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WO2002030480A1 - Biokompatibles verbundmaterial für medizinische anwendungen - Google Patents

Biokompatibles verbundmaterial für medizinische anwendungen Download PDF

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Publication number
WO2002030480A1
WO2002030480A1 PCT/DE2001/003910 DE0103910W WO0230480A1 WO 2002030480 A1 WO2002030480 A1 WO 2002030480A1 DE 0103910 W DE0103910 W DE 0103910W WO 0230480 A1 WO0230480 A1 WO 0230480A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
composite material
material according
biocompatible composite
biocompatible
cells
Prior art date
Application number
PCT/DE2001/003910
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Peter-Jürgen Müller
Stephanie MÖLLER
Jörg OZEGOWSKI
Gundela Peschel
Hans-Georg Kastner
Matthias Hilliger
Original Assignee
Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Friedrich-Schiller-Universität Jena
Biocell Teterow Gmbh & Co. Kg
Innovent Technologieentwicklung
HILLIGER, Monika, Maria
HILLIGER, Stephan, Matthias, Friedrich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V., Friedrich-Schiller-Universität Jena, Biocell Teterow Gmbh & Co. Kg, Innovent Technologieentwicklung, HILLIGER, Monika, Maria, HILLIGER, Stephan, Matthias, Friedrich filed Critical Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V.
Priority to AU2002218134A priority Critical patent/AU2002218134A1/en
Publication of WO2002030480A1 publication Critical patent/WO2002030480A1/de

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    • A61L31/129—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material having a macromolecular matrix containing macromolecular fillers

Definitions

  • the biocompatible composite materials consist of biopolymers of non-animal origin and can be used for very different medical applications. In a version for covering wounds, they are particularly suitable for large-area wounds. Other applications are the separation of organs by fabrics, e.g. after abdominal or heart surgery to prevent adhesions.
  • the biocompatible composite material can also be used to seal textile vascular prostheses.
  • the material can serve as a carrier material for animal and human cells, which are grown on the biocompatible composite material or the pores and then subsequently transferred to organs or to the wound surfaces.
  • animal and human cells which are grown on the biocompatible composite material or the pores and then subsequently transferred to organs or to the wound surfaces.
  • ephit cells, endothelial cells, Langerhans islet cells, liver cells, skin cells, dividing cells of the hair root or keratinocytes can be grown on or in the material.
  • a preferred area of application are chronic wounds that are difficult to heal and extensive burns.
  • tissue regeneration and ingrowth of implants in humans and animals is significantly improved.
  • the composite material is absorbed without residue during the healing process.
  • Biocompatible synthetic, semi-synthetic polymers and biopolymers are already used as biocompatible resorbable materials. There is a relatively large number of property rights for this.
  • a number of implant materials and wound covers are based on polymers, homopolymers and copolymers made from resorbable polyglycolide / polylactide (US 3636956, US 3463658, US 3982543, RU 2125859).
  • Polyalkanoate esters such as poly-ß-hydroxybutyrate are used in the form of cast films as well as in the form of compact implant material.
  • US 5641505 provides porous flexible membranes or tubes with wall thicknesses of approximately 10 ⁇ m to 1 mm and pore sizes between 0.1 ⁇ m and 30 ⁇ m made of polyhydroxybutyrate, a copolymer of poly- ⁇ -hydroxybutyrate and poly- ⁇ -hydroxyvalerianate or a combination of poly -ß-hydroxybutyrate with copolymers between the two polymers under protection.
  • the material is bioresorbable and contains pores with a pore diameter through which water and salts can be exchanged, but animal cells cannot pass through. The material is suggested for use in healing soft tissues.
  • hyaluronic acid esters or also chemically cross-linked hyaluronic acid or self-cross-linked hyaluronic acid are used 0.922.060, US 5,939,323, US 4,957,744 or INI 170,801) for medical and cosmetic applications.
  • a hyaluronic acid ester for example with the brand name HYAFF (Fidia, Italy), is available for wound care (hyalgin, laserskin).
  • HYAFF relatively hydrophobic ben foils are mechanically stable and can be provided with arrays of pores that are produced by laser. The pores are said to cause oxygen admission and drainage of wound fluid: Above all, however, they have the function that through them the skin cells can grow through to the wound surface.
  • EP 9707.833, EP 0.850.074, AU 6.930.096, WO 9.808.876 and EP 0.922.060 use membranes made of hyaluronic acid esters or crosslinked hyaluronic acid derivatives to prevent postoperative adhesions.
  • US 5,849,368 describes a process for rendering non-polar or slightly polar, hydrophobic surfaces of plastic material or rubber hydrophilic by means of plasma and subsequent coating with hydrophilic materials.
  • the coating of medical products or implants with hyaluronic acid is given in WO 9.624.392.
  • EP 0.470.007 describes a wound covering made of a hydrophobic porous membrane which has been coated hydrophilically with a nonionic surface-active substance.
  • US 5,916,585 is concerned with hydrophobic biodegradable polymer material on the surface of which a hydrophilic polymer has been immobilized or chemically crosslinked.
  • WO 0.037.124 and US 5,644,049 use a biodegradative network of hyaluronic acid ester in the form of a film, a membrane, a sponge, a hydrogel, a guide channel, a thread, a gauze or a non-woven, crosslinked hyaluronic acid as a carrier of mammalian cells , with microspheres, sponge fragments, fibers and granules from hyaluronic acid derivatives being contained as the biologically active component.
  • the material can be used in biomedical and sanitary applications including in dermatology, urology, orthopedics, otology, microsurgery, plastic surgery and in the cardiovascular area.
  • US 5J66.631 describes implant materials which contain bioabsorbable microspheres with a diameter between 10 ⁇ m and 1,500 ⁇ m in a freeze-dried hydrophilic and biocompatible collagen matrix, which consist of polylactide / polyglycolic acid copolymers, collagen, cross-linked collagen, hyaluronic acid and cross-linked hyaluronic acid, alginate and cellulose derivative ten, collagen, polystyrene, dextran, polyacrylamide, cellulose, calcium alginate, latex, polysulfone or glass.
  • a freeze-dried hydrophilic and biocompatible collagen matrix consist of polylactide / polyglycolic acid copolymers, collagen, cross-linked collagen, hyaluronic acid and cross-linked hyaluronic acid, alginate and cellulose derivative ten, collagen, polystyrene, dextran, polyacrylamide, cellulose, calcium alginate, latex, polysulfone or glass.
  • WO 9,961,080 and AU 4,368,099 describe materials which use hyaluronic acid derivatives with three-dimensional structures, including cavities, communicating pores; Contain needles or fibers of the same material and serve for temporary tissue replacement.
  • Polymeric microspheres with a diameter between 10 nm and 2 mm consist of a water-insoluble polylactide or of polyhydroxybutyrate. Their manufacture for biomedical applications is described in US 5,922,357.
  • the microspheres are coated with a water-soluble polymer such as dextran, chitosan, pectin, hyaluronic acid cellulose, starch, pullulan, inulin, heparin and heparin-like synthetic polymers.
  • Hyaluronic acid in native form is therefore a frequently used constituent of materials.
  • a formulation in the form of liquid, cream, gel, hydrogel, hydrocolloid or as a cover for the treatment of wounds contains hyaluronic acid and plasma fibronectin as constituents of the amniotic liquid (US 5,604,200) which creates a humid environment like that found in a fetus in the uterus and is used to treat burns and open wounds. Because of its human-identical composition (WO 0.016.818 and US 4,813,942), hyaluronic acid is of particular importance for wound coverings.
  • US 5,955,578 describes a framework material derivatized with hyaluronic acid for various medical purposes, such as tissue regeneration, tissue reconstruction and wound healing, and a method of production.
  • the materials can contain biologically active molecules such as growth factors.
  • hyaluronic acid fractions with molecular weights of 50,000 D to 100,000 D stimulate wound healing particularly well.
  • US 5,644,049 describes materials which consist of an interpenetrating polymeric network, where one component can be an acidic polysaccharide such as hyaluronic acid or a derivative thereof and the second component is a synthetic polymer.
  • Uronides of hyaluronic acid are produced by the action of the enzyme hyaluronate lyase on hyaluronic acid or its salts (WO 0.044.342)
  • sulfated glycosaminoglycans are proposed as ingredients of the wound covers and implants. Other property rights use poorly soluble polyelectrolytes.
  • wound healing is accelerated by heparin or heparin sulfate in the presence of chitosan.
  • carboxymethylchitosan for wound healing is proposed in US 5,679,658.
  • US 5,929,050 describes compositions which contain chondroitin sulfate and glycosaminoglycans.
  • US 4,570,629 provides hydrophilic bipolymeric copolyelectrolytic material based on linear water-soluble anions such as keratin and and a water-soluble linear cationic biopolymer of collagen and glucosaminoglycan under protection.
  • WO 0.016.817 describes a dermal scaffold made of chitosan / collagen for wound healing
  • EP 0.477.979 mentions chitin / chitosan as a wound healing filling material for wounds.
  • WO 9.822.H4 uses to accelerate tissue repair e.g. Chitosan, chitin and glucosamine, hyaluronic acid and sucrose octasulfate.
  • US 5,520,916 and US 5,824,335 use threads embedded in a matrix.
  • the threads can consist of esters of hyaluronic acid.
  • a certain pore size should allow the growth of grown cells to the wound base, on the other hand, in the case of materials that are intended to prevent tissue growth, the access of cells should be blocked by appropriately small pores.
  • a polyester mesh (US 5,972,332) is used to transfer keratinocyte cell turf directly to the wound surface. Smaller pores are said to prevent microorganisms from growing through. It can thus be stated that there are serious disadvantages with materials according to the prior art. It is disadvantageous, for example, that the physiologically very advantageous hyaluronic acid and its salts are soluble in water and do not form a mechanically stable material under moist conditions. Ingestion of body fluids or wound exudate produces a fluid that becomes less and less viscous with increasing dilution. In order to avoid this disadvantage, the hyaluronic acid has been chemically crosslinked or has been
  • Derivatives such as the hyaluronic acid ester used.
  • the derivatives are sparingly or not soluble in water; however, their functional groups, which produce the advantageous physiological properties, are blocked.
  • the semi-synthetic hyaluronic acid ester disintegrates under physiological conditions not only into the physiologically very favorable hyaluronic acid but also into cell-toxic alcohols such as butanol. The latter leads to local inflammatory reactions with rapid absorption.
  • a general disadvantage of the chemically crosslinked hyaluronic acids in addition to their reduced healing effect is that toxic crosslinking agents are used for their production.
