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WO1999064455A1 - Peptides a activite de transport du noyau - Google Patents

Peptides a activite de transport du noyau Download PDF

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Publication number
WO1999064455A1
WO1999064455A1 PCT/JP1999/003015 JP9903015W WO9964455A1 WO 1999064455 A1 WO1999064455 A1 WO 1999064455A1 JP 9903015 W JP9903015 W JP 9903015W WO 9964455 A1 WO9964455 A1 WO 9964455A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
seq
oligonucleotide
cdna
nuclear
Prior art date
Application number
PCT/JP1999/003015
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Nobuhide Ueki
Kazuhiro Yano
Original Assignee
Helix Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Helix Research Institute filed Critical Helix Research Institute
Priority to EP99923926A priority Critical patent/EP1085024A1/en
Priority to CA002330548A priority patent/CA2330548A1/en
Publication of WO1999064455A1 publication Critical patent/WO1999064455A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a peptide having an activity of translocating to a nucleus in a cell, and a DNA encoding the peptide. Since the peptide can be used as a carrier for transporting a substance to the nucleus, the present invention mainly belongs to the field of drug delivery (drug 'Delino, Li).
  • Delivering the drug specifically to the target site and maintaining the optimal concentration at the target site is very important for effectively exhibiting the efficacy and reducing the side effects of the drug. For this reason, various systems have been developed for delivering drugs to specific target sites.
  • a number of methods have been developed for transporting substances to the nucleus, including microinjection, transfection, antibody, and peptide methods.
  • the microinjection method is a method for reliably and directly introducing a sample into the nucleus through a small injection needle. Usually, it is frequently used to introduce high molecular substances such as nucleic acids and proteins. However, the amount that can be injected into the nucleus is very small, and especially when the sample does not have the property of being stably retained in the nucleus, the sample rapidly diffuses out of the nucleus at the same time as the injection. It is also conceivable.
  • the transfusion method (Experimental Medicine Separate Volume, New Handbook of Genetic Engineering, Yodosha, 155-168 [1996]) has been widely used especially for the introduction of foreign genes.
  • Methods such as the DEAM dextran method, the ribosome method, and the lipofection method, are known. In these methods, after a complex is formed between the sample and the carrier, it is taken up into cells by phagocytosis or membrane fusion, and the detailed mechanism is not yet clear, but finally the sample is introduced into the nucleus. That's how it works.
  • An object of the present invention is to provide a novel peptide having a nuclear transport activity and a DNA encoding the peptide. It is also an object to provide a nuclear mass transport system using these.
  • NTT method a method for easily isolating DNA encoding a peptide having nuclear translocation activity by utilizing the properties of a transcription factor.
  • This method was named "NTT method").
  • the principle of the NTT method is as follows. Eukaryotic transcription factors translocate into the nucleus and interact with the promoter region of certain genes. It has a function of inducing the expression of the specific gene by acting, and it is considered that the nuclear translocation ability of the transcription factor is caused by a nuclear translocation signal present in the transcription factor.
  • a region having a nuclear translocation ability in a transcription factor is removed and a fusion protein in which an unknown peptide is introduced is expressed in a cell instead, an unknown peptide in the fusion protein is expressed. If has the ability to translocate to the nucleus, the fusion protein translocates into the nucleus and acts with a specific promoter region, thereby inducing the expression of a specific gene downstream thereof. On the other hand, if the unknown peptide in the fusion protein does not have nuclear translocation ability, the fusion protein will not translocate into the nucleus, and the expression of a specific gene downstream of the promoter region will not be induced.
  • the unknown peptide in the fusion protein has a nuclear translocation ability. It is possible to determine whether or not to have it.
  • the present inventors have prepared a fusion DNA of a DNA encoding a transcription factor from which a region having nuclear translocation ability has been removed and a test DNA, and have prepared a promoter that is activated when the transcription factor binds.
  • the region and the repo overnight gene whose expression is induced by the activation of the promoter region were introduced into a eukaryotic host holding the nucleus, and the expression of the repo overnight gene was detected.
  • MA encoding a peptide having nuclear translocation ability is used as the test DNA, expression of the reporter gene is induced, while the test DNA does not have nuclear translocation ability.
  • the DNA encoding the peptide was used, no reporter gene expression was induced. That is, it has been found that, based on the above principle, a DNA encoding a peptide having nuclear translocation activity can be actually isolated specifically.
  • the present inventors next prepared a library of cDNAs encoding a fusion protein of a transcription factor from which a region having nuclear translocation ability was removed and another peptide, and introduced this into a cell.
  • a cDNA encoding a peptide having nuclear translocation ability was screened using the expression of the repo overnight as an index.
  • the core from the cMA library Several new DNAs encoding peptides having translocation activity were successfully isolated.
  • the present invention relates to a novel DNA encoding a peptide having nuclear translocation activity isolated by the NTT method, which was uniquely developed by the present inventors, a peptide encoded by the DNA, and uses thereof. More specifically,
  • a peptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 21 and 101 to 107 and having nuclear translocation activity
  • a peptide according to (1) or (2) which is a fusion peptide containing a desired peptide for translocation to the nucleus;
  • peptide refers to a compound in which amino acids are bonded to each other via peptide bonds. Therefore, “polypeptides” and “proteins” that are peptides having a long chain length are also included in the “peptide” of the present invention.
  • DNAs encoding peptides having nuclear translocation activity isolated by the NTT method and developed by the present inventors are shown in SEQ ID NOs: 22 to 42 and 92 to 100.
  • the peptides encoded by these DNAs included in the peptides of the present invention are shown in SEQ ID NOs: 1 to 21 and 101 to 107, respectively.
  • the peptides of the present invention have a common feature of having nuclear transport activity. For this reason, the peptide of the present invention is required to transport a substance desired to be transported to the nucleus to the nucleus. It can be used as a body. As the peptide of the present invention used for transporting a substance to the nucleus, a peptide containing an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 21 and 101 to 107 is preferable.
  • peptides having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence of these peptides can be used as long as they have nuclear translocation activity.
  • Such amino acid modifications can be performed by methods known to those skilled in the art, for example, site-directed mutagenesis (Curretnt Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publich. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5). ) And PCR (PCR Primer A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, 581-621).
  • the amino acid modification site and the number of modifications are not particularly limited as long as the modified peptide retains nuclear translocation activity.
  • the number of modified amino acids is usually within 20 amino acids, preferably within 10 amino acids, more preferably within 5 amino acids, and further preferably within 3 amino acids.
  • the substance for transporting the peptide of the present invention to a nucleus as a carrier is not particularly limited.
  • peptides, nucleic acids, polysaccharides, metals, synthetic compounds and the like can be mentioned.
  • These substances can be, but are not limited to, drugs for treating, preventing, or diagnosing a disease.
  • the substance may be used for purposes other than clinical application, for example, for biological analysis.
  • the bond may be a chemical cross-linking using a cross-linking agent (Biochemical Experiment Lecture 2, edited by The Biochemical Society of Japan 2, Protein Chemistry (below), Tokyo Kagaku Dojin, 604-618).
  • the DNA encoding the peptide and the DNA encoding the peptide of the present invention are linked to each other by expressing these peptides as fusion peptides. It is also possible to bind peptides.
  • the connection may be through a spacer region.
  • a binding utilizing mutual affinity generated between the peptide of the present invention and a substance for transporting to the nucleus may be used.
  • binding forms include, for example, binding using electrostatic affinity, binding using hydrophobic affinity, binding using a binding motif such as protein-protein or protein-nucleic acid, and enzyme-substrate binding. Binding using affinity can be mentioned. When the peptide of the present invention and the substance for transporting to the nucleus have essentially no binding ability, a functional domain having these binding ability may be newly added and used.
  • the target cells for transporting a substance using the peptide of the present invention as a carrier are not particularly limited, and various cells can be used depending on the purpose of using the peptide of the present invention.
  • the target cell can be, for example, a cell in a living body or a cultured cell in vitro. These cells can be, for example, animal cells including humans, plant cells, and microbial cells.
  • the present invention also relates to a DNA encoding the peptide of the present invention.
  • the DNA of the present invention is not particularly limited as long as it can encode the peptide of the present invention, and includes, for example, cDNA, genomic DNA, and synthetic MA.
  • the DNA of the present invention may be, for example, a human fetal brain-derived cDNA library or a genomic DNA library using, as a probe, a DNA consisting of all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NOS: 22 to 42 and 92 to 100. One can be prepared by screening one.
  • fflRNA, cDNA, or genomic DNA derived from human fetal brain is used as a primer as an oligonucleotide that specifically hybridizes to MA consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 22 to 42 and 92 to 100. It can also be prepared by a polymerase chain reaction.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, for producing the peptide of the present invention.
  • the production of the peptide of the present invention is generally carried out by inserting the DNA of the present invention into an appropriate vector, introducing it into an appropriate host cell, culturing the obtained transformed cell, The purification is performed by purifying the recombinant protein expressed in the recombinant cell.
  • a conventional general expression system can be used for expression of the recombinant peptide.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast In vitro expression systems using insect cells, plant cells, animal cells, etc., as well as test tubes using cell extracts such as Escherichia coli, wheat germ, or rabbit reticulosite.
  • Recombinant peptides expressed in this way can be used, for example, by combining conventional chromatography steps such as ion exchange, gel filtration, partitioning, and affinity, or by using appropriate fillers. It can be purified to high purity by using HPLC or the like.
  • the peptide of the present invention can be used as a "nuclear transport indicator" if it can be visually recognized by modification with an appropriate substance. That is, by introducing such a modified peptide into a cell, it becomes possible to monitor the mass transfer from the cytoplasm to the nucleus in real time.
  • the peptide may be directly labeled with a fluorescent dye or the like, or a fusion peptide with a fluorescent protein such as EGFP may be prepared.
  • a “nuclear transport indicator” can be applied, for example, to a screening system for developing a nuclear transport inhibitor or the like.
  • Figure 1 shows the plasmid “pLexAD”.
  • Figure 2 shows the plasmid “pLexADrev”.
  • FIG. 3 shows the plasmid "pRSlF”.
  • FIG. 4 shows the plasmid “pRS3F”.
  • FIG. 5 shows the nuclear translocation ability of a transcription factor used for fusion with a test peptide.
  • FIG. 6 shows the nuclear translocation ability of a transcription factor fused with a test peptide.
  • FIG. 7 shows the plasmid “pNS”.
  • FIG. 8 is a micrograph showing the result of detecting the nuclear translocation activity of 21 genes isolated by the NTT method.
  • the numbers in the figure correspond to the order of the gene clones in Tables 1 and 2 (the first clone in Table 1 is 1 and the last clone in Table 2 is 21).
  • the Taq polymerase used was “TaKaRa Ex Taqj (TaKaRa)” and the reaction conditions were in accordance with the product manual.
  • the amplified DNA fragment was purified by ethanol precipitation and digested with the restriction enzymes EcoRI and Ncol. After that, 6% polyacrylamide gel electrophoresis was performed, and the target DNA fragment was excised from the gel and recovered by electroelution.
