[go: up one dir, main page]

UA122768C2 - Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти - Google Patents

Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти Download PDF

Info

Publication number
UA122768C2
UA122768C2 UAA201607729A UAA201607729A UA122768C2 UA 122768 C2 UA122768 C2 UA 122768C2 UA A201607729 A UAA201607729 A UA A201607729A UA A201607729 A UAA201607729 A UA A201607729A UA 122768 C2 UA122768 C2 UA 122768C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
desaturase
lipid
elongase
plant
acid
Prior art date
Application number
UAA201607729A
Other languages
English (en)
Inventor
Джємс Робертсон Пітрі
Джемс Робертсон Питри
Сарайндер Пол Сінгх
Сарайндер Пол Сингх
Пушкар Шрестха
Джейсон Тімоті МакАлістер
Джэйсон Тимоти МакАлистер
Малколм Девід Девайн
Малколм Дэвид Девайн
Файтєр Роберт Чарльз де
Файтер Роберт Чарльз дэ
Original Assignee
Коммонвелз Сайнтіфік Енд Індастріал Рисерч Организейшн
Коммонвелз Сайнтифик Энд Индастриал Рисерч Организэйшн
Нусід Пти Лтд
Нусид Пти Лтд
Ґраінс Ресерч Анд Девелопмент Корпоратіон
Граинс Ресерч Анд Девелопмент Корпоратион
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53367674&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA122768(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from AU2013905033A external-priority patent/AU2013905033A0/en
Application filed by Коммонвелз Сайнтіфік Енд Індастріал Рисерч Организейшн, Коммонвелз Сайнтифик Энд Индастриал Рисерч Организэйшн, Нусід Пти Лтд, Нусид Пти Лтд, Ґраінс Ресерч Анд Девелопмент Корпоратіон, Граинс Ресерч Анд Девелопмент Корпоратион filed Critical Коммонвелз Сайнтіфік Енд Індастріал Рисерч Организейшн
Publication of UA122768C2 publication Critical patent/UA122768C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C69/00—Esters of carboxylic acids; Esters of carbonic or haloformic acids
    • C07C69/52—Esters of acyclic unsaturated carboxylic acids having the esterified carboxyl group bound to an acyclic carbon atom
    • C07C69/587—Monocarboxylic acid esters having at least two carbon-to-carbon double bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C3/00—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom
    • C11C3/02—Fats, oils, or fatty acids by chemical modification of fats, oils, or fatty acids obtained therefrom by esterification of fatty acids with glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23D—EDIBLE OILS OR FATS, e.g. MARGARINES, SHORTENINGS OR COOKING OILS
    • A23D9/00—Other edible oils or fats, e.g. shortenings or cooking oils
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/201—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having one or two double bonds, e.g. oleic, linoleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/20—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids
    • A61K31/202—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms, e.g. stearic, palmitic, arachidic acids having three or more double bonds, e.g. linolenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
    • A61K31/23—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms
    • A61K31/232—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin of acids having a carboxyl group bound to a chain of seven or more carbon atoms having three or more double bonds, e.g. etretinate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/31—Brassicaceae or Cruciferae (Mustard family), e.g. broccoli, cabbage or kohlrabi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01051—1-Acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase (2.3.1.51)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)

Abstract

Винахід належить до екстрагованого рослинного ліпіду, що містить докозагексаєнову кислоту (ДГК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 до 30 % або від 20,1 до 35 %. Крім того, даний винахід належить до рослинного та/або мікробного ліпіду, що містить докозапентаєнову кислоту (ДГК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 35 %, і способів одержання екстрагованого ліпіду.

Description

(54) ЕКСТРАГОВАНИЙ РОСЛИННИЙ ЛІПІД, ЩО МІСТИТЬ ДОВГОЛАНЦЮГОВІ ПОЛІНЕНАСИЧЕНІ
ЖИРНІ КИСЛОТИ
(57) Реферат:
Винахід належить до екстрагованого рослинного ліпіду, що містить докозагексаєнову кислоту (ДГК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 до 30 95 або від 20,1 до 35 95. Крім того, даний винахід належить до рослинного та/або мікробного ліпіду, що містить докозапентаєнову кислоту (ДГК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 до 35 95, і способів одержання екстрагованого ліпіду.
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ
Цей винахід відноситься до ліпіду, що містить докозагексаєнову кислоту та/або докозапентаєнову кислоту, одержані із рослинних клітин або мікробних клітин, і способів одержання та застосування ліпіду.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Довголанцюгові омега-3 поліненасичені жирні кислоти (ДЛ-ІПНЖК) на сьогоднішній день широко визнані як важливі сполуки для здоров'я людини і тварин. Вказані жирні кислоти можуть бути одержані з харчових джерелом або шляхом перетворення лінолевої (ЛК, 18:26) або а- ліноленової (АЛК, 18:3003) жирних кислот, обидві з яких розглядаються як незамінні жирні кислоти в раціоні людини. Хоча людина і багато інших хребетних тварин можуть перетворювати
ЛК або АЛК, одержані з рослинних джерел, на С22, вони здійснюють таке перетворення з дуже низькою швидкістю. Крім того, більшості сучасних суспільств властиве незбалансоване харчування, в якому щонайменше 90 95 поліненасичених жирних кислот (ПНЖК) складають об жирні кислоти, замість співвідношення 4:1 або менше для 06:03 жирних кислот, яке вважається ідеальним (Тгацїмеїй, 2001). Безпосереднім харчовим джерелом ДЛ-ПНЖК, наприклад, ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:53) і докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:603) для людини, в основному, є риба або риб'ячий жир. Таким чином, медичні працівники рекомендують регулярно включати рибу до раціону людини, що містить значні рівні ДЛ-ПНЖК. Все частіше ДЛ-
ПНЖК, одержані з риб'ячого жиру, вводять, наприклад, в харчові продукти і дитяче харчування.
Однак за рахунок зменшення глобального і національного вилову риби, необхідні альтернативні джерела вказаних жирів, що проявляють позитивний вплив на здоров'я.
Квіткові рослини, на противагу тваринам, не здатністні синтезувати поліненасичені жирні кислоти з довжиною ланцюга більше 18 атомів вуглецю. Зокрема, культивовані і садові рослини разом з іншими покритонасінними не мають ферментів, необхідних для синтезу 03 жирних кислот з довшим ланцюгом, наприклад, ЕПК, докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:53) і ДГК, одержаних з АЛК. Важливою метою в біотехнології рослин, таким чином, є створення культивованих рослин, що продукують значні кількості ДЛ-ПНЖК, таким чином забезпечуючи альтернативне джерело цих сполук.
Шляхи біосинтезу ДЛА-ПНЖК
Біосинтез ДЛ-ПНЖК в організмах, таких як мікроводорості, мохи і гриби, звичайно відбувається як серія реакцій кисень-залежної десатурації і елонгації (Фіг. 1). Найпоширеніший шлях одержання ЕПК у вказаних організмах включає АДб-десатурацію, Дб-елонгацію і Д5Ь- десатурацію (має назву шляху Дб-десатурації), тоді як в менш поширеному шляху використовується ЛОУ-елонгація, ДЛ8-десатурація і Д5-десатурація (має назву шляху Дое- десатурації). Вказані послідовні реакції десатурації і елонгації можуть починатися із субстрату 0б жирної кислоти ЛК, схематично проілюстрованого у верхній лівій частині Фіг. 1 (06) або субстрату 03 АЛК до ЕПК, проілюстрованого на нижній правій частині Фіг. 1 (03). Якщо початкова Дб-десатурація здійснюється на субстраті 06 ЛК, продукт серії із трьох ферментів
ДЛ-ПНЖК буде 06 жирною арахідоновою кислотою (АРК). Організми, які синтезують ДЛ-ПНЖК, можуть перетворювати 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти з використанням о3-десатурази, що проілюстровано як стадія А17-десатурази на Фіг. 1, для перетворення арахідонової кислоти (АРК, 20:406) на ЕПК. Деякі члени родини о3-десатурази можуть впливати на різні субстрати, що варіюють від ЛК до АРК. Рослинні 0З3-десатурази часто специфічно каталізують А15- десатурацію ЛК до АЛК, тоді як грибкові і дріжджові 3-десатурази можуть бути специфічними по відношенню до А17-десатурації АРК до ЕПК (Регеїга еї аї., 2004а; 7апк еї аї., 2005). Деякі звіти наводять на думку про те, що можуть існувати неспецифічні 03-десатурази, які можуть перетворювати широкий спектр об субстратів на відповідні 03 продукти (2папо еї аї., 2008).
Перетворення ЕПК на ДГК в таких організмах відбувається шляхом Д5-елонгації ЕПК з утворенням ДПК, після чого слідує Д4-десатурація з утворенням ДГК (Фіг. 1). І навпаки, ссавці використовують так званий шлях "Шпрехера", в якому ДПК перетворюється на ДГК в ході трьох окремих реакцій, незалежних від Л4-десатурази (Зргеспег еї аї., 1995).
Фронт-енд десатурази, загалом знайдені в рослинах, мохах, мікроводоростях і нижчих тваринах, наприклад, Саепогппабраїйїіх еієдап5, в основному приймають субстрати жирних кислот, естерифікованих в положенні 5п-2 фосфатидилхолінового (ФХ) субстрату. Вказані десатурази, таким чином, відомі як ацил-ФХ, зв'язані з ліпідом, фронт-енд десатурази (Ботегдиеєе еї аї., 2003). | навпаки, фронт-енд десатурази вищих тварин загалом приймають субстрати ацил-КоА, де жирнокислотний субстрат зв'язаний з КоА замість ФХ (Юотегоце еї аї!., 2005). Відомо, що деякі десатурази мікроводоростей і одна рослинна десатураза використовують жирнокислотні субстрати, естерифіковані до КоА (Табл. 2).
Кожна реакція елонгації ПНЖК складається з чотирьох стадій, що каталізуються багатокомпонентним білковим комплексом: спочатку, реакція конденсації приводить до додавання модуля 2С з малоніл-КоОА до жирної кислоти, результатом чого є утворення рД- кетоацильної проміжної сполуки. Далі вона відновлюється НАДФ-Н, з подальшою дегідратацією і утворенням єноїльної проміжної сполуки. Вкінці ця проміжна сполука повторно відновлюється з утворенням подовженої жирної кислоти. Загалом, вважається, що стадія конденсації в числі вказаних чотирьох реакцій є специфічною для субстрату, а інші стадії -- ні. На практиці це означає, що природний апарат елонгації рослини здатний до елонгації ПНЖК, за умови, що введений конденсаційний фермент (звичайно під назвою «елонгаза»), специфічний по відношенню до ПНЖК, хоча ефективність природного апарату елонгації рослини з точки зору елонгації неприродних субстратів ПНЖК може бути низькою. У 2007 році була опублікована інформація щодо ідентифікації та опису циклу елонгації дегідратази дріжджів (Оепіс апа
М/еів5тап, 2007).
Десатурація ПНЖК в рослинах, мохах і мікроводоростях природним чином відбувається на жирнокислотних субстратах, в основному, в пулі ацил-ФХ, тоді як елонгація відбувається на субстратах в пулі ацил-КоА. Перенесення жирних кислот від молекул ацил-ФХ до носія КоА здійснюється фосфоліпазами (ФЛА), тоді як перенесення жирних кислот ацил-КоА до носія ФХ здійснюється лізофосфатидил-холін ацилтрансферазами (ЛФХАТ) (Фіг. 9) (5іпоп еї а!., 2005).
Сконструйоване продукування ДЛ-ПНЖК
Велика частина метаболічного конструювання ДЛ-ПНЖК здійснювалася з використанням аеробного шляху Дб-десатурація/елонгація. Про біосинтез у-ліноленової кислоти (ГЛК, 18:306) в тютюні з використанням Аб-десатурази із ціанобактерії Зупеспосувіїх вперше повідомлялося в 1996 році (Кедау апа Тротавх, 1996). Пізніше, ГЛК була одержана в культивованих рослинах, таких як сафлор (73 956 ГЛК в олії з насіння; М/О 2006/127789). Продукування ДЛ-ПНЖК, наприклад, ЕПК і ДГК, включає складніше конструювання за рахунок збільшення кількості залучених стадій десатурації та елонгації. Про продукування ЕПК в наземній рослині вперше повідомлялося 0) еї а!. (2004), які ввели гени, що кодують Де9-елонгазу з Ізоспгузів даІрапа, Д8- десатуразу з ЕЄцдієпа дгасіїїз і Д5-десатуразу з МогііегеїІа аІріпа в Агарідорзі5 з одержанням до З до ЕПК. Ця робота була продовжена Абррбаді еї аї. (2004), які повідомляли про продукування до
Зо 0,8 956 ЕПК в насінні льону з використанням генів, що кодують Дб-десатуразу і Дб-елонгазу з
РпузсоптійгеПа раїепз і Д5-десатуразу з РпаєодасіуЇ нт ісогпишшИт.
Перший звіт про одержання ДДЛ-ДГК у УМО 04/017467, в якій розкрито продукування З 90
ДГК у зародках сої, але не насінні, шляхом введення генів, що кодують АДб-десатуразу заргоїєдпіа даісіїпа, АДб-десатуразу МогіегеПйа аїріпа, Д5-десатуразу МогііегейМйа аїріпа, да- десатуразу ЗаргоїІеодпіа адісіїпа, А17-десатуразу ЗаргоЇІедпіа аїісіїпа, Аб-елонгазу МогііегеїІа аІріпа та Д5-елонгазу Раміома Ішїпегі. Максимальний рівень ЕПК в ембріонах, які також продукують
ДГК, становив 19,6 95, вказуючи на низьку ефективність перетворення ЕПК на ДГК (УМО 2004/071467). Це відкриття було подобнім до опублікованого Кобегі еї аїЇ. (2005), де вихід перетворення ЕПК на ДГК був низьким, з продукуванням З 95 ЕПК і 0,5 95 ДГК в Агабідаорвів з використанням Д5Б/б-десатурази Вапіо гегіо, Аб-елонгази Саєепогпарай5 еІєдапв та Д5-елонгази і
Дда-десатурази Раміома заїїпа. Крім того, в 2005 році УМи еї аі. опублікували повідомлення щодо продукування 25 95 АРК, 15 95 ЕПК і 1,5 95 ДГК у Вгазвзіса |ипсеа з використанням лЛб-десатурази
РуїШішт ітедиіаге, Д5-десатурази ТПгаивіоспуїгій, Дб-елонгази РПузсотійгеПйа раїеп5, А12- десатурази Саїепаціа ойісіпаїйє, Д5-елонгази ТПгаизіоспуїгій, А17-десатурази Рпуорпїпога іптезіап5, елонгази ДДЦ-ПНЖК Опсогпупсиз тукКіз5, Л4-десатурази ТПгаивіоспуїгій ії ЛФХАТ
Тигаивіоспуїтій (Уи еї аіІ., 2005). Короткий опис зусиль з одержання врожаю насіння олійних культур, яке синтезує Ф3 ДЛ-ПНЖК, наведений у Мепедаз-Саїегоп еї а. (2010) ії Киї2-І оре? еї аї. (2012). Як вказано Еці-І оре; еї аї. (2012), на дату публікації результати з одержання ДГК у трансгенних рослинах навіть віддалено не нагадують рівнів, що спостерігаються в риб'ячому жирі. Пізніше, Реїгіе єї а! (2012) повідомляли про продукування близько 15 95 ДГК в насінні
Агарідорзів ІПаїїапа, та у М/О2013/185184 повідомлялося про продукування деяких олій з насіння, що містили від 7 96 до 20 95 ДГК. Однак, не існує повідомлень щодо продукування рослинних олій, які містили б більше 20 95 ДГК.
