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WO1991018017A1 - Method for preparing high-purity factor viii including a rapid immunoadsortpion step - Google Patents

Method for preparing high-purity factor viii including a rapid immunoadsortpion step Download PDF

Info

Publication number
WO1991018017A1
WO1991018017A1 PCT/FR1991/000400 FR9100400W WO9118017A1 WO 1991018017 A1 WO1991018017 A1 WO 1991018017A1 FR 9100400 W FR9100400 W FR 9100400W WO 9118017 A1 WO9118017 A1 WO 9118017A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
factor viii
monoclonal antibody
mixture
factor
complex
Prior art date
Application number
PCT/FR1991/000400
Other languages
French (fr)
Inventor
Abdessatar Chtourou
Original Assignee
Fondation Nationale De Transfusion Sanguine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fondation Nationale De Transfusion Sanguine filed Critical Fondation Nationale De Transfusion Sanguine
Publication of WO1991018017A1 publication Critical patent/WO1991018017A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Definitions

  • the subject of the invention is a process for the preparation of Factor VIII of very high purity from a complex aqueous mixture comprising Factor VIII.
  • the invention proposes to provide means for obtaining Factor VIII of very high purity more quickly and optionally with better yield than by known methods, from various sources of Factor VIII.
  • the invention also proposes to provide a method for purifying Factor VIII from a complex aqueous mixture which implements an immunoadsorption step, which overcomes the drawbacks of known methods, regardless of the nature of the starting aqueous complex mixture.
  • the inventor has now discovered that, surprisingly, this object is achieved when, prior to the immunoadsorption step with an immunoadsorbent containing an anti-Factor VIII monoclonal antibody.
  • the complex aqueous mixture is placed in the presence of divalent ions in sufficient quantity to obtain the dissociation of the factor complex
  • the anti-Factor VIII monoclonal antibody being moreover chosen as it is directed against the light chain of Factor VIII and has both an ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions. This is why the invention firstly relates to a process for the preparation of Factor VIII of very high purity from a complex aqueous mixture containing Factor VIII complexed with von Factor
  • Willebrand comprising an immunoadsorption step on an anti-Factor VIII monoclonal antibody, characterized in that:
  • the mixture obtained in a) is brought into contact with an immunoadsorbent consisting of an anti-Factor VIII monoclonal antibody immobilized by covalent bonding on a rigid support, said monoclonal antibody being directed against the light chain of Factor VIII and having at the times an ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions;
  • contact time is meant the time necessary for the implementation of step b), until all the Factor VIII present in the complex mixture has been fixed, determined for an amount of Factor VIII per mg of antibody monoclonal ranging from 200 to 600 IU.
  • the monoclonal antibody By binding to the light chain of Factor VIII, the monoclonal antibody inhibits coagulant activity by blocking the site of activation by thrombin. This leads to stabilization of Factor VIII and can in some cases contribute to an improvement in the yield of the immunoadsorption step. In addition, under the conditions indicated, it is found that only Factor VIII binds to the monoclonal antibody.
  • the method according to the invention applies to various complex aqueous mixtures, in particular: plasma, cryoprecipite redissolved, a concentrate of intermediate purity, a concentrate of high purity, a culture supernatant containing recombinant Factor VIII.
  • concentrations of divalent ions necessary to obtain the dissociation of the FVIII-vWF complex depend both on the nature of the ions used and on the source of Factor VIII used as the starting complex mixture. In practice, a concentration ranging from 0.1 to 0.6 M, preferably from 0.2 to 0.4 M is particularly suitable.
  • the concept underlying the invention is based on the discovery that with anti-Factor VIII monoclonal antibodies having certain precise characteristics, it is possible to avoid the disadvantages usually associated with a high concentration of divalent ions in the mixture with purify.
  • FIG. 1 indeed shows that in the presence of dissociating salts such as CaCl 2 , MgCl 2 , a lower amount of Factor VIII is obtained after one hour of incubation than when the cryoprecipite is as it is (example witness).
  • any divalent ion having an ionic strength effect can be used.
  • Ca + + ions will preferably be used, more particularly in the form of CaCl 2 QU calcium gluconate or related salts .
  • Such an operation can for example be carried out according to the method described in patents US 4,481,189 and US 4,540
  • solvent and detergent to be used in practice depend both on the nature of the complex aqueous mixture and on the nature of the solvents and detergents.
  • a support for immobilizing the monoclonal antibodies is prepared on the one hand and the monoclonal antibodies themselves on the other hand.
  • Different supports such as agarose beads, acrylamide, silica, synthetic polymers or a mixture of these substances can be activated with different types of chemical reagents.
  • gels of very high porosity in particular acrylamide gels. Mention may in particular be made of the gel formed from a mixture of dextran and of acrylamide Sephacryl S 1000, sold by the company
  • the activated gel is brought into contact with the solution of monoclonal antibodies.
  • the level of antibodies to be immobilized is not too high. This is why the concentration of monoclonal antibody is preferably from 0.1 to 5 mg / ml of gel, more preferably still from 0.3 to 1 mg / ml.
  • the excess proteins are removed by washing. The remaining activated sites are blocked by adding buffers, for example buffers containing glycine, ethanolamine or Tris.
  • the cells producing the antibody are cultured, either in vivo in Balb / C mice, or preferably m vitro in a cytocooker in an appropriate medium.
  • the ACMs are therefore purified from either ascites liquids or culture supernatants.
  • MCAs as described in the publication by M. P. Croissant et al, Thrombosis and
  • this immunopurification step is followed by an affinity chromatography step, preferably on an anionic ion exchanger.
  • This chromatography step aims both to concentrate Factor VIII and to eliminate the monoclonal antibodies of murine origin which could have contaminated the product.
  • a more particular subject of the invention is the process as described above, in which as the starting complex mixture, human plasma is used. Under these conditions, prior to step b), the pH is adjusted to around 6.5 to 6.8. In this case also, it will be preferable, when carrying out viral inactivation, to use larger amounts of the appropriate viral inactivation mixture than those used for the other complex mixtures.
  • FIG. 1 represents the change in the amount of Factor VIII present in a cryoprecipite as a function of the incubation time of this cryoprecipite with different monovalent and divalent ions, the control being the cryoprecipitate.
  • FIG. 2 represents the change in the amount of Factor VIII not adsorbed on an immunoaffinity column comprising the anti-Factor VIII ACMs as a function of the contact time between Factor VIII and the ACM considered, under dissociating conditions and not dissociating, the complex starting mixture being a concentrate of viral inactivated intermediate purity.
  • FIG. 3 represents the same evolution as that presented in FIG. 2, the complex starting mixture being the plasma.
  • Figure 4 shows the same evolution as that shown in Figure 3, but comparing the effect of divalent and monovalent ions, the starting complex mixture being a concentrate of intermediate purity.
  • the invention can be implemented from various sources of Factor VIII, which can be prepared in the following manner before the immunoadsorption step.
  • the plasma is thawed quickly. After addition of the divalent ions and possibly of a viral inactivation mixture, it is brought into contact with the immunoadsorbent.
  • cryoprecipite human blood collected in the presence of sodium citrate is centrifuged in order to remove the cell fraction. The plasma obtained is frozen at -40 ° C in plastic bags. We then proceed in three successive stages to obtain the cryoprecipite:
  • Pre-thawing of the plasma it is gradually reheated so that its temperature drops from -40 ° C to - 1 1 ° C in 8 hours:
  • - Defrosting of the plasma the plastic bags are eliminated and then the frozen plasma is placed in a grinder for approximately 2 minutes. The temperature of the suspension obtained is maintained between 0 and 0.5 ° C;
  • the suspension is centrifuged at a temperature between 1 and 4 ° C.
  • cryoprecipite is resuspended in a buffer then the contaminating proteins are eliminated and the Factor VIII can be recovered in the form of a concentrated solution having a specific activity around 1 IU / mg.
  • VIII can be performed as for the preparation of the cryoprecipite.
  • Baib / c mouse is immunized as follows, with Factor VIII purified as described in the publication M. P. Croissant et al, already cited.