  • Films made of polylactide or polyhydroxyalkanoates are proposed for wound care and for closing organ or tissue defects.
  • Polylactide is a mechanically stable, synthetically produced polymer that breaks down into lactic acid in the organism. They are somewhat less hydrophobic than the hyaluronic acid esters.
  • lactic acid leads to local accumulations of lactic acid during absorption in the body, which usually lead to tissue irritation.
  • the polyhydroxyalkanoates are better tolerated by the body, but have a hydrophobic surface.
  • the aim of the invention is to develop a material which does not have the disadvantages of the known technical solutions, is particularly biocompatible and is available.
  • the production of larger areas is to be carried out in a simple manner. This is not the case with the materials mentioned in the patent literature.
  • the material is said to contain pores with pore sizes adapted to the applications, it should be of biological origin but not be from mammals and contain no protein. It should be versatile, e.g. for covering or sealing or closing organ and tissue defects, as a carrier in cell cultivation, for covering large wound surfaces, for sealing vessel walls and implants and as a resorbable implant for separating organs. It is said to have a promoting effect on the healing of organ and tissue defects and not to have the disadvantages of previous materials. In particular, they should combine good flexibility with high hydrophilicity and swellability of the surface.
  • the cultivation of adhesive human or animal cells is to take place on the material or in the pores as a carrier, and the overgrown carriers are to be used to treat tissue defects, in particular chronic, difficult to treat wounds or burns.
  • Culturing animal cells e.g. Keratinocytes on the carrier material should preferably be made on flat surfaces.
  • the backing materials must be so flexible that they conform to the irregular surfaces of the wound surface.
  • the mechanical properties should make it easy for the attending physician to handle.
  • the material should also be easy to produce in a form adapted to the organs or implants.
  • the cells located on the carrier material should be able to grow through macropores or openings larger than 10 ⁇ m to the wound surface.
  • the wound coverings or carrier materials are said to have broken down after a while and living tissue has taken its place.
  • a material must be found which is completely biocompatible, can remain in the body without irritation and which is broken down or resorbed within a certain period of time without harmful side effects or the occurrence of toxic products.
  • the surface should have low swellable properties and the inside should be connected to the outside by pores.
  • the material should be easy to manufacture and commercially usable without much effort.
  • the invention is based on the scientifically technical task of producing a new, suitable, biocompatible and resorbable material which is suitable for a variety of medical purposes Applications can be used and meets commercial requirements.
  • the object on which the invention is based is achieved in that two types of biocompatible, known per se, very different in their properties and alone not suitable for the intended applications, are combined in the form of a composite material.
  • the new composite material consists of polyalkanoate esters as a matrix, in which microparticles are embedded, which consist of one or more polysaccharide polyelectrolytes and / or their salts and / or their derivatives with a spherical, fibrous or irregular shape with a diameter between 0.1 ⁇ m up to 500 ⁇ m and which may contain auxiliary substances, active substances or medicinal products.
  • the new material is a composite material consisting of a hydrophobic matrix with hydrophilic particles as a filler.
  • the polyalkanoate is dissolved in a water-immiscible solvent, preferably chloroform, and the polyelectrolytic particles are suspended in the solution. The solvent is then removed.
  • a water-immiscible solvent preferably chloroform
  • it is provided with pores and / or slot-shaped openings.
  • the pores are created in two ways.
  • the suspension is mixed with easily water-soluble, non-polyelectrolytic pore-forming particles.
  • the particles consist of the components of cell culture media such as glucose or amino acids, which are later removed by leaching.
  • the pores have diameters in the range from 1 ⁇ m to 100 ⁇ m (micropores). Larger pores (macropores) in particular can also be created by suspending an aqueous solution or an aqueous solution of a polyelectrolyte with ethanol in the form of small drops in the solution. After drying, instead of the droplets, predominantly pores with diameters from 10 ⁇ m to 1000 ⁇ m are formed.
  • Poly- ⁇ -hydroxybutyrate of biological origin is preferably used as the matrix-forming polyalkanoate ester.
  • Auxiliaries, active substances or medicaments present in the material according to the invention additionally influence the physiological properties of the material.
  • the polyelectrolytic microparticles in the matrix should be as small as possible. Their diameter is less than 100 ⁇ m, preferably less than 1 ⁇ m.
  • the polyelectrolytic microparticles create a swellable, soft and biocompatible consistency of the material when water enters.
  • the polyelectrolytic properties of the microparticles according to the invention give rise to a particularly high osmotic swelling pressure in the area of the microparticles when water enters, which is responsible for the tissue-like mechanical properties of the surfaces of the composite material and of the sheetlike structures produced from it.
  • the source pressure is over the
  • the microparticles consist of the very easily and completely water-soluble polyanionic hyaluronic acid or, in another embodiment, of pectic acid, xanthan and or their salts and / or their derivatives.
  • Derivatives are the uronides of hyaluronic acid or pectic acid or the sulfated polysaccharides or their salts.
  • the uronides are obtained in a manner known per se by the partial degradation of the hyaluronic acid via a ⁇ -elimination with the enzyme hyaluronate lyase or the pectic acid with the enzyme pectate lyase.
  • An advantage of them is that, owing to the double bonds, they have very intensive radical-trapping and angiogenic properties with limited swellability. They promote cell growth and the healing process in a similar way to natural hyaluronic acid. They will be lighter than the high molecular hyaluronic acid from the matrix surface through water with the formation of pores with pore sizes from 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • Sulphated polyelectrolytic polymers preferably sulphated hyaluronic acid with degrees of sulphation between 0.1 to 3.9, preferably 1 to 3, reduce the adhesive behavior of blood and animal cells on the material surface due to their presence. Their presence as a minor component can therefore regulate the adhesion of the cells. Their presence according to the invention in foils which are used for separating organs after operations with the aim of avoiding adhesions or for sealing textile vascular implants is particularly advantageous.
  • the microparticles are produced from polyelectrolytes, selected from the alkaline earth metal salts of alginic acid which are less soluble in water but swellable in water, the polycationic chitosan which is only soluble under slightly acidic pH conditions, or the sparingly soluble polyelectrolyte complexes of chitosan with the polyanionic biopolymers with hyaluronic acid.
  • polyelectrolytes selected from the alkaline earth metal salts of alginic acid which are less soluble in water but swellable in water, the polycationic chitosan which is only soluble under slightly acidic pH conditions, or the sparingly soluble polyelectrolyte complexes of chitosan with the polyanionic biopolymers with hyaluronic acid.
  • the water-soluble polyanionic component is bound to the biocompatible composite material in a form which is difficult to dissolve in water. Coating with a chitosan-containing solution reduces
  • the pore-forming, water-soluble particles are released from the matrix when liquid enters and leave pores up to a size of 1 mm.
  • the particles consist of crystals or aggregates of substances that are present in the culture media of cell culture, such as glucose, sucrose, L-amino acids, sodium bicarbonate, sodium or potassium phosphates, magnesium sulfate, potassium chloride or common salt.
  • the diameter of the pore-forming particles determines the pore diameter. Pores can be present in the material as open, closed or continuous cavities. Although it was known that pores can be produced by leaching sodium chloride crystals with water in cast films.
  • a new aspect of the invention is that leaching takes place only during the use of the cast films in an aqueous environment, such as is present in the human body or in a cell culture.
  • Another new feature is that particles from other nutrient media are used to form pores through leaching. This avoids the problem that an independent leaching step would lead to undesired losses of the polyelectrolytic polymers.
  • the composition of the culture medium must take into account the additional constituents added by leaching.
  • a water-soluble plasticizer preferably an ester of citric acid, can also be added as an auxiliary during the production of the material. The plasticizer prevents embrittlement of the material and increases flexibility. It is advantageous that the water-soluble plasticizers of the citric acid ester type can be easily removed by washing.
  • the biocompatible composite material is varied in an application-specific manner by the presence of further constituents, such as auxiliaries, active ingredients or pharmaceuticals, or by special designs of the manufacturing process.
  • auxiliaries such as auxiliaries, active ingredients or pharmaceuticals
  • antibiotics or anti-inflammatory or anticoagulant agents can be added.
  • the hyaluronic acid uronides and the sulfated polysaccharides, for example of the sulfated hyaluronic acid type have such active ingredient properties.
  • the biocompatible composite material would have such surprisingly good physiological properties and biocompatibility. It has been found to be very advantageous that the microdisperse polyelectrolytic particles produce a biocompatible hydrophilic outer and inner surface of the materials.
  • the use of hyaluronic acid, its salts, its polyelectrolyte complex with chitosan and its uronides as polyelectrolytic particles according to the invention is particularly advantageous. In native form, these compounds have outstanding wound healing, angiogenic and radical-trapping properties.
  • biocompatible composite material activates the macrophages, which release growth factors which promote cell growth.
  • the preferably used hyaluronic acid enclosed as microdisperse particles remains, although water-soluble, partly in the matrix of the material when water enters. It swells and regulates further water access. The swelling makes the cast films very flexible. Irregularly shaped wound surfaces are largely covered by the adherent surface. The adherence of adherent cells is promoted for the same reason.
  • the environment around the pores formed by suspension of aqueous solutions of polyelectrolytes and their inner walls proved to be particularly suitable for the growth and growth of keratinocytes.
  • the suspension containing dissolved polyalkanoate esters, microparticles, pore-forming particles and other constituents is suspended in an organic solvent such as chloroform or methylene chloride.
  • the suspension is applied to a mold as a casting solution and the film is produced by evaporation of the organic solvent.
  • the shape is a flat surface e.g. a glass plate or a carrier material made of plastic, in another a textile knitted fabric, for example in the form of a vascular implant, or it has an irregularly shaped surface.
  • Flat structures or membranes according to the invention have a thickness of 1 ⁇ m to 500 ⁇ m, preferably 10 ⁇ m to 20 ⁇ m, depending on the application.
  • They can have continuous pores with opening widths that are approximately between 10 ⁇ m and 1000 ⁇ m or arrangements of slots with lengths between 0.5 mm and 10 mm. The latter are made by cutting with cutting tools.
  • Other macropores can be produced in a known manner by piercing with piercing tools or using laser beams. The macro pores make the material permeable to the cells cultivated on the film surface. The growth of the wound surface through divisible skin cells is made possible. In addition, the wound exudate can flow off when the cast films are used as a wound covering.