Не існує повідомлень щодо продукування ДПК у рекомбінантних клітинах із значущими рівнями без супутнього продукування ДГК. Насправді, авторам даного винаходу невідомо про будь-яку опубліковану навідну думку або ідею продукування ДПК у рекомбінантних клітинах без продукування ДГК.
Таким чином, залишається потреба в ефективнішому продукуванні ДЛ-ПНЖК в рекомбінантних клітинах, зокрема ДГК або ДПК у насінні рослин олійних культур. 60 КОРОТКИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДУ
Авторами даного винаходу ідентифіковані способи і рослини для одержання ліпіду з високими рівнями ДГК та/або ДПК. Як описано у УУМО2013/185184, авторами даного винаходу раніше був розкритий екстрагований рослинний ліпід, а також рослини і частини рослин для продукування такого ліпіду, що містять ДГК в кількості від 7 95 до 20 95 від загального вмісту жирних кислот у екстрагованому ліпіді. Була визначена верхня межа 20 905, оскільки на той час це вважалося максимальною кількістю ДГК, що може продукуватися в рослинах. Однак, як описано у даній заявці, винахідниками несподівано було знайдено, що можна одержати рівні
ДГК більше 20 95 від загального вмісту жирних кислот. Крім того, авторами знайдений рослинний ліпід, а також частини рослин і рослини для продукування ліпіду, що містить ДПК у кількості від 7 9о до 35 95 від загального вмісту жирних кислот в екстрагованому ліпіді, особливо за відсутності ДГК.
Відповідно, у першому аспекті даного винаходу пропонується екстрагований рослинний ліпід, який містить жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30
Фо або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 90.
В іншому аспекті даного винаходу розкривається екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), та необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) притому, що рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 95 до 16 9б, і, при цьому, рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менше 1 95, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30
Фо або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 905.
В іншому аспекті винаходу пропонується екстрагований ліпід, переважно екстрагований рослинний ліпід або екстрагований мікробний ліпід, що містить жирні кислот в естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), і, при цьому, рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту, рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 905, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 95, близько 22 9, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 30 95, від близько 7 90 до близько 28 до, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30
Фо, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 905, від близько 14 95 до 35 до, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25 до або від близько 16 95 до близько 22 95.
У варіанті реалізації згаданого вище аспекту ДГК присутня на рівні менше 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот екстрагованого ліпіду і, більш переважно, відсутня у загальному вмісті жирних кислот ліпіду.
В іншому аспекті винаходу пропонується екстрагований ліпід, переважно екстрагований рослинний ліпід або екстрагований мікробний ліпід, що містить жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), і, при цьому, щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованих у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковані в положенні 5п-2 ТАГ. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід додатково має одну або більше або всі ознаками з (ї) він містить жирні кислоти, включаючи олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а- ліноленову кислоту (АЛК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), (ї) щонайменше близько 40 96, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 905, від 35 95 до близько 60 95 або від 60 35 956 до близько 50 95 ДРК та/або ДГК, естерифікованих у формі триацилгліцеролу (ТАГ),,
естерифіковані в положенні 51-2 ТАГ, і (ії) рівень ДПК та/або ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 95, або від близько 7 95 до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту рівень ДПК та/або ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 905, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 95, близько 22 9, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 905, близько 30 95, від близько 7 90 до близько 28 до, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 95, від близько 10 95 до близько 30 до, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 до, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25 до або від близько 16 95 до близько 22 95. У переважних варіантах реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє ознаками (Її) і (ії), (І) (ії) або (ії) і (ії), переважніше, все з (Її), (ії) і (ії).
Переважно, екстрагований ліпід додатково характеризується рівнем пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, що становить від близько 2 95 до 16 9б, і, при цьому, рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менше 1 95.
Варіанти реалізації кожного із чотирьох описаних вище аспектів детальніше розкриті нижче.
Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, будь-які з варіантів реалізації винаходу, описані ширше відповідної ознаки у згаданому вище аспекті, не застосовуються до даного аспекту.
У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід володіє однією або більше із наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 95 до 18 905, від близько 2 95 до 16 95, від близько 2 95 до 15 95 або від близько З 95 до близько 10 95, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 6 95, менше З 95, менше 2 95, менше 1 95 або близько 0,1 95, ії) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до близько 30 95, від близько З 95 до близько 30 95, від близько 6 95 до близько 30 905, від 1 95 до близько 20 95, від близько 30 95 до близько 60 95, від близько 45 905 до близько 60 95, близько 30 95 або від близько 15 95 до близько 30 905,
Зо їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 905, від близько 4 95 до близько 20 95, від близько 4 95 до близько 17 95 або від близько 5 95 до 10 95, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 40 95, від близько 7 95 до близько 40 95, від близько 10 95 до близько 35 95, від близько 20 95 до близько 35 95, від близько 4 95 до близько 16 95 або від близько 2 95 до близько 16 905, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько З 95, менше, ніж близько 2 95, менше, ніж близько 1 95, менше, ніж близько 0,5 905, від 0,05 95 до близько 7 95, від 0,05 95 до близько 4 95, від 0,05 95 до близько З 95 або від 0,05 95 до близько 2 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 10 95, менше, ніж близько 8 95, менше, ніж близько 7 95, менше, ніж близько 6 95, менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько З 95, від близько 0,05 95 до близько 7 95, від близько 0,05 95 до близько 6 95, від близько 0,05 95 до близько 4 95, від близько 0,05 95 до близько З 95, від близько 0,05 95 до близько 10 95, або від 0,05 95 до близько 2 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 6 95, менше, ніж близько 5 95, менше, ніж близько 4 95, менше, ніж близько 1 95, менше, ніж близько 0,5 95, від 0,05 95 до близько 6 95, від 0,05 95 до близько 5 905, від 0,05 95 до близько 4 905, від 0,05 95 до близько 3 95 або від 0,05 95 до
БО близько 2 95, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТРрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж 2 95, менше, ніж близько 1 95, від 0,05 95 до 4 95, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до близько 2 95 або від 0,05 95 до близько 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 15 95 менше, ніж 4 956, менше, ніж близько З 95, менше, ніж близько 2 95, від 0,05 95 до 10 905, від 0,05 95 до 5 905, від 0,05 95 до З 95 або від 0,05 95 до 2 95, хі) якщо рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 35 95, то рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот 60 екстрагованого ліпіду становить менше, ніж 4 95, менше, ніж близько З 95, менше, ніж близько 2 оо, від 0,05 95 до 8 905, від 0,05 95 до 5 905, від 0,05 95 до З 95 або від 5 95 до 15 905, від 5 95 до 10 95 або від 0,05 95 до близько 2 95, хії) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 22 90, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 31 95, від 20,1 95 до 29 905, від 20,1 95 до 28 95, від 20,1 95 до близько 27 95, від 20,1 95 до близько 26 95, від 20,1 95 до близько 25 95, від 20,1 95 до близько 24 95, від 21 95 до 35 905, від 21 95 до 30 905, від 21 95 до 28 905, від 21 95 до близько 26 95 або від 21 95 до приблизне 24 95, хії) ліпід містить Фб-докозапентаєнову кислоту (22:525710и13и6) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід містить менше 0,1 95 ф0б-докозапентаєнової кислоти (22:525771013116) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хм) ліпід містить менше 0,1 95 однієї або більш або всіх із СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому,
Хмі) рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, від близько 4 95 до близько 20 до, від близько 6 95 до близько 20 95 або від близько 6 95 до близько 12 95, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 40 95, від близько 4 95 до близько 35 до, від близько 8 95 до близько 25 905, від 8 95 до близько 22 95, від близько 15 95 до близько 40 95 або від близько 15 95 до близько 35 95, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, від близько 30 95 до близько 75 95, від близько 50 95 до близько 75 95, близько 60 905, близько 65 95, близько 70 95, близько 75 до або від близько 60 95 до близько 75 9б, хіх) рівень загальних 0б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 35 95 до близько 50 95, від близько 20 95 до близько 35 95, від близько 6 95 до 20 95, менше, ніж 20 95, менше, ніж близько 16 95, менше, ніж близько 10 95, від близько 1 95 до близько 16 95, від близько 2 95 до близько 10 95 або від близько 4 95 до близько 10 95,
Зо хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше, ніж близько 10 95, менше, ніж близько 8 95, менше, ніж близько 6 95, менше, ніж 4 95, від близько 1 95 до близько 20 95, від близько 1 95 до близько 10 95, від 0,5 956 до близько 8 95 або від близько 0,5 95 до 4 905, ххі) рівень загальних 003 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 956 до близько 65 95, від 36 95 до близько 70 95, від близько 40 95 до близько 60 95, від близько 30 95 до близько 60 905, від близько 35 95 до близько 60 905, від 40 95 до близько 65 95, від близько 30 95 до близько 65 905, від близько 35 95 до близько 65 95, близько 35 до, близько 40 95, близько 45 95, близько 50 95, близько 55 95, близько 60 95, близько 65 95 або близько 70 95, ххії) рівень нових Фі! жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 21 95 до близько 45 95, від 21 95 до близько 45 95, від близько 23 95 до близько 35 95, від близько 25 95 до близько 35 95, від близько 27 95 до близько 35 95, близько 23 до, близько 25 95, близько 27 95, близько 30 95, близько 34 95, близько 40 95 або близько 45 905, ххії) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше, ніж близько 0,50, менше, ніж близько 0,40, менше, ніж близько 0,30, менше, ніж близько 0,20, менше, ніж близько 0,15, близько 1,0, близько 0,1, від близько 0,1 до близько 0,4 або близько 0,2, ххім) співвідношення нових 0б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,02 до близько 0,1, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше, ніж близько 0,50, менше, ніж близько 0,40, менше, ніж близько 0,30, менше, ніж близько 0,20, менше, ніж близько 0,15, близько 0,1, близько 0,2 або близько 1,0, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією Д12-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, від близько 60 95 до близько 98 95, від близько 70 95 до близько 95 до або від близько 75 95 до близько 90 9б, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Дб-десатурази щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 30 95 до близько 70 95, від близько 35 95 до близько 60 95 або від близько 50 95 до близько 70 905, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту
ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 88 95 або від близько 75 95 до близько 85 905, ххміїї) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 99 905, від близько 70 95 до близько 99 95 або від близько 75 95 до близько 98 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 85 95, щонайменше близько 90 95, від близько 50 95 до близько 99 95 або від близько 85 95 до близько 99 95, від близько 50 95 до близько 95 95 або від близько 85 95 до близько 95 95, ххх) якщо рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, то склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 93 95, від близько 50 95 до близько 95 95, від близько 80 95 до близько 95 95 або від близько 85 95 до близько 95 905, хххі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК та/"або ДПК щонайменше близько 10 9565, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 25 95, близько 20 95, близько 25 95, близько 30 95, від близько 10 95 до близько 50 95, від близько 10 95 до близько 30 905, від близько 10 95 до близько 95 або від близько 20 95 до близько 30 95, 25 хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДГК та/або
ДПК щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 956, щонайменше близько 22 9б5, щонайменше близько 25 95, щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, близько 25 до, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, близько 45 95, близько 50 95, від близько 15 95 до близько 50 95, від близько 20 95 до близько 40 95 або від близько 20 95 до близько 30 905,
Зо хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК та/або ДПК щонайменше близько 17 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 24 95, щонайменше близько 30 95, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, близько 45 95, близько 50 95, близько 55 95, близько 60 95, від близько 22 95 до близько 70 95, від близько 17 95 до близько 55 95, від близько 22 95 до близько 40 95 або від близько 24 95 до близько 40 905, хххім) загальні жирні кислоти у екстрагованому ліпіді містять менш ніж 1,5 96 С2071, менш ніж 195 С20:1 або близько 1 95 С20:1, хххМ) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) у ліпіді становить щонайменше близько 70 9б5, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше 95 95, від близько 70 95 до близько 99 95 або від близько 90 95 до близько 99 905, ххухмії) ліпід містить диацилгліцерол (ДАГ), причому ДАГ переважно містить ДГК та/або ДПК, ххумії) ліпід містить менш ніж близько 10 95, менш ніж близько 5 95, менш ніж близько 1 95 або від близько 0,001 95 до близько 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, або по суті не містить їх, ххуміїї) щонайменше 70 95, щонайменше 72 95 або щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК та/або ДПК у формі ТАГ знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, хххіх) найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, у ліпіді є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), ліпід, що містить три-ДГК ТАГ (ТАС 66:18), і
ХхІ) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 до, близько 8 95, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 95, близько 15 95, близько 18 95, близько
БО 20 95, близько 22 95, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 31 95, від близько 7 95 до близько 31 95, від близько 7 95 до близько 28 95, від близько 10 905 до 35 95, від близько 10 905 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 95, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько 30 95, від близько 16 95 до близько 25 95, або від близько 16 95 до близько 22 95, причому рівень ДГК необов'язково становить менш ніж 0,5 9о від загального вмісту жирних кислот екстрагованого ліпіду.
В іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід володіє однією або більше із наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 2 95 до 15 905, б і) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить близько 0,1 95, ії) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1 95 до 30 95, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 4 95 до 20 905, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 4 95 до 40 905, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 90 до 7 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 95 до 10 95, мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 6 905, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 4 95, х) екстрагований рослинний ліпід містить менш ніж 0,1 956 0б-докозапентаєнової кислоти (22:5Д4,7,10,13,16) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хі) рівень нових 0б жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж 10 905, хії) співвідношення загального вмісту 06 жирних кислот: загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1,0 до 3,0 або від 0,1 до 1, хії) співвідношення нових б жирних кислот : нових 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 1,0 до 3,0, від 0,02 до 0,1 або від0О/1 до 1, хім) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше 10 95, хм) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності
Зо перетворення ЛК на ДГК щонайменше 15 95, хмі) склад жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДГК щонайменше 17 905, хмії) загальні жирні кислоти у екстрагованому рослинному ліпіді містять менш ніж 1,5 90
С2071, і хмії) вміст триацилгліцеролів (ТАГ) екстрагованого рослинного ліпіду становить щонайменше 70 905, і може характеризуватися однією або більше із наступних ознак хіх) екстрагований рослинний ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ,, який містить ДГК, хх) екстрагований рослинний ліпід містить менш ніж 10 95 вільних (неетерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду або по суті не містить їх, ххі) щонайменше 70 95 ДГК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться в положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, ххії) найбільш розповсюджені ДГК-вмісні види ТАГ в екстрагованому рослинному ліпіді являють собою ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), і ххії) екстрагований рослинний ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
У варіанті реалізації рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 0,05 95 до 10 95.