  • Weeks 1 and 4 Subcutaneous injection of 150 ⁇ l of AL (OH 3 ) containing
  • Week 8 Intravenous injection of 50 IU of Factor VIII.
  • the animal is sacrificed for the removal of the spleen.
  • Murine spienocytes are fused with NS 1 myeloma cells in a 10: 1 ratio.
  • the cells are then selected on a HAT medium and then tested for their ability to secrete antibodies meeting these two criteria:
  • the cells meeting these criteria were cloned by limiting dilution.
  • the producer cells are cultured in vivo in a cytocultor in an appropriate medium.
  • Anionic ion exchange chromatography for example on Q Sepharose FF.
  • the gel d immunoaffinity is stored at 4 ° C in the presence of agents preventing the growth of microorganisms.
  • the gel is incubated for 24 hours in the presence of a viral inactivation mixture as mentioned above.
  • CaCl 2 is added until a final concentration of 0.25M is reached, then a viral inactivation mixture is added at a concentration of 1% Tween 80 and 0.3% TnBP, then incubated for 6 hours at 24 °. vs.
  • the solution is then ready for the immunoadsorption step.
  • Immunoadsorption is then carried out as follows: To prepare the column, it is filled with 1.2 l of the immunoaffinity gel (Sephacryl S 1000 activated with benzoquinone) in which the monoclonal antibody 463A8 is attached to a concentration of 0.5 mg / ml of gel in the presence of the viral inactivation mixture already described. The column is thus stored for 24 hours at 20 ° C., then transferred to a virus-free zone (2HV) where the gel is balanced by 10 column volumes of buffer A. 23.5 1 of the prepurified Factor VIII solution obtained previously are injected into the column at a rate of 16 column volumes / hour.
  • 2HV virus-free zone
  • Unretained proteins are removed by washing the immunoadsorbent with 10 column volumes of equilibration buffer A with a flow rate of 16 column volumes / hour.
  • Factor VIII is eluted with 6.5 column volume of buffer B with a flow rate of 8 column volumes / hour.
  • the immunopurification step is followed by an ion exchange chromatography step, according to which 900 ml of Q Sepharose FF (gel marketed by Pharmacia) are placed in a column in the presence of 20% ethanol and then washed. successively with 2 1 0.5 N NaOH, 5 1 distilled water, 3 1 2M NaCl, 5 I distilled water, then finally, equilibrated with 7 1 buffer C.
  • the eluate recovered from the immunoaffinity column is then injected at a flow rate of 12 l / h. At the end of the injection, the gel is washed with 9 l of equilibration buffer A.
  • Factor VIII is eluted with 3 l of elution buffer D at a flow rate of 6 l / h. Then, to prepare Factor VIII ready for marketing, the Factor VIII solution obtained after dialysis is dialyzed against 6 volumes of buffer E at a flow rate of 15 l / h. The solution is then sterile filtered, distributed in unit dose and then lyophilized.
  • the time required to load the Factor VIII solution (324.5 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody) into the immunoaffinity column is 1 h 20 min, the washing lasts 45 min and the elution lasts 58 min.
  • the following table represents the various characteristics of the process according to the invention.
  • the results include both the yield from each process step and the overall process yield.
  • a comparative example was carried out under the conditions indicated in document EP-A- Q 286 323, that is to say that the immunopu ⁇ fication does not include step a) but includes after step b) an additional step to eliminate the von Willebrand factor. Under these conditions, the time required to load the Factor VIII solution into the column is 27 hours, the washing comprising the need to remove the von Willebrand factor lasts 10 hours and the elution lasts 3 h 20 minutes. The time saving obtained according to the invention is therefore significant.
  • FIG. 2 This example is further illustrated by FIG. 2 which clearly shows that after 50 minutes of contact according to the invention, approximately 10% of Factor
  • FIG. 4 also illustrates the advantage of using divalent ions rather than other ions, in particular monovalent ions such as NaCl. Indeed, even if, according to FIG. 1, NaCl tends to destabilize Factor VIII less quickly than CaCl- ,, Factor VIII is adsorbed much more quickly when it has been dissociated with divalent ions.
  • the gel is washed with a 20 mM imidazole buffer, pH 6.8, 0.25 M CaCl 2 , to elute the vWF.
  • Factor VIII is subsequently eluted with a 10 mM imidazoy buffer pH7 0.075 M NaCl 0.075 M ethylene glycol 50% Tween 80 1%.
  • the factor VIII yield is 24.96.
  • CaCl 2 is added to a final concentration of 0.113 M, the plasma is virally inactivated with a mixture of 2% Tween 80 and 0.6 96 TnBP, and the pH is adjusted to 6.8.
  • Immunoadsorption is carried out in a column with a flow rate of 120 ml / cm 2 / h, in a column with a diameter of 5 cm, which corresponds to a volume flow rate of 2.4 l / hour and a loading time of 25 mn for 1 1 of plasma.
  • the factor VIII yield is 61 96.
  • FIG. 3 illustrates this aspect of the invention well applied to plasma. After 25 minutes, practically all of Factor VIII is adsorbed according to the invention, while nearly 70% is not adsorbed according to the comparative example.

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Abstract

A method for preparing high-purity Factor VIII from a complex aqueous mixture containing von Willebrand Factor-complexed Factor VIII, indluding immunoadsorption on an anti-Factor VIII monoclonal antibody. The method is characterized in that (a) a sufficient quantity of divalent ions is added to the complex aqueous mixture to ensure the dissociation of the Factor VIII/von Willebrand Factor complex; (b) the mixture containing Factor VIII is contacted with an immunoadsorbent consisting of an anti-Factor VIII monoclonal antibody which is immobilized on a rigid support by a covalent bond, said monoclonal antibody being so selected that it is directed against the light chain of the Factor VIII and can both inhibit the coagulative activity of the Factor VIII:C and bond the Factor VIII through strong hydrophobic interactions; and (c) the immunoadsorbent Factor VIII solution is eluted.

Description

PROCEDE DE PREPARATION DE FACTEUR VIII DE TRES HAUTE PURETE COMPRENANT UNE ETAPE RAPIDE D ' IMMUNOADSORPTION  PROCESS FOR THE PREPARATION OF VERY HIGH PURITY FACTOR VIII INCLUDING A RAPID IMMUNOADSORPTION STEP
L 'invention a pour objet un procédé de préparation de Facteur VIII de très haute pureté à partir d'un mélange aqueux complexe comprenant du Facteur VIII. The subject of the invention is a process for the preparation of Factor VIII of very high purity from a complex aqueous mixture comprising Factor VIII.
De nombreux procédés ont déjà été décrits, visant à préparer des formes purifiées de Facteur VIII humain, en raison de l'importance industrielle de ce facteur pour les hémophiles et surtout, de la nécessité de disposer de Facteur VIII dépourvu de contaminants.  Numerous processes have already been described, aiming to prepare purified forms of human Factor VIII, because of the industrial importance of this factor for hemophiliacs and above all, the need to have Factor VIII free of contaminants.
Suivant les utilisations envisagées, une pureté plus ou moins grande est requise, soit que le Facteur VIII soit destiné à être utilisé tel quel dans une forme de pureté intermédiaire, soit qu'un état de pureté intermédiaire constitue justement un état transitoire avant le mise en oeuvre d'étapes ultérieures de purification plus poussée.  Depending on the uses envisaged, a greater or lesser purity is required, either that Factor VIII is intended to be used as it is in a form of intermediate purity, or that a state of intermediate purity precisely constitutes a transient state before the work of further stages of further purification.
Pour préparer du Facteur VIII de très haute pureté, c'est-à-dire une pureté correspondant à une activité spécifique comprise entre environ 2000 et environ 6000 Ul/mg de protéines, un certain nombre de procédés proposent de mettre en oeuvre, à partir de diverses sources de Facteur VIII, une étape d'immunoadsorption utilisant comme immunoadsorbant un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII.  To prepare Factor VIII of very high purity, that is to say a purity corresponding to a specific activity of between approximately 2000 and approximately 6000 IU / mg of proteins, a certain number of methods propose to implement, from from various sources of Factor VIII, an immunoadsorption step using an anti-Factor VIII monoclonal antibody as an immunoadsorbent.