  • the nuclear export signal (SEQ ID NO: 47) of the HIV Rev protein was synthesized as follows, and inserted into the Hpal site near the N-terminus of the LexA protein encoded by “pLexAD”. "NU9” (SEQ ID NO: 48) as the sense strand, "NU10" as the antisense strand
  • Plasmid ⁇ pRSlF '' which has CEN / ARS region for replication protein expression at the origin of replication, and LexA protein inserted with NES and GAL4 transcriptional activity Of pRS3F, a plasmid that has a CEN / ARS region at the origin of replication for expressing a fusion protein with an activation domain
  • a fusion protein between a normal LexA protein that does not insert a nuclear export signal (NES) and a GAL4 transcription activation domain and a fusion protein between a LexA protein that has NES inserted at the N-terminus and a GAL4 transcription activation domain
  • NES nuclear export signal
  • a fusion protein between a LexA protein that has NES inserted at the N-terminus and a GAL4 transcription activation domain eg, The nucleotide sequence including the amino acid sequence of the fusion protein is shown in SEQ ID NO: 50
  • the minimum unit required for expression in yeast is “pLexAD” in the former case and “pLexAD” in the latter case.
  • a DNA fragment of about 1.7 kb obtained by digesting pLexADrevj with Sphl This expression unit contains the ADH1 motor region, the coding region of the expressed protein, the multiple cloning site, the ADH1
  • the plasmid “pRS413” manufactured by STRATAGENE
  • yeast shuttle vector 1, CEN / ARS origin was prepared in advance.
  • a Pseudomonas aeruginosa branched-chain amino acid binding protein ('BraC) from which the secretory signal recognized to be localized in the cytoplasm has been removed (base sequence including the amino acid sequence of the protein is also shown).
  • 'BraC Pseudomonas aeruginosa branched-chain amino acid binding protein
  • PRS3FN was similarly constructed. The nucleotide sequence was confirmed to confirm that the target fragment was inserted correctly.
  • nuclear fragmentation is achieved by in-frame fusion of a DNA fragment encoding a peptide to the C-terminus of the transcription factor encoded by pRS3F and expression in yeast.
  • the presence or absence of the function could be easily detected by checking the expression of the reporter gene.
  • PRS3F was improved. There are three improvements: (1) The EcoRI site at the junction between LexA and GAL4AD has been removed. (2) A new EcoRI site was introduced at the multi-cloning site. (3) Unnecessary regions derived from “pRS413” were removed and minimized as much as possible.
  • This pLexADrev-dE was digested with the restriction enzyme Sphl, and the obtained DNA fragment containing the ADH1 expression unit of about 1.7 kb was subcloned into the Sphl site of the universal plasmid pUC19, and the plasmid ⁇ pULexADrev-dE '' And Next, a synthetic phosphoric acid having an EcoRI site between the Nhel site and the Ncol site of “pULexADrev-dE”, “NU28” (SEQ ID NO: 58) as the sense strand, and “ ⁇ 29 ⁇ ” as the antisense strand (SEQ ID NO: 59) was inserted to give a plasmid “pULexADrev-E”.
  • pRS413 was digested with Drall and PvuII to remove the MA fragment containing the 757 bp multicloning site, and a synthetic linker with Sphl site and “NU25” as the sense strand (SEQ ID NO: 60), insert “Book 26” (SEQ ID NO: 61) as the antisense strand, and add plasmid
  • PRS-S The DM fragment containing the 1.7 kb ADH1 expression unit obtained by Sphl digestion of the above-mentioned “pULexADrev-E” was inserted into the Sphl site of this “pRS-S” to prepare a cDNA library.
  • a vector-pNS (Fig. 7) was constructed (the direction of transcription by ADH1 is the same as the direction of transcription by HIS3).
  • mRNA is a protocol attached to human cultured cells NT2 progenitor cells (Stratagene)
  • cDNA library was prepared using a part (3 ⁇ g) of the cDNA library using a commercially available cDNA synthesis kit (Pharmacia). Specifically, cDNA synthesis was performed using oligo (dT) 12-18 primers and inserted into the EcoRI / Notl site of the NS vector. The introduction of cMA was made unidirectional by using Directional Cloning Toolbox (Pharmacia).
  • E. coli ElectroMAX DH10B Cel ls manufactured by GibcoBRL
  • the obtained transformant was cultured on an LB agar medium containing ampicillin (100 g / ml) at 30 ° C. for 16 hours, and after collecting cells, a plasmid was prepared (QIAGEN axi kit manufactured by QIAGEN).
  • transform EGY48 strain by a conventional method (CL0NTECH3 ⁇ 4, Yeast Protocols Handbook, PT3024-1: 17-20). Converted. After culturing at 30 ° C for 3 to 7 days on SD agar medium (-His / -Leu) for the purpose of selecting clones by expressing the reporter gene LEU2, about 1000 positive clones were obtained.
  • a part (12 clones) of the positive clones thus obtained was subjected to nucleotide sequence determination of the cDNA fragment inserted therein.
  • template DNA was first prepared from each clone by colony PCR.
  • template DNA was obtained by desalting and removing unreacted primer with Microcon-100 (manufactured by Millipore). Using a part (100 to 200 ng) of the template thus obtained, the nucleotide sequence was determined by a method according to the product manual of ABI.
  • a fusion protein expression library was prepared by amplifying a commercially available human fetal brain cDNA library (SUPERSCRIPT library 1 manufactured by GibcoBRL) according to the attached protocol and then purifying a plasmid purified by QIAGEN.
  • the plasmid containing the cDNA fragment as an insert was purified using the method described above.
  • a DNA fragment excised from a part (30 zg) using two kinds of restriction enzymes EcoR I and Not I was selected by agarose electrophoresis of 0.8 into cDNA of 0.7 kb to 4 kb in length. Purified.
  • the cDNA fragment thus obtained is inserted into the EcoRI / Notl site of the pNS vector described above to prepare a fusion protein expression library, and a part of the library is used by a conventional method (new cell engineering experiment protocol).
  • Escherichia coli (ElectroMAX DH10B Cels, manufactured by GibcoBRL) was transformed by electroporation (Gene Pulser, manufactured by BIORAD) according to Shujunsha, 114-115).
  • the obtained transformant was cultured on an LB agar medium containing ambicillin (100 / g / ml) at 30 ° C for 16 hours, and after collecting the cells, a plasmid was prepared (QIAGEN Maxi kit manufactured by QIAGEN).
  • EGY48 strain was transformed by a conventional method (CLONTECH, Yeast Protocols Handbook, PT3024-1: 17-20) using 60 ⁇ g of the plasmid of the prepared fusion protein expression library. After culturing at 30 ° C for 3-7 days on SD agar medium (-His / -Leu) for the purpose of selecting clones based on the expression of the repo overnight gene LEU2, about 1000 positive clones were obtained.
  • CLONTECH Yeast Protocols Handbook, PT3024-1: 17-20
  • the nucleotide sequence of the cDNA fragment inserted into the vector was determined.
  • template DNA was prepared from each clone by colony PCR.
  • template DNA was obtained by desalting and removing unreacted primers using Microcon-100 (manufactured by Millipore). Using a part (100 to 200 ng) of the template thus obtained, a partial nucleotide sequence was determined by a method according to the ABI product manual.
  • the base sequence of 489 clones is available from the National Center for Biotechnology Information (NCBI), Basic BLAST, a public database.
  • the base sequence was determined for 21 of 172 genes which are candidates for novel nuclear localization proteins.
  • the nucleotide sequence was determined in accordance with the product manual of ABI, and appropriate primers were designed and primer-walking was performed. Structural features were also analyzed based on the determined sequences. Specifically, (1) A region in which four or more basic amino acids (lysine or arginine) appear within a class of six consecutive amino acids is defined as “putative nuclear translocation signal (NLS)” It was examined whether such an NLS exists in the amino acid sequence predicted from the above. (2) We also examined the presence of known typical motif structures (eg, Zinc Finger and Leucine Zipper), repeat regions, or certain amino acid-rich regions in the amino acid sequence.
  • NLS putative nuclear translocation signal
  • Nuclear localization was predicted using “PS0RT,” a program that predicts the intracellular localization of proteins.
  • the coil structure in the protein was predicted using “Coils” (Lupas, A. Methods Enzymol., 1996, 266: 513-525), a program for predicting the coiled-coil structure. The results are shown in Tables 1 and 2.
  • clones hfb030, hfb044, hfb060, hfb066, hfblOl, and hfb341 were isolated in the same manner as in Example 5.
  • the full length cDNA of the NTT clone was obtained using the GENE TRPPER TM cDNA Positive Selection System (Gibco BRL) with the Superscript TM Human Fetal Brain cDNA Library (Gibco BRL) as the source.
  • GENE TRPPER The principle of GENE TRPPER is to hybridize a single-stranded cDNA library with a specific oligonucleotide of a target cDNA and to separate and obtain a target cDNA using a biotin-avidin bond.
  • Kits and reagents used are shown below.
  • ElectroMAX DH10B TM Cells (Gibco BRL)
  • Oligonucleotides A, B, C, D sequences are described below
  • Hybond TM -N + (Amersham Pharmacia Biotech)
  • Superscript TM Human Fetal Brain cDNA Library (Gibco BRL) was used as a source for obtaining full-length cDNA.
  • a nick was generated in the sense strand of the fl intergenic region present on the library vector pCMV SP0RT2 by Gene I I, and the same strand was digested by Exonuclease I II.
  • the Superscript TM Human Fetal Brain cDNA Library has a unidirectional cDNA inserted into pCMV SP0RT2. Since the fl intergenic region and the sense strand of the inserted cDNA are on the same strand, the sense strand is digested by Gene II and Exonuclease II treatment, leaving only the antisense strand as a single strand.
  • a cDNA library single-stranded to only the antisense strand was obtained.
  • the confirmation of single-strand formation was performed by agarose electrophoresis in comparison with an untreated cDNA library and a Gene II-treated cDNA library.
  • Oligonucleotides A, B, and C specific to the nucleotide sequence of the cDNA fragment cloned by the NTT method were designed. CDNA cloned by NTT method (5, one pass) The nucleotide sequences of the fragments hfb030, hfb044, hfb060, hfb066, hfblOK and hfb341 are shown in SEQ ID NOs: 66 to 71 in order (Tables 3 and 4). The oligonucleotides A, B, and C designed for each clone are shown in Tables 3 and 4 (SEQ ID NOs: 72 to 89).
  • Oligonucleotide A is shown with a solid underline
  • oligonucleotide B is shown with a double underline
  • oligonucleotide C is shown with a dotted underline.
  • oligonucleotide C is an antisense oligonucleotide, it is an annealing sequence in the cDNA sequence.
