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WO2000037111A1 - Preparations de cellules de mammifere eventuellement transfectees avec un gene codant pour une substance active et les contenant - Google Patents

Preparations de cellules de mammifere eventuellement transfectees avec un gene codant pour une substance active et les contenant Download PDF

Info

Publication number
WO2000037111A1
WO2000037111A1 PCT/FR1999/002964 FR9902964W WO0037111A1 WO 2000037111 A1 WO2000037111 A1 WO 2000037111A1 FR 9902964 W FR9902964 W FR 9902964W WO 0037111 A1 WO0037111 A1 WO 0037111A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
preparation
microns
composition
aggregate
Prior art date
Application number
PCT/FR1999/002964
Other languages
English (en)
Inventor
Serge Timsit
Jérôme QUINONERO
Original Assignee
Neurotech (S.A.)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Neurotech (S.A.) filed Critical Neurotech (S.A.)
Priority to EP99973473A priority Critical patent/EP1140207A1/fr
Priority to AU13923/00A priority patent/AU1392300A/en
Priority to CA002355882A priority patent/CA2355882A1/fr
Priority to JP2000589221A priority patent/JP2002532117A/ja
Publication of WO2000037111A1 publication Critical patent/WO2000037111A1/fr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system

Definitions

  • the present invention relates to the preparation of genetically modified mammalian cells useful both as a model for research and for diagnosis or gene therapy, more particularly for the treatment of diseases of the cerebral nervous system in humans and possibly in animals.
  • gene therapy that is to say the in vivo correction of the phenotype of a disease through the use of a functional gene as a pharmacological agent
  • two types of gene therapy strategy can be distinguished: 0 - A so-called in vivo strategy, where the gene of interest is administered directly into the cells of the host.
  • ex vivo or cell gene therapy strategy consisting in removing and culturing cells chosen as vector, in transferring one or more genes, also called transgenes, into these cells, then in implanting cells genetically modified.
  • Cellular gene therapy has undeniable advantages such as the possibility of being able to verify, in vi tro, prior to transplantation, the effects of the introduction and expression of the transgene on the phenotype of the modified cells, the number of 5 copies. of the transgene, its transcription rate, the amount of protein produced and the biological effect thereof.
  • the cell population to be grafted can be purified in order to introduce a homogeneous graft both from the phenotypic point of view and from the production of the desired protein.
  • endothelial cells are the same.
  • adult endothelial cells form a very heterogeneous cell population, not only between organs, but also, in the same organ, between vessels of various calibers.
  • Endothelial heterogeneity is characterized by morphological differences but also by the expression of molecular markers specific to one or more populations of endothelial cells.
  • CNS central nervous system
  • BBB blood-brain barrier
  • the research carried out by the Applicant on the immortalization of mammalian cells, more particularly cerebral endothelials, has enabled it to obtain a large, homogeneous and perfectly characterized quantity of material to be grafted or injected allowing the implementation of an effective method of gene therapy for a disease in a patient.
  • the genetically modified immortalized brain endothelial cells such as the RBE4 cells not expressing a transgene, the RBEZ and RBE4 / GFP cells expressing a transgene, are capable of surviving and integrating into the vascular wall of the cerebral microvessels, as well as into the cerebral parenchyma.
  • microspheres 48 microns in diameter (900 microspheres) into the right internal carotid artery causes cerebral infarctions in the parieto-temporal cortex, the corpus callosum, the hippocampus, the thalamus and the lenticular nucleus (Miyaké et al. , 1993, Stroke, 24: 415-420).
  • the object of the present invention is therefore to offer an effective and simple solution making it possible to avoid the deleterious effects of injections of cell preparations, and thus to develop their application in human medicine.
  • This object is achieved thanks to a preparation of immortalized mammalian cells possibly transfected with at least one gene coding for an active substance, to be administered systemically in a subject, characterized in that it does not comprise an aggregate of said cells of a size likely to cause in said patient transient or permanent dysfunctions.
  • the immortalized cells are non-tumorigenic.
  • the preparations of the invention can then contain a large number of cells, of the order of 1,000 to 300,000 cells per microliter, making it possible to obtain a biological effect, whether diagnostic or therapeutic, effective without inducing a deleterious effect which can cause a transient or permanent decrease in the blood supply to an organ, such as pulmonary embolism, ischemic stroke, peripheral ischemia or even death.
  • a preparation of the invention does not include an aggregate of cells larger than about 200 microns, preferably greater than 50 microns and most preferably greater than 30 microns.
  • All types of cells can enter into the constitution of the preparations of the invention, such as cells of the endoderm, the epidermis or the mesoderm, such as cerebral or peripheral endothelial cells and their progenitor, the cells choroid plexus, epithelial cells, retinal pigment cells, ependymocytes, tanycites, neural stem and progenitor cells, or even embryonic stem cells.
  • the invention relates more particularly to endothelial cells and epithelial cells of mammals, advantageously cerebral or retinal.
  • the immortalization of the cells can be carried out by any method known to those skilled in the art, such as those described in the PCT patent applications published under the numbers WO96 / 11278 and WO97 / 40139. Particularly preferred within the framework of the invention are immortalized cells because these have the advantage of standardization of production in large quantities with high quality criteria.
  • the immortalized cells have a non-tumorigenic character obtained by any method known to those skilled in the art such as those described in the PCT applications cited above.
  • the absence of a cell aggregate capable of causing transient or permanent dysfunctions in subjects having received a preparation of the invention can be obtained by any treatment.
  • biological, chemical or physical of the cells preventing the formation of aggregate or specifically suppressing the aggregates of said cells of a size greater than about 200 microns, preferably greater than 50 microns and most preferably greater than 30 microns.
  • the cells are advantageously suspended in a medium allowing their survival and not promoting their re-aggregation.
  • a medium is, for example, any nutritive medium which does not favor aggregation such as PBS glucose without calcium or magnesium.
  • a biological treatment of cells according to the invention consists, for example, in selecting endothelial cells for particular adhesion criteria or in genetically modifying said cells by a nucleic acid sequence expressing an agent preventing the formation of aggregate or inhibiting the expression of an agent promoting the formation of aggregates of said cells.
  • sequences coding for adhesion molecules such as: ZOl, Z02, E-selectin, V.E. Cadherin, ICAM-1, occludin, P-CAM, etc., or - the introduction of sequences coding for molecules preventing the formation of aggregates, such as negative dominants of the adhesion molecules mentioned above or coding for decoy proteins.
  • a physical treatment of the cells according to the invention consists, for example, of filtration or sieving. Besides the exclusion of aggregates, this filtration or sieving offers the advantage of having a population of cells of uniform size.
  • This filtration or sieving is carried out as follows: The cells are filtered using shielding filters of advantageously 30 microns, then diluted and dissociated gently, for example by multiple pipetting, and the cell suspension is then aspirated in a syringe. The filter was previously soaked in sterile physiological serum then disinfected in alcohol at 100 °, air-dried, re-soaked in sterile physiological serum. The filter is then placed between the needle and the tip of the syringe containing the cells. The piston is gently pushed so as to have a drop by drop flow of the diluted cells.
  • a physical treatment can also be constituted by a sorting of FACS type "Fluorescent Analysis Cell Sorting”. Chemical treatment of cells according to
  • the invention consists, for example, in trypsinizing the cells or in subjecting them to the action of another protease.
  • the invention may or may not be transfected with one or more genes encoding an active substance which is useful for therapy or diagnosis.
  • the term “transfection with one or more genes coding for an active substance” means transfection of the cells with a nucleic acid fragment, such as an expression vector, integrated into the genome or present in the cytoplasm cells, and capable of allowing the expression of polypeptide (s), protein (s) or viral vector constituting directly or indirectly an active substance.
  • a nucleic acid fragment such as an expression vector
  • s polypeptide
  • protein protein
  • viral vector constituting directly or indirectly an active substance.
  • the invention also relates to the use of the above cell preparations for the preparation of a medicament intended for the diagnosis or the treatment by gene therapy of a disease in a patient by systemic administration of a sufficient quantity of said cells.
  • the invention therefore also relates to a pharmaceutical composition to be administered systemically in a subject, characterized in that it comprises a preparation of cells as described above, in combination in said composition with a pharmaceutically acceptable vehicle allowing the survival of said cells and not promoting their re-aggregation.
  • pharmaceutical composition is meant both therapeutic and diagnostic compositions.
  • the size of the aggregates which are not liable to induce, when the compositions of the invention are injected into a patient, transient or permanent dysfunctions are a function of the route of administration.