Ainsi, la publication du brevet européen EP-A-0 286 323 décrit un procédé de purification de Facteur VIII à partir d'un mélange de polypetides qui comprend une étape d'immunopurification puis d'élution de la solution purifiée de Facteur VIII, suivie d'une étape de chromatographie, l'étape d'immunopurification consistant à mettre en contact ledit mélange avec un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, à laver le produit adsorbé pour éliminer le Facteur von Willebrand, puis à éluer la solution de Facteur Thus, the publication of European patent EP-A-0 286 323 describes a process for the purification of Factor VIII from a mixture of polypetides which comprises a step of immunopurification then of elution of the purified solution of Factor VIII, followed a chromatography step, the immunopurification step consisting of bringing said mixture into contact with an anti-Factor VIII monoclonal antibody, washing the adsorbed product to remove the von Willebrand Factor, then eluting the Factor solution
VIII pour désorber le Facteur VIII de l'anticorps monoclonal anti-Facteur VIII. VIII to desorb Factor VIII from the anti-Factor VIII monoclonal antibody.
En effet, dans tous les mélanges complexes contenant du Facteur VIII, tels que le plasma, le cryoprecipite remis en solution, les concentrés de pureté intermédiaire ou encore les surnageants de culture qui contiennent du vWF destiné à stabiliser le Facteur VIII, le Facteur VIII se trouve complexé à son transporteur naturel qui est le facteur v on Willebrand (vWF). Ce complexe de haut poids moléculaire (20.106 D) est stable et ne se dissocie qu'en présence d'ions divalents tels que le Ca- -, Mg ++, Mn ++, à des concentrations généralement supérieures à 0,25 M. Le Facteur VIII est lui-même formé d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère associées par l'intermédiaire d'un ion calcium. In fact, in all complex mixtures containing Factor VIII, such as plasma, cryoprecipite re-dissolved, concentrates of intermediate purity or even culture supernatants which contain vWF intended to stabilize Factor VIII, Factor VIII finds complex with its natural carrier which is the factor v on Willebrand (vWF). This high molecular weight complex (20.10 6 D) is stable and only dissociates in the presence of divalent ions such as Ca - - , Mg ++ , Mn ++ , at concentrations generally greater than 0.25 M Factor VIII is itself formed of a heavy chain and a light chain associated via a calcium ion.
Dans les conditions indiquées dans le document cité ci-dessus, on a constaté que les temps nécessaires pour mettre en contact la totalité du mélange complexe à purifier avec l'immunoadsorbant sont relativement importants, de l'ordre de 15 à 30 heures. Ces durées sont probablement dues au fait que le Facteur VIII est mis en contact avec l'immunoadsorbant alors qu'il se trouve sous sa forme complexée au Facteur von Willebrand, ce qui tend à ralentir le processus. Ces conditions sont également souvent associées à un rendement assez faible, une partie non négligeable de Facteur VIII restant fixée sur l'immunoadsorbant ou même étant très rapidement déstabilisée avant même de pouvoir se fixer.  Under the conditions indicated in the document cited above, it has been found that the times required to bring the entire complex mixture to be purified into contact with the immunoadsorbent are relatively long, of the order of 15 to 30 hours. These durations are probably due to the fact that Factor VIII is brought into contact with the immunoadsorbent while it is in its form complexed with von Willebrand Factor, which tends to slow down the process. These conditions are also often associated with a fairly low yield, a non-negligible part of Factor VIII remaining fixed on the immunoadsorbent or even being very quickly destabilized before even being able to be fixed.
L'invention se propose de fournir des moyens pour obtenir plus rapidement et éventuellement avec un meilleur rendement que par les procédés connus, un Facteur VIII de très haute pureté, à partir de sources diverses de Facteur VIII.  The invention proposes to provide means for obtaining Factor VIII of very high purity more quickly and optionally with better yield than by known methods, from various sources of Factor VIII.
L'invention se propose également de fournir un procédé de purification de Facteur VIII à partir d'un mélange aqueux complexe qui met en oeuvre une étape d'immunoadsorption, qui remédie aux inconvénients des procédés connus, et ce, quelle que soit la nature du mélange aqueux complexe de départ.  The invention also proposes to provide a method for purifying Factor VIII from a complex aqueous mixture which implements an immunoadsorption step, which overcomes the drawbacks of known methods, regardless of the nature of the starting aqueous complex mixture.
L'inventeur a maintenant découvert que, de façon surprenante, ce but est atteint lorsque, préalablement à l'étape d'immunoadsorption avec un immunoadsorbant contenant un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII. le mélange aqueux complexe est mis en présence d'ions divalents en quantité suffisante pour obtenir la dissociation du complexe Facteur The inventor has now discovered that, surprisingly, this object is achieved when, prior to the immunoadsorption step with an immunoadsorbent containing an anti-Factor VIII monoclonal antibody. the complex aqueous mixture is placed in the presence of divalent ions in sufficient quantity to obtain the dissociation of the factor complex
VIII-vWF. l'anticorps monoclonal anti-Facteur VIII étant par ailleurs choisi tel qu'il est dirigé conre la chaîne légère du Facteur VIII et a à la fois une aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et à lier le Facteur VIII par des fortes interactions hydrophobes. C'est pourquoi l'invention a tout d'abord pour objet un procédé de préparation de Facteur VIII de très haute pureté à partir d'un mélange aqueux complexe contenant du Facteur VIII complexé au Facteur vonVIII-vWF. the anti-Factor VIII monoclonal antibody being moreover chosen as it is directed against the light chain of Factor VIII and has both an ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions. This is why the invention firstly relates to a process for the preparation of Factor VIII of very high purity from a complex aqueous mixture containing Factor VIII complexed with von Factor
Willebrand, comprenant une étape d'immunoadsorption sur un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, caractérisé en ce que : Willebrand, comprising an immunoadsorption step on an anti-Factor VIII monoclonal antibody, characterized in that:
a) on ajoute audit mélange aqueux complexe des ions divalents en quantité suffisante pour obtenir la dissociation du complexe Facteur VIII-Facteur von Willebrand ;  a) adding to said complex aqueous mixture of divalent ions in sufficient quantity to obtain the dissociation of the Factor VIII-Von Willebrand Factor complex;
b) on met en contact le mélange obtenu en a) avec un immunoadsorbant constitué d'un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII immobilisé par liaison covalente sur un support rigide, ledit anticorps monoclonal étant dirigé contre la chaîne légère du Facteur VIII et ayant à la fois une aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et à lier le Facteur VIII par des fortes interactions hydrophobes ;  b) the mixture obtained in a) is brought into contact with an immunoadsorbent consisting of an anti-Factor VIII monoclonal antibody immobilized by covalent bonding on a rigid support, said monoclonal antibody being directed against the light chain of Factor VIII and having at the times an ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions;
c) on élue de l'immunoadsorbant la solution de Facteur VIII obtenue.  c) the factor VIII solution obtained is eluted from the immunoadsorbent.
Ainsi, il est du mérite de l'inventeur d'avoir établi que en choisissant correctement l'anticorps monoclonal, il était possible de mettre en oeuvre l'étape d'immunoadsorption dans des conditions de dissociation du complexe Facteur VIII-vWF et, par là même, de diminuer de façon considérable le temps de contact entre le mélange complexe à purifier et l'immunoadsorbant.  Thus, it is to the credit of the inventor to have established that by correctly choosing the monoclonal antibody, it was possible to carry out the immunoadsorption step under conditions of dissociation of the Factor VIII-vWF complex and, by there same, considerably reducing the contact time between the complex mixture to be purified and the immunoadsorbent.
Par temps de contact, on entend le temps nécessaire à la mise en oeuvre de l'étape b), jusqu'à fixation de la totalité du Facteur VIII présent dans le mélange complexe, déterminé pour une quantité de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal allant de 200 à 600 Ui.  By contact time is meant the time necessary for the implementation of step b), until all the Factor VIII present in the complex mixture has been fixed, determined for an amount of Factor VIII per mg of antibody monoclonal ranging from 200 to 600 IU.
