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WO1995006114A1 - Allele de phosphenolpyruvate carboxylase, gene de cet allele et procede de production de l'acide amine - Google Patents

Allele de phosphenolpyruvate carboxylase, gene de cet allele et procede de production de l'acide amine Download PDF

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WO1995006114A1
WO1995006114A1 PCT/JP1994/001365 JP9401365W WO9506114A1 WO 1995006114 A1 WO1995006114 A1 WO 1995006114A1 JP 9401365 W JP9401365 W JP 9401365W WO 9506114 A1 WO9506114 A1 WO 9506114A1
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WO
WIPO (PCT)
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leu
ala
glu
val
carboxylase
Prior art date
Application number
PCT/JP1994/001365
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masakazu Sugimoto
Tomoko Suzuki
Hiroshi Matsui
Katsura Izui
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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Filing date
Publication date
Family has litigation
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Priority to RU96107112A priority patent/RU2133772C1/ru
Priority to US08/596,366 priority patent/US5876983A/en
Priority to SK204-96A priority patent/SK283369B6/sk
Priority to BR9407625A priority patent/BR9407625A/pt
Priority to KR1019960700741A priority patent/KR100337959B1/ko
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Priority to HU9600240A priority patent/HU219600B/hu
Priority to PL94313119A priority patent/PL181380B1/pl
Priority to AU80991/94A priority patent/AU682547B2/en
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Priority to AT94924384T priority patent/ATE220099T1/de
Publication of WO1995006114A1 publication Critical patent/WO1995006114A1/ja
Priority to KR1019960700074A priority patent/KR960704029A/ko

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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    • C12N9/88—Lyases (4.)
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine

Definitions

  • the present invention relates to a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, a method for producing a gene and an amino acid encoding the same, and more particularly, to a method for releasing a mutation that releases the feedback inhibition by aspartic acid.
  • the present invention relates to a gene and its use.
  • BACKGROUND ART Phosphoenorubyruvate carboxylase is an enzyme found in most bacteria and all plants. The role of this enzyme is to biosynthesize aspartic acid and glutamic acid, and to supply C4 dicarboxylic acid to maintain rotation during the citric acid cycle.
  • amino acids are compounds that are universally present in cells as a component of protein, but their production is strictly controlled due to economical energy metabolism and substance metabolism.
  • This regulation is mainly feedback regulation, that is, regulation of products downstream of the metabolic pathway by inhibiting the activity of an enzyme that catalyzes an upstream reaction.
  • Phosphoenolpyruvate carboxylase is also subject to various regulation of activity expression. ing.
  • phosphoenolpyruvate carboxylase of the genus Escherichia or Corynebacterium belongs to asparagine.
  • the activity is inhibited by the acid.
  • the ppc gene which encodes phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli, has been cloned and its nucleotide sequence has been determined (Fujita, N. , Miwa, T., Ishijima, S., Izui, L and Katsuki H. L Biochem. 95, 909-916 (1984)) What,
  • the present invention has been made in view of the above, and an object of the present invention is to provide a phosphoenol pyruvate carboxylase substantially free of feedback inhibition by aspartic acid, a gene thereof, and a method of using the same.
  • DISCLOSURE OF THE INVENTION As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that aspartic acid is substituted by substituting an amino acid at a specific site of phosphenol pyruvate carboxylase of E. coli with another amino acid. The inventors have found that the inhibition caused by the enzyme is substantially released, succeeded in obtaining a gene encoding such a mutant enzyme, and completed the present invention.
  • the present invention provides a mutant phosphoenolpyruvyl carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia, wherein the phosphoenolpyruvyl carboxylase has a mutation that releases feedback inhibition of aspartate by phosphoenol pyruvate carboxylase.
  • 2 is a DNA sequence encoding acid carboxylase and the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
  • the present invention further provides a microorganism belonging to the genus Escherichia or Coryneform that retains the DNA fragment, and culturing any of these microorganisms in a suitable medium, and culturing L-lysine, L-threonine, or L-methionine from the medium.
  • a method for producing an amino acid comprising separating an amino acid selected from L-isoleucine, L-glutamic acid, L-arginine and L-proline.
  • a DNA sequence encoding a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase or a DNA sequence containing a promoter is simply referred to as a “DNA sequence of the present invention”, a “mutant gene” or a phosphoenol pyruvate.
  • a “mutant gene” or a phosphoenol pyruvate is sometimes referred to as the ruboxylase gene.
  • mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention (hereinafter, also simply referred to as “mutant enzyme”) is a phosphoenol pyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia, and is derived from phosphoenol pyruvate carboxylase by aspartic acid. It has a mutation that releases feedback inhibition. Such a mutation may be any mutation that substantially releases the above-mentioned feedback inhibition without losing the enzyme activity of phosphoenolpyruvate carboxylase.
  • mutations that confer resistance to the compounds having the following properties on the cells are included;
  • the growth inhibitory effect is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid.
  • the phosphoaminopyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia is an amino acid sequence deduced from the phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, L and Katsuki HJ Biochem. 95, 909-916 (1984)) are shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
  • the entire nucleotide sequence of plasmid pT2 including the phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli is shown in SEQ ID NO: 1 together with the amino acid sequence.
  • the mutant enzyme is encoded by the following DNA sequence of the present invention, and is produced by expressing this DNA sequence in E. coli or the like.
  • the DNA sequence of the present invention is a DNA sequence encoding the above-mentioned mutant enzyme, and in a DNA fragment encoding phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia, feedback of phosphoenolpyruvate carboxylase by aspartic acid. It has a mutation in the coding region that releases inhibition.
  • a DNA sequence encoding a phosphoenolpyruvate carboxylase having the above-mentioned mutations (1) to (4) for example, in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, i) GAA of nucleotide numbers 2109 to 2111 is AAA or Mutation to convert to AAG,
  • AAA with base numbers 2094-2096 is TCT, TCC, TCA, TCG,
  • Such a mutant gene, L which is a wild-type enzyme gene, is a recombinant DNA obtained by ligating a phosphenol pyruvate carboxylase gene having another mutation with a vector DNA compatible with the host. It is obtained by mutagenizing and screening from transformants with this recombinant DNA.
  • a microorganism that produces a wild-type enzyme may be subjected to mutation treatment to create a mutant strain that produces the mutant enzyme, and then a mutant gene may be screened from the mutant strain. Hydroxynoreamine or the like is used for the mutation treatment of the recombinant DNA.
  • a drug or a method usually used for artificial mutation may be used.
  • the above mutant gene was obtained by the Overlapping Extension method (Ho., SN, Hunt, HD, Horton, R, M., Pullen, J. L and Pease, LR, Gene, 77, 51-59 (1989)) Specific mutation method (Kramer, W. and Frits, HJ, Meth. In Enzymol., 154, 350 (1987);
  • the wild-type enzyme gene or the phosphoenol pyruvate carboxylase gene having other mutations used for mutagenesis may be any gene that encodes phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia. Is preferably determined and cloned. If the DNA has not been cloned, the DNA fragment containing the gene can be amplified and isolated using the PCR method or the like, and then cloned using an appropriate vector. Examples of such genes include, for example, Escherichia coli genes (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki HJ Biochem.
  • Screening of a host having a mutant gene can be performed using an analog compound of aspartic acid.
  • the analog compound preferably has the following properties. That is, it exhibits a growth inhibitory effect on a microorganism belonging to the genus Escherichia that produces wild-type phosphoenol pyruvate carboxylase, the growth inhibitory effect is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid, and Inhibits monorubic acid carboxylase activity.
  • An analog compound as described above is selected as a marker for the growth of a microorganism belonging to the genus Escherichia X which produces a wild-type enzyme, for example, Escherichia coli HB101, and a mutant strain resistant to the analog compound is selected.
  • a host producing phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by aspartic acid has been released will be obtained.
  • Escherichia coli HB101 was pre-cultured in LB medium, and DL-2-amino-4-phosphonobutyric acid, bromosuccinic acid Meso-2,3-dibromosuccinic acid, 2,2-difluorosuccinic acid, 3-bromopyruvic acid, ⁇ -ketobutyric acid, ⁇ -ketoadipic acid, DL-threo-; 8-hydroxyspartic acid, rare spartic acid -) 9-methyl ester, ⁇ -methyl-DL-aspartic acid, 2,3-diaminosuccinic acid or aspartic acid- / 3-hydrazide ⁇ 9 medium (thiamine 20 g / ⁇ 1, leucine, proline 3 ⁇ g / m1),
  • nucleic acids peridine, adenosine 1 Omg / d 1 each
  • glumic acid or amino acids of the aspartic acid family (Asp 0.025%, Met, Thr, It was examined whether or not the inhibition was restored by the addition of Lys (0.1% each).
  • FIGS. 4 to 6 show the recovery of the growth of Escherichia coli when the above-mentioned inhibitory / restorative substance is added alone or as a mixture of two or three kinds.
  • FIG. 7 shows the growth when an inhibitory recovery substance was added in the absence of the inhibitory substance.
  • additives 1, 2, and 3 represent nucleic acids, glutamic acid, or amino acids of the aspartic acid family, respectively.
  • Escherichia coli HB101 cultured in an LB medium was disrupted, and the suspension was centrifuged to obtain a supernatant as a crude enzyme solution.
  • Enzyme activity was measured in a measurement system containing 2 mM potassium phosphoenol virinate, 0.1 ImM NADH, 0.1 M tris-pic acid (pH 8.5), 1.5 U malate dehydrogenase, and a crude enzyme.
  • the assay was performed by measuring the decrease in absorbance at 340 nm in the presence of acetylchoenzyme A, which is known to affect the activity, at a concentration of 0.1 ImM.
  • Fig. 8 shows the results.
  • a transformant having the desired mutant enzyme gene is screened using the above compound, and the recombinant DNA is obtained by collecting the recombinant DNA.
  • a mutant strain having the desired mutant enzyme gene is screened using the above compound, and a DNA fragment containing the target mutant enzyme gene is isolated from the strain.
  • the mutant enzyme gene can be obtained.
  • the present inventors have studied the importance of arginine residues in the aspartic acid binding protein of E. coli (Krikos, A., Mouth, N. Boyd A and Simon M, I. Cell, 33, 615-622 (1983), Mowbray, S. L and Koshland, DEJ Biol. Chem. 264, 15638-15643 (1990), Milburn, MV Prive, GG, illigan, DL, Scott, WG, Yeh, J.
  • the conversion of arginine at position 438 to cysteine substantially eliminates inhibition by aspartic acid. I found something.
  • the arginine codon of the gene at position 438 of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene can be converted to a cysteine codon.
  • the CGT of nucleotide numbers 1548 to: I550 should be converted to D01: or D && 0.
  • the present inventors carried out a chemical modification of a lysine residue of phosphoenorubyruvate carboxylase with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS), a compound that chemically modifies a lysine residue in a protein.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • malic acid which can be an inhibitor of phosphoenolpyruvate carboxylase, was co-present. In other words, it was postulated that lysine residues near the binding site of phosphoenolpyruvate carboxylase would not be protected and chemically modified by the bound malic acid.
  • the codon of lysine at position 420 of the gene encoding phosphoenolpyruvate carboxylase may be converted into a codon of serine.
  • the nucleotide number AAA may be replaced with TCT, TCC, TCA, TCG, AGT or AGC.
  • the conversion of c- codon is performed by the Overlapping Extension method (Ho., SN, Hunt, HD, Horton, R , M., Pullen, JK and Pease, LR, Gene, 77, 51-59 (1989)), site-directed mutagenesis (Kramer, I. and Frits, HJ, Meth.
  • mutations can be introduced by synthesizing a sequence that has both ends of the restriction enzyme at both ends and that includes both sides of the mutation point and replaces the corresponding part of the unmutated gene (force-set mutation method).
  • a mutant enzyme can be produced by expressing a DNA fragment encoding the phosphoenol pyruvate carboxylase mutated as described above using an appropriate host-vector system. Further, even when the DNA fragment of the present invention is transformed by integrating it into the host chromosome DNA, the desired mutant enzyme can be produced.
  • Examples of the host include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli and coryneform bacteria. Coryneform bacteria are very similar to Corynebacterium bacteria, which were previously classified as Brevibacterium sp., But are now integrated as Corynebacterium sp., And Corynebacterium sp. Includes closely related Brevipacterium bacteria. In addition, a suitable host for amino acid production will be described later.
  • the vector DNA a plasmid vector is preferable, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable. When the host is Escherichia coli, examples include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 and the like. Alternatively, a phage DNA vector can be used.
  • vectors that can be used when the host is a coryneform bacterium and hosts that carry the vector are exemplified below.
  • the deposit numbers of the international depository organizations are shown in parentheses.
  • PAJ611 xi x'Jt7'JAJ11884 (FERM BP-138)
  • PAJ440 / ,,, Chil's ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,
  • These vectors are obtained from the deposited microorganism as follows. Cells collected during the logarithmic growth phase were lysed using lysozyme and SDS, centrifuged at 300,000 X g, and polyethylene glycol was added to the supernatant obtained from the lysate. Separate and purify by equilibrium density gradient centrifugation at tide tube mouth.
  • a method of increasing the permeability of DNA by treating the cells with calcium chloride (andel, M. and Higa , 'J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)) and the like, which are usually used for transformation of Escherichia coli.
  • methods for transforming coryneform bacteria include a method of treating the above cells with calcium chloride or a method of incorporation at a specific growth stage at which the cells can take DN ⁇ (Bacillus' by Duncan, CH et al.). Reports on subtilis).
  • plasmid DNA can be readily incorporated into bacterial cells by shaping protoplasts or spheroplasts of DNA receptors that readily incorporate the DNA. These are known for Bacillus subtilis, Actinomyces and yeast (Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979), Bibb et al., Nature, 274, 398, ( 1978), Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)).
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791 discloses a method for transforming coryneform bacteria.
  • the DN A sequence of the present invention to be expressed in said host ⁇ is, lac, trp may be used a promoter that acts effectively in microorganisms such as P L, DN A sequence ho scan Hoe Nord carboxylase of the present invention If it contains a gene promoter, it may be used as it is.
  • a coryneform bacterium is used as a host, a known trp promoter derived from a bacterium belonging to the genus B. revibacterium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-244382) can also be used.
  • the DNA sequence of the present invention inserted into a self-replicating vector DNA may be introduced into a host, and the host may be retained as a plasmid.
  • Mu phage Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985
  • homologous recombination Example in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)
  • JP-A-5-7491 can be used.
  • a mutant enzyme By culturing a microorganism transformed with the DNA sequence of the present invention as described above and expressing this DNA sequence, a mutant enzyme is obtained. Whether or not the thus-obtained variant enzyme has released feedback inhibition by aspartic acid can be clarified by measuring the activity by adding aspartic acid to the enzyme reaction system. For the measurement of enzyme activity, spectroscopic methods (Yoshinaga.T., Izui, K and
  • the DNA sequence of the present invention encodes a mutant enzyme in which feedback inhibition by aspartic acid has been eliminated
  • a microorganism having this DNA sequence can be used as an aspartic acid group or a glutamic acid group as shown below. It can be used for efficient production of acid fermentation of amino acids.
  • Escherichia coli AJ12907, AJ12908, AJ12909 carrying the mutant enzyme gene obtained in the Examples described below was developed on August 3, 1993 by Postal Code 305 Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japan It has been deposited as FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13776, and FERM P-13777, respectively, in the order of Ichihigashi 1-3-1). The deposit has been transferred to an international deposit under the Budapest Treaty and deposited under accession numbers FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, and FERM BP-4737.
  • Amino acids can be produced by culturing a microorganism having the DNA sequence of the present invention in a suitable medium and separating the resulting amino acids.
  • amino acids include L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, L-glutamic acid, L-arginine, and L-proline.
  • the host used for the production of L-lysine according to the present invention includes bacteria belonging to the genus Escherichia, and preferably Escherichia coli which produces L-lysine. Specifically, a mutant strain having resistance to a lysine analog can be exemplified. This lysine analog is such that it inhibits the growth of microorganisms of the genus Escherichia, but its inhibition is such that it is totally or partially released when L-lysine coexists in the medium. It is.
  • lysine there are oxa lysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) monocysteine (hereinafter abbreviated as "AEC"), fermethyl lysine, and monochlorocaprolactam.
  • AEC S- (2-aminoethyl) monocysteine
  • fermethyl lysine there are oxa lysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) monocysteine (hereinafter abbreviated as "AEC”), fermethyl lysine, and monochlorocaprolactam.
  • AEC S- (2-aminoethyl) monocysteine
  • L-lysine producing bacteria various artificial mutants of coryneform bacteria have been used as L-lysine producing bacteria, and these can be used in the present invention.
