du sel sodique de l'acide 4-aminobenzylnitriIo-N,N-diacétique 8 :
Figure imgf000034_0002
Le composé 7 (476 mg, 1.6 mmoles) est solubilisé dans un minimum d'éthanol; la soude 2M (3.2 ml, 3.2 mmoles) est ajoutée. Le mélange réactionnel est porté à 35°C pendant lh30 mn, sans bouchon afin de laisser s'évaporer l'éthanol. La soude est ensuite évaporée, le résidu est repris par de l'acétone et évaporé; cette opération est répétée plusieurs fois jusqu'à obtention d'une poudre orange pâle (masse obtenue = 452 mg).
Résultats relatifs au composé 8:
*Formule brute: C, ,H12N2O4Na3 *MM ≈ 280 g.mol"1 *Rdt = 100%
* RMNΗ (D2O): 3,12 (s, 4H, H-l), 3,65 (s, 2H, H-2), 6,8 (d, 2H, H-4, 3JHH=8,3HZ), 7,16 (d, 2H, H-3, 3JHH=8,3Hz). d) Synthèse de l'acide N4(Fmoc)4-aminobenzyMtri_.o-N',N'-diacétiq-ιe 9:
1
Figure imgf000035_0001
Le composé 8 (1.57 g, 5.6 mmoles) est dissous dans 15 ml de Na2CO3 10% et 10 ml de dioxanne. La solution est placée à 0°C. Le chloroformate de 9-fluorenylméthyle (1.5 g, 5.6 mmoles) est ajouté par petites portions. La réaction est maintenue 4 heures à 0°C puis une nuit à température ambiante. Après évaporation des solvants, le résidu est repris dans 15 ml d'eau et acidifié à pH 0-1 par HC1 6M. Le composé 9 précipite; il est filtré, rincé par de l'eau et séché.1.55 g ont été obtenus sous forme d'une poudre blanche.
Résultats relatifs au composé 9 :
^Formule brute: C26H24N2O6 *MM = 460.7 g.mol"1 *Rdt = 60%
* RMNΗ (MeOD): 3,7 (s, 4H, H-2), 4,17 (t, 1H, H-8, 3JHH=6.7HZ), 4,21 (s, 2H, H-3), 4,4 (d, 2H, H-7, 3JHH=6,7HZ), 7,2 (m, 8H, H-9,10,11,12), 7,59 (d, 2H, H-5, 3JHH=6,9HZ), 7,70 (d, 2H, H-4, 3JHH=6,9Hz). e) Synthèse du N4(Fmoc)4-ammobenzylnitrilodi- i NαacétylNε[histaminosuccinylglycyl]lysinate d'éthyle } 10:
Figure imgf000035_0002
Le composé 9 (1.04 g, 2.26 mmoles) est solubilisé dans 5 ml de DMF anhydre, sous courant d'azote. Le CDI (878 mg, 5.42 mmoles) est ajouté à la solution. Après arrêt de l'effervescence (5-10mn), l'histaminosuccinylglycyllysinate d'éthyle (2.3 g, 5.42 mmoles) dissous dans 5 ml de DMF est additionné. La réaction se poursuit une nuit à température ambiante. Après évaporation du DMF, le résidu est repris par de l'eau. Le composé 10 précipite sous la forme d'une pâte rose. La phase aqueuse surnageante est éliminée, puis le résidu est lavé plusieurs fois par de l'eau puis repris par de l'acétone. Après évaporation de l'acétone et séchage, le composé 10 est obtenu sous la forme d'une poudre blanche (masse obtenue = 1.8 g). Résultats relatifs au composé 10:
*Formule brute: C64Hg4N14O14 *MM = 1272 g.mol"1 *Rdt = 63%
* RMNΗ (MeOD): 1,1 (t, 6H, H-l 9, ^ = 7,02Hz), l,2àl,9 (m, 12H, H-13,14,15), 2,4 (m, 8H, H-7,8), 2,6 (t, 4H, H-4, ^≈ 7,02Hz), 3,06 (t, 4H, H- 12, 3JHH= 6,8HZ), 3,27 (t, 4H, H-5, 3JHH= 7,02Hz), 3,56 (s, 2H, H-22), 3,60 (s, 4H, H-21), 3,67 (s, 4H, H-10), 4,02 (q, 4H, H-l 8, 3JHH ≈ 7,02HZ), 4,15 (t, 1H, H-27, 3JHH= 6,5Hz), 4,24 (m, 2H, H-16), 4,35 (d, 2H, H-26, 3~ m≈ 6,5Hz), 6,72 (s, 2H, H-3), 7,13 à 7,33 (m, 8H, H-28,29,30,31), 7,49 (s, 2H, H-l), 7,57 (d, 2H, H-23, 3JHH= 7,22HZ), 7,70 (d, 2H, H-24, 3JHH= 7,23Hz). f) Synthèse du 4-aminobenzylnitriIodi- \ NαacétylNε[histaminosuccinylglycyl]Iysinate d'éthyle^ U :