En se fixant sur la chaîne légère du Facteur VIII, l'anticorps monoclonal inhibe l'activité coagulante par blocage du site d'activation par la thrombine. Ceci conduit à une stabilisation du Facteur VIII et peut dans certains cas contribuer à une amélioration du rendement de l'étape d'immunoadsorption. En outre, dans les conditions indiquées, on constate que seul le Facteur VIII se fixe sur l'anticorps monoclonal. By binding to the light chain of Factor VIII, the monoclonal antibody inhibits coagulant activity by blocking the site of activation by thrombin. This leads to stabilization of Factor VIII and can in some cases contribute to an improvement in the yield of the immunoadsorption step. In addition, under the conditions indicated, it is found that only Factor VIII binds to the monoclonal antibody.
On constate que selon l'invention, il est possible d'avoir des temps de contact inférieurs à 1 heure et 30 minutes, et même parfois inférieurs à 1 heure.  It is found that according to the invention, it is possible to have contact times of less than 1 hour and 30 minutes, and even sometimes less than 1 hour.
Avantageusement, le procédé selon l'invention s'applique à différents mélanges aqueux complexes, notamment : le plasma, le cryoprecipite remis en solution, un concentré de pureté intermédiaire, un concentré de haute pureté, un surnageant de culture contenant du Facteur VIII recombinant.  Advantageously, the method according to the invention applies to various complex aqueous mixtures, in particular: plasma, cryoprecipite redissolved, a concentrate of intermediate purity, a concentrate of high purity, a culture supernatant containing recombinant Factor VIII.
Les concentrations d'ions divalents nécessaires pour obtenir la dissociation du complexe FVIII-vWF dépendent à la fois de la nature des ions utilisés ainsi que de la source de Facteur VIII utilisée comme mélange complexe de départ. En pratique, une concentration allant de 0.1 à 0,6 M, de préférence de 0,2 à 0,4 M convient particulièrement bien.  The concentrations of divalent ions necessary to obtain the dissociation of the FVIII-vWF complex depend both on the nature of the ions used and on the source of Factor VIII used as the starting complex mixture. In practice, a concentration ranging from 0.1 to 0.6 M, preferably from 0.2 to 0.4 M is particularly suitable.
Le concept à la base de l'invention repose sur la découverte qu'avec des anticorps monoclonaux anti-Facteur VIII présentant certaines caractéristiques précises, il est possible d'éviter les inconvénients habituellement liés à une concentration élevée d'ions divalents dans le mélange à purifier.  The concept underlying the invention is based on the discovery that with anti-Factor VIII monoclonal antibodies having certain precise characteristics, it is possible to avoid the disadvantages usually associated with a high concentration of divalent ions in the mixture with purify.
Ces inconvénients sont illustrés par la figure 1 qui montre en effet qu'en présence de sels dissociants tels que CaCl2, MgCl 2, on obtient une quantité plus faible de Facteur VIII après une heure d'incubation, que lorsque le cryoprecipite est tel quel (exemple témoin). These drawbacks are illustrated by FIG. 1 which indeed shows that in the presence of dissociating salts such as CaCl 2 , MgCl 2 , a lower amount of Factor VIII is obtained after one hour of incubation than when the cryoprecipite is as it is (example witness).
Tous les ions divalents ayant un effet de force ionique peuvent être utilisés. De façon non limitative, on peut citer les ions Mg+ +, Mn++, Ca++, Ba++. Cependant, on utilisera de préférence les ions Ca+ +, plus particulièrement sous la forme CaCl2 QU gluconate de calcium ou sels apparentés. En ce qui concerne le mélange aqueux de départ, il est préférable qu'il soit autant que possible débarrassé de ses contaminants éventuels avant l'étape d'immunoadsorption. C'est pourquoi, on procède avantageusement à une inactivation virale. Une telle opération peut par exemple être réalisée selon le procédé décrit dans les brevets US 4 481 189 et US 4 540Any divalent ion having an ionic strength effect can be used. Without limitation, mention may be made of the ions Mg + + , Mn ++ , Ca ++ , Ba ++ . However, Ca + + ions will preferably be used, more particularly in the form of CaCl 2 QU calcium gluconate or related salts . As far as the starting aqueous mixture is concerned, it is preferable for it to be freed of its possible contaminants as much as possible before the immunoadsorption step. This is why, one proceeds advantageously to a viral inactivation. Such an operation can for example be carried out according to the method described in patents US 4,481,189 and US 4,540
573 qui utilisent un mélange solvant et détergent tel que le mélange Tween 80/TnBP (Tri-n-butyl phosphate). 573 which use a solvent and detergent mixture such as the Tween 80 / TnBP (Tri-n-butyl phosphate) mixture.
La nature et les quantités de solvant et détergent à utiliser en pratique dépendent à la fois de la nature du mélange aqueux complexe et de la nature des solvants et détergents.  The nature and the amounts of solvent and detergent to be used in practice depend both on the nature of the complex aqueous mixture and on the nature of the solvents and detergents.
D'une manière générale, il est avantageux de procéder à une inactivation virale de tous les produits qui interviennent dans la mise en oeuvre du procédé, c'est-à-dire notamment du support d'immobilisation des anticorps monoclonaux, comme des anticorps monoclonaux eux-mêmes.  In general, it is advantageous to carry out a viral inactivation of all the products which are involved in the implementation of the method, that is to say in particular of the support for immobilizing monoclonal antibodies, such as monoclonal antibodies themselves.
Pour préparer l'immunoadsorbant utilisable selon l'invention, on prépare d'une part un support d'immobilisation des anticorps monoclonaux et d'autre part, les anticorps monoclonaux eux-mêmes.  To prepare the immunoadsorbent which can be used according to the invention, a support for immobilizing the monoclonal antibodies is prepared on the one hand and the monoclonal antibodies themselves on the other hand.
Différents supports tels que les billes d'agarose, d'acrylamide, de silice, de polymères synthétiques ou encore à base de mélange de ces substances peuvent être activés avec différents types de réactifs chimiques. Different supports such as agarose beads, acrylamide, silica, synthetic polymers or a mixture of these substances can be activated with different types of chemical reagents.
On utilisera de préférence des gels de très forte porosité, notamment des gels d'acrylamide. On peut citer en particulier le gel formé d'un mélange de dextran et d'acrylamide Sephacryl S 1000, commercialisé par la sociétéIt is preferable to use gels of very high porosity, in particular acrylamide gels. Mention may in particular be made of the gel formed from a mixture of dextran and of acrylamide Sephacryl S 1000, sold by the company
Pharmacia, que l'on active avec de la benzoquinone selon une technique classique décrite par Brandt et al, Bioch. Biophys. Acta, 1975, 386, 192-202. Pharmacia, which is activated with benzoquinone according to a conventional technique described by Brandt et al, Bioch. Biophys. Acta, 1975, 386, 192-202.
En général, après élimination par différents lavages des groupements non réactifs, le gel activé est mis en contact avec la solution d'anticorps monoclonal. Afin de minimiser les fuites d'anticorps, il est préférable que le taux d'anticorps à immobiliser ne soit pas trop élevé. C'est pourquoi, la concentration d'anticorps monoclonal est de préférence de 0, 1 à 5 mg/ml de gel, plus préférentiellement encore de 0,3 à 1 mg/ml. Ensuite, après une certaine durée de réaction de l'ordre de 24 heures, les protéines en excès sont éliminées par lavage. Les sites activés restants sont bloqués par addition de tampons, par exemple des tampons contenant de la glycine, de l'éthanolamine ou encore du Tris. In general, after removal of the non-reactive groups by various washes, the activated gel is brought into contact with the solution of monoclonal antibodies. In order to minimize the leakage of antibodies, it is preferable that the level of antibodies to be immobilized is not too high. This is why the concentration of monoclonal antibody is preferably from 0.1 to 5 mg / ml of gel, more preferably still from 0.3 to 1 mg / ml. Then, after a certain reaction time of the order of 24 hours, the excess proteins are removed by washing. The remaining activated sites are blocked by adding buffers, for example buffers containing glycine, ethanolamine or Tris.