В іншому варіанті реалізації, у якому ДГК присутня в кількості від 20,1 95 до 35 95, рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить менш ніж близько 4 905.
У подальшому варіанті реалізації рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого рослинного ліпіду становить від 20,1 95 до 30 95.
У іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід знаходиться у формі олії, причому ліпід складає щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 98 95 або від близько 95 95 до близько 98 95 мас. олії.
У переважному варіанті реалізації описаних вище перших двох аспектів ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДГК становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж близько б 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до 60 близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, співвідношення загального вмісту 06 жирних кислот : загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 3,0, і вміст триацилгліцеролів (ТАГ), у ліпіді становить щонайменше близько 70
Фо, і необов'язково ліпід по суті не містить холестерину та/або ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18). Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: щонайменше 70 95 ДГК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ), АЛК присутня на рівні від 4 96 до 40 905 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ДПК становить від 0,05 95 до близько 8 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на ЕТК кислоту під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією А. -елонгази від близько 50 95 до близько 95 95, ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази від близько 50 95 до близько 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше близько 10 95. Найбільш переважно, щонайменше 81 95 ДГК естерифіковано в положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ).
У переважному варіанті реалізації описаного вище третього аспекту ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДПК становить від близько 7 95 до 30 95 або від 7 95 до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, співвідношення загального вмісту б жирних кислот : загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 3,0, і вміст триацилгліцеролів (ТАГ) у ліпіді становить щонайменше близько 70 95, і необов'язково ліпід по суті не містить від холестерину, та/або ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: щонайменше 70 95 ДПК естерифіковано у положенні 5п-1ї або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ), АЛК присутня на рівні від 4 95 до 40 95 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 956 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на
ЛК під дією А12-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на
ЕТК кислоту під дією Аб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від близько 50 95 до близько 95 95, і ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше близько 10 95. Найбільш переважно, щонайменше 81 95
ДПК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ).
В іншому переважному варіанті описаного вище четвертого аспекту, ліпід або олія, переважно олія з насіння, що містить ДГК та/або ДПК, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, загальний рівень насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 25 95, бо співвідношення загального вмісту б жирних кислот : загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 3,0, вміст триацилгліцеролів (ТАГ) ліпіду становить щонайменше близько 70 95, і необов'язково ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) та/або три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15), причому щонайменше 35 95
ДПК та/або ДГК, естерифікованих у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано в положенні 5п-2 ТАГ. Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: АЛК присутня на рівні від 4 95 до 40 95 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня, та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних мононенасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 9о, співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на
ЛК під дією ДІТ2-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від близько 50 95 до близько 95 95, ефективності перетворення
ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази (якщо вони присутні) від близько 50 95 до близько 95 95, ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДГК щонайменше близько 10 95.
В контексті екстрагованого ліпіду або олії за винаходом, рівень ДГК та/або ДПК у екстрагованому ліпіді або олії не підвищений або є істотною мірою таким же, як рівень ДГК та/або ДПК в ліпіді або олії частини рослини або мікроба до екстракції. Іншими словами, після екстракції не проводилося процедур для підвищення рівня ДГК та/або ДПК у ліпіді або олії відносно інших жирних кислот. Як буде очевидно, ліпід або олія в подальшому можуть бути оброблені фракціонуванням або іншими методами, з метою модифікації складу жирних кислот.
У ще одному переважному варіанті реалізації ліпід або олія, переважно олія з насіння, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДГК становить від близько 20,1 95 до 30 95 або від близько 20,1 95 до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж близько 6 95 і переважно менш ніж близько 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, ГЛК присутня, рівень СДК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 6 95, рівень ЕПК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95, рівень ДПК становить від близько 0,05 95 до близько 8 95.
У іншому переважному варіанті реалізації ліпід або олія, переважно олія з насіння і, більш переважно, олія з насіння Вгаз5іса, така як гірчична олія або рапсова олія, володіє наступними ознаками: у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії рівень ДПК становить від близько 7
Фо до 35 95, рівень пальмітинової кислоти становить від близько 2 95 до близько 16 95, рівень міристинової кислоти становить менш ніж близько б 95 і переважно менш ніж 1 95, рівень олеїнової кислоти становить від близько 1 95 до близько 30 95, рівень ЛК становить від близько 4 95 до близько 35 95, АЛК присутня, рівень СДК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько б 95, рівень ЕПК становить від близько 0,05 95 до близько 10 95. ДГК може бути присутня або може бути відсутня у ліпіді або олії. Переважно, ДГК, якщо вона присутня, присутня на рівні не більше ніж 0,5 95 від загального вмісту жирних кислот в ліпіді або олії і, більш переважно, відсутня у загальному вмісті жирних кислот ліпіду або олії.
Необов'язково, ліпід по суті не містить холестерину та/або ліпід містить три-ДПК ТАГ (ТАГ 66:15). Більш переважно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, додатково має одну або більше або всі із наступних ознак: щонайменше 70 95 ДПК естерифіковано в положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ), АЛК присутня на рівні від 4 9о до 40 905 від загального вмісту жирних кислот, ГЛК присутня та/або рівень ГЛК становить менш ніж 4 95 від загального вмісту жирних кислот, рівень СДК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень ЕТК становить менш ніж близько 4 95, рівень ЕПК становить від 0,05 95 до близько 10 95, рівень загальних ненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 95 до близько 35 95, рівень загальних поліненасичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 95 до близько 75 95, співвідношення нових б жирних кислот : нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 0,03 до близько 3,0, переважно менш ніж близько 0,50, склад жирних кислот ліпіду базується на: ефективності перетворення олеїнової кислоти на бо ЛК під дією АТ2-десатурази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення СДК на
ЕТК кислоту під дією Дб-елонгази щонайменше близько 60 95, ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією Д5-елонгази від близько 50 95 до близько 95 95 та ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК щонайменше близько 10 95. У варіанті реалізації щонайменше 81 95
ДПК естерифіковано у положенні 5п-1 або 5п-3 триацилгліцеролу (ТАГ). Як альтернатива, щонайменше 35 9о ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ.
В подальшому варіанті реалізації екстрагований ліпід за винаходом додатково містить один або більше стеролів, переважно рослинних стеролів.
В іншому варіанті реалізації екстрагований ліпід знаходиться у формі олії і містить менш ніж близько 10 мг стеролів/г олії, менш ніж близько 7 мг стеролів/г олії, від близько 1,5 мг до близько 10 мг стеролів/г олії або від близько 1,5 мг до близько 7 мг стеролів/г олії.
Приклади стеролів, які можуть бути присутні у екстрагованому ліпіді, включають, не обов'язково обмежуючись ними, один або більше або всі з наступного: кампестрол/24- метилхолестерин, Д5-стигмастерол, ебурикол, ДВ-ситостерол/24-етилхолестерин, /-(Д5- авенастерол/ізофукостеролі ПАд7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-3р-ол і Д7-авенастерол.
У варіанті реалізації вид рослини є одним із наведених у Табл. 14, наприклад, рапс, і рівень стеролів є близько таким же, як наведений у Табл. 14 для даного конкретного виду рослин.
Види рослин можуть являти собою гірчицю (В. |їшпсєа) або б. заїма і містять рівень стеролів, близький до знайденого в екстрагованій олії гірчиці дикого типу або С. заїїма, відповідно.
У варіанті реалізації екстрагований рослинний ліпід містить один або більше або всі з кампастеролу/24-метилхолестерину, д5-стигмастеролу, ебуриколу, В-ситостеролу/24- етилхолестерину, Д5-авенастеролу/зофукостеролу, Д7-стигмастеролу/стигмаст-7-ен-Зр-олу і д7-авенастеролу, або містить рівень стеролів, по суті такий же, як в олії рапсу дикого типу.
У варіанті реалізації екстрагований ліпід містить рівень стеролів, по суті такий же, як в олії рапсу, гірчичній олії або олії С. займа дикого типу.
У варіанті реалізації екстрагований ліпід містить менш ніж близько 0,5 мг холестерину/г олії, менш ніж близько 0,25 мг холестерину/г олії, від близько 0 мг до близько 0,5 мг холестерину/г олії або від близько 0 мг до близько 0,25 мг холестерину/г олії або по суті не містить холестерину.
У подальшому варіанті реалізації ліпід є олію, переважно олію з олійної культури. Приклади
Зо таких олій включають, без обмеження, олію виду Вгаз55іса, наприклад, олію рапсу або олію гірчиці, олію сзо55урішт Ппігешщит, олію Гіпит изнасвзвітит, олію виду НеїЇапіпив5, олію Сагпатив
Ііпсіогіо5, олію Сіусіпе тах, олію 7еа тау»х, олію Агарідорзі5 (паіІапа, олію Зогдоапит бБісоїог, олію зогопит мцідаге, олію Амепа заїїма, олію виду ТиоїЇїШт, олію ЕІаевзіб5 диїпеепі5, олію Місопбапа
Брепіпатіапа, олію Ногдешт миідаге, олію Гиріпи5 апдивбійоїйш5, олію Огуа 5аїїма, олію Огу;а
Чіарегтіта, олію Сатеїймпа 5аїїма, олію Статье абрузвіпіса, олію Мізсапійи5 х дідапієи5 або олію
Мібсапійи5 5іпепзіх5. Більш переважно, олія являє собою олію виду Вгазвзіса, олію Сатвіїпа займа або олію Сіусіпе тах (сої). У варіанті реалізації ліпід містить або являє собою олію виду
Вгаззіса, таку як олія Вгаззіса пари5 або олія Вгаз5зіса |їнпсєа, олія Со55урішт Нітвшит, олія
Мпит ивзйаїіззітит, олія виду Неїапіпи5, олія Санпатив іпсіогій5, олія Сіусіпе тах, олія 7еа тауз, олія ЕІаевіз диіпеепів, олія Місоїапа репінатіапа,, олія І иріпи5 апдивійоїїШв5, олія Сатеїїпа займа, олія Статре абрузвзіпіса, олія Мізсапіпиз х дідапівиє або олія Мізсапіпив5 віпепвів. В подальшому варіанті реалізації олія являє собою олію рапсу, олію гірчиці (В. |шпсеєа), олію сої (СІусіпе тах), олію Сатеїйпа заїїма або олію Агабідорвзі5 Інайапа. В альтернативному варіанті реалізації олія являє собою рослинну олію, крім олії А. (йаійапа та/або крім олії б. займа. У варіанті реалізації рослинна олія є олією, окрім олії б. тах (сої). У варіанті реалізації олія була одержана з рослини, вирощеної у стандартних умовах, наприклад, як описано у Прикладі 1, або з рослини, вирощеної в полі або в теплиці із стандартними умовами.
В іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти, містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, ш0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду у частині рослини становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 60 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95.
У подальшому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, ш0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 95 до 16 95, і, при цьому, рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менш ніж 1 95, притому, що рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду у частині рослини становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 9б, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95.
В подальшому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 003 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 95 до 16 9б, і, при цьому, рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менш ніж 1 95, притому, що рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду у частині рослини становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, і
Зо і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95.
У варіанті реалізації трьох вищезгаданих аспектів винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії: 35 ї) одержання частини рослини, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, склад жирних кислот ліпіду включає олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, ФП Пжирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), ФГ Пжирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової 40 кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що (і) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 905, переважно від 30 95 до 35 905, (ії) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 9б, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 1 905, (ім) рівень 45 олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 905 до 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 905, (мі) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 9б, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 95, (мії) загальний рівень насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 905, (їх) співвідношення загального вмісту б жирних кислот : загального вмісту 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 і 1, (х) вміст триацилгліцеролів (ТАГ) ліпіду становить щонайменше 70 9б, і (хі) щонайменше 70 95 ДГК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 95. Переважно, щонайменше 81 95 або щонайменше 90 95 ДГК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ.
У подальшому аспекті винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини або мікробних клітин, що містить ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), Ф3 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду з частини рослини або мікробних клітин становить від близько 7 95 до 35 95, і ії) екстракцію ліпіду із частини рослини або мікробних клітин, причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 35 95. У варіанті реалізації рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 20 95 або від 20,1 95 до 35 905.
У варіанті реалізації згаданого вище аспекту винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду або мікробного ліпіду, який включає стадії: ї) одержання частини рослини або мікробних клітин, що містять ліпід, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, склад жирних кислот ліпіду включає олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДПК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому (ї) рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 7 95 до 30 95 або від 7 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35
Фо, (і) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 90 до 16 90, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж б 9о, переважно менш ніж 1 905, (ім) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 95, (м) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 905, (мі) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 9б, (мії) рівень ейкозатриєнової кислоти
Зо (ЕТрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 4 905, (мії) рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 25 9б, (їх) співвідношення загальних б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до 1, (х) вміст триацилгліцеролів (ТАГ) у ліпіді становить щонайменше 70 95, і (хі) щонайменше 70 95 естерифікованої ДПК у формі ТАГ знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ, і ії) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до 30 95 або від 7 95 до близько 35 95, переважно від 30 95 близько 35 95.
Переважно щонайменше 81 95 або щонайменше 90 95 ДПК, естерифікованої у формі ТАГ, знаходиться у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ.
В іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого ліпіду, який включає стадії: ї) одержання клітин, що містять ліпід, переважно частини рослини, що містить клітини, або мікробних клітин, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), притому, що щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, їі і) екстракцію ліпіду із клітин, причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, естерифіковано у положенні 5п- 2 ТАГ. У варіанті реалізації екстрагований ліпід, одержаний за способом, додатково характеризується одним або більше або всіма із наступного: (ї) він містить жирні кислоти, що включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають са-ліноленову кислоту (АЛК) і необов'язково одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), (її) щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 95, від 35 95 до близько 60 95 або від 35 95 до близько 50 95, ДПК та/або ДГК, естерифіковано у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ, і (ії) рівень ДПК та/або
ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 95 60 або від близько 7 95 до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95. У варіантах реалізації даного аспекту рівень ДПК та/(або ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 7 95, близько 8 905, близько 9 95, близько 10 95, близько 12 905, близько 15 95, близько 18 95, близько 20 95, близько 22 95, близько 24 95, близько 26 95, близько 28 95, близько 30 95, від близько 7 95 до близько 28 95, від близько 7 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до 35 до, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95, від близько 10 95 до близько 22 95, від близько 14 95 до 35 905, від близько 16 95 до 35 95, від близько 16 95 до близько
ЗО 95, від близько 16 95 до близько 25 95, або від близько 16 95 до близько 22 95. У переважних варіантах реалізації екстрагований ліпід характеризується (і) і (ії), (і) і (ії) або (ії) і (ії), більш переважно, всіма із (і), (ії) і (ії). Переважно, екстрагований ліпід додатково характеризується рівнем пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, який становить від близько 2 95 до 16 95, причому рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, якщо вона присутня, становить менш ніж 1 95.