Figure imgf000036_0001
Résultats relatifs au composé 11:
*Formule brute: C49H74N14O12 *MM = 1050 g.mol"1 *Rdt = 91%
* RMNΗ (MeOD): 1,1 (d.t, 6H, H-19, ^ 7,02Hz), 1,2 à 1,75 (m, 12H, H-13,14,15), 2,38 (m, 8H, H-7,8), 2,63 (t, 4H, H-4, 3Jm= 7,0Hz), 3,07 («t, 4H, H-12, 3JHH= 6,9Hz), 3,25 (t, 4H, H-5, 3JHH= 7,02Hz), 3,50 (s, 2H, H-22), 3,57 (s, 4H, H-21), 3,67 (s, 4H, H-10), 4,02 (d.q, 4H, H-l 8, 3JHH = 7,02Hz), 4,24 (m, 2H, H-16), 6,57 (d, 2H, H-23, 3Jm = 8,35Hz), 6,72 (s, 2H, H- 3), 6,97 (d, 2H, H-24, 3JHH= 8,35Hz), 7,48 (s, 2H, H-l). g) Synthèse de l'isothiocyanate du 4-aminobenzy!nitrilodi-[NαacétylNε (histammosuccinylglycyl)lysmate d'éthyle] 12 :
Figure imgf000037_0001
Le thiophosgène (15.3 mg, 133 μmoles) est dilué dans 1 ml de chloroforme. Le composé 11 (14 mg, 13.3 μmoles) solubilisé dans 1 ml de HC1 0.5M est ajouté lentement, sous vive agitation à la phase organique. La réaction se poursuit une nuit à température ambiante. La phase aqueuse est lavée plusieurs fois par 2 ml de chloroforme. Le composé 12 est conservé dans la solution de HC1 0.5M.
Résultats relatifs au composé 12:
^Formule brute: C50H72N14Oι2S *MM = 1092 g.mol"1 h) Couplage de l'isothiocyanate du 4-aminobenzylnitrilodi-[N acétylNε
(histaminosuccinylglycyl) lysinate d'éthyle] 12 et de l'acide 4- aminobenzyldiéthylènetriammepentaacétique : composé 13
L'acide 4-aminobenzyldiéthylènetriaminepentaacétique (28 mg, 56.8 μmoles) est solubilisé dans 1 ml d'eau; la solution est amenée à pH 6.5-7 par une solution de carbonate de sodium
0.2M puis évaporée à sec. L'isothiocyanate 12 est dissous dans 1ml de DMF anhydre, la solution est placée sous courant d'azote. Parallèlement, le BzDTPA est solubilisé dans 3 ml de
DMF anhydre puis ajouté lentement à la solution d'isothiocyanate. Après une nuit d'agitation à la température de 35°C, le DMF est évaporé. i) Radiomarquage à l' In du composé 13
A 22.8 μl d'une solution de InCl3 (10 μmol/ml) sont ajoutés 20 μl d'une solution de composé 13, (11.4 μmol ml) et 4 μl de solution tampon citrate/acétate (0.25M/1.5M - pH=5). Après 30 nui à 37°C, le mélange réactionnel est purifié sur colonne Sep-Pa Cl 8 .
Le radioimmunoconjugué obtenu est ensuite déposé sur deux tubes revêtus par l'anticorps 679. Après une heure d'incubation à 37°C, la radioactivité est mesurée (T). Les tubes sont ensuite lavés pour éliminer le radioimmunoconjugué non-fixé à l'anticorps. La radioactivité après lavage est à nouveau mesurée (B).
Résultats :
^=45248 cpm B!=34446 cpm T2=47674 cpm B,=35821 cpm
(B1/ T,)*100=76~l%
(B/ T)*100=75.6%
(B2/ T2)*100=75.1%
2-Couplage de deux B.C.A sur le peptide LM085
Le peptide LM085 correspond au composé 11.
Figure imgf000038_0001
B.C.Aj et B.C.A2 sont identiques ou différents et correspondent à un groupe U tel que défini ci-dessus.