Pour préparer les anticorps monoclonaux (ACM), les cellules productrices de l'anticorps sont cultivées, soit in vivo chez des souris Balb/C, soit de préférence m vitro dans un cytocuiteur dans un milieu approprié. Les ACM sont donc purifiés à partir soit de liquides d'ascites, soit de surnageants de culture. On utilisera de préférence des ACM tels que décrits dans la publication de M. P. Croissant et al, Thrombosis and To prepare the monoclonal antibodies (MCA), the cells producing the antibody are cultured, either in vivo in Balb / C mice, or preferably m vitro in a cytocooker in an appropriate medium. The ACMs are therefore purified from either ascites liquids or culture supernatants. Preferably, MCAs as described in the publication by M. P. Croissant et al, Thrombosis and
Haemostasis 56(3) 271-276, 1986, c'est-à-dire qui fixent 100 % de Facteur VIII en présence de CaCl2 à une concentration de 0,25 M et plus particulièrement encore l'ACM désigné sous l'appellation 463A8 dans cette publication. Haemostasis 56 (3) 271-276, 1986, that is to say which fix 100% of Factor VIII in the presence of CaCl 2 at a concentration of 0.25 M and more particularly still the ACM designated under the name 463A8 in this publication.
Enfin, selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cette étape d'immunopurification est suivie d'une étape de chromatographie d'affinité, de préférence sur un échangeur d'ions anioniques. Cette étape de chromatographie vise à la fois à concentrer le Facteur VIII et à éliminer les anticorps monoclonaux d'origine murine qui auraient pu contaminer le produit.  Finally, according to an advantageous embodiment of the invention, this immunopurification step is followed by an affinity chromatography step, preferably on an anionic ion exchanger. This chromatography step aims both to concentrate Factor VIII and to eliminate the monoclonal antibodies of murine origin which could have contaminated the product.
L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé tel que décrit précédemment, dans lequel en tant que mélange complexe de départ, on utilise le plasma humain. Dans ces conditions, préalablement à l'étape b), on ajuste le pH aux environs de 6,5 à 6,8. Dans ce cas également, il sera préférable, lorsqu'on effectue une inactivation virale, d'utiliser des quantités plus importantes du mélange d'inactivation virale approprié que celles utilisées pour les autres mélanges complexes.  A more particular subject of the invention is the process as described above, in which as the starting complex mixture, human plasma is used. Under these conditions, prior to step b), the pH is adjusted to around 6.5 to 6.8. In this case also, it will be preferable, when carrying out viral inactivation, to use larger amounts of the appropriate viral inactivation mixture than those used for the other complex mixtures.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au cours de la description détaillée suivante de différents modes de réalisation de l'invention. Les figures 1 à 4 illustrent l'invention. Other characteristics and advantages of the invention will appear during the following detailed description of different embodiments of the invention. Figures 1 to 4 illustrate the invention.
La figure 1 représente l'évolution de la quantité de Facteur VIII présent dans un cryoprecipite en fonction du temps d'incubation de ce cryoprecipite avec différents ions monovalents et divalents, le témoin étant le cryoprécipité.  FIG. 1 represents the change in the amount of Factor VIII present in a cryoprecipite as a function of the incubation time of this cryoprecipite with different monovalent and divalent ions, the control being the cryoprecipitate.
La figure 2 représente l'évolution de la quantité de Facteur VIII non adsorbé sur une colonne d'immunoaffinité comprenant les ACM anti-Facteur VIII en fonction du temps de contact entre le Facteur VIII et l'ACM considéré, dans des conditions dissociantes et non dissociantes, le mélange complexe de départ étant un concentré de pureté intermédiaire inactivé viralement.  FIG. 2 represents the change in the amount of Factor VIII not adsorbed on an immunoaffinity column comprising the anti-Factor VIII ACMs as a function of the contact time between Factor VIII and the ACM considered, under dissociating conditions and not dissociating, the complex starting mixture being a concentrate of viral inactivated intermediate purity.
La figure 3 représente la même évolution que celle présentée à la figure 2, le mélange complexe de départ étant le plasma.  FIG. 3 represents the same evolution as that presented in FIG. 2, the complex starting mixture being the plasma.
La figure 4 représente la même évolution que celle représentée à la figure 3, mais en comparant l'effet des ions divalents et monovalents, le mélange complexe de départ étant un concentré de pureté intermédiaire.  Figure 4 shows the same evolution as that shown in Figure 3, but comparing the effect of divalent and monovalent ions, the starting complex mixture being a concentrate of intermediate purity.
Comme indiqué ci-dessus, l'invention peut être mise en oeuvre à partir de diverses sources de Facteur VIII, qui peuvent être préparées de la façon suivante avant l'étape d'immunoadsorption.  As indicated above, the invention can be implemented from various sources of Factor VIII, which can be prepared in the following manner before the immunoadsorption step.
a) plasma  a) plasma
Le plasma est décongelé rapidement. Après addition des ions divalents et éventuellement d'un mélange inactivation virale, il est mis en contact avec l'immunoadsorbant.  The plasma is thawed quickly. After addition of the divalent ions and possibly of a viral inactivation mixture, it is brought into contact with the immunoadsorbent.
b) cryoprecipite  b) cryoprecipitate
Pour préparer un cryoprecipite, on centrifuge du sang humain collecté en présence de citrate de sodium, afin d'éliminer la fraction cellulaire. Le plasma obtenu est congelé à -40°C dans des poches plastiques. On procède ensuite en trois étapes successives pour obtenir le cryoprecipite :  To prepare a cryoprecipite, human blood collected in the presence of sodium citrate is centrifuged in order to remove the cell fraction. The plasma obtained is frozen at -40 ° C in plastic bags. We then proceed in three successive stages to obtain the cryoprecipite:
- Prédécongélation du plasma : il est réchauffé progressivement de manière à ce que sa température passe de -40°C à - 1 1°C en 8 heures : - Décongélation du plasma : on élimine les poches plastiques puis on place le plasma congelé dans un broyeur pendant environ 2 minutes. On maintient la température de ia suspension obtenue entre 0 et 0,5°C ; - Pre-thawing of the plasma: it is gradually reheated so that its temperature drops from -40 ° C to - 1 1 ° C in 8 hours: - Defrosting of the plasma: the plastic bags are eliminated and then the frozen plasma is placed in a grinder for approximately 2 minutes. The temperature of the suspension obtained is maintained between 0 and 0.5 ° C;
- Séparation du cryoprecipite : on centrifuge la suspension à une température comprise entre 1 et 4°C.  - Separation of the cryoprecipite: the suspension is centrifuged at a temperature between 1 and 4 ° C.
Ensuite, il est généralement resuspensdu dans un tampon tel que Tris-HCl 0,025 M pH 7. Après dissolution, 98 g (3% partie/volume) d'Al(OH)3 sont ajoutés par kg de cryoprecipite de départ. Après 10 mn d'agitation, le mélange est centrifugé à 3000 g. Le surnageant est éventuellement inactivé viralement puis les ions dissociants sont ajoutés et la solution est mise en contact avec l'immunoadsorbant. Then, it is generally resuspended in a buffer such as Tris-HCl 0.025 M pH 7. After dissolution, 98 g (3% part / volume) of Al (OH) 3 are added per kg of starting cryoprecipite. After 10 minutes of stirring, the mixture is centrifuged at 3000 g. The supernatant is optionally virally inactivated, then the dissociating ions are added and the solution is brought into contact with the immunoadsorbent.
c) Facteur VIII de pureté intermédiaire  c) Factor VIII of intermediate purity
Le cryoprecipite est remis en suspension dans un tampon puis les protéines contaminantes sont éliminées et le Facteur VIII peut être récupéré sous forme d'une solution concentrée ayant une activité spécifique aux environs de 1 Ui/mg. L'inactivation virale et la dissociation du Facteur The cryoprecipite is resuspended in a buffer then the contaminating proteins are eliminated and the Factor VIII can be recovered in the form of a concentrated solution having a specific activity around 1 IU / mg. Viral inactivation and factor dissociation
VIII peuvent être réalisées comme pour la préparation du cryoprecipite. VIII can be performed as for the preparation of the cryoprecipite.