  • Such artificial mutants include the following. AEC-resistant mutant, L-homoserine Mutants that require such amino acids (Japanese Patent Publication No. 48-28078,
  • coryneform bacteria used for the production of lysine include the following: ph, revival, cteridium lactofermentum AJ12031 (FERM BP-277) JP-A-60-62994, page 525 See lower left column
  • Examples of the bacterium belonging to the genus Escherichia include, but are not limited to, Escherichia coli: t. Coli 7 ⁇ KX141 (VPM-B4781) (see JP-A-4-330275, paragraph 45); Ratatofar-mentum AJ12404 (FERM P-10141) (refer to the lower left column on page 603 of JP-A-2-42988), fu, leviha, terium 7 laha ', mu AJ12405 (FERM P-10142) ( JP-A-2-42988, page 524, lower left column).
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Xeshia include the following strains.
  • Engineering paper AJ12628 (FERM P-12380) 'See 1993 French Patent Publication No. 2 680 178 Esseri Tari AJ 12624 (FERM P-12379)' See 1993 French Patent Publication No. 2 680 178 Coryneform bacteria include the following strains.
  • Examples of the bacteria belonging to the genus Escherichia include the following strains.
  • Escherichia bacteria examples include the following strains.
  • AJ11543 See Japanese Unexamined Patent Publication No. 56-144093, page 435, lower left column Essieli t] ⁇ AJ11544 (FERM P-5484) Japanese Patent Application Laid-Open No. 56-144093, page 435 lower left See the column.
  • Coryneform bacteria include the following strains. H., Leviha Cterium * Lactofa-mentham AJ11225 (FERM P-4370) JP-A-60-87788, page 473, see upper left column
  • the method for culturing the above host is not particularly different from the conventional method for culturing amino acid-producing bacteria. That is, the medium is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and, if necessary, organic trace nutrients such as amino acids and vitamins.
  • FIG. 1 shows an example of a culture medium for producing amino acids as a culture medium for producing amino acids. Calcium carbonate is added to other components after sterilization. The cultivation is carried out under aerobic conditions, while appropriately adjusting the pH and temperature of the medium, until the production and accumulation of amino acids are substantially stopped. To collect the amino acid thus accumulated in the culture solution, a usual method can be applied. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the growth inhibition by 3-bromopyruvate.
  • FIG. 2 is a diagram showing growth inhibition by aspartic acid-13-hydrazide.
  • FIG. 3 is a diagram showing growth inhibition by DL-Threor / 3-hydroxyaspartic acid.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of an inhibitory and recovery substance on 3-bromopyruvic acid.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of an inhibitory / restorative substance on aspartic acid mono-hydrazide.
  • FIG. 6 is a view showing the effect of an inhibitory recovery substance on DL-Threor-3-hydroxyaspartic acid.
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect of growth recovery factors on growth.
  • FIG. 8 is a diagram showing the inhibition of the growth inhibitory substance on phosphoenolpyruvate potency ruboxylase activity.
  • FIG. 9 is a diagram showing inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.
  • FIG. 10 is a diagram showing the inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.
  • FIG. 11 is a diagram showing a method for introducing a mutation into the phosphoenolpyruvate carboxylase gene.
  • Figure 12 shows the effect of aspartic acid on the activity of wild-type and mutant phosphoenolpyruvate carboxylase (substitution of arginine at position 438 from the N-terminus with cysteine). .
  • FIG. 13 is a diagram showing the effect of aspartic acid on the activity of wild-type and mutant phosphoenolpyruvate carboxylase (substitution of lysine at the 62nd position from the N-terminus with serine).
  • a) is an enlargement of the horizontal axis (concentration of L-aspartic acid) of b).
  • Example 1 Obtaining Mutant Phosphoenolpyruvate Carboxylase Gene
  • Plasmid pS2 obtained by inserting the cloned phosphoenolpyruvate carboxylase gene, which has already been cloned and whose nucleotide sequence has been determined, into the sail site of vector plasmid pBR322.
  • pS2 has an ampicillin resistance gene as a drug resistance marker gene (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984).
  • the nucleotide sequence of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene carried by pS2 is the same as that of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene carried by plasmid pT2.
  • pS2 DNA was added to a hydroxylamine-treated solution (20; g Zm lp S2 DN A.
  • the cells were treated with 0.05 M sodium phosphate (pH 6.0), ImM EDTA, and 0.4 M hydroxylamine for 75 and 2 hours. Since hydroxylamine treatment is affected by pH, 1 M hydroxylamineHC1 adjusted to pH 6.0 with sodium hydroxide, 1 mM EDTA solution 801, and 0.1 M sodium phosphate (pH 6. 0), ImM £ 0 solution 100 1 was mixed with TE (10 mM Tris-HCK ImM EDTA) buffer containing 2 g of pS2DNA, and finally diluted to 2001 with water.
  • TE 10 mM Tris-HCK ImM EDTA
  • the above conditions are conditions under which, when the Escherichia coli HB101 is transformed with pS2 after the treatment, the survival rate of the transformant in the medium containing ampicillin is 0.2% before the treatment.
  • Escherichia coli HB101 was transformed with hydroxylamine-treated pS2, and spread on a plate medium containing ampicillin to obtain about 10,000 colonies of transformants. These are suspended in a liquid medium, and analogs of aspartic acid, 3-bromopyruvic acid (3BP), aspartic acid; 8-hydrazide (AHY), DL-threo ;; 3-hydroxyaspartic acid ( ⁇ HA) was applied to a plate medium containing a concentration near the minimum inhibitory concentration at a density of 10 3 to 10 5 cells per medium, and growing colonies were selected.
  • aspartic acid 3-bromopyruvic acid (3BP), aspartic acid; 8-hydrazide (AHY), DL-threo ;
  • 3-hydroxyaspartic acid ( ⁇ HA) was applied to a plate medium containing a concentration near the minimum inhibitory concentration at a density of 10 3 to 10 5 cells per medium, and growing colonies were selected.
  • each of the produced phosphenol pyruvate carboxylase was roughly purified according to the method described in The Journal of Biochemistry, Vol. 67, No. 4, 1970, The inhibition of activity by the compounds was investigated. The measurement of the enzyme activity was performed in the same manner as described above.
  • plasmid was isolated from a strain that produces an L-mutant enzyme whose activity is not inhibited by an analog compound, and the mutant was identified as a phosphoenolpyruvate carboxylase-deficient mutant, Escherichia coli 'CR 1 (Sabe, H. et. al., Gene, 31, 279-283, 1984), and confirmed to produce mutant enzymes.
  • Table 2 shows the mutations possessed by the phosphoenolpyruvate carboxylase gene contained in each plasmid.
  • the numbers in the table represent nucleotide numbers or amino acid numbers in SEQ ID NO: 1.
  • AJ12907 and AJ12909 are culture media containing 3 BP at 500 ug / ml
  • AJ12908 is a medium containing 1000 ⁇ g_ml (SHA)
  • AJ12910 is 500 ⁇ g / m1 Was selected in a medium containing AH Y.
  • Mutant Phosphoenolpyruvate Carboxylase Phosphoenolpyruvate carboxylase produced by the transformants of the above four strains was examined for sensitivity to aspartic acid.
  • the produced phosphoenolpyruvate carboxylase is derived from plasmid and its sensitivity to aspartic acid is determined by a known method (Yoshinaga, T , Izui, K and Katsuki, HJ Biochem., 68, 747-750 (1970)). That is, in the activity measurement system, acetylchoenzyme A, which is known to affect the activity, is present at a concentration of 0.1 mM or I mM, and each transformant and pS2 are isolated. When the activity of the enzyme produced by the retained Escherichia coli was measured, the sensitivity to aspartic acid was measured as shown in FIGS.
  • B-396 strain JP-A-3-50 1682
  • B-396 was used as a host.
  • This B- 3 9 9 6 strain has been deposited under the ⁇ registration number RIA 1867 in the Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breedin .
  • pBP5 was selected as a mutant phosphoenol pyruvate carboxylase to be evaluated and subjected to an experiment.
  • Plasmid pBP5 containing a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli B-396 is introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)). Then, the transformant was isolated. Wild type as control Escherichia coli 'B-3996 was similarly transformed with pS2, a plasmid expressing the phosphoenol pyruvate carboxylase gene.
  • Escherichia coli B-3996 and its transformant were inoculated into 500 ml Sakaguchi flasks each infused with 2 Om1 of the medium having the composition shown in Table 3 and cultured at 37 ° C for 40 hours to produce L-threonine.
  • the results shown in Table 4 were obtained.
  • the culture medium, glucose and MgSO 4 '7H 2 0, and then 2 minutes and the other ingredients, after adjusting to pH7.0 with KOH, 1 1 5 in 10 minutes autoclave, mixing these after the C a C0 3 were separately sterilized was added 30 g / 1.
  • the expression form of the mutant enzyme having the DNA sequence of the present invention is Escherichia coli B-3996, which contains rasmid, has improved threonine-producing ability than Escherichia coli B-3996, which contains plasmid that expresses wild-type enzyme.
  • Example 4 Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase was introduced
  • a J 12628 strain has been deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the registration number F ERM BP-3853.
  • pBP5 was selected as a mutant phosphoenol birubic acid carboxylase to be evaluated and subjected to an experiment.
  • Plasmid pBP5 containing a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli AJ 12628 was introduced by the method of Hanahan (J. ol. Biol. Vol. 106, p577, 1983), and the transformants were isolated. . Similarly, a transformant of Escherichia coli AJ12628 with pS2 was isolated.
  • Escherichia coli AJ12628 and its transformant were each inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask infused with 20 ml of the medium of the composition shown in Table 5, and cultured for 36 hours at 37, and the amount of L-glutamic acid produced was examined. As a result, the results shown in Table 6 were obtained. Incidentally, the culture medium, glucose and MgSO 4 '7H 2 0, and then 2 minutes and the other components, 1 after adjusting to 117. () at 011 for 10 minutes autoclave at 1 15 hand, these the C a C0 3 were separately sterilized after mixing was added 30 g / l. Table 5
  • Escherichia coli carrying the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is Escherichia coli AJ12628, which is a plasmid carrying the plasmid expressing the wild-type enzyme. Glutamic acid-producing ability was improved as compared with E. coli AJ12628.
  • Example 5 Production of Lysine by Coryneform Bacteria Introduced Mutant Phosphoenolpyruvate Carboxylase
  • a promoter derived from Brevibacterium sp. Linked, phenotype A plasmid was prepared. Furthermore, this was introduced into a bacterium belonging to the genus Brevibacterium to produce L-lysine.
  • AK aspartokinase
  • the DNA was synthesized according to a conventional method using a phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems. PCR reaction was performed by Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the fragment excised from the gel was purified by a conventional method, and restricted with Nrul (manufactured by Takara Shuzo) and EcoRI (manufactured by Takara Shuzo). Cut. PHSG399 (Takeshita, S. et al .; see Gene (1987), 61, 63-74) was used as a vector for gene fragment cloning.
  • PHSG399 was digested with the restriction enzyme Smal (Takara Shuzo Co., Ltd.) and the restriction enzyme EcoRI, and connected to the amplified AK gene fragment.
  • the DNA was connected using a DNA ligation kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the specified method. In this way, a plasmid in which the AK gene fragment amplified from the Brevibacterium chromosome was connected to PHSG399 was prepared.
  • pHS2 and pHBP5 were introduced as a plasmid expressing in Brevibacterium, a promoter functioning in Brevibacterium, and a replication origin of plasmid were introduced. From the Nrul site at the 1st nucleotide in the nucleotide sequence, it is assumed that the promoter region is the promoter region of the cloned AK gene.
  • the gene fragment containing up to the ApaLI site was extracted from P399AKY, and inserted into the Aval site about 60 bp before the pHS2 and pHBP5 structural genes so that the transcription direction was forward.
  • a gene fragment that enables autonomous propagation of plasmid in Brevipacterimu a plasmid origin of replication
  • the gene fragment containing the plasmid origin of replication was prepared using Brevipacterium vector pHC4 (see Paragraph No. 10 of JP-A-5-7491; Escherichia coli AJ12036 carrying the plasmid was manufactured by MIC (Deposited with the National Institute of Technology, under the deposit number FERM P12215).
  • the restriction enzyme sites at both ends were modified into Pstl sites by introducing linkers. This fragment was introduced into the Pstl site, which is a vector part of the plasmid to which the promoter of Brevipacterium was added.
  • the constructed phosphoenolpyruvyl carboxylase plasmid of the expression type was compared with the wild-type phosphoenol pyruvate carboxylase plasmid of pS2 and the mutant phosphoenol pyruvate carboxylase plasmid of pHS 2B and pBP5. Each of them was named pHBP 5B.
  • Each of the prepared pHS 2B and pHBP 5B was introduced into AJ 3463 (see Japanese Patent Publication No. 51-34477) which is a Brevibacterium 'lactofermentum L-lysine producing bacterium.
  • the gene was introduced by a transformation method using an electric pulse (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791).
  • the host and the transformant were cultured in a lysine production medium having the composition shown in Table 7 for 72 hours with shaking at 31.5.
  • the medium was added to Ingredient C a C0 3 1 1 of water than of the described table was adjusted to pH8.0 with K0H, after autoclave 115, 15 minutes, and dry heat sterilized the accumulated amount of C a C0 3 further to the culture medium after the prepared culture added L- lysine shown in Table 8.
  • Table 7
  • Brevibacterium lactofermentum AJ3463 having the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is a Brevibacterium having the plasmid expressing the wild-type enzyme.
  • the lysine production capacity was higher than that of AJ 3463.
  • Example 6 Mutant phosphoenol pyruvate carboxylase of the present invention
  • a phosphoenolpyruvate carboxylase gene cloned into plasmid pT2 was used as a material.
  • the host retaining the plasmid pT2 preferably lacks the phosphoenolpyruvate carboxylase gene in order to detect the activity of only the plasmid-derived phosphoenol pyruvate carboxylase.
  • E. coli F15 Hir, recAl, met, ⁇ ( ⁇ .-argECBH), TnlO
  • FERM P-13752 was deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology (Postal Code 305, Tsukuba 1-3-1 Higashi, Ibaraki, Japan) on July 15th, and on July 11, 1994. This original deposit has been transferred to an international deposit under the Budapest Treaty and deposited under accession number FERM BP-4732.
  • nucleotide sequence of pT2 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • FIG. 11 shows the region where the site-specific mutation was performed by the PCR method.
  • the primer used in the present invention comprises a primer c having a sequence before and after the 438th arginine codon (SEQ ID NO: 11: corresponding to nucleotide numbers 1535 to 1554 in SEQ ID NO: 1), and a sequence complementary to the primer c.
  • a primer b (SEQ ID NO: 10) having a sequence upstream thereof and a primer a (SEQ ID NO: 9 corresponding to base numbers 1185 to 1200 in SEQ ID NO: 1) having a sequence complementary to the downstream sequence
  • Four types of primers having d (SEQ ID NO: 12: corresponding to nucleotide numbers 2327 to 2342 in SEQ ID NO: 1) o
  • the PCR reaction is a cycle consisting of denaturation (94, 1.5 minutes), annealing (50, 2 minutes), polymerase extension reaction (72 ° C, 3.5 minutes) after heating at 94 ° C for 1 minute. Was performed 30 times.
  • Table 9 shows the reaction composition.
  • Escherichia coli was transformed with the plasmid obtained above, and the transformant was cultured to recover a plasmid, which was selected for digestion with EcoRI. With respect to the selected DNA, the nucleotide sequence of the region amplified by the PCR method was determined by the dideoxy method, and it was confirmed that the desired base substitution was introduced. This plasmid was named pT2R438C.
  • the base sequence of PT2R438C is a sequence in which the 154th nucleotide and the 550th nucleotide in SEQ ID NO: 1 are each substituted with C to T.
  • the sensitivity of phosphoenolpyruvate carboxylase produced by the aforementioned Escherichia coli strain F15 (AJ12874) having pT2R438C to aspartic acid was examined.
  • the Escherichia coli F15 strain lacks phosphoenolpyruvate carboxylase, so that phosphophenolpyruvate carboxylase produced by AJ12874 is derived from plasmid.
  • the sensitivity to aspartic acid was examined according to a known method (Yoshinaga, T., Izui, K and Katsuki, H. J. Biochem., 68, 747-750 (1970)).
  • acetylchoenzyme A which is known to affect the activity, was present at a concentration of 1 mM or 2 mM in the activity measurement system, and the enzyme activity was measured, The sensitivity was measured as shown in Figure 12.
  • the wild-type enzyme When the aspartic acid concentration becomes high, the wild-type enzyme substantially loses its activity, whereas the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention is apparently maintaining its activity.