  • Oligonucleotide B (HFB030-S2) (SEQ ID NO: 73) rrTAACCGGCTGTTTTATGC
  • Oligonucleotide C (HFB030-A1) (SEQ ID NO: 74) CACTCCnACTncCATCTCnCCAGTGCC
  • Oligonucleotide B (HFB04-S2) (SEQ ID NO: 76) GTCnCACCTCTCCACAACC
  • Oligonucleotide C (HFB0 "-A1) (SEQ ID NO: 77) GCCTGHGGAGGTAnTGGAGTAncnGC
  • rmr ⁇ TR (3 ⁇ 4GGnc ⁇ GGAGCGCTTGGACCCCGGCHCT (mCGCGTCAGGAGAAAGGAGCACTGGCTTTGCnrCAT CAGGCCAAAGATGCCTnCTnGGGAATACG CAGTCCGAAGAAGACACCTCCTCGGAAGTCGGCATCTCTCTCCAACC TGCATTCTTTGGATCGATCAACCCGGGAGGTGGAGCTGGGCTT ⁇ I ⁇ ; ⁇ ( ⁇ pJ ⁇ ⁇ p.g.TGGCAGGGCAA AGCCT ⁇ GTTTGAAAATGGCCAGTGGATAGCAGAGACAGGGGnAGTGGCGGTGTGGACCGGAGGGAAGnCAGCGCCT TCGCAGGCGGMCCAGCAGnGGAGG GAl ⁇ CMTCTCnKGGCTGAMGTGGACATCTTAnAGACATGCnTCAG AGTCCACTGCCGAATCCCACnAATGGAGAAGGAACTGGATGAACTGAGGATC oligonucleotide A (HFB06
  • Oligonucleotide B (HFB060-S2) (SEQ ID NO: 79) CCAAAGATGCC1TTCTTTGG
  • Oligonucleotide C (HFB060-A4) (SEQ ID NO: 80) GGTTCATAGTCGGGGATCCGTAHCC [Table 4]
  • A66CCGC6C6CCA ( ⁇ 6nCCG6CAGnCCGnATMGGACAT ( »CAGGTCCCCGGGAGGCCCTGGACCAGCTCCGAGAG CTGTGTCACCAGTGGCTACAGCCT GGCACGCTCCAAGGAGCAGATCCTGGAGCTGCTGGTGCTGGAGCAGnCCTMG TGCACTGCCTGTGAAACTCCCGACATGGGTGGAATCGCNGCACCCAAAAAATGCCAANAAGTGGTGGCCCTGGTAAAAGG TGTGACCTGGAnCTGAAGAAGAAGTACnCCTGCAGGANAACTGCCNAGGGCACCNCTGCTGCTCAAGGTCNCTGCCCN CAGGAAGAAAAACANAAG
  • Oligonucleotide A (HFB101-S1) (SEQ ID NO: S: 8) TTGA6GTCCTCACACTGAACC Oligonucleotide B (HFB101-S2) (SEQ ID NO: 85) TCCGHATAAGGACATGACAGG Oligonucleotide C (HFB101-A1) (K column number: 86) CACTCAGGCHCCATCnCAGCATATAGGG hfb (Number: 71)
  • Oligonucleotide A (HFB341-S1) (SEQ ID NO: 87) CTAHCCCncCCAAAAAAGC Oligonucleotide B (HFB341-S2) (SEQ ID NO: 88) CCCATTCCGTTTGnGATCC Oligonucleotide C (HFB341-A1) (SEQ ID NO: 89) CGTCTCACGACACAGTGGACAAGTGG pCMVsp-S3) (SEQ ID NO: 90); CGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACC (common) Cloning site of cloning vector pCW SP0RT2 Upper row (SEQ ID NO: 91)
  • Oligonucleotides ⁇ and ⁇ were sense strands, and oligonucleotide C was an antisense strand. Oligonucleotide ⁇ was designed for hybridization and B was designed for repair to increase stringency. Oligonucleotide C was used for colony hybridization and colony PCR.
  • a sense strand oligonucleotide D specific to the upstream of the cDNA insertion site of pCMV SP0RT2 was designed.
  • the sequence of oligonucleotide D is shown in SEQ ID NO: 90, and the sequence upstream of the cMA insertion site of pCMV SP0RT2 corresponding to oligonucleotide D is shown in SEQ ID NO: 91.
  • Oligonucleotide synthesis was relied on Toagosei.
  • Oligonucleotide A was added with biotin-14-dCTP to the 3 'end using terminal deoxynucleotidyl transferase to check for the presence of c- biotin labeled with biotin, by acrylamide electrophoresis.
  • the single-stranded cDNA library in (2) and the oligonucleotide A that had been biotinylated in (4) were hybridized. Unhybridized cDNA was isolated by adding streptavidin-paramagnetic beads to the hybridization solution, fixing to a magnetic stand and removing the supernatant. After washing several times with the washing buffer attached to the kit, the target cDNA library hybridized with the elution buffer was eluted.
  • the eluted cDNA was repaired into a double-stranded cDNA library using dNTPs and a repair enzyme using oligonucleotide B as a primer.
  • the repaired double-stranded cDNA library was electroporated into ElectroMAX DHlOBTM Cells (Gibco BRL), and then spread on an agar medium to form colonies.
  • the presence or absence of the target cDNA was determined by (7) colony hybridization or (8) colony PCR. (7) Colony hybridization
  • the colonies formed on the agar medium were transferred to a nylon membrane Hybond TM -N + (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and colony hybridization was performed using DIG-labeled oligonucleotide C.
  • DIG labeling of oligonucleotides was performed using a DIG Oligonucleotide Tailing Kit (manufactured by BOEHRINGER MANNHEIM), and hybridization was performed using DIG Easy Hyb (manufactured by BOEHRINGER MANNHEIM).
  • Detection was performed using a DIG Wash and Block Buffer Set (manufactured by BOEHRINGER MANNHEIM) and a DIG Nucleic Acid Detection Kit (manufactured by BOEHRINGER MAHEIM).
  • a colony formed on the agar medium was subjected to PCR using KOD Dash (manufactured by T0Y0B0) as type I. Oligonucleotide C specific to the target cDNA and oligonucleotide D specific to the cloning vector were used as primers.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis to confirm the presence or absence of a band.
  • a colony determined to have the target cDNA according to (7) or (8) was cultured, a plasmid was extracted, and the nucleotide sequence was determined.
  • the extraction of plasmid was performed using QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by QIAGEN).
  • the nucleotide sequence can be determined using BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems) or dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit
  • Total length 3041 bp, putative translation region 48-2735 hfb044-2 (total length 3060 bp, putative translation region 69-2756), hfb060-1, hfb060-2, hfb066 (total length is estimated to be part of the translation region), hfblOl-1 (total length 2565 bp, putative translation region 474-2120), hfblOl-2 (total length 2694 bp, putative)
  • the nucleotide sequences of translation region 402-2267) and hfb341 (total length 6193 bp, putative translation region 466-3873) are shown in SEQ ID NOs: 92 to 100, respectively.
  • a peptide having a nuclear transport activity is provided.
  • the peptide of the present invention is useful as a carrier for transporting a desired substance to be transferred to the nucleus into the nucleus. It can also be used as a nuclear transport indicator if it can be visually recognized by modifying it with an appropriate substance.

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Description

明細書 核移行活性を有するぺプチド 技術分野
本発明は、 細胞内の核へ移行する活性を有するぺプチドおよび該ぺプチドをコ 一ドする DNAに関する。該ぺプチドは、核へ物質を輸送するための担体として利用 しうるため、 本発明は、 主として薬物送達 （ドラッグ 'デリノ、リ一） の分野に属 する。
