WO1990003425A1 - Verfahren zur biosensorischen quantitativen bestimmung von verbindungen sowie eine vorrichtung dafür - Google Patents
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- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
Definitions
- Enzyme reactions using dissociable adenine dinucleotides are suitable for biochemical analysis. There is an abundance of specific detection reactions / 1 / in which these coenzymes are involved. Such reactions can easily be followed by determining the coenzyme concentration (eg photometric, fluorometric, electrochemical).
- the immobilized enzymes are attached in front of the detection unit (electrodes or fluorometer at / 2 /, fluorescence fiber optics at / 3 /, thermistor at / 4/1, the sample to be analyzed is mixed with the necessary coenzyme and into a buffer carrier stream (flow injection Principle), which transports the mixture to the enzymes, and after the enzymatic reaction, the coenzyme concentration is determined, from which the concentration of the substance to be analyzed can be determined.
- a buffer carrier stream flow injection Principle
- the system can work continuously, whereby the sensor has to be regenerated (e.g. enzymatically, see description). Enzymes and coenzymes can be reused many times.
- Each substrate molecule converts a coenzyme molecule that is retained in the measuring reactor. An apparent concentration of the substrate in the measuring space is thereby achieved.
- the detection limit of the system is the minimally detectable coenzyme concentration in the measuring volume. This is determined by the corresponding amount of substrate that has flowed through the measuring cell. This amount of substrate can vary in a small amount
- sample volume with a high substrate concentration or in a large sample volume with a small amount of substrate For example, the lower detection limit of NADH lies in the sensor at 0.01 ⁇ mol / ml, this can be achieved by a test application with 100 ⁇ l at a concentration of 100 ⁇ mol / 1 substrate or with 10 ml sample with the substrate concentration of 1 ⁇ mol / 1. In this way, the sensor can also record the smallest amount of substrate (eg water monitoring).
- the invention relates to a method for the biosensory quantitative determination of compounds whose concentration can be determined fluorometrically by adenine-dinucleotide-dependent enzymatic reactions, in which:
- the enzymes and adenine dinucleotide coenzymes involved are present in front of the detection unit based on fluorescent glass fiber optics in a homogeneous solution in a space closed by an ultrafiltration membrane, the coenzyme being present as a macromolecular derivative (e.g. bound to polyethylene glycol, MW: 20,000)
- a macromolecular derivative e.g. bound to polyethylene glycol, MW: 20,000
- integral fluorescence decreases or increases as a result of the formation of the coenzyme in oxidized or reduced form represent the substance concentrations to be analyzed
- the coenzyme involved is brought into the desired oxidized or reduced form in situ by enzymatic regeneration; characterized in that the combination of an enzyme membrane reactor with enclosed enzymes and macromolecular adenine-dinucleotide-dependent coenzyme derivatives, fluorescent glass fiber optics and the flow injection principle is present.
- the sensor used is a fluorosensor with glass fiber optics. Excitation light with a wavelength of 360 nm is fed into the measuring reactor via the glass fiber optics and the reverse fluorescent light of the NAD (P) H is detected via the same optics at 460 nm.
- LDH lactate dehydrogenase
- ADH alcohol dehydogenase
- the alcohol is detected by the enzymatic oxidation of ethanol to acetaldehyde, which is intercepted by semicarbazide (which is added to the sample in a concentration of 20 mmol / 1, dissolved in carrier buffer).
- the resulting NADH can be measured.
- the sensor is regenerated by adding 0.3 ml of a pyruvate solution (40 mg / 1 in carrier buffer).
- the calibration curve for ethanol is shown in Fig. 4.
- the specified concentrations apply to the sample concentration.
- ethanol can also be measured in fermentation media for fermentation control (see Fig. 10). In each case 20 ⁇ l of the cell-free
- Fermentation medium placed in the measuring cell. These samples did not have to be pretreated further. They had been added 1: 1 to 3: 1 semicarbazide (to ethanol) to scavenge the acetaldehyde.
