WO1999006050A1 - Agent reparateur contre la calvitie et autres maladies - Google Patents

Description

明細書

脱毛症等治療剤 [技術分野]

本発明は、 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の優れた治療効果あるいは前立腺癌 の骨転移の優れた予防効果を有する新規な組成物に関する。

[背景技術]

ジヒ ドロテス トステロン （D H T ) などの男性ホルモンの過剰刺激により、 ァ ンドロ デン依存性脱毛症 （男性禿頭症など）、 尋常性座瘡、 脂漏、 女性多毛症、 前立腺肥大症及び前立腺癌が引き起こされる。

このような男性ホルモンの過剰刺激による症状を治す化合物と しては、 まずス テロイ ド系抗男性ホルモン剤 （例えば、 女性ホルモン、 エス トロジェン） が発見 された。 しかし、 これらはそれ自体がホルモン活性を有しているので、 好ましく ない作用、 例えば女性化作用を有する。

一方、 非ステロイ ド系抗男性ホルモン剤も開発されている。 これらの化合物は ホルモン作用はないものの、 天然男性ホルモンと受容体で競合するので、 女性体 内の男子胎児または男性を女性化する作用、 あるいは睾丸を過剰刺激するフィ一 ドバック機構を開始する等の好ましく ない作用を有する。

そこで、 5 α還元酵素がテス トステロンに作用してジヒ ドロテス トステロン（D Η Τ ) が生成されることに鑑み、 この酵素を阻害すれば上記副作用を伴わず、 男 性ホルモンの過剰刺激による症状を治すことが期待できる。

さて、 かかる人の 5 α還元酵素には 2つのアイソザィムがある。 タイプ 1酵素 は顔および皮膚の皮脂腺に存在し、 タイプ 2酵素は前立腺に分布していることが 分かっている。

タイプ 1酵素は毛包に存在するので、 その酵素を強く阻害すれば男性禿頭症が 改善されると期待された。 しかしながら男性禿頭症のモデル動物であるサルを用 いてタイプ 1酵素選択的阻害剤である MK 3 8 6の効果を評価したが、 血中の D H T濃度は 3 0 — 4 0 %減少していたものの有効性が認められなかった （ J. Invest. Dermatol. , 104, 658 (1995) )。

一方、 タイプ 2酵素選択的阻害剤であるフィナステリ ドは、 同モデルにおける 1 m g / k g用量で血中の D H T濃度は 6 0— 7 0 %減少し、 予想に反し、 有効 性が認められた （J. Clin. Endocrinol. etabol. , 79, 991 (1994) )。

実際、 フィナステリ ドは臨床試験で人禿頭症に対する効果が確認されている。 そのメカニズムは毛包の縮小に関与している因子を阻害した結果であり、 これは 血中の D H T濃度に依存していると考えられている。 更に、 最近の臨床試験の結 果では血中の D Η Τを低下させる作用の強さは主と してタイプ 2酵素の阻害作用 の強さによるが、 タイプ 1酵素の阻害作用を併有していた方がさらに良いことが 判ってきた （J. Clin. Endocrinol. Metabol. , 81, 2942-2947 (1996) )。

同様に、 女性多毛症、 脂漏症の治療の場合も、 タイプ 2酵素の阻害作用だけで なくタイプ 1酵素の阻害作用も併有する化合物の方が優れた治療薬になると考え られる。 したがって、 より有効な脱毛症、 女性多毛症、 脂漏症の治療薬の探索を するために、 フィナステリ ドより更に強くタイプ 2酵素を阻害し、 かつタイプ 1 酵素をも強く阻害する化合物が必要とされている。

また、 前立腺にはタイプ 2酵素が分布しており、 強いタイプ 2酵素阻害作用を 持つ化合物は前立腺癌の治療に有効であるが、 前立腺癌の発達及び骨への転移の 過程では、 タイプ 1酵素が活性な酵素形であることも最近わかってきた （特開平 8— 2 7 7 2 2 0号公報）。 よって、 上記のような両タイプ阻害型化合物は、 こ れらの予防及び治療にも効果が期待される。

なお、 本発明の化合物 （ I ) は強い前立腺酵素の阻害活性を持つことが発表さ れている （特開平 5— 3 2 6 9 3号公報）。 しかしながら前立腺酵素の阻害活性 からはタイプ 2酵素の阻害作用は予想できるが、 前立腺にはタイプ 1酵素は分布 していないのでタイプ 1酵素の阻害活性は予想することはできない。

[発明の開示]

本発明者等は、 テス トステロン 5 _α還元酵素阻害活性を有する誘導体の合成と その薬理活性について永年に亘り鋭意研究を行なった結果、 特異な構造を有する 化合物が 5 α還元酵素のタイプ 2酵素を強く阻害し、 その上タイプ 1酵素をも強 く阻害するので、 既知のタイプ 2選択的 5 _α還元酵素阻害剤では得られなかった 強い血中 D H T低下作用を示すこと、 また脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の優れ た治療効果、 あるいは前立腺癌の骨転移の優れた予防効果を有することを新たに 見出し、 本発明を完成した。

本発明の目的は、 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の優れた治療効果あるいは前 立腺癌の骨転移の優れた予防効果を有する新規な組成物を提供することであり、 本発明の他の目的は、 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物ある いは前立腺癌の骨転移の予防のための組成物を製造するために上記化合物を使用 することにある。

また、 本発明の更に他の目的は、 上記化合物の薬理的な有効量を温血動物に投 与する脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療方法又は前立腺癌の骨転移の予防方 法を提供することである。

本発明の新規な脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは 前立腺癌の骨転移予防のための組成物は、 下記一般式 （ I ) で表わされる化合物、 その薬理上許容される塩又はその他の誘導体を有効成分と して含有し、好適には、 N— [ 1 —メチル _ 1 — ( 4ーメ トキシフエニル） ェチル] — 3—ォキソ— 4— ァザー 5 α —アンドロ ス トー 1 一ェン— 1 7 ;3—カルボキサミ ドを有効成分と し て含有している。