У варіанті реалізації згаданого вище аспекту винаходу пропонується спосіб одержання екстрагованого ліпіду, який включає стадії: ї) одержання клітин, що містять ліпід, переважно частини рослини, що містить клітини, або мікробних клітин, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК) і додатково включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають са-ліноленову кислоту (АЛК), і одну або більш із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому (ї) рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 2 95 до 16 9б, (ії) рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 1 9б, (її) рівень олеїнової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 1 95 до 30 905, (ім) рівень лінолевої кислоти (ЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 35 95, (м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 95 до 40 95, (мі) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕтрК) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 905; (мії) рівень загальних насичених жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 905 до 25 90, (мії) співвідношення загальних 0б жирних кислот : загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 0,05 до близько 1 95, (їх) вміст триацилгліцеролу (ТАГ) у ліпіді становить щонайменше близько 70 905, і (х) щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано в положенні 5п-2 ТАГ, і і) екстракцію ліпіду із частини рослини, причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ,, в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду, естерифіковано у положенні 5п- 2 ТАГ.
Стадія одержання частини рослини або мікробних клітин може включати збирання врожаю частин рослини, переважно насіння, із рослин, що утворюють частини рослини, виділення мікробних клітин із культур таких клітин або одержання частин рослини або мікробних клітин шляхом придбання у виробника або постачальника, або шляхом імпорту. Спосіб може включати стадію визначення складу жирних кислот ліпіду у зразку частин рослини або мікробних клітин або екстрагованого ліпіду.
У переважному варіанті реалізації екстрагований ліпід, одержаний за способом у відповідності до винаходу, володіє, якщо це доречно, однією або більше ознак, визначених у даному описі, наприклад, як визначено вище для перших чотирьох аспектів.
Варіанти реалізації кожного із п'яти розкритих вище аспектів більш детально описані нижче.
Кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що жоден із варіантів реалізації, описаних ширше, ніж відповідна ознака у згаданому вище аспекті, не застосовується до цього аспекту.
У варіанті реалізації частина рослини є насінням, переважно насінням олійної культури.
Приклади такого насіння включають, без обмеження, насіння виду Вгаз5іса, бо55урішт піг шт,
Сіпит изйнабззітит, виду Неїїапіпи5, Сагіпатив іпсіогіиб5, Сіусіпе тах, 2еа тауз, Агарідорвів
Іаійапа, Зогуопит бісоїог, Зогупит миЇдаге, Амепа займа, виду ТгіїоЇйшт, ЕІаебіб5 диїпеепів,
Місоїйапа репіпатіапа, Ногадєит миїЇдаге, Гиріпиє апдивійоїйи5, Огуга заїїма, Огуга діабегтіта,
Сатеїймпа займа або Статре абруззіпіса, переважно насіння виду Вгаззіса, насіння С. займа або насіння Сх. тах (сої), більш переважно, насіння Вгаз5іса паривх, В. |ипсеа або С. заїїма. У варіанті реалізації частина рослини є насінням, переважно олійної культури, такої як вид Вгазвзіса, наприклад, Вгаззіса пари5 або Вгаззіса |нпсєа, Соз55зуріит ПНігзшіит, І іпит и5Наїйввітит, вид 60 Неїїапіпих, Саннатизв іпсіогпив, Сіусіпе тах, 7єа тауз, ЕІаєзіз диіпеєпів, Місоїапа репінатіапа,
Гиріпиз апдивійоїйше, Сатеїїпа 5айма або Статбре абузхвзіпіса, переважно насінням Вгазвзіса парих, В |шпсеа або С. заїїма. У варіанті реалізації насіння являє собою насіння рапсу, насіння гірчиці, насіння сої, насіння Сатеїйна займа або насіння Агарідорвів Інаійапа. В альтернативному варіанті реалізації насіння є насінням, окрім насіння А. ІПпаїїапа та/або окрім С. заїїма. У варіанті реалізації насіння є насінням, окрім насіння сої. У варіанті реалізації частина рослини є насінням виду Вгаззіса. У варіанті реалізації насіння було одержане від рослини, вирощеної у стандартних умовах, наприклад, як описано у Прикладі 1, або від рослини, вирощеної в полі або в теплиці із стандартними умовами.
В іншому варіанті реалізації насіння містить щонайменше близько 18 мг, щонайменше близько 22 мг, щонайменше близько 26 мг, від близько 18 мг до близько 100 мг, від близько 22 мг до близько 70 мг, близько 80 мг, від близько 30 мг до близько 80 мг, або від близько 24 мг до близько 50 мг ДГК та/або ДПК на грам насіння.
У подальшому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, і) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, Дб-елонгаза і дь- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза та/або А15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, да -десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) д12-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ДУ-елонгаза і дД5- елонгаза, мії) Д12-десатураза, 03-десатураза та/або Л15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, да -десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами,
Зо здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини.
У подальшому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, містять екзогенні полінуклеотиди, що кодують один з наступних наборів ферментів; її Ф03-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) Д12-десатураза, ю03-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Ф3-десатураза та/або Л15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, ЛУ9-елонгаза і Д5- елонгаза, м) А12-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) Д12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, до-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більш промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини або клітинах.
У варіанті реалізації, якщо частина рослини або клітини містять ліпід, що містить жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти містять докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, то частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, містить екзогенний полінуклеотид, що кодує 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), і, при цьому, полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, що здатні керувати експресією полінуклеотиду у клітині частини рослини або клітинах. У подальшому варіанті реалізації клітини містять екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; і) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5- десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, її) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А15-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза,
ії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, їм) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і дД5-елонгаза (і необов'язково Д4-десатураза, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), 03-десатураза, Ав-десатураза, Д5- десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мі) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, А8в-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Ав-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), АЛ12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Л8-десатураза, Д5-десатураза, ЛУ-елонгаза, Д5-елонгаза («|і необов'язково Д4-десатураза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині. Переважно, ЛФААТ може використовувати поліненасичений С22 жирний ацил-КоА субстрат, такий як ДГК-КоА та/або
ДПК-КоА.
У варіанті реалізації А12-десатураза додатково володіє 03-десатуразною та/або А15- десатуразною активністю, тобто види активності забезпечуються єдиним поліпептидом. Як альтернатива, ДЛ12-десатураза не володіє 03-десатуразною активністю і не володіє А15- десатуразною активністю, тобто Д12-десатураза є окремим поліпептидом від поліпептиду, що володіє 03-десатуразною та/або ДЛ15-десатуразною активністю.
Ще в одному варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, володіють одним або більше або всіма із наступних ознак: ї) ДІ2-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більш клітин частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 90 95 або від близько 75 95 до близько 85 905,
Зо ї) Ф3-десатураза перетворює б жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 65 95, щонайменше близько 75 9565, щонайменше близько 85 95, від близько 65 95 до близько 95 до, від близько 75 95 до близько 91 95 або від близько 80 95 до близько 91 95, ії) Де-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 30
Фо, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 30 95 до близько 70 95, від близько 35 95 до близько 60 до або від близько 50 95 до близько 70 9бо, їм) Де-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю менш ніж близько 5 95, менш ніж близько 2,5 95, менш ніж близько 1 95, від близько 0,1 95 до близько 5 95, від близько 0,5 95 до близько 2,5 95 або від близько 0,5 95 до близько 1 95, м) Дбе-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 до, щонайменше близько 75 95, від близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 80 95 або від близько 75 95 до близько 80 905, мі) Д5-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70
Фо, щонайменше близько 75 956, щонайменше близько 80 956, щонайменше близько 90 95, від
БО близько 60 95 до близько 95 95, від близько 70 95 до близько 95 95 або від близько 75 95 до близько 95 95, мії) Д5-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 85
Фо, щонайменше близько 90 95, від близько 50 95 до близько 90 95 або від близько 85 95 до близько 95 95, мії) Д4-десатураза перетворює ДПК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах із ефективністю щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90
Фо, щонайменше близько 93 95, від близько 50 95 до близько 95 95, від близько 80 95 до близько 95 95 або від приблизне 85 950 до близько 95 905,
їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 25 95, близько 20 до, близько 25 90, близько 30 95, від близько 10 95 до близько 50 95, від близько 10 95 до близько 30 95, від близько 10 95 до близько 25 95 або від близько 20 95 до близько 30 95, х) ефективність перетворення ЛК на ДГК або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 25 9565, щонайменше близько 30 до, близько 25 95, близько 30 95, близько 35 905, від близько 15 95 до близько 50 95, від близько 20 до до близько 40 95 або від близько 20 95 до близько 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДГК або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини або у рекомбінантних клітинах становить щонайменше близько 17 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 24 956, щонайменше близько 30 95, близько 30 95, близько 35 95, близько 40 95, від близько 17 95 до близько 55 95, від близько 22 95 до близько 35 95 або від близько 24 95 до близько 35 95, хії) одна або більше клітин частини рослини або рекомбінантних клітин містять щонайменше близько на 25 95, щонайменше близько на 30 95, від близько 25 95 до близько 40 95 або від близько 27,5 95 до близько 37,5 95, більше жирних кислот м/3, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів, хії) Дб-десатураза переважно зменшує ступінь насиченості а-ліноленової кислоти (АЛК) відносно лінолевої кислоти (ЛК), хім) Де елонгаза додатково володіє активністю дД9-елонгази! хм) Д12-десатураза додатково володіє активністю Л15-десатурази" хмі) Де-десатураза додатково володіє активністю Д8-десатурази п хмії) Ав-десатураза додатково володіє активністю лб-десатурази або не володіє активністю
ДІ -десатурази, хмії) АТ15-десатураза додатково володіє активністю 03-десатурази по відношенню до ГЛК, хіх) Ф3-десатураза додатково володіє активністю Л15-десатурази по відношенню до ЛК, хх) Ф3-десатураза зменшує ступінь насиченості ЛК та/або ГЛК,
Зо ххі) Ф3-десатураза переважно зменшує ступінь насиченості ГЛК відносно ЛК, ххії) одна або більше або всі десатурази, переважно Аб-десатураза та/або А5-десатураза, володіють більш високою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до відповідного субстрату ацил-фосфатидилхоліну (ацил-ФХ), ххії) Де-десатураза володіє вищою Дб-десатуразною активністю по відношенню до АЛК, ніж
ЛК як жирно кислотного субстратуп ххім) Аб-десатураза володіє більш високою Дб-десатуразною активністю по відношенню
АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххм) Аб-десатураза володіє щонайменше у 2 рази вищою Дб-десатуразною активністю, щонайменше в З рази більш високою активністю, щонайменше в 4 рази більш високою активністю або щонайменше в 5 разів більш високою активністю по відношенню до АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК; ххмі) Аб-десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) Дб-десатураза володіє щонайменше у 5 разів вищою Дб-десатуразною активністю або щонайменше у 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) десатураза являє собою фронт-енд десатуразу, ххіх) Дб-десатураза не володіє Д5-десатуразною активністю, що піддавалася б виявленню, по відношенню до ЕТК.
Ще в одному варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантна клітина, така як мікробні клітини, володіє одним або більше або всіма із наступних ознак: ї) Д12-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 4, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО ІЮО МО: 4, ії) ю3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 6, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну бо ЗЕОІЮ МО: 6,
ії) Дб-десатураза містить послідовність амінокислоту, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 9, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕОІЮО МО: 9, їм) Де-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 16, її біологічно активний фрагмент, такий як ЗЕО ІЮ МО: 17, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну 5ЗЕО ІЮ МО: 16 та/або 5ЕО ІЮО МО: 17, м) д5-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕБЕО ІЮ МО: 20, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО І МО: 20, мі) дД5-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕБО ІЮ МО: 25, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО І МО: 25, мії) Д4-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 28, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 95 ідентичну
ЗЕО І МО: 28.
У варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, додатково містить(ять) екзогенний полінуклеотид, що кодує діацилгліцеролацилтрансферазу (ДГАТ), моноацилгліцеролацилтрансферазу (МГАТ), гліцерол-
З-фосфатацилтрансферазу (ГФАТ), 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФКАТ), переважно ЛФКАТ, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, такий як ДГК-КоА або ДПК-КоА, ацил-КоА : лізофосфатидилхолінацилтрансферазу (ЛФХАТ), фосфоліпазу А» (РЛК2), фосфоліпазу С (РІС), фосфоліпазу ОО (РІФ), СДП- холіндіаацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (ХФТ), фосфатидилхоліндіацилгліцеролацилтрансферазу (ФДАТ), фосфатидилхолін : діацилгліцеролхолінфосфотрансферазу (ФДХТ), ацил-КоА синтетазу (АКС) або комбінацію двох або більше із вказаних ферментів.
У іншому варіанті реалізації частина рослини, така як насіння, або рекомбінантні клітини, такі як мікробні клітини, додатково містить(ять) введену мутацію або екзогенний полінуклеотид, який у клітині частини рослини негативно регулює продукування та/або активність ендогенного ферменту, вибраного з числа ЕАЕТ, ДГАТ, МГАТ, ГФАТ, ЛФКАТ, ЛФХАТ, РЛКО, РІ С, РІБ, ХФТ,
ФДАТ, тіоестерази, наприклад, ЕАТВ або 012-десатурази, або комбінації двох або більш із вказаних ферментів.
У подальшому варіанті реалізації щонайменше один або всі промотори є специфічними для насіння промоторами. У варіанті реалізації щонайменше один або всі промотори одержані із гена біосинтезу або акумуляції олії, такого як ген, що кодує олеозин, або із генів зберігання білка у насінні, таких як ген, що кодує конлінін.
В іншому варіанті реалізації промотор(и), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують Л4-десатуразу 2 Д5-елонгазу ініціює експресію полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, або рекомбінантних клітинах, таких як мікробні клітини, перед або досягає піку експресії перед промотором(ами), що спрямовує(ють) експресію екзогенних полінуклеотидів, які кодують Л12-десатуразу і 0о3-десатуразу.
У подальшому варіанті реалізації екзогенні полінуклеотиди ковалентно сполучені в молекулу ДНК, переважно молекулу Т-ДНК, інтегровану до геному клітин частини рослини або рекомбінантних клітин, таких як мікробні клітини, причому кількість таких молекул ДНК, інтегрованих до геному клітин частини рослини або рекомбінантних клітин, переважно становить не більш однієї, двох або трьох, або становить дві або три.
Ще в одному варіанті реалізації частина рослини містить щонайменше два різних екзогенних полінуклеотиди, кожен з яких кодує Лб-десатуразу з такою ж або іншою послідовністю амінокислот.