  • Escherichia coli strain F15 lacks phosphoenolpyruvate carboxylase, so that the phosphoenol pyruvate carboxylase produced by the transformant is derived from plasmid.
  • Sensitivity to aspartic acid was determined according to a known method (Yoshinaga, ⁇ ., Izui, K and Katsuki, H. J. Biochem., 68, 747-750 (1970)). That is, when acetylchoenzyme A, which is known to affect the activity, was present at a concentration of 1 mM in the activity measurement system, and the enzyme activity was measured, the sensitivity to aspartic acid was Measured as 13 In Fig. 13, the horizontal axis (concentration of L-aspartic acid) of a) and (ib) is enlarged.
  • the wild-type enzyme When the aspartic acid concentration becomes high, the wild-type enzyme substantially loses its activity, whereas the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention is apparently maintaining its activity.
  • Figure 13 shows the mutant phosphoenol pyruvate carboxylase (K65OA mutant enzyme) in which the lysine at position 65 is replaced with serine and the mutant phosphoenol with the lysine at position 491 replaced by serine.
  • K65OA mutant enzyme mutant phosphoenol pyruvate carboxylase
  • the sensitivity of enolpyruvate carboxylase (K49A mutant enzyme) to aspartic acid is also described. These mutant enzymes did not release the inhibition by aspartic acid.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The DNA sequence of the present invention encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, and a microorganism having the DNA sequence produces the enzyme.
  • mutant phosphoenorubyruvic acid carboxylase of the present invention is not substantially affected by the activity inhibition by aspartic acid, it can be used for the production of a fermentation enzyme of amino acid whose biosynthesis is regulated by aspartic acid.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type other nucleic acid Genomic DNA and vector
  • Organism name Escherichia coli
  • GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572 Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val lie Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
  • GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT GAG GCA 1916
  • BIV 3Md ail OJJ an BTV 3iy n ⁇ l -i3S " ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 QJd% Z 330 Oil OXV 001 033 IIV 330 390 VIO VOX 9V0 310 399 009 33V VOO
  • Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met
  • Gly lie lie Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
  • Glu lie Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala lie Leu Glu 625 630 635 640
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • V a 3iraou93 i ⁇ 3 ⁇ 40fi ⁇ 2
  • m ⁇ - ⁇ mo mm oii
  • VVX 393 V90 33V 009 VOO IVI 110 0X0 330 VV9.
  • S9CI0 / f6df / IDd WI90 / S6 OAV Lys lie Cys lie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
  • Sequence type nucleic acid
  • Type of system IJ genomic DNA
  • Organism Name Corynebacterium, Cterizmuku, Luyum Micum (Corynebacterium glutamicum)
  • Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明細書 変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼとその遺伝子
及びァミノ酸の製造方法 技術分野 本発明は、 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ、 それをコード する遺伝子及びアミノ酸の製造法に関し、 詳しくは、 ァスパラギン酸によるフィ 一ドバック阻害を解除する変異を有する遺伝子とその利用に関する。 背景技術 ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼは、 大部分の細菌や全ての植物に 見いだされる酵素である。 本酵素の役割は、 ァスパラギン酸やグルタミン酸の生 合成および、 クェン酸サイクルに回転維持のために C 4ジカルボン酸を供給する ことにある。 しかし、 微生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼ す影響を示した報告は少なく、 その重要性は明らかではない （Atushi Yokota and Isamu Shiio, Agric. Biol. Chem. , 52, 455-463 (1988)、 Josef Cremer et al. , Appl. Environ. Microbiol. , 57, 1746-1752 (1991)、 Petra, G. Peters - Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993))。
ところで、 アミノ酸は夕ンパクの成分として細胞に普遍的に存在する化合物で あるが、 経済的なエネルギー代謝及び物質代謝のために、 その生産は厳密に制御 されている。 この制御は、 主としてフィードバック制御、 すなわち代謝経路の下 流における産物が上流の反応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御で あり、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼも、 活性発現に様々な調節を 受けている。
例えば、 ェシヱリヒア （Escherichia) 属、 コリネバクテリゥム （Corynebacte rium) 属細菌のホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼでは、 ァスパラギン 酸によって活性が阻害される。
従来、 アミノ酸酰酵においては効率的な生産のために種々の技術が開発され、 フィードバック制御に非感受性になつた変異株を使用したロイシン、 イソ口イシ ン、 トリブトファン、 フヱニルァラニン等の酰酵生産が行われている。 しかしな がら、 ァスパラギン酸による阻害に非感受性になったホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼ変異酵素や、 これをァスパラギン酸族やグルタミン酸族のァミ ノ酸の酰酵生産に利用するという試みは知られていない。
一方、 大腸菌 （ェシ Iリ 1:7·コリ： Escherichia coli) のホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼをコ一ドする遺伝子である ppc遺伝子はすでにクローニングさ れ、 塩基配列も決定されている (Fujita, N. , Miwa, T. , Ishijima, S. , Izui, L and Katsuki H. L Biochem. 95, 909-916(1984)) が、 同酵素においてもァスパラギン酸 による阻害が解除された変異体の報告はな 、。
本発明は、 上記観点からなされたものであり、 ァスパラギン酸によるフィード バック阻害が実質的に解除されたホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ及 びその遺伝子及びその利用法を提供することを課題とする。 発明の開示 本発明者は、 上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、 大腸菌のホス ホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの特定の部位のァミノ酸を他のァミノ酸 に置換することによって、 ァスパラギン酸による阻害が実質的に解除されること を見いだし、 そのような変異酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、 本発明を完成させるに至った。
すなわち本願発明は、 ェシエリヒア属に属する微生物由来のホスホエノ一ルビ ルビン酸カルボキシラーゼにおいて、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼのァスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有することを特 徴とする変異型ホスホエノ一ルピルビン酸カルボキシラ一ゼ、 及びこの変異型ホ スホエノ一ルピルビン酸カルボキシラーゼをコードする D N A配列である。 本発明はさらに、 この D N A断片を保持するェシヱリヒア属又はコリネホルム 細菌に属する微生物、 及びこれらの微生物のいずれかを好適な培地で培養し、 こ の培地から L一リジン、 L -スレオニン、 L—メチォニン、 L一イソロイシン、 L一グルタミン酸、 L一アルギニン及び L一プロリンから選ばれるアミノ酸を分 離することを特徴とするァミノ酸の製造方法を提供する。
尚、 本明細書において、 変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼを' コードする D N A配列あるいはこれにプロモーク一を含む D N A配列を、 単に 「本発明の D N A配列」 、 「変異遺伝子」 あるいはホスホェノールピルビン酸力 ルボキシラーゼ遺伝子ということがある。
以下、 本発明について詳細に説明する。
く 1〉変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ
本発明の変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼ （以下、 単に 「変 異型酵素」 ともいう） は、 ェシヱリヒア属に属する微生物のホスホェノールピル ビン酸カルボキシラーゼにおいて、 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ のァスパラギ 酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有するものである。 このような変異としては、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの酵素 活性を失わないまま、 上記フィ一ドバック阻害を実質的に解除するものであれば どのようなものでもよいが、 例えば、 その変異を有する変異型ホスホエノールビ ルビン酸カルボキシラーゼをェシヱリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させ たときに、 下記性質を有する化合物に対する耐性を細胞に付与する変異が挙げら れる ；
野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを産生するェシヱリヒア属 に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、
前記生育阻害作用は L一グルタミン酸または L—ァスパラギン酸の存在によつ て回復され、 かつ、
野生型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
さらに具体的には、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端か ら
① 6 2 5番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、 ② 222番目のアルギニンをヒスチジンに、 223番目のグル夕ミン酸をリジン に各々置換させる変異、
③ 288番目のセリンをフエ二ルァラニンに、 289番目のグルタミン酸をリジ ンに、 551番目のメチォニンをイソロイシンに、 804番目のグルタミン酸 をリジンに各々置換させる変異、
④ 867番目のァラニンをスレオニンに置換させる変異、
⑤ 438番目のアルギニンをシスティンに置換させる変異、
⑥ 620番目のリジンをセリンに置換させる変異、
が挙げられる。
尚、 ェシヱリヒア属に属する微生物のホスホェノールピルビン酸カルボキシラ ーゼとして、 大腸菌のホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子から推 定されるァミノ酸配列 (Fujita, N. , Miwa, T.， Ishijima, S. , Izui, L and Katsuki H. J. Biochem.95, 909- 916(1984)) を、 配列表配列番号 2に示す。 また、 大腸菌の ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含むプラスミ ド p T 2の全 ヌクレオチド配列を、 ァミノ酸配列とともに配列番号 1に示す。
上記変異型酵素は、 下記の本発明の DNA配列によってコードされ、 この DN A配列を大腸菌等で発現させることにより生産される。
< 2 >本発明の DN A配列及びそれを保持する微生物
一方、 本発明の DNA配列は、 上記変異型酵素をコードする DNA配列であり、 ェシヱリヒア属に属する微生物のホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを コードする DN A断片において、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの ァスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異をコ一ディング領域内 に有する。
具体的には、 上記①〜⑥の変異を有するホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラーゼをコードする DNA配列、 例えば、 配列表配列番号 1の塩基配列において、 i ) 塩基番号 2109〜2111の GAAが、 A A Aまたは A A Gに変換する 変異、
ii) 塩基番号 900〜902の CGCが CATまたは C ACに、 及び 903〜 905の GAAが AAAまたは AAGに各々変換する変異、 iii)塩基番号 1098〜1100の T C Tが T T Tまたは T T Cに、 1101 〜1103の G A Aが A A Aまたは A AGに、 1887〜 1889の A TG が ATT、 AT Cまたは AT Aに、 及び 2646〜 2648の G A Aが A A Aまたは A AGに各々変換する変異
iv) 塩基番号 2835〜2837の GCGが ACT、 ACC、 AC A, ACGの いずれかに変換する変異
V) 塩基番号 1548〜： L 550の CGTが、 T G T又は T G Cに変換される変 異
vi) 塩基番号 2094〜2096の AAAが、 TCT、 TCC、 TCA、 TCG、
AGT、 AG Cのいずれかに変換する変異
の 1、ずれかを有する D N A配列が挙げられる。
このような変異型遺伝子は、 野生型酵素遣伝子ある L、は他の変異を有するホス ホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と宿主に適合するベクター DN A とを連結して得られる組換え DN Aを変異処理し、 この組換え DN Aによる形質 転換体からスクリーニングすることにより得られる。 あるいは、 野生型酵素を生 産する微生物を変異処理し、 変異型酵素を生産する変異株を創成した後、 該変異 株から変異型遺伝子をスクリーニングしてもよい。 組換え D N Aの変異処理には、 ヒドロキシノレアミン等が使用される。 また、 微生物自体を変異処理する場合は、 通常人工突然変異に用いられている薬剤あるいは方法を用いればよい。
また上記変異型遺伝子は、 Overlapping Extension法 (Ho. , S. N.， Hunt, H. D. , Horton, R, M. , Pullen, J. L and Pease, L. R. , Gene, 77, 51-59(1989))、 部位特異的 変異法 (Kramer, W. and Frits, H. J.， Meth. in Enzymol. , 154, 350 (1987)；
Kunkel, T. A. et. al. , eth. in Enzymol. , 154, 367(1987)) などの方法により、 野 生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラーゼ遺伝子にアミノ酸の置換、 挿入および欠失等の変異を導入することによつ ても得られる。 これらの方法は、 未変異の遺伝子 DNAを铸型とし、 変異点にミ スマッチを含む合成 DN Aをプライマーとして前記遺伝子 DN Aの相補鎖を合成 することにより、 変異を導入するという原理に則っている。 これらの方法を用い れば、 目的部位に意図する変異を起こすことができる。 その他、 両末端に制限酵素切断末端を持ち、 変異点の両側を含む配列を合成し、 未変異遺伝子の相当する部分と入れ換える事により、 変異を導入することができ る （力セット変異法） 。
変異導入に用いる野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホェノール ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、 ェシヱリヒア属に属する微生物のホスホ エノールビルビン酸カルボキシラーゼをコ一ドする遺伝子であれば、 いかなるも のでもよく、 塩基配列が決定されておりクローン化されていることが好ましい。 クローン化されていない場合には、 P C R法等を用いて該遺伝子を含む D N A断 片を増幅単離した後、 適当なベクターを用いてクローン化することができる。 上記のような遺伝子として、 例えば、 すでにクローニングされ塩基配列も決定 されている、 大腸菌の遺伝子 (Fujita, N. , Miwa, T. , Ishijima, S. , Izui, K. and Katsuki H. J. Biochem. 95, 909- 916(1984)) が挙げられる。 この遺伝子のコーディ ング領域の配列は、 配列表の配列番号 1に示したとおりである （塩基番号 2 3 7 〜2 8 8 8 ) o
変異遺伝子を有する宿主のスクリーニングは、 ァスパラギン酸のアナログ化合 物を用いて行うことができる。 アナログ化合物としては、 次の性質を有している ことが好ましい。 すなわち、 野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ を生産するェシェリヒア属に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、 前記生 育阻害作用は L一グルタミン酸又は Lーァスパラギン酸の存在によって回復され、 かつ、 野生型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
上記のようなアナログ化合物を、 野生型酵素を生産するェシ Xリヒア属に属す る微生物、 例えばェシェリヒア 'コリ H B 1 0 1の生育の阻害を指標として選択 し、 そのアナログ化合物に耐性な変異株をスクリーニングすれば、 ァスパラギン 酸によるフィードバック阻害が解除されたホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラ一ゼを生産する宿主が得られる可能性が高 、。
ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤の一般的な構造として、 C 4ジカルボン酸構造をとることが必須であると提唱されている。 このような観 点から、 本発明者は種々の化合物をスクリ一二ングした。 ェシヱリヒア 'コリ H B 1 0 1を L B培地で前培養し、 DL- 2-ァミノ- 4-ホスホノ酪酸、 プロモコハク酸 メソ- 2, 3-ジブロモコハク酸、 2,2-ジフルォロコハク酸、 3-ブロモピルビン酸、 α -ケト酪酸、 α-ケトアジピン酸、 DL-スレオ-； 8-ヒ ドロキシァスパラギン酸、 レア スパラギン酸-) 9-メチルエステル、 α-メチル -DL-ァスパラギン酸、 2, 3-ジァミノ コハク酸又はァスパラギン酸- /3-ヒドラジドを含む Μ9培地 （チアミン 2 0 g /τη 1、 ロイシン、 プロリン各 3 ^ g/m 1含む） で本培養し、 経時的に 6 6 0 nmで吸光度を測定することにより、 生育を調べた。
さらに、 それらの化合物が生育阻止濃度で存在するときに、 核酸 （ゥリジン、 アデノシン各 1 Omg/d 1 ) 、 グル夕ミン酸、 あるいはァスパラギン酸族のァ ミノ酸 (Asp 0.025%, Met, Thr、 Lys各 0.1%)の添加により阻害が回復するか否か を調べた。
その結果、 3種の化合物、 3—ブロモピルビン酸 （3 B P) (式（1)) 、 ァスパ ラギン酸一 3—ヒドラジド （AHY) (式 (2)) 、 D L—スレオー 3—ヒ ドロキシ ァスパラギン酸 （;SHA) (式 (3)) を選択した。
COOH
I
( 1 )
Figure imgf000009_0001
CONHNH
HCH I
H3NCH (2)
I
COOH 〇0〇H
I
HCOH
I (3)
H3NCH COOH
これらのアナログ化合物による大腸菌の生育阻害を図 1〜 3に示す。 さらに、 上記阻害回復物質を単独で、 あるいは 2種類もしくは 3種類の混合物として加え たときの、 大腸菌の生育回復を図 4〜 6に示す。 また、 対照として、 阻害物質非 存在下で阻害回復物質を添加したときの生育を図 7に示す。 尚、 図 4〜7中、 添 加物 1、 2、 3は、 各々核酸、 グルタミン酸、 あるいはァスパラギン酸族のアミ ノ酸を示す。
さらに、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼに対するアナ口グ化合物 による活性阻害を調べた。 Yoshinaga, T. , Izui, L Katsuki, H.， J. Biochem. , 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、 酵素活性を測定した。
LB培地で培養したエシュリヒア 'コリ HB 101を破砕し、 懸濁液を遠心分 離して上清を粗酵素液とした。 酵素活性の測定は、 2 mMホスホエノールビルビ ン酸カリウム、 0. ImM NADH、 0. 1M トリスー鲊酸 (pH8. 5) 、 1. 5Uマレートデヒドロゲナーゼ、 及び粗酵素を含む測定系中に、 活性に影響 する事が知られているァセチルコェンザィム Aを 0. ImMの濃度で存在させて、 340 nmの吸光度の減少を測定することにより行った。 結果を図 8に示す。 以上の結果から、 上記の 3種のアナログ化合物は、 大腸菌の生育を阻害し、 核 酸単独ではこの阻害を回復できないが、 グルタミン酸あるいはァスパラギン酸族 アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明らかである。 したがって、 これ らのアナ口グ化合物はホスホエノ一ルピルビン酸カルボキシラ一ゼの選択的な阻 害剤であると推定された。 本発明において、 後記実施例に示したように、 これら 3種の化合物を用いて変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産 する大腸菌を選択することに成功している。