又、 本発明の新規な使用方法は、 下記一般式 （ I ) で表わされる化合物、 その 薬理上許容される塩又はその他の誘導体を脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療 のための組成物あるいは前立腺癌の骨転移の予防のための組成物を製造するため に使用することであり、 好適には、 N— [ 1—メチル一 1 一 （4 —メ トキシフエ ニル） ェチル] — 3—ォキソ一 4 —ァザ一 5 ひ 一アン ドロス ト 一 1 一ェンー 1 7 )3—カルボキサミ ドを上記の組成物を製造するために使用することである。

(式中、 R ¹ 及び R ² は、 同一又は異なって、 水素原子、 水酸基又低級アル コキシ基を示す。）

上記一般式 （ I ) において、

「低級アルコキシ基」 とは、 例えば、 メ トキシ、 エ トキシ、 n—プロポキシ、 ィ ソプロボキシ、 n —ブトキシ、 イソブトキシ、 s —ブトキシ、 t ert—ブトキシ、 n —ペントキシ、 イソペントキシ、 2—メチルブトキシ、 ネオペン トキシ、 n— へキシノレオキシ、 4 —メチルペントキシ、 3 —メチノレペン トキシ、 2 —メチルぺ ントキシ、 3 ， 3 —ジメチルブトキシ、 2 , 2—ジメチルブトキシ、 1 , 1 ージ メチルブトキシ、 1 , 2—ジメチルブトキシ、 1 , 3—ジメチルブトキシ、 2 ， 3 —ジメチルブトキシのような炭素数 1乃至 6個の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基 を示し、 好適には炭素数 1乃至 4個の直鎖又は分枝鎖アルコキシ基であり、 更に 好適には、 メ トキシ基である。

「脱毛症」 とは、 男性禿頭症及び女性の頭部の脱毛症を意味する。 W

「その薬理上許容される塩」 とは、 本発明の化合物 （ I ) は、 塩にすることが できるので、 その塩をいい、 そのような塩と しては、 好適にはナト リ ウム塩、 力 リウム塩、 リチウム塩のようなアルカリ金属塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩 のよ うなアルカ リ土類金属塩、 アルミニウム塩、 鉄塩、 亜鉛塩等の金属塩を挙げ ることができる。

又、 本発明の化合物 （ I ) は、 大気中に放置しておく ことにより、 水分を吸収 し、 吸着水が付いたり、 水和物となる場合があり、 そのような物も本発明に包含 される。

本願発明の化合物 （ I ) は、 次に示す方法によって製造することができる。

[A法]

(III)

(上記式中、 R ¹ 及び R ² は、 前述したものと同意義を示す。）

A法は、 カルボン酸とアミンを縮合させ、 目的化合物 （ I ) を製造する方法で ある。

第 A 1工程は化合物（II)又はその反応性誘導体と化合物（III) を用いて化合物 ( I ) を製造する工程で、 ペプチド合成法における常法、 例えばアジド法、 活性 エステル法、 混合酸無水物法又は縮合法によって行われる。

上記方法において、 アジド法は、 化合物（II)又はそのエステル体をヒ ドラジン と、 不活性溶剤 （例えば、 ジメチルホルムアミ ド） 中、 室温付近で反応させるこ とによって製造されるアミノ酸ヒ ドラジドを亜硝酸化合物と反応させ、 アジド化 合物に変換した後、 ァミン化合物（III) と処理することにより行われる。 使用される亜硝酸化合物と しては、 例えば亜硝酸ナトリ ウムのようなアル力リ 金属亜硝酸塩又は亜硝酸ィソアミルのような亜硝酸アルキルをあげることができ る。

反応は、 好適には不活性溶剤中で行われ、 使用される溶剤と しては、 例えばジ メチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ドのようなアミ ド類、 ジメチルスルホ キシドのようなスルホキシド類、 N—メチルピロ リ ドンのようなピロ リ ドン類を あげることができる。 又、 本方法の 2つの工程は、 通常 1つの反応液中で行われ、 反応温度は、 前段が一 5 0 °C乃至 0 °Cであり、 後段が— 1 0 °C乃至 1 0 °Cであり 又、 反応に要する時間は、 前段が 5分間乃至 1時間であり、 後段が 1 0時間乃至 5 日間である。

活性エステル法は、 化合物（Π )を活性エステル化剤と反応させ、 活性エステル を製造した後、 ァミ ン化合物（I I I ) と反応させることによって行われる。

両反応は、 好適には、 不活性溶剤中で行われ、 使用される溶剤と しては、 例え ば、 メチレンクロリ ド、 クロ口ホルムのようなハロゲン化炭化水素類、 エーテル、 テ トラヒ ドロフランのようなエーテル類、 ジメチルホルムアミ ド、 ジメチルァセ トアミ ドのようなアミ ド類、 ァセ トニ ト リルのような二 ト リル類をあげることが できる。

使用される活性エステル化剤と しては、 例えば、 N—ヒ ドロキシサクシンイミ ド、 1 ーヒ ドロキシベンゾト リァゾール、 N—ヒ ドロキシ一 5 —ノルボルネンー 2 , 3—ジカルボキシイミ ドのような N—ヒ ドロキシ化合物又はジピリジルジス ルフィ ドのようなジスルフィ ド化合物をあげることができ、 活性エステル化反応 は、 ジシクロへキシルカルポジイミ ド、 カルボニルジイ ミダゾールまたはト リ フ ェニルホスフィンのような縮合剤の存在下に好適に行われる。

反応温度は、 活性エステル化反応では、 — 1 0 °C乃至 1 0 o °cであり、 活性ェ ステル化合物とァミ ン（I I I ) との反応では室温付近であり、 反応に要する時間は 両反応ともに 3 0分乃至 8 0時間である。 活性ェステルとァミ ンの反応では、 4ージメチルァミ ノ ピリ ジン等を加えるこ とも出来る。