  • a micro- to macroporous structure is also produced according to the invention by producing a highly viscous suspension according to the invention with a content of at least 40 g / l polyhydroxyalkanoate and suspending an aqueous solution of the polyelectrolytes in this solution, which may be mixed with an amount of ethanol beforehand where the polyelectrolyte is just not yet failing.
  • aqueous solution of the polyelectrolytes in this solution which may be mixed with an amount of ethanol beforehand where the polyelectrolyte is just not yet failing.
  • evaporation for example of chloroform
  • continuous micropores as well as macropores are formed in the cast films, depending on the size of the suspended particles.
  • the syrup-like, highly viscous state of the suspension prevents the organic and the suspended aqueous phase from segregating during the pouring process.
  • a microporous to macroporous structure is preformed by the polyelectrolytic microarticles and / or by the pore-forming nutrient medium components.
  • the particles are washed out or dissolve after implantation in the tissue fluid or during cell cultivation in the medium of cell cultivation with the formation of cavities.
  • Other fabrics according to the invention are formed by dipping molds into the suspension of the polyelectrolytic microparticle and the polyalkanoate ester in an organic solvent and then evaporating the solvent and, if necessary, repeating the procedure.
  • the fabric can then be detached from the shape or it can remain on the form.
  • the material remains as a thin film on the surface or between the meshes of the textile vascular implant.
  • the culture of cells on and inside the material according to the invention takes place with cells of different origins such as, for example, epithelial cells, endothelial cells, Langerhans islet cells, liver cells, skin cells, actively dividing cells of the hair root and generation cells.
  • the material is overlaid with a cell cultivation medium known per se and, if necessary, moved slowly. After about 6 hours, the pore-forming particles are washed out and the culture is inoculated with adherent cells. After waxing, the materials are removed and implanted under aseptic conditions or placed on wound surfaces.
  • Fine cleaning of the 3-PHB 100 g of 3-poly-ß-hydroxybutyrate (3-PHB) with a molecular weight of 1J00 kD are mixed with 50 g of silica gel 1020 P (chemical plant Bad Köstritz) with 5 l of freshly distilled chloroform and left under for 1 hour Warm to temperatures in the range of 62 ° C using a reflux condenser.
  • the silica gel was previously heated to a temperature of 180 ° C. for 10 hours in order to remove pyrogens in a drying oven.
  • the suspension is filtered by filtration at temperatures of about 50 ° C - 60 ° C through a filter with a pore size of 10 ⁇ m - 25 ⁇ m (Seitz T 1500).
  • the filtrate is mixed with 100 ml of chloroform and again with 10 g of silica gel 1020 P (chemical plant Bad Köstritz) and stirred for 1 hour while heating to temperatures of about 60 ° C.
  • the suspension is then filtered through a filter with a pore size of 3 ⁇ m - 8 ⁇ m (Seitz T 500) at temperatures of 50 ° C - 60 ° C.
  • the 3-PHB is then precipitated by pouring it into 80% aqueous methanol.
  • the 3-PHB is washed with ethanol and then dried at 40 ° C. in a vacuum drying cabinet.
  • a purified 3-PHB is obtained which is used to produce the composite materials in accordance with the examples below.
  • Example 2 60 g of 3-PHB prepared according to Example 1 is dissolved in one liter of freshly distilled chloroform. 4 g of an aqueous solution containing 20 g / l of sodium salt of hyaluronic acid with a molar mass in the range from 1,300 to 1,700 kD and 3.2 ml of absolute ethanol are added to this solution and the solution is stirred vigorously until the droplets of the aqueous phase are homogeneously suspended are. The suspension is spread with a squeegee on a glass plate. The distance of the Squeegee edge to the glass surface (gap width) is 500 ⁇ m.
  • films After drying the coated glass plates under a hood to remove the chloroform and standing in the air under clean room conditions, the film is swollen with a little water for injection and then lifted off its base. After drying the film in air at 56 ° C and removing the water, films are formed which are approximately 20 ⁇ m thick and contain pores in the size range from 10 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • Casting a coarse-pore film A film is produced as in Example 2, but the addition of ethanol is omitted. Pores with pore sizes between 20 ⁇ m to 500 ⁇ m are formed.
  • the starting materials are produced as in Example 2.
  • the casting solution is applied to a band-shaped film made of polyterephthalate and a width of 20 cm, which moves uniformly at a speed of 2 m / min under the stationary doctor blade, with a gap width of 300 ⁇ m. This is followed by drying under clean room conditions at 56 ° C to 58 ° C.
  • Example 7 Use of hyaluronic acid uronide in porous films:
  • Example 3 the sodium salt of hyaluronic acid uronide with a molecular weight of 20 kD is used instead of the sodium salt of hyaluronic acid. After pouring and drying according to Example 2, a large-pore film is formed. In a parallel experiment, L-phenylalanine is added as described in Example 6. Many small pores are formed.
  • Example 4 cast at a doctor blade spacing of 250 microns.
  • the film thickness of the films obtained after drying is 8 ⁇ m.
  • 3-PHB film according to Example 4 is cast on a plastic tape made of polyterephthalate.
  • the result is 3-PHB composite material films with a layer thickness of approximately 15 ⁇ m, which adheres to the plastic tape.
  • the film lying on the plastic tape is activated by passing the tape through a corona discharge.
  • the film is then sprayed with an aqueous 1% sodium uronide solution.
  • the molar mass of the uronide is 15 kD.
  • the amount of this solution applied is 1 ml to 3 ml per 100 cm 2 .
  • a chloroform solution containing 45 g / l of 3-PHB and solid hyaluronic acid particles corresponding to Example 4 is mixed with 100 ⁇ l of citric acid triethyl ester.
  • a film is cast in accordance with Example 3. The result is a stretchable film with an average film thickness of 12 ⁇ m.
  • Example 5 In a film production in accordance with Example 5, an additional 200 mg of saline particles with a particle diameter of approximately 30 ⁇ m are suspended. After production of the films according to Example 5, films are formed which have no pores. After the films have been introduced into a submerged cell culture medium, pores with a diameter of approximately 25 ⁇ m are formed by removing the saline particles and the hyaluronate particles.
  • Foils containing hyaluronate and chitosan Foils containing hyaluronate and chitosan:
  • chitosan 0.01 g is suspended in 10 ml of distilled water and concentrated acetic acid is added dropwise with stirring until the chitosan has dissolved.
  • Solution are given 5 ml of a solution containing 2 g / l sodium hyaluronate.
  • the precipitated gel-shaped polyelectrolyte complex consisting of chitosan and hyaluronic acid, is filtered off and washed with water.
  • the gel is pressed through a sieve with a pore size of 50 ⁇ m and the resulting gel particles are then suspended in a 3 PHB / chloroform solution.
  • a film according to Example 4 is produced with the solution.
  • a chitosan solution is sprayed onto a film strip produced in accordance with Example 4 in a second pass.
  • 0.05 g of chitosan is suspended in 1 liter of distilled water and concentrated acetic acid is added dropwise until the chitosan has dissolved.
  • the solution is sprayed onto the film strip using a spray device.
  • the spray density is in the range of about 20 spray drops per mm 2 with an average drop volume of 0.01 ⁇ l.
  • the film is then dried at 58 ° C.
  • chitosan 0.01 g is suspended in 5 ml of distilled water and, while stirring, concentrated acetic acid is added dropwise until the chitosan has dissolved.
  • This solution is suspended in 1 l of a 3-PHB / chloroform solution according to Example 2 and it is Cast foils. After the films have dried, a solution of 0.05 g / l hyaluronic acid is sprayed onto the film in the form of a thin layer of approximately 2 ⁇ m to 5 ⁇ m. The sprayed foils are then dried at room temperature.
  • a completely clear 3-PHB / chloroform solution prepared according to Example 1 which contains 60 g / l of 3-PHB, 4 g of an aqueous solution containing 20 g / l of sodium salt of hyaluronic acid with a molecular weight in the range of Contains 1,300 to 1J00 kD and 1 g of an acetic acid solution of 5 g / l chitosan and 3.2 ml of absolute ethanol and the solution stirred vigorously until the droplets of the aqueous phase are homogeneously suspended.
  • the chitosan solution is prepared by combining chitosan and water with the addition of just as much concentrated acetic acid in which the chitosan is completely dissolved.
  • the suspension is spread with a squeegee on a glass plate.
  • the distance from the squeegee edge to the glass surface is 500 ⁇ m.
  • a textile vascular implant made of plastic (Dacron) with an inner diameter of 0.5 cm and a length of 5 cm is immersed in a solution which is produced in accordance with Example 2. After excess solution has dripped off, the vascular implant is rotated in a horizontal position at a speed of rotation of 30 to 120 rpm in order to avoid the formation of drops. After the seal has set, a drying process of several days takes place in a clean room at temperatures from 40 ° C to 50 ° C. The immersion process is repeated for vessels with an inner diameter greater than 0.5 cm.
  • the medium DMEM (IBCO BRL, Cat. No. 41966-029) with the addition of 10 ml / i penicillin / streptomycin solution (GIBCO BRL., Cat. No. 043-05-140H) and 10 % fetal calf serum.
  • the keratinocyte cell line HaCaT is defined in multishells (NUNC, cat. No. 143982) (10 x 10 5 cells) sown in 0.8 ml DMEM per well. In the recess is a circular piece of the film to be examined from the biocompatible composite material or no film is inserted (control).
  • the number of adherent cells is determined after incubation for 72 h at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% relative atmospheric humidity, then removing the medium, washing with PBS / EDTA solution, trypsinization with 0.02 ml 0, 25% trypsin solution by electronic cytoanalysis.
  • the average growth of the samples with the cells is between 70% and 95% compared to the control.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein biokompatibles und resorbierbares Verbundmaterial und dessen Herstellung. Das Verbundmaterial besteht aus einer Matrix aus Polyhydroxyalkanoaten, in welchem in Wasser quellbare Mikropartikel aus polyelektrolytischen Biopolymeren und/oder Polyelektrolyt-komplexe polysaccharidischer Zusammensetzung, enthalten sind. Das Verbundmaterial kann bevorzugt als Flächengebilde, aber auch als mehr kompaktes Biomaterial genutzt werden. Als Flächengebilde besitzt es anwendungsspezifische geformte Mikro- und Makroporen und/oder Schlitze. Das Verbundmaterial ist beispielsweise für die Abdeckung von großflächigen Wundoberflächen, zur Kultivierung adhäsiver humaner und tierischer Zellen und Übertragen der Zellen auf Wundflächen, zum Verschluss von Organdefekten, zur Abdichtung von implantierbaren textilen Gefässprothesen, als Barriere zur Trennung von Organen zur Verhinderung von Verwachsungen und als Transplantationsmaterial vorgesehen.