  • selective arterial injections by organ go directly into said organ without first passing through a filtering organ such as the lung. Consequently, for intra-arterial administration, the tolerated size of the aggregates is lower than for an intravenous injection.
  • the pulmonary filter can act and limit the presence of aggregates in the other organs.
  • the risk of deleterious effect during an intravenous injection exists since the Applicant has observed the death of animals, probably by pulmonary embolism, during the injection of endothelial cells which have not undergone prior filtration.
  • the physical criteria for the deformability of cells in a micro-vessel are different from that of a synthetic particle, and this parameter must be taken into account during cell treatments, such as for example in filtration, where the use of a 30 micron filter makes it possible to eliminate aggregates of more than 30 microns as a maximum and, consequently, the remaining cells, at least 90%, are isolated cells, the average diameter of which, for example an endothelial cell, is 10 microns.
  • the invention relates more particularly: on the one hand, a composition to be administered by the intra-arterial route, advantageously intra-carotid, in a patient, characterized in that it comprises a preparation of cells not comprising aggregate of said cells of a size greater than 50 microns and preferably greater than 30 microns, and
  • composition to be administered intravenously in a subject, characterized in that it comprises a preparation of cells not comprising an aggregate of said cells of a size greater than 200 microns and preferably greater than 100 microns.
  • compositions intravenously requires having selected or given cells specific properties allowing them to target the organ or tissue targeted. It may, for example, be a selection of endothelial cells having specific adhesion properties or a gene modification conferring on it the required properties of the target organ.
  • the intra-arterial injection route preferably intra-carotid for applications relating to the CNS, constitutes a preferred embodiment of the compositions of the invention.
  • systemic injection seems the most adequate because it allows the widest possible biodistribution
  • the analysis of this parameter by the Applicant to optimize the gene therapy process using the compositions of the invention led to the preferential retention of the carotid vascular network, which is the blood path closest to the CNS.
  • This network provides 80% of the cerebral blood flow necessary in humans for the proper functioning of the CNS and is accessible in human clinic but also to the animal experimenter.
  • the Applicant has shown in the context of the present invention that the injection of endothelial cells into the carotid is feasible while respecting the blood flow.
  • the intra-carotid injection caused mortality, and parenchymal lesions. Mortality was generally immediate and most often associated with respiratory disorders. The most plausible explanation is that the injection of cells caused fatal pulmonary embolism. Parenchymal lesions occurred when the amounts of endothelial cells were high and when the cell suspension was not filtered. These data confirm the concept of the present invention, according to which it is the cellular aggregates which are responsible for cerebral parenchymal lesions and mortality since they are minimized after filtration. The cerebral parenchymal lesions most probably correspond to cerebral infarctions since they appear in hyperintensity in T2 and are localized in the vascular territory of the internal carotid. Filtration has almost eliminated all these deleterious effects, in rare cases a dilation of the lateral ventricle was visible on the injection side.
  • compositions according to the invention comprise of the order of 1,000 to 300,000 cells per microliter of composition.
  • compositions according to the invention are very particularly useful in the field of gene therapy, but their use can also be envisaged in terms of diagnosis.
  • the invention relates more particularly to a pharmaceutical composition to be administered systemically, advantageously intra-arterially, in a method of gene therapy for a disease of the central nervous system in a subject, characterized in that the cells of the preparation present in said composition are transfected with at least one gene coding for an active substance in the treatment or prevention of a disease of the nervous system.
  • CNS disease is meant both the CNS itself and the eye, and in particular the retina, as well as the vessels constituting or irrigating it.
  • CNS diseases there may be mentioned, brain tumors, cerebral infarctions, neurodegenerative diseases such as those mentioned above, or arteriovenous or simply arterial malformations such as arterial or simply venous aneurysms, eye diseases and in particular retinal degenerations.
  • the cells of the compositions of the invention are transfected with a gene coding for an active substance in the treatment and / or prevention of the above pathologies.
  • the substance coded by the gene with which the cells were transfected can be directly or indirectly active, that is to say require: - the administration to the subject of a second substance interfering with the first or with the gene coding for this- ci, or exposure to an energy source, or transformation by a substance naturally present in the body, to achieve the therapeutic effect.
  • Mention may in particular be made of the substances and genes chosen from: growth factors, anti-apoptotic factors, killer genes, antiproteases, immunomodulators, tumor suppressor genes, genes blocking the cell cycle, or any other gene or active substance known to those skilled in the art to be useful in the prevention or treatment of CNS diseases.
  • compositions of the invention useful for the treatment of a CNS disease are, for example, dosed so as to allow administration of 1 million to 200 million cells per kilogram of weight of the subject to be treated.
  • the invention more particularly envisages advantageously immortalized cerebral endothelial cells.
  • Gene therapy is known by intracerebral grafting of genetically modified cells which apply to neurological deficits due to a disturbance in a restricted area of the central nervous system.
  • a low production of therapeutic molecule by small grafts, may be able to restore normal function.
  • injection by systemic route seems the most adequate. Indeed, the blood route is the classic route of administration of therapeutic substances. It allows the widest possible biodistribution.
  • the cerebral endothelial cell now appears as a means of choice.
  • brain endothelial cells are capable of constituting good vectors of gene therapy for the central nervous system.
  • the cerebral endothelial cells making up the cerebral vascular network are at the interface between the blood and the cerebral parenchyma and form the blood-brain barrier characteristic of the central nervous system. It has also been shown that they are capable of surviving and of establishing themselves in the central nervous system after an intracerebral graft (Quinonéro et al, Gene therapy, 1997, 4, 111-119).
  • the work carried out within the framework of the present invention made it possible to show, using three different techniques, bisbenzimide staining and reporter genes (beta-galactosidase and GFP) that the endothelial cells were capable, on the one hand of s' integrate into the vessels and on the other hand survive within the parenchyma outside the lumen of the vessels. These results therefore demonstrate that it is possible to express a strangene in the brain.
  • the therapeutic potentials of the compositions of the invention therefore more specifically target diseases of the central nervous system.
  • the more diseases particularly concerned by this approach are brain tumors and cerebral infarctions.
  • Neurodegenerative diseases can also be concerned and in particular Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and Huntington's disease.
  • the subject of the invention is very particularly the use of immortalized cerebral endothelial cells possibly transfected with a gene coding for an active substance for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention by gene therapy of a disease of the central nervous system in a subject by administration by intra-arterial (intra-carotid) route to said subject of a sufficient quantity of said cells to deliver said active substance to the central nervous system.
  • intra-arterial intra-carotid
  • Figure 1 shows the parenchymal lesions induced by injections of endothelial cells.
  • Figure 2 shows the identification of pre-labeled RBE4 cells in the brain.
  • the following three cell lines were used: the parental line RBE4 and two lines derived from RBE4, the line RBEZ and the line RBE4 / GFP.
  • the RBE4 line was obtained by transfection of brain rat endothelial cells from Lewis rat in primary culture with an immortalizing plasmid containing the E1A sequence of the adenovirus type 2.
  • the culture conditions for the RBE4 cells and the cells derived from RBE4 have already described previously (Durieu-Trautmann et al., Frontiers in CVB, 1993,331: 205-210).
  • the RBEZ cells were obtained by exposure of the RBE4 cells to a non-replicative MFG-NB retroviral vector containing the LacZ gene coding for the E. coli beta-galactosidase associated with a nuclear localization sequence (nls) (Lai et al., PNAS, 1994, 91: 9695-9699).
  • the RBEZ cells were then selected by FACS (fluorescence-activated cell sorting) using the fluorescent substrate of beta-galactosidase, fluorescein di-beta-galactopyranoside (Lai et al., PNAS, 1994, 91: 9695-9699).
  • the RBE4 / GFP line expressing GFP was obtained after transfection of RBE4 cells with a construct containing the GFP sequence under the control of the ubiquitin promoter in RBE4 cells.
  • the cells in culture were dissociated by trypsin, rinsed several times and suspended in solution at the initial concentration of 300,000 cells per microliter.
  • the dilution solution used was either PBS glucose (10 mMol) comprising calcium and magnesium, or PBS glucose without calcium or magnesium.
  • PBS glucose 10 mMol
  • PBS glucose without calcium or magnesium.
  • different concentrations of cells were used. These final cell concentrations ranged from 10,000 cells to 300,000 cells per microliter. The total volume injected was 500 to 1000 microliter.
  • the RBE4 cells in culture were premarked with bisbenzimide (Hoechst 33342 Sigma) at a concentration of 7.5 mg / ml for 15 minutes at 37 ° C. This nuclear dye fluoresces blue under ultraviolet light from the fluorescence microscope.
