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WO1990004791A1 - Three-dimensional complexes based on streptavidin (or avidin) and on polybiotinylated luminescent compounds - Google Patents

Three-dimensional complexes based on streptavidin (or avidin) and on polybiotinylated luminescent compounds Download PDF

Info

Publication number
WO1990004791A1
WO1990004791A1 PCT/FR1989/000562 FR8900562W WO9004791A1 WO 1990004791 A1 WO1990004791 A1 WO 1990004791A1 FR 8900562 W FR8900562 W FR 8900562W WO 9004791 A1 WO9004791 A1 WO 9004791A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
streptavidin
avidin
luminescent compound
biotin
polybiotinylated
Prior art date
Application number
PCT/FR1989/000562
Other languages
French (fr)
Inventor
Odette Prat
Gérard Mathis
Etienne Jolu
Original Assignee
Compagnie Oris Industrie S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Compagnie Oris Industrie S.A. filed Critical Compagnie Oris Industrie S.A.
Publication of WO1990004791A1 publication Critical patent/WO1990004791A1/en

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means

Definitions

  • the present invention relates to three-dimensional complexes based on streptavidin (or avidin) and on luminescent biotinylated compounds.
  • a given biological substance is highlighted by forming a complex between the desired substance and a specific compound of this substance, said complex being visualized using a marker, for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme etc.
  • the complex formed is a nucleic acid-target / nucleic acid-probe complex in the case of nucleic acid assays by the hybridization technique, and an antigen / antibody complex in the case of immunological assays.
  • Radioimmunoassays are the oldest immunoassay techniques. However, they have drawbacks linked in particular to the handling of radioactive substances.
  • enzyme immunoassays and fluoroimmunoassays in which an enzyme or a fluorescent agent is used respectively as a marker.
  • fluorescent agents suitable in this field there may be mentioned in particular: chelating agents, such as those described in patent applications EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413 and EP-A-0.171.978 or international application W087 / 02708, the rare earth cryptates, such as those described in patent applications FR 84.14799 and 87.17765. Nucleic acid assays using DNA or RNA fragments as probes are much more recent.
  • probe nucleic acids essentially consist in hybridizing the sought-after nucleic acid or target nucleic acid with a labeled nucleic acid-probe, and in measuring the quantity of labeled nucleic acid-probe which is fixed.
  • the labeling of the probe nucleic acids is carried out using markers analogous to those used in the field of immunoassays. These markers are mainly isotopes, enzymes and luminescent agents.
  • markers are mainly isotopes, enzymes and luminescent agents.
  • the avidin-biotin or streptavidin-biotin systems are used in particular in assays, immunological by fluorescence resolved over time.
  • Each streptavidin molecule can be labeled with ten chelate molecules.
  • the amplification at the assay site is therefore only 10.
  • the demonstration of the complex formed can only be done through a step additional during which the enzymatic activity of the complex is revealed by causing an emission of light (bioluminescence) in the presence of suitable reagents.
  • the assays by direct fluorescence are faster than the assays using an enzyme insofar as the label used is directly fluorescent and does not need to be revealed, as is the case for an enzyme.
  • the new compounds according to the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one streptavidin (or avidin) molecule linked by affinity bond to at least one polybiotinylated luminescent compound or to at least one polybiotinylated macromolecule coupled to at least one compound luminescent, one of the affinity binding sites of streptavidin (avidin) with biotin being free.
  • streptavidin or avidin
  • the compounds of the invention can be represented by the following statistical formula
  • X represents the luminescent compound
  • P represents the macromolecule
  • B represents biotin
  • A represents avidin or streptavidin; i is an integer greater than or equal to 1; j is an integer equal to 0 or 1;
  • Avidin which comes from egg white and streptavidin, which is extracted from Streptomyces * avidinii, are tetrameric proteins containing four affinity binding sites for biotin, which is a vitamin, low molecular weight, soluble in water.
  • the luminescent compounds suitable for the purposes of the invention are both phosphorescent compounds, such as eosin, erythrosine, acridine or derivatives thereof, as fluorescent compounds, such as in particular chelating agents, cryptates or other luminescent molecules, in particular phycobiliproteins (V. 01 et al. J. of Cell Biology
  • EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413, EP-A-0.171.978 and EP-A-0.203.407 these documents being incorporated by reference into the present request.
  • the cryptates which are suitable for the purposes of the invention are the rare earth cryptates described in patent applications FR 84.14799 and FR 87.17765 also incorporated in the present description by way of reference. We prefer everything particularly the rare earth cryptates described in patent application FR 87.17765.
  • the luminescent compounds which naturally carry at least two reactive functions with respect to biotin can be used according to the invention as well as the luminescent compounds onto which such reactive functions have been introduced chemically.
  • reactive functions with respect to biotin functions capable of forming with the reactive functions of biotin stable covalent bonds.
  • the reactive functions with respect to biotin can be, for example, alcohol, acid, amino and thiol functions.
  • the introduction of the reactive functions on the luminescent compound can be carried out by any conventional means within the reach of the skilled person using the heterobifunctional compounds available commercially.
  • the compounds of the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one molecule of streptavidin (avidin) linked by affinity bond to a luminescent polybiotinylated compound, one of the affinity binding sites of the biotin streptavidin (avidin) being free.
  • the luminescent compound is directly biotinylated and serves as a bridge between the streptavidin molecules.
  • the compounds of the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one streptavidin (avidin) linked by affinity bonding to at least one polybiotinylated macromolecule, coupled to at least one luminescent compound, one of the affinity binding sites of streptavidin (avidin) with biotin being free.
  • the streptavidin molecules are linked together via a non-luminescent macromolecule which is coupled to both the luminescent compound and the biotin. They can be represented schematically as follows:
  • the macromolecules used according to the invention can be proteins having a molecular weight between
  • proteins suitable for the purposes of the invention mention may in particular be made of human or animal plasma proteins such as for example human serum albumin or thyroglobulin.
  • water-soluble polymers it is possible to use the water-soluble polymers defined in patent application W0
  • the macromolecules used according to the invention must have at least two reactive functions with respect to biotin. These reactive functions can be naturally present on the macromolecule or introduced chemically by any process within the reach of those skilled in the art using the heterobifunctional compounds available commercially.
  • the macromolecules used according to the invention must also have adequate functions allowing coupling with the luminescent compound as defined above.
  • a luminescent compound when the macromolecule used is human serum albumin, a luminescent compound may be coupled thereto by using the naturally present reactive functions thereof, such as the amino functions and the acid functions and by using the agents of classic coupling well known to those skilled in the art.
  • the complexes of the invention in which the luminescent compound is directly biotinylated are obtained by "the process which consists: 1) in polybiotinylating the luminescent compound after having optionally introduced thereon at least two reactive functions with respect to biotin;
  • the luminescent compound chosen must have at least two organic functions which are reactive with regard to biotin. These functions can be acid, amino, alcohol or thiol functions.
  • the luminescent compound does not have such reactive functions, these can be introduced. on said compound by appropriate reactions well known to those skilled in the art, using the commercially available heterobifunctional compounds.
  • the luminescent compound naturally having at least two reactive organic functions or endowed with these functions according to the above methods, can - then be polybiotinylated, that is to say condensed by covalent bond with at least two molecules of biotin per 1 action of suitable reagents well known to those skilled in the art.
  • the reactive functions of the luminescent compound then react with the reactive functions of biotin.
  • the luminescent compound Depending on the reactive functions carried by the luminescent compound, it is possible to use: a) the reaction of active esters for the primary amines to form amides; b) reacting active esters with alcohols to form esters; c) the reaction of isocya ⁇ ates or isothiocyanates with amines to form ureas or thioureas; d) the reaction of maleimides with thiols to form thioethers; e) reacting diazonium salts with aromatic compounds to form diazo compounds; f) reacting sulfonic acid chlorides with alcohols or amines to form sulfonates or sulfonamides.
  • a dibioti ⁇ ylated europium cryptate can be formed by the action of biotin
  • biotinylated molecules based on rare earth chelates it is possible for example to use the products corresponding to the formulas ZB and YB below:
  • the three-dimensional complex according to the first variant is then obtained by mixing at room temperature in an appropriate buffer (for example PBS pH 7.4) of the luminescent compound thus polybiotinylated and of streptavidin (or avidin).
  • an appropriate buffer for example PBS pH 7.4
  • one of the streptavidin (or avidin) binding sites for biotin must be free.
  • the stoichiometry of the complex must therefore be optimized so as not to saturate all the sites.
  • the complexes according to the second variant namely those which have at least one macromolecule, are obtained by the process which consists:
  • streptavidin site available.
  • biotinylate albumin as a macromolecule by the action of biotin -NHS on amino functions of the protein.
  • biotin -NHS on amino functions of the protein.
  • EDC ethyldimethylamino-propylcarbodiimide.
  • the three-dimensional complex is formed by mixing the molecule thus formed with streptavidin in defined amounts in a buffer medium (PBS pH 7.4).
  • All the complexes according to the invention are stable compounds, which can be stored at 4 ° C. or in sterile solutions.
  • the complexes according to the invention are suitable as fluorescent markers for the detection of biomolecules biotinylated (nucleic acids, oligo ⁇ ucleotides, antibodies, proteins, antigens, haptens or any other biological substances) recognizing biomolecules for which they have a great affinity in a mixture according to a conventional assay or detection process.
  • biomolecules biotinylated nucleic acids, oligo ⁇ ucleotides, antibodies, proteins, antigens, haptens or any other biological substances
  • biotinylation of the substances to be assayed is carried out according to techniques well known to those skilled in the art.
  • the complexes according to the invention are also suitable for the determination or detection of nucleic acids, such as those described in the article by J. Matthews and L. Kricka in Analytical Biochemistry 169, 1-25 (1988) entitled “Analytical strategies for the use of DNA probes ", only for assays of biological substances such as those described in international patent applications W085 / 03356 and W087 / 02708.
  • the complexes according to the invention may be used as markers in all types of immunoassays by competition or by excess described in particular in US patent 4,281,061 or by "Monoclonal Antibodies and developme ⁇ t in Immunoassay” Elsevier 1981, p. 3-21.
  • these assays can be carried out both in the liquid phase and on any solid support commonly used in this field, such as for example on cellulose nitrate or nylon membrane, microparticles of latex, polystyrene or cellulose, etc. .
  • the mixture was produced at room temperature with slight stirring for 30 min minimum and was then stored at 4 ° C until use.
  • the membrane was then presaturated with a solution (A) containing 4 x SSC, 10 x FPG (0.2% ficoll, 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% glycine), 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml herring sperm DNA at 100 ⁇ g / ml overnight at 65 ° C.
  • A a solution containing 4 x SSC, 10 x FPG (0.2% ficoll, 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% glycine), 0.1% SDS and 100 ⁇ g / ml herring sperm DNA at 100 ⁇ g / ml overnight at 65 ° C.
  • the membrane was then placed in the presence of a biotinylated probe (B) previously denatured at 100 ° C for 5 min.
  • biotinylated probe was prepared according to the method of LANGER, WALDROP and WARD (PNAS, 1981, 78_, 6633-6637) by "nicktranslation” by incorporating a biotinylated ⁇ ucleotide (biotin-II-dUTP) using the labeling kit marketed by BRL (Bethesda Research Laboratories).
  • Hybridization was carried out with 0.5 ⁇ g of probe / ml (B) in the buffer (A) above overnight at 65 ° C.
  • the membrane was then washed 3 times 15 min in solutions of decreasing ionic strength containing 0.1% SDS.
  • the membrane was again treated to avoid non-specific adsorption of the complex containing cryptate with a 3% BSA solution in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl for 1 h at 65 ° C.
  • the membrane was then placed in contact for 30 min at room temperature with a solution of streptavidin-dibiotinylated cryptate complex at a rate of 5 ⁇ g of streptavidin / ml in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.05% Triton X-100, 1 g / 1 HSA and 1 g / 1 herring sperm DNA (C).
  • Tris-HCl pH 7.4
  • Triton X-100 1 g / 1 HSA
  • C herring sperm DNA
  • the membrane could then be analyzed without further treatment on a time-resolved epifluorescence reading device.
  • the emission excitation wavelengths were 308 nm and 618 nm respectively.
  • the read delay was 0.2 ms and the measurement duration was 0.4 ms.
  • the fluorescence values measured for unknown samples are compared to a calibration curve established for known quantities of target DNA and thus make it possible to find the quantity of target DNA fixed to the membrane.
  • Example 4 Detection by the complex of Example 2 and a biotinylated oligonucleotide probe of a target DNA fragment fixed to a membrane constituting the bottom of a 96-well plate
  • DNA deposits to be assayed were made as in the previous example but at the bottom of microwells fitted with a nitrocellulose membrane.
  • the microplate was placed for two hours at 50 ° C. Prehybridization was carried out for one hour at 40 ° C with 200 ⁇ l of buffer A.
  • the prehybridization mixture was replaced by 100 ⁇ l of hybridization solution containing 100 ng / ml in buffer A of a biotinylated oligonucleotide complementary to the target sequence, comprising one or more 5 * biotin molecules and comprising 15 to 50 residues.
  • the hybridization lasted from one hour to 4 hours at a temperature varying from 20 ° C to 50 ° C depending on the length of the probe chosen, with slight agitation of the microplate.
  • the membranes were then presaturated with 100 ⁇ l of a solution of 3% BSA in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl for one hour at 30 ° C. After elimination of this solution, each well received 100 ⁇ l of a solution of fluorescent complex according to Example 2 at 5 g / ml in streptavidin. The plate was stirred for one hour at room temperature.
  • Example 3 The wells were then washed three times with the washing solution as in Example 3, then the microplate was placed 5 min in a microwave oven (or 5 min in an oven at 80 ° C).
  • the measurement of the residual fluorescence was then carried out on an automatic device suitable for reading by epifluorescence on a 96-well plate connected to a computer making it possible to process these data.
  • comparing the measured values with calibration curves provides access to the quantity of target DNA contained in each well.
  • the protein fractions are then combined and dialyzed against a HEPES 10 mM 1M NaCl buffer pH 7.4, hereinafter referred to as buffer J.
  • the level of cryptate / HSA labeling is approximately 5.
  • the mixture is produced at room temperature with gentle stirring for at least 30 min and stored at -20 ° C in the presence of glycerol (50%).
  • the complex thus prepared can be used both for the detection of nucleic acids by means of biotinylated probes and for the detection of antigens by means of specific biotinylated antibodies, as described in the following example.
  • microwells of a polystyrene plate were treated with a 1 g / ml solution of a monoclonal antibody directed against a specific antigen (protein) for 18 hours at 4 ° C. in a 100 M carbonate buffer pH 8.6.
  • the wells are placed under light agitation for 30 min to 3 hours depending on the nature of the antigen to be assayed, then washed with five times 300 ⁇ l of 100 M phosphate buffer pH 7.4, 0.1%
  • the wells are dried for 5 min under a stream of dry air, the residual fluorescence originating from the complex attached to the bottom of the wells is measured by epifluorescence without any other form of treatment.
  • epifluorescence without any other form of treatment.