Description

Biokompatibles Verbundmaterial für medizinische Anwendungen
Die biokompatiblen Verbundmaterialien bestehen aus Biopolymeren nichttierischer Herkunft und können für sehr unterschiedliche medizinische Anwendungen eingesetzt werden. Sie sind in einer Ausführung zur Wundabdeckung vor allem bei großflächigen Wunden geeignet. Andere Anwendungen sind die Trennung von Organen durch Flächengebilde, z.B. nach Operationen im Bauchraum oder am Herzen, um Verwachsungen zu verhindern. Auch für die Abdichtung von textilen Gefäßprothesen kann das biokompatible Verbundmaterial eingesetzt werden.
Darüber hinaus kann es als Trägermaterial für tierische und menschliche Zellen dienen, die auf dem biokompatiblen Verbundmaterial odcer dem Poren gezüchtet werden und mit diesem anschließend in Organe oder auf die Wundflächen übertragen werden. Z. B. können Ephitelzellen, Endothelzellen, Langerhansschen Inselzellen, Leberzellen, Hautzellen, teilungsaktive Zellen der Haarwurzel oder Keratinozyten auf oder in dem Material gezüchtet werden.
Ein bevorzugtes Anwendungsgebiet sind die schwerheilbaren chronischen Wunden und die großflächigen Brandwunden. Durch die Anwendung der Erfindung wird die Geweberegeneration und das Einwachsen von Implantaten bei Mensch und Tier wesentlich verbessert. Das Verbundmaterial wird im Verlaufe des Heilungsprozesses ohne Rückstand resorbiert.
Als biokompatible resorbierbare Materialien werden tierische und pflanzliche Produkte oder biokompatible synthetische, halbsynthetische Polymere und Biopolymere bereits eingesetzt. Es gibt hierzu eine relativ große Zahl von Schutzrechten. Eine Reihe von Implantatmaterialien und Wundabdeckungen basieren auf Polymeren, Homopo- lymeren und Copolymeren aus resorbierbaren Polyglycolid/Polylactid (US 3636956, US 3463658, US 3982543, RU 2125859).
Polyalkanoatester wie das Poly-ß-hydroxybutyrat werden in Form von Gießfolien als auch in Form von kompakten Implantationsmaterial eingesetzt. So stellt US 5641505 poröse flexible Membranen oder Röhren mit Wanddicken von etwa 10 μm bis 1 mm und Porengröße zwischen 0,1 μm bis 30 μm aus Polyhydroxybutyrat, aus einem Copolymeren aus Poly-ß-hydroxybutyrat und Poly-ß-hydroxyvalerianat oder Kombination von Poly-ß-hydroxybutyrat mit Copolymeren zwischen den beiden Polymeren unter Schutz. Das Material ist bioresorbierbar und enthält Poren mit einer Porendurchmesser, durch welchen Wasser und Salze ausgetauscht, tierische Zellen aber nicht passieren können. Das Material wird für den Einsatz bei der Heilung von Weichgewebe vorgeschlagen.
Um aus der physiologisch vorteilhaften wasserlöslichen Hyaluronsäure ein stabiles Material zu erhalten, werden Hyaluronsäureester oder auch chemisch vernetzte Hyaluronssäure oder selbstvernetzte Hyaluronsäure (US 5.874.417, WO 9.707.833, EP 0.850.074, AU 6.930.096, WO 9.808.876, EP 0.922.060, US 5.939.323, US 4.957.744 oder INI 170.801) für medizinische und kosmetische Anwendungen vorgeschlagen.
Ein Hyaluronsäureester, z.B. mit der Markenbezeichnung HYAFF (Fidia, Italien), wird für Wundversorgung (Hyalgin, Laserskin) angeboten. Die aus HYAFF hergestellt, relativ hydropho- ben Folien sind mechanisch stabil und können mit Arrays von Poren versehen sein, die mit Laser hergestellt werden. Die Poren sollen den Sauerstoffzutritt und die Abführung von Wundflüssigkeit bewirken: vor allem aber haben sie die Funktion, daß durch sie hindurch die Hautzellen zur Wundoberfläche durchwachsen können. WO 9707.833, EP 0.850.074, AU 6.930.096, WO 9.808.876 und EP 0.922.060 nutzen Membranen aus Hyaluronsäureestern oder vernetzte Hyaluronsäurederivaten zur Verhinderung postoperativer Verwachsungen.
Die Quellbarkeit und die Hydrophilität der Polyhydroxyalkanoatester als auch der Hyaluronsäure- ster als Hauptkriterium der Biokompatibilität dieser halbsynthetischer Materialien sind jedoch relativ gering. Ihre Verwendung als Trägermaterial für tierische und humane Zellkulturen ist deshalb verbesserungsbedürftig.
Es werden verschiedene Methoden zur Erhöhung der Hydrophilität bei synthetischen und halbsynthetischen Polymeren vorgeschlagen.
US 5.849.368 beschreibt einen Prozeß, um nicht polare oder wenig polare, hydrophobe Oberflächen von Plastikmaterial oder Gummi mit Hilfe von Plasma und anschließender Beschichtung mit hydrophilen Materialien hydrophil zu gestalten. Die Beschichtungen von medizinischen Produkten oder Implantaten mit Hyaluronsäure wird in WO 9.624.392 angeführt. Eine Wundabdeckung aus einer hydrophoben porösen Membran, welche hydrophil mit einer nichtionischen oberflächenaktiven Substanz beschichtet wurde, beschreibt EP 0.470.007.
US 5.916.585 befaßt sich mit hydrophoben bioabbaubaren Polymerematerial, auf dessen Oberfläche ein hydrophiles Polymer immobilisert bzw. chemisch vernetzt wurde.
Um die Materialeigenschaften zu verändern, werden auch polymere Verbundmaterialien, bestehend aus Mikrosphären, die in einer Matrix eingelagert sind, vorgeschlagen. Man erwartet, daß die Eigenschaften der Ausgangsmaterialien sich in dem Material wiederfinden lassen. US 5.977.428 und WO 9.828.013 setzen hydrolytisch labile Mikrosphären aus vernetzten Polysacchariden mit Durchmessern zwischen 1 μm - 100 μm in einem hydrophoben adhäsiven Matrixmaterial ein.
WO 0.037.124 und US 5.644.049 verwenden ein biodegradatives Netzwerk aus Hyaluronsäureester in Form eines Films, einer Membran, eines Schwamms, eines Hydrogels, eines Führungskanals, eines Fadens, , einer Gaze oder einer nicht-gewebten, vernetzten Hyaluronsäure als Träger von Säugerzellen, wobei als biologisch aktive Komponente Mikrosphären, Schwammfragmente, Fasern und Granulat aus Hyaluronsäurederivaten enthalten sind. Das Material kann in biomedizinischen und sanitären Anwendungen einschließlich in der Dermatologie, Urologie, Orthopädie, Otologie Mikochirurgie, plastischen Chirurgie und im cardiovascularen Bereich eingesetzt werden. US 5J66.631 beschreibt Implantatmaterialien, die bioabsobierbare Mikrosphären mit einem Durchmesserzwischen 10 μm und 1.500 μm in einer gefriergetrockneten hydrophilen und biokompatiblen Kollagenmatrix, welche aus Polylactid/Polyglycolsäure Copolymeren, Kollagen, vernetztes Kollagen, Hyaluronsäure und vernetzte Hyaluronsäure, Alginat und Zellulosederiva- ten, Kollagen, Polystyrol, Dextran, Polyacrylamid, Cellulose, Calciumalginat, Latex, Polysulfon oder Glas bestehen können.
WO 9.961.080 und AU 4.368.099 beschreiben Materialien, die Hyaluronsäurederivate mit dreidimensionalen Strukturen, darunter Hohlräume, kommunizierende Poren; Nadeln oder Fasern aus dem gleichen Material enthalten und für den zeitweisen Gewebeersatz dienen.
Polymere Mikrospären mit einem Durchmesser zwischen 10 nm bis 2 mm bestehen aus einem wasserunlöslichen Polylactid oder aus Polyhydroxybutyrat. Deren Herstellung für biomedizinische Anwendungen beschreibt US 5.922.357. Die Mikrosphären sind mit einem wasserlöslichen Polymer wie Dextran, Chitosan, Pectin, Hyaluronsäure Zellulose, Stärke, Pullulan, Inulin, Heparin und heparinähnliche synthetische Polymeren beschichtet.
Hyaluronsäure in nativer Form stellt demnach ein häufig eingesetzter Bestandteil von Materialien dar. Eine Formulierung in Form von Flüssigkeit, Creme, Gel, Hydrogel, Hydrocolloid oder als Abdeckung zur Behandlung von Wunden enthält Hyaluronsäure und Plasmafibronectin als Bestandteile der amniotischen Flüssigkeit (US 5.604.200) welche eine feuchte Umgebung wie sie bei einem Fötus im Uterus vorliegen, hervorruft und mit der Verbrennungen und offene Wunden behandelt werden. Hyaluronsäure ist wegen ihrer humanidentischen Zusammensetzung (WO 0.016.818 und US 4.813.942 ) von besonderer Bedeutung bei Wundabdeckungen.
Ein mit Hyaluronsäure derivatisiertes Gerüstmaterial für verschiedene medizinische Zwecke wie Geweberegeneration, Geweberekonstruktion und Wundheilung und eine Methode der Herstel- lung beschreibt US 5.955.578. Die Materialien können biologisch aktive Moleküle wie wie Wachstumsfaktoren enthalten.