混合酸無水物法は、 化合物（I I)の混合酸無水物を製造した後、 ァミンと反応さ せることにより行われる。

混合酸無水物を製造する反応は、 不活性溶剤 （例えば、 前記のハロゲン化炭化 水素類、 アミ ド類、 エーテル類） 中、 混合酸無水物化剤、 例えば、 ク ロル炭酸ェ チル、 ク ロル炭酸イ ソブチルのよ うなハロゲン化炭酸低級 （C i 一 C ₄ ) アル キル、 ピバロイルクロ リ ドのよ うな低級アルカノィルハライ ド、 ジェチルシアノ リ ン酸、 ジフエ二ルシアノ リ ン酸のよ うな低級アルキル若しくはジァ リールシア ノ リン酸又は 2 ， 4 , 6 — ト リイ ソプロピルベンゼンスルホニルク ロ リ ド， ノ ラ トノレエンスルホユルクロ リ ド、 メタンスノレホニノレクロ リ ドのようなノヽロゲンィ匕ス ルホニル類等と化合物（Π)を反応させることによ り達成される。

反応は、 好適には、 トリェチルァミ ン、 N _ メ チルモルホリ ンのような有機ァ ミ ンの存在下に行われ、 反応温度は、 一 1 0 t乃至 5 0 Cであり、 反応に要する 時間は 3 0分間乃至 2 0時間である。

混合酸無水物とァミ ン（I I I) の反応は、 好適には不活性溶剤 （例えば、 前記の ハロゲン化炭化水素、 アミ ド類、 エーテル類） 中、 前記の有機ァミンの存在下に 行われ、 反応温度は 0 °C乃至 8 ◦ °Cであり、 反応に要する時間は 1時間乃至 4 8 時間である。

また、 本反応は、 混合酸無水物を単離することなく化合物（11)、 化合物（I II) 及び混合酸無水物化剤の共存下にも行われる。

縮合法は、 化合物（I I)とァミン（I I I ) をジシクロへキシルカルポジイミ ド、 力 ノレボニノレジイ ミジゾーノレ、 1 ーメチノレー 2—ク ロ口 一 ピリ ジニゥムョージ ドー ト リェチルァミンのような縮合剤の存在下、 直接反応することによって行われる。 本反応は前記の活性エステルを製造する反応と同様に行われる。

R ¹ 、 R ² に保護された水酸基が存在する場合には、 常法に従って保護基を 除去することができる。

なお、 原料化合物 （ I I ) 又はその活性エステル体は、 公知であるか公知の方 法に従って製造される

[例えば、 J. Med, Chem. , 27, 1690(1984)； J. Med. Chem. , 29, 2298(1986) ]。 又、 化合物 （ I I I ) は、 公知であるか公知の方法 （例えば、

Synthesis, 593 (】976) ;

J. Org. Chem. , 36, 305(1971)；

Angew. Chem. , 82, 138(1970)；

Synthesis, 24(1978)；

Synthetic Co画 n. , 18, 777( 1988)；

Snythetic Commun. , 18, 783(1988)；

Organic Reaction, 3, 337(1946)；

Org. Synthesis, 51, 48(1971)；

Tetrahedron, 30， 2151 (1974)；

J. Org. Chem.， 37, 188 (1972) ]

に従って製造され、 例えば、 本願発明の原料化合物である、

一般式 H N - C ( e ) (M e ) — P h ( R ¹ ) ( R ² ) を有する化合物は、

NH,

(上記式中、

R ¹ R² は、 前記と同意義を示し、

M eは、 メチル基を、 P hは、 フエ二ル基を示す。） 上式のように、 グリ二ヤール反応、 水酸基のアジド化反応、 及び還元反応により、 シンセシス（S yn t hes i s ) 、 第 2 4頁 （ 1 9 7 8年） に記載の方法に準じて製造さ れる。

本発明の化合物 （ I ) の投与形態と しては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 顆粒 剤、 散剤若しくはシロップ剤等による経口投与及びエタノール溶液、 クレンジン グフォーム、 ク レンジングク リーム、 スキンジエル、 スキンローショ ン、 シャン ブージエル、 ク リームシャンプー等による局所投与を挙げることができる。

経口投与における製剤は、 賦形剤 （例えば、 乳糖、 白糖、 葡萄糖、 マンニッ ト、 ソルビッ トのような糖誘導体： トウモロコシデンプン、 ノ レイショデンプン、 α 澱粉、 デキス ト リン、 カルボキシメチルデンプンのような澱粉誘導体 ； 結晶セル ロース、 低置換度ヒ ドロキシプロピルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルメチルセ ルロース、 カノレボキシメチルセノレロース、 カノレボキシメチルセノレロースカノレシゥ ム、 内部架橋カルボキシメチルセルロースナト リ ゥムのよ うなセルロース誘導体 ； アラビアゴム ；デキス トラン ； プルランのような有機系賦形剤 ：及び、 軽質無 水珪酸、 合成珪酸アルミニウム、 メタ珪酸アルミ ン酸マグネシウムのような珪酸 塩誘導体 ；燐酸カルシウムのような憐酸塩 ； 炭酸カルシウムのような炭酸塩 ； 硫 酸カルシウムのような硫酸塩等の無機系賦形剤を挙げることができる。）、 滑沢剤 (例えば、 ステアリン酸、 ステアリン酸カルシウム、 ステアリン酸マグネシウム のよ うなステアリン酸金属塩； タルク ； コロイ ドシリカ ； ビーガム、 ゲイ蠟のよ うなワックス類 ；硼酸 ； アジピン酸； 硫酸ナト リ ウムのよ うな硫酸塩 ； グリ コー ル ； フマル酸 ；安息香酸ナトリ ウム ； D Lロイシン ；脂肪酸ナトリ ウム塩 ； ラウ リル硫酸ナトリ ウム、 ラウリル硫酸マグネシゥムのよ うなラウリル硫酸塩 ；無水 珪酸、 珪酸水和物のような珪酸類；及び、 上記澱粉誘導体を挙げることができる。 )、 結合剤 （例えば、 ポリ ビニルピロ リ ドン、 マクロゴール、 及び、 前記賦形剤 と同様の化合物を挙げることができる。）、 崩壊剤 （例えば、 前記賦形剤と同様の 化合物、 及び、 クロスカルメ ロースナ ト リ ウム. カルボキシメチルスターチナ ト リ ウム、 架橋ポリ ビニルピロリ ドンのような化学修飾されたデンプン 'セル口一 ス類を挙げることができる。）、 安定剤 （メチルパラベン、 プロピルパラベンのよ うなパラォキシ安息香酸エステル類 ； ク口ロブタノール、 ベンジルアルコール、 フエニルエチルアルコールのようなアルコール類 ；塩化ベンザルコニゥム ； フエ ノール、 ク レゾールのよ うなフユノ一ル類 ； チメ 口サール ；デヒ ドロ酢酸；及び、 ソルビン酸を挙げることができる。）、 矯味矯臭剤 （例えば、 通常使用される、 甘 味料、 酸味料、 香料等を挙げることができる。）、 希釈剤等の添加剤を用いて周知 の方法で製造される。