背覃技術
薬剤を標的部位に特異的に送達し、 標的部位において至的濃度を維持すること は、 薬効を効果的に発現させると共に薬物の副作用を低減させる上で、 非常に重 要である。 このため特定の標的部位に薬物を送達するための様々なシステムが開 発されてきた。
核へ物質を輸送するための方法に関しては、 これまでにマイクロインジェクシ ヨン法、 トランスフエクシヨン法、 抗体法、 ペプチド法など多くの方法が開発さ れている。
マイクロインジヱクシヨン法 （実験医学別冊、 新遺伝子工学ハンドブック、 半 土社、 173-176 [ 1996] ) は、 微小な注入針を通じて直接的に確実に核内へと試料 を導入する方法で、 通常、 核酸やタンパク質などの高分子物質の導入に頻繁に用 いられている。 しかし、 核内に注入できる量は微量であり、 また、 特に試料が核 内で安定に保持されるような性質を持たない場合などは、 注入と同時に試料が核 外へと急速に拡散してしまうことも考えられる。
トランスフエクシヨン法（実験医学別冊、 新遺伝子工学ハンドブック、 羊土社、 155-168 [1996] ) は、 特に外来遺伝子の導入に多用されており、 りん酸カルシゥ ム法、 DEAEデキストラン法、 リボソーム法、 リポフエクシヨン法などが知られて いる。 これらの方法は、 試料と担体の間で複合体を形成させた後、 貪食や膜融合 により細胞内に取り込ませ， 詳細な機構はいまだ明らかではないが、 最終的に試 料が核内へ導入される方法である。
抗体法 (Avrameas A, et al . Proc. atl . Acad. Sci . USA 1998 May 12； 95 ( 10)5601-5606)は、核内の特別なタンパク質や DNAに対する特異的な抗体を作製 し、 抗体自身を担体あるいは担体の一部として使用して、 試料を核内に導入する 方法である。 この方法は非常に優れた方法ではあるが、 適切な抗体を得るために 時間と労力が必要となる。
ぺプチド法 (Chaloin L, et al . Biochem Biophys Res Commun 1998
Febl3 ;243(2)601-608, Sebestyen MG, et al . Nat Biotechnol 1998 Jan; 16 ( 1) ： 80-85) は、 抗体法で用いられる抗体の代わりに核移行シグナルなどを含んだぺ プチドを用いる方法で、 抗体よりも遥かに小さな分子 （最小 4~5アミノ酸残基） で機能することが知られている。 さらに、 核移行ペプチドは、 抗体などの受動的 な拡散による核移行とは異なり、 細胞自身が持つ核移行シグナル依存的なキヤリ ァーを介して能動的に核内に取り込まれるため、 高効率かつ迅速に核移行が行わ れるといった優れた特徴を有している。 発明の開示
本発明は、 核移行活性を有する新規なぺプチドおよび該ぺプチドをコ一ドする DNAを提供することを課題とする。また、 これらを利用した核への物質輸送系を提 供することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために、 まず、 転写因子の性質を利用して 核移行活性を有するぺプチドをコ一ドする DNAを簡便に単離する方法を独自に開 発した （この方法を 「NTT法」 と命名した） 。 NTT法の原理は、 以下の如くである。 真核生物の転写因子は、 核内へ移行して特定の遺伝子のプロモーター領域と相互 作用することにより該特定の遺伝子の発現を誘導する機能を有しており、 転写因 子の核移行能は転写因子中に存在する核移行シグナルに起因していると考えられ ている。 従って、 転写因子中の核移行能を有する領域を除去してその代わりに未 知のぺプチドが導入された融合タンパク質を細胞内で発現させた場合、 該融合夕 ンパク質中の未知のぺプチドが核移行能を有すれば、 融合タンパク質が核内へと 移行して特異的なプロモータ一領域と作用し、 その下流の特定の遺伝子の発現が 誘導される。 一方、 該融合タンパク質中の未知のペプチドが核移行能を有しなけ れば、 融合タンパク質は核内へ移行せず、 プロモー夕一領域下流の特定の遺伝子 の発現は誘導されない。 このため核移行能を有しない転写因子に未知のぺプチド を融合したタンパク質による、 特異的なプロモータ一下流の遺伝子の発現の誘導 を指標に、 融合タンパク質中の未知のぺプチドが核移行能を有するか否かの判定 を行うことができる。
本発明者らは、 この原理に基づき、 核移行能を有する領域を除去した転写因子 をコードする DNAと被検 DNAとの融合 DNAを調製し、転写因子が結合した際に活性化 されるプロモーター領域および該プロモーター領域の活性化により発現が誘導さ れるレポ一夕一遺伝子を核内に保持している真核生物宿主に導入し、 該レポ一夕 —遺伝子の発現の検出を行った。その結果、被検 DNAとして核移行能を有するぺプ チドをコ一ドしている MAを用いた場合にはレポーター遺伝子の発現が誘導され、 一方、 被検 DNAとして核移行能を有しないぺプチドをコ一ドしている DNAを用いた 場合には、 レポーター遺伝子の発現が誘導されなかった。 即ち、 上記原理に基づ き、実際に、核移行活性を有するぺプチドをコ一ドする DNAを特異的に単離するこ とができることを見出した。
そこで、 本発明者らは、 次に、 核移行能を有する領域を除去した転写因子と他 のべプチドとの融合タンパク質をコードする cDNAのライブラリーを調製し、 これ を細胞内に導入してレポ一夕一の発現を指標に核移行能を有するぺプチドをコ一 ドする cDNAのスクリーニングを行った。 その結果、 cMAライブラリーの中から核 移行活性を有するペプチドをコードする複数の新規な DNAを単離することに成功 した。
本発明は、本発明者らが独自開発した NTT法により単離された核移行活性を有す るペプチドをコードする新規な DNA、 該 DNAによりコードされるペプチド、 および それらの利用に関する。 より具体的には、
( 1 ) 配列番号： 1から 21、 101から 107のいずれかに記載のアミノ酸 配列を含み、 核移行活性を有するペプチド、
(2) 配列番号： 1から 21、 101から 107のいずれかに記載のアミノ酸 配列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および/若しくは付加した アミノ酸配列を含み、 核移行活性を有するペプチド、
(3) 核へ移行させるための所望のペプチドを含む融合ペプチドである、 （ 1) または （2) に記載のぺプチド、
(4) ( 1) から （3) のいずれかに記載のペプチドをコードする DNA、
(5) (4) に記載の DNAを含むベクタ一、
(6) (5) に記載のベクタ一を保持する形質転換細胞、
(7) (6) に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、 （ 1) または （2) に記載のペプチドの製造方法、 に関する。
なお、 本発明において 「ペプチド」 とは、 アミノ酸同士がペプチド結合により 結合した化合物を指す。 従って、 鎖長の長いペプチドである 「ポリペプチド」 や 「タンパク質」 もまた本発明の 「ペプチド」 に含まれる。
本発明者らが開発した NTT法により単離された核移行活性を有するぺプチドを コードする DNAを配列番号： 22から 42、 および 92から 100に示す。 また、本発明のぺ プチドに含まれる、これら DNAによりコードされるぺプチドをそれぞれ配列番号： 1 から 21、 および 101から 107に示す。
本発明のペプチドは、 核移行活性を有するという共通の特徴を有する。 このた め、 本発明のペプチドは、 核へ輸送することを望む物質を核へ輸送するための担 体として利用することが可能である。 核へ物質を輸送するために用いる本発明の ペプチドとしては、 配列番号： 1から 21、 および 101から 107のいずれかに記載され たァミノ酸配列を含むペプチドが好適である。
但し、核移行活性を有する限り、 これらべプチドのアミノ酸配列において 1若し くは複数のアミノ酸が置換、 欠失、 および/若しくは付加したアミノ酸配列を含 むペプチドも同様に用いることが可能である。 このようなアミノ酸の改変は、 当 業者に公知の方法、 例えば、 部位特異的変異誘発法 (Curretnt Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. ( 1987) Publich. Jhon Wi ly & Sons Section 8.1-8.5 ) )や PCR法 (PCR Primer A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995, 581 - 621) を利用して行うことができる。 アミノ酸の改 変部位および改変個数は、 改変後のぺプチドが核移行活性を保持する限り特に制 限はない。 アミノ酸の改変個数は、 通常は、 20アミノ酸以内であり、 好ましくは 10アミノ酸以内であり、 さらに好ましくは 5アミノ酸以内であり、さらに好ましく は 3アミノ酸以内である。
本発明のぺプチドを担体として核へ輸送するための物質としては特に制限はな い。 例えば、 ペプチド、 核酸、 多糖、 金属、 合成化合物などが挙げられる。 これ ら物質は、 疾患の治療用、 予防用、 診断用の薬物でありうるが、 これらに制限さ れない。 臨床応用以外の目的、 例えば、 生物学的解析などの目的で用いられる物 質であってもよい。
本発明のペプチドを用いて、 物質を核へ輸送するためには、 該物質を本発明の ペプチドに結合させることが必要である。結合は、一定の結合力が得られる限り、 その形態に制限はない。結合は、架橋剤を用いた化学的架橋（日本生化学会編 続 生化学実験講座 2、 タンパク質の化学 （下） 、 東京化学同人、 604— 618) でもよく、 例えば、 従来から頻繁に利用されるジメチルスべ口イミデート二塩酸塩、 スベリ ン酸ジ - N-ヒドロキシスクシンィミ ドエステル、 酒石酸ジ- N-ヒドロキシスクシン ィミ ドエステル、 p-フエ二レンビスマレイ ミ ド、 メチル 4一メルカプトブチルイミ デ一ト塩酸塩、 メチル 4—アジドベンゾィミデ一ト塩酸塩、 グルタルアルデヒド、 N—スクシンィミジル 3- (2-ピリジルジチォ） プロビオネ一ト、 N— (ァ-マレイミ ドブチリルォキシ） スクシンイミ ド、 N- ( £ -マレイミ ドへキサノィルォキシ）ス クシンイミ ド、 1-ェチル -3- (3-ジメチルァミノプロビル）カルポジイミ ドなどが 挙げられる。 また、 核へ輸送させるための物質がペプチドであれば、 該ペプチド をコードする DNAと本発明のぺプチドをコードする DNAを連結して、 これらべプチ ドを融合べプチドとして発現させることにより両ぺプチドを結合させることも可 能である。 結合はスぺーサ一領域を介した結合であってもよい。 一方、 結合形態 としては、 上述の共有結合的な結合形態以外に、 本発明のペプチドと核へ輸送す るための物質の間に生じる相互的な親和作用を利用した結合でもよい。 このよう な結合形態として、 例えば、 静電気的な親和力を利用した結合、 疎水的な親和力 を利用した結合、 タンパク質-タンパク質、 あるいは、 タンパク質一核酸などの結 合モチーフを利用した結合、 酵素と基質の親和力を利用した結合などが挙げられ る。 本発明のベプチドと核へ輸送するための物質が本質的にこれらの結合能を有 していない場合は、 これらの結合能をもつ機能ドメインを新たに付加して利用す ることも考えられる。
本発明のぺプチドを担体として物質を輸送するための標的細胞としては、 特に 制限はなく、 本発明のぺプチドを利用する目的に応じて種々の細胞を用いること が可能である。 標的細胞としては、 例えば、 生体における細胞で有り得るし、 ま たインビトロにおける培養細胞で有り得る。 また、 これら細胞は、 例えば、 ヒト を含む動物細胞、 植物細胞、 微生物細胞で有り得る。
また、 本発明は、 本発明のペプチドをコードする DNAに関する。本発明の DNAは、 本発明のペプチドをコードしうるものであれば、 特に制限はなく、例えば、 cDNA、 ゲノム DNA、 および合成 MAが含まれる。 本発明の DNAは、 例えば、 配列番号： 22か ら 42、 および 92から 100に記載された塩基配列の全部若しくは一部からなる DNAを プローブとして、ヒト胎児脳由来の cDNAライブラリ一またはゲノム DNAライブラリ 一をスクリーニングすることにより調製することができる。 また、 配列番号: 22 から 42、 および 92から 100に記載された塩基配列からなる MAに特異的にハイプリ ダイズするオリゴヌクレオチドをブライマーとして、ヒト胎児脳由来の fflRNA、cDNA、 またはゲノム DNAを铸型としたポリメラ一ゼ連鎖反応により調製することもでき る。
本発明の DNAは、例えば、本発明のぺプチドの製造に利用することが可能である。 本発明のぺプチドの製造は、一般的には、本発明の DNAを適当なベクターに挿入し て、 これを適当な宿主細胞に導入し、 得られた形質転換細胞を培養して、 形質転 換細胞に発現させた組み換えタンパク質を精製することにより行う。 組換えぺプ チドの発現には、 従来の一般的な発現系を利用することができる。 例えば、 大腸 菌、 枯草菌、 酵母. 昆虫細胞， 植物細胞， 動物細胞などを用いた生体内発現系は もとより、 大腸菌、 小麦胚芽、 あるいはラビットレティキュロサイ トなどの細胞 抽出液を用いた試験管内発現系も利用することが可能である。 このように発現さ れた組み換えペプチドは、 例えば、 従来から用いられているイオン交換、 ゲルろ 過、 分配、 ァフィ二ティ一などのクロマトグラフィーのステップを組み合わせた り、 適当な充填剤を使用した HPLCなどを利用するなどして高純度に精製すること が可能である。