У подальшому варіанті реалізації загальний вміст олії у частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше близько 40 95, або щонайменше близько 50
Фо, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 96, щонайменше близько 70 95, від близько 50 95 до близько 80 95 або від близько 80 95 до близько 100 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, у якій відсутні екзогенні полінуклеотиди. У подальшому варіанті реалізації маса насіння, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше близько 40 95, меншій мірі близько 50 95, меншій мірі близько 60 95, меншій мірі близько 70 95, від близько 50 95 до близько 80 95 або від близько 80 95 до 100 95 від маси відповідного насіння, що не містить екзогенних полінуклеотидів.
У іншому варіанті реалізації ліпід знаходиться у формі олії, переважно олії з насіння олійної культури, причому щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 95, щонайменше близько 98 95 або від близько 95 95 до близько 98 95 мас. ліпіду складають триацилгліцероли.
У подальшому варіанті реалізації спосіб додатково включає обробку ліпіду з метою підвищення рівня ДГК та/або ДПК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. Наприклад, обробка може включати переестерифікацію. Наприклад, ліпід, такий як олія рапсу, може бути підданий обробці з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри, які в подальшому можуть бути фракціоновані із збагаченням ліпіду або олії ДГК та/або ДПК. У варіантах реалізації склад жирних кислот ліпіду після такої обробки включає щонайменше 40 95, щонайменше 50 95, щонайменше 60 95, щонайменше 70 95, щонайменше 80 95 або щонайменше 90 95 ДГК та/або ДПК. Співвідношення ДГК:ДПК у ліпіді після обробки переважно перевищує 2:1 або, в якості альтернативи, буде становити менш ніж 0.5:1. Як альтернатива, рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду після обробки становить менш ніж 2,0 9о або менш ніж 0,5 95, переважно вона відсутня у ліпіді.
Крім того, розкритий ліпід, або олія, що містить ліпід, одержані із застосуванням способу за винаходом.
У іншому аспекті даного винаходу розкривається спосіб одержання метилових або етилових ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає введення триацилгліцеролів у реакцію з метанолом або етанолом, у екстрагованому рослинному ліпіді або в ході процесу екстракції, відповідно, причому екстрагований рослинний ліпід містить естерифіковані жирні кислоти у формі ТАГ, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а- ліноленову кислоту (АЛК), і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 95, з одержанням в такий спосіб метилових або етилових ефірів поліненасиченних жирних кислот.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання метилових або етилових
Зо ефірів поліненасичених жирних кислот, який включає введення триацилгліцеролів у реакцію з метанолом або етанолом, в екстрагованому рослинному ліпіді або в ході процесу екстракції, відповідно, причому екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти, естерифіковані у формі ТАГ, ї при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а- ліноленову кислоту (АЛК) і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), притому, що рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 7 до 35 95, переважно від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 95 до 35 9б, з одержанням в такий спосіб метилових або етилових ефірів поліненасичених жирних кислот.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується спосіб одержання метилових або етилових ефірів докозапентаєнової кислоти (ДПК) та/або кислоти докозагексаєнової (ДГК), який включає введення триацилгліцеролів (ТАГ) у реакцію з метанолом або етанолом, в екстрагованому рослинному ліпіді або в ході процесу екстракції, відповідно, причому екстрагований рослинний ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і, при цьому, жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), причому щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі ТАГ, естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ, з одержанням в такий спосіб метилових або етилових ефірів поліненасичених жирних кислот.
У переважному варіанті реалізації ліпід, який використовується у способі у відповідності до описаних вище трьох аспектів, володіє однією або більш ознак, визначених у даному описі в контексті екстрагованого ліпіду або олії за винаходом.
У іншому аспекті даного винаходу розкривається олійна рослина або її частина, така як насіння, що містить: а) ліпід у своєму насінні, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: її А12-десатураза, ю3-десатураза та/"або А15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза,
Дда-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або ії) Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, да -десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними бо для насіння промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 0б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК) і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння становить від 20,1 95 до 30 95, або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 905.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується рослина олійної культури або її частина, така як насіння, що містить: а) ліпід у насінні, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; її Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза,
Дда-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або ії) Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, да - десатураза, Д9У-елонгаза та Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, б жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК) і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), притому, що рівень
ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1
Фо до 35 95, переважно від 30 95 до 35 905.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується рослина олійної культури або її частина, така як насіння, що містить: а) ліпід у насінні, причому ліпід містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: її Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза,
Дда-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або ї) А12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, АВ-десатураза, А5-десатураза, да - десатураза, Л9-елонгаза та Д5-елонгаза, притому, що кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, що здатні керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти включають лінолеву кислоту (ЛК) і у- ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти включають (а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК) і необов'язково ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння становить від 20,1 95 до 30 95 або від 20,1 9о до 35 905, і, при цьому, рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить від близько 2 95 до 16 95, притому, що рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот ліпіду, якщо вона присутня, становить менш ніж 1 905.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується рослина олійної культури або її частина, така як насіння, що містить ліпід у насінні, або мікробна клітина, що містять: а) ліпід, який містить жирні кислоти у естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; її Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ї) А12-десатураза, о3-десатураза та/або А15-десатураза, А8-десатураза, А5-десатураза, до-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) ю3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5- елонгаза, або їм) Ф3-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, Де9-елонгаза і Д5- елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше специфічними для насіння промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у насінні рослини, що розвивається, або одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у мікробній клітині, і, при цьому, жирні кислоти включають олеїнову бо кислоту, пальмітинову кислоту, фб жирні кислоти, які включають лінолеву кислоту (ЛК) і необов'язково у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які включають а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), і докозапентаєнову кислоту (ДПК), і необов'язково докозагексаєнову кислоту (ДГК), ейкозапентаєнову кислоту (ЕПК) та/або ейкозатетраєнову кислоту (ЕТК), притому, що рівень ДПК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду насіння або мікробної клітини становить від 7 95 до 35 95. У переважному варіанті реалізації даного аспекту
ДГК присутній на рівні менш ніж 0,5 956 від загального вмісту жирних кислот ліпіду насіння і екстрагованого ліпіду і, більш переважно, відсутній у загальному вмісті жирних кислот ліпідів.
У іншому аспекті даного винаходу пропонується клітина, переважно клітина в або із рослини, такої як рослина олійної культури, або її частини, такої як насіння, або рослина олійної культури або її частина, або мікробна клітина, що містить: а) жирні кислоти у естерифікованій формі, причому жирні кислоти включають докозапентаєнову кислоту (ДПК) та/або докозагексаєнову кислоту (ДГК), і, при цьому, щонайменше 35 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ),, естерифіковано у положенні 51-2 ТАГ, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів; і) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Ф3-десатураза, Дб-десатураза, Д5- десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, її) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, ії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Аб-десатураза, д5-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, їм) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і дД5-елонгаза (і необов'язково Д4-десатураза, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), ю03-десатураза, Ав-десатураза, Д5- десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мі) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), Д15-десатураза, А8в-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), А12-десатураза, Ав-десатураза, д5-десатураза, Д9-елонгаза, Д5-елонгаза і необов'язково Л4-десатураза, мії) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансфераза (ЛФААТ), АЛ12-десатураза, о3-десатураза та/або Д15-десатураза, Л8-десатураза, Д5-десатураза, ЛУ-елонгаза, Д5-елонгаза («|і необов'язково Д4-десатураза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині. Переважно, ЛФААТ може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, такий як ДГК-КоА та/або
ДПК-КоА, і рівень ДПК та/або ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 95 до 35 95 або від близько 7 95 до 35 95 або від близько 20,1 95 до 35 95.
У варіантах реалізації щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 45 95, щонайменше близько 48 95, від 35 95 до близько 60 95, або від 35 95 до близько 50 95 ДПК та/або ДГК, естерифікованої у формі триацилгліцеролу (ТАГ), естерифіковано у положенні 5п-2 ТАГ.
У варіантах реалізації кожного із згаданих вище п'яти аспектів, АТ5-десатураза є грибковою
Д15-десатуразою, і 03-десатураза є грибковою 03-десатуразою.
У переважному варіанті реалізації рослина олійної культури, мікробна клітина або клітина за винаходом володіє, якщо це доречно, однією або більш ознак, визначених у даному описі, наприклад, як визначено вище для екстрагованого рослинного ліпіду, екстрагованого мікробного ліпіду або способу їх одержання.
Приклади рослин олійної культури включають, без обмеження, вид Вгаззіса, Соззурійт пігвшійт, Гіпит ивійаїйввітит, вид Неїїапійи5, Сапнатив іпсіопйие, Сіусіпе тах, 7єеа таув,
Агарідорвів ІПаїйапа, богойпит бБісоїог, Зогопит мицЇдагє, Амепа взаїїма, вид Ттгйоїйшт, ЕІаевів диіпеепіб, Місойапа Бепіпатіапа, Ногдешт уцїдаге, ІГиріпиє апдивійоїйше, Огула займа, Огуга діабетіта, Сатеїїпа займа або Статре абруззіпіса. У варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною виду Вгаззіса, рослиною б. займа або рослиною б. тах (соя). У варіанті реалізації олійна рослина є рослиною рапсу, В. |ппсеа, Сіусіпе тах, Сатеїїпа займа або
Агарідорзіє Шаїйапа. В альтернативному варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною, окрім А. ІПаіапа та/або окрім С. заїїма. У варіанті реалізації рослина олійної культури є рослиною, окрім Сї1. тах (сої). У варіанті реалізації рослина олійної культури знаходиться у полі або була вирощена у полі або була вирощена в теплиці у стандартних умовах, наприклад, як описано у Прикладі 1.
У варіанті реалізації винаходу одна або більш десатураз здатні використовувати субстрат ацил-КоА. У переважному варіанті реалізації винаходу одна або більш з Аб-десатурази, Д5- десатурази, Л4-десатурази і Д8-десатурази, якщо вони присутні, здатні використовувати субстрат ацил-КоА, переважно кожна з ї) ДАб-десатурази, Д5-десатурази і Д4-десатурази або ії) д5-десатурази, Д4-десатурази і Ав-десатурази здатна використовувати субстрат ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу Д12-десатураза та/або о03-десатураза здатні використовувати субстрат ацил-КоА. Субстрат ацил-КоА переважно являє собою АЛК-КоА для Аб-десатурази,
ЕТК-КоА для Д5-десатурази, ДПК-КоА для лЛ4-десатурази і ЕТрК-КоА для Лл8-десатурази, олеїл-
КоА для Д12-десатурази, або один або більше з ЛК-КоА, ГЛК-КоОА або АРК-КОА для оФз3- десатурази.
У варіанті реалізації винаходу зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння рослини містить ДГК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 80 мг на грам насіння.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається рослина Вгаз5іса парив, В. |Їнпсєа або
Сатеїйпа займа, яка здатна давати насіння, що містить ДГК та/або ДПК, причому зібране в процесі збору урожаю, зріле насіння рослини містить ДГК та/або ДПК в кількості щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 80 мг на грам насіння.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається клітина рослини за винаходом, що містить екзогенні полінуклеотиди, розкриті в даному описі.
Також розкрита частина рослини, переважно насіння, яка володіє однією або більше з наступних ознак: ї) одержана з рослини за винаходом, ії) містить ліпід, розкритий в цьому документі,
Зо ії) може використовуватися в способі за винаходом,
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається зріле, зібране в процесі збору урожаю насіння Вгаззіса парих, В. їнпсеа або Сатеїїмнпа взаїїма, що містить ДГК, із вмістом вологи від близько 4 95 до близько 15 95 мас., переважно від близько б 95 до близько 8 95 мас. або від близько 4 95 до близько 8 95 мас., більш переважно від близько 4 95 до близько б 95 мас., причому вміст ДГК в насінні становить щонайменше близько 28 мг на грам насіння, переважно щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, більш переважно щонайменше близько 44 мг на грам насіння або щонайменше близько 48 мг на грам насіння, близько 80 мг на грам насіння або від близько 30 мг до близько 800 мг на грам насіння.
У варіанті реалізації винаходу розкрита клітина за винаходом, трансгенний організм за винаходом, рослина олійної культури за винаходом, рослина Вгаззіса пари5, В. |Їнпсеа або
Сатвеїйнпа заїма за винаходом, частина рослини за винаходом або насіння за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду, що володіє одним або більш або всіма ознаками, визначеними в цьому документі.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання рослини або клітини за винаходом, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого ліпіду за винаходом, причому спосіб включає: а) аналіз рівня ДГК та/"або ДПК у ліпіді, продукованому однією або більше частинами рослини, такими як насіння, або рекомбінантними клітинами, такими як мікробні клітини, від декількох рослин або рекомбінантних клітин, таких як мікробні клітини, причому кожна рослина або рекомбінантна клітина, така як мікробна клітина, містить один або більше екзогенних полінуклеотидів, що кодують один із наступних наборів ферментів; ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ДЛб-елонгаза і д5ь- елонгаза, ії) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, АДб-елонгаза і дь- елонгаза, їм) А12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, 60 м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза,
м) А15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛО-елонгаза і дь- елонгаза, мі) А12-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Л4-десатураза, ЛУ-елонгаза і дь- елонгаза, мії) А12-десатураза, ю3-десатураза або А15-десатураза, Ав-десатураза, А5-десатураза, Ла- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, їх) Ф3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, х) А15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, хі) А12-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, хії) А12-десатураза, о3-десатураза або А15-десатураза, Аб-десатураза, А5-десатураза, Дб- елонгаза і Д5-елонгаза, або хім) А12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, До- елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з одним або більше промоторами, здатними керувати експресією вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини або рекомбінантній клітині, і б) ідентифікацію із множини рослин або рекомбінантних клітин рослини або рекомбінантної клітини, які можуть застосовуватися для одержання екстрагованого рослинного ліпіду або клітинного ліпіду за винаходу в одній або більше їх частин, і в) необов'язково, одержання потомства рослин або рекомбінантних клітин від ідентифікованої рослини або рекомбінантної клітини, або їх насіння.
У варіанті реалізації рослина або рекомбінантна клітина додатково містить екзогенний полінуклеотид, що кодує ЛФААТ, як визначено у даному описі.
Переважно, рослина-нащадок належить щонайменше до другого або третього покоління відносно ідентифікованої рослини, і переважно є гомозиготною по одному або більше полінуклеотидах. Більш переважно, один або більш полінуклеотидів присутні у рослині-нащадку тільки в одному інсерційному локусі. Таким чином, у винаході пропонується спосіб, який може застосовуватися як спосіб скринінгу для ідентифікації рослини або її насіння з числа багатьох трансформованих рослин або насінин кандидатів, причому ідентифікована рослина або її
Зо рослина-нащадок продукує ліпід за винаходом, переважно у насінні. Таку рослина або рослину- нащадок або її насіння відбирають, якщо вона продукує ліпід за винаходом, зокрема із вказаним рівнем ДГК та/або рівнем ДПК, або не відбирають, якщо вона не продукує ліпіду за винаходом.