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Abstract

The invention concerns three-dimensional complexes consisting of at least one molecule of streptavidin (or avidin) linked by an affinity bond to at least one polybiotinylated luminescent compound or to at least one polybiotinylated macromolecule coupled to at least one luminescent compound, one of the sites of the affinity bond between the streptavidin (avidin) and the biotin being free. Application: labels for immunological doses or for the detection or determination of target nucleic acids.

Description

Complexes tridimensionnels à base de streptavidine (ou avidine) et de composés luminescents polybiotinylés. Three-dimensional complexes based on streptavidin (or avidin) and on polybiotinylated luminescent compounds.
La présente invention a pour objet des complexes tridimensionnels à base de streptavidine (ou avidine) et de composés luminescents biotinylés.The present invention relates to three-dimensional complexes based on streptavidin (or avidin) and on luminescent biotinylated compounds.
Elle concerne également le procédé pour l'obtention de ces complexes ainsi que leur application dans le domaine des dosages immunologiques et des dosages d'acides nucléiques.It also relates to the process for obtaining these complexes as well as their application in the field of immunological assays and assays of nucleic acids.
De manière générale, dans les dosages immunologiques et les dosages d'acides nucléiques, on met en évidence une substance biologique donnée en formant un complexe entre la substance recherchée et un composé spécifique de cette substance, ledit complexe étant visualisé à l'aide d'un marqueur, par exemple un radioisotope, un composé fluorescent, une enzyme etc. Le complexe formé est un complexe acide nucléique-cible/acide nucléique-sonde dans le cas de dosages d'acides nucléiques par la technique d'hybridation, et un complexe antigène/anticorps dans le cas des dosages immunologiques.In general, in immunoassays and nucleic acid assays, a given biological substance is highlighted by forming a complex between the desired substance and a specific compound of this substance, said complex being visualized using a marker, for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme etc. The complex formed is a nucleic acid-target / nucleic acid-probe complex in the case of nucleic acid assays by the hybridization technique, and an antigen / antibody complex in the case of immunological assays.
Les dosages radioimmunologiques sont les techniques de dosages immunologiques les plus anciennes. Elles présentent toutefois des inconvénients liés notamment à la manipulation de substances radioactives.Radioimmunoassays are the oldest immunoassay techniques. However, they have drawbacks linked in particular to the handling of radioactive substances.
Parmi les autres techniques couramment utilisées, on peut citer principalement les dosages immunoenzymatiques et les dosages fluoroimmunologiques dans lesquels on utilise respectivement une enzyme ou un agent fluorescent comme marqueur. Parmi les agents fluorescents appropriés dans ce domaine, on peut citer notamment : les agents chélatants, tels que ceux décrits dans les demandes de brevets EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413 et EP-A-0.171.978 ou la demande internationale W087/02708, les cryptâtes de terres rares, tels que ceux décrits dans les demandes de brevets FR 84.14799 et 87.17765. Les dosages d'acides nucléiques utilisant les fragments d'ADN ou d'ARN comme sondes sont beaucoup plus récents. Ils consistent essentiellement à hybrider l'acide nucléique recherché ou acide nucléique-cible avec un acide nucléique-sonde marqué, et à mesurer la quantité d'acide nucléique-sonde marqué qui s'est fixée. Le marquage des acides nucléiques-sondes est réalisé à l'aide de marqueurs analogues à ceux utilisés dans le domaine des dosages immunologiques. Ces marqueurs sont principalement les isotopes, les enzymes et les agents luminescents. D'autre part, on a proposé d'utiliser dans tous les types de dosages, l'affinité de deux substances entre elles, telles que par exemple la biotine et l'avidine ou la biotine et la streptavidine. A cet effet, on peut se référer notamment à l'ouvrage ci-après : M. WILCHEK et E. BAYER Anal. Biochem. (1988), 171, 1-32.Among the other techniques commonly used, there may be mentioned mainly enzyme immunoassays and fluoroimmunoassays in which an enzyme or a fluorescent agent is used respectively as a marker. Among the fluorescent agents suitable in this field, there may be mentioned in particular: chelating agents, such as those described in patent applications EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413 and EP-A-0.171.978 or international application W087 / 02708, the rare earth cryptates, such as those described in patent applications FR 84.14799 and 87.17765. Nucleic acid assays using DNA or RNA fragments as probes are much more recent. They essentially consist in hybridizing the sought-after nucleic acid or target nucleic acid with a labeled nucleic acid-probe, and in measuring the quantity of labeled nucleic acid-probe which is fixed. The labeling of the probe nucleic acids is carried out using markers analogous to those used in the field of immunoassays. These markers are mainly isotopes, enzymes and luminescent agents. On the other hand, it has been proposed to use in all types of assays, the affinity of two substances between them, such as for example biotin and avidin or biotin and streptavidin. To this end, we can refer in particular to the following work: M. WILCHEK and E. BAYER Anal. Biochem. (1988), 171, 1-32.
Par exemple, les systèmes avidine-biotine ou streptavidine-biotine sont utilisés notamment dans les dosages, immunologiques par fluorescence résolue dans le temps.For example, the avidin-biotin or streptavidin-biotin systems are used in particular in assays, immunological by fluorescence resolved over time.
A cet effet, on peut citer par exemple l'article de Chan et al. dans Clin. Chem. 33/11, 2000-2003 (1987) qui décrit le dosage de l'alphafétoprotéine à l'aide d'anticorps biotinylés et d'un complexe streptavidine-chélate d'europium.For this purpose, one can quote for example the article of Chan et al. in Clin. Chem. 33/11, 2000-2003 (1987) which describes the determination of alphafetoprotein using biotinylated antibodies and a streptavidin-europium chelate complex.
De même, dans le domaine des dosages d'acides nucléiques, on peut citer l'article de " Dahlen, dans Analytical Biochemistry 164, 78-83 (1987) qui décrit la détection, par fluorescence résolue dans le temps, de sondes d'ADN biotinylées à l'aide de streptavidine marquée par un chélate d'europium. Il s'agit donc d'une méthode de dosage utilisant un conjugué covalent de streptavidine et de chélate d'europium comme traceur pour reconnaître un acide nucléique biotinylé.Likewise, in the field of nucleic acid assays, mention may be made of the article by " Dahlen, in Analytical Biochemistry 164, 78-83 (1987) which describes the detection, by time resolved fluorescence, of DNA biotinylated using streptavidin labeled with europium chelate, therefore it is a method of assay using a covalent conjugate of streptavidin and europium chelate as a tracer to recognize a biotinylated nucleic acid.
Chaque molécule de streptavidine peut être marquée par dix molécules de chélate. L'amplification au site de dosage est donc seulement de 10.Each streptavidin molecule can be labeled with ten chelate molecules. The amplification at the assay site is therefore only 10.
Dans les dosages immunoenzymatiques, on a également proposé l'utilisation de complexes formés par interaction d'avidine avec une enzyme biotinylée, par exemple la glucose -6- phosphate déhydrogénase biotinylée comme décrit dans la demande internationale WO 85/03356.In enzyme immunoassays, the use of complexes formed by the interaction of avidin with a biotinylated enzyme has also been proposed, for example biotinylated glucose -6-phosphate dehydrogenase as described in international application WO 85/03356.
On notera dans ce cas que la mise en évidence du complexe formé ne peut se faire que par l'intermédiaire d'une étape supplémentaire au cours de laquelle l'activité enzymatique du complexe est révélée en provoquant une émission de lumière (bioluminescence) en présence de réactifs appropriés.Note in this case that the demonstration of the complex formed can only be done through a step additional during which the enzymatic activity of the complex is revealed by causing an emission of light (bioluminescence) in the presence of suitable reagents.
De même dans Nature vol 320, Avril 1986, on a proposé l'utilisation de l'interaction streptavidine-biotine et l'utilisation de complexes tridimensionnels de streptavidine et d'enzymes biotinylées.Similarly in Nature vol 320, April 1986, the use of the streptavidin-biotin interaction and the use of three-dimensional complexes of streptavidin and biotinylated enzymes have been proposed.