上記化合物を用 L、て目的とする変異型酵素遺伝子を有する形質転換体をスクリ 一二ングし、 組換え D N Aを回収すれば、 その変異型酵素遺伝子が得られる。 ま た、 微生物自体を変異処理した場合には、 上記化合物を用いて目的とする変異型 酵素遺伝子を有する変異株をスクリーニングし、 該株より目的とする変異型酵素 遺伝子を含む D N A断片を単離し、 適当なベクターに連結すれば、 その変異型酵 素遺伝子が得られる。
一方、 本発明者らは、 大腸菌のァスパラギン酸結合蛋白質におけるアルギニン 残基の重要性 (Krikos, A.， Mouth, N. Boyd A and Simon M, I. Cell, 33, 615-622 (1983)， Mowbray, S. L and Koshland, D. E. J. Biol. Chem. 264, 15638-15643(1990), Milburn, M. V. Prive, G. G. , illigan, D. L.， Scott, W. G. , Yeh, J. Jancarik, J.， Koshkand, D. E. and Kim, S. H. Science, 254, 1342- 1347(1991)) に着目し、 鋭意検 討を重ねた結果、 4 3 8番目のアルギニンをシスティンに変換することによって ァスパラギン酸による阻害が実質的に解除される事を見いだした。 4 3 8番目の アルギニンをシスティンに変換するには、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラーゼをコ一ドする遺伝子の 4 3 8審目のアルギニンのコドンをシスティンのコ ドンに変換すればよい。 例えば、 配列番号 1において、 ヌクレオチド番号 1 5 4 8〜： I 5 5 0の C G Tを、 丁01：又は丁& 0に変換すればょぃ。
また、 本発明者らは、 蛋白質中のリジン残基を化学修飾する化合物である 2， 4 , 6—トリニトロベンゼンスルホン酸 （T N B S ) によって、 ホスホエノ —ルビルビン酸カルボキシラーゼのリジン残基の化学修飾を行った。 修飾反応を 行う際、 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤となりうるリンゴ 酸を共存させた。 つまり、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの結合部 位近傍のリジン残基は、 結合したリンゴ酸によって保護を受けて化学修飾されな いだろうと仮定したのである。 その結果、 6 2 0番目のリジン残基がリンゴ酸が ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに結合するために重要であることが 示唆され、 さらに、 この 6 2 0番目のリジン残基をセリン残基に変換することに よって、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性が維持されたま ま、 ァスパラギン酸によるフィ一ドバック阻害が解除されることが見いだされた
6 2 0番目のリジン残基をセリン残基に変換するには、 ホスホェノールピルビン 酸カルボキシラーゼをコ一ドする遺伝子の 6 2 0番目のリジンのコドンをセリン のコドンに変換すればよい。 例えば、 配列番号 1において、 ヌクレオチド番号 A A Aを、 T C T、 T C C、 T C A、 T C G、 A G T又は A G Cに置換すればよい c コドンの変換は、 Overlapping Extension法 （Ho. , S. N. , Hunt, H. D.， Horton, R, M. , Pullen, J. K. and Pease, L. R. , Gene, 77, 51-59(1989)) 、 部位特異的変異法 (Kram er, I. and Frits, H. J. , Meth. in Enzymol. , 154, 350 (1987)； unkel, T. A. et. al. , Meth. in Enzymol. , 154, 367(1987)) などの方法により、 野生型酵素遺伝子あるい は他の変異を有するホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子にァミノ 酸の置換、 挿入および欠失等の変異を導入することによつても得られる。 これら の方法は、 未変異の遺伝子 D N Aを铸型とし、 変異点にミスマッチを含む合成 D N Aをプライマーとして前記遺伝子 D N Aの相補鎖を合成することにより、 変異 を導入するという原理に則っている。 これらの方法を用いれば、 目的部位に意図 する変異を起こすことができる。
その他、 両末端に制限酵素切断末端を持ち、 変異点の両側を含む配列を合成し、 未変異遺伝子の相当する部分と入れ換える事により、 変異を導入することができ る （力セット変異法） 。
上記のようにして変異を導入されたホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼをコ一ドする D NA断片を、 適当な宿主一ベクター系を用いて発現させること によって、 変異型酵素を生産させることができる。 また、 本発明の D N A断片を、 宿主染色体 D N A内に組み込むことにより形質転換しても、 目的の変異型酵素を 産生できる。
宿主としては、 ェシエリヒア属に属する微生物、 例えば、 大腸菌、 コリネホル ム細菌等が挙げられる。 コリネホルム細菌は、 コリネバクテリゥム属細菌、 従来 ブレビパクテリゥム属に分類されていたが現在コリネバクテリゥム属細菌として 統合されたブレビバクテリゥム属細菌、 及びコリネパクテリゥム属細菌と非常に 近縁なブレビパクテリゥム属細菌を含む。 尚、 アミノ酸製造に好適な宿主につい ては、 後述する。 一方、 ベクター D N Aとしては、 プラスミ ドベクターが好ましく、 宿主の細胞 内で自立複製可能なものが好ましい。 宿主が大腸菌の場合には、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG399、 RSF1010等が挙げられる。 他にもファージ D N Aのベクターも利用できる。
また、 宿主がコリネホルム細菌の場合に使用できるベクター及びそれを保持す る宿主を以下に例示する。 尚、 かっこ內に国際寄託機関の寄託番号を示した。
PAJ655 x' リヒ了'コリ AJ11882(FERM BP- 136)
コリネ / ク ίリウム*ク、'ルタミクム SR820KATCC39135)
PAJ1844 ii/x'Jh7 >JAJ11883(FERM BP- 137)
コリネハ、、クテリゥム *ク 'ルタミクム SR8202(ATCC39136)
PAJ611 xi x'Jt7 'JAJ11884(FERM BP- 138)
PAJ3148 コリネハ、、ク ίリウム*ク、、ルタミクム SR8203(ATCC39137)
PAJ440 /、、、チルス'ス、、フ、、チリス AJ1190KFERM BP-140)
これらのベクターは、 寄託微生物から次のようにして得られる。 対数増殖期に 集められた細胞をリゾチーム及び S D Sを用いて溶菌し、 3 0 0 0 0 X gで遠心 分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、 セシウムク 口ライドーェチジゥムブ口マイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。 本発明の D N A配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸 菌を形質転換するには、 例えば細胞を塩化カルシウムで処理して D N Aの透過性 を高める方法 ( andel, M. and Higa, ' J. Mol. Biol. , 53, 159 (1977)) 等、 通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
また、 コリネホルム細菌の形質転換法としては、 上記の細胞を塩化カルシウム で処理する方法、 または細胞が D N Αを取込可能な特定の成長時期に取り込む方 法 （Duncan, C. H. et al.によるバチルス 'ズブチリスに関する報告） がある。 さらに、 プラスミ ド D N Aを容易に取り込む D N A受容体のプロトプラストまた はスフエロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能で ある。 これらは、 バチルス ·ズブチリス、 ァクチノマイセス及び酵母について知 られている （Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet. , 168, 111, (1979)、 Bibb et al. , Nature, 274, 398, (1978)、 Hinnen, A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978))。 その他、 特開平 2— 207791号公報にコリ ネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
本発明の DN A配列を上記宿主內で発現させるには、 l a c、 t r p、 P L等の 微生物内で効率よく働くプロモーターを用いてもよく、 本発明の DN A配列がホ スホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを含んでいる場 合は、 これをそのまま用いてもよい。 また、 コリネホルム細菌を宿主とする場合 は、 公知のブ.レビバクテリゥム属細菌由来の t rpプロモーター （特開昭 62— 244382号公報） 等を使用することもできる。
また、 上記のように、 本発明の DNA配列を自立複製可能なベクター DNAに 挿入したものを宿主に導入し、 プラスミ ドとして宿主に保持させてもよいが、 本 発明の D N A配列を、 トランスポゾン （Berg, D. E. and Berg, C. M. , Bio/Technol. , 1,417(1983))、 Muファージ （特開平 2— 109985) または相同性組換え (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972))を用い た方法で微生物の染色体に組み込んでもよい。 また、 コリネホルム細菌の染色体 に本発明の DNAを組み込むには、 特開平 5— 7491号公報に開示される温度 感受性プラスミ ドが利用できる。
上記のようにして本発明の D N A配列で形質転換された微生物を培養し、 この DNA配列を発現させると、 変異型酵素が得られる。 このようにして得られた変 異型酵素が、 ァスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されているかどう かは、 酵素反応系にァスパラギン酸を添加して活性を測定することにより、 明か となる。 酵素活性の測定には、 分光学的方法 （Yoshinaga.T., Izui，K and
atsuki, H. J. Biochem.,68, 747-750(1970))等を用いる事ができる。
また、 本発明の DN A配列は、 ァスパラギン酸によるフィードバック阻害が解 除された変異酵素をコードしているので、 この DNA配列を有する微生物を、 以 下に示すように、 ァスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の効率的な酸酵 生産に利用することができる。
後記実施例で得られた変異型酵素遺伝子を保持するェシエリヒア 'コリ A J 1 2907、 A J 12908, A J 12909> AJ 12910は、 平成 5年 8月 3日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば 市東一丁目 1番 3号） に、 各々順に FERM P— 13774、 FERM P— 1 3775、 FERM P— 13776、 FERM P— 13777として寄託され ており、 平成 6年 7月 1 1日に、 この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄 託へ移管され、 受託番号 FERM BP- 4734、 FERM BP- 4735、 FERM BP- 4736、 FERM BP - 4737として寄託されている。
< 3 >アミノ酸の製造方法
本発明の DNA配列を保持する微生物を好適な培地で培養し、 生じたアミノ酸 を分離することにより、 アミノ酸を製造することができる。 このようなアミノ酸 として、 L一リジン、 L—スレオニン、 L—メチォニン、 L—イソロイシン、 L 一グルタミン酸、 L一アルギニン、 L一プロリンが挙げられる。
以下に、 本発明の DNA配列を導入し各アミノ酸の製造に使用するのに好適な 宿主及び培養法を例示する。
( 1 ) 本発明のァミノ酸の製造方法に好適な宿主
(i)Lーリジン製造に好適な宿主
本発明による L一リジン製造に用いる宿主として、 ェシエリヒア属細菌、 好ま しくは L—リジン生産性の大腸菌が挙げられる。 具体的には、 リジンアナログに 耐性を有する変異株が例示できる。 このリジンアナログは、 エシ リヒア属の微 生物の増殖を阻害するようなものであるが、 その抑制は L—リジンが培地中に共 存すれば、 全体的または部分的に解除されるようなものである。 例えば、 ォキサ リジン、 リジンハイドロキサメート、 S— （2—アミノエチル） 一システィン (以下、 「AEC」 と略記する） 、 ァーメチルリジン、 ひ一クロロカプロラクタ ム等がある。 これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、 通常の人工変異 操作をェシエリヒア属の微生物に施すことにより得られる。 Lーリジン製造に用 いる菌株として、 具体的には、 ェシェリヒア 'コリ A J 11442 (FERM P— 5084として寄託されている。 特開昭 56 - 18596号公報第 471頁 左下欄参照） が挙げられる。
一方、 コリネホルム細菌の種々の人工変異株が、 L一リジン生産菌として用い られており、 これらを本発明に使用することができる。 このような人工変異株と しては次のようなものがある。 AEC耐性変異株、 その成長に L—ホモセリンの ようなアミノ酸を必要とする変異株 （特公昭 48— 28078号， 特公昭 56—
6499号） ， AECに耐性を示し、 更に L一口イシン、 L—ホモセリン， L一 プロリン， Lーセリン， L—アルギニン， L—ァラニン， L—バリン等のアミノ 酸を要求する変異株 （米国特許第 3708395号及び第 3825472号） ， D L— α—ァミノ一 ε—力プロラクタム， α—アミノーラウリルラクタム， キノ イ ド， Ν—ラウロイルロイシンに耐性を示す L—リジン生産変異株， ォキザ口酢 酸脱炭酸酵素 （デカルボキシラーゼ） または呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示す L -リジン生産変異株 （特開昭 50— 53588号， 特開昭 50— 31 093号， 特開昭 52— 1 02498号， 特開昭 53— 86089号， 特開昭 55— 978 3号， 特開昭 55— 9759号， 特開昭 56— 32995号， 特開昭 56— 39
778号， 特公昭 53— 43591号， 特公昭 53— 1 833号） ， イノシトー ルまたは酢酸を要求する L—リジン生産変異株 （特開昭 55— 9784号， 特開 昭 56— 8692号） ， フルォロピルビン酸または 34°C以上の温度に対して感 受性を示す L一リジン生産変異株 （特開昭 55— 9783号， 特開昭 53— 86 090号） 、 エチレングリコールに耐性を示し、 L一リジンを生産するブレビパ' クテリゥムまたはコリネバクテリゥムの変異株 （米国特許出願第 333455号 参照） 。
リジン製造に用いる具体的なコリネホルム細菌としては、 次のものが挙げられ フ、、レビ Λ、、クテリゥム ·ラクトファ-メン夕ム AJ12031 (FERM BP- 277) 特開昭 60-62994号公報第 525頁 左下欄参照
フ"レビ^クテリゥム，ラクトファ -メンタム ATCC39134 特開昭 60- 62994号公報第 473頁右下欄参照 フ、'レビハ'ク ίリウム'ラクトファ -メンタム AJ3463 (FERM P - 1987) 特公昭 51-34477号公報参照 また、 以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本発明に使用することが できる。
コリネバクテリウム ·ァセトァシドフィルム ATC C 1 3870 コリネバクテリゥム .ァセトグルタミクム ATC C 1 5806 コリネバクテリゥム .カルナェ ATCC 1 599 1 コリネバクテリゥム 'グルタミクム ATCC 1 3032 AT C C 3060
(ブレビバクテリゥム ·ディバリカタム） AT C C 4 020
(ブレビ クテリゥム ·ラク トフアーメンタム） ATC C 3869
(コリネバクテリゥム · リリウム） ATCC 1 5 990 コリネバクテリゥム メラセコーラ ATCC 17965 ブレビ / クテリゥム サッカロリティクム ATC C 4066 ブレビノ クテリゥム ィンマリオフィルム ATCC 4068 ブレビ 'クテリゥム ロゼゥム ATCC 3825 ブレビパクテリゥム フラバム ATC C 3826 ブレビパ'クテリゥム チォゲ二タリス ATCC 1 9 240 ミクロノくクテリゥム アンモニアフィラム ATCC 1 5354
(ii) Lースレオニン製造に好適な宿主
ェシエリヒア' B-3996 (RIA 1867) 特表平 3-501682号公報参照
ェシエリヒ了' リ AJ12349 (FERM P-9574) 特開平 2- 458号公報第 887頁左上欄参照 工シェ ァ' AJ 12351 (FERM P-9576) 特開平 2- 458号公報第 887頁右下欄参照 ェシ 了 ·]リ AJ12352 (FERM P-9577) 特開平 2- 458号公報第 888頁左上欄参照 工シ 了 ·]リ AJ11332 (FERM P-4898) 特開平 2- 458号公報第 889頁左上欄参照 ェシエリ！: Τ·コリ AJ12350 (FERM P-9575) 特開平 2-458号公報第 889頁左上欄参照 ェシエリヒ了 ·]リ A J 12353 (FERM P- 9578) 特開平 2-458号公報第 889頁右上欄参照 ェシエリ υ·コリ AJ12358 (FERM P-9764) 特開平 2- 458号公報第 890頁左上欄参照 工シエリヒ了 ·]リ AJ12359 (FERM P-9765) 特開平 2- 458号公報第 890頁左上欄参照 ェシエリ！:了 ·]') AJ11334 (FERM P-4900) 特公平 1-29559号公報第 201頁 6欄参照 ェシエリヒア ·]リ AJ11333 (FERM P-4899) 特公平 1-29559号公報第 201頁 6欄参照 ェシエリヒ了 ·]リ AJ11335 (FERM P-4901) 特公平 1-29559号公報第 202頁 7欄参照 コリネホルム細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。
フ、、レビ Λ、'クテリゥム ·ラクトフ τ_メンタム AJ11188 (FERM P-4190) 特開昭 60- 87788号公報第 473頁右上欄参照
コリネハ、、ク ίリウム'ク、、ルタミクム AJ11682 (FERM BP- 118)特公平 2- 31956号公報第 230頁 8 欄参照 フ、、レビハ、'クテリウム ·7ラハ、、ム AJ11683 (FERM BP- 119) 特公平 2- 31956号公報第 231頁 10 欄参照
(iii) L一メチォニン製造に好適な宿主
L一メチォニン製造には、 以下の菌株が挙げられる。
ェシエリ tァ · ]リ AJ11457 (FERM P-5175) 特開昭 56- 35992号公報第 552頁右上欄参照 ェシ l:了 · ]リ AJ11458 (FERM P-5176) 特開昭 56- 35992号公報第 552頁右上欄参照 ェシエリヒ了 ·]リ AJ11459 (FERM P-5177) 特開昭 56-35992号公報第 552頁右上欄参照 ェシエリ ·コリ AJ11539 (FERM P-5479) 特開昭 56- 144092号公報第 435頁左下欄参照 ェシェリヒ了 · ]リ AJ11540 (FERM P-5480) 特開昭 56- 144092号公報第 435頁左下欄参照 ェシエリヒア ·]リ AJ11541 (FERM P-5481) 特開昭 56-144092号公報第 435頁左下欄参照 ェシェリヒ了 ·]') AJ11542 (FERM P-5482) 特開昭 56- 144092号公報第 435頁左下欄参照
(iv) L—ァスパラギン酸製造に好適な宿主
Lーァスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。
フ'レビハ、、クテリゥム ·7ラハ'ム AJ3859 (FERM P-2799) 特開昭 51- 61689号公報第 524頁左上欄
7"レビ/ クテリゥム，ラクトフ了-メンタム AJ3860 (FERM P-2800) 特開昭 51- 61689号公報第 524頁 左上欄参照
コリネハ、、ク ίリウム*ァセトァシドフィラム AJ3877 (FERM P-2803) 特開昭 51- 61689号公報第 524頁左 上欄参照
コリネハ'クテリウム ·Γルタミクム AJ3876 (FERM P-2802) 特開昭 51- 61689号公報第 524頁左上欄
(V) L—イソ口イシン製造に好適な宿主
ェシエリヒア属細菌としては、 ェシ: tリヒ 7·コリ KX141 (V PM-B4781) (特開平 4-33027 5号公報 4 5段落参照） が、 コリネホルム細菌としては、 フ、、レビハ、、クテリウム'ラタトフア-メン タム AJ 12404 (FERM P-10141) (特開平 2- 42988号公報第 603頁左下欄参照） 、 フ、、レビ ハ、、クテリゥム ·7ラハ'、ム AJ12405 (FERM P- 10142) (特開平 2-42988号公報第 524頁左下欄参 照） が挙げられる。
(vi) L一グルタミン酸製造に好適な宿主
ェシ Xリヒア属細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。 工シヱリヒ Τ·コリ AJ12628 (FERM P - 12380) ' 93年フランス特許公開 No. 2 680 178号参照 ェシエリ tァ リ A J 12624 (FERM P- 12379) ' 93年フランス特許公開 No. 2 680 178号参照 コリネホルム細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。
フ、、レビハ'クテリウム*ラクトフ了-メンタム AJ 12745 (FERM BP - 2922) 特開平 3- 49690号公報第 561頁 右下欄参照
： Tレビハ、、クテリゥム ·ラクトファ-メン夕ム AJ12746 (FERM BP- 2923) 特開平 3-49690号公報第 562頁 左上欄参照
フ"レヒ、、ハ、、クテリゥム,ラクトファ-メンタム AJ 12747 (FERM BP- 2924) 特開平 3-49690号公報第 562頁 左上欄参照
ア'レビハ'クテリウ ラクトフ了-メンタム AJ 12748 (FERM BP- 2925) 特開平 3- 49690号公報第 562頁 左上欄参照
ァ、レビハ、、クテリゥム ,フラハ、、ム ATCC 14067特開平 5 - 3793号公報第 3頁表 1参照
コリネ Λ'クテリウム'ク*ルタミクム ATCC 21492 特開平 5-3793号公報第 3頁表 1参照
(vii) L —アルギニン製造に好適な宿主
ェシヱリヒア属細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。
ェシェリヒ了 ·]リ AJ11593 (FERM P-5616) 特開昭 57-5693号公報第 468頁左上欄参照 ェシ：：リヒァ，コリ AJ11594 (FERM P-5617) 特開昭 57-5693号公報第 468頁右上欄参照 コリネホルム細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。
フ、、レビ、ハ'クテリゥム ,フラハ、、ム AJ12144 (FERM P-7642) 特公平 5-27388号公報第 174頁 4欄参 昭
コリネハ、、ク ίリウム*ク、、ルタミクム AJ12145 (FERM P-7643) 特公平 5-27388号公報第 174頁 4欄参
4昭"、
フ、'レビハ'ク i'Jゥム ·7ラ^ム ATCC 21493 特開平 5-3793号公報第 3頁表 1参照
コリネハ"ク ίリウム*ク レタミクム ATCC 21659 特開平 5- 3793号公報第 3頁表 1参照
(viii) L —プロリ ン製造に好適な宿主
エシュリヒア属細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。
ェシエリ ·]リ AJ11543 (FERM P-5483) 特開昭 56-144093号公報第 435頁左下欄参照 ェシエリ t了 ·]リ AJ11544 (FERM P- 5484) 特開昭 56- 144093号公報第 435頁左下欄参照 コリネホルム細菌としては、 以下の菌株が挙げられる。 フ、、レビハ'クテリウム*ラクトファ -メンタム AJ11225 (FERM P-4370) 特開昭 60- 87788号公報第 473頁 左上欄参照
フ'レビハ、、ク ίリウム，フラハ、 'ム AJ11512 (FERM P-5332) 特公昭 62- 36679号公報第 185頁 2欄 フ、、レビハ、、ク ίリウム *フラ^ム AJ11513 (FERM P - 5333) 特公昭 62- 36679号公報第 185頁 2欄 参照
フ、'レビ Λ、、クテリゥム *フラ Λ、、ム AJ11514 (FERM P-5334) 特公昭 62- 36679号公報第 185頁 2欄 参照
コリネハ、、クテリウム ·Γルタミクム AJ11522 (FERM P-5342) 特公昭 62- 36679号公報第 185頁 2欄 参照
コリネハ、、クテリウ ク、、ルタミクム AJ11523 (FERM P-5343) 特公昭 62- 36679号公報第 185頁 2欄
( 2 ) 培養法