Neben der Humanidentität der Hyaluronsäure und der damit verbundenen hohen Biokompatibilität ist besonders der angiogene Effekt, die Förderung der Wundheilung sowie generell die Wachstumsförderung verschiedener Zelltypen von Bedeutung. Nach US 5.925.626 stimulieren Hyaluronsäurefraktionen mit Molmassen von 50.000 D bis 100.000 D die Wundheilung besonders gut. US 5.644.049 beschreibt Materialien, die aus einem interpenetrierenden polymeren Netzwerk bestehen, wobei eine Komponente ein saures Polysaccharid wie die Hyaluronsäure oder ein Derivat derselben sein kann und die zweite Komponente ein synthetisches Polymer ist. Uronide der Hyaluronsäure werden durch Einwirkung des Enzyms Hyaluronatlyase auf Hyalu- ronsäure bzw. deren Salze hergestellt (WO 0.044.342)
Neben den o.g. hydrophoben und hydrophilen Materialien werden sulfatierte Glycosaminglykane als Inhaltstoffe der Wundabdeckungen und Implantate vorgeschlagen. Andere Schutzrechte nutzen schwerlösliche Polyelektrolyte. Nach US 5.902J98 wird die Wundheilung durch Heparin oder Heparinsulfat in Anwesenheit von Chitosan beschleunigt. Die Verwendung von Carboxy- methylchitosan für Wundheilung wird in US 5.679.658 vorgeschlagen. US 5.929.050 beschreibt Kompositionen, die Chondroitinsulfat und Glycosaminoglycane enthalten. US 4.570.629 stellt hydrophiles bipolymeres copolyelektrolytisches Material aus linearen wasserlöslichen Anionen wie Keratin und und ein in Wasser lösliches linearen kationisches Biopolymer auf der Grundlage von Kollagen und Glucosaminoglycan unter Schutz. WO 0.016.817 beschreibt ein dermales Gerüst aus Chitosan/Kollagen für Wundheilung, EP 0.477.979 nennt Chitin/Chitosan als wundheilendes Füllmaterial von Wunden.
WO 9.822.H4 setzt zur Beschleunigung der Gewebereparatur z.B. Chitosan, Chitin und Glucosamin, Hyaluronsäure und Sucroseoctasulfat ein.
US 5.520.916 und US 5.824.335 verwenden Fäden, die in einer Matrix eingebettet sind. Die Fäden können aus Estern der Hyaluronsäure bestehen.
Damit das Wundexudat ablaufen und Luft zur Wunde gelangen kann, werden Poren unterschiedlicher Größe in das Material eingebracht. Eine bestimmte Porenweite soll das Durchwachsen von angezüchteten Zellen zum Wundgrund gestatten, anderseits soll bei Materialien, die Gewebeverwachsungen verhindern sollen, durch entsprechend kleine Poren der Zugang von Zellen versperrt werden. Ein Netz aus Polyester (US 5.972.332) wird zur Übertragung von Keratino- zytenzellrasen direkt auf die Wundoberfläche genutzt. Kleinere Poren sollen das Durchwachsen von Mikroorganismen verhindern. Es kann somit festgestellt werden, daß bei Materialien entsprechend dem Stand der Technik gravierende Nachteile auftreten. Nachteilig ist beispielsweise, daß die physiologisch sehr vorteilhafte Hyaluronsäure und ihre Salze in Wasser löslich sind und unter Feuchtbedingung keine mechanisch stabiles Material bilden. Unter Aufnahme von Körperflüssigkeiten oder Wundexudat entsteht eine mit zunehmender Verdünnung immer weniger viskose Flüssigkeit. Um diesen Nachteil zu umgehen, wurde die Hyaluronsäure chemisch vernetzt oder es wurden
Derivate wie die Hyaluronsäureester eingesetzt. Die Derivate sind zwar in Wasser schwer- oder nichtlöslich; ihre funktionellen Gruppen, die die vorteilhaften physiologischen Eigenschaften hervorrufen, sind jedoch blockiert.
Besonders nachteilig ist, daß die halbsynthetische Hyaluronsäureester unter physiologischen Bedingungen nicht nur in die physiologisch sehr günstige Hyaluronsäure sondern auch in zelltoxische Alkohole wie Butanol zerfällt. Letzteres führt bei schneller Resorption zu örtlichen Entzündungsreaktionen.
Generell nachteilig bei den chemisch vernetzten Hyaluronsäuren neben ihrer verminderten heilenden Wirkung ist, daß zur ihrer Herstellung toxische Vemetzungsmittel eingesetzt werden. Folien aus Polylactid oder Polyhydroxyalkanoaten werden für die Wundversorgung und für das Schließen von Organ- oder Gewebedefekten vorgeschlagen. Polylactid ist ein mechanisch stabiles, synthetisch hergestellte Polymer, welches im Organismus in Milchsäure zerfällt. Sie sind etwas weniger hydrophob als die Hyaluronsäureester. Die Milchsäure führt aber bei der Resorption im Körper zu lokalen Anreicherungen von Milchsäure, die in der Regel zu Gewebeirritationen führen. Die Polyhydroxyalkanoate sind besser körperverträglich, besitzen aber eine hydrophobe Oberfläche.
Auch die Flexibilität und Weichheit der aus Polylactat hergestellten Folien bzw. Membranen ist häufig nicht ausreichend. Materialien tierischer Herkunft wie Kollagen werden in neuerer Zeit nicht mehr empfohlen, da sie infektiöses Material übertragen können und auf Grund ihrer Eiweißstruktur allergen wirken können.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Material zu entwickeln, welches die Nachteile der bekannten technischen Lösungen nicht aufweist, besonders biokompatibel und verfügbar ist. Darüber hinaus soll die Herstellung größerer Flächen auf einfach realisierbarem Weg erfolgen. Das ist bei den in der Patentliteratur genannten Materialien nicht der Fall.
Das Material soll Poren mit an die Anwendungen angepaßten Porenweiten enthalten, es soll biologischer Herkunft sein aber nicht aus Säugetieren stammen und kein Protein enthalten. Es soll vielfältig einsetzbar sein, z.B. bei der Abdeckung oder Abdichtung bzw. Verschluß von Organ- und Gewebedefekten, als Träger in der Zellzucht, zur Abdeckung von großflächigen Wundoberflächen, zur Abdichtung von Gefäßwänden und von Implantaten und als resorbierbares Implantat zur Trennung von Organen. Es soll einen fördernden Effekt auf die Heilung von Organ- und Gewebedefekten aufweisen und die Nachteile bisheriger Materialien nicht aufweisen. Insbesondere sollen sie eine gute Flexibilität mit einer hohen Hydrophilität und Quellbarkeit der Oberfläche verbinden.
In einer Ausführung soll auf dem Material oder auch in den Poren als Träger die Kultivierung adhasiver humaner oder tierischer Zellen erfolgen und die bewachsenen Träger zur Versorgung von Gewebedefekten, insbesondere von chronischen, schwer heibaren Wunden oder von Brandwunden eingesetzt werden.
Die Anzucht der tierischen Zellen z.B. von Keratinozyten auf dem Trägermaterial soll bevorzugt auf planen Oberflächen erfolgen. Die Trägermaterialien müssen so flexibel sein, daß sie sich an die unregelmäßigen Oberflächen der Wundoberfläche anschmiegen. Die mechanische Eigenschaften sollen eine leichte Handhabbarkeit für den behandelnden Arzt bewirken. Darüber hinaus sollen das Material auch in einer den Organen oder Implantaten angepaßten Form auf einfachem Weg herstellbar sein.
Die auf den Trägermaterial angesiedelten Zellen sollen durch Makroporen bzw. Öffnungen größer als 10 μm hindurch zur Wundoberfläche durchwachsen können. Die Wundbedeckungen bzw. Trägermaterialien sollen nach einer Zeit abgebaut und lebendes Gewebe an seine Stelle getreten sein.
Es muß demnach ein Material gefunden werden, welches vollständig biokompatibel ist, im Körper ohne Irritationen verbleiben kann und welches innerhalb eines bestimmtem Zeitraumes ohne schädliche Nebenwirkung bzw. Auftreten von toxischen Produkten abgebaut bzw. resorbiert wird. Die Oberfläche soll gering quellbare Eigenschaften aufweisen und das Innere soll durch Poren mit der äußeren Umgebung verbunden sein. Das Material soll auf einfachem Weg herstellbar und gewerblich ohne größeren Aufwand nutzbar sein.
Der Erfindung liegt die wissenschaftlich technische Aufgabe zu Grunde, ein neues geeignetes biokompatibles und resorbierbares Material herzustellen, welches für vielfältige medizinische Anwendungen eingesetzt werden kann und gewerblichen Ansprüchen genügt.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, das zwei an sich bekannte biokompatible, von ihren Eigenschaften sehr unterschiedliche und alleine nicht für die vorgesehene Anwendungen geeignete Typen von Biopolymeren in Form eines Verbundmateriales zusammengefügt werden.
Erfindungsgemäß besteht das neue Verbundmaterial aus Polyalkanoatester als Matrix, in welche Mikropartikel eingelagert sind, die aus einem oder mehreren polysaccharidischen Polyelektroly- ten und/oder deren Salze und/oder deren Derivaten mit sphärischer, faserförmiger oder unregelmäßiger Form mit einem Durchmesser zwischen 0,1 μm bis 500 μm bestehen und welche gegebenfalls Hilfstoffe, Wirkstoffe oder Arzneimittel enthält. Das neue Material ist ein Verbundmaterial, bestehend aus einer hydrophoben Matrix mit hydrophilen Partikeln als Füllstoff. Zur Herstellung wird das Polyalkanoat in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösemittel, bevorzugt Chloroform, gelöst und in der Lösung die polyelektrolytischen Partikel suspendiert. Anschließen wird das Lösemittel entfernt. In einer anderen Ausführung, bevorzugt bei der Herstellung als flächig geformtes Material, ist es mit Poren und/oder schlitzförmigen Öffnungen versehen.
Die Poren werden auf zwei Wegen erzeugt. So wird in einem Weg die Suspension mit leicht wasserlöslichen, nichtpolyelektrolytischen porenbildenden Partikeln versetzt. Die Partikel bestehen aus den Bestandteilen von Zellkulturmedien wie Glucose oder Aminosäuren, die später durch Auslaugung wieder entfernt werden. Die Poren weisen Durchmesser im Bereich von 1 μm bis 100 μm (Mikroporen) auf. Vor allem größere Poren (Makroporen) können auch dadurch erzeugt werden, dass eine wässrige Lösung oder eine mit Ethanol versetzte wässrige Lösung eines Polyelektrolyten in Form kleiner Tropfen in der Lösung suspendiert wird. Nach Trocknen bilden sich an Stelle der Tropfen überwiegend Poren mit Durchmessern von 10 μm bis zu 1000 μm. Als Matrix-bildender Polyalkanoatester wird bevorzugt Poly-ß-hydroxybutyrat biologischer Herkunft verwendet.
Im erfindungsgemäßen Material vorhandene Hilfsstoffe, Wirkstoffe oder Arzneimittel beinflussen zusätzlich die physiologischen Eigenschaften des Materials.
Die polyelektrolytischen Mikropartikel in der Matrix sollen möglichst klein sein. Ihr Durchmesser ist kleiner als 100 μm, bevorzugt kleiner als 1 μm. Die polyelektrolytischen Mikropartikel erzeugen bei Wasserzutritt eine quellbare, weiche und biokompatible Konsistenz des Materials.