Les dosages par fluorescence directe sont plus rapides que les dosages mettant en oeuvre une enzyme dans la mesure où le marqueur utilisé est directement fluorescent et n'a pas besoin d'être révélé, comme c'est le cas pour une enzyme.The assays by direct fluorescence are faster than the assays using an enzyme insofar as the label used is directly fluorescent and does not need to be revealed, as is the case for an enzyme.
De plus, contrairement à une réaction de bioluminescence où l'émission de lumière, produite par la dégradation d'un substrat par une enzyme, est un phénomène irréversible et éphémère, la fluorescence, due à une molécule organique, est un phénomène reproductible et persistant.In addition, unlike a bioluminescence reaction where the emission of light, produced by the degradation of a substrate by an enzyme, is an irreversible and ephemeral phenomenon, fluorescence, due to an organic molecule, is a reproducible and persistent phenomenon .
Il suffit de maintenir l'excitation du fluorophore à une longueur d'onde donnée pour observer une émission de fluorescence caractéristique. Toutefois, il s'est avéré que la sensibilité des dosages par fluorescence résolue dans le temps pouvait être relativement faible, notamment lorsque le dosage est réalisé en phase solide (voir W087/02708 page 51) .It suffices to maintain the excitation of the fluorophore at a given wavelength to observe a characteristic fluorescence emission. However, it has been found that the sensitivity of assays by fluorescence resolved over time could be relatively low, in particular when the assay is carried out in the solid phase (see WO87 / 02708 page 51).
On a maintenant trouvé des nouveaux composés qui permettent de réaliser des dosages par fluorescence et notamment des dosages par fluorescence résolue dans le temps avec une très grande sensibilité.We have now found new compounds which make it possible to carry out assays by fluorescence and in particular assays by fluorescence resolved over time with very high sensitivity.
Les nouveaux composés selon l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (ou avidine) liée par liaison d'affinité à au moins un composé luminescent polybiotinylé ou à au moins une macromolécule polybiotinylée couplée à au moins un composé luminescent, l'un des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre. Les composés de l'invention peuvent être représentés par la formule statistique ci-aprèsThe new compounds according to the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one streptavidin (or avidin) molecule linked by affinity bond to at least one polybiotinylated luminescent compound or to at least one polybiotinylated macromolecule coupled to at least one compound luminescent, one of the affinity binding sites of streptavidin (avidin) with biotin being free. The compounds of the invention can be represented by the following statistical formula
[xi pj Bk] m[ x i p j B k] m
dans laquelle :in which :
X représente le composé luminescent ;X represents the luminescent compound;
P représente la macromolécule ;P represents the macromolecule;
B représente la biotine ;B represents biotin;
A représente 1*avidine ou la streptavidine ; i est un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; j est un nombre entier égal à 0 ou 1 ;A represents avidin or streptavidin; i is an integer greater than or equal to 1; j is an integer equal to 0 or 1;
K est un nombre entier supérieur ou égal à 2 ; π est un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; m est un nombre entier supérieur ou égal à n, et inférieur à 4n. L'avidine, qui provient du blanc d'oeuf et la streptavidine, qui est extraite de Streptomyces*avidinii, sont des protéines tétramères contenant quatre sites de liaison d'affinité pour la biotine, laquelle est une vitamine, de faible poids moléculaire, soluble dans l'eau. Les composés luminescents appropriés aux fins de l'invention sont aussi bien des composés phosphorescents, tels que l'éosine, l'érythrosine, l'acridine ou des dérivés de celle-ci, que des composés fluorescents, tels que notamment les agents chélatants, les cryptâtes ou les autres molécules luminescentes, notamment les phycobiliprotéines (V. 01 et al. J. of Cell BiologyK is an integer greater than or equal to 2; π is an integer greater than or equal to 1; m is an integer greater than or equal to n, and less than 4n. Avidin, which comes from egg white and streptavidin, which is extracted from Streptomyces * avidinii, are tetrameric proteins containing four affinity binding sites for biotin, which is a vitamin, low molecular weight, soluble in water. The luminescent compounds suitable for the purposes of the invention are both phosphorescent compounds, such as eosin, erythrosine, acridine or derivatives thereof, as fluorescent compounds, such as in particular chelating agents, cryptates or other luminescent molecules, in particular phycobiliproteins (V. 01 et al. J. of Cell Biology
(1982), 981-986).(1982), 981-986).
A titre d'agents chélatants, on peut citer par exemple les chélates de terres rares décrits dans les demandes de brevetsMention may be made, as chelating agents, of the rare earth chelates described in the patent applications.
EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413, EP-A-0.171.978 et EP-A-0.203.407 ces documents étant incorporés à titre de référence dans la présente demande.EP-A-0.068.875, EP-A-0.203.047, EP-A-0.195.413, EP-A-0.171.978 and EP-A-0.203.407 these documents being incorporated by reference into the present request.
Les cryptâtes qui conviennent aux fins de l'invention sont les cryptâtes de terres rares décrits dans les demandes de brevets FR 84.14799 et FR 87.17765 également incorporées dans la présente description à titre de référence. On préfère tout particulièrement les cryptâtes de terres rares décrits dans la demande de brevet FR 87.17765.The cryptates which are suitable for the purposes of the invention are the rare earth cryptates described in patent applications FR 84.14799 and FR 87.17765 also incorporated in the present description by way of reference. We prefer everything particularly the rare earth cryptates described in patent application FR 87.17765.
On peut utiliser selon l'invention aussi bien les composés luminescents portant naturellement au moins deux fonctions réactives à l'égard de la biotine que les composés luminescents sur lesquels on a introduit par voie chimique de telles fonctions réactives.The luminescent compounds which naturally carry at least two reactive functions with respect to biotin can be used according to the invention as well as the luminescent compounds onto which such reactive functions have been introduced chemically.
Par "fonctions réactives à l'égard de la biotine" on désigne les fonctions capables de former avec les fonctions réactives de la biotine des liaisons covalentes stables.By "reactive functions with respect to biotin" is meant functions capable of forming with the reactive functions of biotin stable covalent bonds.
Les fonctions réactives à l'égard de la biotine peuvent être par exemple des fonctions alcool, acide, aminé et thiol.The reactive functions with respect to biotin can be, for example, alcohol, acid, amino and thiol functions.
L'introduction des fonctions réactives sur le composé luminescent peut être réalisé par tout moyen classique à la portée de l'homme de métier en utilisant les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement.The introduction of the reactive functions on the luminescent compound can be carried out by any conventional means within the reach of the skilled person using the heterobifunctional compounds available commercially.
Selon une première variante, les composés de l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (avidine) liée par liaison d'affinité à un composé luminescent polybiotinylé, l'un des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) à la biotine étant libre. Dans ce cas, le composé luminescent est directement biotinylé et sert de pont entre les .molécules de streptavidine.According to a first variant, the compounds of the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one molecule of streptavidin (avidin) linked by affinity bond to a luminescent polybiotinylated compound, one of the affinity binding sites of the biotin streptavidin (avidin) being free. In this case, the luminescent compound is directly biotinylated and serves as a bridge between the streptavidin molecules.
Ils peuvent être représentés sché atiquement comme suit :They can be represented diagrammatically as follows:
SAj... B BSAj ... B B
I XI X
II
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0001
B : biotine
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000007_0001
B: biotin
SA : streptavidine ou avidineSA: streptavidin or avidin
X : composé luminescentX: luminescent compound
Selon une seconde variante, les composés de l'invention sont des complexes tridimensionnels constitués d'au moins une streptavidine (avidine) liée par liaison d'affinité à au moins une macromolécule polybiotinylée, couplée à au moins un composé luminescent, l'un des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre. Dans ce cas, les molécules de streptavidine sont reliées entre elles par l'intermédiaire d'une macromolécule non luminescente qui est couplée à la fois au composé luminescent et à la biotine. Ils peuvent être représentés schématiquement comme suit :According to a second variant, the compounds of the invention are three-dimensional complexes consisting of at least one streptavidin (avidin) linked by affinity bonding to at least one polybiotinylated macromolecule, coupled to at least one luminescent compound, one of the affinity binding sites of streptavidin (avidin) with biotin being free. In this case, the streptavidin molecules are linked together via a non-luminescent macromolecule which is coupled to both the luminescent compound and the biotin. They can be represented schematically as follows:
Figure imgf000008_0001
B = Biotine
Figure imgf000008_0001
B = Biotin
SA = Streptavidine ou avidineSA = Streptavidin or avidin
X = composé luminescentX = luminescent compound
o*macromoléculeo * macromolecule
Les macromolécules mises en oeuvre selon l'invention peuvent être des protéines ayant un poids moléculaire compris entreThe macromolecules used according to the invention can be proteins having a molecular weight between
4 6 10 et 10 daltons ou des polymères hydrosolubles ayant un poids4 6 10 and 10 daltons or water-soluble polymers having a weight
4 6 moléculaire compris entre 10 et 10 daltons.4 6 molecular between 10 and 10 daltons.
A titre d'exemple de protéines appropriées aux fins de l'invention, on peut citer notamment les protéines plasmatiques humaines ou animales telles que par exemple la sérum albumine humaine ou la thyroglobuline.By way of example of proteins suitable for the purposes of the invention, mention may in particular be made of human or animal plasma proteins such as for example human serum albumin or thyroglobulin.
Comme polymères hydrosolubles, on pourra utiliser les polymères hydrosolubles définis dans la demande de brevet W0As water-soluble polymers, it is possible to use the water-soluble polymers defined in patent application W0
88/02784, à savoir les polymères de type polyuréthane, polyéthylèneimine, polylysine, polyarginine, polysaccharides et leurs dérivés ainsi que les polyacrylamides.88/02784, namely polymers of polyurethane, polyethyleneimine, polylysine, polyarginine, polysaccharides and their derivatives as well as polyacrylamides.
Les macromolécules mises en oeuvre selon l'invention doivent posséder au moins deux fonctions réactives à l'égard de la biotine. Ces fonctions réactives peuvent être naturellement présentes sur la macromolécule ou introduites par voie chimique par tout procédé à la portée de l'homme de métier utilisant les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement.The macromolecules used according to the invention must have at least two reactive functions with respect to biotin. These reactive functions can be naturally present on the macromolecule or introduced chemically by any process within the reach of those skilled in the art using the heterobifunctional compounds available commercially.
Les macromolécules utilisées selon l'invention doivent posséder en outre des fonctions adéquates permettant le couplage avec le composé luminescent tel que défini précédemment.The macromolecules used according to the invention must also have adequate functions allowing coupling with the luminescent compound as defined above.
Par exemple, lorsque la macromolécule utilisée est la sérum albumine humaine, on pourra coupler à celle-ci un composé luminescent en utilisant les fonctions réactives naturellement présentes de celle-ci, telles que les fonctions aminés et les fonctions acides et en utilisant les agents de couplage classiques bien connus de l'homme de métier.For example, when the macromolecule used is human serum albumin, a luminescent compound may be coupled thereto by using the naturally present reactive functions thereof, such as the amino functions and the acid functions and by using the agents of classic coupling well known to those skilled in the art.
Les complexes de l'invention dans lesquels le composé luminescent est directement biotinylé, sont obtenus par "le procédé qui consiste : 1) à polybiotinyler le composé luminescent après avoir éventuellement introduit sur celui-ci au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine ;The complexes of the invention in which the luminescent compound is directly biotinylated, are obtained by "the process which consists: 1) in polybiotinylating the luminescent compound after having optionally introduced thereon at least two reactive functions with respect to biotin;
2) à mélanger ledit composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoechiométriques définies. Le composé luminescent choisi doit posséder au moins deux fonctions organiques réactives a l'égard de la biotine. Ces fonctions peuvent être des fonctions acide, aminé, alcool ou thiol.2) mixing said polybiotinylated luminescent compound with streptavidin (or avidin) in defined stoichiometric amounts. The luminescent compound chosen must have at least two organic functions which are reactive with regard to biotin. These functions can be acid, amino, alcohol or thiol functions.
Dans le cas où le composé luminescent ne possède pas de telles fonctions réactives, celles-ci peuvent être introduites . sur ledit composé par des réactions appropriées bien connues de l'homme de métier, en utilisant les composés hétérobifonctionnels disponibles commercialement.In the case where the luminescent compound does not have such reactive functions, these can be introduced. on said compound by appropriate reactions well known to those skilled in the art, using the commercially available heterobifunctional compounds.
Le composé luminescent, possédant naturellement au moins deux fonctions organiques réactives ou doté de ces fonctions selon les procédés ci-dessus, pourra - alors être polybiotinylé, c'est-à-dire condensé par liaison covalente avec au moins deux molécules de biotine par l'action de réactifs adéquats bien connus de l'homme de métier. Les fonctions réactives du composé luminescent réagissent alors avec les fonctions réactives de la biotine.The luminescent compound, naturally having at least two reactive organic functions or endowed with these functions according to the above methods, can - then be polybiotinylated, that is to say condensed by covalent bond with at least two molecules of biotin per 1 action of suitable reagents well known to those skilled in the art. The reactive functions of the luminescent compound then react with the reactive functions of biotin.
On pourra utiliser, suivant les fonctions réactives portées par le composé luminescent : a) la réaction d'esters actifs pour les aminés primaires pour former des amides ; b) la réaction d'esters actifs sur les alcools pour former des esters ; c) la réaction d'isocyaπates ou isothiocyanates avec des aminés pour former des urées ou thiourées ; d) la réaction des maléimides avec des thiols pour former des thioéthers ; e) la réaction de sels de diazonium avec des composés aromatiques pour former des composés diazo ; f) la réaction de chlorures d'acides sulfoniques sur des alcools ou des aminés pour former des sulfonates ou des sulfamides.Depending on the reactive functions carried by the luminescent compound, it is possible to use: a) the reaction of active esters for the primary amines to form amides; b) reacting active esters with alcohols to form esters; c) the reaction of isocyaπates or isothiocyanates with amines to form ureas or thioureas; d) the reaction of maleimides with thiols to form thioethers; e) reacting diazonium salts with aromatic compounds to form diazo compounds; f) reacting sulfonic acid chlorides with alcohols or amines to form sulfonates or sulfonamides.
A titre d'exemple, on pourra former un cryptate d'europium dibiotiπylé par action de la biotineBy way of example, a dibiotiπylated europium cryptate can be formed by the action of biotin
N-hydroxysuccinimide ester (Biotine-NHS) sur le cryptate trisbipyridiπe diamine d'europium selon le schéma réactionnel ci-après :N-hydroxysuccinimide ester (Biotin-NHS) on the europium diamine trisbipyridiπe cryptate according to the reaction scheme below:
[Eu C (bipy.bipy.bipy(NH2)2)"| Cl3 + Biotine.NHS[Eu C (bipy.bipy.bipy (NH 2 ) 2 ) " | Cl 3 + Biotine.NHS
[Eu C (bipy.bipy.bipy (Biotine)2)j C ,[Eu C (bipy.bipy.bipy (Biotin) 2 ) j C,
Quant aux molécules biotinylées a base de chélates de terres rares, on pourra par exemple utiliser les produits répondant aux formules ZB et YB ci-après :As for the biotinylated molecules based on rare earth chelates, it is possible for example to use the products corresponding to the formulas ZB and YB below:
Figure imgf000011_0001
10
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10
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Le complexe tridimensionnel selon la première variante est ensuite obtenu par mélange à température ambiante dans un tampon approprié (par exemple PBS pH 7,4) du composé luminescent ainsi polybiotinylé et de streptavidine (ou avidine) .The three-dimensional complex according to the first variant is then obtained by mixing at room temperature in an appropriate buffer (for example PBS pH 7.4) of the luminescent compound thus polybiotinylated and of streptavidin (or avidin).