  • the final solution was filtered using 30 micron blocking filters (Polylabo, nylon blotting cloth # 87404 NY 30 HC) according to the following protocol: the cells at the initial concentration were aspirated at l using a yellow cone of a P200 pipette to be diluted in the dilution solution. The cells are then diluted and dissociated gently by multiple pipetting of the preparation using a P1000 pipette and its corresponding blue cone. The cell suspension is then aspirated into a 1 ml syringe with an 18 gauge pink needle. The 30 micron filter was previously soaked in sterile physiological saline then disinfected in alcohol at 100 °, air dried, re-soaked in sterile physiological serum.
  • 30 micron blocking filters Polylabo, nylon blotting cloth # 87404 NY 30 HC
  • the filter is then placed between the needle and the tip of the syringe containing cells.
  • the piston is gently pushed so as to have a drop by drop flow of the diluted cells.
  • the filter is replaced. This replacement maneuver can be done up to 2 times for one ml.
  • the cell viability was measured before and after filtration after staining with trypan blue and reading on a Malassez cell.
  • cauterization of the collateral branches of the external carotid artery was performed using a bipolar thermocoagulator. Thermocoagulation was also performed on the cephalic end of the external carotid artery in order to have a catheterizable stump as long as possible.
  • a vascular clip (SUNDT type for arteriovenous malformation), previously soaked in diluted heparin, is then placed on the external carotid, close to the carotid bifurcation.
  • a catheterization of the stump excluded from the arterial circulation is carried out using a fin catheter in Vialon (0.7x19 mm, Insyte-W TM Becton Dickinson) previously rinsed with dilute heparin.
  • a point of glue with Super-glue (Loctite) on the arterial collar around the catheter is then placed in order to secure the stump and the catheter.
  • the clip is opened to allow backflow of arterial blood into the catheter and the evacuation of any clot that may have formed.
  • the flow is again interrupted to allow adaptation of the syringe, containing the cells, to the tip of the catheter.
  • the flow is then restored and the injection is carried out manually or using a motorized syringe pump whose speed will have been previously adjusted to allow a balance of the flows between the blood arriving from the common carotid and the solution coming from the catheter .
  • the injection is done under the control of a surgical magnifying glass (Leica).
  • the stump is cauterized while checking that the flow in the common and internal carotid is perfectly maintained.
  • the control animals underwent the same operation as that described above, but only the cell suspension dilution buffer was injected, without the endothelial cells.
  • Some rats underwent a brain MRI on a 7 Tesla device (Varian device) or even spectroscopy.
  • MRI imaging was performed with contiguous coronal sections of 1 mm from the whole brain and contiguous coronal sections centered on the anterior brain (telencephalon and diencephalon, excluding the olfactory bulb) of 500 microns.
  • T2-weighted sequences were used in the majority of cases.
  • a diffusion sequence was added to identify lesions that may not be visible in T2 sequences.
  • spectroscopy was performed to compare the right and left spectral profiles in the same animal.
  • the animals were sacrificed at different times after injection. In the event of immediate sacrifice, the various organs removed (brain, heart, liver, kidney, eye, spleen, testicle, left carotid) were immediately frozen in isopentane cooled by liquid nitrogen. In the event of later sacrifices, the animals had a transcardiac perfusion of 100 ml of PBS and then 500 ml of 4% PFA. The sampled brains were post-fixed for 2 to 4 hours in 4% PFA and then cryoprotected in sucrose (20 to 30%) for 48 hours. The brains were then frozen in isopentane.
  • A, B, C injection of 25 million unfiltered RBEZ cells
  • D, E, F injection of 25 million RBEZ cells after filtration.
  • A, B, C the presence of a left cortical and putaminal hypersignal ipsilateral to the injection which is the witness of a cerebral infarction; the right and left lateral ventricles (hypersignals more intense and homogeneous than the lesion) are dilated; the lesion also causes a mass effect with displacement of the midline.
  • D, E, F we note the absence of parenchymal hypersignal, ventricular dilation and mass effect.
  • FIG. 3 shows in A, an RBEZ cell is incorporated into the lumen of an intra-cerebral vessel.
  • B an RBEZ cell in the extraluminal intra-parenchymal position.
  • C the border of the vessel (black arrows).
  • GFP expressing cells were visible as green fluorescent staining 1, 3 and 5 days after injection of GFP endothelial cells.
  • the green labeling of GFP was visible in both the cytoplasm and the nucleus of the cell, as confirmed by the counterstaining of the nucleus using Bisbenzimide.
  • Two types of endothelial cell morphology were visible. On the one hand, isolated round cells which appeared in the endovascular position and on the other hand, cells often elongated in groups of 2 within the parenchyma.

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Abstract

La présente invention a pour objet une préparation de cellules de mammifère éventuellement transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active, pour être administrée par voie sytémique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'agrégat desdites cellules d'une taille susceptible d'entraîner chez ledit patient des dysfontionnements transitoires ou permanents. L'invention concerne aussi les compositions pharmaceutiques comprenant une telle préparation et un véhicule acceptable.

Description

PREPARATIONS DE CELLULES DE MAMMIFERE EVENTUELLEMENT TRANSFECTEES AVEC UN GENE CODANT POUR UNE SUBSTANCE ACTIVE ET LES CONTENANT
5 La présente invention concerne la préparation de cellules de mammifères génétiquement modifiées utiles tant comme modèle pour la recherche que pour le diagnostic ou la thérapie génique plus particulièrement pour le traitement des maladies du 0 système nerveux cérébral chez l'homme et éventuellement 1 ' animal .
Parmi les nouveaux traitements des maladies humaines, la thérapie génique, c'est-à-dire la 5 correction in vivo du phénotype d'une maladie à travers l'utilisation d'un gène fonctionnel comme agent pharmacologique, est en plein essor. Schématiquement , deux types de stratégie de thérapie génique peuvent être distingués : 0 - Une stratégie dite in vivo, où le gène d'intérêt est administré directement dans les cellules de l'hôte.
- Une stratégie dite ex vivo ou de thérapie génique cellulaire, consistant à prélever et mettre en 5 culture des cellules choisies comme vecteur, à transférer in vi tro un ou plusieurs gènes, aussi désignés transgènes, dans ces cellules, puis à implanter des cellules génétiquement modifiées.
0 La thérapie génique cellulaire présente des atouts indéniables comme la possibilité de pouvoir vérifier, in vi tro, préalablement à la greffe, les effets de l'introduction et de l'expression du transgène sur le phénotype des cellules modifiées, le nombre de 5 copies du transgène, son taux de transcription, la quantité de protéine produite et l'effet biologique de celle-ci . La population cellulaire à greffer peut être purifiée afin d'introduire un greffon homogène tant du point de vue phénotypique, que de la production de la protéine désirée.
Parmi les cellules utilisées en thérapie génique cellulaire, il a été proposé dans la demande de brevet internationale PCT publiée sous le No. O93/13807 d'administrer par voie intraveineuse des cellules endothéliales non immortalisées génétiquement modifiées pour exprimer au niveau de sites angiogéniques des produits thérapeutiques .
Toutefois, il convient de rappeler que toutes les cellules endothéliales ne sont pas identiques. En effet, les cellules endothéliales de l'adulte forment une population cellulaire très hétérogène, non seulement entre les organes, mais aussi, dans un même organe, entre les vaisseaux de divers calibres. L'hétérogénéité endothéliale se caractérise par des différences morphologiques mais aussi par l'expression de marqueurs moléculaires spécifiques à une ou des populations de cellules endothéliales. Par exemple dans le système nerveux central (SNC) , les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébraux forment, en association avec les cellules astrocytaires du parenchyme cérébral, la barrière hémato-encéphalique (BHE) .
La mise au point de préparation de cellules de mammifère pour la thérapie génique présente donc un problème quant à l'homogénéité et à la caractérisation desdites cellules. Une solution efficace à ce problème consiste à immortaliser les cellules . On a ainsi décrit dans l'art antérieur des lignées de cellules endothéliales cérébrales ou encore de cellules endothéliales et épithéliales rétiniennes de mammifères immortalisées portant éventuellement un transgène utiles pour le traitement des maladies neurologiques y compris les tumeurs . On peut citer tout particulièrement les travaux de la Demanderesse rapportées dans les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les numéros W096/11278 et WO97/40139.