上記宿主を培養する方法は、 従来のアミノ酸生産菌の培養方法と特に変わらな い。 すなわち、 培地としては炭素源、 窒素源、 無機イオン、 さらに必要に応じて アミノ酸、 ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。
炭素源としては、 グルコース、 シュクロース、 ラクト一ス等及びこれらを含有 する澱粉加水分解液、 ホエイ、 糖蜜等が用いられる。 窒素源としては、 アンモニ ァガス、 アンモニア水、 アンモニゥム塩その他が使用できる。 尚、 アミノ酸等の 栄養要求性変異株を宿主に使用する場合は、 その株が要求するアミノ酸等の栄養 素を培地に適宜加える必要がある。 以下に、 アミノ酸製造に用いる培地として、 ΪΙジン製造用の培地の一例を表 1に示す。 尚、 炭酸カルシウムは別個に殺菌後、 他成分に添加する。
Figure imgf000021_0001
培養は、 好気的条件下で培地の p H及び温度を適宜調節しつつ、 実質的にアミ ノ酸の生成蓄積が停止するまで行われる。 こうして培養液中に蓄積されたァミノ 酸を採取するには、 通常の方法を適用できる。 図面の簡単な説明 図 1は， 3—ブロモピルビン酸による生育阻害を示す図である。
図 2は、 ァスパラギン酸一 3—ヒドラジドによる生育阻害を示す図である。 図 3は、 D L—スレオー /3—ヒドロキシァスパラギン酸による生育阻害を示す図 である。
図 4は、 3—ブロモピルビン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図である。 図 5は、 ァスパラギン酸一 ^一ヒドラジドに対する阻害回復物質の効果を示す図 である。
図 6は、 D L—スレオー 3—ヒドロキシァスパラギン酸に対する阻害回復物質の 効果を示す図である。
図 7は、 生育に与える生育回復因子の影響を示す図である。 図 8は、 生育阻害物質のホスホェノールピルビン酸力ルボキシラーゼ活性に対す る阻害を示す図である。
図 9は、 本発明のホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼのァスパラギン酸 による阻害を示す図である。
図 1 0は、 本発明のホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼのァスパラギン 酸による阻害を示す図。
図 1 1は、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ遺伝子に変異を導入する 方法を示す図である。
図 1 2は、 野生型及び変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ （N— 末端から 4 3 8番目のアルギニンをシスティンに置換したもの） の活性にァスパ ラギン酸が与える影響を示す図である。
図 1 3は、 野生型及び変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ （N— 末端から 6 2 0番目のリジンをセリンに置換したもの） の活性にァスパラギン酸 が与える影響を示す図である。 a ) は b ) の横軸 （Lーァスパラギン酸の濃度） を拡大したものである。 発明を実施するための最良の形態 以下に、 実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。 実施例 1 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の取得 すでにクローニングされ、 塩基配列も決定されているホスホエノ一ルビルビン 酸カルボキシラーゼ遺伝子をベクタープラスミ ド pBR322の sail部位に挿入して得 られたプラスミ ド p S 2を用いて、 変異型遺伝子の作製を行った。 p S 2は、 薬 剤耐性マーカー遺伝子として、 アンピシリン耐性遺伝子を有する （Sabe, H. et al. , Gene, 31, 279-283, 1984) 。 尚、 p S 2が保持するホスホエノ一ルビルビ ン酸カルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列は、 前述のプラスミ ド p T 2が保持する ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と同一である。
p S 2 D N Aを、 ヒドロキシルアミン処理溶液 （2 0 ; g Zm l p S 2 D N A. 0. 05M リン酸ナトリウム （pH6.0) 、 ImM ED TA、 0. 4 Mヒドロキシ ルァミン） で、 75 、 2時間処理した。 ヒドロキシルァミン処理は、 pHの影 響を受けるので、 水酸化ナトリウムで pHを 6. 0に調整した 1Mヒドロキシル ァミン · HC 1、 1 mM EDTA溶液 80 1と、 0. 1M リン酸ナトリゥム (pH6.0) 、 ImM £0丁 溶液100 1と、 2 gの pS 2DNAを含む TE (lOmM Tris-HCK ImM EDTA)緩衝液とを混合し、 最終的に水で 200 1と しフ
上記条件は、 処理後の p S 2でェシヱリヒア 'コリ HB 101を形質転換した ときに、 アンピシリン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の 0. 2%とな る条件である。
ヒドロキシルアミン処理した p S 2でェシヱリヒア 'コリ HB 101を形質転 換し、 アンピシリンを含む平板培地に塗布し、 約 10000コロニーの形質転換 体を得た。 これらを液体培地に懸濁し、 ァスパラギン酸のアナログ化合物である 3—ブロモピルビン酸 （3 BP)、 ァスパラギン酸一; 8—ヒドラジド （AHY)、 DL—スレオ—； 3—ヒドロキシァスパラギン酸 （^HA) のいずれかを最小阻止 濃度付近の濃度で含む平板培地に、 培地 1枚あたり 103〜105個となるように 塗布し、 生育するコロニーを選択した。
こうして得られたアナログ化合物耐性株 100株から、 The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970に記載の方法に準じて、 各々の生産するホス ホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、 アナログ化合物による活性 阻害を調べた。 酵素活性の測定は、 前記と同様にして行った。
さらに、 アナ口グ化合物により活性を阻害されな L、変異型酵素を生産する菌株 からプラスミ ドを単離し、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異 株であるェシエリヒア 'コリ P CR 1 (Sabe, H. et al. , Gene, 31, 279-283, 1984) に導入し、 変異型酵素を産生することを確認した。
こうして、 変異型酵素遺伝子を有する 5株の形質転換体を得た。 これらの遺伝 子の塩基配列を決定した結果、 2株については同一の変異を有しており、 4種類 の変異型遺伝子が得られた。 これらを保持する形質転換体は、 A J 12907、 A J 12908, A J 12909 A J 12910と命名され、 平成 5年 8月 3 日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば市 東一丁目 1番 3号） に、 各々順に FERM P— 13774、 FERM P— 13 775、 FERM P— 13776、 FERM P— 13777として寄託されて おり、 平成 6年 7月 1 1日に、 この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託 へ移管され、 受託番号 FERM BP- 4734、 FERM BP- 4735、 FERM BP- 4736、 FERM BP- 4737として寄託されている。 また、 これらの保持するプラスミ ドは、 各々順に pBP 5、 HA 19、 p BP 122、 pR 6と名付けた。 各々のプラスミ ドに 含まれるホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が有する変異を、 表 2に示す。 表中の数字は、 配列番号 1におけるヌクレオチド番号またはアミノ酸 番号を表す。 表 2
Figure imgf000024_0001
尚、 AJ 12907、 AJ 12909は、 500 ug/m lの 3 BPを含む培 地で、 AJ 12908は、 1000〃g_ m lの) S HAを含む培地で、 A J 12 910は、 500〃 g/m 1の AH Yを含む培地で選択されたものである。 実施例 2 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ 上記 4株の形質転換体の産生するホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ について、 ァスパラギン酸に対する感受性を調べた。 これらの菌株は、 宿主由来 のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損しているので、 産生 するホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 プラスミ ド由来のものであ ァスパラギン酸に対する感受性は、 既知の方法 （Yoshinaga, T. , Izui，K and Katsuki, H. J. Biochem. , 68, 747-750(1970)) に従って調べた。 すなわち、 活性測 定系中に、 活性に影響することが知られているァセチルコェンザィム Aを 0 . 1 mMあるいは I mMの濃度で存在させて、 各形質転換体及び p S 2を保持する大 腸菌が産生する酵素の活性を測定したところ、 ァスパラギン酸に対する感受性は、 図 9、 1 0のように測定された。
この結果から、 ァスパラギン酸が高濃度になると、 野生型の酵素は活性を失う のに対し、 本発明の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 活性 を実質的に保持し続けていることが明らかである。 実施例 3 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入した
ェシヱリヒア ·コリによる Lースレオニンの発酵生産 ェシヱリヒア ·コリのスレオニン生産菌としては B— 3 9 9 6株 （特表平 3- 50 1682号公報） が現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。 そこで変 異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うにあたり、 B— 3 9 9 6を宿主として用いることにした。 この B— 3 9 9 6株は、 Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breedin に Λ 登録番号 RIA 1867 のもとに寄託されている。 また評価する変異型ホスホェノールピルビン 酸カルボキシラーゼとしては p B P 5を選び、 実験に供した。
ェシェリヒア ' コリ B— 3 9 9 6に変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキ シラーゼを持つプラスミ ド p B P 5を、 Hanahan (J. Mol. Biol. , Vol. 106, p577, (1983)) の方法により導入し、 形質転換体を分離した。 対照として、 野生型 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミ ドである p S 2でェシエリヒア 'コリ B— 3996を同様に形質転換した。
ェシヱリヒア ·コリ B— 3996及びその形質転換体を、 それぞれ表 3の組成 の培地 2 Om 1を注入した 500m l坂口フラスコに接種して 37°Cにて 40時 間培養し、 Lースレオニンの生産量を調べたところ、 表 4に示す結果を得た。 尚、 前記培地は、 グルコースと MgS04 ' 7H20、 及びそれ以外の成分とに 2分し、 KOHで pH7.0 に調整した後に、 1 1 5 で 10分間オートクレープし、 これら を混合した後に別殺菌した C a C03を 30 g/ 1添加した。 表 3
Figure imgf000026_0001
表 4
Figure imgf000026_0002
この結果から明らかなように、 本発明の D N A配列を有する変異型酵素発現プ ラスミ ドを保持するェシヱリヒア 'コリ B— 3996は、 野生型酵素を発現する プラスミ ドを保持するェシヱリヒア ·コリ B— 3996よりもスレオニン生産能 が向上した。 実施例 4 変異型ホスホエノ一ルピルビン酸カルボキシラ一ゼを導入した
ェシヱリヒア ·コリによる L—グル夕ミン酸の発酵生産 ェシヱリヒア 'コリ グルタミン酸生産菌としては、 特開平 4— 1 1461号公 報に示されるェシヱリヒア 'コリ A J 12628が、 現在知られている內で最も 高い生産能力を持っている。 そこで変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシ ラーゼを評価するにあたり、 A J 12628を宿主として用いることにした。
A J 12628株は、 工業技術院生命工学工業技術研究所に登録番号 F ERM BP— 3853のもとに寄託されている。 また評価する変異型ホスホエノールビ ルビン酸カルボキシラーゼとしては p BP 5を選び、 実験に供した。
ェシヱリヒア ·コリ AJ 12628に変異型ホスホェノールピルビン酸カルボ キシラーゼを持つプラスミ ド pBP 5を、 Hanahan (J. ol. Biol. Vol.106, p577, 1983)の方法により導入し、 形質転換体を分離した。 同様に、 p S 2による ェシヱリヒア .コリ A J 12628の形質転換体を分離した。
ェシヱリヒア ·コリ A J 12628及びその形質転換体を、 それぞれ表 5の組 成の培地 20m 1を注入した 500m l坂口フラスコに接種して 37てにて 36 時間培養し、 L一グルタミン酸の生産量を調べたところ、 表 6に示す結果を得た。 尚、 前記培地は、 グルコースと MgS04 ' 7H20、 及びそれ以外の成分とに 2 分し、 1 011で 117.() に調整した後に、 1 15てで 10分間オートクレープし、 これらを混合した後に別殺菌した C a C03を 30 g/ l添加した。 表 5
Figure imgf000028_0001
表 6
Figure imgf000028_0002
この結果から明らかなように、 本発明の D N A配列を有する変異型酵素発現プ ラスミ ドを保持するェシヱリヒア 'コリ A J 1 2 6 2 8は、 野生型酵素を発現す るプラスミ ドを保持するェシヱリヒア 'コリ A J 1 2 6 2 8よりもグルタミン酸 生産能が向上した。 実施例 5 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入した コリネホルム細菌によるリジンの生産 変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させるために、 ブレビバクテ リウム属細菌由来のプロモーターの取得を行い、 変異型遺伝子に連結し、 発現型 プラスミ ドを作製した。 さらに、 これをブレビバクテリゥム属細菌に導入し、 L 一リジンの製造を行った。
< 1〉ブレビパクテリゥム属細菌由来ァスパルトキナーゼ （A K ) 遺伝子の取得 ブレビパクテリゥム ·ラクトフアーメンタム （コリネバクテリゥム ·グルタミ カム） 野生株 ATCC13869株より常法に従い、 染色体 DNAを調製した。 染色体 DNAより PCR polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trends Genet. 5, 185 (1989)参照） により A K遺伝子を増幅した。 増幅に用いた DNAプライマーはコリネ バクテリゥム ·グルタミカムにおいて既知となっている配列 （Molecular
Microbiology(1991)5(5), 1197-1204， Mol. Gen. Genet. (1990)224, 317- 324参照) を 基にして A K遣伝子をコードする約 1643bpの領域を増幅すべく、 23merのオリゴヌ クレオチド （配列番号 2 ) 及び 21merのォリゴヌクレオチド （配列番号 3 ) を合成 した。
D N Aの合成は、 Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 380Bを使用し、 ホスホアミダイト法 (Tetrahedron Letters(1981), 22， 1859参照) を用いて、 常法 に従って合成した。 PCR反応は、 宝酒造 （株）製 D N Aサ一マルサイクラ一
PJ2000型を用い、 TaqDMポリメラーゼを用い、 供給者により指定された方法に従 つて遺伝子増幅を行なった。
増幅した 1643kbの遺伝子断片をァガロースゲル電気泳動により確認した後、 ゲ ルより切り出した該断片を常法により精製し、 制限酵素 Nrul (宝酒造 （株） 製） 及び EcoRI (宝酒造 （株） 製） にて切断した。 遺伝子断片のクローン化用ベクター には PHSG399 (Takeshita, S. et al. ； Gene(1987)， 61, 63- 74参照） を用いた。
PHSG399を制限酵素 Smal (宝酒造 （株）製） 及び制限酵素 EcoRIにて切断し、 増幅 した A K遺伝子断片と接続した。
D N Aの接続は D N Aライゲーシヨンキット （宝酒造 （株） 製） を用い、 指定 された方法にて行なった。 この様にして PHSG399にブレビバクテリゥム染色体より 増幅された A K遺伝子断片の接続されたプラスミ ドを作製した。 野生株である ATCC13869由来の A K遺伝子を有するプラスミ ドを p399AKYと命名した。
< 2 >ブレビバクテリゥム ·ラクトファーメンタムの A K遺伝子の塩基配列の決 AKプラスミ ド P399AKYを調製し、 A K遺伝子の塩基配列の決定を行なった。 塩 基配列の決定はサンガーらの方法 （F. Sanger et al.： Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463(1977)などがある） によった。 結果を配列番号 4及び 5に示す。 同 DNA 断片は 2つのオープン ' リーディング 'フレームをもち、 これらはおのおの、 A Kのなサブュニッ卜と /3サブュニッ卜に対応する。 配列番号 5及び 7は、 各々の オープン · リーディング ·フレームに対応するアミノ酸配列をヌクレオチド配列 とともに示したものである。 さらに、 各々のオープン · リーディング ·フレーム に対応するァミノ酸配列のみを配列番号 6及び配列番号 7に示す。
< 3 >ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミ ドの作製 野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミ ドである p S 2、 及び取得した変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラー ゼ遣伝子を保持するプラスミ ドである p BP 5より、 ホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子を含む約 4. 4 kbの Sail断片を抽出し、 大腸菌に汎用 されているプラスミ ドベクター pHSG 399の Sailサイトに導入した。 作製し たプラスミ ドを、 野生型を pHS 2、 変異型を pHBP 5と各々命名した。
pHS 2および p HBP 5をブレビバクテリゥム中で発現するプラスミ ドとす ベく、 ブレビパクテリゥム中で機能するプロモーター、 及びプラスミ ドの複製起 点の導入を行った。 プロモーターとしては、 クローン化した AK遺伝子のプロモ —ター領域と推定される、 塩基配列の 1番目の Nrulサイ卜から 207番目の
ApaLIサイトまでを含む遺伝子断片を P399AKYより抽出し、 pHS 2および pHB P 5の構造遺伝子の約 60 b p手前にある Avalサイトに転写方向が順方向となる よう挿入した。
更に、 ベクタ一上にあるサイトにブレビパクテリゥム中でプラスミ ドの自律増 殖を可能にする遺伝子断片、 すなわちプラスミ ドの複製起点を導入した。 プラス ミ ドの複製起点を含む遺伝子断片は、 ブレビパクテリゥム用ベクター pHC 4 (特開平 5— 7491号公報段落番号 10参照、 同プラスミ ドを保持するェシェ リヒア ·コリ AJ12036は工業技術院微生命工学工業技術研究所に寄託されており、 寄託番号 FERM P12215が付されている） より抽出し、 両末端の制限酵素部位をリン カーの導入により Pstlサイ卜に改変した。 この断片を、 ブレビパクテリゥムのプロモータ一を付加したプラスミ ドの、 ベ クタ一部分である Pstlサイ卜に導入した。 構築した発現型ホスホエノ一ルビルビ ン酸カルボキシラーゼプラスミ ドを、 p S 2に由来する野生型ホスホエノールビ ルビン酸カルボキシラーゼプラスミ ドを pHS 2B、 p BP 5に由来する変異型 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミ ドを pHBP 5 Bと各々命 名した。
< 4〉ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミ ドを用いた L -リジンの生産
作成した pHS 2B、 pHBP 5Bを各々ブレビバクテリウム 'ラクトファー メンタム L—リジン生産菌である A J 3463 (特公平 51- 34477号公報参照） に 導入した。 遺伝子の導入は、 電気パルスを用いた形質転換法を用いた （特開平 2 - 207791号公報参照） 。 宿主及び形質転換体を表 7の組成のリジン生産培 地にて 72時間、 31. 5 にて振蘯培養を行った。前記培地は、 表に記載の成 分のうち C a C03以外を 1 1の水に添加し、 K0Hを用いて pH8.0に調整後、 115 、 15分間オートクレープした後、 乾熱滅菌した C a C03をさらに添加して調製した 培養後の培地中の L—リジンの蓄積量を表 8に示す。 表 7
Figure imgf000031_0001
表 8
Figure imgf000032_0001
この結果に示されるように、 本発明の D N A配列を有する変異型酵素発現ブラ スミ ドを保持するブレビバクテリゥム ·ラク トファーメンタム A J 3463は、 野生型酵素を発現するプラスミ ドを保持するブレビバクテリゥム ·ラク トファー メンタム AJ 3463よりもリジン生産能が向上した。 実施例 6 本発明の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ
及びその遺伝子の他の実施例
< 1 >変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の作成
変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする D N Aを作製 するにあたって、 材料としてプラスミ ド pT 2にクローニングされたホスホエノ 一ルピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を用いた。
このプラスミ ド pT 2を保持させる宿主は、 プラスミ ド由来のホスホェノール ピルビン酸カルボキシラーゼのみの活性を検出するために、 ホスホェノールピル ビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が欠損していることが好ましい。 このような欠損 株として大腸菌 F 15 (Hir,recAl,met， Δ(ρρ。- argECBH),TnlO) を用い、 これに pT2を保持させた大腸菌 F 15株 （A J 12873) は、 平成 5年 7月 15日 に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305 日本国茨城県つくば市東 一丁目 1番 3号） に、 FERM P- 13752として寄託されており、 平成 6年 7月 11日に、 この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、 受 託番号 FERM BP- 4732として寄託されている。 また p T 2の全塩基配列を、 配列番 号 1に示す。 pT2を用い、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ遺伝子の 438番 目のアルギニンのコドンをシスティンのコドンに置換するには、 PCR
(Polymerase Chain Reaction)法を禾讀した Overlapping Extension法 (Ho. S. N. , Hunt, H. D. , Horton, R， M. , Pullen, J. K. and Pease, L. R. , Gene, 77, 51-59(1989)) を用いた。
尚、 PCR法は、 二本鎖 DN Aの一本鎖 DN Aへの熱変性、 増幅を目的とする 部位の両端の配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマ一と前記熱変性 DN A とのァニーリング、 前記オリゴヌクレオチドをプライマーとしたポリメラ一ゼ反 応からなる増幅サイクルを繰り返すことにより、 前記 DN A配列を指数関数的に 増幅する方法である。
PCR法による部位特異的変異を行った領域を図 11に示す。 本発明において 用いたプライマーは、 438番目のアルギニンのコドンの前後の配列を有するプ ライマー c (配列番号 11 ：配列番号 1中塩基番号 1535〜 1554に相当） 、 このプライマー cと相補的な配列を有するプライマー b (配列番号 10) 、 これ らよりも上流側の配列を有するプライマー a (配列番号 9 ：配列番号 1中塩基番 号 1185〜1200に相当） 、 下流側の配列に相補的な配列を有するプライマ 一 d (配列番号 12 ：配列番号 1中塩基番号 2327〜2342に相当） の 4種 める o