У варіанті реалізації екзогенні полінуклеотиди, що присутні у клітині, такій як мікробна клітина, або рослині або її частині, як визначено у даному описі, стають стабільно інтегрованими до геному клітини, рослини або частини рослини, такої як насіння. Переважно, екзогенний(і) полінуклеотид(и) стають стабільно інтегрованими до геному клітини, рослини або частини рослини, такої як насіння, в одному локусі в геномі, і переважно є гомозиготними по інсерції. Більш переважно, рослина, частина рослини або насіння додатково характеризується тим, що в ньому відсутні екзогенні полінуклеотиди, окрім однієї або більше молекул Т-ДНК.
Таким чином, жодних екзогенних векторних послідовностей не інтегровано до геному, окрім послідовностей Т-ДНК.
У варіанті реалізації, перед стадією а) спосіб включає введення одного або більше екзогенних полінуклеотидів в одну або більше клітин рослини.
Додатково пропонується рослина, одержана із застосуванням способу за винаходом, і насіння такої рослини.
У варіанті реалізації рослина за винаходом володіє як чоловічою, так і жіночою фертильністю, переважно з рівнями як чоловічої, так і жіночої фертильності, що складають щонайменше 70 95 відносно відповідної рослини дикого типу, або переважно є такими ж. У варіанті реалізації пилок, що продукується рослиною за винаходом або рослиною, одержаною із насіння за винаходом, є на 90-100 95 життєздатним за даними фарбування фарбником для визначення життєздатності. Наприклад, життєздатність пилку можна оцінити, як описано у
Прикладі 1.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання насіння, який включає: а) вирощування рослини за винаходом або рослини, яка утворює частину, розкриту в цьому документі, переважно в полі як частини популяції розміром щонайменше 1000 або 2000 або 3000 таких рослин або на площі щонайменше 1 гектар або 2 гектари або З гектари, насаджених із стандартною щільністю насадження, б) збір урожаю насіння з рослини або рослин, і в) необов'язково, екстракцію ліпіду з насіння, переважно з одержанням олії із загальним виходом ДГК та/або вихолом ДПК щонайменше 60 кг або 70 кг або 80 кг ДГК та/або ДПК на гектар.
У варіанті реалізації винаходу рослина, клітина рослини, частина рослини або насіння за винаходом володіє однією або більше з наступних ознак: ї) олія є такою, як розкрито в цьому документі, ії) частина рослини або насіння можуть застосовуватися в способі за винаходом,
Наприклад, насіння може застосовуватися для одержання рослини за винаходом. Рослина може бути вирощена в полі або в теплиці із стандартними умовами, наприклад, як описано у
Прикладі 1.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається ліпід або олія, продуковані або одержані із застосуванням способу за винаходом, із клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду ВГгавзвзіса,
Вгаззіса парих, В. |нпсєа, С. тах або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно, ліпід або олію очищують для видалення забруднюючих речовин, таких як нуклеїнова кислота (ДНК та/або РНК), білок та/або вуглевод, або пігментів, таких як хлорофіл. Крім того, ліпід або олія можуть бути очищені з метою збільшення вмісту ТАГ, наприклад, шляхом видалення вільних жирних кислот (ВЖК) або фосфоліпіду.
У варіанті реалізації винаходу ліпід або олія одержані екстракцією олії з олійної культури.
Приклади олії з олійних культур включають, без обмеження, олію рапсу (Вгаззіса парих, підвид
Вгаззіса гара), олію гірчиці (Вгаззіса |нпсеа), іншу олію виду Вгаззіса, соняшникову олію (Неїїапіпив аппив), льняну олію (І іпит изнагіббвітит), соєву олію (Сіусіпе тах), сафлорову олію (Сапнатизвз ііпсіогіиз), кукурудзяну олію (7еа тауз), олію тютюну (Місоїапа іабасит), арахісове масло (Агаспі5 пуродаєа), пальмову олію, бавовняну олію (Со55урішт Віг5шит), кокосове масло (Сосов писіїега), олію авокадо (Регхеа атегісапа), оливкову олію (ОіІеа еигораєа), олію кеш'ю (Апасагадішт оссідепіаіє), олію макадамії (Масадатіа іпіегагіоїйа), мигдальну олію (Ргипив5 атудаа|шв) або олію насіння Агарідорвіз (Агабідорзвів ІНаїїапа).
У варіанті реалізації клітина (рекомбінантна клітина) за винаходом або використовувана у відповідності до винаходу, є мікробною клітиною, такою як клітина, придатна для ферментації, переважно масляниста мікробна клітина, здатна акумулювати триацилгліцероли до рівня щонайменше 25 95 в перерахунку на масу. Переважними процесами ферментації є анаеробні процеси ферментації, як добре відомі з рівня техніка. Придатні ферментуючі клітини, звичайно мікроорганізми, здатні ферментувати, тобто, перетворювати цукри, такі як глюкоза або мальтоза, прямо або непрямо, на бажані жирні кислоти. Приклади ферментуючих мікроорганізмів включають грибкові організми, такі як дріжджі. В даному описі «дріжджі» включають види Засспаготусе5, Засспаготусев сегемізіае, засспаготусев сагірегдепві5, види
Сапаїйда, види Кіимеготусев5, види Ріспіа, види Напзепиціа, види Тгісподепта, І іротусез «агкеу і переважно Маїгтом/а Ііроїуїіса.
У подальшому аспекті цього винаходу розкривається жирна кислота, продукована або одержана із застосуванням способу за винаходом, з клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса,
Вгаззіса парих, В. |нпсєа, С. тах або Сатеїїпа займа за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, або рослини, клітини рослини, частини рослини або насіння за винаходом. Переважно жирна кислота являє собою ДГК. Жирна кислота може знаходитися в суміші жирних кислот, склад жирних кислот у якій є таким, як розкрито в цьому документі, або суміш може бути збагачена таким чином, щоб жирна кислота становила щонайменше 40 95 або щонайменше 90 95 від вмісту жирних кислот в суміші. У варіанті реалізації винаходу жирна кислота є неестерифікованою. Як альтернатива, жирна кислота є естерифікованою із застосуванням, наприклад, метильної, етильної, пропільної або бутильної групи.
Додатково розкривається шрот, одержаний із насіння за винаходом або одержаний із рослини за винаходом. Переважний шрот включає, не обмежуючись цим, шрот Вгаз5іса пари»,
В. іїмпсеа, Сатеїїпа займа або Сіусіпе тах. У варіанті реалізації шрот містить екзогенний) полінуклеотид(и) та/або генетичні конструкції, як розкрито у даному документі. У переважному варіанті реалізації в шроті залишається частина ліпіду або олії, продукованого у насінні, з якого одержаний шрот, але на низькому рівні (наприклад, менш ніж 2 95 мас.) після екстракції більшої частини ліпіду або олії. Шрот може застосовуватися як корм для тварин або як інгредієнт у виробництві харчових продуктів.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається композиція, що містить один або більше з 60 ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса, Вгаззіса парив, В. нпсєа, Спусіпе тах або Сатеїїпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом або макухи за винаходом. У варіантах реалізації винаходу композиція містить носій, придатний для фармацевтичного, харчового або сільськогосподарського застосування, сполуки для обробки насіння, добриво, інший харчовий продукт або поживний інгредієнт, або додатковий білок або вітаміни.
Також розкриті корми, косметика або хімічні речовини, що містять одне або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, клітини за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса, Вгабхбзіса пари5, В. |їппсеа, Сіусіпе тах або
Сатвеіїйпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, насіння за винаходом, шрот за винаходом або композиції за винаходом.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання корму, який включає змішування одного або більше ліпідів, або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, клітини за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгаззіса, Вгазвзіса парив, В. |їнпсеа, Сіусіпе тах або Сатеїмпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, шроту за винаходом або композиції за винаходом, щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом. Спосіб може включати стадії змішування, термічної обробки, випічки, екструдування, емульгації або іншої обробки фуражу або пакування фуражу або аналізу вмісту ліпіду або олії у фуражі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб лікування або попередження стану, при якому ПНЖК здійснюють сприятливу дію, причому вказаний спосіб включає введення суб'єкту одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду
Вгаззіса, Вгаззіса пари, В. їнпсеа, Сіусіпе тах або Сатеїйпа займа за винаходом, частини
Зо рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або корму за винаходом. У переважному варіанті реалізації ПНЖК вводять у формі фармацевтичної композиції, що містить етиловий ефір ПНЖК. Суб'єкт може бути людиною або твариною, окрім людини.
Приклади станів, при яких ПНЖК здійснюють сприятливу дію, включають, без обмеження, підвищені рівні тригліцеролів в сироватці, підвищені рівні холестерину у сироватці, наприклад, підвищені рівні ЛЛНП холестерину, серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодістрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.
Також розкрите застосування одного або більше з ліпіду або олії за винаходом, жирної кислоти за винаходом, генетичної конструкції за винаходом, виділеного та/або екзогенного полінуклеотиду за винаходом, вектора або генетичної конструкції за винаходом, клітини за винаходом, трансгенного організму за винаходом, рослини олійної культури за винаходом, рослини виду Вгазвзіса, Вгазвзіса парив, В. |їнпсєа, Сіусіпе тах або Сатеїнпа заїїма за винаходом, частини рослини за винаходом, насіння за винаходом, рослини, рослинної клітини, частини рослини або насіння за винаходом, шроту за винаходом, композиції за винаходом або харчових продуктів (корму) за винаходом для виробництва лікарського засобу для лікування або попередження стану, при якому ПНЖК, переважно ДГК та/або ДПК, здійснюють сприятливу дію.
Одержання лікарського засобу може включати змішування олії за винаходом з фармацевтично прийнятним носієм, з метою лікування стану, розкритого в цьому документі.
Спосіб може включати, по-перше, очищення та/або переестерифікацію олії та/або фракціонування олії, з метою підвищення рівня ДГК та/або ДПК. У конкретному варіанті реалізації винаходу спосіб включає обробку ліпіду або олії, наприклад, олії рапсу, з метою перетворення жирних кислот в олії на алкілові ефіри, наприклад, метилові або етилові ефіри. бо Подальша обробка, наприклад, фракціонування або дистиляція, може застосовуватися для збагачення ліпіду або олії ДГК та/"або ДПК. У переважному варіанті реалізації винаходу лікарський засіб містить етилові ефіри ДГК та/або ДПК. У ще більш переважному варіанті реалізації винаходу рівень етилових ефірів ДГК та/або ДПК в лікарському засобі становить від 30 95 до 50 95. Лікарський засіб може додатково містити етилові ефіри ЕПК, наприклад, від 30 95
Б до 50 95 або щонайменше 80 95 або щонайменше 85 95 або щонайменше 90 95 або щонайменше 95 95 від загального вмісту жирних кислот в лікарському засобі. Такі лікарські засоби придатні для введення суб'єктам-людям або тваринам при лікуванні медичних станів, як розкрито в цьому документі.
В іншому аспекті цього винаходу розкривається спосіб торгівлі насінням, який включає одержання насіння за винаходом і торгівлі одержаним насінням з одержанням грошової вигоди.
У варіанті реалізації винаходу одержання насіння включає культивацію рослин за винаходом та/або збір урожаю насіння з рослин.
В іншому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає вміщення насіння до ємності та/або зберігання насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу одержання насіння додатково включає перевезення насіння в інше місце.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу спосіб додатково включає перевезення насіння в інше місце після продажу насіння.
У подальшому варіанті реалізації винаходу торгівля здійснюється з використанням електронних засобів, наприклад, комп'ютера.
Ще в одному аспекті цього винаходу розкривається спосіб одержання бункерів з насінням, який включає: а) валкування, рядкове компостування та/або жнива наземних частин рослин, що містять насіння за винаходом, б) молотьбу та/або віяння частин рослин, з відокремленням насіння від залишку частин рослини, і в) просівання та/або сортування насіння, відокремленого на стадії б), і завантаження просіяного та/або сортованого насіння в бункери, з одержанням в такий спосіб бункерів із насінням.
Зо У варіанті реалізації винаходу, якщо це доречно, ліпід або олія, переважно олія з насіння, за винаходом або придатні у відповідності до винаходу, містять близько такі рівні жиру, як розкрито в Таблиці в розділі Прикладів, наприклад, насіння 14 СТ136-27-18-2 або СТ136-27-18- 19 з Табл. 10 або олія насіння із Табл. 12, 20, 22, 23 або 24.
Будь-який варіант реалізації в цьому документі слід інтерпретувати як застосовний, з відповідними поправками, до будь-якого іншого варіанту, якщо конкретно не вказано інше.
Контекст цього винаходу не повинен обмежуватись конкретними варіантами, розкритими в цьому документі, які наведені тільки з метою ілюстрації. Функціонально еквівалентні продукти, композиції і способи очевидно знаходяться в межах обсягу винаходу, розкритого в цьому документі.
В цьому документі, якщо конкретно не вказано інше або з контексту очевидно не слідує інше, посилання на єдину стадію, композицію речовини, групу стадій або групу композицій речовини повинно бути інтерпретоване як включаюче однину і множину (тобто, одну або більше) таких стадій, композицій речовини, груп стадій або груп композицій речовини.
Винахід додатково розкритий за допомогою наступних необмежуючих Прикладів, з посиланням на додані графічні матеріали.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Фігура 1. Аеробні шляхи біосинтезу ДГК.
Фігура 2. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої меж руР3416-5А7. КВ позначає праву межу; ІВ, ліва межа; ТЕК, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання; РКО, промотор; кодуючі ділянки показані над стрілками, промотори і термінатори -- під стрілками.
Місри-АбО, Дб-десатураза! Місготопа5 ризіПа; Ругсо-ДАбЕ, Дб-елонгаза Ругатітопав согаайа;
Рамза-А5БО, Д5-десатураза Раміома заїїпа; Рісра-ю30, Ф3-десатураза Ріспіа разіогіз; Рамза-А40О, да десатураза Р. заїїпа; І асКкІ-А120, А12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі; Ругсо-А5ЗЕ, Д5-елонгаза
Ругатітопаз согадаї:":ь0 МОЗ позначає ділянку термінатора транскрипції/поліаденілювання нопалінсинтази Адгобасіегічт їштеїасіеп5; ЕР1, укорочений промотор напіну Вгаззіса парив;
ЕАЕЇ, промотор Агарідорзів Іаїапа ЕАЕ1; Ї есііп, ділянка термінатора транскрипції/поліаденілювання лектину Сіусіпе тах; Спії і Спі2 позначає промотор або термінатор конлініну 1 або конлініну 2 Гіпит изнагзбзітит. ДПМ позначає ділянку прикріплення до матриксу КБ7 з Місойапа їарасит.
Фігура 3. Карта ділянки вставки Т-ДНК від лівої до правої межі рОР3404. Позначення такі ж, як на Фіг. 2.