本発明のぺプチドは、 適当な物質で修飾して視覚的に認識できるようすれば、 「核輸送指示物質」 として利用することも可能である。 すなわち、 このように修 飾を受けたベプチドを細胞内に導入することにより、 細胞質から核への物質移動 をリアルタイムでモニタリングすることが可能となる。 ぺプチドの修飾方法とし ては、 ペプチドを直接的に蛍光色素などで標識したり、 あるいは EGFPなどの蛍光 タンパク質との融合ペプチドを作製すればよい。 このような 「核輸送指示物質」 は、 例えば、 核移行阻害剤などを開発するためのスクリーニング系に応用するこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド 「pLexAD」 を示す。
図 2は、 プラスミ ド 「pLexADrev」 を示す。
図 3は、 プラスミ ド 「pRSlF」 を示す。
図 4は、 プラスミ ド 「pRS3F」 を示す。
図 5は、被検ぺプチドとの融合に用いる転写因子の核移行能のアツセィを示す。 図 6は、 被検ぺプチドを融合した転写因子の核移行能のアツセィを示す。
図 7は、 プラスミ ド 「pNS」 を示す。
図 8は、 NTT法により単離した 21の遺伝子の核移行活性を検出した結果を示す顕 微鏡写真である。図中の番号は表 1および表 2における遺伝子クローンの順番（表 1 における最初のクローンを 1として、 表 2における最後のクローンを 21とした） に 対応する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。 なお、 以下の実施例においては、 特に記載する場合を除 き、 基本的な遺伝子工学的手法は常法 （Sambrook, J. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 1989, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ) に従った。 また、 制限酵素およびその他の修飾酵素などの 遺伝子工学製品は宝酒造から購入し、 それぞれの使用条件は添付マニュアルに従 つた。 また、 大腸菌からのプラスミ ドの精製は 「QIAprep Kit」 （QIAGEN社製） を 用いた。 また、 塩基配列の確認は 「ABI PRISM 377」 （PEHKIN ELMER社製） を用い た。 解析用試料の調製は同社の試薬を用い、 使用法は製品マニュアルに従った。 また、 酵母の取り扱い（培地、 宿主、 シャトルべクタ一、 遺伝子の導入法、 レポ一 夕一遺伝子のアツセィ法、 遺伝子の単離法など） については、 「MATCHMAKER LexA Two-Hybrid Systemj (CL0NTECH社製）を使用し、添付の「Yeast Protocols Handbookj に従った。 また、 カスタムオリゴヌクレオチドの合成は東亜合成に依頼した。
[実施例 1 ] 核移行夕ンパク質トラップベクターの作製
( 1 ) GAL4転写活性化ドメインをコードする DNA配列の PCRによる増幅
5，側に add- in EcoRIサイ トをデザィンした 「プライマ一 NU13」 （配列番号: 43) および「MATCHMAKER 3， AD LD-Insert Screening Amplimerj (配列番号： 44) (CLONTECH社製） とをプライマーに用い、 「プラスミ ド pACT2」 （CL0NTECH社製） を铸型として、 GAL4転写活性化ドメイン （塩基配列を配列番号: 45に示す）を含む DM断片を 「GeneAmp PCR System 2400」 （PERKIN ELMER社製） にて増幅した。 Taq ポリメラーゼとしては 「TaKaRa Ex Taqj (TaKaRa社製） を使用し、 反応条件など は製品マニュアルに従った。これにより増幅された DNA断片をエタノール沈殿にて 精製し、制限酵素 EcoRIと Ncolによる消化を行った後、 6%のポリアクリルアミ ドゲ ル電気泳動を行い、目的の DNA断片をゲルから切り出して電気溶出法により回収し た。
(2) LexAタンパク質と GAL4転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現させ るべクタ— 「pLexAD」 の作製
プラスミ ド 「pLexA」 （CLONTECH社製） のマルチクローニングサイ ト内の EcoRI サイ 卜と Ncolサイ 卜の間に上記（1 )の GAL4転写活性化ドメインをコードする DNA断 片を挿入して 「pLexAD」 を構築した （図 1 ) 。 塩基配列を決定して目的の断片が 正しく挿入されていることを確認した。 なお、 LexA遺伝子の塩基配列を配列番 号: 46に示す。
( 3) LexAの N末端に核外移行シグナル（NES)を挿入したベクター 「pLexADrev」 の作製
H IVの Revタンパク質が有する核外移行シグナル（配列番号：47) を以下のように 合成し、 「pLexAD」がコードする LexAタンパク質の N末端近傍の Hpalサイ トに揷入 した。 センス鎖として 「NU9」 （配列番号: 48) 、 アンチセンス鎖として 「NU10」
(配列番号: 49)を合成し、それぞれ T4ポリヌクレオチドキナーゼで 5'末端をリン 酸化した後、 両者をァニールさせた。 この MA断片を、 予め Hpal消化後アルカリフ ォスファターゼによる脱リン酸化処理を行った「pLexAD」に揷入して「pLexADrev」 を構築した （図 2 ) 。 目的の断片が正しく挿入されていることは、 塩基配列を決 定して確認した。
(4) LexA夕ンパク質と GAL4転写活性化ドメインとの融合夕ンパク質を発現させ るための CEN/ARS領域を複製起点にもつプラスミ ド「pRSlF」と NESを挿入した LexA タンパク質と GAL4転写活性化ドメインとの融合タンパク質を発現させるための CEN/ARS領域を複製起点にもつプラスミ ド 「pRS3F」 の構築
核外移行シグナル ( NES )を挿入しない通常の LexAタンパク質と GAL4転写活性化 ドメインとの融合タンパク質と、 N末端に NESを挿入した LexAタンパク質と GAL4転 写活性化ドメインとの融合夕ンパク質 （該融合夕ンパク質のアミノ酸配列を併記 した塩基配列を配列番号： 50に示す）とをそれぞれ酵母内で発現するために必要な 最小ュニヅトは、 前者の場合は「pLexAD」 を、 後者の場合は「pLexADrevj を Sphl で消化して得られる約 1.7kbの DNA断片である。 この発現ュニヅ ト内には、 ADH1プ 口モーター領域、発現タンパク質のコード領域、マルチクローニングサイ ト、 ADH1 夕一ミネ一夕一領域が含まれている。それぞれの発現ュニッ卜の DNA断片を精製し た後、 予めプラスミ ド 「pRS413」 （STRATAGENE社製） （酵母シャトルベクタ一、 CEN/ARS origin)のマルチクローニングサイ トを含む PvuI I消化断片の部分を、 汎 用プラスミ ド pUC19のマルチクロ一ニングサイ トを含む PvuI I消化断片で置換たベ クタ一 「pRSF」 の Sphlサイ 卜に挿入して 「pRSlF」 と 「pRS3F」 を構築した （それ それ図 3、 図 4 ) 。 目的の断片が正しく挿入されていることは塩基配列を決定し て確認した。 このようにして構築した「pRSlF」（ポジティブコントロール）および 「pRS3F」は、 転写因子として機能する融合タンパク質の直後に pLexA由来のマル チクロ一ニングサイ 卜が存在しているので、目的の cDNAなどの DNA断片を常法によ り容易に融合して発現させることが可能である。
[実施例 2 ] 人工的な核移行タンパク質 cDNAの融合による核移行タンパク質 トラップぺク夕一 「pRS3F」 の有効性の実証
( 1 ) 既知の cDNA断片の融合
既知の cDNA断片として、 細胞質に局在することが認められている分泌シグナル を除去した緑膿菌の分岐鎖アミノ酸結合タンパク質 ( ' BraC) (該タンパク質のアミ ノ酸配列を併記した塩基配列を配列番号: 51に示す） （田中真人、新生化学実験講 座 6 [日本生化学会編] 、 生体膜と膜輸送 （下） 、 1992、 東京化学同人、 9 · 15) と、 その N末端に SV40ラージ T抗原由来の核移行シグナルを融合させた人工的な核 移行タンパク質とをコ一ドする cDNA断片を「pRS3F」の GAL4転写活性化ドメインの C末端にインフレーム （in- frame) で融合させた。 実際には、 「，BraC」 をコード する DNA断片 (Ncol-Dral )を、 予め Xholで消化後、 クレノウ処理により平滑末端化 し、 その後 Ncol消化して精製した 「pRS3F」に挿入して 「pRS3F' BraCj を構築した。 さらに、 この 「pRS3F，BraC」 を Nhelと Ncolで消化して精製したベクターに、 SV40 ラージ T抗原由来の^ ¾移行シグナル（配列番号： 52) をコードする合成 DNA断片、 す なわち、 センス鎖として「NU17」 （配列番号： 53)、 アンチセンス鎖として「冊 18」
(配列番号： 54)を合成し、それぞれ T4ポリヌクレオチドキナーゼで 5，末端をリン 酸化した後、 両者をァニールさせたものを挿入して「pRS3FN' BraC」を構築した。 また、 対照実験のために、 「' BraC」 断片を持たず、 核移行シグナルのみを持つ
「pRS3FN」 も同様に構築した。 目的の断片が正しく挿入されていることは、 塩基 配列を決定して確認した。
(2) レポ一夕一遺伝子の発現による核移行能のアツセィ
上述（1 )の 3種類のプラスミ ド 「pRS3F，BraC」、 「pRS3FN， BraC」、 「pRS3FN」 と [実施例 1 ] で構築した 「pRSlF」 、 「pRS3F」 をそれぞれ用い、 LexAォペレ一夕 一配列を有するプロモ一夕一領域（配列番号： 55) (Estojak， J. , Mole. Cell . Biol . , 1995, 15 : 5820-5829) とその下流のレポ一夕一遺伝子である LEU2と 5 -ガラクト シダ一ゼを、 それぞれ染色体上とプラスミ ド上に持つ宿主酵母 EGY48[p80P- lacZ] (CL0NTECH社より入手）を形質転換した。目的のプラスミ ドが宿主に導入されたこ とは、 栄養要求マーカーである HISの相補性で確認した。次に、 レポ一ター遺伝子 の発現をアツセィするための培地（SD/- LEU, -HIS, -URA, X-gal )にそれぞれの形 質転換体をレプリカし、 30°Cで 2- 3日培養した。 この結果、 人工的な核移行タンパ ク質を融合させた 「pRS3FN， BraC」、 核移行シグナルのみを融合させた「pRS3FN」、 またポジティブコントロールとして「pRSlF」を導入したものは、 レポ一夕一遺伝 子である/?一ガラクトシダ一ゼと LEU2の両方が発現しており、 青色の発色と正常 な生育の両方が確認できた （図 5、 図 6 ) 。 一方、 核移行シグナルを持たない夕 ンパク質を融合した「pRS3F' BraC」、 何も融合していない 「pRS3F」 を導入したも のは、 レポ一夕一遺伝子はほとんど発現せず、 青色の発色も生育も認められなか つた （図 5、 図 6 ) 。
以上の結果から、 あるペプチドをコードする DNA断片を、 「pRS3F」 がコードす る転写因子の C末端にインフレーム （in-frame)で融合させて、酵母内で発現させ ることにより、 核移行能の有無をレポーター遺伝子の発現を見ることで簡便に検 出することができた。
[実施例 3 ]cDNAラィブラリ一作製用べクタ一 pNSの構築
「pRS3F」の改良を行った。改良点は以下の 3点である：① LexAと GAL4ADの接合 部分の EcoRIサイ トを取り除いた。 ②マルチクローニングサイ 卜に新たに EcoRIサ ィ トを導入した。 ③「pRS413」 由来の不必要な領域を取り除き、 可能な限り最小 化した。
まず、 「pLexADrev」 の EcoRIサイ 卜に合成リンカ一、 センス鎖として 「而 31」 (配列番号: 56 )、 アンチセンス鎖として 「NU30」 （配列番号： 57)を挿入し、 ブラ スミ ド 「pLexADrev-dE」 とした。 この 「pLexADrev- dE」 を制限酵素 Sphlで消化し た得られた約 1.7kbの ADH1発現ュニットを含んだ DNA断片を、汎用プラスミ ド pUC19 の Sphlサイ 卜にサブクローニングし、 プラスミ ド 「pULexADrev-dE」 とした。次に、 この 「pULexADrev-dE」 の Nhelサイ 卜と Ncolサイ 卜の間に EcoRIサイ トを持つ合成 リン力一、センス鎖として「NU28」 （配列番号： 58)、アンチセンス鎖として「Νϋ29 ι (配列番号： 59)を挿入し、 プラスミ ド 「pULexADrev- E」 とした。 一方、 「pRS413」 を Dral l lと PvuI Iで消化して 757bpのマルチクローニングサイ ト含む MA断片を取 り除き、 そこに Sphlサイ トを持つ合成リンカ一、 センス鎖として 「NU25」 （配列 番号: 60)、 アンチセンス鎖として 「冊 26」 （配列番号: 61 )を挿入し、 プラスミ ド