- the buffer system described under 1. can be used for the lactate detection.
- the LDH and coenzyme concentration corresponds to that under 1).
- the second enzyme system is glutamate pyruvate transaminase (hereinafter referred to as GPT, 20 ⁇ l GPT, Boehringer Mannheim)
- Lactate is converted from the LDH to pyruvate in a first reaction with the formation of NADH. Since the equilibrium is on the side of lactate, the formed must Pyruvate are converted to alanine via the GPT reaction in the presence of glutamic acid to allow the reaction to proceed quantitatively. Therefore glutamate (final concentration 20 g / l) is added to the lactate samples. Pyruvate solution (80 mg / 1, glutamate-free) can be used again as the regeneration reaction. The individual task volumes correspond to those under 1). The calibration curve for lactate is shown in Fig. 5. The specified concentrations apply to the sample concentration.
- Both example 1) and 2) can be used as detection reactions for pyruvate.
- the lactate 2.5 g / 1 lactate, 20 g / l glutamate
- ethanol addition 50 mg / 1, 20 mmol / 1 semicarbazide
- All other analysis parameters correspond to those under 1) and 2).
- the calibration curve for pyruvate (when regenerated with ethanol) is shown in Fig. 6.
- the specified concentrations apply to the sample concentration.
- the measuring cell (1 ml volume) contained 32 units of phenylalanine dehydrogenase, 264 units of alcohol dehydrogenase (semicarbazide concentration 20 mM) and 30 mg of PEG-NAD + .
- the applied sample amount was 300 ⁇ l.
- Figure 12 shows the calibration curve.
- Fig. 7 shows a sequence of measurement signals for the lactate-pyruvate reaction.
- the samples were injected alternately. A decrease in the increase in the lactate reaction of less than 5% was observed over a period of 24 hours. This reduced the signal level by 3%.
- Fig. 9 the temporal decreases in activity (calculated from the slope of the signals) and the resulting decrease in signal levels are plotted for the ethanol detection according to 1).
- pyruvate / ethanol samples were injected every 15 minutes over a period of 20 hours. It can be seen that the half-life for the alcohol dehydrogenase is approximately 50 hours. (This roughly corresponds to the values of the native enzymes at 25 ° C. In the 20 h, in which the activity by about 20%
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biosensorischen quantitativen Bestimmung von Verbindungen, deren Konzentration sich durch adenindinukleotidabhängige enzymatische Reaktionen fluorometrisch bestimmen läßt, sowie eine Vorrichtung dafür.
Description
Verfahren zur biosensorischen quantitativen Bestimmung
von Verbindungen sowie eine Vorrichtung dafür
Enzymreaktionen, bei denen dissoziierbare Adenin-Dinucleotide (z.B. NAD(P)+, NAD(P)H) eingesetzt werden, eignen sich für die biochemische Analytik. Es gibt eine Fülle von spezifischen Nachweisreakticnen /1/, an denen diese Coenzyme beteiligt sind. Solche Reaktionen lassen sich einfach über die Bestimmung der Coenzymkonzentration (z.B. photometrisch, fluorometrisch, elektrochemisch) verfolgen.
Bisher sind off-line - also Einzeibestimmungen - bekannt oder Analysensysteme, in denen diese Einzelbestimmungen automatisiert ablaufen. Beiden gemeinsam ist, daß jeweils nach einer Probe Enzyme und Coenzyme verworfen werden. Hier gibt es Ansätze, wenigstens die Enzyme durch Immobilisierung mehrfach einzusetzen /2-4/. Dabei werden die immobilisierten Enzyme vor der Detektionseinheit angebracht (Elektroden oder Fluorometer bei /2/, Fluoreszenz-Fiberoptik bei /3/, Thermistor bei /4 / 1 , die zu analysierende Probe mit dem nötigen Coenzym vermischt und in einen Pufferträgerstrom ( Flow-Injection-Prinzip) injiziert, der das Gemisch zu den Enzymen transportiert. Nach der enzymatischen Reaktion wird die Coenzymkonzentration bestimmt. Daraus laßt sich die Konzentration der zu analysierenden Substanz bestimmen.