En résumé, les étapes du procédé schématisé ci-dessus sont les suivantes : La première étape de cette synthèse est l' ester ification de la paranitrophénylalanine par action de HClg dans le MeOH. Le composé 13 obtenu est traité par de l'ammoniac gazeux pour conduire à l'amidel4 ; cette dernière est ensuite réduite par traitement en BH3/THF conduisant à la diamine 15. Les fonctions aminés sont ensuite protégées par un groupement Boc (tertiobutoxycarbonyl). La fonction nitro aromatique du composé 16 obtenu est réduite par hydrogénation catalytique en présence de palladium sur charbon. L'aminé aromatique du composé 17 est protégée par un groupement Fmoc (9-fluorenylmethoxycarbonyl). La diamine 19 est obtenue après traitement en HCl 3M puis lavage basique. Le composé 20 résulte des couplages successifs de différents B.C.A ou simultanés de B.C.A identiques. L'aminé aromatique du composé 21 est déprotégée par traitement avec de la diéthylèneamine dans le DMF. L'isothiocyanate 22 est ensuite formé par action du thiophosgène sur l'aminé aromatique. Le couplage du composé 22 et du composé 11 dans le DMF en présence de triéthylamine permet d'obtenir le composé 23.
Formule développée du composé 23 :
Figure imgf000039_0001
3 - Synthèse d'un peptide permettant à la fois le couplage « central » d'un B.CA et le couplage latéral de deux B.C.A. a - Synthèse du motif HSGL' (composé 31)
Figure imgf000040_0001
6 24 25
Figure imgf000040_0002
Figure imgf000040_0003
En résumé, les étapes du procédé schématisé ci-dessus sont les suivantes : La première étape de cette synthèse est le couplage amidique de la Nε(Boc)N (Z)Lysine et du composé 25 (N4(Fmoc)4-aminobenzylamine). L'aminé située en ε est ensuite déprotégée par HCl 3M, puis libérée de son sel par lavages basiques. Le composé 27 est alors couplé avec le N(Boc) glycinate de paranitrophénol pour conduire au composé 28. La libération de" la fonction aminé du composé 28 protégée par le groupement Boc est réalisée en milieu acide fort (CF3CO2H). Parallèlement, le composé 3bis est synthétisé; il résulte de l'addition nucléophile de l'aminé de rhistamine sur le carbonyle de l'anhydride succinique. Le couplage amidique des composés 3bis et 29 est réalisé en présence de DCC/NHS. Le clivage du groupement Z du composé 30 résulte d'une hydrogénation catalytique (H2, Pd/C) pour conduire à l'obtention du composé 31 (HSGL1). b - Synthèse des peptides bivalents 34 et 35
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
En résumé, les étapes du procédé schématisé ci-dessus sont les suivantes : La fonction acide de la paranitrophénylalanine est activée par le C.D.I (carbonydiimidazole) puis couplée avec la fonction aminé du composé 31 (HSGL'). La libération de la fonction aminé du composé 32 protégée par le groupement Boc est réalisée en milieu HC13M, l'aminé est libérée de son sel par lavages basiques. La fonction aminé du composé 33 obtenue est activée par le C.D.I puis, couplée avec la fonction a iné, soit du composé 5 pour conduire au composé 34, soit du composé 31 pour conduire au composé 35. c - Couplage de trois B.C.A sur le peptide bivalent 35
Figure imgf000043_0001
B.C.A!, B.C.A2 et B.C.A3 sont identiques ou différents, et correspondent à un groupe U tel que défini ci-dessus.
En résumé, les étapes du procédé schématisé ci-dessus sont les suivantes : Les fonctions aminés aromatiques latérales du composé 35 sont déprotégées par traitement avec la diéthylènamine dans le DMF. Le composé 36 est obtenu par couplage simultané des isothiocyanates de B.C.A! et B.C.A.- dans "le cas où B.C.A! = B.C.A.2 ou par couplages successifs dans le cas où B.C.Ai est différent de B.C.A.2. La fonction NO2 aromatique est hydrogénée en présence de palladium sur charbon ; l'aminé aromatique obtenue est couplée avec l'isothiocyanate du B.C.A3 pour conduire à l'obtention du composé 37.
III - Résultats relatifs à l'hétéropeptide LM085
III-l- Couplage de l'isothiocyanate du p.aminoBzDTPA sur l 'hétéropeptide LM085. Le composé 13 décrit précédemment a été obtenu par couplage de l'isothiocyanate de l'hétéropeptide 11 (composé 12) sur le p.aminoBzDTPA. Pour obtenir le composé 13, nous avons mis au point la réaction inverse, c'est-à-dire le couplage de l'isothiocyanate du p.aminoBzDTPA sur l'hétéropeptide 11.