Les travaux de recherche réalisée par la demanderesse sur 1 ' immortalisation de cellules de mammifère, plus particulièrement endothéliales cérébrales, lui ont permis d'obtenir une quantité importante, homogène et parfaitement caractérisée, de matériel à greffer ou à injecter permettant la mise en œuvre d'un procédé efficace de thérapie génique d'une maladie chez un patient. Ainsi, il a été mis en évidence dans le cadre de la présente invention, qu'après avoir été injectées dans le compartiment sanguin irriguant le SNC, les cellules endothéliales cérébrales immortalisées génétiquement modifiées, comme les cellules RBE4 n'exprimant pas de transgène, les cellules RBEZ et RBE4/GFP exprimant un transgène, sont capables de survivre et de s ' intégrer dans la paroi vasculaire des micro-vaisseaux cérébraux, ainsi que dans le parenchyme cérébrale. La démonstration de l'intérêt de cette approche a demandé une maîtrise technique tant dans la mise au point des préparations cellulaires et des compositions les contenant qui ont été injectées, que dans les modes opératoires de l'injection. En effet, les travaux de la Demanderesse concernant l'injection des cellules à des animaux lui ont permis de mettre en évidence l'effet délétère de la présence d'aggrégats cellulaires dans les compositions injectées, comme par exemple des accidents vasculaires cérébraux ou des embolies pulmonaires. Or, de manière surprenante, l'effet délétère induit par la présence de ces agrégats cellulaires lors de l'injection ne semble pas avoir été envisagé jusqu'à ce jour. Pourtant, on a proposé dans l'art antérieur d'injecter des particules conjugués ou non a un agent actif pour réaliser un diagnostic ou une thérapie. On peut citer par exemple les travaux réalisés sur des microsphères synthétiques de tailles bien définies ci-après:
- l'injection de sphères de 75 à 150 microns dans les vaisseaux du coeur provoque une nécrose myocardique (Battler et al., 1993, J. Am. Coll. Cardiol., 22: 2001-2006),
- l'injection de sphères de 7 microns dans les artères de cochon, à raison de 105 particules par gramme de myocarde, ne provoque pas d'effets délétères sur le tissu myocardique (Arras et al., 1998, Nature Biotechnology, 16: 159-162),
- l'injection de microsphères de 48 microns de diamètre (900 microsphères) dans la carotide interne droite provoque des infarctus cérébraux dans le cortex pariéto-temporal, le corps calleux, l'hippocampe, le thalamus et le noyau lenticulaire (Miyaké et al., 1993, Stroke, 24: 415-420) .
On a également décrit l'injection chez l'homme de microsphères d'albumines radiomarquées , d'une taille de 15 à 30 microns, dans les artères carotides commune ou interne pour détecter des régions infarcies du cerveau par des techniques de tomo-scintigraphie cérébrales (Verhas et al., 1976, J. Nucl. Med. , 17: 170- 174) sans qu'aucun effet délétère n'ait été rapporté.
Dans le domaine de la circulation extracorporelle (CEC) où les particules générés sont susceptible d'avoir un effet délétère sur l'organisme, il a été proposé d'utiliser des filtres de 20 microns pour diminuer de 90% le nombre de particules potentiellement délétères (Loop et al., 1976, Ann. Thorac. Surg., 21: 412-420).
Or, comme indiqué précédemment, les rares travaux de l'art antérieur concernant l'injection de cellules notamment endothéliales ne rapporte pas d'effets délétères des compositions cellulaires injectées dus à la présence d'agrégats cellulaires. Ainsi, la demande de brevet internationale PCT WO93/13807 décrit l'injection intraveineuse de 2 x 10β cellules endothéliales non immortalisée par la veine de la queue de souris, et ne mentionne pas l'observation d'effet délétère lié à la formation d'agrégats cellulaires (Ojeifo et al., 1995, Cancer Res . , 55: 2240- 2244) . Dans l'hypothèse ou effectivement aucun effet délétère n'a été observé, il est vraisemblable que le faible nombre de cellules injectées chez une souris de 30 g, de l'ordre de 2 x 106, soit 2 fois moins que ce qui est réalisé dans le cadre de la présente invention chez un rat de 300 g, n'induise pas d'effet délétère malgré la formation d'agrégats cellulaires.
De même, les auteurs des travaux concernant l'injection intra-artérielle (intra-fémorale) de 1 à 2 x 106 cellules endothéliales non immortalisée dans le membre inférieur de rat, ne rapportent pas l'observation d'effet délétère et ne suggère pas le problème de la formation d'agrégats (Messina et al., 1992, Proc . Natl . Acad. Sci., 89: 12018-12022). Bien que ces travaux ne s ' intéresse pas aux effets délétères provoqués par l'injection, il convient de remarquer que le nombre de cellules injectées est faible, de l'ordre de 50 fois moins que ce qui est réalisé dans le cadre de la présente invention. En outre, la cible concernée par ces travaux est les vaisseaux du membre inférieur, dont la tolérance à l'ischémie est plus grande que d'autres organes. D'ailleurs, il est indiqué que les expérimentateurs ont clampé pendant une heure l'artère fémorale pour permettre une diminution du débit sanguin et ainsi favoriser 1 ' adhésion des cellules aux parois vasculaires.
Le but de la présente invention est donc d'offrir une solution efficace et simple permettant d'éviter les effets délétères des injections de préparations cellulaires, et ainsi de développer leur application en médecine humaine.
Ce but est atteint grâce à une préparation de cellules immortalisées de mammifère éventuellement transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active, pour être administrée par voie systémique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'agrégat desdites cellules d'une taille susceptible d'entraîner chez ledit patient des dysfonctionnements transitoires ou permanents. De préférence, les cellules immortalisées sont non tumorigènes .
Les préparations de 1 ' invention peuvent alors contenir un grand nombre de cellules, de l'ordre de 1 000 à 300 000 cellules par microlitre, permettant d'obtenir un effet biologique, en diagnostic ou thérapeutique, efficace sans induire d'effet délétère pouvant provoquer une diminution transitoire ou permanente de l'apport sanguin d'un organe, du type embolie pulmonaire, accident ischémique cérébral, ischémie périphérique voire la mort.
Les essais réalisés dans le cadre de 1 ' invention ont permis de caractériser la taille des agrégats susceptibles d'induire des effets délétère lors de l'injection systémique de composition contenant les cellules. Ainsi, de façon avantageuse, une préparation de l'invention ne comprend pas d'agrégat de cellules d'une taille supérieure à environ 200 microns, de préférence supérieure à 50 microns et tout préférentiellement supérieure à 30 microns. Tous type de cellules, immortalisées ou non, peuvent entrer dans la constitution des préparations de l'invention, comme des cellules de l'endoderme, de 1 ' épiderme ou du mésoderme, telles que cellules endothéliales cérébrales ou périphériques et leur progéniteur, les cellules des plexus choroïdes, les cellules épithéliales, les cellules rétiniennes pigmentaires, les épendymocytes , les tanycites, les cellules souches et progénitrices neurales, ou encore même les cellules souches embryonnaires. Parmi celles-ci, l'invention concerne plus particulièrement les cellules endothéliales et les cellules épithéliales de mammifères, avantageusement cérébrales ou rétiniennes .
L ' immortalisation des cellules peut être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier, comme celles décrites dans les demandes de brevet PCT publiées sous les numéros W096/11278 et WO97/40139. On préfère tout particulièrement dans le cadre de 1 ' invention des cellules immortalisées car celles-ci présentent l'avantage de la standardisation de production en grande quantité avec des critères élevés de qualité. Les cellules immortalisées présentent un caractère non tumorigène obtenu par toute méthode connue de l'homme du métier comme celles décrites dans les demandes PCT citées ci-dessus.
L'absence d'agrégat cellulaire susceptible d'entraîner des dysfonctionnements transitoires ou permanents chez les sujets ayant reçu une préparation de l'invention, peut être obtenue par tout traitement biologique, chimique ou physique des cellules empêchant la formation d'agrégat ou supprimant spécifiquement les agrégats desdites cellules d'une taille supérieure à environ 200 microns, de préférence supérieure à 50 microns et tout préférentiellement supérieure à 30 microns. Après ce traitement les cellules sont avantageusement mises en suspension dans un milieu permettant leur survie et ne favorisant pas leur réagrégation. Un tel milieu est par exemple tout milieu nutritif ne favorisant pas 1 ' agrégation comme du PBS glucose sans calcium ni magnésium.
Un traitement biologique des cellules selon 1 ' invention consiste par exemple à sélectionner des cellules endothéliales pour des critères particuliers d'adhésion ou à modifier génétiquement les dites cellules par une séquence d'acide nucléique exprimant un agent empêchant la formation d ' agrégat ou inhibant l'expression d'un agent favorisant la formation d'agrégat desdites cellules. Deux approches peuvent ainsi être mises en œuvre :
- la délétion de séquences codant pour des molécules d'adhésion telles que : ZOl, Z02 , E-selectine, V.E. Cadhérine, ICAM-1, occludine, P-CAM, etc ..., ou - 1 ' introduction de séquences codant pour des molécules empêchant la formation d'agrégats, telles que des dominants négatifs des molécules d'adhésion citées ci-dessus ou codant pour des protéines leurres.