Pour l'ensemble des exemples de réalisation qui vont suivre, la préparation de l'immunoadsorbant se fait dans les conditions indiquées ci-après :  For all the examples of embodiments which will follow, the preparation of the immunoadsorbent is carried out under the conditions indicated below:
Obtention des anticorps monoclonaux  Obtaining monoclonal antibodies
1 ° - Immunisation  1 ° - Immunization
Une souris Baib/c est immunisée de la façon suivante, avec un Facteur VIII purifié de la façon décrite dans la publication M. P. Croissant et al, déjà citée.  A Baib / c mouse is immunized as follows, with Factor VIII purified as described in the publication M. P. Croissant et al, already cited.
Semaines 1 et 4 : Injection sous cutanée de 150 μl d'AL (OH3) contenant Weeks 1 and 4: Subcutaneous injection of 150 μl of AL (OH 3 ) containing
50 UI de Facteur VIII ;  50 IU of Factor VIII;
Semaine 8 : Injection par voie intraveineuse de 50 UI de Facteur VIII. Week 8: Intravenous injection of 50 IU of Factor VIII.
3 jours après la dernière injection, l'animal est sacrifié pour le prélèvement de la rate.  3 days after the last injection, the animal is sacrificed for the removal of the spleen.
2° - Fusion et production d'hybridomes murins Les spiénocytes murins sont fusionnés avec des cellules myélomateuses NS 1 dans un rapport 10: 1. 2 ° - Fusion and production of murine hybridomas Murine spienocytes are fused with NS 1 myeloma cells in a 10: 1 ratio.
Les cellules sont par la suite sélectionnées sur un milieu HAT puis testées quant à leur aptitude à sécréter des anticorps répondant à ces deux critères :  The cells are then selected on a HAT medium and then tested for their ability to secrete antibodies meeting these two criteria:
- Aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et - Aptitude à lier le Facteur VIII par de fortes interactions hydrophobes.  - Ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and - Ability to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions.
Les cellules répondants à ces critères ont été clonées par dilution limite.  The cells meeting these criteria were cloned by limiting dilution.
582 hybrides ont été ainsi testées. 20 % des surnageants cellulaires contiennent des anticorps anti-Facteur von Willebrand et 2,5 % des anticorps anti-Facteur VIII:C. Parmi les lignées stables après clonage, et sécrétant un anticorps anti-Facteur VIII:C la lignée CAG- 1 463A8 a été sélectionné (M. P. Croissant et al, déjà citée).  582 hybrids were tested in this way. 20% of cell supernatants contain anti-von Willebrand Factor antibodies and 2.5% of anti-Factor VIII: C antibodies. Among the stable lines after cloning, and secreting an anti-Factor VIII: C antibody, the line CAG-1463A8 was selected (M. P. Croissant et al, already cited).
3° - Préparation des anticorps monoclonaux  3 ° - Preparation of the monoclonal antibodies
Les cellules productrices sont cultivées in vivo dans un cytoculteur dans un milieu approprié.  The producer cells are cultured in vivo in a cytocultor in an appropriate medium.
Le protocole de purification suivant peut être appliqué.  The following purification protocol can be applied.
1. Séparation des cellules et débris cellulaires par une filtration tangentielle sur 0,45 puis 0,22 μ ;  1. Separation of cells and cellular debris by a tangential filtration on 0.45 then 0.22 μ;
2. Concentration 10 fois du surnageant de culture par ultrafiltration.  2. Concentration 10 times of the culture supernatant by ultrafiltration.
3. Chromatographie sur protéine A Sépharose FF commercialisée par la société Pharmacia.  3. Chromatography on protein A Sepharose FF sold by the company Pharmacia.
4. Ajustement du pH et de la résistivité de l'éluat de la protéine A Sépharose.  4. Adjustment of the pH and the resistivity of the eluate of protein A Sepharose.
5. Chromatographie d'échange d'ions anioniques par exemple sur Q Sépharose FF.  5. Anionic ion exchange chromatography, for example on Q Sepharose FF.
6. Dialyse et ultrafiltration pour ajuster le taux d'anticorps à la concentration voulue. 7. Inactivation v irale de la solution d'anticorps par pasteurisation. 6. Dialysis and ultrafiltration to adjust the antibody level to the desired concentration. 7. Viral inactivation of the antibody solution by pasteurization.
8. Congélation à -80°C jusqu'à libération du lot après contrôle. Immobilisation de l'anticorps monoclonal  8. Freezing at -80 ° C until release of the batch after control. Immobilization of the monoclonal antibody
Après lavage avec des tampons de pH extrême (pH 4 et pH 9) et des agents chaotropes, c'est-à-dire des agents susceptibles de casser les interactions hydrophobes, afin d'éliminer les molécules fixées de façon aspecifique, le gel d'immunoaffinité est stocké à 4°C en présence d'agents empêchant la croissance des microorganismes.  After washing with extreme pH buffers (pH 4 and pH 9) and chaotropic agents, that is to say agents capable of breaking hydrophobic interactions, in order to eliminate the molecules fixed in an specific manner, the gel d immunoaffinity is stored at 4 ° C in the presence of agents preventing the growth of microorganisms.
De préférence, avant son utilisation, le gel est mis à incuber pendant 24 heures en présence d'un mélange d'inactivation virale tel que cité précédemment. Tampons utilisés dans les exemples :  Preferably, before its use, the gel is incubated for 24 hours in the presence of a viral inactivation mixture as mentioned above. Buffers used in the examples:
Immunoaffinité :  Immunoaffinity:
- tampon d'équilibrage (tampon A) :  - balancing buffer (buffer A):
Imidazole-HCI 20 mM, pH 6,8 ; NaCl 150 mM,  20 mM Imidazole-HCl, pH 6.8; 150 mM NaCl,
- tampon d'elution (tampon B) :  - elution buffer (buffer B):
Imidazoie 10 mM pH 7, NaCl 0,075 M, éthylène glycol 50 %, Imidazoie 10 mM pH 7, NaCl 0.075 M, ethylene glycol 50%,
Tween 80 l 96. L'ajout d'un détergent dans le tampon d'elution est particulièrement avantageux et il permet d'améliorer encore le rendement de l'étape. Chromatographie par échange d'ions Tween 80 l 96. The addition of a detergent to the elution buffer is particularly advantageous and makes it possible to further improve the yield of the stage. Ion exchange chromatography
- tampon d'équilibrage (tampon C) :  - balancing buffer (buffer C):
Tris-HCl 20mM, pH7, NaCl 0,27 M,  20mM Tris-HCl, pH7, 0.27 M NaCl,
- tampon d'elution (tampon D),  - elution buffer (buffer D),
glycine 0,1 M, lysine 0,03 M, NaCl 0,05 M, CaCl2, 0,3 M, pH7 - tampon de dialyse (tampon E) : 0.1 M glycine, 0.03 M lysine, 0.05 M NaCl, 0.3 M CaCl 2 , pH7 - dialysis buffer (buffer E):
glycine 0,1 M, lysine 0,03 M, NaCl 0,2M, CaCl2 1mM, pH7. Exemple de mise en oeuyre du procédé à partir d'un concentré de pureté intermédiaire 0.1 M glycine, 0.03 M lysine, 0.2 M NaCl, 1 mM CaCl 2 , pH7. Example of implementation of the process from a concentrate of intermediate purity
4 kg de cryoprécipité, obtenus à partir de 524 1 de plasma ont été remis en solution dans un tampon Tris 20 mM pH 7. Le pH de la soluton est ensuite ajusté à pH 7,1 et les principaux contaminants protéiques tels que fibronectine, fibrinogène, IgG sont éliminés en deux temps : une première précipitation à l'héparine obtenue par ajout de 24 unités d'héparine par ml de solution à 20°C, et Je précipité formé est éliminé par centrifugation ; ensuite, on ajoute 22 g de gel d'hydroxyde d'aluminium par litre de solution, puis on abaisse le pH à 6,00. Le précipité formé est éliminé par centrifugation.  4 kg of cryoprecipitate, obtained from 524 1 of plasma, were redissolved in a 20 mM Tris buffer pH 7. The pH of the soluton is then adjusted to pH 7.1 and the main protein contaminants such as fibronectin, fibrinogen , IgG are eliminated in two stages: a first precipitation with heparin obtained by adding 24 units of heparin per ml of solution at 20 ° C., and the precipitate formed is eliminated by centrifugation; then 22 g of aluminum hydroxide gel are added per liter of solution, then the pH is lowered to 6.00. The precipitate formed is removed by centrifugation.