局所投与における製剤は、 懸濁化剤 （例えば、 アラビアゴム、 トラガント、 メ チルセノレロース、 カルボキシメチノレセルロースナ ト リ ウム、 ヒ ドロキシェチノレセ ノレロース、 ヒ ドロキシプロ ピルセルロース、 アルギン酸ナ ト リ ウム、 ベン トナイ トを挙げることができる。）、 乳化剤 （例えば、 ト リエタノールァ ミ ン、 ラウ リ ル 硫酸ナトリ ウム、 セスキォレイ ン酸ソルビタン、 ポリ ソルベー ト 8 0、 ステアリ ン酸ポリオキシル 4 0を挙げることができる。）、 湿潤剤 （例えば、 ソルビトール、 エチレングリ コール、 プロピレングリ コール、 ブチレングリ コール、 グリセリン を挙げることができる。）、 保存剤 （例えば、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラオ キシ安息香酸ェチル、 パラォキシ安息香酸プロピル、 パラォキシ安息香酸ブチル を挙げることができる。）、 溶剤 （例えば、 水 ： エタノール、 イソプロピルアルコ ール、 プロピレングリ コーノレ、 セタノ一ル、 イ ソステア リ ノレアノレコ一ノレのような アルコール類 ； 天然油脂、 ロウ類、 流動パラフィ ンのような炭化水素類 ； ステア リン酸、 イソステアリン酸、 ォレイン酸、 リ ノール酸のよ うな脂肪酸類 ： ミ リ ス チン酸イソプロ ピルのようなエステル類を挙げることができる。） 等の当業界で よく知られた様々な基剤又はそれらの混合基剤に、 例示した化合物等を添加する ことにより製造される。

経口投与及び局所投与における化合物 （ I ) の使用量は、 症状、 年齢等により 異なるが、 例えば、 1 回当り、 下限と して、 0 . 0 0 1 m g/kg 体重 （好ましくは、 0. 0 1 mg/kg 体重） 、 上限と して、 1 0 mg/kg 体重 （好ましくは、 0. 5 mg/k 体重） を 1 日当り 1乃至数回症状に応じて投与することが望ましい。

[発明を実施するための最良の形態]

以下に、 試験例、 参考例及び製剤例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明する。

[試験例 1 ]

5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2阻害活性試験法

( 1 ) 組換えヒ ト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の作製

a ) ヒ ト 5 ひ還元酵素タイプ 1およびタイプ 2 cDNAのクローニング

ヒ ト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の全翻訳領域をポリメラーゼ連鎖反 応（PCR) 法によりクローニングするために、既報（Stefan. A et al： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3640-3644(1990)、 Stefan. A et al: Nature, 354, 159- 161(1991) 参照） のヒ ト 5 α還元酵素タイプ 1およびタイプ 2の塩基配列を基に、 配列番号 1 、 2および 3、 4に示すプライマーをオリ ゴ 1000DNA シンセサイザ 一（Oligo 1000 DNA synthesizer ：ベックマン社製 （BECKMAN Co. , Lfd. ) ) を 用いて合成した。 タイプ 1 センス . プライマ一 ： 5' -CCAGCCCTGGCGATGGCAAC- 3' (配列番号 1 ) タイプ 1 アンチセンス · プライマー ： 5' CAGAGCTTGAAATTCTGACCTGTTA- 3' (酉己歹 ij 番号 2)

タイプ 2 センス . プライマー ： 5' - ACGGCGCGATGCAGGTTCAGTG- 3' (配列番号 3 ) タイプ 2 アンチセンス · プライマ一 ： 5' - AGCATTGTGGGAGCTCTGCTCCT-3' (配列番 号 4)

PCR 法の铸型と しては Human Liver QUICK-Clone™ cDNA および Human Prost ate QUICK-Clone™ cDNA (ク ロンテック社製 ： CL0NTECH し aboratories, Inc.

) を用いた。 cDNA を 1 μ ΐ 、 付属の PCR 緩衝液を 5 μ ΐ 、 10 mM dNTP 混合液 を 1 μ ΐ 、 上記センスおょぴアンチセンス · プライマ一各 20μΜ を 1 μ 1 、 Ta KaRa Taq polymerase 5 単位/ ml を 1 μ ΐ 、 蒸留水を 40 μ 1 用レ、、 反応用量を 50 μ 1 と して、 PCR を行った。 PCR の条件は 94°C、 20 秒間、 55°C、 1 分間、 72 °C、 1 分間の反応を 25 回繰り返し行い、 最後に 4 °Cで保存した。 PCR 反応液約 5 μ 1 について 0.8 %ァガロースゲル電気泳動を行ったところ、 上記文献から 予測される大きさ （タイプ 1 ： 1021bp、 タイプ 2 _: 812bp ) に相当するバンドが 確認されたので、 残りの PCR 反応液について 5 <½ポリアク リルアミ ドゲル電気 泳動を行い、 分離精製した。 精製した cDNA 断片を TA Cloning™ Kit( インビ トロジェン社製 ： Invitrogen Corporation) を用いてサブクローニングした。 サ ブクローニングしたタイプ 1およびタイプ 2 cDNA について、 全塩基配列の解析 をダイ ターミネータ一（dye terminator)法で行い、 既報の配列と同じであるこ とを確認した。 塩基配列を確認したタイプ 1およびタイプ 2 cDNA は発現べクタ 一に組み込んで発現させ使用した。