Un traitement physique des cellules selon 1 ' invention consiste par exemple en une filtration ou un tamisage. Outre, l'exclusion d'agrégat, cette filtration ou tamisage offre l'avantage de disposer d'une population de cellules de taille homogène. Cette filtration ou tamisage est conduit de la façon suivante : Les cellules sont filtrées à l'aide de filtres de blutage d'avantageusement 30 microns, puis diluées et dissociées avec douceur par exemple par pipetage multiple, et la suspension cellulaire est ensuite aspirée dans une seringue. Le filtre a été trempé au préalable dans du sérum physiologique stérile puis désinfecté dans l'alcool à 100°, séché à l'air, retrempé dans du sérum physiologique stérile. Le filtre est ensuite placé entre l'aiguille et l'embout de la seringue contenant les cellules . Le piston est poussé délicatement de manière à avoir un écoulement goutte à goutte des cellules diluées.
Mais un traitement physique peut aussi être constitué par un tri de type FACS "Fluorescent Analysis Cell Sorting" . Un traitement chimique des cellules selon
1 ' invention consiste par exemple à trypsiniser les cellules ou à les soumettre à l'action d'une autre protéase .
Les cellules des préparations selon
1 ' invention peuvent ou non être transfectées avec un ou plusieurs gènes codant pour une substance active qui est utile pour la thérapie ou le diagnostic. On entend au sens de la présente invention, par transfection avec un ou plusieurs gènes codant pour une substance active, la transfection des cellules par un fragment d'acide nucléique, comme un vecteur d'expression, intégré dans le génome ou présent dans le cytoplasme des cellules, et capable de permettre l'expression de polypeptide (s) , protéine (s) ou vecteur viral constituant directement ou indirectement une substance active. A titre d'exemples, on peut citer les cellules endothéliales cérébrales immortalisées transfectées avec un gène codant pour une substance active des compositions décrite dans la demande de brevet internationale PCT 096/11278 dont l'enseignement est intégré à la présente demande par référence.
L'invention se rapporte aussi à l'utilisation des préparations cellulaires précédentes pour la préparation d'un médicament destiné au diagnostic ou au traitement par thérapie génique d'une maladie chez un patient par administration par voie systémique d'une quantité suffisante desdites cellules. L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique pour être administrée par voie systémique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules comme décrite précédemment, en association dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable permettant la survie desdites cellules et ne favorisant pas leur ré-agrégation. On entend par composition pharmaceutique tant des compositions thérapeutique que de diagnostic.
La taille des agrégats qui ne sont pas susceptibles d'induire, lors de l'injection des compositions de l'invention chez un patient, des dysfonctionnements transitoires ou permanents sont fonction de la voie d'administration. Ainsi, les injections artérielles sélective par organe vont directement dans ledit organe sans passer préalablement par un organe filtrant comme le poumon. En conséquence, pour une administration intra-artérielle, la taille tolérée des agrégats est plus basse que pour une injection intra-veineuse . En effet, après injection dans une veine du pli du coude, le filtre pulmonaire peut agir et limiter la présence d'agrégats dans les autres organes. Toutefois, le risque d'effet délétère lors d'une injection intra-veineuse existe puisque la Demanderesse a observé la mort d'animaux, probablement par embolie pulmonaire, lors de l'injection de cellules endothéliales n'ayant pas subies une filtration préalable . En outre, une interprétation des données de l'art antérieur et les expériences réalisées par la Demanderesse, semblent indiquer que des sphères d'une taille de plus de 40 microns sont susceptibles de présenter un effet délétère sur les tissus cibles par voie intra-artérielle. En conséquence, si l'on considère qu'un amas de cellules, par exemple endothéliales, se comporte comme une sphère, il est recommandé selon l'invention d'éliminer les agrégats de taille supérieure à 30 microns. Néanmoins, les critères physiques de déformabilité des cellules dans un micro-vaisseaux sont différents de ceux d'une particules synthétiques, et ce paramètre doit être pris en compte lors des traitements de cellules, comme par exemple en filtration, où l'utilisation d'un filtre de 30 microns permet d'éliminer au maximum les agrégats de plus de 30 microns et, en conséquence, les cellules restantes, au moins 90%, sont des cellules isolées, dont le diamètre moyen, par exemple d'une cellule endothéliale, est de 10 microns . En conséquence, l'invention concerne plus particulièrement : d'une part une composition pour être administrée par voie intra-artérielle, avantageusement intra-carotidienne, chez un patient, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules ne comprenant pas d'agrégat desdites cellules d'une taille supérieure à 50 microns et de préférence supérieure à 30 microns, et
- d'autre part, une composition pour être administrée par voie intra-veineuse, chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules ne comprenant pas d'agrégat desdites cellules d'une taille supérieure à 200 microns et de préférence supérieure à 100 microns.
Ces deux voies d'administration sont à prendre en considération pour la sélection des cellules injectées vers l'organe ou le tissus visé. Il est en effet recommandé de cibler un organe en injectant les compositions de 1 ' invention dans 1 ' artère irriguant directement l'organe ciblé.
A l'inverse, l'injection desdites compositions par voie intra-veineuse, nécessite d'avoir sélectionné ou conféré aux cellules des propriétés particulières leur permettant de cibler 1 ' organe ou le tissus visé. Il peut s'agir par exemple d'une sélection de cellules endothéliales présentant des propriétés d'adhésion spécifiques ou d'une modification génique lui conférant les propriétés requises de l'organe cible.
La voie d'injection intra-artérielle, de préférence intra-carotidienne pour des applications rapportant au SNC, constitue un mode de mise en oeuvre préférée des compositions de l'invention. En effet, bien que l'injection par voie systémique semble la plus adéquate car elle permet une biodistribution la plus large possible, l'analyse de ce paramètre par la Demanderesse pour optimiser le procédé de thérapie génique mettant en oeuvre les compositions de l'invention a conduit à retenir tout préférentiellement le réseau vasculaire carotidien, qui est la voie sanguine la plus proche du SNC. Ce réseau apporte 80 % du débit sanguin cérébral nécessaire chez l'homme au bon fonctionnement du SNC et est accessible en clinique humaine mais aussi à l'expérimentateur animal. Ainsi, la Demanderesse a montré dans le cadre de la présente invention que l'injection de cellules endothéliales dans la carotide est faisable en respectant le débit sanguin. Le choix de cette voie d'administration permet de minimiser au maximum les modifications du flux sanguin cérébral. En effet, le flux dans la carotide interne n'est jamais interrompu au cours de cette procédure. De plus, les analyses menées sur des animaux contrôles n'ont montré aucune atteinte parenchymateuse. Chez le rat, l'injection se fait dans la circulation carotidienne générale et se répartit à tout le territoire concerné. Chez l'homme, il est possible par les techniques de neuroradiologie interventionnelle d'injecter à l'aide d'un cathéter des vaisseaux plus petits, tels que l'artère cérébrale moyenne, l'artère cérébrale antérieure ou l'artère cérébrale postérieure voire des branches de ces artères et donc d'obtenir potentiellement un meilleur ciblage et un effet délétère moindre. Bien entendu, ces techniques sont invasives, mais elles ne le sont néanmoins pas plus qu'une artériographie qui requiert les mêmes procédures. Elles sont en revanche bien moins invasives que les gestes d'injections intraventriculaires ou intracérébrales qui permettraient la délivrance d'un produit de thérapie génique.
Dans certaines conditions, l'injection intra-carotidienne a occasionné une mortalité, et des lésions parenchymateuses . La mortalité était en générale immédiate et associée le plus souvent à des troubles respiratoires. L'explication la plus plausible est que l'injection de cellules provoquaient des embolies pulmonaires mortelles. Les lésions parenchymateuses sont survenues lorsque les quantités de cellules endothéliales étaient élevées et lorsque la suspension cellulaire n'était pas filtrée. Ces données confirment le concept de la présente l'invention, selon lequel ce sont les agrégats cellulaires qui sont responsables des lésions parenchymateuses cérébrales et de la mortalité puisqu'elles sont minimisées après filtration. Les lésions parenchymateuses cérébrales correspondent le plus probablement à des infarctus cérébraux puisqu'elles apparaissent en hypersignal en T2 et sont localisées au territoire vasculaire de la carotide interne. La filtration a presque permis de faire disparaître tous ces effets délétères, dans de rares cas une dilatation du ventricule latéral était visible du côté de 1 ' injection.