Фігура 4. Вміст олії (мас./мас.) проти вмісту ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот у ліпіді із трансгенного насіння Агабрідорзів (Паїапа.
Фігура 5. Позиційний аналіз розподілу ЯМР на А) жирі тунця і, В) олії трансгенних зерен ДГК
Агарідорзбіх. Піки, позначені «ДГК-альфа» представляють кількість ДГК, присутньої в положеннях 5п-1 і 5п-3 ТАГ (без позиційної переваги це дорівнювало б 66 95 від загальної ДГК), тоді як піки, позначені «ДГК-бета» представляють кількість ДГК, присутньої в положенні 51-2
ТАГ (без переваги це дорівнювало би 33 95 ДГК).
Фігура 6. Аналіз методом РХ-МС основних різновидів триацилгліцеролів, що містять ДГК, в трансгенному насінні, що розвивається (сірі), і зрілих (чорні), А. ІПпайапа. Число, наступне за ДГК, позначає загальну кількість атомів вуглецю і загальну кількість подвійних зв'язків у двох інших жирних кислотах. Таким чином, ДГК/34:1 може також бути позначений як ТАГ 56:7, тощо.
Фігура 7. (А) Основна структура фітостерину з кільцем і нумерацією бічного ланцюга. (В)
Хімічні структури деяких фітостеринів.
Фігура 8. Філогенетичне дерево відомих ЛФКАТ (І РААТ).
Фігура 9. Різноманітні ферменти обміну ацилу, які переносять жирні кислоти між ФХ, пулами
КоА і пулами ТАГ. Адаптовано із 5іподп еї аї. (2005).
Фігура 10. Рівні ДГК у загальному вмісті жирних кислот олії із насіння, одержаної з індивідуального насіння Т2 від насіння В. пари5, трансформованого Т-ДНК із конструкції СА7- тоав. Кожна точка ілюструє рівень ДГК в індивідуальному насінні, причому кожен стовпчик точок представляє насіння 12 від індивідуальної рослини Т1.
КЛЮЧ ДО ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
ЗЕО ІО МО: 1 -- послідовність нуклеотидів руР3416-САТ7.
ЗЕО ІО МО: 2 -- послідовність нуклеотидів роА7-тос В.
ЗЕБЕО І0О МО: 3 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А12- десатурази І аспапсеа Кішумегі в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 4-- Д12-десатураза І аспапсеа Кіпумегі.
ЗЕО ІО МО: 5-- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Ф3-десатурази
Зо Ріспіа разіогі5 в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 6 -- Ф3-десатураза Ріспіа равіогів.
ЗЕО І МО: 7 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-десатуразу Місготопах ризіНа.
ЗЕО ІЮ МО: 8 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-десатурази
Місготопах ризхіМйа в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 9-- Аб-десатураза Місготопах ризійа.
ЗЕБЕО ІЮ МО: 10 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Дб-десатуразу О5ігеососсив5
Іосітаїгіпив.
ЗЕБЕО 10 МО: 11 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Дб- десатурази О5ігеососсиз Іссітагіпи5 в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 12 -- Дб-десатураза О5ігеососсиз Іссітагіпив.
ЗЕО ІО МО: 13 -- Аб-десатураза О5ігеососсиз їацгі.
ЗЕО ІО МО: 14 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Аб-елонгазу Ругатітопах согаага.
ЗЕО ІО МО: 15 - кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Аб-елонгази
Ругатітопазх согааїа в рослинах (вкорочена на 3' кінці і кодуюча функціональну елонгазу).
ЗЕО ІЮ МО: 16 -- Аб-елонгаза Ругатітопах согдаїйа.
ЗЕО І МО: 17 - вкорочена Аб-елонгаза Ругатітопах согааа.
ЗЕО ІЮ МО: 18 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Раміоома заїіпа.
ЗЕБЕО 10 МО: 19 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії Д5- десатурази Раміома заїїпа в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 20 -- А5-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІО МО: 21 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-десатуразу Ругатітопах согааа.
ЗЕО ІЮ МО: 22 -- Д5-десатураза Ругатітопах согдаца.
ЗЕО ІЮ МО: 23 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А5-елонгазу Ругатітопах согаага.
ЗЕО І МО: 24 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії А5-елонгази
Ругатітопах согдайа в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 25 -- Д5-елонгаза Ругатітопах согдаїйа.
ЗЕО ІЮ МО: 26 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Л4-десатуразу Раміоома заїіпа.
ЗЕБЕО І0О МО: 27 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії да4- десатурази Раміома заїїпа в рослинах. 60 ЗЕО ІЮ МО: 28 -- Д4-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО: 29 -- Д9У-елонгаза Ізоспгузів даІрапа.
ЗЕО І МО: 30 -- кодон-оптимізована відкрита рамка зчитування для експресії ЛУ-елонгази
Етійапіа пихіеуї в рослинах.
ЗЕО ІЮ МО: 31 -- Д9У-елонгаза Етійапіа пихіеуії.
ЗЕО ІЮ МО 32 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ле9-елонгазу Раміома ріпдиі5.
ЗЕО ІЮ МО 33 -- Д9У-елонгаза Раміома ріпдиів.
ЗЕО ІЮ МО 34 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча Ле9-елонгазу Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 35 -- Д9-елонгаза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 36 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча А8-десатуразу Раміома заїпа.
ЗЕО ІЮ МО 37 -- Ав-десатураза Раміома заїїпа.
ЗЕО ІЮ МО 38 -- вірусний супресор М2.
ЗЕО ІЮ МО 39 -- відкрита рамка зчитування, кодуюча вірусний супресор М2.
ЗЕО ІЮ МО 40 -- ЛФКАТ2 Агарідорвів ІНаїіапа.
ЗЕО ІЮО МО 41 -- ЛФКАТ І ітпапінез аїра.
ЗЕО ІЮ МО 42 -- ЛФКАТ Засспаготусез сегемівіає.
ЗЕО ІЮ МО 43 -- ЛФКАТ Містотопаз ризвіїа.
ЗЕО ІЮ МО 44 -- ЛФКАТ МопієгеїІа аїріпа.
ЗЕО ІЮ МО 45 - ЛФКАТ Вгассіза парив.
ЗЕО ІЮ МО 46 -- ЛФКАТ Вгавзвіса парив.
ЗЕО ІЮ МО 47 -- 03 десатураза Рпуїюоріннога іптевіапв.
ЗЕО ІЮ МО 48 -- 03 десатураза ТпаіІаззіовіга реейдопапа.
ЗЕО ІЮ МО 49 -- 03 десатураза РуїШйіит ігедшаге.
ЗЕО ІЮ МО 50-58 -- Олігонуклеотидні праймери/зонди.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
Загальні способи і визначення
Якщо конкретно не визначено інше, всі технічні і наукові терміни, використані в цьому документі, слід розуміти, як маючі таке ж значення, якого завжди надає їм середній фахівець в даній галузі техніки (наприклад, в культивуванні клітин, молекулярній генетиці, синтезі жирних кислот, трансгенних рослинах, рекомбінантних клітинах, хімії білка і біохімії).
Зо Якщо не вказано інше, білок, культура клітин та імунологічні методи, що використовуються в цьому винаході, являють собою стандартні способи, добре відомі фахівцям з рівня техніки. Такі методики описані і пояснені в літературних джерелах, наприклад, -). Регтаї, А Ргасіїса! Сціде 1
МоїІесшіаг Сіопіпо, дхопп Уміеу апа 5оп5 (1984), 9. затьгоок еї аї., МоїІесшаг СіІопіпо: А І арогагогу
Мапиаї, Соїй Зргіпд Нагброиг І аброгаїогу Рге55 (1989), Т.А. Вгоум/п (редактор), Еззепійа! МоїІесшаг
Віоіоду: А Ргасіїса! Арргоаси, Моїштевз 1 апа 2, ІВ Ргезз (1991), О.М. Спіомег апа В.О. Натев (редактори), ОМА Сіопіпд: А Ргасіїсаї Арргоасі, МоЇштев5 1-4, ІКІ Рге55 (1995 і 1996), Е.М.
А!йзибреї еї аІ. (редактори), Сиггепі РгоїосоЇ5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Сгеепе Риб. Азвзосіасез апа
УМПеу-Іпіегзсіепсе (1988, включаючи всі видання до сьогоднішнього дня), Ей Нагіомж апа Рамід
І апе (редактори), Апііродіе5: А І арогаїогу Мапиаї, Со Зргіпд Нагроишг Гарогайогу, (1988) ї У.Е.
Соїїдап еї а. (редактори), Сшгтепі Ргоїосої5 іп Іттипоіоду, допп УмМіеу 5 5оп5 (включаючи всі видання до сьогоднішнього дня).
Термін «та/або», наприклад, «Х та/або У» слід розуміти, як такий, що позначає будь-яке з «Х і У» або «Х або У», і його слід інтерпретувати як явно підтримуючий обидва значення або будь- яке із значень.
В цьому документі термін «близько», якщо не вказано протилежне, позначає х/- 10 95, більш переважно ч-/- 5 95, більш переважно ч«/- 1 95 від наведеного значення.
В цьому документі слово «включають» або його варіації, наприклад, «включає» або «який включає» слід розуміти, як таке, що позначає включення заявленого елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій, але не виключення будь-якого іншого
БО елементу, цілого числа або стадії, або групи елементів, цілих чисел або стадій.
Деякі визначення
В цьому документі терміни «екстрагований рослинний ліпід» і «виділений рослинний ліпід» позначають ліпідну композицію, що виділена, наприклад, шляхом подрібнення, з рослини або її частини, такої як насіння. Екстрагований ліпід може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені. Нижче розкриті приклади способів очищення. У варіанті реалізації винаходу екстрагований або виділений рослинний ліпід містить щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 96, щонайменше 60 близько 80 956, щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 мас./ 95 мас. ліпіду в композиції. Ліпід може бути твердим або рідким за кімнатної температури, якщо він є рідиною, то має назву олії. У варіанті реалізації винаходу екстрагований ліпід за винаходом не змішується з іншим ліпідом, наприклад, ДГК та/або ДПК, продукованою іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК та/або ДПК, пальмітинова кислота : ДГК та/або ДПК, лінолева кислота : ДГК та/або ДПК, і загальні 06 жирні кислоти : загальні 3 жирні кислоти, істотною мірою не змінюються (наприклад, не більш, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. В іншому варіанті реалізації винаходу екстрагований рослинний ліпід не обробляється процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінити одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК та/або ДПК, пальмітинова кислота : ДГК та/"або ДПК, лінолева кислота : ДГК та/або ДПК ії загальні 0б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. Якщо екстрагований рослинний ліпід за винаходом міститься в олії, олія може додатково містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
В цьому документі терміни «екстрагована рослинна олія (масло)» і «виділена рослинна олія (масло)» позначають речовину або композицію, що містить екстрагований рослинний ліпід або виділений рослинний ліпід, що є рідким за кімнатної температури. Олію одержують з рослини або її частини, наприклад, насіння. Екстрагована або виділена олія може являти собою відносно неочищену композицію, одержану, наприклад, шляхом подрібнення насіння рослини, або більш очищену композицію, з якої більшість, якщо не всі, з одного або більше або кожного із води, нуклеїнових кислот, білків і вуглеводів, що походять з рослинного матеріалу, видалені.
Композиція може містити інші компоненти, що можуть бути ліпідними або неліпідними. У варіанті реалізації винаходу олійна композиція містить щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, або щонайменше близько 95 95 мас./мас. екстрагованого рослинного ліпіду. У варіанті реалізації винаходу екстрагована олія за винаходом не змішується з іншим маслом, таким як ДГК та/або
ДПК, продукована іншим джерелом (наприклад, ДГК з риб'ячого жиру). У варіанті реалізації винаходу, після екстракції одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК
Зо та/"або ДПК, пальмітинова кислота : ДГК та/або ДПК, лінолева кислота: ДГК та/або ДПК і загальні 0б жирні кислоти : загальні 003 жирні кислоти істотно не змінюються (наприклад, не більше, ніж 10 95 або 5 95 змін), в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині.
В іншому варіанті реалізації винаходу екстраговану олію рослини не обробляють процедурою, такою як гідрогенізація або фракціонування, яка може змінювати одне або більше або всі із співвідношень олеїнова кислота : ДГК та/(або ДПК, пальмітинова кислота : ДГК та/або ДПК, лінолева кислота : ДГК та/або ДПК ії загальні б жирні кислоти : загальні 03 жирні кислоти, в порівнянні із співвідношенням в інтактному насінні або клітині. Екстрагована рослинна олія за винаходом може містити молекули, що не є жирними кислотами, наприклад, стероли.
У даному описі такі терміни, як «екстрагований мікробний ліпід» або «екстрагована мікробна олія» мають значення, аналогічне відповідним термінам «екстрагований рослинний ліпід» і «екстрагована рослинна олія», відповідно, причому основна відмінність полягає у джерелі ліпіду або олії.
В цьому документі «олія (масло)» являє собою композицію, що містить в основному ліпід і є рідкою за кімнатної температури. Наприклад, олія за винаходом переважно містить щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95 або щонайменше 90 95 мас. ліпіду.
Як правило, очищена олія містить щонайменше 90 95 мас. триацилгліцеролів (ТАГ), від вмісту ліпіду в олії. Мінорні компоненти олії, такі як діацилгліцероли (ДАГ,, вільні жирні кислоти (ВЖК), фосфоліпід і стероли, можуть бути присутніми, як розкрито в цьому документі.
В цьому документі термін «жирна кислота» позначає карбонову кислоту (або органічну кислоту), часто з довгим аліфатичним хвостом, насиченим або ненасиченим. Зазвичай жирні кислоти містять ланцюг вуглець-вуглецевих зв'язків завдовжки щонайменше 8 атомів вуглецю, більш переважно завдовжки щонайменше 12 атомів вуглецю. Переважні жирні кислоти за винаходом містять вуглецеві ланцюги завдовжки 18-22 атомів вуглецю (жирні кислоти С18, С20,
С22), більш переважно 20-22 атоми вуглецю (С20, С22) і, найбільш переважно, 22 атоми вуглецю (С22). Більшість жирних кислот, що зустрічаються в природі, містить парну кількість атомів вуглецю, оскільки в їх біосинтезі приймає участь ацетат, що містить два атоми вуглецю.