b ) ヒ トタイプ 1およびタイプ 2発現プラスミ ドの調製

大腸菌 DH5 株 （supE44, hsdR17, recAl, endAl, gyrA96, thi-1, relAl) (購 入先 ： 東洋紡績株式会社） を ヒ トタイプ 1 またはタイプ 2発現プラス ミ ド、 p E18sH5Rl または pME18sH5R2、 を用いて TA Cloning™ Kit 添付文書の方法で 形質転換した。 形質転換株の一次培養液約 ΙΟμ Ι を 50/ig/mlのアンピシリン （ギ ブコ社製 ： GIBC0 BRL ) を含む 2 Xし B 培地 （20g Bacto-Tr yptone ( ディフコ社 製 ： DIFC0 Labs. ), 10g Bacto- Yeast Extract (ディフコ社製 ： DIFC0 Labs. ) , 10g 塩化ナトリ ウム， 2g グルコース /1 し） 50ml に植菌し、 37 で約 40 時間培養し た。 培養液を遠心分離（5000rpm 、 10 分間） し、 菌体を回収した。 回収した菌体 から QIAGEN Plasmid Maxi Kit (キアジユ ン社製 ： QIAGEN Inc. )を用いて、 _PME18sH5Rl または pME18sH5R2を調製した。

c ) ヒ トタイプ 1およびタイプ 2蛋白質の発現と調製

10乃至 20 μ g の pME18sH5Rl または _PME18sH5R2を 2 X 10⁶個 /0.5 ml の COS- 1 細胞に、 エレク トロポレーシヨ ン法 （Gene Pulser™ ： バイオ ' ラッ ド社製 (Bio-Rad Laboratories) , 960 μ F 、 200 Ω、 300 V ) により導入した。 導入 後、約 48時間培養し細胞を回収した。 回収した細胞は氷冷下のバッファー （20 mM リン酸カリ ウム緩衝液、 pH 7.4、 10% グリセロール、 0.33M ショ糖、 50μΜ ニコ チンァミ ドアデニンジヌク レオチドフォスフエ一ト還元体（NADPH) 、 0.001 % フ ェ ニルメ チルスノレホニルフノレオリ ド （PMSF) ) 中でポリ ト ロ ン （ P0LYTR0N、 KINEMATICA GmbH ) でホモゲナイズ （1000 rpni、 30秒間） し、 遠心分離 （10000 X g、 1 時間） 後、 沈渣を再び、 ノ ッファーに懸濁し、 - 80 Cに保存した。 これを、 ヒ ト 5 α還元酵素タイプ 1またはタイプ 2 と して使用した。

(2) 蛋白質量の測定

蛋白質量は Bradford 法 （Bio - Rad, Bio-Rad Protein Assay) にて測定した。 標準品と してゥシ ガンマグロブリン （Sigma, bovine cohn fraction II) を使 用した。

(3) 5 α還元酵素活性の測定

5 α還元酵素活性は ^{1 4} Cテス トステロン （Amersham) から ^{1 4} C 5 ひジヒ ドロ テス トステロンへの変換率を指標と して測定した。 化合物はジメチルスルホキシ ド （DMS0) を用いて溶解および希釈し、 試験管当り 5 μ 1 分注した。 なお、 対照 群には DMS0のみを 5 μ 1 分注した。 これにリ コンビナン トヒ ト 5 α還元酵素タイ プ 1またはタイプ 2を 10〜25μ g 含む酵素反応緩衝液 （タイプ 1 ; 1μΜ^{1 4} 。 テス トステロン、 ImMジチオス レイ ト一ル及び 0.5mM NADPHを含む 40mMリン酸力 リ ウム緩衝液 （pH 7.5) 、 タイプ 2 ； 1μΜ ^{1 4} 〇テス トステロ ン、 ImMジチォ スレイ ト一ル及び ImM NADPHを含む 100mM トリスークェン酸緩衝液 （pH 5.5) ) 0.5ml を加え、 37°Cで 15分間イ ンキュベーショ ン した。 イ ンキュベーショ ン終了 後、 酢酸ェチル 2 ml (テス トステロ ン、 5 α—ジヒ ドロテス トステロ ン、 アン ド ロステンジオン各々 10μ₈ 含む） を加えてよく攪拌し、 酵素反応を停止すると と もにステロイ ド化合物を酢酸ェチル相に抽出した。 その後、 遠心分離 （3000rpm, 5分間） し酢酸ェチル相と水相を分離し、 酢酸ェチル相を別の試験管に移し窒素 ガス噴霧下で蒸発乾固した。 試験管壁をジェチルェ—テル 0.8ml で洗浄しステロ イ ド化合物を試験管底に洗い落とし、 再び蒸発乾固後、 酢酸ェチル 40μ1 中にス テロイ ド化合物を溶解し、 薄層クロマ トプレー ト （Whatman, LK6DF silica plate ) にスポッ トした。 薄層ク口マ トプレー トを酢酸ェチル： シクロへキサン （ 1 ： 1 ) 混合液にて 2度展開し、 各ステロイ ド分画を分離した。 薄層クロマ トプレー ト上 に分離された各ステロイ ド分画の放射活性はバイオイメージアナライザー （富士 写真フィルム （株）） を用いて測定した。 なお、 酵素阻害作用は 5 0 %阻害濃度

( I C ₅。） で示した。

I C ₅。値の算出は以下のように行った。 まず対照群の変換率を 100 %と し、 酵素活性抑制率 （100 — （検体添加時の変換率 ÷対照群の変換率） X100 ) (%) を求めた。 化合物の希釈列を作成し、 各濃度における抑制率を上記の方法により 計算した。 抑制率が、 約 2 0 <½から約 8 0 %の範囲となった希釈濃度を用いて、 化合物の濃度の 1 o g値を Xと し、 抑制率を Yと して最小二乗法により回帰曲線 を計算した。 得られた回帰曲線から、 5 0 °/。抑制率となる化合物濃度を算出し、

I C ₅。値とした。

表 1にタイプ 1の I C₅。値を、 表 2にタイプ 2の I C ₅。値を示す。

[表 1 ] (タイプ 1 ) 化合物 I C 化合物 I 4. 9 X 1 0 " ⁸ M

フィナステリ ド 7. 0 X 1 0 - ⁷M [表 2] (タイプ 2) 化合物 I C 化合物 I 3. 2 X

フィナステリ ド 1. 5 x 1 0 M

[試験例 2 ]