Comme indiqué précédemment 1 ' absence d'agrégats dans les préparations selon l'invention permettent de disposer de compositions comprenant un nombre de cellules supérieur à ce qui était permis dans l'art antérieur. Ainsi, les composition selon l'invention, comprennent de l'ordre de 1 000 à 300 000 cellules par microlitre de composition.
Les composition selon l'invention sont tout particulièrement utiles dans le domaine de la thérapie génique, mais leur utilisation peut aussi être envisagée en matière de diagnostic.
A titre d'exemple d'applications thérapeutiques des composition de l'invention, ont peut citer le traitement et/ou la prévention des maladies neurologiques dégénératives , comme le Parkinson, l'Alzheimer, le Chorée d' Huntington, etc., des accidents vasculaires cérébraux, des cancers, des affections de l'œil, des maladies inflammatoires telles que la polyarthrite rhumatoïde, des maladies immunologiques, des malformations vasculaires artérielles ou veineuses . Parmi, les applications thérapeutiques ci- dessus, l'invention concerne plus particulièrement, une composition pharmaceutique pour être administrée par voie systémique, avantageusement intra-artérielle, dans un procédé de thérapie génique d'une maladie du système nerveux central chez un sujet, caractérisée en ce que les cellules de la préparation présente dans ladite composition sont transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active dans le traitement ou la prévention d'une maladie du système nerveux.
On entend par maladie du SNC, tant le SNC lui-même que l'oeil et notamment la rétine, que les vaisseaux le constituant ou l'irriguant. A titre d'exemples de maladies du SNC, on peut citer, les tumeurs cérébrales, les infarctus cérébraux, les maladies neuro-dégénératives comme celles citées précédemment, ou les malformations artério-veineuses ou simplement artérielles telles que les anévrysmes artériels ou simplement veineux, les maladies oculaires et en particulier les dégénérescences rétiniennes .
En conséquence, les cellules des compositions de l'inventions sont transfectées avec un gène codant pour une substance active dans le traitement et/ou la prévention des pathologies ci-dessus.
La substance codée par le gène avec lequel les cellules ont été transfectées peut être directement ou indirectement active, c'est à dire nécessiter : - l'administration au sujet d'une deuxième substance interférant avec la première ou avec le gène codant pour celle-ci, ou l'exposition à une source d'énergie, ou la transformation par une substance naturellement présente dans l'organisme, pour réaliser l'effet thérapeutique. On peut citer notamment les substances et les gènes choisis parmi : les facteurs de croissance, les facteurs anti-apoptotiques , les gènes tueurs, les antiprotéases, les immunomodulateurs, les gènes suppresseurs de tumeur, les gènes bloquant le cycle cellulaire, ou tout autre gène ou substance actif connus de l'homme du métier pour être utile dans la prévention ou le traitement des maladies du SNC.
Les compositions de 1 ' invention utiles pour le traitement d'une maladie du SNC sont par exemple dosées de façon à permettre une administration de 1 million à 200 millions de cellules par kilogramme de poids du sujet à traiter.
Pour cette application au SNC, l'invention envisage plus particulièrement des cellules endothéliales cérébrales avantageusement immortalisées .
On connaît en effet la thérapie génique par greffe intracérébrale de cellules génétiquement modifiées qui s'appliquent aux déficits neurologiques dus à une perturbation dans une zone restreinte du système nerveux central. Dans ce mode de traitement, une faible production de molécule thérapeutique, par de petits greffons, peut être capable de rétablir une fonction normale. Pour pouvoir couvrir des territoires plus étendus que ceux atteints par greffe mécanique, directement dans le parenchyme cérébral, l'injection par voie systémique semble la plus adéquate. En effet, la voie sanguine est la voie classique d'administration des substances thérapeutiques. Elle permet une biodistribution la plus large possible. Pour étendre cette approche d'injection à la thérapie génique cellulaire, la cellule endothéliale cérébrale apparaît maintenant comme un moyen de choix. Mais la thérapie génique de maladies du système nerveux central se heurte, en partie, aux problèmes posés par le nombre de types cellulaires différent composant le SNC et surtout par le nombre et la complexité de leurs connexions. De plus, la présence de la barrière hémato-encéphalique, caractéristique du SNC, rend l'accès au cerveau difficile pour le traitement des pathologies du SNC, et complique la conception de nouvelles substances thérapeutiques limitant ainsi l'utilisation de ces substances à des injections intracraniennes ou intraoculaires .
La demanderesse a maintenant mis en évidence que les cellules endothéliales cérébrales sont susceptibles de constituer de bons vecteurs de thérapie génique pour le système nerveux central. En effet, les cellules endothéliales cérébrales composant le réseau vasculaire cérébral sont à 1 ' interface entre le sang et le parenchyme cérébral et forment la barrière hématoencéphalique caractéristique du système nerveux central . II a en outre été montré qu'elles sont capables de survivre et de s ' implanter dans le système nerveux central après greffe intracérébrale (Quinonéro et al, Gène therapy, 1997, 4, 111-119).
Les travaux réalisés dans le cadre de la présente invention, ont permis de montrer à l'aide de trois techniques différentes, coloration bisbenzimide et gènes reporter (bêta-galactosidase et GFP) que les cellules endothéliales étaient capables, d'une part de s'intégrer dans les vaisseaux et, d'autre part de survivre au sein du parenchyme en dehors de la lumière des vaisseaux. Ces résultats démontrent donc qu'il est possible d'exprimer un trangène dans le cerveau. Les potentialités thérapeutiques des compositions de l'invention visent donc plus spécifiquement les maladies du système nerveux central. Les maladies plus particulièrement concernées par cette approche sont les tumeurs cérébrales et les infarctus cérébraux. Les maladies neuro-dégénératives peuvent être aussi concernées et en particulier la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, et la maladie de Huntington.
En conséquence, l'invention a tout particulièrement pour objet l'utilisation de cellules endothéliales cérébrales immortalisées éventuellement transfectées avec un gène codant pour une substance active pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention par thérapie génique d'une maladie du système nerveux central chez un sujet par administration par voie intra-artérielle (intra- carotidienne) audit sujet d'une quantité suffisante desdites cellules pour délivrer au niveau du système nerveux central ladite substance active.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent concernant la préparation des cellules endothéliales cérébrales immortalisées transfectées avec un gène codant pour une substance active et leur utilisation dans le traitement par thérapie génique d'une maladie du système nerveux central chez un patient par administration par voie intra-artérielle. Ces exemples se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels :
La figure 1 montre les lésions parenchymateuses induites par les injections de cellules endothéliales . - La figure 2 montre l'identification des cellules RBE4 pré-marquées dans le cerveau.
- La figure 3 montre l'identification des cellules RBEZ dans le cerveau après révélation de la bêtagalactosidase nucléaire par le X-Gal . I - Matériel et méthodes .
Les trois lignées cellulaires suivantes ont été utilisées : la lignée parentale RBE4 et deux lignées dérivées de RBE4, la lignée RBEZ et la lignée RBE4/GFP.
Les lignées RBE4 et RBEZ sont décrites dans la demande de brevet internationale PCT No. W096/11278.
La lignée RBE4 a été obtenue par la transfection de cellules endothéliales cérébrales de rat Lewis en culture primaire par un plasmide immortalisant contenant la séquence E1A de 1 ' adénovirus de type 2. Les conditions de culture pour les cellules RBE4 et les cellules dérivées de RBE4 ont déjà été décrites précédemment (Durieu-Trautmann et al., Frontiers in CVB, 1993,331:205-210) .
Les cellules RBEZ ont été obtenues par exposition des cellules RBE4 à un vecteur rétroviral non replicatif MFG-NB contenant le gène LacZ codant pour la bêta-galactosidase de E. Coli associée à une séquence de localisation nucléaire (nls) (Lai et al., PNAS, 1994, 91:9695-9699). Les cellules RBEZ furent ensuite sélectionnées par FACS (fluorescence-activated cell sorting) en utilisant le substrat fluorescent de la bêta-galactosidase, la fluoresceine di-bêta- galactopyranoside (Lai et al., PNAS, 1994, 91:9695- 9699) .
La lignée RBE4/GFP exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein) a été obtenue après transfection des cellules RBE4 avec une construction contenant la séquence GFP sous le contrôle du promoteur de l'ubiquitine dans des cellules RBE4.