L'introduction d'une aminé aromatique comme site de couplage sur l'hétéropeptide présente un double intérêt : elle autorise d'une part le couplage avec différentes fonctions activées (esters activés, anhydrides, isothiocyanates, isocyanates...) présentes sur des B.C.A candidats au couplage. Elle peut d'autre part être facilement transformée en isothiocyanate, fonction réactive vis-à-vis d'aminés aliphatiques et aromatiques primaires éventuellemnt portées par le B.C.A. Ainsi, l'hétéropeptide synthétisé peut être soit couplé à un B.C.A préalablement activé, soit activé en isothiocyanate et couplé au B.C.A,.
Par ailleurs des B.C.A de structures différentes ont également été couplés à l'hétéropeptide LM085.
III-2- Couplage de l'isothiocyanate du p.aminoB∑TTHA sur l'hétéropeptide LM085.
Figure imgf000044_0001
2 équivalents de l'isothiocyanate du 3-(p.aminobenzyl)TTHA sont mis à réagir avec l'hétéropeptide LM085 en présence de triéthylamine dans le DMF anhydre. La réaction est suivie par HPLC analytique. Après réaction totale de l'hétéropeptide LM085, le composé 14 est purifié par HPLC semi-préparative.
III-3- Couplaεe de l'isothiocyanate du p.aminoBzHEHA sur l'hétéropeptide LM085.
Figure imgf000045_0001
pjsothiocyanatobenzylHEHA
L'hétéropeptide LM085 a été couplé au p.isothiocyanatobenzylHEHA dans les mêmes conditions que précédemment. Le suivi par HPLC analytique puis la purification sur colonne semi-préparative nous ont permis d'isoler le composé 15 attendu. IV - Résultats relatifs à un nouvel hétéropeptide, l'hétéropeptide LM218 (composé 16).
IN-1 Synthèse de l'hétéropeptide LM218
La fonction acide de la lysine de l'hétéropeptide AG 8.1 (ou peptide 740) étant protégée par un groupement acétamido, nous avons réalisé Tamidification des fonctions esters d'éthyle du composé 10 afin de vérifier l'influence de ce groupe fonctionnel sur l'immunoréactivité et la stabilité en milieu sérique. L'amidification des fonctions esters par barbotage de ΝH3 (g) a également permis la déprotection de l'aminé aromatique pour obtenir le composé 16 (LM218) avec un rendement de 74 %.
Figure imgf000046_0001
IN-2- Tests de compétition des hétéropeptides LM218 et AG 8.1 vis-à-vis de l'anticorps-679.
Nous observons une excellente conservation de l'affinité de l'hétéropeptide LM218 par rapport à l'hétéropeptide AG 8.1 (= Peptide 740). (voir figure 3).
IV-3- Tests de stabilité sérique de l'hétéropeptide LM218 en comparaison avec l 'hétéropeptide AG 8.1.
Les tests de stabilité sérique reposent sur le même principe que les courbes de compétition ; il s'agit ici de vérifier la conservation de T immunoréactivité dans le temps de l'hétéropeptide à tester, en milieu sérique, en comparaison avec l'hétéropeptide AG 8.1 ou peptide 740. Ces tests sont réalisés de la même façon dans des tubes revêtus par l'anticorps-679 et en utilisant toujours comme traceur une quantité constante de l'hétéropeptide AG 8.1 radiomarqué à l'iode-125.
Des solutions à 50 pmoles/ml et 250 pmoles/ml de l'hétéropeptide à tester et de l'hétéropeptide AG 8.1 dans le sérum sont incubés à 37 °C. 200 μl de chacune (c'est à dire 10 et 50 pmoles) sont prélevées à différents temps (t = 0, 4 h, 24 h, 48 h, 96 ou 144 h) et mises en compétition avec le traceur dans les tubes revêtus par l'anticorps pendant une heure. La radioactivité des tubes est mesurée (T). Les tubes sont ensuite lavés pous éliminer l'excès de traceur et/ou d'hétéropeptide froid non-fixé. La radioactivité est à nouveau mesurée (B). Le tracé d'un graphique représentant l'évolution de B/T'en fonction du temps d'incubation des hétéropeptides à tester nous permet de comparer leur stabilité en milieu sérique. Pour une même concentration, l'augmentation dans le temps du % B/T (c'est à dire la quantité de traceur fixé sur les tubes) signifie que l'hétéropeptide froid perd une partie de son immunoréactivité par dégradation dans le sérum. Il devient donc de moins en moins compétitif vis-à-vis du traceur. Les tests de stabilité sérique concernant ce nouvel hétéropeptide LM218 (composé 16) ont montré que nous avons obtenu un nouvel hétéropeptide dont la stabilité en milieu sérique est comparable à celle de l'hétéropeptide de référence AG 8.1.
En effet seulement à t = 96 heures, on commence à observer une légère diminution de la stabilité de l'hétéropeptide LM218. (voir figure 4).