ヒ トにおける血中ジヒ ドロテス トステロン低下作用

ヒ 卜に 1乃至 1 0 mg/body の化合物 I 又は 5 mg/body のフィナステリ ドを経口 投与し、 血中のジヒ ドロテス トステロン （DHT) 濃度及びテス トステロン （T) 濃度を測定した。 投与前（pre) 及び経過時間後のそれらの比（DHT/T) を計算し、 (DHT7T)バ DHTVT)preを求め、 表 3に示した。 （人数 _n = 4〜 6)

[表 3 ]

0時間後 1 8時間後 化合物 I (lmg) 0.518 0.525

化合物 I (5mg) 0.411 0.376

化合物 I (10mg) 0.279 0.284

フィナステ リ ド（5rag) 0.553 0.461 [試験例 3 ]

ヒ ト毛乳頭細胞を用いた試験

毛乳頭は毛包の中の小数の細胞塊であり、 現在、 毛の成長の基部を形成する幹 細胞と考えられている。この細胞は 5 α還元酵素活性を持つことが示されている。 そこでこの細胞の培養系を用いて 5 α還元酵素阻害剤の試験を行なうことが可能 である。 毛乳頭細胞の単離及び培養は Messenger, A. G. (The Culture of Dermal Papilla Cells From Human Hair Follicles, Br. J. Dermatol. , 110:685-989, 1984) と Itami, S. ら (5a— Reductase Activity In Cultured human Dermal Papilla Cells From Beard Compared With Reticular Dermal Fibroblasts, J. Invest. Dermatol. , 94: 150-152, 1990) の方法に従い行なう。 髭毛乳頭細胞と二人の後 頭部毛根を実験に使用する。 すべての実験は 4から 6代のサブカルチヤ一後、 コ ンフルェン 卜の状態で行なう。 コンフルェン 卜になった細胞はリン酸緩衝食塩水 (PBS) にて二回洗浄後、 ラバ一ポリスマンで剥離し、 遠心チューブに回収する。 細胞は 4 °Cにて 1500 rpm、 1 0分間遠心分離する。 ペレツ トを緩衝液 （ 250 mMシ ョ糖， 1 mM 塩化マグネシウム及び 2 mM 塩化カルシウムを含む 20 mM トリス塩 酸緩衝液（pH 7.5)) に懸濁し、 25G の針を 1 0回通過させる。 さらに、 テフロン 一ガラスホモゲナイザーを用いてホモゲナイズし、 これを細胞破砕液とする。 5 α還元酵素の細胞内局在を調べるために、 細胞破砕液を 800 Xg にて 1 0分間遠 心分離し、 粗核分画を得る。 上清は 10，000Xg にて 1 5分間遠心分離し、 ミ ト コンドリア分画を得る。 この上清をさらに 100， OOOXgにて 6 0分間遠心分離し、 ミクロソーム分画とサイ トゾ一ル分圃を得る。 それぞれの沈渣部分は 2回洗浄し た後、 再懸濁する。

通常のィンキュベ一ショ ン条件は 50 nM [³H]—テス トステロン及び 1 mM NADPH を含む 100 mM クェン酸ナ トリ ウム（pH 5.5)又は 100 mM トリス—塩酸（pH 7. δ) に 50 ml の細胞破砕液を加えて、 100 ml とする。 各チューブには蛋白質量で 50 〜100 mg相当の細胞破砕液を加える。 反応は 37 Cにて 30分間行なう。 インキュ ベーションの間、反応は時間に比例して進行する。反応至適 pHの検討には、 pH 4.5 から 6.5 はクェン酸緩衝液を、 pH 7.0から 9.0 はトリスー塩酸緩衝液を用いる。 蛋白質量の測定は Lowry らの方法 （Protein Measurement With The Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem. , 193:265 - 275， 1951) により行なう。

インキュべ一シヨ ン終了後、 キャ リア一ステロイ ドをそれぞれ 110 mg 含んだ 4倍量のクロ口ホルム一メタノール （2/l:V/V ) を加えて反応を停止させる。 抽 出したステロイ it Gomez らの方法 (In Vitro Metabolism Of Testosterone-4-¹⁴C and D - androstene 3, 17 - dione - 4- "C In Human Skin, Biochem. , 7:24-32, 1968) に従い薄層クロマ トグラフィ一にて解析する。 それぞれのステロイ ドの純度は再 結晶法にて確認する。 5 _α還元酵素活性は生成されたジヒ ドロテス トステロンで 示す。 なお、 酵素阻害作用は対照群の変換率を 100 %と し、 阻害率 （100 — （検 体添加時の変換率 ÷対照群の変換率） X 100 ) (%) と して示す。

化合物 （ I ) は良好な 5 _α還元酵素阻害作用を示す。

[試験例 4 ]

ベニガオザル抜け毛予防と発毛促進作用 （ D

ベニガオザルはヒ 卜の男性型脱毛症に似たパターンで禿頭症になる。 この禿頭 のプロセスは思春期直後に始まる （年齢約 4才）。 これは雌雄両性のベニガオザ ルのほとんど 1 0 0 %に起こり、 しかもアンドロゲン依存性である。 従って、 ヒ トの男性型脱毛症の有用な動物モデルである。

雄のベニガオザル （年齢 3— 1 6才） を一群 3— 6匹ずつにわける。 頭皮の前 頭部と後頭部のうち、 一つの領域の境界を明確に定めて、 例えば入れ墨でマーク し、 マーク した領域の毛髪を剃り落とす。 実験薬剤は各種の用量と各種の組み合 わせにより溶液又は粉末を調製し、 1 日 1回又は 2回、 剃り落と した領域に均等 に塗布又は経口投与する。 対照動物には同量の溶媒 （例えばジメチルスルホキシ ドなど） 又はク リーム （皮膚投与） 或はプラセボ （経口投与） を投与する。 この マーク した領域は 4一 6週間毎に剃り落と し、 剃った毛髪の重量を計量する。 投 与期間は 6週間乃至 2年間である。 フィナステリ ドは 5 _α—レダクタ一ゼ阻害剤 であり、 この動物の禿頭を防止することで知られている。 フィナステリ ド （経口） を対照薬として実験に使用する。