プライマー b及びプライマー cは、 438番目のアルギニンのコドン （CGT) をシスティンのコドン （TGT) に換えてある。 この置換は、 他のシスティンの コドンである TGCでもよい。 また、 435番目のァスパラギンのコドン （AA C) の 3文字目の Cを Tに置換してあり、 アミノ酸を置換せずに內部に EcoRI部位 が導入されるので、 これを指標に変異プラスミ ドの選択ができるが、 この変異は 本発明に必須なものではな 、。
pT 2DNAを铸型とし、 プライマー a及びプライマー bをプライマーに用い て PCR反応を行うと、 変異部位の上流から変異部位までの断片 （図 11中 AB 断片） が増幅される。 また、 プライマー c及びプライマ一 dを用いて PCR反応 を行うと、 変異部位から下流の断片 （図 11中 CD断片） が増幅される。 各々の 増幅産物 （AB、 CD) を熱変成後、 再びァニールさせ、 ポリメラ一ゼ反応を行 うと、 これらが連結した断片 （図 11中 AD断片） が得られる。 尚、 PCR反応 は、 94てで 1分間加熱した後、 変成 （94 、 1. 5分） 、 アニーリング (50 、 2分） 、 ポリメラーゼによる伸長反応 （72°C、 3. 5分） からなる サイクルを 30回行うことにより行った。 また、 反応組成を表 9に示す。 表 9
P C R 断片 組 成
(( )内は終濃度を表す） AB CD AD
H20 53.5 53.5 53.5
10倍反応緩衝液 10 10 10
1. 25mM dNTP 混合液 16 16 16
20 プライマー a (1 ^M) 5 5
20 αΜプライマー b ( 1〃M) 5
20 t Mプライマー c ( 1 μΜ) 5
20 αΜプライマー d (1 βΜ) 5 5
10〃 g/ 1 ρ Τ 2 (0. 1〃 g) 10 10
PCR断片 AB * 5
PCR断片 CD * 5
2. 5 υ μ 1 T a Qポリメラーゼ 0.5 0.5 0.5 合 計 量 100 1 100〃 1 100^ 1
*： P CR断片 AB、 CDは、 P CR反応後、 その内の 10〃 1をポリアク リルアミ ドゲルより回収し、 5〃 1の TE (lOmM Tris-HCl (pH8.0)) , ImM EDTA (pH8. 0) に溶解したもの 上記のようにして得られた AD断片は、 上流側に BssHII部位 （配列番号 1中 1 231〜 1236 )が、 下流側に Spll (配列番号 1中 2249〜 2254)部位 が存在しているので、 これらの酵素で完全消化し、 プラスミ ド pT 2の対応する 領域と置換した （図 11)。 く 2〉阻害解除型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択
上記で得られたプラスミ ドで大腸菌を形質転換し、 形質転換株を培養してブラ スミ ドを回収し、 EcoRIで切断されるものを選択した。 選択された D N Aについて, 上記 P C R法で増幅した領域の塩基配列をジデォキシ法で決定し、 目的どおりの 塩基置換が導入されている事を確認した。 このプラスミ ドを p T 2 R 4 3 8 Cと 命名した。 このプラスミ ドを前述の大腸菌 F 1 5株に導入した株 （A J 1 2 8 7 4 ) は、 平成 5年 7月 1 5日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に、 F E RM P— 1 3 7 5 3と して寄託されており、 平成 6年 7月 1 1日に、 この原寄託からブダペスト条約に 基づく国際寄託へ移管され、 受託番号 FERM BP- 4733として寄託されている。
P T 2 R 4 3 8 Cの塩基配列は、 配列番号 1において、 1 5 4 1番目及び 1 5 5 0番目のヌクレオチドが、 各々 Cから Tに置換された配列である。
< 3 >変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼのァスパラギン酸によ る阻害解除の確認
前述の p T 2 R 4 3 8 Cを持つ大腸菌 F 1 5株 （A J 1 2 8 7 4 ) の産生する ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼについて、 ァスパラギン酸に対する 感受性を調べた。 尚、 前述したように、 大腸菌 F 1 5株はホスホェノールピルビ ン酸カルボキシラーゼを欠損しているので、 A J 1 2 8 7 4の産生するホスホェ ノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 プラスミ ド由来のものである。
ァスパラギン酸に対する感受性は、 既知の方法 （Yoshinaga, T.， Izui, K and Katsuki, H. J. Biochem. , 68, 747-750(1970)) に従って調べた。 すなわち、 活性測 定系中に、 活性に影響する事が知られているァセチルコェンザィム Aを 1 mM、 2 mMの濃度で存在させて、 酵素活性を測定したところ、 ァスパラギン酸に対す る感受性は、 図 1 2のように測定された。
ァスパラギン酸が高濃度になると、 野生型の酵素は活性を実質的に失うのに対 し、 本発明の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 活性を保持 し続けている事が明らかである。
< 4 >変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の作成 （その 2 ) プラスミ ド p T 2上に搭載されているホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ ーゼ遺伝子の 6 2 0番目のリジンのコドンをセリンのコドンに置換するには、 P C R (Polymerase Chain Reaction) 法を利用した Overlapping Extension法 (Ho, S. N. . Hunt, H. D.， Horton, R, M. , Pullen, J. K. and Pease, L R. , Gene, 77, 51-59 (1989)) を用いた。 具体的な手法は、 < 1〉で述べた方法に準じる。 目的の置換 がなされた変異型遺伝子を搭載するプラスミ ドを p T 2 K 6 2 0 Sと命名した。 また、 得られた変異型酵素を K 6 2 0 S変異型酵素と命名した。
< 5〉変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼのァスパラギン酸によ る阻害解除の確認
プラスミ ド p T 2 K 6 2 0 Sが前述の大腸菌 F 1 5株に導入されて得られる形 質転換株の産生するホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼについて、 ァス パラギン酸に対する感受性を調べた。 尚、 前述したように、 大腸菌 F 1 5株はホ スホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼを欠損しているので、 該形質転換株の 産生するホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 プラスミ ド由来のもの である。
ァスパラギン酸に対する感受性は、 既知の方法 （Yoshinaga, Τ. , Izui, K and Katsuki, H. J. Biochem. , 68, 747-750(1970)) に従って調べた。 すなわち、 活性測 定系中に、 活性に影響する事が知られているァセチルコェンザィム Aを 1 mMの 濃度で存在させて、 酵素活性を測定したところ、 ァスパラギン酸に対する感受性 は、 図 1 3のように測定された。 図 1 3において、 a ) (i b ) の横軸 （L—ァス パラギン酸の濃度） を拡大したものである。
ァスパラギン酸が高濃度になると、 野生型の酵素は活性を実質的に失うのに対 し、 本発明の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼは、 活性を保持 し続けている事が明らかである。
図 1 3には、 6 5 0番目のリジンがセリンに置換された変異型ホスホェノール ピルビン酸カルボキシラーゼ （K 6 5 O A変異型酵素） と、 4 9 1番目のリジン がセリンに置換された変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ ( K 4 9 1 A変異型酵素） のァスパラギン酸に対する感受性も記されている。 こ れらの変異型酵素は、 ァスパラギン酸による阻害が解除されなかった。 産業上の利用可能性 本発明の D N A配列は、 変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼを コードし、 この D NA配列を保持する微生物は、 前記酵素を産生する。
本発明の変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼは、 ァスパラギン 酸による活性阻害を実質的に受けないので、 ァスパラギン酸により生合成の調節 を受けるァミノ酸の懾酵生産等に利用することができる。
配列表 配列番号： 1
配列の長さ ： 5186
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：環状
配列の種類：他の核酸 Genomic DNA及びベクター
起源
生物名：ェシヱリヒア · コリ（Escherichia coli)
株名：
配列の特徴： CDS
存在位置： 237. . 2888
配列
TCGACCGGCG ATTTTTTAAC ATTTCCATAA GTTACGCTTA TTTAAAGCGT CGTGAATTTA 60 ATGACGTAAA TTCCTGCTAT TTATTCGTTT GCTGAAGCGA TTTCGCAGCA TTTGACGTCA 120 CCGCTTTTAC GTGGCTTTAT AAAAGACGAC GAAAAGCAAA GCCCGAGCAT ATTCGCGCCA 180 ATGCGACGTG AAGGATACAG GGCTATCAAA CGATAAGATG GGGTGTCTGG GGTAAT 236 ATG AAC GAA CAA TAT TCC GCA TTG CGT AGT AAT GTC AGT ATG CTC GGC 284 Met Asn Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly
1 5 10 15
AAA GTG CTG GGA GAA ACC ATC AAG GAT GCG TTG GGA GAA CAC ATT CTT 332 Lys Val Leu Gly Glu Thr lie Lys Asp Ala Leu Gly Glu His l ie Leu
20 25 30
GAA CGC GTA GAA ACT ATC CGT AAG TTG TCG AAA TCT TCA CGC GCT GGC 380 Glu Arg Val Glu Thr l ie Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly
35 40 45
AAT GAT GCT AAC CGC CAG GAG TTG CTC ACC ACC TTA CAA AAT TTG TCG 428 Asn Asp Ala Asn Ar Gin Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser
50 55 60 AAC GAC GAG CTG CTG CCC GTT GCG CGT GCG TTT AGT CAG TTC CTG AAC 476 Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gin Phe Leu Asn
65 70 75 80
CTG GCC AAC ACC GCC GAG CAA TAC CAC AGC ATT TCG CCG AAA GGC GAA 524 Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gin Tyr His Ser l ie Ser Pro Lys Gly Glu
85 90 95
GCT GCC AGC AAC CCG GAA GTG ATC GCC CGC ACC CTG CGT AAA CTG AAA 572 Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val lie Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
100 105 110
AAC CAG CCG GAA CTG AGC GAA GAC ACC ATC AAA AAA GCA GTG GAA TCG 620 Asn Gin Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr He Lys Lys Ala Val Glu Ser
115 120 125
CTG TCG CTG GAA CTG GTC CTC ACG GCT CAC CCA ACC GAA ATT ACC CGT 668 Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu l ie Thr Arg
130 135 140
CGT ACA CTG ATC CAC AAA ATG GTG GAA GTG AAC GCC TGT TTA AAA CAG 716 Arg Thr Leu He His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gin
145 150 155 160
CTC GAT AAC AAA GAT ATC GCT GAC TAC GAA CAC AAC CAG CTG ATG CGT 764 Leu Asp Asn Lys Asp l ie Ala Asp Tyr Glu His Asn Gin Leu Met Arg
165 170 175
CGC CTG CGC CAG TTG ATC GCC CAG TCA TGG CAT ACC GAT GAA ATC CGT 812 Arg Leu Arg Gin Leu l ie Ala Gin Ser Trp His Thr Asp Glu l ie Arg
180 185 190
AAG CTG CGT CCA AGC CCG GTA GAT GAA GCC AAA TGG GGC TTT GCC GTA 860 Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val
195 200 205
GTG GAA AAC AGC CTG TGG CAA GGC GTA CCA AAT TAC CTG CGC GAA CTG 908 Val Glu Asn Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu
210 215 220
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596 096 5SS
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Ο^ΐ 9XV 309 131 000 OVO 113 VOl OVO OVX 301 100 OVX 310 000 VV9 001
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S9£IO/^6dT/I3d fII90/S6 OAV TGT TTC GGC GTA CCG CTG GTC CGT ATT GAT ATC CGT CAG GAG AGC ACG 1436
Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg l ie Asp lie Arg Gin Glu Ser Thr
385 390 395 400
CGT CAT ACC GAA GCG CTG GGC GAG CTG ACC CGC TAC CTC GGT ATC GGC 1484
Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly lie Gly
405 410 415
GAC TAC GAA AGC TGG TCA GAG GCC GAC AAA CAG GCG TTC CTG ATC CGC 1532
Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gin Ala Phe Leu l ie Arg
420 425 430
GAA CTG AAC TCC AAA CGT CCG CTT CTG CCG CGC AAC TGG CAA CCA AGC 1580
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser
435 440 445
GCC GAA ACG CGC GAA GTG CTC GAT ACC TGC CAG GTG ATT GCC GAA GCA 1628
Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gin Val l ie Ala Glu Ala
450 455 460
CCG CAA GGC TCC ATT GCC GCC TAC GTG ATC TCG ATG GCG AAA ACG CCG 1676
Pro Gin Gly Ser lie Ala Ala Tyr Val l ie Ser Met Ala Lys Thr Pro
465 470 475 480
TCC GAC GTA CTG GCT GTC CAC CTG CTG CTG AAA GAA GCG GGT ATC GGG 1724
Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly lie Gly
485 490 495
TTT GCG ATG CCG GTT GCT CCG CTG TTT GAA ACC CTC GAT GAT CTG AAC 1772
Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn
500 505 510
AAC GCC AAC GAT GTC ATG ACC CAG CTG CTC AAT ATT GAC TGG TAT CGT 1820
Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gin Leu Leu Asn lie Asp Trp Tyr Arg
515 520 525
GGC CTG ATT CAG GGC AAA CAG ATG GTG ATG ATT GGC TAT TCC GAC TCA 1868
Gly Leu l ie Gin Gly Lys Gin Met Val Met lie Gly Tyr Ser Asp Ser
530 535 540 GCA AAA GAT GCG GGA GTG ATG GCA GCT TCC TGG GCG CAA TAT GAG GCA 1916
Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gin Tyr Gin Ala
545 550 555 560
CAG GAT GCA TTA ATC AAA ACC TGC GAA AAA GCG GGT ATT GAG CTG ACG 1964
Gin Asp Ala Leu l ie Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly l ie Glu Leu Thr
565 570 575
TTG TTC CAC GGT CGC GGC GGT TCC ATT GGT CGC GGC GGC GCA CCT GCT 2012
Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser He Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala
580 585 590
CAT GCG GCG CTG CTG TCA CAA CCG CCA GGA AGC CTG AAA GGC GGC CTG 2060
His Ala Ala Leu Leu Ser Gin Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595 600 605
CGC GTA ACC GAA CAG GGC GAG ATG ATC CGC TTT AAA TAT GGT CTG CCA 2108
Arg Val Thr Glu Gin Gly Glu Met l ie Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
610 615 620
GAA ATC ACC GTC AGC AGC CTG TCG CTT TAT ACC GGG GCG ATT CTG GAA 2156
Glu He Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala lie Leu Glu
625 630 635 640
GCC AAC CTG CTG CCA CCG CCG GAG CCG AAA GAG AGC TGG CGT CGC ATT 2204
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg l ie
645 650 655
ATG GAT GAA CTG TCA GTC ATC TCC TGC GAT GTC TAC CGC GGC TAC GTA 2252
Met Asp Glu Leu Ser Val lie Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670
CGT GAA AAC AAA GAT TTT GTG CCT TAC TTC CGC TCC GCT ACG CCG GAA 2300
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu
675 680 685
CAA GAA CTG GGC AAA CTG CCG TTG GGT TCA CGT CCG GCG AAA CGT CGC 2348
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg
690 695 700 098 558 058 ΐ^Λ 3JV OJJ dsy OJJ ηΐ ^ ηχο sAq BTV uxg 3iy 3』v
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配列の長さ ： 883
配列の型：アミノ酸
配列
Met Asn Glu Gin Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly
1 5 10 15
Lys Val Leu Gly Glu Thr lie Lys Asp Ala Leu Gly Glu His lie Leu
20 25 30
Glu Arg Val Glu Thr lie Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly
35 40 45
Asn Asp Ala Asn Arg Gin Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gin Asn Leu Ser
50 55 60
Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gin Phe Leu Asn
65 70 75 80
Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gin Tyr His Ser lie Ser Pro Lys Gly Glu
85 90 95 Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val lie Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
100 105 110
Asn Gin Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr l ie Lys Lys Ala Val Glu Ser
115 120 125
Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu lie Thr Arg
130 135 140
Arg Thr Leu He His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gin 145 150 155 160
Leu Asp Asn Lys Asp He Ala Asp Tyr Glu His Asn Gin Leu Met Arg
165 170 175
Arg Leu Arg Gin Leu lie Ala Gin Ser Trp His Thr Asp Glu lie Arg
180 185 190
Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val
195 200 205
Val Glu Asn Ser Leu Trp Gin Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu
210 215 220
Asn Glu Gin Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe 225 230 235 240
Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
245 250 255
Pro Asn Val Thr Ala Asp lie Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg
260 265 270
Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp He Gin Val Leu Val Ser
275 280 285
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly
290 295 300
Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg 305 310 315 320