Nous sommes donc parvenus à synthétiser un nouvel hétéropeptide utilisable dans le cadre du système A.E.S, l'hétéropeptide LM218 (16) répondant aux critères que nous nous étions fixés
- voie de synthèse simple et rapide, offrant de bons rendements. - immunoréactivité vis-à-vis de l'anticorps-679 équivalente à celle de l'hétéropeptide
AG 8.1.
- conservation de l' immunoréactivité dans le sérum à 37°C.
- présence d'une fonction aminé aromatique autorisant le couplage de différents B.C.A. IV-4 Couplage des B. C.A sur V 'hétéropeptides LM218
L'hétéropeptide LM218 a été couplé au p.isothiocyanatobenzylDTPA, au p.isothiocyanatobenzylTTHA et au CHXA"DTPA. Pour chacun, l'isothiocyanate du B.C.A est mis à réagir avec l'hétéropeptide LM218 dans le DMF anhydre en présence de triéthylamine. Les composés.17, 18 et 19 obtenus ont été purifiés par HPLC semi-préparative. La synthèse de ces composés est représentée ci-après :
H H
Figure imgf000048_0001
V Partie expérimentale détaillée (suite)
N,N-(histaminosuccinyIglycylIysinamidyl-carboxyméthyl)-p.aminobenzylamme 16 :
Figure imgf000049_0001
Le composé 10 (70 mg, 55 μmoles) est solubilisé dans 5 ml de MeOH. Un barbotage de NH3(g) anhydre est effectué dans la solution sous agitation maintenue à 5°C par un bain de glace. La formation du composé 16 est suivie par analyse en spectrométrie de masse. L'opération de barbotage du NH3(g) est réitérée jusqu'à réaction totale du composé 10 de départ. Le mélange réactionnel est ensuite évaporé et repris dans 2 ml d'H2O. La phase aqueuse est lavée 5 fois par 5 ml de CHC13. La solution aqueuse est enfin concentrée et séchée sous vide pour donner une poudre jaune 16 (40 mg; 74 %). HPLC analytique : type de colonne : C18-SymmetryShield ; Solvant A : TFA / H20, 0,1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-5 min, 100% A ; 5-35 min, 100%-0% A ; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 14,3 mn ; λ = 211 nm.
RMN Η (MeOD) : δ = 1,17 à 1,82 (m, 12H) ; 2,50 (s, 8H) ; 2,74 (t, 4H, J=6,6Hz) ; 3,15 (t, 4H, J=6,6Hz) ; 3,34 (s, 4H) ; 3,39 (t, 4H, J=7,lHz) ; 3,58 (s, 2H) ; 3,79 (s, 4H) ; 4,13 (m, 2H) ; 6,74 (d, 2H, J=8,3Hz) ; 6,89 (s, 2H) ; 7,13 (d, 2H, J=8,3Hz) ; 7,69 (s, 2H).
SM (M+KT) : 993. LM085-BzDTPA 13 :
Figure imgf000050_0001
Voie 1 : Du thiophosgène (33 μl; 0,43 mmoles) est mis en solution dans 1ml de CHC13. Le composé 11 (LM085) (30mg; 0,29 μmoles) préalablement solubilisé dans 1ml de HCl 0,5 M est additionné lentement, sous vive agitation à la solution de thiophosgène dans le CHC13.
Après 6 heures de réaction, les phases sont séparées et la phase aqueuse est lavée deux fois par
' 2 ml de CHC13. Après évaporation et séchage de la phase aqueuse, l'isothiocyanate du composé 11 est obtenu sous forme d'une poudre blanche (31 mg; 0,28 μmoles) qui est solubilisée dans 1 ml de DMF anhydre et placée sous flux d'azote. Parallèllement, le p.aminoBzDTPA (28 mg; 0,57 μmoles) est solubilisé dans l'eau et amené à pH 6,5-7 par une solution de
Figure imgf000050_0002
0,2 M puis évaporée à sec. Le résidu est repris dans 3 ml de DMF et additioné à la solution d'isothiocyanate du composé 11. Après 16 heures de réaction à température ambiante, le DMF est évaporé et le résidu est 'analysé par HPLC analytique (Cl 8- SyrnmetrySbield) puis le composé 13 est isolé par HPLC semi-préparative. Voie 2 : Le composé 11 (LM085) (1,1 mg; 1 μmole), l'isothiocyanate du p.aminoBzDTPA (2.10-6 moles ; 1,3 mg) et la triéthylamine (1,4 μl 10 μmoles) sont mis en solution dans 1 ml de DMF anhydre sous atmosphère inerte. Après 12 heures de réaction à température ambiante, le DMF est évaporé et le résidu est analysé sur HPLC analytique (C18-SymmetryShield). Le composé 13 est purifié par HPLC semi-préparative sur le même type de colonne. HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-25 min, 100%-60% A; 25-26 min, 60%-0% A; 26-36 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 13,9 mn ; λ = 211 nm. SM CM+H4) : 1592.