頭皮の生検材料 （4 m mのパンチ） は治療開始時と終了時に採取する。 標本に より 5 _α _レダクターゼ活性を分析し、 組織検査を行なって脱毛症の有無を判定 する。

化合物 （ I ) は脱毛症に対して有効である。

[試験例 5 ]

ベニガオザル抜け毛予防と発毛促進作用 （ 2 )

雌雄のベニガオザル （年齢 3— 1 6才） を一群 3 - 6匹ずつにわける。 実験薬 剤は各種の用量と各種の組み合わせにより溶液または粉末を調製し、 1 日 1回前 頭部皮膚に塗布又は経口投与する。 投与期間は 6週間乃至 2年間である。 対照群 の動物には同量の溶媒 （例えばジメチルスルホキシドなど） またはク リーム （皮 膚投与） 或いはプラセボ （経口投与） を投与する。 1 ヶ月毎に前頭部の毛の状態 を観察し、 毛の太さ、 密度、 発毛領域、 発毛時期から実験薬剤の効果についての 評価すると同時に写真を撮影し写真による全体的な判定も行なう。 実験開始前、 3ヶ月 目及び 6ヶ月 目の時点で前頭部皮膚の一部をバイォプシ一により採取 （直 径 4 m mの円形） し、 組織学的検索により毛根部の発育ステージに対する効果に ついて検討する。

化合物 （ I ) は脱毛症に対して有効である。

[試験例 6 ]

ファジーラッ トを用いた試験

ファジーラッ トはアンドロゲン依存性で毛根部皮脂腺細胞の増殖および分泌能 が異常に亢進するモデル動物である。 また幼若期 （4週齢前後） の毛根は成長期 が主体であるが、 性成熟後 （ 8週齢前後） には休止期の毛根が増加する。 このた め毛の発育に及ぼす影響について検討するためのモデル動物と して用いられてい る。

ファジーラッ ト （雄、 3— 1 2週齢） を一群 5から 6匹ずつに分ける。 実験薬 剤は各種の用量と各種の組み合わせにより溶液又は粉末を調製し、 1 日 1回背部 皮膚に塗布又は経口投与する。 投与期間は 4乃至 8週間である。 対照群の動物に は同量の溶媒 （例えばジメチルスルホキシドなど） 又はク リーム （皮膚投与） 或 いはプラセボ （経口投与） を投与する。 投与終了翌日に断頭屠殺後、 背部皮膚組 織を採取 （直径 4 mmの円形） し、 組織学的検索により皮脂腺及び毛根部発育ス テ一ジに対する効果について検討する。

化合物 （ I ) は脂漏症及び脱毛症に対して有効である。 なお、 上記試験例の他に、 文献 （B de Brouwer et al, Br. J. Dermatol. , 137, 699- 702 (1997))記載の方法に従って、 ヌードマウスを用いて育毛を評価すること もできる。

[参考例 1 ]

- [ 1 —メチル一 1 一 （ 4ーメ トキシフエ二ル) ェチル] — 3—ォ_キソー 4 —ァザ一 5 α—アン ドロス ト— 1 一ェン— 1 7 /3—カルボキサミ ド

乾燥した トルエン 3 0 ml に 3—ォキソ一 4一ァザー 5 α—アン ドロス トー 1 一ェン— 1 7 ;3—カルボン酸 l.Og 、 ト リフエニルホスフィン 1.6g及ぴ 2 , 2 ' ージピリジルジスルフィ ド 1.4g を順次加え、 室温で一夜撹拌放置した。 反応液 をそのまま 3 5 gのシリカゲルを用いたカラムクロマ トグラフィ一に付し、 ァセ トン一塩化メチレン （ 1 ： 9力 ら 1 ： 1 ) で溶出して 2—ピリジルチオエステル 体 l. llg を得た。 乾燥した塩化メチレン 3 0 ml に同様に合成した 2—ピリジル チォエステル体 5.0g 及び 1 — ( 4ーメ トキシフエ二ル） — 1 —メチルェチルァ ミ ン 5.0_gを順次加え、 室温で 3 日間撹拌放置した。 反応液を塩化メチレン 100ml で希釈して、 1 N—塩酸、 水、 重曹水及び飽和食塩水で順次洗浄し、 硫酸マグネ シゥムで乾燥後、 減圧濃縮した。 残渣を 1 5 gのシリカゲルを用いたカラムクロ マ トグラフィ一に付し、 アセ トン—塩化メチレン （ 1 ： 9から 1 ： 1 ) で溶出し て、 目的化合物 5.2gを得た。

NMRスペク トル （CDCl₃) 5ppm ： 0.68 (3H s) , 0.98 (3H, s) , 0.90 - 2.20 ( 16H, m) , 1.70(3H, s), 1.72(3H, s), 3.35 ( 1H, t, J=9Hz) , 3.80(3H, s), 5.48 ( 1H br. ) , 5.76 (1H, br. ), 5.83(1H, d, J=10Hz), 6.82 ( 1H, d， J= 10Hz) , 6.88(2H, d, J=9Hz), 7.32 (2H, d, J=9Hz)

I Rスぺク トル v cm—¹ (KBr) ： 2969, 2938, 1672, 1599, 1514, 1455, 1248, 1181, 1035, 825

[製剤例 1 ]

錠剤

、 5 mg飽) ロロ名 基本処方（mg/錠 ） 参考例 1の化合物 5

ヒ ドロキシプロ ピルメチノレセノレ口一ス 15

カルボキシメチルスタ一チナト リ ウム 9.5

結晶セルロース 30.5

クロス力ノレメロースナトリ ゥム 20

乳糖 （篩過） 38.75

黄色三二酸化鉄 0.05

ステアリン酸マグネシウム （篩過） 1.2

錠剤 120.0 [製剤例 2 ]

アルコール溶液

参考例 1 の化合物 1 5. 0 (重量％) 水 4 5

エタノーノレ 4 0

[製剤例 3]