Comme indiqué précédemment, un des sites de liaison de la streptavidine (ou avidine) pour la biotine doit être libre. La stoéchiométrie du complexe doit donc être optimisée de façon à ne pas saturer tous les sites.As previously indicated, one of the streptavidin (or avidin) binding sites for biotin must be free. The stoichiometry of the complex must therefore be optimized so as not to saturate all the sites.
Les complexes selon la seconde variante, à savoir ceux qui possèdent au moins une macromolécule, sont obtenus par le procédé qui consiste :The complexes according to the second variant, namely those which have at least one macromolecule, are obtained by the process which consists:
1) à polybiotinyler la macromolécule après avoir éventuellement introduit sur celle-ci, au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine ;1) polybiotinylating the macromolecule after having optionally introduced thereon at least two reactive functions with respect to biotin;
2) à coupler par liaison covalente, la molécule polybiotinylée au composé luminescent ;2) coupling, by covalent bond, the polybiotinylated molecule to the luminescent compound;
3) à mélanger le composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoéchiométriques définies.3) mixing the luminescent polybiotinylated compound with streptavidin (or avidin) in defined stoichiometric amounts.
Ces quantités doivent être optimisées de façon à laisser au moins un site de streptavidine disponible. A titre d'exemple, on peut biotinyler de l'albumine entant que macromolécule par action de biotine -NHS sur les fonctions aminés de la protéine. Puis on peut la coupler à un cryptate d'europium diamine en faisant réagir les fonctions C00K de la protéine en présence de EDC (ethyldimethylamino- propylcarbodiimide) . Enfin, on forme le complexe tridimensionnel en mélangeant la molécule ainsi formée avec de la streptavidine en quantités définies dans un milieu tampon (PBS pH 7,4).These amounts must be optimized so as to leave at least one streptavidin site available. For example, it is possible to biotinylate albumin as a macromolecule by the action of biotin -NHS on amino functions of the protein. Then it can be coupled to a europium diamine cryptate by reacting the C00K functions of the protein in the presence of EDC (ethyldimethylamino-propylcarbodiimide). Finally, the three-dimensional complex is formed by mixing the molecule thus formed with streptavidin in defined amounts in a buffer medium (PBS pH 7.4).
Tous les complexes selon l'invention sont des composés stables, qui peuvent être conservés à 4°C ou en solutions stériles.All the complexes according to the invention are stable compounds, which can be stored at 4 ° C. or in sterile solutions.
Ces complexes conservent les propriétés de fluorescence du fluorophore utilisé.These complexes retain the fluorescence properties of the fluorophore used.
Par exemple, pour le cryptate d'europium, on peut voir dans le tableau ci-après, que les longueurs d'ondes d'émission ainsi que les durées de vie sont inchangées, que le fluorophore soit sous forme libre, biotinylée ou complexée avec la streptavidine.For example, for europium cryptate, we can see in the table below, that the emission wavelengths as well as the lifetimes are unchanged, whether the fluorophore is in free form, biotinylated or complexed with streptavidin.
Figure imgf000013_0001
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Les complexes selon l'invention conviennent comme marqueurs fluorescents pour la détection des biomolécules biotinylées (acides nucléiques, oligoπucléotides, anticorps, protéines, antigènes, haptènes ou toutes autres substances biologiques) reconnaissant des biomolécules pour lesquelles elles ont une grande affinité dans un mélange selon un procédé de dosage ou de détection classique.The complexes according to the invention are suitable as fluorescent markers for the detection of biomolecules biotinylated (nucleic acids, oligoπucleotides, antibodies, proteins, antigens, haptens or any other biological substances) recognizing biomolecules for which they have a great affinity in a mixture according to a conventional assay or detection process.
La biotinylation des substances à doser est réalisée selon des techniques bien connues de l'homme de l'art.The biotinylation of the substances to be assayed is carried out according to techniques well known to those skilled in the art.
A cet effet, on pourra avantageusement se référer aux ouvrages ci-après, cités dans la présente demande à titre de référence :For this purpose, one can advantageously refer to the works below, cited in this application for reference:
1) P.R. Langer et Coll. dans P.N.A.S., 78, 6633-6637 (1981) pour la biotinylation des acides nucléiques ;1) P.R. Langer et al. in P.N.A.S., 78, 6633-6637 (1981) for the biotinylation of nucleic acids;
2) A. Chollet, N.A.R., 13_, 1529-1541 (1985) pour la biotinylation des oligonucléotides ; 3) P. TIJSSEN "Practice and Theory of enzyme immunoassays" (1985) Elsevier Press pour la biotinylation des protéines.2) A. Chollet, N.A.R., 13, 1529-1541 (1985) for the biotinylation of oligonucleotides; 3) P. TIJSSEN "Practice and Theory of enzyme immunoassays" (1985) Elsevier Press for protein biotinylation.
Les complexes selon l'invention conviennent aussi bien pour les dosages ou détection d'acides nucléiques, tels que ceux décrits dans l'article de J. Matthews et L. Kricka dans Analytical Biochemistry 169, 1-25 (1988) intitulé "Analytical stratégies for the use of DNA probes", que pour les dosages de substances biologiques tels que ceux décrits dans les demandes de brevets internationales W085/03356 et W087/02708.The complexes according to the invention are also suitable for the determination or detection of nucleic acids, such as those described in the article by J. Matthews and L. Kricka in Analytical Biochemistry 169, 1-25 (1988) entitled "Analytical strategies for the use of DNA probes ", only for assays of biological substances such as those described in international patent applications W085 / 03356 and W087 / 02708.
De même on pourra utiliser les complexes selon l'invention comme marqueurs dans tous les types de dosages immunologiques par compétition ou par excès décrits notamment dans le brevet US 4.281.061 ou par "Monoclonal Antibodies and developmeπt in Immunoassay" Elsevier 1981, p. 3-21.Similarly, the complexes according to the invention may be used as markers in all types of immunoassays by competition or by excess described in particular in US patent 4,281,061 or by "Monoclonal Antibodies and developmeπt in Immunoassay" Elsevier 1981, p. 3-21.
On notera que ces dosages pourront être réalisés aussi bien en phase liquide que sur un support solide quelconque couramment utilisé dans ce domaine, tel que par exemple sur membrane en nitrate de cellulose ou en nylon, microparticules de latex, de polystyrène ou de cellulose, etc.It will be noted that these assays can be carried out both in the liquid phase and on any solid support commonly used in this field, such as for example on cellulose nitrate or nylon membrane, microparticles of latex, polystyrene or cellulose, etc. .
L'invention va être maintenant illustrée par les exemples ci-après non limitatifs. Exemple 1The invention will now be illustrated by the following non-limiting examples. Example 1
Synthèse de cryptate-trisbipyridine d'europium biotinyléSynthesis of biotinylated europium cryptate-trisbipyridine
Le cryptate Eu C (bipy.bipy.bipy (NH2)2 Cl3 a été obtenu selon le procédé décrit dans le brevet FR 84.14799 et plus précisément le mode opératoire décrit dans l'exemple 5 de ce brevet.The cryptate Eu C (bipy.bipy.bipy (NH 2 ) 2 Cl 3 was obtained according to the method described in patent FR 84.14799 and more precisely the procedure described in Example 5 of this patent.
0,5 g de cryptate diamine ci-dessus a été dissous dans0.5 g of cryptate diamine above was dissolved in
650 μl de tampon borate 0,1 M pH 9,0. On a ajouté alors 100 ιl d'une solution 0,05 M de biotine L-C NHS (produit PIERCE) en solution dans un tampon borate 0,1 M pH 9,0. La réaction a duré une heure à 37°C.650 μl of 0.1 M borate buffer pH 9.0. Then added 100 μl of a 0.05 M solution of biotin L-C NHS (PIERCE product) in solution in a 0.1 M borate buffer pH 9.0. The reaction lasted one hour at 37 ° C.
Le mélange réactionnel a été alors purifié par HPLC (C18The reaction mixture was then purified by HPLC (C18
Pharmacia) en gradient H20-CH CN 0-60%. On a obtenu deux composés fluorescents élues respectivement à 24 min et .26 min après l'injection.Pharmacia) in gradient H 2 0-CH CN 0-60%. Two fluorescent compounds were obtained, eluted respectively at 24 min and .26 min after the injection.
L'éluant a été évaporé, et le second produit recueilli sous forme de solide blanc dénommé ci-après KB ,a été analysé :The eluent was evaporated, and the second product collected in the form of a white solid hereinafter referred to as KB, was analyzed:
Masse : Pic à 100 % à M/e 1576 pour KB« correspondant au produit attendu (non chloré) .Mass: 100% peak at M / e 1576 for KB "corresponding to the expected product (not chlorinated).
Exemple 2Example 2
Préparation d'un complexe de streptavidine et de cryptate d'europium* dibiotinylé (SA-KB?)Preparation of a complex of streptavidin and dibiotinylated europium * cryptate (SA-KB ? )
1 ml d'une solutiori~de streptavidine à 2 mg/ml a été mis1 ml of a solution of streptavidin 2 mg / ml was put