「pRS-S」 とした。 この「pRS-S」の Sphlサイ トに、 前述の「pULexADrev-E」を Sphl 消化して得られた約 1.7kbの ADH1発現ュニットを含んだ DM断片を挿入して、 cDNA ライブラリ一作製用のベクタ一 pNS (図 7 ) を構築した（ADH1による転写方向は、 HIS 3の転写方向と同一である） 。
[実施例 4 ]融合タンパク質発現ライブラリ一（ヒト培養細胞 NT2前駆細胞由来） の作製と核移行アツセィ
( 1 )融合タンパク質発現ライブラリーの作製
mRNAは、 ヒト培養細胞 NT2前駆細胞（Stratagene社製）を添付プロトコ一ル
(Catalog #204101, Revision #036002a)に従って培養し、 市販のトータル RNA抽出 キットおよび mRNA抽出キヅ 卜（Pharmacia社製）により調製した。 その一部（3〃g) を使用して市販の cDNA合成キット（Pharmacia社製）により cDNAライブラリーを作 製した。具体的には、 oligo(dT) 12- 18プライマーを利用して cDNA合成を行い、 NS ベクターの EcoRI/Notlサイ 卜に挿入した。 なお、 cMAの揷入は、 Directional Cloning Toolbox (Pharmacia社製）を用いることにより、 一方向性とした。 その後、 作製した cDNAライブラリーの一部を用い、常法 (新細胞工学実験プロトコ一ル、秀 潤社、 114-115 )に従ってエレクトロポレーシヨン（BI0 RAD社製 Gene Pulser)によ り市販の大腸菌（GibcoBRL社製 ElectroMAX DH10B Cel ls)を形質転換した。 得られ た形質転換体をアンピシリン（100 g/ml )を含む LB寒天培地で 30°Cで 16時間培養 し、 集菌後プラスミ ドを調製した（QIAGEN社製 QIAGEN axi kit)。
(2)酵母を用いた核移行アツセィ
調製した融合タンパク質発現ライブラリ一のプラスミ ド 60/ gを用いて、 常法 (CL0NTECH¾, Yeast Protocols Handbook, PT3024- 1 : 17-20)により EGY48株を形 質 転換した。 レポーター遺伝子 LEU2の発現によりクローンを選択する目的で SD寒天 培地 ( -His/- Leu)にて 30°Cで 3〜 7日培養したところ、約 1000個のポジテイブクロ —ンが得られた。
( 3 )塩基配列の決定
このようにして得られたポジティブクローンの一部（12クローン）についてぺク 夕一に挿入された cDNA断片の塩基配列の決定を行った。 塩基配列の決定を行うた めに、 まず各クローンからテンプレート DNAをコロニー PCRによって調製した。 20 〃1の PCR反応液 （耐熱性 DNAポリメラ一ゼ（TaKaRa社製 Ex Taq) 0.5unit、 dNTP mixture各 4nmol、 「プライマ一 NU15」 （配列番号： 62 )、 「プライマー NU36」 （配列 番号： 63 )を各 0.4pmol、 2^ 1の添付バッファ一、 および滅菌水）に各クローンから 接き取った少量の菌体を加え、 「GeneAmp PCR System 2400」 （PERKIN ELMER社製） で変性 94 C、 アニーリング 60°C、 伸張 72°C、 サイクル数 40の条件にて挿入 cDNA断 片の増幅を行った。 各 PCR産物について、 Microcon- 100(Mil lipore社製）にて脱塩 および未反応プライマ一の除去を行いテンプレート DNAを得た。こうして得られた テンプレートの一部（100〜200ng)を用い、 ABI社の製品マニュアルに従った方法で 塩基配列の決定を行った。
(4)得られたクローンのデータベース解析
各クローンの塩基配列を公共データべ一スである National Center for
Biotechnology Information (NCBI ) の Basic BLAST
(http：〃 www.ncbi . nlm.nih. gov/cgi-bin/BLAST/nph-blast?Jfonn=0 )で検索した。 その結果、 12クローン全てが既知の遺伝子と一致した。 その内、 これまでに核内 で機能することが報告あるいは示唆されているのは 10クローンあり、 その中の 5 クローンは塩基性ァミノ酸に富んだ SV40ラ一ジ T抗原夕ィプの核移行シグナル様 配列を有する NP220( Inagaki， H.， J. Biol . Chem.， 1996， 271 : 12525 - 12531 )、 PC4(Ge, H.， Cel l , 1994, 78: 513-523 )、 ERC-55( Imai , T.， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1997， 233: 765-769 )、 ヒストン結合タンパク質（0， Rand, M. G.， Dev. Biol. , 1992， 154: 37-44)、 プロサイモシン a l(Manrow， R. E.， J. Biol. Chem. , 1991, 266 : 3916-3924)、 1クローンは核内外の往復移動を司る M9配列を有する hnRNPAK Michael , W. M.， Cell, 1995, 83: 415- 422)であった。 また、 4クローン は既知の核移行シグナ ルを有さない ferritin H chain(Cai， C. X.， J. Biol . Chem, 1997, 272: 1283卜 12839)、シャぺ口ニン 10(Bonardi， M. A. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 1995, 206 : 260- 265 )、プロティンキナーゼ Cィンヒビ夕一- I(Brzoska， P. M. , Proc . Natl. Acad. Sci.， 1995， 92 : 7824-7828)、 ステロイ ドレセプ夕一コ ァクチべ一夕一 l(0nate， S. A.， Science, 1995， 270: 1354- 1357)であった。 現 在のところ核内で機能することが報告されていない残りの 2クローン、トロポミオ シン（Lin， C. -S.， Mol. Cell . Biol. , 1988， 8: 160-168)、 G-リッチシークェン スファクタ一- KQian, Z.， Nucleic Acids Res. , 1994， 22: 2334- 2343)について は既知の核移行シグナルは認められなかつた。
[実施例 5〗 融合タンパク質発現ライブラリー （ヒト胎児脳由来） の作製と核 移行アツセィ
( 1 )融合タンパク質発現ライブラリ一の作製は、 まず、 市販のヒト胎児脳 cDNA ライブラリ一（GibcoBRL社製 SUPERSCRIPTライブラリ一）を添付のプロトコ一ルに 従って増幅した後、 QIAGEN社製プラスミ ド精製キッ トを用い cDNA断片をインサ一 トに持つプラスミ ドを精製した。次に、 その一部（30 zg) から 2種類の制限酵素 EcoR Iと Not Iを用いて切り出された DNA断片を、 0.8 のァガロース電気泳動により 0.7kb〜4kbの長さの cDNAに選別して精製した。 このようにして得られた cDNA断片 を前述の pNSベクタ一の EcoRI/Notlサイ 卜に挿入して融合タンパク質発現ライブ ラリーを作製し、 その一部を用い、 常法 (新細胞工学実験プロトコ一ル、秀潤社、 114- 115)に従ってエレクトロポレーシヨン（BI0 RAD社製 Gene Pulser)により市販 の大腸菌（GibcoBRL社製 ElectroMAX DH10B Cel ls)を形質転換した。 得られた形質 転換体をアンビシリン（100/ g/ml )を含む LB寒天培地で 30°Cで 16時間培養し、集菌 後プラスミ ドを調製した（QIAGEN社製 QIAGEN Maxi kit)。 (2)酵母を用いた核移行アツセィ
調製した融合タンパク質発現ライブラリ一のプラスミ ド 60〃gを用いて、 常法 (CLONTECH社、 Yeast Protocols Handbook, PT3024- 1 : 17- 20 )により EGY48株を形質 転換した。 レポ一夕一遺伝子 LEU2の発現によりクローンを選択する目的で SD寒天 培地（ -His/-Leu )にて 30°Cで 3〜 7日培養したところ、約 1000個のポジティブクロ ーンが得られた。
( 3)塩基配列の決定
このようにして得られたポジティブクローンの一部（489クローン）についてベ クタ一に挿入された cDNA断片の塩基配列の決定を行つた。 塩基配列の決定を行う ために、 まず各クローンからテンブレート DNAをコロニー PCRによって調製した。
20 1の PCR反応液 （耐熱性 DNAポリメラ一ゼ（TaKaRa社製 Ex Taq) 0.5unit、 dNTP mixture各 4nmol、 「ブラィマ一 NU15」 （配列番号： 64)、 「ブラィマ一 NU36」 配列 番号： 65 )を各 0.4pmol、 の添付バッファ一、 および滅菌水） に各クローンか ら搔き取った少量の菌体を加え、 「GeneAmp PCR System9600」（PERKIN ELMER社製） で変性 94°C、 アニーリング 60°C、 伸張 72°C、 サイクル数 40の条件にて挿入 cDNA断 片の増幅を行った。 各 PCR産物について、 Microcon-100(Millipore社製）にて脱塩 および未反応プライマーの除去を行いテンプレート DNAを得た。こうして得られた テンプレートの一部（100〜200ng)を用い、 ABI社の製品マニュアルに従つた方法で 部分的な塩基配列の決定を行った。
(4)得られたクローンのデータベース解析
489クローンの塩基配列を公共データベースである National Center for Biotechnology Information (NCBI ) の Basic BLAST
( http： //www .ncbi . nlm.nih. gov/cgi-b in/BLAST/nph-b 1 ast?Jform=0 )で検索した 結果、 220クローンが新規の配列あるいは既知の EST (Expressed Sequence Tag) 配列と相同性の高い配列を含む 172の遺伝子と一致した。これらは新規核移行夕ン パク質の候補遺伝子と考えられた。 (5)新規核移行夕ンパク質の候補遺伝子の配列決定
そこで、新規核移行タンパク質の候補である 172の遺伝子のうち、 21個に関し、 その塩基配列（部分的な配列） を決定した。塩基配列決定の方法は ABI社の製品マ ニュアルに従い、適当なプライマーを設計してプライマ一ウォーキングを行った。 決定した配列に基づき構造上の特徴の解析も行った。具体的には、①連続した 6 アミノ酸のクラス夕一内に、塩基性のアミノ酸（リジンあるいはアルギニン）が 4 個以上出現する領域を「推定の核移行シグナル （NLS) 」 と定義し、 塩基配列から 予想されるアミノ酸配列内にそのような NLSが存在するか否かを調べた。②ァミノ 酸配列内に既知の典型的なモチーフ構造（例えば、 Zinc Fingerや Leucine Zipper など） 、 繰り返し領域、 あるいは、 ある種のアミノ酸に富んだ領域の存在なども 調べた。③タンパク質の細胞内局在を予測するプログラムである「PS0RT」を用い て、 核内の局在を予測した。 ④ Coiled-Coil構造を予測するプログラムである 「Coils」 （Lupas，A.Methods Enzymol .， 1996, 266 :513-525) を用いて、 タンパク 質内におけるコイル構造を予測した。 その結果を表 1および表 2に示す。
なお、 これら表中における a)プレーティング効率は、 レポ一夕一遺伝子の発現 強度の目安として用いた。 DNAlOOngを用いて EGY48株の形質転換を行い、 レポ一夕 一遺伝子 （LEU2) の発現を検出するための SD (-LEU) 培地プレートに直接接種し て、 出現してくるコロニーの数を示す。 このプレーティング効率は核移行能の強 さだけではなく、 融合したタンパク質の酵母での転写活性可能をある程度反映す ると考えられる。 但し、 融合したタンパク質が酵母に対して毒性に作用する場合 などもありうるため、 あくまでも目安である。 また、 b)推定核局在は、 PS0RTにお ける核局在の予測値 N=(%)を示す。 18
【表 1】
Figure imgf000020_0001
【表 2】
Figure imgf000021_0001
(6 )培養細胞 （COS- 7) における核移行の確認
上述の 21の遺伝子を、 EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) との融合 タンパク質として培養細胞（C0S-7)で一過的に発現させ、 生細胞内での生産物の 局在を観察することで、 得られた個々の遺伝子が実際に核移行能を有したぺプチ ドをコードしていることを確認した。 その結果、 蓄積の程度に強弱差はあるもの の、 融合タンパク質が確かに核内に存在することが認められた （図 8 )。