On ajoute du CaCl2 jusqu'à atteindre une concentration finale de 0.25M puis on ajoute un méiange d'inactivation virale à une concentration de 1% de Tween 80 et 0,3 % de TnBP, puis on incube pendant 6 heures à 24°C. CaCl 2 is added until a final concentration of 0.25M is reached, then a viral inactivation mixture is added at a concentration of 1% Tween 80 and 0.3% TnBP, then incubated for 6 hours at 24 °. vs.
La solution est alors prête pour l'étape d'immunoadsorption. L'immunoadsorption est ensuite réalisée de la façon suivante : Pour préparer la colonne, on la remplit avec 1,2 1 du gel d'immunoaffinité (le Sephacryl S 1000 activé à la benzoquinone) où se trouve fixé l'anticorps monoclonal 463A8 à une concentration de 0,5 mg/ml de gel en présence du mélange d'inactivation virale déjà décrit. La colonne est conservée ainsi 24 heures à 20°C, puis transférée dans une zone hors virus (2HV) où le gel est équilibré par 10 volumes colonne de tampon A. 23,5 1 de la solution de Facteur VIII prépurifiée, obtenue précédemment sont injectés dans la colonne à un débit de 16 volumes colonne/heure.  The solution is then ready for the immunoadsorption step. Immunoadsorption is then carried out as follows: To prepare the column, it is filled with 1.2 l of the immunoaffinity gel (Sephacryl S 1000 activated with benzoquinone) in which the monoclonal antibody 463A8 is attached to a concentration of 0.5 mg / ml of gel in the presence of the viral inactivation mixture already described. The column is thus stored for 24 hours at 20 ° C., then transferred to a virus-free zone (2HV) where the gel is balanced by 10 column volumes of buffer A. 23.5 1 of the prepurified Factor VIII solution obtained previously are injected into the column at a rate of 16 column volumes / hour.
Les protéines non retenues sont éliminées par lavage de l'immunoadsorbant avec 10 volumes colonne de tampon d'équilibrage A avec un débit de 16 volumes colonne/heure.  Unretained proteins are removed by washing the immunoadsorbent with 10 column volumes of equilibration buffer A with a flow rate of 16 column volumes / hour.
Le Facteur VIII est élue avec 6,5 volume colonne d'un tampon B avec un débit de 8 volumes colonne/heure. L'étape d'immunopurification est suivie d'une étape de chromatographie d'échange d'ions, selon laquelle 900 ml de Q Sépharose FF (gel commercialisé par Pharmacia) sont placés dans une colonne en présence d'éthanol à 20 % puis lavés successivement avec 2 1 NaOH 0,5 N, 5 1 d'eau distillée, 3 1 NaCl 2M, 5 I d'eau distillée, puis enfin, équilibrés avec 7 1 du tampon C. L'éluat récupéré de la colonne d'immunoaffinité est alors injecté à un débit de 12 l/h. A la fin de l'injection, le gel est lavé avec 9 1 de tampon d'équilibrage A. Le Facteur VIII est élue avec 3 1 de tampon d'elution D à un débit de 6 l/h. Ensuite, pour préparer du Facteur VIII prêt à la commercialisation, on dialyse la solution de Facteur VIII obtenu après addition d'albumine contre 6 volumes d'un tampon E à un débit de 15 l/h. La solution est ensuite filtrée stérilement, répartie en dose unitaire puis lyophilisée. Factor VIII is eluted with 6.5 column volume of buffer B with a flow rate of 8 column volumes / hour. The immunopurification step is followed by an ion exchange chromatography step, according to which 900 ml of Q Sepharose FF (gel marketed by Pharmacia) are placed in a column in the presence of 20% ethanol and then washed. successively with 2 1 0.5 N NaOH, 5 1 distilled water, 3 1 2M NaCl, 5 I distilled water, then finally, equilibrated with 7 1 buffer C. The eluate recovered from the immunoaffinity column is then injected at a flow rate of 12 l / h. At the end of the injection, the gel is washed with 9 l of equilibration buffer A. Factor VIII is eluted with 3 l of elution buffer D at a flow rate of 6 l / h. Then, to prepare Factor VIII ready for marketing, the Factor VIII solution obtained after dialysis is dialyzed against 6 volumes of buffer E at a flow rate of 15 l / h. The solution is then sterile filtered, distributed in unit dose and then lyophilized.
Le temps nécessaire pour charger la solution de Facteur VIII (324.5 UI de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal) dans la colonne d'immunoaffinité est de 1 h 20 mn, le lavage dure 45 mn et l'éiution dure 58 mn.  The time required to load the Factor VIII solution (324.5 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody) into the immunoaffinity column is 1 h 20 min, the washing lasts 45 min and the elution lasts 58 min.
Le tableau suivant représente les différentes caractéristiques du procédé selon l'invention. Les résultats comportent à la fois le rendement de chaque étape du procédé et le rendement global du procédé. The following table represents the various characteristics of the process according to the invention. The results include both the yield from each process step and the overall process yield.
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0001
Un exemple comparatif a été réalisé dans les conditions indiquées dans le document EP-A-Q 286 323, c'est-à-dire que l'immuno- puπfication ne comporte pas l'étape a) mais comporte après l'étape b) une étape supplémentaire pour éliminer le Facteur von Willebrand. Dans ces conditions, le temps nécessaire pour charger la solution de Facteur VIII dans la colonne est de 27 heures, le lavage comportant la nécessité d'éliminer le Facteur von Willebrand dure 10 heures et l'élution dure 3 h 20 minutes. Le gain de temps obtenu selon l'invention est donc significatif. A comparative example was carried out under the conditions indicated in document EP-A- Q 286 323, that is to say that the immunopuπfication does not include step a) but includes after step b) an additional step to eliminate the von Willebrand factor. Under these conditions, the time required to load the Factor VIII solution into the column is 27 hours, the washing comprising the need to remove the von Willebrand factor lasts 10 hours and the elution lasts 3 h 20 minutes. The time saving obtained according to the invention is therefore significant.
Cet exemple est par ailleurs illustré par la figure 2 qui montre bien qu'après 50 mn de contact selon l'invention, 10 % environ de Facteur This example is further illustrated by FIG. 2 which clearly shows that after 50 minutes of contact according to the invention, approximately 10% of Factor
VIII seulement n'est pas adsorbé, alors que ce pourcentage s'élève à près de 65 % lorsque le Facteur VIII n'a pas été préalablement dissocié. VIII only is not adsorbed, whereas this percentage rises to almost 65% when Factor VIII has not been previously dissociated.
La figure 4 illustre par ailleurs l'intérêt de l'utilisation d'ions divalents plutôt que d'autres ions, en particulier des ions monovalents tels que NaCl. En effet, même si, d'après la figure 1, NaCl a tendance à déstabiliser moins rapidement le Facteur VIII que CaCl-,, le Facteur VIII est adsorbé beaucoup plus rapidement lorsqu'il a été dissocié avec des ions divalents. Exemple de purification du Facteur VIII à partir du plasma  FIG. 4 also illustrates the advantage of using divalent ions rather than other ions, in particular monovalent ions such as NaCl. Indeed, even if, according to FIG. 1, NaCl tends to destabilize Factor VIII less quickly than CaCl- ,, Factor VIII is adsorbed much more quickly when it has been dissociated with divalent ions. Example of Purification of Factor VIII from Plasma
a) Exemple comparatif, dans des conditions non dissociantes. 1000 ml de plasma inactivé viralement (Tween 80 296, TnBP 0,6 °6) pH 6,8 sont mis à incuber avec 10 ml de gel d'immunoaffinité pendant 16 heures, soit 200 UI de Facteur VIII par mg d'anticorps a) Comparative example, under non-dissociating conditions. 1000 ml of virally inactivated plasma (Tween 80 296, TnBP 0.6 ° 6) pH 6.8 are incubated with 10 ml of immunoaffinity gel for 16 hours, i.e. 200 IU of Factor VIII per mg of antibody
Ensuite, le gel est lavé avec un tampon imidazole 20 mM, pH 6,8, CaCl2 0,25 M, pour éluer le vWF. Le Facteur VIII est élué ultérieurement avec un tampon imidazoie 10 mM pH7 NaCl 0,075 M éthylène glycol 50 % Tween 80 1 % . Le rendement en Facteur VIII est de 24 96. Then, the gel is washed with a 20 mM imidazole buffer, pH 6.8, 0.25 M CaCl 2 , to elute the vWF. Factor VIII is subsequently eluted with a 10 mM imidazoy buffer pH7 0.075 M NaCl 0.075 M ethylene glycol 50% Tween 80 1%. The factor VIII yield is 24.96.
b) Selon l'invention  b) According to the invention
A 1000 mi de plasma, on ajoute CaCl2 à une concentration finale de 0, 1 13 M, on inactive viralement le plasma avec un mélange de 2 % de Tween 80 et de 0,6 96 de TnBP, et on ajuste le pH à 6,8. At 1000 ml of plasma, CaCl 2 is added to a final concentration of 0.113 M, the plasma is virally inactivated with a mixture of 2% Tween 80 and 0.6 96 TnBP, and the pH is adjusted to 6.8.