II - Préparation et marquage des cellules . Les cellules en culture ont été dissociées par la trypsine, rincées à plusieurs reprises et mise en suspension en solution à la concentration initiale de 300 000 cellules par microlitre. La solution de dilution utilisée a été soit le PBS glucose (lOmMol) comprenant du calcium et du magnésium, soit le PBS glucose sans calcium ni magnésium. Pour l'injection, différentes concentrations de cellules ont été utilisées. Ces concentrations finales de cellules allaient de 10 000 cellules à 300 000 cellules par microlitre. Le volume total injecté a été de 500 à 1000 microlitre.
Les cellules RBE4 en culture ont été prémarquées au bisbenzimide (Hoechst 33342 Sigma) à la concentration de 7,5 mg/ml pendant 15 minutes à 37°C. Ce colorant nucléaire fluoresce en bleu sous lumière ultraviolette du microscope à fluorescence.
III - Filtration cellulaire.
Dans certains cas, la solution finale a été filtrée à l'aide de filtres de blutage (Polylabo, toile à bluter nylon #87404 NY 30 HC) de 30 microns selon le protocole suivant : les cellules à la concentration initiale ont été aspirées à l'aide d'un cône jaune d'une pipette P200 pour être diluées dans la solution de dilution. Les cellules sont alors diluées et dissociées avec douceur par pipetage multiple de la préparation à l'aide d'une pipette P1000 et de son cône bleu correspondant. La suspension cellulaire est ensuite aspiré dans une seringue de 1 ml avec une aiguille rose de 18 gauge . Le filtre de 30 microns a été trempé au préalable dans du sérum physiologique stérile puis désinfecté dans l'alcool à 100°, séché à l'air, retrempé dans du sérum physiologique stérile. Le filtre est ensuite placé entre l'aiguille et l'embout de la seringue contenant les cellules. Le piston est poussé délicatement de manière à avoir un écoulement goutte à goutte des cellules diluées. En cas de difficultés à pousser le piston, le filtre est remplacé. Cette manœuvre de remplacement peut se faire jusqu'à 2 fois pour un ml. La viabilité des cellules a été mesurée avant et après filtration après coloration au Bleu trypan et lecture sur cellule de Malassez .
IV - Les injections intra-carotidiennes .
Des rats adultes mâles Lewis (Iffa-Credo) pesant 300 g en moyenne, ont été ânesthésiés par anesthésique volatil (Isoflurane) dans un mélange oxygène et protoxyde d'azote. Une induction de 5 minutes par 1 ' isoflurane à 5% a été suivi d'une dose de maintien de 1% pour l'opération qui durait généralement 30 à 40 minutes. L'incision des tissus cutanés et sous cutanés a été réalisé à l'aide d'un bistouri monopolaire. Les tissus musculaires ont ensuite été écartés pour permettre une exposition correcte, à gauche, de la carotide commune, la bifurcation carotidienne, la carotide externe et interne. Après dissection précautionneuse de la bifurcation carotidienne, une cautérisation des branches collatérales de l'artère carotide externe a été effectuée à l'aide d'un thermo- coagulateur bipolaire. Une thermocoagulation a aussi été effectué sur l'extrémité céphalique de l'artère carotide externe afin d'avoir un moignon cathétérisable le plus long possible. Un clip vasculaire (type SUNDT pour malformation artério-veineuse) , préalablement trempé dans l'héparine diluée, est ensuite posé sur la carotide externe, proche de la bifurcation carotidienne. Une cathétérisation du moignon exclu de la circulation artérielle est réalisée à l'aide d'un cathéter à ailette en Vialon (0,7x19 mm, Insyte-WTM Becton Dickinson) préalablement rincé par de l'héparine diluée. Une pointe de colle par de la Super-glue (Loctite) sur la collerette artérielle autour du cathéter est ensuite posée afin de solidariser le moignon et le cathéter. Le clip est ouvert pour permettre un reflux de sang artériel dans le cathéther et l'évacuation d'un éventuel caillot qui aurait pu se former. Le flux est à nouveau interrompu pour permettre l'adaptation de la seringue, contenant les cellules, à l'embout du cathéter. Le flux est ensuite rétabli et l'injection est effectuée manuellement ou à l'aide d'un pousse seringue motorisé dont la vitesse aura été préalablement réglée pour permettre une équilibration des flux entre le sang arrivant de la carotide commune et la solution venant du cathéther. L'injection se fait sous le contrôle de la loupe chirurgicale (Leica) . A la fin de l'injection le moignon est cautérisé tout en vérifiant que le flux dans la carotide commune et interne soit parfaitement maintenu. Les animaux contrôles ont subi la même opération que celle décrite ci-dessus mais seul le tampon de dilution de la suspension cellulaire a été injecté, sans les cellules endothéliales.
V - Etude par imagerie des tissus.
Certains rats ont subi une IRM cérébrale sur un appareil de 7 Tesla (appareil Varian) voire une spectroscopie . L'imagerie IRM a été réalisée avec des coupes coronales jointives de 1 mm de tout le cerveau et des coupes coronales jointives centrées sur le cerveau antérieur ( télencephale et diencéphale, à l'exclusion du bulbe olfactif) de 500 microns. Des séquences pondérées en T2 ont été utilisées dans la majorité des cas. Dans les rares cas où les IRM étaient réalisées avant 24 heures une séquence de diffusion était rajoutée pour identifier les lésions éventuellement non visibles en séquences T2. Lorsque le cerveau ne montrait pas d'anomalies parenchymateuses à 1 ' IRM, une spectroscopie était réalisée afin de comparer les profils spectraux droits et gauche chez un même animal .
VI - Etude histologi ue .
Les animaux ont été sacrifiés à différents temps après injection. En cas de sacrifice immédiat, les différents organes prélevés (cerveau, cœur, foie, rein, œil, rate, testicule, carotide gauche) ont été immédiatement congelés dans 1 ' isopentane refroidie par l'azote liquide. En cas de sacrifices plus tardifs, les animaux ont eu une perfusion transcardiaque de 100 ml de PBS puis de 500 ml de PFA 4%. Les cerveaux prélevés ont été, post-fixés pendant 2 à 4 heures dans le PFA 4% puis cryoprotégés dans du sucrose (20 à 30%) pendant 48 heures . Les cerveaux ont ensuite été congelés dans 1 ' isopentane . Tous les tissus ont été sectionnés au cryostat soit pour obtenir des coupes montées sur lame de 30 microns d'épaisseur (tous les organes) ou des coupes flottantes (le cerveau) de 40 microns d'épaisseur. Les coupes flottantes étaient ensuite incubées dans une solution comprenant du X-gal pendant 3 heures 30 en cas d'utilisation de cellules RBEZ selon la technique décrite par eis et al. (1991). Les tissus contrôles étaient toujours traités de manière concomitante
VII - Résultats.
Quarante huit rats ont été opérés et injectés. Neuf ont eu une injection manuelle et 39 une injection à l'aide d'un moteur électrique portable de notre conception afin d'obtenir une injection lente et régulière. Les premières opérations ont permis de confirmer l'absence de thrombose après injection de la carotide commune et interne.
1) Mortalité.
Sept rats sont morts prématurément dont 5 quelques minutes après l'injection avec semble t-il des problèmes respiratoires (n=3), des troubles neurologiques avec convulsions (n=l) ou sans cause évidente (n=l) . Dans tous les cas ces morts sont survenus avant l'utilisation des filtres. Pour 6/7 rats la dose injectée était > 50 millions de cellules. Aucun décès n'a été identifié dans le groupe contrôle (n=10).
2 ) Effets délétères tissulaires .
a) IRM et spectroscopie. Afin d'étudier les lésions tissulaires produites par les injections intra-carotidiennes de cellules endothéliales génétiquement modifiées nous avons réalisé des IRM cérébrales et des études en spectroscopie. L ' IRM cérébrale représentée aux figures 1 et 2 en annexe fournit des données morphologiques alors que la spectroscopie fournie des données chimiques . La spectroscopie a surtout été réalisée lorsque 1 ' IRM était normale. Vingt IRM (rats #17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30 (2 fois), 31, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 39) ont été réalisée et 6 spectroscopies . Elle était toujours normale chez les animaux contrôles (n=3)
On observe sur les photos de la figure 1, les coupes coronales IRM jointives de 1 mm, séquences pondérées en T2. A, B, C : injection de 25 millions de cellules RBEZ non filtrées ; D, E, F : injection de 25 millions de cellules RBEZ après filtration. Il convient de remarquer en A, B, C la présence d'un hypersignal cortical et putaminal gauche ipsilatéral à l'injection qui est le témoin d'un infarctus cérébral; les ventricules latéraux (hypersignaux plus intenses et homogènes que la lésion) droit et gauche sont dilatés ; la lésion provoque aussi un effet de masse avec déplacement de la ligne médiane. En D, E, F, on note l'absence d'hypersignal parenchymateux, de dilatation ventriculaire et d'effet de masse.