[実施例 6 ] NTTクローンの全長取得
NTTクローンの全長を取得するため、実施例 5と同様の方法でクローン hfb030, hfb044, hfb060, hfb066, hfblOl, および hfb341を単離した。 NTTクローンの全長 cDNAの取得は、 Superscript™ Human Fetal Brain cDNA Library (Gibco BRL社製） をソースとして GENE TRPPER™ cDNA Positive Selection System (Gibco BRL社製) を用いて行った。
GENE TRPPERの原理は、 一本鎖化した cDNA Libraryとピオチン化した標的 cDNA 特異的ォリゴヌクレオチドをハイブリダィゼ一シヨンし、ピオチン-アビジン結合 を利用して標的 cDNAを分離取得するものである。
( 1 ) 以下に使用したキットおよび試薬を示す。
• Superscript™ Human Fetal Brain cDNA Library (Gibco BRL社製)
• GENE TRPPER™ cDNA Positive Selection System (Gibco BRL社製)
•その付属物：
Gene I I (fl intergenic regionのセンス鎖に nickを生じさせる）
Exonuc lease I I I
ピオチン- 14- dCTP
ターミナル ·デォキシヌクレオチジル · トランスフェラ一ゼ
ストレブトァビジン-パラマグネティック ビーズ
洗浄バッファー
溶出バッファ一
dNTPs
修復酵素 （Repair enzyme)
• ElectroMAX DH10B™Cells (Gibco BRL社製)
•ォリゴヌクレオチド A，B，C，D (配列は後述） • Hybond™-N+ (Amersham Pharmacia Biotech社製)
•DIG Oligonucleotide Tailing Kit (BOEHRINGER MANNHEIM社製）
• DIG Easy Hyb (BOEHRINGER MANNHEIM社製）
• DIG Wash and Block Buffer Set (BOEHRINGER MANNHEIM社製)
- DIG Nucleic Acid Detection Kit (BOEHRINGER麵 NHEIM社製）
• OD Dash (T0Y0BO)
• QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製)
• BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems社製)
• dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin- Elmer Applied Biosystems社製)
• ABI PRISM 377XL (Perkin-Elmer Applied Biosystems社製)
( 2 ) cDNAラィブラリの一本鎖化
全長 cDNA取得のソースとして Superscript™ Human Fetal Brain cDNA Library (Gibco BRL社製） を使用した。 Gene I Iによってライブラリベクタ一 pCMV SP0RT2 上に存在する fl intergenic regionのセンス鎖に nickを生じさせ、 Exonuclease I IIによって同鎖を消化した。 Superscript™ Human Fetal Brain cDNA Libraryは pCMV SP0RT2に一方向に cDNAが挿入されている。 fl intergenic regionと挿入 cDNA のセンス鎖が同一鎖上にあるため、 Gene I Iおよび Exonuclease ΠΙ処理によりセ ンス鎖が消化されアンチセンス鎖のみが一本鎖として残る。 これによりアンチセ ンス鎖のみに一本鎖化した cDNAライブラリを得た。 一本鎖化の確認はァガロース 電気泳動によって、未処理 cDNAライブラリおよび Gene I I処理 cDNAライブラリと比 較し行った。
( 3 ) オリゴヌクレオチド作製
NTT法によってクローニングされた cDNA断片の塩基配列に特異的なオリゴヌク レオチド A，B，Cを設計した。 NTT法によってクローニング（5， one pass)された cDNA 断片、 hfb030、 hfb044、 hfb060、 hfb066、 hfblOK hfb341の塩基配列を、 順に配 列番号： 66〜71に示す （表 3および 4 ) 。 各クローンに対して設計したオリゴヌ クレオチド A, B，Cは、 表 3および 4 (配列番号： 72〜89) に示す。 オリゴヌクレオ チド Aは実線下線で、 オリゴヌクレオチド Bは二重下線で、 オリゴヌクレオチド C は点線下線で表した。但し、オリゴヌクレオチド Cはアンチセンスオリゴヌクレオ チドであるため、 cDNA配列中ではァニーリング配列となっている。
23
【表 3】 hfb030 (配列番号: 66)
GCAATTTTGCCnCTGTACrrTGTGCAGGnGACCTACCATGGGGTCTCCCCATGTAAGGTGACTGCAGAGAAATTAATG GACrrACGAAATGAATACCTGCCAGCGGATGAGGCTAATAAAAGACTTTTGGATCAAAGGTATGGTAAGAGAGTGATTCA δΜ. ς·Τ T.?^ I^^GCTAMGAAGMCTCC GCTGCCCATGnGTGGAACTCCCATAG AGAMnAGACGGATGHACMGAT(^CATGnCTGGCTGTATGCAATAmCTGn6GATTTGCATGGGHCTCTCTCT AGAACA CCCnACA CAmCAATGACCCTGGnCACCATGTmMCCGGCTGTTnATGCTGTGGATGTT(^CM CMTAmGGGMGATGAAGTAGAAGACTAGnAACTACTGCTCNAGATATGGAAGTGGA GTnTTCCCNAATCTCCG TCCAGTNCCAAAGTAACTTTGCGGGATATTTAGGGTCTATCNnCACTCTCCTGCGTAA オリゴヌクレオチ卜 'A(HFB030-S1 )(E列番号: 72) GCCnCTGTACTTTGTGCAGG
オリゴヌクレオチド B(HFB030-S2) (配列番号: 73) rrTAACCGGCTGTTTTATGC
オリゴヌクレオチド C(HFB030-A1 ) (配列番号: 74) CACTCCnACTncCATCTCnCCAGTGCC
hfb04 (配列番号: 67)
GAATTCCTGATGAGGTmACAAAGTATTTTGGATCMTACTCCAAC ATCAGAAAGCCAGAAAGAGGATCCTTTCMT AnGCAGAACCACGAGTGGArrTACACACCTCAGGAGAACACTCAGAAnGGTTCAAGAAGAAAATTTGAGCCCAGGCAC CCAMCACOTCA TGATA GCMGTATG ffi I TTTTSAAAAATCCACTA ATGCAAGrnTACTCrrTGGACACGGTTTCCAAmGTCAGTTreTCTTCACCTCTCCACMCCACACTrTGTTTCCAGAA ATACACTACGTCTCCmGGAGTGT∞mCGGCCAATCTGnACCTCAGTGnGCCATCTTWTGCCAAA GCCTCC而 imTOTGmGGATCTCAGCCAffiTCmAmGTCTGCTTTGGATGCTACACATCAGCAGnGACAC C CCCAGGAGCTGGATGATCTGATAGAnCTCAGAAGAACTTAGAGACTTCAT オリゴヌクレオチド A(HFB044-S1 ) (配列番号： 75) CAGAAAGCCAGAAAGAGGATCC
オリゴヌクレオチド B(HFB04 -S2) (配列番号: 76) GTCnCACCTCTCCACAACC
オリゴヌクレオチド C(HFB0"-A1 ) (配列番号： 77) GCCTGHGGAGGTAnTGGAGTAncnGC
hfb060 (配列番号: 68)
rmr^TR(¾GGnc∞GGAGCGCTTGGACCCCGGCHCT(mCGCGTCAGGAGAAAGGAGCACTGGCTTTGCnrCAT CAGGCCAAAGATGCCTnCTnGGGAATACG CAGTCCGAAGAAGACACCTCCTCGGAAGTCGGCATCTCTCTCCAACC TGCATTCTTTGGATCGATCAACCCGGGAGGTGGAGCTGGGCTT^I^;^ (^pJ^ ^p.g.TGGCAGGGCAA AGCCT^GTTTGAAAATGGCCAGTGGATAGCAGAGACAGGGGnAGTGGCGGTGTGGACCGGAGGGAAGnCAGCGCCT TCGCAGGCGGMCCAGCAGnGGAGG GAl^CMTCTCnKGGCTGAMGTGGACATCTTAnAGACATGCnTCAG AGTCCACTGCCGAATCCCACnAATGGAGAAGGAACTGGATGAACTGAGGATC オリゴヌクレオチド A(HFB060-S1 ) (配列番号： 78) CAGGAGAAAGGAGCACTGGC
オリゴヌクレオチド B(HFB060-S2) (配列番号: 79) CCAAAGATGCC1TTCTTTGG
オリゴヌクレ才チド C(HFB060-A4) (配列番号: 80) GGTTCATAGTCGGGGATCCGTAHCC 【表 4】
hfb066 (配列番号: 69)
GGATCCGCTCAGA TGGGCCAGCTTCGGCAGGAGAACGAGCTGCTGCAGAACAAGnACATMTGCTGTGCAAATGAAG GAAMAGACAAGCAGMTATCAGCCAGnGGAGAAA GCTAAAAGCTGAGCAGG GCCCG GmTGTAGAGAAACA
Figure imgf000026_0001
AAAGAAGACCAAATCAGAGAACTAGAACTAAAAGTCCAGGAGCTTCGGAAATATAAGGAAAATGAGAAGGACACTGAGGT
GnAATGTCAGCCCTCTCAGCCATGCAAGACAA CACAGCACCTGGAGAACAGCTTAAGTGCAGAGACGAGAATCAAGC TGGACCTGnCTCCGCACTGGGCGATGCAAAGCGGCAGCTCGAGAnGCCCAAGG
才リゴヌクレオチド A(HFB066 - S1 ) (配列番兮: 81 ) ATAATGCTGTGCAAATGAAGC オリゴヌクレ才チド B(HFB066-S2) (配列番号: 82) AGCAGAATATCAGCCAGHGG オリゴヌクレオチド C(HFB066-A4) (配列番号: 83) GCTTCTAGTTCTCTGATCCGATTCCGTAAG hfb101 (配列番号: 70)
G TTCCTCAAGACACCATTCCAGAGTATCCTGAGCTCCAGCTGGACCCTAAATTGGATCCTCrniTGCTGAGAGTCCC CTAATGMCAnGAGGTTCTTGAGGTCCTCACACTGAACCAGGAGGTGGCTGGTCCCCGGAATGCCCAGATCCAGGCCCT ATGCTGAAGATGJ^G^^^^^
A66CCGC6C6CCA(^6nCCG6CAGnCCGnATMGGACAT(»CAGGTCCCCGGGAGGCCCTGGACCAGCTCCGAGAG CTGTGTCACCAGTGGCTACAGCCT GGCACGCTCCAAGGAGCAGATCCTGGAGCTGCTGGTGCTGGAGCAGnCCTMG TGCACTGCCTGTGAAACTCCCGACATGGGTGGAATCGCNGCACCCAAAAAATGCCAANAAGTGGTGGCCCTGGTAAAAGG TGTGACCTGGAnCTGAAGAAGAAGTACnCCTGCAGGANAACTGCCNAGGGCACCNCTGCTGCTCAAGGTCNCTGCCCN CAGGAAGAAAAACANAAG
オリゴヌクレオチド A(HFB101-S1 ) (配列番 S:8 ) TTGA6GTCCTCACACTGAACC オリゴヌクレオチド B(HFB101-S2) (配列番号: 85) TCCGHATAAGGACATGACAGG オリゴヌクレオチド C(HFB101-A1 )(K列番号: 86) CACTCAGGCHCCATCnCAGCATATAGGG hfb341 (配列番号: 71 )
GTTTCAACTATTCCCTTCCCAAAAAAGCCTGTAGAACATGCMGAAAA TTCCATTCAGCCTGCnGTACAAATGGTn ACATCTAGCAACMATpCA ^ PACjgiPIP^L^G C15TTTTTCTGAGATTTTTTCACTGGAAGGGTCCCTGAAGT ACATCAAACAAAGGCAnGGGTaGGTCCGTCTGAAAGTGTGGTGTGGGGAAGCCAGTGAGCAnACTTTAAATAGGACC TCTCTGGAAAATATmGGTMTGTAATMTCCTAAMTCAMnACT CnAGAnGCTTGTA TGmGGAACnC 而 ACAAMGAATA ACATATnGAGAGAAAATATTTCAnAATGCTTAATTTCnGTATATrTAAAAATAAATATGA AAAACCCCTAAATTACAGAATTNGGNArrTGTGAAAAGNTGCACAACTATAnAnGANA CCCATTCCGTTTGnGAT CCGTmTTA AATATCCAAGTGAAGCAAAACG CTGAGAGAGCT nTACATCTATAGATATnAAGCCTATTm"AGT ATNG