Durch die polyelektrolytischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Mikropartikel entsteht bei Wasserzutritt ein besonders hoher osmotischer Quelldruck im Bereich der Mikropartikel, der für die gewebeähnlichen mechanischen Eigenschaften der Oberflächen des Verbundmaterials und der aus ihm hergestellten Flächengebilde verantwortlich ist. Der Quelldruck wird über die
Abstoßung der gleichionisch geladenen Ketten der polyanionischen Biopolymere bei Wasserzutritt bewirkt. Der Flüssigkeitszugang in das Innere der Materialien ist durch die Poren als auch durch den Gehalt an auswaschbaren, bzw. porenbildenden Partikeln gewährleistet. Vorteilhaft ist, daß die biokompatiblen Verbundmaterialien trotz der Quellbarkeit eine ausreichende Festigkeit aufweisen.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bestehen die Mikropartikel aus der sehr leicht und vollständig in Wasser löslichen polyanionischen Hyaluronsäure oder in einer anderen Ausführung aus Pectinsäure, aus Xanthan und oder deren Salzen und/oder deren Derivaten. Derivate sind die Uronide der Hyaluronsäure oder der Pectinsäure oder die sulfatierten Polysac- charide bzw. deren Salze.
Die Uronide werden in ansich bekannter Weise durch den partiellen Abbau der Hyaluronsäure über eine ß-Elimierung mit dem Enzym Hyaluronatlyase oder der Pectinsäure mit dem Enzym Pectatlyase erhalten. Vorteilhaft an ihnen ist, daß sie auf Grund der Doppelbindungen sehr intensive radikalfangende und angiogene Eigenschaften bei eingeschränkter Quellbarkeit besitzen. Sie fördern das Zellwachstum bzw. den Heilungsprozeß ähnlich wie die natürliche Hyaluronsäure. Sie werden leichter als die hochmolekulare Hyaluronsäure aus der Matrixoberfläche durch Wasser unter Bildung von Poren mit Porengrößen von 1 μm bis zu 1000 μm ausgewa- sehen.
Sulfatierte polyelektrolytische Polymere, bevorzugt sulfatierte Hyaluronsäure mit Sulfatierungs- graden zwischen 0,1 bis 3,9, bevorzugt 1 bis 3, verringern durch ihre Anwesenheit das Adhäsionsverhalten von Blut und tierischen Zellen an der Materialoberfläche. Durch ihre Anwesenheit als Minorkomponente kann somit die Adhäsion der Zellen reguliert werden. Besonders vorteilhaft ist ihre erfindungsgemäße Anwesenheit in Folien, die zur Trennung von Organen nach Operationen mit dem Ziel der Vermeidung von Verwachsungen oder zur Abdichtung von textilen Gefäßimplantaten genutzt werden.
In einer anderen Ausführung werden die Mikropartikel aus Polyelektrolyten hergestellt, ausgewählt aus den in Wasser schwerer löslichen, aber in Wasser quellbaren Erdalkalimetallsalzen der Alginsäure, dem nur unter leicht sauren pH-Bedingungen löslichen polykationischen Chitosan oder den schwerlöslichen Polyelektrolytkomplexen des Chitosans mit den polyanionischen Biopolymeren, bevorzugt mit Hyaluronsäure. Durch die Polyelektrolytbildung wird die ansich wasserlösliche polyanionische Komponente an das biokompatible Verbundmaterial in einer im Wasser schwer löslichen Form gebunden. Durch Beschichten mit einer chitosanhaltigen Lösung wird die Quellbarkeit und die Löslichkeit in wässriger Umgebung der Oberfläche des biokopati- blen Verbundmaterials verringert.
Die porenbildenden, wasserlöslichen Partikel werden bei Flüssigkeitszutritt aus der Matrix herausgelöst und hinterlassen Poren bis zu einer Größe von 1 mm. Die Partikel bestehen aus Kristallen oder Aggregaten von Substanzen, die in den Kulturmedien der Zellzucht vorhanden sind wie Glukose, Saccharose, L-Aminosäuren, Natriumbicarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphaten, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid oder Kochsalz. Der Durchmesser der porenbildenden Partikel bestimmt die Porendurchmesser. Poren können im Material als offene, geschlossene oder durchgängige Hohlräume vorhanden sein. Es war zwar bekannt, daß man Poren durch Auslaugen von Kochsalzkristallen mit Wasser in Gießfolien herstellen kann. Neu ist eine Ausführungsform der Erfindung, daß das Auslaugen erst während der Anwendung der Gießfolien in einer wässrigen Umgebung, wie sie im menschlichen Körper oder in einer Zellkultur vorliegt, erfolgt. Neu ist auch, daß Partikel von anderen Nährbo- denkonstituenten zur Porenbildung durch Auslaugen eingesetzt werden. Damit wird das Problem umgangen, daß ein selbständiger Auslaugeschritt zu nicht gewünschten Verlusten der polyelektrolytischen Polymere führen würde. Die Zusammensetzung des Kulturmediums muß in seiner Zusammensetzung der durch das Auslaugen zusätzlich zugeführten Konstituenten Rechnung tragen. Als Hilfstoff kann erfindungsgemäß auch ein wasserlöslicher Weichmacher, bevorzugt ein Ester der Zitronensäure, bei der Herstellung des Materials zugefügt werden. Der Weichmacher verhindert Versprödungen des Materials und erhöht die Flexibilität. Vorteilhaft ist, daß die wasserlöslichen Weichmacher vom Typ der Zitronensäureester durch Auswaschen leicht entfernt werden können. Das biokompatible Verbundmaterial wird anwendungsspezifisch durch Anwesenheit weiterer Konstituenten, wie Hilfstoffe, Wirkstoffe oder Arzneimittel oder durch spezielle Ausführungen des Herstellungsprozesses variiert. Beispielsweise können Antibiotika oder entzündungshemmende oder blutgerinnungshemmende Mittel zugesetzt werden. Die Hyaluronsäureuronide und die sulfatierten Polysaccharide, beispielsweise vom Typ der sulfatierten Hyaluronsäure besitzen neben ihrer strukturgebenden Eigenschaften als Materialkomponenten solche Wirkstoffeigenschaften.
Es war nicht zu erwarten, daß das biokompatible Verbundmaterialie so überraschend gute physiologische Eigenschaften und eine so ausgeprägte Biokompatibilität besitzen würde. Es erwies sich als sehr vorteilhaft, daß die mikrodispersen polyelektrolytischen Partikel eine biokompatible hydrophile äußere und innere Oberfläche der Materialien erzeugen. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von Hyaluronsäure, ihren Salzen, ihren Polyelektrolytkomplex mit Chitosan und ihren Uroniden als erfindungsgemäße polyelektrolytische Partikel. Diese Verbindungen haben in nativer Form herausragende wundheilende, angiogene und radikalfangende Eigenschaften. Diese Eigenschaften bleiben in dem erfindungsgemäßen Verbundmaterial im Gegensatz zu den chemisch vernetzten Hyaluronsäuren oder den Hyaluronsäureestern, bei denen die für die Biokompatibilität verantwortlichen chemischen Gruppen durch die chemischen Bindungen maskiert sind. Vorteilhaft ist, daß das biokompatible Verbundmaterial die Makropha- gen aktiviert, die das Zellwachstum fördernde Wachstumsfaktoren freisetzen.
Die als mikrodisperse Partikel eingeschlossene, bevorzugt eingesetzte Hyaluronsäure verbleibt, obwohl wasserlöslich, bei Wasserzutritt teilweise in der Matrix des Materials. Sie quillt auf und reguliert den weiteren Wasserzutritt. Durch das Quellen werden die Gießfolien sehr flexibel. Durch die adhärente Oberfläche werden auch unregelmäßig geformete Wundoberflächen weitgehend abgedeckt. Aus dem gleichen Grund wird die Haftung adhärenter Zellen gefördert. Die Umgebung um die durch Suspension von wässrigen Lösungen von Polyelektrolyten gebildeten Poren und deren Innenwände erwiesen sich als besonders geeignet für das Anwachsen und Durchwachsen von Keratinozyten.
Ohne die Erfindung einzuschränken, soll die Erfindung durch einige Parameter und Herstellungs- Varianten erläutert werden.
Die Suspension enthaltend gelöste Polyalkanoatester, Mikropartikel, porenbildender Partikel und andere Konstituenten wird in einem organischen Lösemittel wie Chloroform oder Methylenchlorid suspendiert. Die Suspension wird auf eine Form als Gießlösung aufgebracht und die Folie durch Verdunsten des organischen Lösemittels erzeugt. Die Form ist in einer Ausführung eine planen Fläche z.B. eine Glasplatte oder einTrägermaterial aus Kunststoff, in einer anderen ein textiles Gewirk, beispielsweise in Form eines Gefäßimplantats oder sie besitzt eine unregelmäßig geformte Oberfläche. Erfindungsgemäße Flächengebilde bzw. Membranen besitzen je nach Anwendungszweck eine Dicke von 1 μm bis 500 μm, bevorzugt 10 μm bis 20 μm.
Sie können durchgehende Poren mit Öffnungsweiten, die etwa zwischen 10 μm und 1000 μm liegen oder Anordnungen von Schlitzen mit Längen zwischen 0,5 mm und 10 mm aufweisen. Letztere werden durch Schneiden mit schneidenden Werkzeug hergestellt. Andere Makroporen können auf bekannte Weise durch Stechen mit stechenden Werkzeugen oder mit Hilfe von Laserstrahlen hergestellt werden. Durch die Makroporen wird das Material durchlässig für die auf der Folienoberfläche kultivierten Zellen. Der Bewuchs des Wundoberfläche durch teilungsfähige Hautzellen wird ermöglicht. Außerdem kann das Wundexudats bei der Verwendung der Gießfolien als Wundabdeckung abfließen.
Eine mikro- bis makroporöse Struktur wird erfindungsgemäß auch dadurch erzeugt, daß eine hochviskose erfindungsgemäße Suspension mit einem Gehalt von mindestens 40 g/l Polyhy- droxyalkanoat hergestellt wird und in dieser Lösung eine wässrige Lösung der Polyelektrolyte suspendiert wird, die gegebenfalls vorher mit einer Ethanolmenge versetzt wird, bei der der Polyelektrolyt gerade noch nicht ausfällt. Nach Abdunsten, beispielsweise des Chloroforms, bilden sich in den Gießfolien je nach der Größe der suspendierten Partikel teilweise durchgehende Mikro- als auch Makroporen. Der sirupähnliche, hochviskose Zustand der Suspension verhindert hierbei das Entmischen der organischen und der suspendierten wässrigen Phase während des Gießprozesses.