On observe sur les photos de la figure 2, les coupes coronales histologiques de cerveau permettant identification de cellules RBE4 préalablement marquées au bisbenzimide et visualisées en épifluorescence par une émission dans les ultra-violets. En A-D, observation du parenchyme cérébral quelques minutes après injection intracarotidienne . En F, G, observation 7 jours après. Les flèches en B et C identifient des cellules marquées dans les micro-vaisseaux intracérébraux. Il convient de remarquer en E, la présence de cellules marquées dans les vaisseaux du plexus choroïde. La flèche en F montre un vaisseau exprimant une cellule positive. En G, la flèche montre la présence de cellules marquées dans les plexus choroïdes .
Pour deux rats, L ' IRM a été réalisée 15 heures environ après l'injection des cellules, et dans ces cas des séquences de diffusion ont été réalisée en plus des séquences T2 pour être certain de bien visualiser les modifications parenchymateuses. Dans les autres cas, les IRM ont été faites entre 4 et 7 jours post-injection. Avant le protocole de filtration, 13 IRM ont été réalisées et 7 IRM après. Avant filtration, pour les rats injectés avec 10 millions (n=3) aucune lésion parenchymateuse n'a été détectée sur IRM ou spectroscopie; néanmoins une dilatation ventriculaire était visible dans 2 des 3 cas toujours du coté gauche correspondant à la carotide injectée. Parmi les rats injectés avec 25 millions (n=4) une dilatation ventriculaire était visible dans 3 cas mais sans anomalie parenchymateuse et un rat présentait un hypersignal parenchymateux. Dans les 3 cas sans anomalie à l'IRM, 2 sur 3 avaient une spectroscopie anormale. Parmi les rats injectés avec 50 millions (n=2) les 2 avaient des lésions d' hypersignal parenchymateuses visibles en IRM.
Après application du protocole de filtration, les cerveaux des rats injectés avec 25 millions (n=2) ne présentaient pas d' hypersignal parenchymateux, mais l'un d'eux avait une dilatation ventriculaire. Parmi les cerveaux de rats injectés avec 50 millions (n=4) un seul révélait un hypersignal cortical gauche. Ce rat avait néanmoins été préalablement traité par mannitol afin d'ouvrir la barrière hémato-encéphalique . Un autre, parmi les 3 restants, avait une dilatation du ventricule latéral ipsilatérale à l'injection.
b) Histologie des tissus injectés. Les colorations des coupes par un colorant de Nissl (cresyl violet) n'ont pas révélé de lésions paranchy ateuses évidentes après injection de cellules filtrées. Par contre, avant filtration, l'injection de cellules provoquait des anomalies histologiques . Ces anomalies étaient d'une part, des pertes cellulaires avec perte régionale de la lamination des différentes couches du cerveau et d'autre part, une hypercellularité, témoin d'une réaction inflammatoire microgliale et astrocytaire . 3 ) Localisations des cellules.
a) Identification des cellules RBE4 prémarσuées au Bisbenzimide. Quelques minutes après injection de cellules endothéliales RBE4 marquées par le Bisbenzimide, les cellules étaient clairement identifiées dans les microvaisseaux du cerveau, comme montré sur la figure 3. Sept jours après l'injection, quelques cellules sont encore visibles, intégrées dans des vaisseaux sanguins mais aussi au sein du parenchyme.
La figure 3 montre en A, une cellule RBEZ est incorporée à la lumière d'un vaisseau intra- cérébral . En B, une cellule RBEZ en position extraluminale intra-parenchymateuse. Il convient de remarquer en C (agrandissement de B) la bordure du vaisseau (flèches noires).
b) Identification des cellules RBEZ par la coloration au X-Gal .
Des greffes systémiques de cellules RBEZ permettent de mettre en évidence, 7 jours postinjection, des cellules dont le noyau est bleu, soit intégrées dans des vaisseaux, soit dans le parenchyme à distance de la paroi vasculaire. La localisation nucléaire du marquage X-gal a été confirmée par un marquage des coupes à l'aide du bisbenzimide (Hoechst), un colorant du noyau. Lorsque le marquage était effectivement nucléaire le marquage fluorescent Hoechst était masqué par la coloration au X-gal. En revanche lorsque le marquage était cytoplasmique le marquage nucléaire était clairement visible témoignant d'une expression de la bêta-galactosidase endogène (non montré) caractéristiques des cellules macrophagiques . c) Identification des cellules GFP par épifluorescence .
Des cellules exprimant le GFP étaient visibles sous forme d'une coloration fluorescente verte à 1, 3 et 5 jours après injection de cellules endothéliales GFP. Le marquage vert de la GFP était visible à la fois dans le cytoplasme et le noyau de la cellule comme a permis de le confirmer les contre- colorations du noyau à l'aide du Bisbenzimide. Deux types de morphologie de cellules endothéliales étaient visibles. D'une part, des cellules rondes isolées qui semblaient en position endovasculaires et d'autre part, des cellules allongées souvent par groupe de 2 au sein du parenchyme .

Claims

REVENDICATIONS
1) Préparation de cellules de mammifère éventuellement transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active, pour être administrée par voie systémique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'agrégat desdites cellules d'une taille susceptible d'entraîner chez ledit patient des dysfonctionnements transitoires ou permanents.
2) Préparation de cellules de mammifère selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas d'agrégat desdites cellules d'une taille supérieure à environ 200 microns, de préférence supérieure à 50 microns et tout préférentiellement supérieure à 30 microns.
3) Préparation de cellules de mammifère selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que lesdites cellules sont immortalisées.
4) Préparation de cellules de mammifère selon l'une quelconque des revendication 1 à 3, caractérisée en ce que les cellules sont non tumorigènes .
5) Préparation de cellules de mammifère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdites cellules sont choisies dans le groupe comprenant les cellules endothéliales et les cellules épithéliales de mammifères.
6) Préparation de cellules de mammifère selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdites cellules sont choisies dans le groupe comprenant les cellules cérébrales et rétiniennes.
7) Préparation de cellules de mammifère selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdites cellules ont subies un traitement biologique, chimique ou physique empêchant la formation d'agrégat ou supprimant spécifiquement les agrégats desdites cellules d'une taille supérieure à environ 200 microns, de préférence supérieure à 50 microns et tout préférentiellement supérieure à 30 microns, puis mises en suspension dans un milieu permettant la survie desdites cellules et ne favorisant pas leur ré-agrégation.
8) Préparation de cellules de mammifère selon la revendication 7, caractérisée en ce que le traitement biologique consiste à modifier génétiquement les dites cellules par une séquence d'acide nucléique exprimant un agent empêchant la formation d'agrégat ou inhibant l'expression d'un agent favorisant la formation d'agrégat desdites cellules.
9) Préparation de cellules de mammifère selon la revendication 7, caractérisée en ce que le traitement physique consiste en une filtration ou un tamisage.
10) Composition pharmaceutique pour être administrée par voie systémique chez un sujet, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, en association dans ladite composition avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable permettant la survie desdites cellules et ne favorisant pas leur réagrégation.
11) Composition pour être administrée par voie intra-artérielle, avantageusement intra- carotidienne, chez un patient, selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules ne comprenant pas d'agrégat desdites cellules d'une taille supérieure à 50 microns et de préférence supérieure à 30 microns.
12) Composition pour être administrée par voie intra-veineuse, chez un sujet, selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend une préparation de cellules ne comprenant pas d'agrégat desdites cellules d'une taille supérieure à 200 microns et de préférence supérieure à 100 microns.
13) Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce qu'elle comprend de l'ordre de 1 000 à 300 000 cellules par microlitre de composition.
14) Composition pharmaceutique pour être administrée par voie systémique dans un procédé de thérapie génique d'une maladie du système nerveux central chez un sujet, selon l'une des revendications 10 à 13, caractérisée en ce que les cellules sont transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active dans le traitement ou la prévention d'une maladie du système nerveux.
15) Composition selon la revendication 14, caractérisée en ce que la substance ou le gène actif dans le traitement ou la prévention d'une maladie du système nerveux est choisie parmi les facteurs de croissance, les facteurs anti-apoptotiques , les gènes tueurs, les antiprotéases, les immunomodulateurs , les gènes suppresseurs de tumeur, les gènes bloquant le cycle cellulaire.
16) Composition selon l'une des revendications 14 à 15, caractérisée en ce qu'elle est dosée de façon à permettre une administration de 1 million à 200 millions de cellules de mammifère immortalisées transfectées avec au moins un gène codant pour une substance active par kilogramme de poids du sujet à traiter.
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