オリゴヌクレオチド A(HFB341-S1 ) (配列番号: 87) CTAHCCCncCCAAAAAAGC オリゴヌクレオチド B(HFB341-S2〉 (配列番号: 88) CCCATTCCGTTTGnGATCC オリゴヌクレオチド C(HFB341-A1 ) (配列番号 :89) CGTCTCACGACACAGTGGACAAGTGG 才リゴヌクレオチド D(pCMVsp-S3) (配列番号: 90); CGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACC (共通 ) クローニングベクター pCW SP0RT2のクローニング部位上 列 （配列番号: 91 ) (下線部が 才リゴヌクレオチド D)
C∞CTGGAGACGCCATCCACGCTG CCTCCATAGAA(¾CACC∞ CGATCCAG∞TCCGGACTCTA∞CTA∞ CCGCGGAKGGATMCMmCACACAGGAAACAGCTATGACCACTAGGCTmGCAAAAAGCTAlTTAGGTGACACTAT AGAAGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCGGGTCGACCCACGCGTCCG-ィンザ一ト- オリゴヌクレオチド Α, Βはセンス鎖、 オリゴヌクレオチド Cはアンチセンス鎖と した。 厳密性を増すためオリゴヌクレオチド Αはハイブリダィゼーシヨン用、 Bは 修復用に別々に設計した。また、オリゴヌクレオチド Cはコロニーハイブリダィゼ —シヨン用およびコロニー PCR用に用いた。 また、 pCMV SP0RT2の cDNA挿入部位上 流に特異的なセンス鎖オリゴヌクレオチド Dを設計した。 オリゴヌクレオチド Dの 配列は配列番号： 90に、 オリゴヌクレオチド Dに対応する pCMV SP0RT2の cMA挿入 部位上流配列を配列番号： 91に示す。 ォリゴヌクレオチドの合成は東亜合成に依 頼した。
( 4 ) ハイブリダィゼ一シヨン用オリゴヌクレオチドのピオチン化
オリゴヌクレオチド Aにターミナル ·デォキシヌクレオチジル · トランスフェラ ーゼを用いてピオチン- 14- dCTPを 3 '末端に付加することによりピオチン標識した c ピオチン標識の有無はァクリルアミ ド電気泳動によって確認した。
( 5 ) ハイプリダイゼ一ションおよび標的 cDNAラィブラリの分離
( 2 ) で一本鎖化 cDNAライブラリと （4 ) でピオチン化したオリゴヌクレオチ ド Aをハイプリダイゼ一ションした。ハイブリダイゼ一ション溶液にストレプトァ ビジン-パラマグネティック ビーズを加え、 磁石スタンドに固定して上清を除く ことによってハイブリダィゼ一シヨンしていない cDNAを分離した。 キヅ卜に添付 の洗浄バッファーで数回洗浄した後、 溶出バッファ一でハイプリダイゼ一ション した標的 cDNAラィブラリを溶出した。
( 6 ) 二本鎖への修復およびクローン化
溶出した cDNAをオリゴヌクレオチド Bをプライマーとして dNTPsおよび修復酵素 を用いて二本鎖 cDNAライブラリに修復した。 修復した二本鎖 cDNAライブラリを ElectroMAX DHlOBTMCells (Gibco BRL社製） にエレクトロポレーシヨンした後、 寒天培地上に撒きコロニーを形成させた。 標的 cDNAの有無は、 （7 ) コロニーハ イブリダィゼーシヨンあるいは （8 ) コロニー PCRで判別した。 ( 7 ) コロニーハイブリダィゼ一シヨン
寒天培地上に形成させたコロニーをナイロンメンブレン Hybond™- N+ (Amersham Pharmacia Biotech社製） にトランスファーし、 DIGラベルしたオリゴヌクレオチ ド Cを用いてコロニーハイプリダイゼ一シヨンを行った。 ォリゴヌクレオチド の DIGラベルは DIG Oligonucleotide Tailing Kit (BOEHRINGER MANNHEIM社製) を用 い、 ハイブリダイゼ一ションは DIG Easy Hyb (BOEHRINGER MANNHEIM社製） を用い て行った。 検出は DIG Wash and Block Buffer Set (BOEHRINGER MANNHEIM社製) および DIG Nucleic Acid Detection Kit (BOEHRINGER MA丽 HE IM社製） を用いて行 つた。
( 8 ) コロニー PCR
寒天培地上に形成させたコロニーを銪型として KOD Dash (T0Y0B0社製） を用い て PCRを行った。 プライマーとしては標的 cDNAに特異的なォリゴヌクレオチド Cお よびクローニングベクタ一に特異的なオリゴヌクレオチド Dを用いた。 PCR反応液 をァガロース電気泳動しバンドの有無を確認した。
( 9 ) 塩基配列決定
( 7 ) あるいは （8 ) により目的 cDNAを有すると判別したコロニーを培養し、 プラスミ ドを抽出して塩基配列を決定した。 プラスミ ドの抽出は QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN社製）を用いた。塩基配列の決定は BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Applied Biosystems社製) あ るいは dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit
(Perkin-Elmer Applied Biosystems社製）を用いて ABI PRISM 377XL(Perkin-Elmer Applied Biosystems社製） にて行った。
単離された各クローン、 hfb030 (3092bp、 推定翻訳領域 237-1661) 、 hfb044-l
(全長 3041bp、 推定翻訳領域 48-2735) 、 hfb044-2 (全長 3060bp、 推定翻訳領域 69-2756)、 hfb060- 1、 hfb060 - 2、 hfb066 (全長が翻訳領域の一部と推定される)、 hfblOl-1 (全長 2565bp、 推定翻訳領域 474- 2120) 、 hfblOl-2 (全長 2694bp、 推定 翻訳領域 402- 2267) 、 hfb341 (全長 6193bp、 推定翻訳領域 466-3873) の塩基配列 は順に配列番号： 92〜100に示す。 また、 hfb060-lおよび hfb060- 2を除くこれらク ローンがコードするタンパク質の推定アミノ酸配列 （HFB030; 474アミノ酸、 HFB044-1 ; 895アミノ酸、 HFB044-2; 895アミノ酸、 HFB066, HFB101-1 ; 548ァミノ 酸、 HFB101-2; 621アミノ酸、 HFB341 ; 1135アミノ酸) を、 順に配列番号： 101〜 107に示す。 産業上の利用の可倉 生
本発明により、 核移行活性を有するペプチドが提供された。 本発明のペプチド は、核へ移行させたい所望の物質を核内へ輸送するための担体として有用である。 また、 適当な物質で修飾して視覚的に認識できるようすれば、 核輸送指示物質と して利用することも可能である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1から 2 1、 1 0 1から 1 0 7のいずれかに記載のアミノ酸配 列を含み、 核移行活性を有するペプチド。
2 . 配列番号： 1から 2 1、 1 0 1から 1 0 7のいずれかに記載のアミノ酸配 列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および Z若しくは付加したァ ミノ酸配列を含み、 核移行活性を有するペプチド。
3 . 核へ輸送するための所望のペプチドを含む融合ペプチドである、 請求項 1 または 2に記載のぺプチド。
4 . 請求項 1から 3のいずれかに記載のぺプチドをコ一ドする DNA。
5 . 請求項 4に記載の DNAを含むベクター。
6 . 請求項 5に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
7 . 請求項 6に記載の形質転換細胞を培養する工程を含む、 請求項 1または 2 に記載のぺプチドの製造方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2357084A (en) * 1999-12-06 2001-06-13 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd A hydrophobic carrier peptide
FR2811681A1 (fr) * 2000-07-17 2002-01-18 Commissariat Energie Atomique Procede de criblage de la translocation nucleo-cytoplasmique de proteines sous l'effet d'un stimulus, d'elements y etant impliques et kits de mise en oeuvre

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5021143B2 (ja) 2000-09-14 2012-09-05 株式会社リバース・プロテオミクス研究所 医療および他の用途に用いる化合物の発見および創製のための方法
AUPR121300A0 (en) * 2000-11-03 2000-11-30 Monash University Cell division autoantigen (CDA) polypeptides, gene sequences and uses thereof
JP2002325573A (ja) * 2001-04-27 2002-11-12 Japan Science & Technology Corp ベクター
GB0125784D0 (en) * 2001-10-26 2001-12-19 Syngenta Ltd Novel expression system

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09322779A (ja) * 1996-04-01 1997-12-16 Nippon Steel Corp Ｄｎａ結合性タンパク質のスクリーニング法およびそれに用いられるプラスミド並びにｄｎａ結合性タンパク質

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09322779A (ja) * 1996-04-01 1997-12-16 Nippon Steel Corp Ｄｎａ結合性タンパク質のスクリーニング法およびそれに用いられるプラスミド並びにｄｎａ結合性タンパク質

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK, Accession No. AA014446, 21 January 1997, MARRA M. et al., "mh09e05.rl Soares mouse placenta 4NbMP13.5 14.5 Mus musculus cDNA clone IMAGE:442016 5', mRNA sequence". *
GENBANK, Accession No. N40788, 22 January 1996, HILLIER L. et al., "yw62b06.rl Soares_placenta_8to9weeks_2NbHP8to9W Homo Sapiens cDNA clone IMAGE:256787 5', mRNA sequence". *
TAKEDA S., ET AL.: "ISOLATION AND MAPPING OF KARYOPHERIN A3 (KPNA3), A HUMAN GENE THAT IS HIGHLY HOMOLOGOUS TO GENES ENCODING XENOPUS IMPORTIN, YEAST SRP1AND HUMAN RCH1.", CYTOGENETICS AND CELL GENETICS., S. KARGER AG, CH, vol. 76., 1 January 1997 (1997-01-01), CH, pages 87 - 93., XP002922753, ISSN: 0301-0171 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2357084A (en) * 1999-12-06 2001-06-13 Amersham Pharm Biotech Uk Ltd A hydrophobic carrier peptide
FR2811681A1 (fr) * 2000-07-17 2002-01-18 Commissariat Energie Atomique Procede de criblage de la translocation nucleo-cytoplasmique de proteines sous l'effet d'un stimulus, d'elements y etant impliques et kits de mise en oeuvre

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