_5 en contact de 1 ml d'une solution 5.10 M de cryptate de dibiotinylé d'europium dans 10 mM phosphate pH 7,4 (Na2 H P04+ Na_5 in contact with 1 ml of a 5.10 M solution of europium dibiotinylated cryptate in 10 mM phosphate pH 7.4 (Na 2 H P0 4 + Na
H2 P04) 0,1 M NaCl et 1 mg/ml de HSA.H 2 P0 4 ) 0.1 M NaCl and 1 mg / ml of HSA.
Le mélange a été réalisé à température ambiante avec une légère agitation pendant 30 min minimum puis a été conservé à 4°C jusqu'à son utilisation.The mixture was produced at room temperature with slight stirring for 30 min minimum and was then stored at 4 ° C until use.
En procédant selon le même mode opératoire, on a également préparé le complexe de formule SA-ZB en utilisant le chélate répondant à la formule ZB ci-dessus. Exemple* 3Using the same procedure, the complex of formula SA-ZB was also prepared using the chelate corresponding to formula ZB above. Example * 3
Détection par le complexe"de*l'exemple-2 d'un fragment d'ADN cible fixé* •à* •une membrane*de•nitrocellulose et• •hybride à une sonde biotinylée L'ADN à closer a été dénaturé par chauffage ou par action d'une solution dénaturante 0,5 M NaOH. Des quantités décroissantes de cible ont été alors déposées en solution dans du 6 x SSC (6 x SSC •= 0,9 M NaCl, 0,09 H sodium citrate pH 7,0) sur une membrane de nitrate de cellulose (Transblot de Biorad ou BA 85 de Schleicher et Schuell) . La membrane a été cuite pendant une à deux heures à 80°C pour fixer l'ADN de façon irréversible.Detection by the complex "of * example-2 of a target DNA fragment fixed * • to * • a membrane * of • nitrocellulose and • • hybridized to a biotinylated probe The DNA to closer was denatured by heating or by the action of a 0.5 M NaOH denaturing solution. Decreasing amounts of target were then deposited in solution in 6 x SSC (6 x SSC • = 0.9 M NaCl, 0.09 H sodium citrate pH 7 , 0) on a cellulose nitrate membrane (Transblot from Biorad or BA 85 from Schleicher and Schuell) The membrane was cooked for one to two hours at 80 ° C. to fix the DNA irreversibly.
La membrane a été alors présaturée avec une solution (A) contenant 4 x SSC, 10 x FPG (0,2% ficoll, 0,2 % polyvinyl- pyrrolidone, 0,2 % glycine), 0,1 % SDS et 100 jjg/ml d'ADN de sperme de hareng à 100 jg/ml pendant une nuit à 65°C. La membrane a été alors mise en présence d'une sonde biotinylée (B) auparavant dénaturée à 100°C pendant 5 min. La sonde biotinylée a été préparée selon la méthode de LANGER, WALDROP et WARD (P.N.A.S., 1981, 78_, 6633-6637) par "nicktranslation" en incorporant un πucléotide biotinylé (biotine-II-dUTP) au moyen du kit de marquage commercialisé par BRL (Bethesda Research Laboratories) .The membrane was then presaturated with a solution (A) containing 4 x SSC, 10 x FPG (0.2% ficoll, 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% glycine), 0.1% SDS and 100 µg / ml herring sperm DNA at 100 µg / ml overnight at 65 ° C. The membrane was then placed in the presence of a biotinylated probe (B) previously denatured at 100 ° C for 5 min. The biotinylated probe was prepared according to the method of LANGER, WALDROP and WARD (PNAS, 1981, 78_, 6633-6637) by "nicktranslation" by incorporating a biotinylated πucleotide (biotin-II-dUTP) using the labeling kit marketed by BRL (Bethesda Research Laboratories).
L'hybridation a été réalisée a«ec 0,5 μg de sonde/ml (B) dans le tampon (A) ci-dessus pendant une nuit à 65°C.Hybridization was carried out with 0.5 μg of probe / ml (B) in the buffer (A) above overnight at 65 ° C.
La membrane a été ensuite lavée 3 fois 15 min dans les solutions de forces ioniques décroissantes contenant 0,1 % de SDS. La membrane a été à nouveau traitée pour éviter l'adsorption non spécifique du complexe contenant le cryptate par une solution de BSA à 3 % dans 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) 0,15 M NaCl pendant 1 h à 65°C. La membrane a alors été mise au contact pendant 30 min à température ambiante d'une solution de complexe streptavidine-cryptate dibiotinylée à raison de 5 μg de streptavidine/ml dans 0,1 M Tris-HCl (pH 7.4), 0,5 M NaCl, 0,05 % Triton X-100, 1 g/1 HSA et 1 g/1 d'ADN de sperme de hareng (C) . La membrane a ensuite été lavée avec du tampon Tris-HClThe membrane was then washed 3 times 15 min in solutions of decreasing ionic strength containing 0.1% SDS. The membrane was again treated to avoid non-specific adsorption of the complex containing cryptate with a 3% BSA solution in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl for 1 h at 65 ° C. The membrane was then placed in contact for 30 min at room temperature with a solution of streptavidin-dibiotinylated cryptate complex at a rate of 5 μg of streptavidin / ml in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4), 0.5 M NaCl, 0.05% Triton X-100, 1 g / 1 HSA and 1 g / 1 herring sperm DNA (C). The membrane was then washed with Tris-HCl buffer
(pH 7,4), 0,1 M, NaCl 0,5 M, 0,05 % Triton X-100 deux fois 15 min puis séchée 5 min au four à micro-ondes.(pH 7.4), 0.1 M, 0.5 M NaCl, 0.05% Triton X-100 twice 15 min then dried for 5 min in the microwave.
La membrane a pu alors être analysée sans autre traitement sur un appareil de lecture par épifluorescence résolue dans le temps. Les longueurs d'onde d'excitation de d'émission étaient respectivement de 308 nm et 618 nm.The membrane could then be analyzed without further treatment on a time-resolved epifluorescence reading device. The emission excitation wavelengths were 308 nm and 618 nm respectively.
Le délai de lecture était de 0,2 ms et la durée de la mesure était de 0,4 ms.The read delay was 0.2 ms and the measurement duration was 0.4 ms.
Les valeurs de fluorescence mesurées pour des échantillons inconnus sont comparées à une courbe d'étalonnage établie pour des quantités connues d'ADN cible et permettent ainsi de trouver la quantité d'ADN cible fixée à la membrane.The fluorescence values measured for unknown samples are compared to a calibration curve established for known quantities of target DNA and thus make it possible to find the quantity of target DNA fixed to the membrane.
Exemple 4 Détection par le complexe de l'exemple 2 et une sonde oligonucleotidique biotinylée d'un fragment d'ADN cible fixé à une membrane constituant le fond d'une plaque à 96 puitsExample 4 Detection by the complex of Example 2 and a biotinylated oligonucleotide probe of a target DNA fragment fixed to a membrane constituting the bottom of a 96-well plate
Des dépôts d'ADN à doser ont été réalisés comme dans l'exemple précédent mais au fond de micropuits munis d'une membrane de nitrocellulose.DNA deposits to be assayed were made as in the previous example but at the bottom of microwells fitted with a nitrocellulose membrane.
La microplaque a été placée deux heures à 50°C. La préhybridation a été effectuée pendant une heure à 40°C avec 200 μl de tampon A.The microplate was placed for two hours at 50 ° C. Prehybridization was carried out for one hour at 40 ° C with 200 μl of buffer A.
Le mélange de préhybridation a été remplacé par 100 μl de solution d'hybridation contenant 100 n.g/ml dans le tampon A d'un oligonucléotide biotinylé complémentaire à la séquence cible, comportant une ou plusieurs molécules de biotine en 5* et comportant 15 à 50 résidus.The prehybridization mixture was replaced by 100 μl of hybridization solution containing 100 ng / ml in buffer A of a biotinylated oligonucleotide complementary to the target sequence, comprising one or more 5 * biotin molecules and comprising 15 to 50 residues.
L'hybridation a duré de une heure à 4 heures à une température variant de 20°C à 50°C selon la longueur de la sonde choisie, avec une légère agitation de la microplaque.The hybridization lasted from one hour to 4 hours at a temperature varying from 20 ° C to 50 ° C depending on the length of the probe chosen, with slight agitation of the microplate.
Chaque puits a été lavé trois fois 15 min à l'aide d'un dispositif semi-automatique de distribution et d'aspiration avec des solutions de SSC (contenant 0,1 % de SDS) de forces ioniques décroissantes. 16Each well was washed three times 15 min using a semi-automatic distribution and aspiration device with SSC solutions (containing 0.1% SDS) of decreasing ionic strength. 16
Les membranes ont été alors présaturées avec 100 jjl d'une solution de BSA 3 % dans 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,5 M NaCl pendant une heure à 30°C. Après élimination de cette solution chaque puits a reçu 100 pi d'une solution de complexe fluorescent selon l'exemple 2 à 5 g/ml en streptavidine. La plaque a été agitée pendant une heure à température ambiante.The membranes were then presaturated with 100 µl of a solution of 3% BSA in 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl for one hour at 30 ° C. After elimination of this solution, each well received 100 μl of a solution of fluorescent complex according to Example 2 at 5 g / ml in streptavidin. The plate was stirred for one hour at room temperature.
Les puits ont été ensuite lavés trois fois avec la solution de lavage comme dans l'exemple 3, puis la microplaque a été placée 5 min dans un four à micro-ondes (ou 5 min dans une étuve à 80°C) .The wells were then washed three times with the washing solution as in Example 3, then the microplate was placed 5 min in a microwave oven (or 5 min in an oven at 80 ° C).