LM085-3-(p.aminoBz)TTHA 14 :
Figure imgf000051_0001
Mode opératoire identique au composé 13 (voie 2) : composé 11 (1,1 mg; 1 μmole) isothiocyanate du .aminoBzTTHA (1,1 mg; 2 μmoles) triéthylamine (1,4 μl; 10 μmoles)
HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-25 min, 90%-67% A; 25-26 min, 67%-0% A; 26-36 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 13,9 mn ; λ = 211 nm.
SM (M+H+) : 1693 L 085-(p.aminoBz)HEHA 15
Figure imgf000052_0001
Mode opératoire identique au composé 13 (voie 2) : composé 11 (1 mg; 0,95 μmole) isothiocyanate du p.aminoBzHEHA (2,8 mg; 1,9 μmoles) triéthylamine (2,1 μl; 15,2 μmoles) HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-35 min, 90%-67% A; 35-36 min, 67%-0% A; 37-47 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 14,l mn ; λ = 211 nm.
SM (M+H+) : 1805 LM218-(p.aminoBz)DTPA 17 :
Figure imgf000053_0001
Mode opératoire identique au composé 13 (voie 2) : composé 16 (6 mg; 6,2 μmoles) isothiocyanate du p.aminoDTPA (8 mg; 12,4 μmoles) triéthylamine (5 μl; 37,2 μmoles) HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-5 min, 100% A; 5-30 min, 100%-0% A; 30-40 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 16,5 mn ; λ = 211 nm.
SM (M+ET> : 1534 LM218-3-(p.aminoBz)TTHA 18 :
Figure imgf000054_0001
Mode opératoire identique au composé 13 (voie 2) : composé 16 (5,1 mg; 5,2 μmoles) isothiocyanate du 3-p.aminoBzTTHA (8 mg; 10,4 μmoles) triéthylamine (5,7 μl; 41,6 μmoles) HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-5 min, 100% A; 5-30 min, 100%-0% A; 30-40 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention : 17,4 mn ; λ = 211 nm.
SM (M+B0 : 1635 LM218-CHXA"DTPA 19 :
Figure imgf000055_0001
Mode opératoire identique au composé 13 (voie 2 : composé 16 (5,7 mg; 6,7 μmoles) isothiocyanate du CHXA"DTPA (8,lmg; 11,5 μmoles) triéthylamine (4,8 μl; 11,5 μmoles) HPLC analytique : Solvant A : TFA / H2O, 0.1% ; solvant B : CH3CN ; gradient : 0-5 min, 100% A; 5-30 min, 100%-0% A; 30-40 min, 0% A; Débit : 1 mL/min. Temps de rétention :
Figure imgf000055_0002
SINKM+H ) : 1588 - 53 - LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Principe du système A.E.S.
Figure 2 : Comparaison des courbes de déplacement du peptide 740 et de l'hétéropeptide synthétisé. Les concentrations sont indiquées en abscisse, et les radioactivités mesurées sont indiquées en ordonnées. La courbe délimitée par des carrés correspond à celle mesurée dans le cas du peptide 740, et celle délimitée par des losanges correspond à celle mesurée dans le cas de l'hétéropeptide synthétisé.
Figure 3 : Tests de compétition des hétéropeptides LM218 et AG 8.1 vis-à-vis de Tanticorps- 679,
Figure 4 : Tests de stabilité sérique de l'hétéropeptide LM218 en comparaison avec l'hétéropeptide AG 8.1.