Zwei große Nachteile bestehen dabei immer noch: Das teure Coenzym muß ständig neu zugegeben werden und die Methode ist in der Empfindlichkeit limitiert, da kein Aufkonzentrierungsschritt involviert werden kann.
Da besonders der Einsatz von Glasfaseroptiken (miniaturisierbar, billig, störunanfällig) interessant ist /5-7/, haben verschiedende Autoren einen anderen Weg eingeschlagen. Anstelle von coenzymabhängigen Nachweisreaktionen benutzten sie leicht
detektierbare Farbstoffe und Oxidasen /8/. Hierbei sei aberdarauf hingewiesen, daß die Anzahl von verfügbaren coenzymabhängigen Enzymreaktionen bei weitem der von oxidaseabhängigen überwiegt. Ein Sensorsystem, bei dem Enzyme und Coenzyme fixiert sind, ist bisher nicht beschrieben.
Als Gegenstand dieser Patentanmeldung wurde ein System entwickelt, bei dem sowohl Enzyme als auch molekulargewichtsvergrößerte Coenzyme in einem Meßreaktor durch Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran immobilisiert sind. Enzyme und Coenzyme befinden sich in einer homogenen wäßrigen Phase. Der Meßreaktor ist mit einer Analyseneinheit versehen, speziell mit einer Glasfiberoptik, um über optische Methoden (speziell fluorometrischen) die Coenzymkonzentration zu bestimmen. Die Proben werden über das Flow-Injection-Prinzip aufgegeben. Dabei werden Drücke bis zu 5 bar (speziell 3,5 bar) benutzt.
Siehe Schema: Gesamtaufbau (Abb. 1)
Meßzelle (Abb. 2)
Prinzip (Abb. 3)
Das System kann kontinuierlich arbeiten, wobei der Sensor regeneriert werden muß (z.B. enzymatisch, siehe Beschreibung). Enzyme und Coenzyme können vielfach wiederverwendet werden.
Eine Aufkonzentrierung der Probe ist gewährleistet
(akkumulativer Sensor). n.b. Erklärung: "Akkumulativer Sensor"
Jedes Substratmolekül setzt ein Coenzymmolekül um, das in dem Meßreaktor zurückgehalten wird. Dadurch wird eine scheinbare Aufkonzentrierung des Substrats im Meßraum erreicht. Die Nachweisgrenze des Systems liegt bei der minimal detektierbaren Coenzymkonzentration im Meßvolumen. Diese wird durch die entsprechende Substratmenge, die durch die Meßzelle geflossen ist, bestimmt. Diese Substratmenge kann sich in einem kleinen
Probenvolumen mit hoher Substratkonzentration oder in einem großen Probenvolumen mit kleiner Substratmenge befunden haben. Liegt zum Beispiel die untere Nachweisgrenze von NADH im Sensor
bei 0,01 μmol/ml, so kann dies durch eine Probeaufgabe mit 100 μl bei einer Konzentration von 100 μmol/1 Substrat oder mit 10 ml Probe mit der Substratkonzentration von 1 μmol/1 erreicht werden. So kann der Sensor auch akkumulativ geringste Substratmengen erfassen (z.B. Gewässerüberwachung).