La mesure de la fluorescence résiduelle a été effectuée alors sur un appareil automatique adapté à la lecture par épifluorescence sur plaque à 96 puits relié à un ordinateur permettant de traiter ces données. Comme pour l'exemple 3, la comparaison des valeurs mesurées avec des courbes d'étalonnage permet d'accéder à la quantité d'ADN-cible contenue dans chaque puits.The measurement of the residual fluorescence was then carried out on an automatic device suitable for reading by epifluorescence on a 96-well plate connected to a computer making it possible to process these data. As in Example 3, comparing the measured values with calibration curves provides access to the quantity of target DNA contained in each well.
Exemple 5 Préparation d'albumine humaine polybiotinylée et liée à un cryptate d'europium a) BiotinylationExample 5 Preparation of polybiotinylated human albumin and bound to a europium cryptate a) Biotinylation
10 mg d'HSA sont dissous dans 500 pi de tampon carbonate10 mg of HSA are dissolved in 500 μl of carbonate buffer
0,1 M, pH 8,5. On ajoute alors 35 μl d'une solution 0,1 M de biotine-LC-NHS (Pierce) dans le DMF. Le mélange réactionnel est légèrement agité pendant une nuit, puis dialyse contre du tampon0.1 M, pH 8.5. 35 μl of a 0.1 M solution of biotin-LC-NHS (Pierce) in DMF are then added. The reaction mixture is slightly stirred overnight, then dialyzed against buffer
HEPES 50 mM NaCl 2M, pH 7,0 dénommé ci-après tampon H. b) Couplage avec le cryptate diamine d'europiumHEPES 50 mM NaCl 2M, pH 7.0 hereinafter referred to as buffer H. b) Coupling with europium cryptate diamine
A 420 pi d'une solution d'HSA biotinylée à 24 mg/ml on ajoute 450 pi d'une solution 40 M de sulfo NHS dans le tampon H etTo 420 μl of a biotinylated HSA solution at 24 mg / ml is added 450 μl of a 40 M solution of NHS sulfo in buffer H and
430 pi d'une solution d'EDCi 80 mM dans le tampon H. Enfin, 1,7 ml430 μl of an 80 mM EDCi solution in buffer H. Finally, 1.7 ml
_3 d'une solution 3.10 M du cryptate diamine d'europium utilisé dans l'exemple 1 dans le tampon H sont ajoutés à ce mélange._3 of a 3.10 M solution of the europium cryptate diamine used in Example 1 in buffer H are added to this mixture.
La réaction dure 3 heures à température ambiante et nécessite une légère agitation. A l'issue de la réaction, ce
Figure imgf000019_0001
The reaction lasts 3 hours at room temperature and requires gentle stirring. At the end of the reaction, this
Figure imgf000019_0001
1717
mélange est chromatographié sur phase inverse type C8 en gradient H20 - CHgCN de 0 à 50 % en présence de 0,1 % TFA.mixture is chromatographed on reverse phase type C8 in H 2 0 - CHgCN gradient from 0 to 50% in the presence of 0.1% TFA.
Les fractions protéiques sont ensuite rassemblées et dialysées contre un tampon HEPES lOmM NaCl 1M pH 7,4 dénommé ci-après tampon J. Le taux de marquage cryptate/HSA est d'environ 5.The protein fractions are then combined and dialyzed against a HEPES 10 mM 1M NaCl buffer pH 7.4, hereinafter referred to as buffer J. The level of cryptate / HSA labeling is approximately 5.
Exemple 6Example 6
Préparation d'un complexe de streptavidine et d'albumine humaine polybiotinylée et cryptatéePreparation of a complex of streptavidin and polybiotinylated and encrypted human albumin
0,1 ml d'une solution de streptavidine à 2 mg/ml a été mis en contact de 1,3 ml d'HSA polybiotinylée et cryptatée; solution à 0,3 mg/ml dans le tampon J.0.1 ml of a streptavidin solution at 2 mg / ml was brought into contact with 1.3 ml of polybiotinylated and encrypted HSA; 0.3 mg / ml solution in buffer J.
Le mélange est réalisé à température ambiante avec une légère agitation pendant 30 min minimum et conservé à -20°C en présence de glycérol (50 %) .The mixture is produced at room temperature with gentle stirring for at least 30 min and stored at -20 ° C in the presence of glycerol (50%).
Le complexe ainsi préparé peut être utilisé aussi bien pour la détection d'acides nucléiques au moyen de sondes biotinylées que pour la détection d'antigènes au moyen d'anticorps spécifiques biotinylés, comme cela est décrit dans l'exemple suivant.The complex thus prepared can be used both for the detection of nucleic acids by means of biotinylated probes and for the detection of antigens by means of specific biotinylated antibodies, as described in the following example.
Exemple 7Example 7
Détection par le complexe de l'exemple 6 d'un antigène cible sur plaque de polystyrène à 96 Puits. 1) Préparation du supportDetection by the complex of Example 6 of a target antigen on a 96-well polystyrene plate. 1) Preparation of the support
Les micropuits d'une plaque de polystyrène ont été traités par une solution à 1 g/ml d'un anticorps monoclonal dirigé contre un antigène spécifique (protéique) pendant 18 Heures à 4°C dans un tampon carbonate 100 M pH 8,6.The microwells of a polystyrene plate were treated with a 1 g / ml solution of a monoclonal antibody directed against a specific antigen (protein) for 18 hours at 4 ° C. in a 100 M carbonate buffer pH 8.6.
Après lavage des micropuits à l'aide d'un dispositif semi-automatique de distribution et d'aspiration, par trois foisAfter washing the microwells using a semi-automatic distribution and suction device, three times
300 pi de tampon phosphate 100 mM, 0,1 % Tween 20, pH 7,4 les puits sont saturés par une solution à 1 g/1 d'HSA dans un tampon phosphate 100 M pH 7,4 pendant 45 min à 37°C.300 μl of 100 mM phosphate buffer, 0.1% Tween 20, pH 7.4 the wells are saturated with a solution of 1 g / l of HSA in 100 M phosphate buffer pH 7.4 for 45 min at 37 ° vs.
Les puits sont à nouveau lavés selon la procédure ci-dessus et conservés jusqu'à utilisation en atmosphère humide en sacs plastiques hermétiques.The wells are again washed according to the procedure above and kept until use in a humid atmosphere in airtight plastic bags.
2/ Protocole dfessai2 / f Protocol Test
Dans les puits ainsi préparés, on distribue : - 150 pi de solution d'antigène à doser en dilutions décroissantes dans un tampon phosphate 100 M pH 7,4, 1 g/1 en HSA ;In the wells thus prepared, are distributed: - 150 μl of antigen solution to be assayed in decreasing dilutions in a 100 M phosphate buffer pH 7.4, 1 g / 1 in HSA;
- 150 pi d'un deuxième anticorps biotinylé à Ipg/ml dans le même tampon.- 150 μl of a second biotinylated antibody at Ipg / ml in the same buffer.
Les puits sont placés sous légère agitation pendant 30 min à 3 heures selon la nature de l'antigène à doser, puis lavés avec cinq fois 300 pi de tampon phosphate 100 M pH 7,4, 0,1 %The wells are placed under light agitation for 30 min to 3 hours depending on the nature of the antigen to be assayed, then washed with five times 300 μl of 100 M phosphate buffer pH 7.4, 0.1%
Tween 20.Tween 20.
On ajoute alors dans chaque puits 100 pi de complexe fluorescent selon l'exemple 6 à raison de 2 tig/ml en streptavidine, puis les plaques sont agitées pendant 1 heure à température ambiante.100 μl of fluorescent complex according to Example 6 are then added to each well at the rate of 2 tig / ml of streptavidin, then the plates are agitated for 1 hour at room temperature.
Les puits sont ensuite lavés avec trois fois 300 pi de tampon phosphate 100 mM, pH 7,4 0,1 % Tween 20 puis séchés sous un courant d'air sec. 3/ Lecture-du*résultatThe wells are then washed with three times 300 μl of 100 mM phosphate buffer, pH 7.4 0.1% Tween 20 and then dried under a stream of dry air. 3 / Reading-of * result
Pour une lectrue en milieu liquide, les puits sont traités pendant 30 min sous agitation par une solution de biotineFor reading in a liquid medium, the wells are treated for 30 min with stirring with a biotin solution
_3 libre 10 M dans du tampon phosphate 100 M pH 7,4, 1 % SDS. Les mesures sont effectuées par épifluorescence sur un appareil automatique comme dans l'exemple 4._3 free 10 M in 100 M phosphate buffer pH 7.4, 1% SDS. The measurements are carried out by epifluorescence on an automatic device as in Example 4.
Pour une lecture sur phase solide, les puits sont séchés 5 min sous un courant d'air sec, la fluorescence résiduelle provenant du complexe fixé au fond des puits est mesurée par épifluorescence sans autre forme de traitement. Ces deux méthodes de mesure permettent, après traitement approprié des résultats, le tracé de courbes d'étalonnage spécifiques de l'antigène à doser. Les quantités d'antigène contenues dans des échantillons inconnus sont calculées à partir de courbes d'étalonnage et des mesures de fluorescence effectuées sur ces échantillons. For a solid phase reading, the wells are dried for 5 min under a stream of dry air, the residual fluorescence originating from the complex attached to the bottom of the wells is measured by epifluorescence without any other form of treatment. These two measurement methods allow, after appropriate processing of the results, the plotting of specific calibration curves of the antigen to be assayed. The amounts of antigen contained in unknown samples are calculated from calibration curves and fluorescence measurements made on these samples.