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Claims

RE V E N D I C A T I O N S
1. Composés de formule générale (I)
Figure imgf000058_0001
dans laquelle :
- U représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant capable de fixer au moins un radionucléide, - B représente un groupe de formule :
Figure imgf000058_0002
dans laquelle bj, et b2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, U' représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant tel que défini ci-dessus, identique ou différent du groupe U susmentionné, et R est tel que défini ci-après, - b représente 0 ou 1,
- Y représente un chaînon métabolisable dans le foie ou dans les reins, tel que -(CH2-S-S-CH2)-, -(CH2-O-CH2)-, -(CH2)n-, n étant un nombre entier compris entre 1 et 12, -(CO-O)-,
- a représente 0 ou 1 , - R représente NH, NHCS, NHCOCH2, ou un groupe NHCO-W-CO dans lequel
W représente -(CH2)p, p étant un nombre entier compris entre 1 et 12, ou W représente un groupe Y tel que défini ci-dessus,
- A représente un cycle, aromatique ou non, le cas échéant substitué, notamment par un ou deux groupes hydroxyle, comprenant environ 5 à environ 10 atomes de carbone dans le cycle, et, le cas échéant environ 1 à 2 atomes d'azote, et/ou de soufre, et/ou d'oxygène dans le cycle, tel qu'un groupe phényle, furane, thiophène, pyrrole, naphtalène, quinoline, pyrimidine, ou quinolaxine,
- m représente 0, ou un nombre entier compris entre 1 et 6,
- k représente 0 ou 1, - X représente N ou CH lorsque k = 1, ou X représente NH ou CH2 lorsque k = 0,
- n{ et n2, indépendamment l'un de l'autre, représentent 0, ou un nombre entier compris entre 1 et 6,
- V, et N2, indépendamment l'un de l'autre, représentent CO, ΝH, ΝH-CO, ou CO-ΝH,
- L[ et L2, identiques ou différents, représentent un motif, notamment un enchaînement hétéropeptidique, ou peptidique, capable de reconnaître spécifiquement des anticorps déterminés, et dont la partie proximale, à savoir celle située à proximité de V, ou de V2 respectivement, est, le cas échéant, substituée par un groupe de formule U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-, dans lequel U, B, b, Y, R, A, a, et m sont tels que définis ci- dessus, sous réserve que lorsque k représente 0, l'un au moins de L. ou L2, est substitué par un groupe susmentionné de formule U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-.
2. Composés selon la revendication 1, de formule (Ibis) suivante C 2)nl- U U-(Y)a-R-A-(CH2)m-X (Ibis)
(CH2)n2-V2-L2 dans laquelle U, Y, R, A, a, m, nls n2, Vls V2, L, et L2 sont tels que définis dans la revendication 1.
3. Composés selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que U représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant capable de fixer au moins un radionucléide choisi parmi les suivants : 213Bi, 225Ac, 211At, 153Sm, 186Re, 188Re, 90Y, 167Ho, 177LU, "Te, mIn.
4. Composés selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que U représente un groupe comprenant au moins un agent chélatant choisi parmi les familles de composés suivants :
- les agents chélatants macrocycliques rigides, tels que les composés polyaza polyaminocarboxyliques et/ou polyaminophosphoniques, ou - les agents chélatants linéaires, tels que les composé polyaminocarboxyliques et/ou polyaminophosphoniques,
- les agents chélatants semi-rigides, tels que les composés dérivés du trans-1,2- cyclohexane polyaminocarboxylique et/ou polyamino phosphonique, ou
- les salens du type Ν2S2.
5. Composés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000060_0001
dans laquelle :
- Ru représente NH, NHCS, NHCOCH2,
- z\, z2, Z3 et Z4, indépendamment les uns des autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, - Ri, R2, R3 et R4, indépendamment les uns des autres, représentent -COOH, ou
-PO(OH)2, ou un groupe de formule : (CH2)n5-R5
- - Y dans laquelle n5 représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R5 représente -COOH, ou -PO(OH)2, et Y représente H ou un groupe -(CH2)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2, l'un au moins de Rj, R2, R3 ou R4 représentant de . préférence un groupe de formule:
(CH2)n5-R5
-N
Y tel que défini ci-dessus.
6 Composés selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000061_0001
dans laquelle R,. est tel que défini dans la revendication 5.
7. Composés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000061_0002
dans laquelle :
- Ru représente NH, NHCS, NHCOCH2,
- ra.Q, j, m , et mn, indépendamment les uns des autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
- ai , et an, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
- R\, et Rn, indépendamment l'un de l'autre, représentent -COOH, ou -PO(OH)2, ou un groupe de formule :
(CH2)n5-R5
-N \
Y dans laquelle n5 représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R5 représente -COOH, ou -PO(OH)2, et Y représente H ou un groupe -(CH2)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2,
- X}, représente un nombre entier de 3 à 12, de préférence de 4 à 6.
8. Composés selon la revendication 7, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000062_0001
dans laquelle -^ est tel que défini dans la revendication 7.