Ser Arg Leu Met Ala Thr Gin Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly
325 330 335 Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gin Asn Glu Glu Leu
340 345 350
Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gin Ser Leu Gin Ala Cys Gly Met
355 360 365
Gly lie lie Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
370 375 380
Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg lie Asp lie Arg Gin Glu Ser Thr 385 390 395 400
Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly He Gly
405 410 415
Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gin Ala Phe Leu lie Arg
420 425 430
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gin Pro Ser
435 440 445
Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gin Val l ie Ala Glu Ala
450 455 460
Pro Gin Gly Ser He Ala Ala Tyr Val l ie Ser Met Ala Lys Thr Pro 465 470 475 480
Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly lie Gly
485 490 495
Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn
500 505 510
Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gin Leu Leu Asn lie Asp Trp Tyr Arg
515 520 525
Gly Leu l ie Gin Gly Lys Gin Met Val Met lie Gly Tyr Ser Asp Ser
530 535 540
Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gin Tyr Gin Ala 545 550 555 560
Gin Asp Ala Leu lie Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly l ie Glu Leu Thr
565 570 575 Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser lie Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala
580 585 590
His Ala Ala Leu Leu Ser Gin Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595 600 605
Arg Val Thr Glu Gin Gly Glu Met l ie Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
610 615 620
Glu lie Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala lie Leu Glu 625 630 635 640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg lie
645 650 655
Met Asp Glu Leu Ser Val lie Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu
675 680 685
Gin Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg
690 695 700
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala He Pro Trp lie Phe Ala 705 710 715 720
Trp Thr Gin Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr
725 730 735
Ala Leu Gin Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gin Ser Glu Leu Glu Ala
740 745 750
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu
755 760 765
Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gin
770 775 780
Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn 785 790 795 800
Leu Gin Glu Glu Asp l ie Lys Val Val Leu Ala lie Ala Asn Asp Ser
805 810 815 His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp lie Ala Glu Ser He Gin Leu Arg
820 825 830
Asn lie Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gin Ala Glu Leu Leu His
835 840 845
Arg Ser Arg Gin Ala Glu Lys Glu Gly Gin Glu Pro Asp Pro Arg Val
850 855 860
Glu Gin Ala Leu Met Val Thr lie Ala Gly lie Ala Ala Gly Met Arg 865 870 875 880
Asn Thr Gly 配列番号： 3
配列の長さ ： 23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23 配列番号： 4
配列の長さ ： 21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジニ：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21 配列番号： 5
配列の長さ ： 1643 QL S9 09 99 nsq naq apj dsy Sjy BTV OJJ OJJ IBA oid "sy I^A BTV Βΐν
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- 8 -
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Thr Ala Gly Glu Arg l ie Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala He Glu
75 80 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522
Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570
Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg l ie Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618
Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys l ie Cys l ie Val Ala
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666
Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714
Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762
Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810
Asp Pro Arg l ie Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858
Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys l ie Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906
Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Ar
215 220 225 230
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- TS -
S9CI0/f6df/IDd WI90/S6 OAV Lys lie Cys lie Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu lie Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg lie Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys He Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 lie Ala Gly Ser Met Glu Asp lie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly lie
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu lie Asn lie Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320
Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365 Arg Asp Val Asn Val Asn lie Glu Leu l ie Ser Thr Ser Glu He Arg
370 375 380
l ie Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420 配列番号： Ί
配列の長さ ： 1643
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配歹 IJの種類： genomic DNA
起源
生物名：コリネハ、、クテリゥム ク、、ル夕ミカム (Corynebacterium glutamicum)
株名： ATCC13869
配列の特徴： mat peptide
存在位置： 964. . 1482
特徴を決定した方法： S
配列
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008 Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
1 5 10 15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu He Asn lie Asp Met Val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu l ie Leu Lys Lys
65 70 75
CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC CAG GTC 1248 Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val
80 85 90 95
GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA GGT GTT 1296 Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val
100 105 110 ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC ATC GAA 1344 Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn lie Glu
115 120 125
TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT GAA GAT 1392 Leu lie Ser Thr Ser Glu lie Arg He Ser Val Leu He Arg Glu Asp
130 135 140
GAT CTG GAT GCT GCT GCA CGT GCA TTG CAT GAG CAG TTC CAG CTG GGC 1440 Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly
145 150 155
GGC GAA GAC GAA GCC GTC GTT TAT GCA GGC ACC GGA CGC TAAAGTTTTAA 1490 Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
160 165 170 172
AGGAGTAGTT TTACAATGAC CACCATCGCA GTTGTTGGTG CAACCGGCCA GGTCGGCCAG 1550 GTTATGCGCA CCCTTTTGGA AGAGCGCAAT TTCCCAGCTG ACACTGTTCG TTTCTTTGCT 1610 TCCCCGCGTT CCGCAGGCCG TAAGATTGAA TTC 1643 配列番号： 8
配列の長さ ： 172
配列の型：アミノ酸
配列
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala
1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly lie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu lie Asn lie Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp lie Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu lie Leu Lys Lys Leu
65 70 75 80 Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn He Glu Leu
115 120 125
lie Ser Thr Ser Glu lie Arg lie Ser Val Leu lie Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly 145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170 配列番号： 9
配列の長さ ： 16
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
AAAAACCTGC GTTCTC 16 配列番号： 1 0
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 D N A
配列
TGACTTAAG GTTTACAGGCC 20 配列番号： 1 1
配列の長さ ： 20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
ACTGAATTCC AAATGTCCGC 20 配列番号： 12
配列の長さ ： 16
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成 DNA 配列
AAGTGCAGG CCGTTT 16

Claims

請求の範囲
1 . ェシヱリヒア属に属する微生物由来のホスホエノ一ルビルビン酸カルボキ シラーゼにおいて、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼのァスパラギン 酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有することを特徴とする変異型ホ スホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ。
2 . ェシエリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させたときに、 下記性質を 有する化合物に対する耐性を細胞に付与することを特徴とする請求項 1記載の変 異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ：
野生型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラ一ゼを産生するェシヱリヒア属 に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、
前記生育阻害作用は —グルタミン酸又は Lーァスパラギン酸の存在によって 回復され、 かつ、
野生型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
3 . 前記化合物が、 3—ブロモピルビン酸、 ァスパラギン酸一 ーヒドラジド、 D L—スレオー 一ヒドロキシァスパラギン酸から選ばれることを特徴とする請 求項 2記載の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
4 . 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端から 6 2 5番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異であることを特徴とする請 求項 1記載の変異型ホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼ。
5 . 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端から 2 2 2番目のアルギニンをヒスチジンに、 2 2 3番目のグルタミン酸をリジンに 各々置換させる変異であることを特徴とする請求項 1記載の変異型ホスホエノ一 ルピルビン酸カルボキシラーゼ。
6 . 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端から 2 8 8番目のセリンをフヱ二ルァラニンに、 2 8 9番目のグルタミン酸をリジン に、 5 5 1番目のメチォニンをイソロイシンに、 8 0 4番目のグルタミン酸をリ ジンに各々置換させる変異であることを特徴とする請求項 1記載の変異型ホスホ ェノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
7. 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端から 867番目のァラニンをスレオニンに置換させる変異であることを特徴とする請 求項 1記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ一ゼ。
8. 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラ一ゼの N—末端から 438番目のアルギニンをシスティンに置換させる変異であることを特徴とする 請求項 1記載の変異型ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
9. 前記変異が、 ホスホェノールピルビン酸カルボキシラーゼの N—末端から 620番目のリジンをセリンに置換させる変異であることを特徴とする請求項 1 記載の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ。
10. 請求項 1〜9のいずれか一項に記載の変異型ホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼをコ一ドする DNA断片。
11. 請求項 10記載の DNA断片が染色体 DNA内に組み込まれて形質転換 されたェシエリヒア属またはコリネホルム細菌に属する微生物。
12. 請求項 10記載の DNA断片とェシヱリヒア属細菌またはコリネホルム 細菌の細胞内で自律複製可能なべクター D N Aとを連結してなる組換え D N A。
13. 請求項 12記載の組換え DNAで形質転換されたェシヱリヒア属またはコ リネホルム細菌に属する微生物。
14. 請求項 11又は 13に記載の微生物を好適な培地で培養し、 この培地から L—リジン、 L—スレオニン、 L—メチォニン、 L一イソロイシン、 L—グルタ ミン酸、 L -アルギニン及び L—プロリンから選ばれるァミノ酸を分離すること を特徴とするアミノ酸の製造方法。
PCT/JP1994/001365 1993-08-24 1994-08-17 Allele de phosphenolpyruvate carboxylase, gene de cet allele et procede de production de l'acide amine WO1995006114A1 (fr)

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AT94924384T ATE220099T1 (de) 1993-08-24 1994-08-17 Eine phosphoenolpyruvat-carboxylasevariante, ihr gen und verfahren zur herstellung von aminosäuren
CA002169170A CA2169170C (en) 1993-08-24 1994-08-17 Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid
US08/596,366 US5876983A (en) 1993-08-24 1994-08-17 Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, its gene, and production method of amino acid
SK204-96A SK283369B6 (sk) 1993-08-24 1994-08-17 Mutantná fosfoenolpyruvátkarboxyláza, mikroorganizmus, rekombinantná DNA a spôsob výroby aminokyseliny
BR9407625A BR9407625A (pt) 1993-08-24 1994-08-17 Carboxilase fosfoenolpiruvato mutante fragmento de DNA microorganismo DNA recombinante e processo para produzir aminoácidos
KR1019960700741A KR100337959B1 (ko) 1993-08-24 1994-08-17 돌연변이체포스포에놀피루베이트카복실라제,이의유전자및아미노산의제조방법
PL94313119A PL181380B1 (pl) 1993-08-24 1994-08-17 zmutowana karboksylaze, zrekombinowany DNA, mikroorganizm zawierajacy DNA kodujacy zmutowana karboksylaze, sposób wytwarzania aminokwasu, sposób selekcji E. coli, oraz sposób wytwarzania zmutowanej karboksylazy PL PL PL PL PL PL
DE69430919T DE69430919T2 (de) 1993-08-24 1994-08-17 Eine phosphoenolpyruvat-carboxylasevariante, ihr gen und verfahren zur herstellung von aminosäuren
HU9600240A HU219600B (hu) 1993-08-24 1994-08-17 Mutáns foszfo-enolpiruvát-karboxiláz, ennek génje, valamint eljárás aminosav előállítására
AU80991/94A AU682547B2 (en) 1993-08-24 1994-08-17 Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid
RU96107112A RU2133772C1 (ru) 1993-08-24 1994-08-17 Модифицированная фосфоенолпируваткарбоксилаза, фрагмент днк, штамм escherichia coli, рекомбинантная днк, способ получения аминокислоты (варианты), способ селекции клеток escherichia coli, способ получения модифицированной фосфоенолпируваткарбоксилазы, способ получения фрагмента днк и способ получения микроорганизма
EP94924384A EP0723011B1 (en) 1993-08-24 1994-08-17 Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid
KR1019960700074A KR960704029A (ko) 1993-08-24 1996-02-14 변이형 포스포에놀피루브산 카복실라제, 이의 유전자, 및 아미노산의 제조 방법(Variant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene thereof, and process for producing amino acid)

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Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2747689A1 (fr) * 1996-04-23 1997-10-24 Ajinomoto Kk Micro-organisme producteur d'acide l-glutamique et procede de production d'acide l-glutamique a l'aide de ce micro-organisme
WO2007100009A1 (ja) 2006-03-03 2007-09-07 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2008044409A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for production of l-amino acid
WO2008075483A1 (ja) 2006-12-19 2008-06-26 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
CN100402657C (zh) * 1998-03-18 2008-07-16 味之素株式会社 生产l-谷氨酸的细菌和生产l-谷氨酸的方法
WO2008093829A1 (ja) 2007-02-01 2008-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2008102572A1 (ja) 2007-02-20 2008-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸または核酸の製造方法
WO2009031565A1 (ja) 2007-09-04 2009-03-12 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2010027045A1 (ja) 2008-09-08 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
WO2010061890A1 (ja) 2008-11-27 2010-06-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2011024555A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011055710A1 (ja) 2009-11-06 2011-05-12 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2014185430A1 (ja) 2013-05-13 2014-11-20 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2015005406A1 (ja) 2013-07-09 2015-01-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
WO2015041265A1 (ja) 2013-09-17 2015-03-26 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法
WO2015050234A1 (ja) 2013-10-02 2015-04-09 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
CN105132388A (zh) * 2015-09-06 2015-12-09 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
CN105907730A (zh) * 2016-05-11 2016-08-31 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6969782B2 (en) 1993-10-06 2005-11-29 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
DE69837041T2 (de) * 1997-07-18 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren und Mikroorganismus zur Herstellung von Purin-Nukleosiden durch Fermentation
CA2305577A1 (en) * 1997-10-04 1999-04-15 Forschungszentrum Julich Gmbh Method for microbial production of amino acids of the aspartate and/or glutamate family and agents which can be used in said method
US20030087381A1 (en) * 1998-04-13 2003-05-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Metabolically engineered organisms for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals
EP2194122B1 (en) 1998-04-13 2015-12-02 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pyruvate carboxylase overexpression for enhanced production of oxaloacetate-derived biochemicals in microbial cells
CN1336958A (zh) * 1998-12-23 2002-02-20 麻省理工学院 来自谷氨酸棒杆菌的丙酮酸羧化酶
US6171833B1 (en) 1998-12-23 2001-01-09 Massachusetts Institute Of Technology Pyruvate carboxylase from corynebacterium glutamicum
CA2377488A1 (en) * 1999-06-29 2001-01-04 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
US6599732B1 (en) * 1999-06-29 2003-07-29 Archer-Daniels-Midland Company Regulation of carbon assimilation
DE60027161D1 (de) 1999-07-02 2006-05-18 Ajinomoto Kk Für das saccharose-pts-enzym ii kodierende dna
DE19931314A1 (de) * 1999-07-07 2001-01-11 Degussa L-Lysin produzierende coryneforme Bakterien und Verfahren zur Herstellung von Lysin
MXPA02003634A (es) * 1999-10-13 2002-10-23 Univ Georgia Res Found Metodo y sistema de expresion de proteina de alto rendimiento.
US6727411B2 (en) 1999-12-13 2004-04-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of producing transgenic plants having improved amino acid composition
ATE417094T1 (de) * 1999-12-24 2008-12-15 Ajinomoto Kk Verfahren zur herstellung von l-aminosäure
US6927046B1 (en) 1999-12-30 2005-08-09 Archer-Daniels-Midland Company Increased lysine production by gene amplification using coryneform bacteria
US7723081B1 (en) 2000-01-21 2010-05-25 Ajinomoto Co., Inc. Bacteria containing aspartate-semialdehyde dehydrogenase, phosphoenolpyruvate carboxylase, and transhydrogenase to produce L-lysine in escherichia, and methods of using same
KR100397423B1 (ko) * 2001-02-13 2003-09-13 씨제이 주식회사 Ｌ-쓰레오닌의 제조방법
US7368266B2 (en) 2001-02-13 2008-05-06 Cj Corporation Method for L-threonine production
US20030115638A1 (en) * 2001-08-17 2003-06-19 Ajinomoto Co., Inc. Plants having increased amino acids content and methods for producing the same
AU2003205041A1 (en) * 2002-07-12 2004-01-29 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by fermentation
BR0304860A (pt) * 2002-11-11 2004-08-31 Ajinomoto Kk Método para produzir uma substância alvo pela utilização de uma-bactéria pertencente ao gênero escherichia
KR100498971B1 (ko) * 2003-04-04 2005-07-04 씨제이 주식회사 염색체 내 ｔｄｃＢＣ 및 ｐｃｋＡ 유전자가 불활성화된 미생물 및 이를 이용하여 Ｌ-쓰레오닌을 제조하는 방법
EP1735339A2 (en) * 2004-04-09 2006-12-27 Genencor International, Inc. Pcka modifications and enhanced protein expression in bacillus
KR100768748B1 (ko) 2004-12-30 2007-10-19 씨제이 주식회사 외래의 ｎａｄｐ 의존적 글리세르알데히드-3-포스페이트디히드로게나제 유전자를 포함하는 에세리키아 종 또는코리네박리움 종 미생물 및 그를 이용하여 ｌ-라이신을생산하는 방법
WO2007017710A1 (en) 2005-08-11 2007-02-15 Metabolic Explorer Process for the preparation of aspartate and derived amino acids like lysine, threonine, isoleucine, methionine, homoserine, or valine employing a microorganism with enhanced isocitrate lyase and/or malate synthase expression
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
AU2008206403A1 (en) * 2007-01-12 2008-07-24 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Compositions and methods for enhancing tolerance for the production of organic chemicals produced by microorganisms
US8883453B2 (en) * 2007-04-30 2014-11-11 University Of Maryland Codon specific mutagenesis
US8048624B1 (en) 2007-12-04 2011-11-01 Opx Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for 3-hydroxypropionate bio-production from biomass
JP2012223091A (ja) 2009-08-25 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
MX2012003604A (es) 2009-09-27 2012-09-12 Opx Biotechnologies Inc Metodo para producir acido 3-hidroxipropionico y otros productos.
US8809027B1 (en) 2009-09-27 2014-08-19 Opx Biotechnologies, Inc. Genetically modified organisms for increased microbial production of 3-hydroxypropionic acid involving an oxaloacetate alpha-decarboxylase
US20110125118A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Production of an Organic Acid and/or Related Chemicals
CN102781901B (zh) 2010-02-11 2016-08-03 梅塔玻利克斯公司 用于从经遗传修饰的聚羟基链烷酸酯生物质制备单体组分的方法
WO2012103263A2 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Finley Kenneth R Compositions and methods for malate and fumarate production
EP2668281A4 (en) 2011-01-25 2015-08-26 Cargill Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF SUCCINATE MANUFACTURE
EP2495317A1 (en) 2011-03-01 2012-09-05 Technische Universität Hamburg-Harburg Modified phosphoenolpyruvate carboxylase from Corynebacterium glutamicum and uses thereof
US20140114082A1 (en) 2011-06-08 2014-04-24 Metabolix, Inc. Biorefinery Process For THF Production
US20140170714A1 (en) 2011-08-10 2014-06-19 Metabolix, Inc. Post process purification for gamma-butyrolactone production
BR112015001601A2 (pt) 2012-07-25 2017-11-07 Bioamber Sas células de levedura tendo curso de tca redutor de piruvato em succinato e superexpressão de uma enzima transidrogenase nad(p)+ exógena
KR20150040359A (ko) 2012-08-10 2015-04-14 오피엑스 바이오테크놀로지스, 인크. 지방산 및 지방산 유도된 산물의 생산을 위한 미생물 및 방법
US20150057465A1 (en) 2013-03-15 2015-02-26 Opx Biotechnologies, Inc. Control of growth-induction-production phases
US9512057B2 (en) 2013-03-15 2016-12-06 Cargill, Incorporated 3-hydroxypropionic acid compositions
US10337038B2 (en) 2013-07-19 2019-07-02 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
US11408013B2 (en) 2013-07-19 2022-08-09 Cargill, Incorporated Microorganisms and methods for the production of fatty acids and fatty acid derived products
EP2993228B1 (en) 2014-09-02 2019-10-09 Cargill, Incorporated Production of fatty acid esters
US11345938B2 (en) 2017-02-02 2022-05-31 Cargill, Incorporated Genetically modified cells that produce C6-C10 fatty acid derivatives
EP3677683B1 (en) * 2017-09-01 2024-07-17 Niigata University Efficient method for producing ambrein
WO2022133917A1 (zh) * 2020-12-24 2022-06-30 武汉远大弘元股份有限公司 改造的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶及其在提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量中的应用
CN115806962A (zh) * 2021-09-15 2023-03-17 中国科学院天津工业生物技术研究所 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶突变体及其应用
KR102614733B1 (ko) * 2023-04-06 2023-12-19 대상 주식회사 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제 신규 변이체 및 이를 이용한 5’-이노신산 생산 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2223754B (en) * 1988-09-12 1992-07-22 Degussa Dna encoding phosphoenolpyruvate carboxylase
JPH07108228B2 (ja) * 1990-10-15 1995-11-22 味の素株式会社 温度感受性プラスミド

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AGRIC BIOL CHEM., Vol. 47, No. 7, (1983), HACHIRO OZAKI et al., "Production of lysine by pyruvate kinase mutants of Brevibacterium flavum", p. 1569-1576. *
J. BIOCHEM., Vol. 95, No. 4, (1984), FUJITA NUBUUKI et al., "The Primary structure of phophoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli Nucleotide Sequence of the ppe gene and deduced aminoacid Sequence", p. 909-916. *
J. BIOL. CHEM., Vol. 265, No. 26, (1990), SHERRYL MOWBRAY et al., "Mutations in the Aspartate Receptor of Escherichia coli Which Affect Aspartate Binding", p. 15638-15643. *

Cited By (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2747689A1 (fr) * 1996-04-23 1997-10-24 Ajinomoto Kk Micro-organisme producteur d'acide l-glutamique et procede de production d'acide l-glutamique a l'aide de ce micro-organisme
CN100402657C (zh) * 1998-03-18 2008-07-16 味之素株式会社 生产l-谷氨酸的细菌和生产l-谷氨酸的方法
US8129151B2 (en) 1998-03-18 2012-03-06 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
WO2007100009A1 (ja) 2006-03-03 2007-09-07 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2008044409A1 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for production of l-amino acid
WO2008075483A1 (ja) 2006-12-19 2008-06-26 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2008093829A1 (ja) 2007-02-01 2008-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2008102572A1 (ja) 2007-02-20 2008-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸または核酸の製造方法
WO2009031565A1 (ja) 2007-09-04 2009-03-12 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
EP2749652A2 (en) 2008-01-10 2014-07-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing a target substance by fermentation
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2010027045A1 (ja) 2008-09-08 2010-03-11 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸を生産する微生物及びｌ－アミノ酸の製造法
WO2010061890A1 (ja) 2008-11-27 2010-06-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2011013707A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 味の素株式会社 Ｌ-アミノ酸の製造法
WO2011024555A1 (ja) 2009-08-28 2011-03-03 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
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EP3521433A1 (en) 2013-07-09 2019-08-07 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-glutamic acid
WO2015041265A1 (ja) 2013-09-17 2015-03-26 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ－アミノ酸の製造方法
WO2015050234A1 (ja) 2013-10-02 2015-04-09 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
WO2015060314A1 (ja) 2013-10-21 2015-04-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法
CN105132388A (zh) * 2015-09-06 2015-12-09 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
CN105132388B (zh) * 2015-09-06 2018-02-23 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体r485p及其应用
CN105907730A (zh) * 2016-05-11 2016-08-31 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用
CN105907730B (zh) * 2016-05-11 2019-06-21 江南大学 一种酶活性提高的丙酮酸羧化酶突变体n1078f及其应用

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