Eine mikro- bis makroporöse Struktur wird erfindungsgemäß durch die polyelektrolytischen Mikroartikel und/oder durch die porenbildenenden Nährbodenbestandteile präformiert. Die Partikel werden ausgewaschen oder lösen sich nach Implantation in der Gewebeflüssigkeit oder bei der Zellzucht im Medium der Zellkultivierung unter Bildung von Hohlräumen auf. Andere erfindungsgemäße Flächengebilde entstehen durch Tauchen von Formen in die Suspension des polyelektrolytischen Mikropartikel und des Polyalkanoatsesters in einem organischen Lösemittel und anschließenden Verdunsten des Lösemittels und gegebenfalls Wiederholung der Prozedur. Das Flächengebilde kann anschließend von der Form gelöst werden oder es kann auf der Form verbleiben. Besonders im Fall eines Abdichten von natürlichen Geweben oder von porösen, textilen Gefäßimplantaten verbleibt das Material als dünner Film auf der Oberfläche bzw. zwischen den Maschen des textilen Gefäßimplantats.
Die Kultur von Zellen auf und im Inneren des erfindungsgemäßen Materials erfolgt mit Zellen verschiedener Herkunft wie beispielsweise Epithelzellen, Endothelzellen, Langerhanssche Inselzellen, Leberzellen, Hautzellen, teilungsaktive Zellen der Haarwurzel und Kerationozyten. Zur Besiedelung mit Zellen wird das Material mit einem an sich bekannten Zellkultivierungsmedi- um überschichtet und gegebenfalls langsam bewegt. Nach etwa 6 Stunden sind die porenbildenden Partikel ausgewaschen und die Kultur wird mit adhärenten Zellen beimpft. Nach Bewachsen werden die Materialien entnommen und unter aseptischen Bedingungen implantiert oder auf Wundflächen aufgelegt.
Beispiel 1
Feinreinigung des 3-PHB: 100 g 3-Poly-ß-hydroxybutyrat (3-PHB) mit einer Molmasse von 1J00 kD werden zusammen mit 50 g Kieselgel 1020 P (Chemiewerk Bad Köstritz) mit 5 I frisch destilliertem Chloroform versetzt und 1 Stunde unter Erwärmen auf Temperaturen im Bereich von 62°C unter Verwendung eines Rückflußkühlers gerührt. Das Kieselgel wurde vorher 10 Stunden auf eine Temperatur von 180°C zwecks Entfernung von Pyrogenen in einem Trockenofen erwärmt. Die Suspension wird durch Filtration bei Temperaturen von etwa 50°C - 60°C durch ein Filter mit einer Porenweite von 10 μm - 25 μm (Seitz T 1500) filtriert. Das Filtrat wird mit 100 ml Chloroform versetzt und noch einmal mit 10 g Kieselgel 1020 P (Chemiewerk Bad Köstritz) versetzt und unter Erwärmen auf Temperaturen von etwa 60°C 1 Stunde gerührt. Anschließend wird die Suspension durch einen Filter mit einer Porenweite von 3 μm - 8 μm (Seitz T 500) bei Temperaturen von 50°C - 60°C filtriert. Anschließend wird das 3-PHB durch Eingießen in 80% wässrigen Methanol ausgefällt. Das 3-PHB wird mit Ethanol gewaschen und anschließend bei 40°C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Man erhält ein gereinigtes 3-PHB welches zur Herstellung der Verbundmaterialien entsprechend nachfolgender Beispiele eingesetzt wird.
Beispiel 2
Gießen einer kleinporigen Folie (Porenweite 20 μm bis 100 μm):
60 g entsprechend Beispiel 1 hergestelltem 3-PHB wird in einem einem Liter frisch destilliertem Chloroform gelöst. Zu dieser Lösung werden 4 g einer wäßrigen Lösung, die 20 g/l Natriumsalzes der Hyaluronsäure mit einer Molmasse im Bereich von 1.300 bis 1.700 kD enthält sowie 3,2 ml absolutes Ethanol gegeben und die Lösung kräftig gerührt bis die Tröpfchen der wäßrigen Phase homogen suspendiert sind. Die Suspension wird mit einem Rakel auf einer Glasplatte ausgestrichen. Der Abstand der Rakelkante bis zur Glasoberfläche (Spaltbreite) beträgt 500 μm. Nach Trocknen der beschichteten Glasplatten unter einem Abzug zur Entfernung des Chloroforms und Stehen an der Luft unter Reinraumbedingungen wird die Folie mit wenig Injektionswasser angequollen und anschließend von ihrer Unterlage abgehoben. Nach Trocknen der Folie an Luft bei 56°C und Entfernen des Wassers entstehen Folien, die etwa 20 μm dick sind und Poren im Größenbereich von 10 μm bis 100 μm enthalten.
Beispiel 3
Gießen einer grobporigen Folie: Wie in Beispiel 2 wird eine Folie hergestellt, es entfällt jedoch der Ethanolzusatz. Es bilden sich Poren mit Porenweiten zwischen 20 μm bis 500 μm.
Beispiel 4
Gießen auf einem Kunststoffband: Die Ausgangsmaterialien werden wie in Beispiel 2 hergestellt. Die Gießlösung wird auf einer bandförmigen Folie aus Polyterephthalat und einer Breite von 20 cm, welche sich mit einer Geschwindigkeit von 2 m/min unter dem stationär angeordneten Rakel gleichförmig bewegt, bei einer Spaltbreite von 300 μm aufgebracht. Anschließend erfolgt eine Trocknung unter Reinraumbedingungen bei 56°C bis 58°C.
Beispiel 5
Gießen einer nichtporigen Folie, enthaltend Hydrokolloidpartikel:
45 g/l 3-PHB in Chloroform werden mit 250 mg Hyaluronsäure-Partikel, welche einen Partikeldurchmesser kleiner als 5 μm aufweist, unter starken Rühren suspendiert. Die entstandene, gleichmäßig getrübte Suspension wird mit einem Rakelabstand von 500 μm auf Glasplatten ausgestrichen. Es bilden sich nach Trocknen bei Raumtemperatur an der Luft Folien mit einer Folienstärke von 20 μm, welche Einschlüsse der Hyaluronsäurepartikel enthält.
Beispiel 6 Folien mit eingeschränkter Porengrößenverteilung:
Es wird wie in Beispiel 2 verfahren. Zusätzlich wird zu der der 3-PHB/Chloroform-Lösung zugesetzte Natriumhyaluronatlösung mit 19 g/l Natriumhyaluronat mit einer Molmasse von 800-kD zusätzlich Phenylalanin in einer Konzentration von 1 g/l zugesetzt. Nach dem Gießen und Trocknen entsprechend Beispiel 2 entsteht eine kleinporige Folie. Beispiel 7 Einsatz von Hyaluronsäure-Uronid in porösen Folien:
Entsprechend Beispiel 3 wird an Stelle der Natriumsalzes der Hyaluronsäure das Natriumsalzes des Hyaluronsäure-Uronides mit einer Molmasse von 20 kD eingesetzt. Nach Gießen und Trocknen entsprechend Beispiel 2 entsteht eine großporige Folie. In einem Parallelexperiment wird L-Phenylalanin wie in Beispiel 6 beschrieben zugesetzt. Es bilden sich viele kleine Poren.
Beispiel 8
Gießen einer sehr dünnen Folie: Eine Gießlösung wie in Beispiel 4 beschrieben, die aber nur 30 g/l 3-PHB enthält, wird wie in
Beispiel 4 bei einem Rakelabstand von 250 μm gegossen. Die Folienstärke der erhaltenen Folien nach Trocknen beträgt 8 μm.
Beispiel 9 Beschichtung unter Anwendung einer Koronaentladung:
Auf einem Kunsstoffband aus Polyterephthalat wird 3-PHB-Folie entsprechend Beispiel 4 gegossen. Es entstehen 3-PHB-Verbundmaterial-Folien mit einer Schichtdicke von etwa 15 μm, die auf dem Kunststoffband haftet. Anschließend an die Trocknung bei 58°C erfolgt eine Aktivierung der auf dem Kunststoffband aufliegenden Folie dadurch, dass das Band durch eine Koronaentladung geführt wird. Anschließend erfolgt eine Besprühung der Folie mit einer wässrigen 1% igen Natriumuronid-Lösung Die Molmasse des Uronids beträgt 15 kD. Die auf aufgebrachte Menge dieser Lösung beträgt 1 ml bis 3 ml pro 100 cm2.
Beispiel 10 Folie, enthaltend Weichmacher:
Eine 45 g/l 3-PHB enthaltende Chloroform-Lösung und fester Hyaluronsäurepartikel entsprechend Beispiel 4, wird mit 100 μl Zitronensäuretriethylester versetzt. Bei einem Rakelabstand von 500 μm wird eine Folie entsprechend Beispiel 3 gegossen. Es entsteht eine dehnbare Folie mit einer durchschnittlichen Foliendicke von 12 μm.
Beispiel 11
Zusatz von Glucosepartikeln:
Bei einer Folieherstellung entsprechend Beispiel 5 werden zusätzlich 200 mg Glucosepartikel mit einem Partikeldurchmesser von etwa 30 μm in der Lösung suspendiert. Nach Herstellung der Folien entsprechend Beispiel 5 entstehen Folien die keine Poren aufweisen. Nach Einbringen der Folien in ein submerses Zellkulturmedium bilden sich durch Herauslösen der Glucosepartikel und der Hyaluronatpartikel Poren mit einem Durchmesser von etwa 25 μm.
Beispiel 12 Zusatz von Kochsalzpartikel:
Bei einer Folieherstellung entsprechend Beispiel 5 werden zusätzlich 200 mg Kochsalzpartikel mit einem Partikeldurchmesser von etwa 30 μm suspendiert. Nach Herstellung der Folien entsprechend Beispiel 5 entstehen Folien die keine Poren aufweisen. Nach Einbringen der Folien in ein submerses Zellkulturmedium bilden sich durch Herauslösen der Kochsalzpartikel und der Hyaluronatpartikel Poren mit einem Durchmesser von etwa 25 μm.