On effectue l'immunoadsorption en colonne avec un débit de 120 ml/cm2/h, dans une colonne de 5 cm de diamètre, ce qui correspond à un débit volumique de 2,4 1/heure et à un temps de charge de 25 mn pour 1 1 de plasma. Le rendement en Facteur VIII est de 61 96. Immunoadsorption is carried out in a column with a flow rate of 120 ml / cm 2 / h, in a column with a diameter of 5 cm, which corresponds to a volume flow rate of 2.4 l / hour and a loading time of 25 mn for 1 1 of plasma. The factor VIII yield is 61 96.
Le même essai répété 10 fois donne à chaque fois des rendements à peu près constants, aussi bien pour l'exemple comparatif que pour l'exemple conforme à l'invention (respectivement 24,3 + 2,3 % et 61.1
Figure imgf000017_0001
The same test repeated 10 times gives almost constant yields each time, both for the comparative example and for the example according to the invention (respectively 24.3 + 2.3% and 61.1
Figure imgf000017_0001
6,3 %). 6.3%).
La figure 3 illustre bien cet aspect de l'invention appliqué au plasma. Après 25 mn pratiquement tout le Facteur VIII est adsorbé selon l'invention, tandis que près de 70 % ne l'est pas selon l'exemple comparatif.  FIG. 3 illustrates this aspect of the invention well applied to plasma. After 25 minutes, practically all of Factor VIII is adsorbed according to the invention, while nearly 70% is not adsorbed according to the comparative example.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation de Facteur VIII de très haute pureté à partir d'un mélange aqueux complexe, contenant du Facteur VIII complexé au Facteur von Willebrand, procédé comprenant une étape d'immunoadsorption sur un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, caractérisé en ce que :  1. Process for the preparation of Factor VIII of very high purity from a complex aqueous mixture containing Factor VIII complexed with von Willebrand Factor, method comprising an immunoadsorption step on a monoclonal anti-Factor VIII antibody, characterized in that than :
a) on ajoute audit mélange aqueux complexe des ions divalents en quantité suffisante pour obtenir la dissociation du complexe Facteur VIII-Facteur von Willebrand ;  a) adding to said complex aqueous mixture of divalent ions in sufficient quantity to obtain the dissociation of the Factor VIII-Von Willebrand Factor complex;
b) on met en contact le mélange obtenu en a) avec un immunoadsorbant constitué d'un anticorps monoclonal anti-Facteur VIII immobilisé par liaison covalente sur un support rigide, ledit anticorps monoclonal étant dirigé contre la chaîne légère du Facteur VIII et ayant à la fois une aptitude à inhiber l'activité coagulante du Facteur VIII:C et à lier le Facteur VIII par de fortes interactions hydrophobes ;  b) the mixture obtained in a) is brought into contact with an immunoadsorbent consisting of an anti-Factor VIII monoclonal antibody immobilized by covalent bonding on a rigid support, said monoclonal antibody being directed against the light chain of Factor VIII and having at the times an ability to inhibit the coagulating activity of Factor VIII: C and to bind Factor VIII by strong hydrophobic interactions;
c) on élue la solution de Facteur VIII de l'immunoadsorbant ; c) eluting the Factor VIII solution from the immunoadsorbent;
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape b) est poursuivie jusqu'à adsorption de la totalité du Facteur VIII présent dans le mélange complexe. 2. Method according to claim 1, characterized in that step b) is continued until adsorption of all of the Factor VIII present in the complex mixture.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, pour 3. Method according to claim 2, characterized in that, for
200 à 600 UI de Facteur VIII par mg d'anticorps monoclonal, le temps de contact est inférieure à 1 heure 30 minutes, de préférence inférieur à 1 heure. 200 to 600 IU of Factor VIII per mg of monoclonal antibody, the contact time is less than 1 hour 30 minutes, preferably less than 1 hour.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit mélange est choisi parmi le plasma, le cryoprecipite remis en solution, un concentré de pureté intermédiaire, un concentré de haute pureté, un surnageant de culture contenant du Facteur VIII recombinant.  4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that said mixture is chosen from plasma, cryoprecipite redissolved, a concentrate of intermediate purity, a concentrate of high purity, a culture supernatant containing Factor VIII recombinant.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les ions divalents sont ajoutés à des concentrations allant de 0,1 à 0,6 M, de préférence de 0,2 à 0,4 M.  5. Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the divalent ions are added at concentrations ranging from 0.1 to 0.6 M, preferably from 0.2 to 0.4 M.
6. Procédé selon l'une des revendications l à 5, caractérisé en ce que les ions divalents ajoutés à l'étape a) sont choisis parmi Mg++, Mn++ , Ba++, Ca++. 6. Method according to one of claims l to 5, characterized in that the divalent ions added in step a) are chosen from Mg ++ , Mn ++ , Ba ++ , Ca ++ .
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que les ions divalents sont les ions Ca
Figure imgf000019_0001
. 7. Method according to claim 6, characterized in that the divalent ions are the Ca ions
Figure imgf000019_0001
.
S. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit mélange est inactivé viralement.  S. Method according to one of the preceding claims, characterized in that said mixture is virally inactivated.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit support et/ou ledit anticorps monoclonal sont inactivés viralement.  9. Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that said support and / or said monoclonal antibody are virally inactivated.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support de l'étape b) comprend un gel de très forte porosité.  10. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the support of step b) comprises a gel of very high porosity.
1 1. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un gel d'acrylamide.  1 1. Method according to claim 10, characterized in that it is an acrylamide gel.
1 2. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la concentration d'anticorps monoclonal est de 0, 1 à 5 mg/ml, de préférence dé 0,3 à 1 mg/ml.  1 2. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the concentration of monoclonal antibody is 0.1 to 5 mg / ml, preferably 0.3 to 1 mg / ml.
1 3. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le mélange complexe est le plasma humain et préalablement à l'étape b), on ajuste le pH aux environs de 6,5 à 6,8.  1 3. Method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the complex mixture is human plasma and prior to step b), the pH is adjusted to around 6.5 to 6.8.
14. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que en tant qu'anticorps monoclonal anti-Facteur VIII, on utilise un anticorps monoclonal qui fixe 100 % de Facteur VIII, en présence de CaCl2 à une concentration de 0,25 M. 14. Method according to one of the preceding claims, characterized in that as an anti-Factor VIII monoclonal antibody, a monoclonal antibody is used which fixes 100% of Factor VIII, in the presence of CaCl 2 at a concentration of 0, 25 M.
1 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce que à l'étape c) on utilise un tampon d'elution qui comprend un détergent.  1 5. Method according to one of claims 1 to 14, characterized in that in step c) using an elution buffer which comprises a detergent.
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il comprend une étape d) selon laquelle on chromatographie par échange d'ions la solution de Facteur VIII éluée à l'étape c).  16. Method according to one of the preceding claims characterized in that it comprises a step d) according to which the solution of Factor VIII eluted in step c) is chromatographed by ion exchange.
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