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur biosensorischen quantitativen Bestimmung von Verbindungen, deren Konzentration sich durch adenin-dinucleotidabhängige enzymatische Reaktionen fluorometrisch bestimmen lassen, bei denen:
a) die beteiligten Enzyme und Adenin-Dinucleotid-Coenzyme vor der Detektionseinheit basierend auf Fluoreszenzglasfaseroptik in homogener Lösung in einem durch eine Ultrafiltrationsmembran abgeschlossenen Raum anwesend sind, wobei das Coenzym als makromolekulares Derivat vorliegt (z.B. gebunden an Polyethylenglykol, MW : 20.000)
b) Proben mit zu quantifizierendem Substrat über das Flow-Injection-Prinzip in das unter a) beschriebene System aufgegeben werden
c) integrale Fluoreszenzab- oder -zunahmen als Folge der Entstehung des Coenzyms in oxidierter oder reduzierter Form die zu analysierenden Substanzkonzentrationen darstellen
d) zwischen den beabsichtigten quantitativen Messungen das beteiligte Coenzym in situ in die gewünschte oxidierte oder reduzierte Form durch enzymatische Regenerierung gebracht wird; gekennzeichnet dadurch, daß die Kombination Enzymmembranreaktor mit eingeschlossenen Enzymen und makromolekularen adenin-di- nucleotidabhängigen Coenzymderivaten, Fluoreszenzglasfaseroptik und das Flow-Injection-Prinzip vorliegt.
Versuche:
Drei Systeme wurden untersucht, um die Tauglichkeit des Systems zu beweisen:
Nachweisreaktionen
Lactatdehydrogenase
a) Lactat + NAD+ -----------------------------> Pyruvat + NADH + H+ Glutamat-Pyravat-Transaainase
b) Pyruvat + L-Glutaβat --------------------------------------------> L-Alanin +a-KLtoglutara
Alkoholdehydrogenase
c) Ethanol + NAD+ ----------------------------------> A cetaldehyd + NADH + H+
d) Acetaldehyd + Semicarbazid ----> Semicarbazon des Acetaldehyds
Bei dem eingesetzten Sensor handelt es sich um einen Fluorosensor mit Glasfaseroptik. Anregungslicht der Wellenlänge 360nm wird über die Glasfaseroptik in den Meßreaktor geleitet und das rückwertige Fluoreszenzlicht des NAD (P )H über die gleiche Optik bei 460 nm detektiert .
Beispiel 1 . Nachweis von Ethanol ( Reaktion a, c und d)
In das Meßvolumen ( 1 ml ) wurden 10 μ1 Lactatdehydrogenase ( im weiteren LDH genannt ) (Boehringer Mannheim, aus Schweinemuskel , entspricht 55 units und 0 , 1 mg Protein pro Meßvolumen) , 15 μl Alkoholdehydogenase ( im weiteren ADH genannt ) ( Boehringer
Mannheim, aus Hefe , entspricht 132 units und 0 , 43 mg Protein pro Meßvolumen) und 30 mg Polyethylenglykol (MW : 20 .000 )-molekulargewichtsvergrößertes NAD+ /siehe 9/ (Angabe : pro mg molekulargewichtsvergrößertem NAD* sind 0 , 024 μmol NAD+ gebunden, entspricht 0 , 72 μmol NAD+ im Meßvolumen) gegeben. Als Membran
wurden Filtron (Omega) oder Amicon (YM) Dialysemembranen mit einer Trenngrenze von S.000 Dalton benutzt. Das System wird bei 3-3,5 bar (entspricht 3 bis 3,5 105 Pa) betrieben. Bei dem Aufbau betrug die freie Filtrationsfläche 3 cm2 und die erzielbaren Filtrationsleistungen 0,15 ml/min. Als Trägerpuffer wurde ein 50 mmolarer Kaliumphosphatpuffer (pH = 8,5) benutzt.
Der Alkoholnachweis erfolgt über die enzymatische Oxidation des Ethanols zu Acetaldehyd, das von Semicarbazid (das der Probe in einer Konzentration von 20 mmol/1 zugesetzt wird, gelöst in Trägerpuffer) abgefangen wird. Das dabei entstehende NADH kann gemessen werden. Eine Regenerierung des Sensors erfolgt über die Aufgabe von 0,3 ml einer Pyruvatlösung (40 mg/1 in Trägerpuffer).