Beispiel 13
Folien enthaltend Hyaluronat und Chitosan:
0,01 g Chitosan werden in 10 ml destilliertem Wasser suspendiert und unter Rühren wird tropfenweise konzentrierte Essigsäure zugegeben, bis das Chitosan sich gelöst hat. In die
Lösung werden 5 ml einer Lösung gegeben, die 2 g/l Natriumhyaluronat enthält. Der ausgefallene gelförmige Polyelektrolytkomplex, bestehend aus Chitosan und Hyaluronsäure wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Gel wird durch ein Sieb mit einer Porengröße von 50 μm gedrückt und die entstandenen Gelpartikel anschließend in einer 3 PHB/Chloroform-Lösung suspendiert. Mit der Lösung wird eine Folie entsprechend Beispiel 4 hergestellt.
Beispeil 14
Aufsprühen von essigsaurer Chitosanlösung:
Auf eine entsprechend Beispiel 4 hergestelltem Folienband wird in einem zweiten Durchlauf eine Chitosanlösung besprüht. Zur Herstellung der Citosanlösung wird 0,05 g Chitosan in 1 I destilliertem Wasser suspendiert und unter Rühren wird tropfenweise konzentrierte Essigsäure zugegeben, bis das Chitosan sich gelöst hat. Die Lösung wird mit einer Sprühvorrichtung auf das Folienband aufgesprüht. Die Sprühdichte liegt im Bereich von etwa 20 Sprühtropfen pro mm2 bei einer durchschittlichen Tropfenvolumen von 0,01 μl. Die Folie wird anschließend bei 58°C getrocknet.
Beispiel 15
Aufsprühen von Hyaluronsäurelösung auf ein chitosanhaltige Folie
0,01 g Chitosan werden in 5 ml destilliertem Wasser suspendiert und unter Rühren wird tropfen- weise konzentrierte Essigsäure zugegeben, bis das Chitosan sich gelöst hat. Diese Lösung wird in 1 I einer 3-PHB/Chloroform-Lösung entsprechend Beispiel 2 suspendiert und es werden Folien gegossen. Nach Trocknen der Folien wird eine Lösung von 0,05 g/l Hyaluronsäure als etwa 2 μm bis 5 μm als dünne Schicht auf die Folie gesprüht. Die besprühten Folien werden anschließend bei Raumtemperatur getrocknet.
Beispiel 16
Gießen einer kleinporigen, chitosanhaltigen Folie:
In einem Liter einer entsprechend Beispiel 1 hergestellten, vollständig klaren 3-PHB/ChIoroform- Lösung, die 60 g/l 3-PHB enthält, werden 4 g einer wäßrigen Lösung, die 20 g/l Natriumsalzes der Hyaluronsäure mit einer Molmasse im Bereich von 1.300 bis 1J00 kD enthält und 1 g einer essigsauren Lösung von 5 g/l Chitosan sowie 3,2 ml absolutes Ethanol gegeben und die Lösung kräftig gerührt bis die Tröpfchen der wäßrigen Phase homogen suspendiert sind. Die Chitosanlösung wird durch Zusammengeben von Chitosan und Wasser unter Zufügen von gerade soviel konzentrierter Essigsäure, bei der das Chitosan vollständig gelöst ist, hergestellt. Die Suspension wird mit einem Rakel auf einer Glasplatte ausgestrichen. Der Abstand der Rakelkante bis zur Glasoberfläche (Spaltbreite) beträgt 500 μm. Nach Trocknen der beschichteten Glasplatten unter einem Abzug zur Entfernung des Chloroforms und Stehen an der Luft unter Reinraumbedingungen wird die Folie mit wenig Injektionswasser angequollen und anschließend von ihrer Unterlage abgehoben. Nach Trocknen der Folie an Luft in einem Reinraum bei 56°C und Entfernen des Wassers entstehen Folien, die etwa 20 μm dick sind und Poren im Größenbe- reich von 10 μm bis 100 μm enthalten.
Beispiel 17
Abdichten eines textilen Gefäßimplantates
Eine aus Kunststoff (Dacron) hergestelltes textiles Gefäßimplantat mit einem Innendurchmesser von 0,5 cm und einer Länge von 5 cm wird in eine Lösung getaucht, die entsprechend Beispiel 2 hergestellt wird. Nach Abtropfen überschüssiger Lösung wird das Gefäßimplantat mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 30 bis 120 rpm in waagerechter Lage gedreht, um Tropfenbildung zu vermeiden. Nach Festwerden der Abdichtung erfolgt eine mehrtägiger Trockenprozeß in einem Reinraum bei Temperaturen von 40°C bis 50°C. Bei Gefäßen mit Innendurchmesser größer als 0,5 cm wird der Tauchprozeß wiederholt.
Beispiel 18
Proliferationsversuch:
Als Zellzuchtmedium wird das Medium DMEM (IBCO BRL, Kat.-Nr. 41966-029) mit einem Zusatz von 10 ml/i Penicillin/Streptomycin-Lösung (GIBCO BRL., Kat.-Nr. 043-05-140H) und 10 % fötalem Kälberserum eingesetzt. Die Keratinozyten-Zelllinie HaCaT wird in Multischalen (NUNC, Kat.-Nr. 143982) definiert (10 x 105 Zellen) in 0,8 ml DMEM pro Vertiefung eingesät. In die Vertiefung wird ein kreisrundes Stück der zu untersuchenden Folie aus dem biokompatiblen Verbundmaterial oder keine Folie eingelegt (Kontrolle). Die Bestimmung der Zahl der adhärenten Zellen erfolgt nach einer Inkubation über 72 h bei 37°C, 5% C02und 95% relativer Luftfeuchtigkeit, anschließendem Entfernen des Mediums, Waschen mit PBS/EDTA-Lösung, Trypsinierung mit 0,02 ml 0,25%iger Trypsinlösung durch elektronische Zytoanalyse. Die durchschnittliche Bewuchs der Proben mit den Zellen liegt zwischen 70% und 95% im Vergleich zur Kontrolle.
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Claims

Patentansprüche
1. Biokompatibles Verbundmaterial für medizinische Anwendungen, gekennzeichnet dadurch, daß eine Matrix aus Polyalkanoatester eingelagerte Mikropartikel eines oder mehrerer, in Wasser quellbarer polysaccharidischer Polyelektrolyten und/oder deren Salze und /oder deren Derivate mit sphärischer, faserförmiger oder unregelmäßiger Form mit einem Durchmesser zwischen 0,1 μm bis 100 μm und gegebenenfalls Hilfsstoffe, Wirkstoffe oder Arzneimittel enthält.
2. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Anspruch 1 , gekennzeichnet dadurch, daß die Matrix aus Poly-ß-hydroxybutyrat (3-PHB) besteht.
3. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Verbundmaterial offene, geschlossene oder durchgängige Poren aufweist.
4. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel polykationische polysaccharidische und/oder polyanionische polysacchari- dischen Biopolymere enthalten.
5. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel einen Polyelektrolytkomplex, gebildet aus einem polyanionischen und einem polykationischen Biopolymer, enthalten.
6. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel polyanionische sulfathaltige Biopolymere enthalten.
7. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel sulfatierter Hyaluronsäure mit Sulfatierungsgraden zwischen 0,1 bis 3,9, bevorzugt zwischen 1 bis 3 enthalten.
8. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel Hyaluronsäure und/oder deren Salze enthalten.
9. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel ein Uronid der Hyaluronsäure und/oder deren Salze enthalten.
10. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel Pectinsäure und/oder deren Salze enthalten.
11. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel ein Uronid der Pectinsäure enthalten.
12. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel Alginsäure und/oder deren Salze enthalten.
13. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Matrix Mikropartikel Xanthan und/oder dessen Salze enthalten.
14. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel Chitosan enthalten.
15. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel einen Polyelektrolytkomplex bestehend aus Chitosan und Hyaluron- säure und/oder deren Uronid enthält.
16. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel einen Polyelektrolytkomplex bestehend aus Chitosan und Xanthan enthält.
17. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Mikropartikel einen Polyelektrolytkomplex bestehend aus Chitosan und Pectinsäure und/oder deren Uronid enthält.
18. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das biokompatibles Verbundmaterial als Gießfolie in Form einer Membran mit einer Dicke von 1 μm bis 500 μm, bevorzugt 10 μm bis 20 μm hergestellt wird.
19. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß die Gießfolie wasserlösliche, nicht in organischen Lösemittel lösliche biokompatible porenbildende Partikel enthält.
20. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß in eine erfindungsgemäße Lösung von Polyalkanoat in einem organischen Lösemittel mit einem Gehalt größer als 40 g/l an gelösten Polyhydroxyalkanoat eine wässrige Lösung eines der Polyelektrolyten, die gegebenfalls mit Ethanol versetzt wird, suspendiert wird.
21. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18, gekennzeichnet dadurch, daß die porenbildenden Partikel aus Glukose, Saccharose, L-Aminosäuren, Natriumbicarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphaten, Magnesiumsulfat, Kaliumchlorid oder Kochsalz oder Kombinationen dieser Bestandteile bestehen.
22. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß das biokompatibles Verbundmaterial wasserlösliche Weichmacher, bevorzugt Ester der Zitronensäure enthält.
23. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18 bis 21, gekennzeichnet dadurch, daß das Biomaterial Makroporen mit einem Durchmesser zwischen 10 μm und
1000 μm aufweist.
24. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18 bis 21 , gekennzeichnet dadurch, daß Makroporen durch Einstechen mit einem Werkzeug oder mit Hilfe der Lasertechnologie hergestellt werden.
25. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 ,2 und 18 bis 21 , gekennzeichnet dadurch, daß die Gießfolie Makroporen in Form von Schlitzen mit einer Länge zwischen 0,5 mm bis 10 mm aufweist.
26. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18 bis 21 , gekennzeichnet dadurch, daß die Schlitze durch Einschnitte mit schneidenden Werkzeugen hergestellt werden.
27. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 , 2 und 18 bis 21 , gekennzeichnet dadurch, daß Membranen für die Trennung von lebenden Geweben Poren kleiner als 1 μm aufweisen.
28. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß textiler Gefäßprothesen in eine Suspension, bestehend aus den in einem organischen Lösemittel gelösten Materialkomponenten getaucht werden, der anhaftende Film anschließend getrocknet und der Prozeß gegebenfalls mehrfach wiederholt wird.
29. Biokompatibles Verbundmaterial gemäß Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß Ephitelzellen, Endothelzellen, Langerhanssche Inselzellen, Leberzellen, Hautzellen oder teilungsaktive Zellen der Haarwurzel oder Kerationozyten in und/oder auf dem Biomaterial kultiviert werden.
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