ク レンジングフォーム

参考例 1 の化合物 1 0. 0 0 (重量％) 水 7 0. 4 3 9

カモミール 0. 0 1

アロエ ベラ シェノレ 0. 0 1

アラン トイン 0. 0 0 1

ト リエタ ノールアミ ン 0. 0 2

メ トセル （METH0CEい ^M 40-100(Dow)) 1. 5 0

グリセリ ン 3. 0 0

ラウリル硫酸ナト リ ウム 1 5. 0 0

ビタミ ン Aオイル 0. 0 1

ビタミ ン Eオイル 0. 0 1

[製剤例 4]

ク レンジングク リーム

参考例 1の化合物 5 · 0 (重量％) 合成ミツロウ 1 4. 0

P P G - ミ リスチルプロピオネー ト 5. 0

ラノ リ ンアルコール 0. 5

ミネラルオイル 3 6. 0

プロピルパラベン 0. 1 5

ホウ砂 1 . 0

水 3 8. 3 5

P P G ： ポリエチレングリ コ一ル ポリプロ ピレングリ コール

[製剤例 5]

スキンジエル

参考例 1 の化合物 2. 0 0 (重量％)

P P G . ミ リスチルエーテルプロ ピオネー ト 4 5. 0 0

P P G . セチノレエーテノレ 5. 0 0 c i _s— c ₃₆ ト リ グリセリ ド 4. 0 0 ミ リスチルミ リステー ト 3. 0 0 グリセリ ノレト リベべネー ト 2. 0 0 シクロメチコン 3 4. 0 0 ポリエチレン 5. 0 0 [製剤例 6 ]

スキン口一、ンョ ン 参考例 1 の化合物 1 . 0 (重量％) ジエタノールアミンォレス 3 リ ン酸 1 . 0

孔ィヒワックス 2 . 0

C , 一 ヮックス脂肪酸 1 . 0

P P G , ミ リスチルプロピオネー ト 5 . 0 グリセリ ン 3 . 0

ト リエタノールアミ ン 0 . 5 水 8 6 . 5

[製剤例 7 ]

シャンプ一ジェル

参考例 1 の化合物 2 . 0 (重量％) ィ ソプロパノ一ルァミ ンラウ リル硫酸 8 1 . 5 ヤシ油脂肪酸ジエタノ ールアミ ド 8 . 0 c _ε— C ₃ . ワックス酸グリセ リルエステル 4 . 5

P P G ₅ セテス 1 0 リ ン酸 4 . 0

[製剤例 8 ]

ク リ一ムシャンプ一 _ 参考例 1 の化合物 0 . 1 (重量％) ラウ リル硫酸ナ ト リ ウム 6 5 . 0 グリセリノレト リベべネー ト 2 . 0 ヒ ドロライズドコラーゲン 1 . 0 ラウ リ ン酸ジエタノールァミ ド 5 . 0 [産業上の利用可能性]

フィナステリ ドは良性前立腺肥大症の治療薬と して欧米で発売され、 現在脱毛 症治療薬と して臨床試験が実施されている化合物である。

本発明の化合物 （ I ) 及び関連化合物は、 フィナステリ ドより強いタイプ 2ァ イソザィム阻害作用を持ち、 加えて、 タイプ 1アイソザィム阻害作用も強い。 そ のためフィナステリ ドより遥かに強力な血中の D H T低下作用を有し、 且つ、 毒 性も少ないので、 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物、 あるい は前立腺癌の骨転移予防のための組成物と して有用である。

[配列表フ リ一テキス ト]

[配列番号 1 ]

合成配列の説明 ： 5 α還元酵素タイプ 1 をコー ドする c DN Α配列に基づいて設 計されたプライマー

[配列番号 2 ]

合成配列の説明 ： 5 α還元酵素タイプ 1 をコー ドする c D Ν Α配列に基づいて設 計されたプライマー

[配列番号 3]

合成配列の説明 ： 5 _α還元酵素タイプ 2をコー ドする c D N A配列に基づいて設 計されたプライマー

[配列番号 4 ]

合成配列の説明 ： 5 ひ還元酵素タイプ 2をコー ドする c DN A配列に基づいて設 計されたプライマ一

Claims

請求の範囲

1. 下記一般式 （ I ) で表わされる化合物、 その薬理上許容される塩又はその 他の誘導体を有効成分と して含有する脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のた めの組成物、 あるいは前立腺癌の骨転移予防のための組成物。

(式中、 R ¹ 及び R ² は、 同一又は異なって、 水素原子、 水酸基又は低級ァ ルコキシ基を示す。）

2. N - [ 1 一メチル一 1 — (4ーメ トキシフエニル） ェチル] 一 3—ォキソ 一 4一ァザー 5 α—アン ドロス ト一 1 一ェン— 1 7 —カルボキサミ ドを有効成 分と して含有する脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物、 あるい は前立腺癌の骨転移予防のための組成物。

3. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治 療のための組成物。

4. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脱毛症の治療のための組成物。

5. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の女性多毛症の治療のための組成物。

6. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の脂漏症の治療のための組成物。

7. 請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の前立腺癌の骨転移予防のための組成 物。

8. 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の 骨転移予防のための組成物を製造するための、 下記一般式 （ I ) で表わされる化 合物、 その薬理上許容される塩又はその他の誘導体の使用。

(式中、 R ¹ 及び R ² は、 同一又は異なって、 水素原子、 水酸基又は低級ァ ルコキシ基を示す。）

9. 脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の治療のための組成物あるいは前立腺癌の 骨転移予防のための組成物を製造するための、 N— [ 1 ーメチルー 1 一 （ 4ーメ トキシフエニル） ェチル] 一 3—ォキソ一 4ーァザ— 5 ct—アン ドロス ト一 1 一 ェンー 1 7 )3—カルボキサミ ドの使用。

1 0. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脱毛症、 女性多毛症又は脂漏症の 治療のための組成物を製造するための使用。

1 1 . 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脱毛症の治療のための組成物を製 造するための使用。

1 2. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の女性多毛症の治療のための組成物 を製造するための使用。

1 3. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の脂漏症の治療のための組成物を製 造するための使用。

1 4. 請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の前立腺癌の骨転移予防のための組 成物を製造するための使用。