Die Kalibrierungskurve für Ethanol ist in Abb. 4 gezeigt. Die angegebenen Konzentrationen gelten für die Probekonzentration.
Beispiel 2. Nachweis von Ethanol
Unter den beschriebenen Analysenbedingungen kann auch Ethanol in Fermentationsmedien zur Fermentationskontrolle gemessen werden (siehe Abb. 10). Es wurden jeweils 20 μl des zellfreien
Fermentationsmediums in die Meßzelle aufgegeben. Diese Proben mußten nicht weiter vorbehandelt werden. Ihnen war Semicarbazid im Verhältnis 1:1 bis 3:1 (zu Ethanol) zum Abfangen des Acetaldehyds zugegeben worden.
Beispiel 3. Nachweis von Lactat (Reaktion a und b)
Für den Lactatnachweis kann das unter 1. beschriebene Puffersystem verwendet werden. Die LDH- und Coenzymkonzentration entspricht der unter 1).
Als zweites Enzymsystem wird Glutamat-Pyruvat-Transaminase (im weiteren GPT genannt , 20 μl GPT , Boehringer Mannheim , aus
Schwe ineherz , entspricht 16 units und 0,2 mg Protein pro Meßvolumen) verwendet. Lactat wird in einer ersten Reaktion von der LDH zu Pyruvat unter der Bildung von NADH umgesetzt. Da das Gleichgewicht auf der Seite von Lactat liegt, muß das gebildete
Pyruvat über die GPT-Reaktion in Gegenwart von Glutaminsäure zuAlanin umgesetzt werden, um die Reaktion quantitativ ablaufen zu lassen. Deshalb wird den Lactatproben Glutamat (Endkonzentration 20 g/l) zugesetzt. Als Regenerierungsreaktion kann wieder Pyruvatlösung (80 mg/1, glutamatfrei) verwendet werden. Die einzelnen Aufgabevolumina entsprechen denen unter 1). Die Kalibrierungskurve für Lactat ist in Abb. 5 gezeigt. Die angegebenen Konzentrationen gelten für die Probenkonzentration.
Beispiel 4. Nachweis von Pyruvat (Reaktion a, c, d oder a, b)
Sowohl Beispiel 1) als auch 2) können als Nachweisreaktionen für Pyruvat verwendet werden. Dabei ist die Lactat- (2 , 5 g/1 Lactat, 20 g/l Glutamat) bzw. Ethanolzugabe (50 mg/1, 20 mmol/1 Semicarbazid) als Regenerierungsreaktion zu sehen. Alle anderen Analysenparameter entsprechen denen unter 1) und 2).
Die Kalibrierungskurve für Pyruvat (bei Regenerierung mit Ethanol) ist in Abb. 6 gezeigt. Die angegebenen Konzentrationen gelten für die Probenkonzentration.
Beispiel 5. Nachweis von Formiat
Das Reaktionsschema sieht wie folgt aus:
Formate Analvsis
Measurement :
formate + PEG-NAD+ CO2 + PEG-NADH
Coenzyme regeneration:
pyruvate + PEG-NAD + H+ lactate + PEG-NAD+
Als Trägerstrom wurde 80 mM TRIS HCl Puffer (pH = 7,5) verwendet. In der Meßzelle (1 ml Volumen) befanden sich 55 Units Lactatdehydrogenase, 14 Units Formiatdehydrogenase und 30 mg PEG-NADH. Regeneriert wurde Pyyruvatlösung. Die aufgegebene
Probemenge betrug 300 μl. In Abbildung 11 ist die Kalibrationskurve zu sehen.