Claims

REVENDICATIONS
1. Complexes tridimensionnels constitués d'au moins une molécule de streptavidine (ou avidine) liée par liaison d'affinité à au moins un composé luminescent polybiotinylé ou à au moins une macromolécule polybiotinylée couplée à au moins un composé luminescent, l'un des sites de liaison par affinité de la streptavidine (avidine) avec la biotine étant libre.1. Three-dimensional complexes consisting of at least one streptavidin (or avidin) molecule linked by affinity bond to at least one polybiotinylated luminescent compound or to at least one polybiotinylated macromolecule coupled to at least one luminescent compound, one of the sites of affinity binding of streptavidin (avidin) with biotin being free.
2. Complexes tridimensionnels selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont représentés par la formule statistique ci-après :2. Three-dimensional complexes according to claim 1, characterized in that they are represented by the following statistical formula:
[ p. °i dans laquelle : X représente le composé luminescent ; P représente la macromolécule ; B représente la biotine ; A représente l'avidine ou la streptavidine ; i est un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; j est un nombre entier égal à 0 ou 1 ;[ p . ° i in which: X represents the luminescent compound; P represents the macromolecule; B represents biotin; A represents avidin or streptavidin; i is an integer greater than or equal to 1; j is an integer equal to 0 or 1;
K est un nombre entier supérieur ou égal à 2 ; n est un nombre entier supérieur ou égal à 1 ; m est un nombre entier supérieur ou égal à n et inférieur à 4n.K is an integer greater than or equal to 2; n is an integer greater than or equal to 1; m is an integer greater than or equal to n and less than 4n.
3. Complexe selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé luminescent est un chélate de terres rares.3. Complex according to one of claims 1 or 2, characterized in that the luminescent compound is a rare earth chelate.
4. Complexe selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé luminescent est un cryptate de terres rares. 4. Complex according to one of claims 1 or 2, characterized in that the luminescent compound is a rare earth cryptate.
5. Complexes selon l'une quelconque des revendications 1 à5. Complexes according to any one of claims 1 to
4, caractérisés en ce que la macromolécule est une protéine ayant4, characterized in that the macromolecule is a protein having
4 6 un poids moléculaire compris entre 10 et 10 .4 6 a molecular weight of between 10 and 10.
6. Complexes selon l'une des revendications 1 à 4 , caractérisés en ce que la macromolécule est un polymère6. Complexes according to one of claims 1 to 4, characterized in that the macromolecule is a polymer
4 6 hydrosoluble ayant un poids moléculaire compris entre 10 et 10 . 4 6 water-soluble having a molecular weight between 10 and 10.
7. Procédé pour l'obtention des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il consiste :7. Method for obtaining three-dimensional complexes according to any one of claims 1 to 4, characterized in that it consists:
1) à dibiotinyler le composé luminescent après avoir éventuellement introduit sur celui-ci deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine ;1) dibiotinylating the luminescent compound after having optionally introduced thereon two reactive functions with respect to biotin;
2) à mélanger ledit composé luminescent dibiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoechiométriques définies.2) mixing said dibiotinylated luminescent compound with streptavidin (or avidin) in defined stoichiometric amounts.
8. Procédé pour l'obtention des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il consiste :8. Method for obtaining three-dimensional complexes according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it consists:
1) à polybiotinyler la macromolécule après avoir éventuellement, introduit sur celle-ci, au moins deux fonctions réactives vis-à-vis de la biotine ; 2) à coupler par liaison covalente, la molécule polybiotinylée au composé luminescent ;1) polybiotinylating the macromolecule after having optionally introduced thereon at least two reactive functions with respect to biotin; 2) coupling, by covalent bond, the polybiotinylated molecule to the luminescent compound;
3) à mélanger le composé luminescent polybiotinylé avec de la streptavidine (ou avidine) en quantités stoechiométriques définies.3) mixing the polybiotinylated luminescent compound with streptavidin (or avidin) in defined stoichiometric amounts.
9. Application des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 comme marqueurs dans des dosages immunologiques.9. Application of the three-dimensional complexes according to any one of claims 1 to 6 as markers in immunoassays.
10. Application des complexes tridimensionnels selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 à la détection et/ou détermination d'acides nucléiques-cibles. 10. Application of the three-dimensional complexes according to any one of claims 1 to 6 to the detection and / or determination of target nucleic acids.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060400A1 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Dade Behring Inc. Bis-biotin compounds for specific binding assays
KR100377946B1 (en) * 2000-07-15 2003-03-29 한국과학기술원 A Process for Preparing Monolayer by Using Dendrimer
KR100381727B1 (en) * 1999-05-26 2003-04-26 황승용 A Method for Identifying DNA Mutation Using Microwell and Kit Therefor

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1742201A (en) * 2002-11-14 2006-03-01 Qtl生物系统有限公司 Methods of biosensing using fluorescent polymers and quencher-tether-ligand bioconjugates

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0077671B1 (en) * 1981-10-19 1986-06-25 Ortho Diagnostic Systems Inc. Immunological reagents employing polymeric backbones
WO1988002784A1 (en) * 1986-10-17 1988-04-21 Wallac Oy Hybridization assay and means to be used in the assay
WO1988004777A1 (en) * 1986-12-15 1988-06-30 Ultra Diagnostics Corporation Monomeric phthalocyanine reagents

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0077671B1 (en) * 1981-10-19 1986-06-25 Ortho Diagnostic Systems Inc. Immunological reagents employing polymeric backbones
WO1988002784A1 (en) * 1986-10-17 1988-04-21 Wallac Oy Hybridization assay and means to be used in the assay
WO1988004777A1 (en) * 1986-12-15 1988-06-30 Ultra Diagnostics Corporation Monomeric phthalocyanine reagents

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nature, Volume 320, 10 Avril 1986, R.M. BUCKLAND: "Strong Signals from Streptavidin-Biotin", pages 557-558 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060400A1 (en) * 1998-05-20 1999-11-25 Dade Behring Inc. Bis-biotin compounds for specific binding assays
US6153442A (en) * 1998-05-20 2000-11-28 Dade Behring Inc. Reagents and methods for specific binding assays
KR100381727B1 (en) * 1999-05-26 2003-04-26 황승용 A Method for Identifying DNA Mutation Using Microwell and Kit Therefor
KR100377946B1 (en) * 2000-07-15 2003-03-29 한국과학기술원 A Process for Preparing Monolayer by Using Dendrimer

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