9. Composés selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000062_0002
dans laquelle : - Ru représente NH, NHCS, NHCOCH2,
- W représente un groupe -(CH2)z2-R2, dans lequel z2 et R2 sont tels que définis ci- après, ou un groupe de formule
Figure imgf000063_0001
dans lequel Z5, zg, R5, et R6 sont tels que définis ci-après,
- z\, z2, Z3, Z4, Z5, et zg, indépendamment les uns des autres, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3,
- R}, R2, R3, R4, R5, et Rg, indépendamment les uns des autres, représentent
-COOH, ou -PO(OH)2, ou un groupe de formule : (CH2)n7-R7
-N ^
Y dans laquelle n7 représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, R7 représente -COOH, ou -PO(OH)2, et Y représente H ou un groupe -(CH2)ng-Rg dans lequel ng représente un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, et Rg représente
-COOH or -PO(OH)2, l'un au moins de R , R2, R3, R4, R5, ou Rg représentant de préférence un groupe de formule:
(CH2)n7-R7 -N
V Y tel que défini ci-dessus,
.- a\, et a2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, . b représente 0 ou 1,
. B représente un groupe de formule :
dans laquelle b , et b2, indépendamment l'un de l'autre, représentent un nombre entier de 1 à 5, de préférence de 1 à 3, U' représente un agent chélatant tel que défini ci- dessus ou dans l'une des revendications 1, 4 à 8, et R est tel que défini dans la revendication 1.
10. Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000064_0001
dans laquelle R„ est tel que défini dans la revendication 9.
11. Composés selon la revendication 9, caractérisés en ce que U représente un groupe de formule :
Figure imgf000064_0002
dans laquelle R,, est tel que défini dans la revendication 9.
13. Composés selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisés en que L, et L-, identiques ou différents, sont choisis parmi les molécules de formule générale (L) suivante :
Figure imgf000064_0003
dans laquelle :
- Xj représente NH, CO, NH-CO, ou CO-NH,
- X2 représente un groupe CHR,,, dans lequel R. représente
. un groupe -COORb dans lequel Rh représente un groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbone, tel qu'un groupe éthyle,
. un groupe -CONH2,
. un groupe -NHZ dans lequel Z représente un groupement protecteur des fonctions aminés, tel qu'un groupement tertiobutyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, ou acétamide,
. ou un groupe de formule U-(B)b-(Y)a-R-A-(CH2)m-NH-CO-, dans lequel U, B, b, Y, R, A, a, et m sont tels que définis dans la revendication 1.
13. Composés selon l'une des revendications 1 à 12, de formule générale (II) suivante :
(Œ^NrXr î^Œ^-l^^C -Ηj- H^O^Œ^αNH^Œ^ U-R-C6H4-(CH2)m-X
\ ,-NH
(Œ2^N2-X^X-(CH2)4-^H-CO ^2- H^C Œ2)2^O- H^Œ2^
N
dans laquelle U, R, m, X, nl5 n2, Y et V2 sont tels que définis dans la revendication 1, et X et X2 sont tels que définis dans la revendication 12.
14. Composés selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisés par les formules suivantes :
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000067_0002
dans lesquelles n„ n2, m, X, R, Y, a, U, et Z sont tels que définis dans l'une des revendications 1 à 10.
15. Composés selon l'une des revendications 1 à 14 de formule
Figure imgf000068_0001
dans laquelle R, et U sont tels que définis dans l'une des revendications 1 à 14.
16. Composés selon l'une des revendications 1 à 14 de formule
3
Figure imgf000068_0002
dans laquelle R, et U sont tels que défims dans, l'une des revendications 1 à 14.
17. Composés selon l'une des revendications 13 à 16, de formule
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000069_0002
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
18. Complexes entre un composé selon l'une des revendications 1 à 17, et un élément radioactif tel que défini dans la revendication 3.
19. Utilisation d'un composé ou complexe selon l'une des revendications 1 à 18, pour :
- la préparation d'un médicament pour la radiothérapie, et plus particulièrement la radioimmunothérapie, ou pour la radioimmunoscintigraphie, notamment dans le cadre du traitement de cancers, ou du traitement ou de la prévention contre la prolifération métastatique, - la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vitro de pathologies telles que les cancers, notamment par radioimmunoscintigraphie,
- la mise en œuvre d'une méthode de traitement des déchets radioactifs,
- la mise en œuvre d'une méthode de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux.
20. Compositions pharmaceutiques comprenant au moins un complexe selon la revendication 18, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
21. 'Composition comprenant au moins un complexe selon la revendication 18, en association avec des anticorps bispécifiques, à savoir des anticorps reconnaissant spécifiquement d'une part les organes ou tissus ou cellules à traiter à l'aide dudit composé, et d'autre part, les motifs Ll et L2 dudit composé, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée ou étalée dans le temps dans le cadre du traitement des pathologies définies dans la revendication 19, ou de l'imagerie, notamment par immunoscintigraphie.
22. Kit pour la mise en œuvre d'une méthode de traitement pour la radiothérapie, ou de diagnostic in vitro, ou de traitement des déchets radioactifs, ou de dosage ou de purification de radionucléides ou de métaux, définies dans la revendication 19, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins un composé ou un complexe selon l'une des revendications 1 à 18,
- et, le cas échéant, des anticorps bispécifiques tels que définis dans la revendication 21.
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