Beispiel 6. Nachweis von Phenylpyruvat
Das Reaktionsschema sieht wie folgt aus:
Phenylpyruvate analvsis
Measurement: phenylpyruvate + NH4Cl + PEG-NADH
phenylalanine + PEG-NAD + Cl
Coenzyme regeneration: ethanol + semicarbazide + PEG-NAD+
semicarbazone of the acetaldehyde + PEG-NADH + H+
Als Trägerstrom wurde 80 mM TRIS HCl Puffer (pH = 8) verwendet. In der Meßzelle (1 ml Volumen) befanden sich 32 Units Phenylalanindehydrogenase, 264 Units Alkoholdehydrogenase (Semicarbazidkonzentration 20 mM) und 30 mg PEG-NAD+. Die aufgegebene Probemenge betrug 300 μl. In Abbildung 12 ist die Kalibrationskurve zu sehen.
LangzeitStabilität
In Abb. 7 sieht man für die Lactat-Pyruvat Reaktion eine Folge von Meßsignalen. Dabei sind die Zeitpunkte der Probenzugabe eingetragen (Probe 1: Lactatlösung wie unter 3) beschrieben, c = 500 mg/1; Probe 2: Pyruvatlösung wie unter 3) beschrieben: c = 100 mg/1). Die Proben wurden im Wechsel injiziert. Dabei war über einen Zeitraum von 24 Stunden eine Abnahme der Steigerung der Lactatreaktion von unter 5 % festzustellen. Die Signalhöhe verringerte sich dadurch um 3 % . Abb. 8 zeigt die Kurven für
Lactatproben verschiedener Konzentration (ci = 5 g/l; C2 = 2,5g/l; C3 = 1,25 g/l; C4 = 0,625 g/l; es = 0,3125 g/l; c6 = 0,15. g/l.
In Abb. 9 sind für den Ethanolnachweis nach 1) die zeitlichen Abnahmen der Aktivität (berechnet aus der Steigung der Signale) und die dadurch bedingte Abnahme der Signalhöhen aufgetragen. Für diese Auftragung wurden Pyruvat/Ethanol Proben im 15-minütigen Wechsel über 20 Stunden injiziert. Man erkennt, daß die Halbwertzeit für die Alkoholdehydrogenase bei ca. 50 h liegt. (Dies entspricht in etwa den Werten der nativen Enzyme bei 25 °C. In den 20 h, in denen die Aktivität um etwa 20 %
abnimmt, verringerte sich die Signalhöhe um ca. 15 % .
Literatur: 1 Bergmeyer, H.U. (1974) Methoden der enzymatischen Analyse, Band 1 und 2, Verlag Chemie, Weinheim
2 Kittstein-Eberle, R.; Schmidt, H.-L., (1986) Biosensoren,
Naturwissenschaften 73, pp.: 314-321
und Beschreibung im Posterabstract zur Analytica 88 (siehe
Beilage)
3 Wangsa, J.; Arnold, M.A. (1988) Fiber-optic biosensors based on the fluorometric detection of reduced nicotinamide adenine dinucleotide, Anal. Chem. 60, pp.: 1080-1082
4 Daniellson, B.; Buelow, L. ; Löwe, C.R.; Satoh, I.; Mosbach, K. (1981), Evaluation of the enmzyme thermistor as a specific detector for Chromatographie procedures, Anal. Biochem., 117, pp.: 84-93
5 Seitz, H.W; (1984) Chemical Sensors based on fiber optics, Anal. Chem. 56, pp. 16A-34A
6 Arnold, M.A. (1985) Enzyme-based fiber optic sensor, Anal.
Chem., 57, pp.: 565-566
7 Andrade, J.D.; Vanwagenen, R.A.; Gregonis, D.E.; Newby, K.;
Lin, J.N. ( remote fiber-optic biosensors based on evanescentexcited fluoro-immunoassay: coneept and progress, JEEE Transactions on Electron Devices, 32:7, pp.: 1175-1179
8 Lübbers, D.W.; Opitz, N. (1983) Optical fluorescence sensors for continuous measurement of chemical concentrations in biological Systems, Sens. and Actuators, 4, pp.: 641-6549 Bückmann, A.F. (1987) A new synthesis of coenzymically active water soluble macromolecular NAD+ and NADP+ derivatives, Biocatalysis 1, pp.: 173-186.
Claims
1. Verfahren zur biosensorischen quantitativen Bestimmung von Verbindungen, deren Konzentration sich durch adenin-dinu- cleotid-abhängige enzymatische Reaktionen fluorometrisch bestimmen läßt, bei dem
a) die beteiligten Enzyme und Adenin-Dinucleotid-Coenzyme vor der Detektionseinheit (basierend auf Fluoreszenzglasfaseroptik) in homogener Lösung in einem durch eine Ultrafiltrationsmembran abgeschlossenen Enzymmembranreaktor vorliegen, wobei das
Coenzym als makromolekulares Derivat vorliegt,
b) Proben mit zu quantifizierendem Substrat nach dem Fiow-Injection-Prinzip in das unter a) beschriebene System aufgegeben werden,
c) integrale Fluoreszenzabnahmen oder -zunahmen als Folge der Entstehung des Coenzyms in oxidierter oder reduzierter Form die zu analysierenden Substratkonzentrationen darstellen und d) zwischen den beabsichtigten quantitativen Messungen das beteiligte Coenzym durch enzymatische Regenerierung in situ in die gewünschte oxidierte oder reduzierte Form gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Coenzym gebunden an Polyethylenglykol (beispielsweise eines Molekulargewichts von etwa 20 000) vorliegt.
3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch
- einen Enzymmembranreaktor,
- der durch eine Ultrafiltrationsmembran abgeschlossen ist, und
- eine Reaktionseinheit mit Fluoreszenzglasfaseroptik.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3833305 | 1988-09-30 | ||
| DEP3833305.8 | 1988-09-30 | ||
| DE19893916576 DE3916576A1 (de) | 1989-05-22 | 1989-05-22 | Verfahren zur biosensorischen quantitativen bestimmung von verbindungen sowie eine vorrichtung dafuer |
| DEP3916576.0 | 1989-05-22 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO1990003425A1 true WO1990003425A1 (de) | 1990-04-05 |
Family
ID=25872746
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/EP1989/001148 WO1990003425A1 (de) | 1988-09-30 | 1989-09-29 | Verfahren zur biosensorischen quantitativen bestimmung von verbindungen sowie eine vorrichtung dafür |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0409913A1 (de) |
| WO (1) | WO1990003425A1 (de) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4040385C1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-07-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | Determn. of organic cpds. e.g. glucose, fructose or sorbitol - comprises enzymatic oxidn. or redn. in presence of associated adenine di:nucleotide(s) in a flow reactor |
| DE4040364C1 (en) * | 1990-12-17 | 1992-09-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De | Determn. of glucose, fructose and sorbitol - by use of a NADP coenzyme in an adenine-di:nucleotide dependent enzyme reaction |
| CN1323296C (zh) * | 2004-07-05 | 2007-06-27 | 江苏省肿瘤医院 | 硅烷交联壳聚糖膜基的流动注射化学发光免疫检测池及制备方法 |
-
1989
- 1989-09-29 EP EP19890911544 patent/EP0409913A1/de not_active Withdrawn
- 1989-09-29 WO PCT/EP1989/001148 patent/WO1990003425A1/de not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHEMICAL ABSTRACTS, Vol. 96, 1982, (Columbus, Ohio, US), A.F. BUECKMANN et al., "An Efficient Synthesis of High-Molecular-Weight NAD (H) Derivatives Suitable for Continuous Operation with Coenzyme-Dependent Enzyme Systems", Abstract 158090w; & J. APPL. BIOCHEM., 1981, 3(4), 301-15. * |
| TALANTA, Vol. 35, No. 2, 1988, PERGAMON JOURNALS, LTD, GB, B.S. WALTERS et al., "Fiber-Optic Biosensor for Ethanol, Based on an Internal Enzyme Concept", pages 151-155. * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0409913A1 (de) | 1991-01-30 |
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