Жирні кислоти можуть бути у вільному стані (неестерифіковані) або в естерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку. Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, бо наприклад, форми фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину,
фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. У варіанті реалізації жирна кислота естерифікована метильною або етильною групою, наприклад, метиловий або етиловий ефір ПНЖК С20 або С22. Переважними жирними кислотами є метилові або етилові ефіри ЕПК, ДПК або ДГК або суміші ЕПК і ДГК або ЕПК, ДПК і ДГК або ЕПК і ДПК. «Насичені жирні кислоти» не містять подвійних зв'язків або інших функціональних груп уздовж ланцюга. Термін «насичений» позначає водень, з тим, що всі атоми вуглецю (окрім групи карбонової кислоти |-СООНІ) містять максимально можливу кількість водню. Іншими словами, омега (0)) кінець містить З атоми водню (СНЗ-), і кожен атом вуглецю в межах ланцюга містить 2 атоми водню (-СН2-). «Ненасичені жирні кислоти» за формою подібні до насичених жирних кислот, за винятком того, що одна або більше алкенових функціональних груп присутні вздовж ланцюга, причому кожен алкен замінює одинарний зв'язок «-СН2-СН2г-» частини ланцюга подвійним зв'язком «-
СнН-СН-» (тобто, вуглець приєднаний подвійним зв'язком до іншого атома вуглецю). Два наступні атоми вуглецю в ланцюгу, які приєднані до кожної із сторін подвійного зв'язку, можуть бути присутніми в цис або транс конфігурації, переважно у цис конфігурації. У варіанті реалізації склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом включає менш ніж 1 96 жирних кислот, що містять подвійні вуглець-вуглецеві зв'язки у транс конфігурації (транс жирні кислоти).
В цьому документі термін «мононенасичена жирна кислота» позначає жирну кислоту, що містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу, і лише одну алкенову групу (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в ланцюгу. В цьому документі терміни «поліненасичена жирна кислота» або «ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 12 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше дві алкенові групи (подвійні вуглець-вуглецеві
Зв'язки).
В цьому документі терміни «довголанцюгова поліненасичена жирна кислота» і «ДЛ-ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 20 атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу і щонайменше два подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки, і таким чином включають ДДЛ-ПНЖК. В цьому документі терміни «поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом» і «ДДЛ-
ПНЖК» позначають жирну кислоту, яка містить щонайменше 22 атоми вуглецю у вуглецевому
Зо ланцюгу їі щонайменше три подвійні вуглець-вуглецевих зв'язки. Звичайно, кількість атомів вуглецю у вуглецевому ланцюгу жирних кислот відноситься до нерозгалуженого вуглецевого ланцюга. Якщо вуглецевий ланцюг розгалужений, кількість атомів вуглецю виключає атоми вуглецю бічних груп. В одному варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота являє собою 03 жирну кислоту, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець- вуглецевий зв'язок) в положенні третього вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти. В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота є 0б жирною кислотою, тобто, містить десатурацію (подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок) в положенні шостого вуглець-вуглецевого зв'язку від метильного кінця жирної кислоти.
В іншому варіанті реалізації винаходу довголанцюгова поліненасичена жирна кислота вибрана з групи, що складається з: арахідонової кислоти (АРК, 20:4Д5,8,11,14; 06), ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК, 20:4Д8,11,14,17, 03), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК, 20:5Д5,8,11,14,17; 03), докозапентаєнової кислоти (ДПК, 22:5А47,10,13,16,19, 03) або докозагексаєнової кислоти (ДГК, 22:6А4,7,10,13,16,19, 03). Крім того, ДЛА-ПНЖК можуть являти собою дигомо-у-лінолеву кислоту (ДГЛК) або ейкозатриєнову кислоту (ЕТрК, 20:3А11,14,17, 03). Буде очевидно, що ДЛ-ПНЖК, одержана у відповідності до винаходу, може бути сумішшю будь-яких або всіх згаданих вище сполук, і може містити іншу ДЛ-ПНЖК або похідні будь-якої з наведених ДЛ-ПНЖК. У переважному варіанті реалізації 03 жирні кислоти являють собою щонайменше ДГК та/або ДПК, переважно, ДПК і ДГК, або ЕПК, ДПК ї ДГК, або ЕПК ї ДПК. Після екстракції з рослини ДГК присутня у ліпіді або олії на рівні 20,1-30 95 або від 20,1 95 до 35 95, переважно від 30 95 до 35 95 від складу загальних жирних кислот. Наприклад, ДГК присутня на рівні від 30,1 95 до 35 95 від складу загальних жирних кислот. У варіанті реалізації рівень ДГК перевищує рівень ДПК, більш переважно, перевищує рівень кожної з ЕПК і ДПК, найбільш переважно, перевищує сумарний рівень ЕПК їі ДПК. У альтернативному варіанті реалізації ДПК присутня на рівні від близько 7 905 до 30 95 або 35 95, і ДГК присутня або відсутня, або, якщо вона присутня, то присутня на рівні менш ніж 2,0 95, переважно менш ніж 1,0 95, більш переважно, менш ніж 0,5 95 від загального складу жирних кислот у композиції і, найбільш переважно, відсутня або не піддається виявленню. Це може забезпечуватися відсутністю активності Д4-десатурази у клітині. У варіанті реалізації рівень ДПК перевищує ЕПК, більш переважно перевищує рівень кожної з ЕПК і ДГК, найбільш переважно перевищує сумарний рівень ЕПК і ДГК. У даному варіанті реалізації ДГК може бути відсутня або, якщо вона присутня, то присутня на рівні менш ніж 0,5 95 від складу загальних жирних кислот.
Додатково, в цьому документі терміни «довголанцюгова поліненасичена жирна кислота» і «поліненасичена жирна кислота з дуже довгим ланцюгом» позначають жирну кислоту, що знаходиться у вільному стані (неестерифіковану) або в естерифікованій формі, наприклад, як частина тригліцеролу, діацилгліцеролу, моноацилгліцеролу, зв'язки з ацил-КоА (тіоефір) або іншої форми зв'язку. У тригліцеролі, ДЛА-ПНЖК або ДДЛ-ПНЖК, такі як ДГК або ДПК, можуть бути естерифіковані у положеннях 5п-1/3 або 5п-2, або тригліцерол може містити дві або три ацильних групи, вибрані із адильних груп ДЛ-ПНЖК і ОДЛ-ПНЖК. Наприклад, тригліцерол може містити ДГК або ДПК як в 5п-1, так і в 5п-3 положеннях. Жирна кислота може бути естерифікованою як фосфоліпід, наприклад, форми фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну, фосфатидилсерину, фосфатидилгліцеролу, фосфатидилінозитолу або дифосфатидилгліцеролу. Тому, ДЛ-ПНЖК може бути присутньою як суміш форм в ліпіді клітини або очищеній олії або ліпіді, екстрагованих з клітин, тканин або організмів. У переважних варіантах реалізації винаходу розкривається олія, що містить щонайменше 75 90 або щонайменше 85 95 триацилгліцеролів, причому решта представлена іншими формами ліпіду, такими як згадані вище, у яких присутні щонайменше вказані триацилгліцероли, що містять ДЛ-ПНЖК. В подальшому олія може бути додатково очищена або оброблена, наприклад гідролізом із сильною основою, з метою вивільнення вільних жирних кислот, або дистиляцією, тощо.
В цьому документі вираз «загальні б жирні кислоти» або «загальний вміст 0б жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 006 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Вказані б жирні кислоти включають ( за наявності) ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї о6-ДПК, але виключають будь-які 003 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Все 0б жирні кислоти, присутні в рослинах, насінні, ліпіді або оліях за винаходом, входять до класу поліненасичених жирних кислот (ПНЖК).
В цьому документі вираз «нові б жирні кислоти» або «вміст нових 0б жирних кислот» або
Зо подібний позначає суму всіх 0б жирних кислот, за винятком ЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові 06 жирні кислоти є жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослини і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (за наявності) ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК ї об-ДПК, але виключають ЛК і будь-які 03 жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Характерний загальний вміст 0б жирних кислот і вміст нових 0б жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК і результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
В цьому документі вираз «загальні 003 жирні кислоти» або «загальний вміст 03 жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі 03 жирні кислоти включають (якщо вони присутні) АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК ії ДГК, і виключають будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти. Все 0б жирні кислоти, присутні в рослинах, насінні, ліпіді або оліях за винаходом, входять до класу поліненасиченних жирних кислот (ПНЖК).
В цьому документі вираз «нові 003 жирні кислоти» або «вміст нових 03 жирних кислот» або подібний позначає суму всіх 003 жирних кислот, за винятком АЛК, естерифікованих і неестерифікованих, в екстрагованому ліпіді, олії, рекомбінантній клітині, частині рослини або насінні, як визначається контекстом, виражену, як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Такі нові 03 жирні кислоти є 003 жирними кислотами, продукованими в клітинах, рослинах, частинах рослин і насінні за винаходом шляхом експресії генетичних конструкцій (екзогенні полінуклеотиди), введених в клітини, і включають (якщо вони присутні) СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК,
ДПК і ДГК, але виключають АЛК і будь-які б жирні кислоти і мононенасичені жирні кислоти.
Характерний загальний вміст 03 жирних кислот і вміст нових 03 жирних кислот визначається за перетворенням жирних кислот у зразку на МЕЖК їі результатами аналізу ГХ, як розкрито в
Прикладі 1.
Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, термін «одержання частини рослини» як стадія 60 у способі за винаходом може включати одержання однієї або більше частин рослини для
Зо застосування у способі. Одержання частини рослини включає збирання врожаю частини рослини із рослини, наприклад, за допомогою комбайна, або придбання частини рослини або одержання частини рослини від постачальника. В іншому прикладі, одержання частини рослини може бути придбанням рослини у будь-кого іншого, хто зібрав урожай частини рослини.
Білки десатураза, елонгаза і ацилтрансфераза та гени, що кодують їх, які можуть застосовуватися у відповідності до винаходу, є будь-якими з відомих в рівні техніки або їх гомологами або похідними. Приклади таких генів і розмір кодованих білків наведені в Табл. 1.
Ферменти десатурази, для яких продемонстровано участь в біосинтезі ДЛ-ПНЖК, всі належать до групи так званих «фронт-енд» десатураз. Переважними білками або комбінаціями білків є кодовані генетичними конструкціями, запропонованими в даному описі як БЗЕО ІЮ МО: 1 і 2.
Таблиця 1
Клоновані гени, що беруть участь в біосинтезі ДЛА-ПНЖК
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (аю) да-десатураза дУуг78558 Меуєег еї а!., 2003 0 ІВодорості | Раміома ІшіНепі АУЗ332747 Топоп е! а!., 2003
Я Регвїга вії аї., 11111011 |Рамомавайна /// (ААМТ5136 7поц еїа!., 2007
ААМ75707 . «ло Ппгаивіоспуйтнит ААМ75708
Траустохітридієві ашейт ААМ75709 515 |Отсутствуют
ААМ75710
Тпигаймвіоспуїніиит 5р. .
Со еїга!., 1999р д5-десатураза |Ссавці Ното зарієп5 АР199596 444 || еопага ві а!., 2000р
Міспає!5оп еї аї.,
Саєпотарайїйів АРГ11440, 19986;
Нематода еіедапо ММ 069350 447 У/айнв5 апа Вгомузе, 1999р
Міспає!5оп еї аї., . . 1998а;
Гриби Мопіегеїа аіІріпа АгРО67654 446
Кпиї2оп ві аї., 1998 0 ТРушШіцтітедціаге | АЕ419297 Нопа ві а!., 2002а
Оістуовівїшт : 11111101 |Барюієопіасїістта | 0 470 |МООгов81668 . . Рпаводасіу т Ротегаие еї аї.,
Водорості 0/0 | Тигайвіоспуйнит зр. | АЕ489588 Оїи єї а!., 2001 ашеийт 11111011 (івоспгувівдаірала, | - 0 442 |МООгов1668
Магснапійа КаїїКама еї аї.,
Со ега!., 1999а; дб-десатураза |Ссавці Ното зарієп5 ММ 013402| 444 (| еопага ес а!., 2000 11111101 |Мивтивсшив ММ 019699 444 |Споеїа!., 19994 вівдапз
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (ак)
Еспіт АХО55117 Сагсіа-Магою єї спи АХУОБ55118 а!., 2002 . и Зауапома вії аї.,
Апетопе Іємейієї | АЕ536525 | 446 |МУпИпеуУ ета. 2003
Магснапійа КаїїКама еї аї., 1 ТРпузсотійнеїіа раїєпо| САА110ОЗ3 сіїке ега!., 1998
Ниапа єї а!., 1999; . . АР110510 г ' 0 ТРуШіцтікмтєдціагє /|АЕ419296 Нопа ві а!., 2002а 0 1Мисог сіїсіпеоіде5. | АВО52086 МОВІ" 11111111 (виде підориз/// |АУЗ20288 папа еїа!., 2004 17111111 ароієопіадісїна | | 453 |УО0гов1668 . . Рпаєдастут Ротегаие еї аї., 11111111 |Бактерї |бупеспосувів. | 11421 Веддау еї а!., 1993 ашеит
Біфункціональна .
АБІДВ- рапіо гегіо деЗОеББЄ | 444 |в егаї; десатураза
С20 дВ- . а мав апа Вгомузе,
Дв-елонгаза // |Нематода Саепотарайів ММ 069288 288 | еацсоїп егаї.; еієдапзо 2000 0 |Мохи 0/0 |Рпузсотійнеїйа раїєпе5| АЕ428243 7апк еї а!., 2002
Магснапійа КаїїКама еї аї., 11111110 |Водорості |Рамомашйей" | 1 501 /УО0о3078639 0 ІТпгайвіоснуйит АХ9О51565 МО 03093482 вид си |АХ214454 УКО 0159128
Тпгаймвіоспуїнит
Ї еєопага ві аї.,
ПНЖК-елонгаза | Ссавці Ното зарієп5 Агг31981 299 |7О00Б;
Ї еєопага ві аї., 2002 11111111 |Найивпогмедісив / |АВО7Т985 Іпадакі еї а!., 2002 11111111 |Найивопогмедісив" |АВО7Т986 Іпадакі еї а!., 2002 11111111 |Мивтивсшив// ГАРТ70907 Тмгаїк ега!., 2000 11111111 |Мивтивсшив//// ГАРТ70908 Тмгаїк ега!., 2000 11111111 Оапіотейо" ММ 199532) 266 | овіаї. 2003 ; Саєпотарайїйів АРрБбої еї а!., 1998
Розмір
Фермент Тип Номери білка Посилання організму доступу (аю) 11111112 фен (ДНК лев вт оплот 11101771 Ф|Рамомашеї" | 0 320 |МОо3078639 Щ 11111011 |Ецбієпадгасіїв/// | 0 258 |МОовлгво0 11100171 |Ругатітопавсогіаюв,/////// 0268 ГМО 2010/057246 вид Раміома Регвїга вії аї., 100000 обме ААмвовю от де 11111101 |Рамомавайна |ААМІ5І35 302 |Норепега). 2009 денно оте рн зе юна роендопапа 11111111 |Риба ////// |Опсобупспив пуківв САМ5586б2 295 |М/О06/008099 Ж р дн еете| зе денно роїтутогріа 2006 " перулумли. порі. піт.пійп.дом/ "7" Функція не доведена/не продемонстрована
В цьому документі термін «фронт-енд десатураза» позначає члена класу ферментів, які вводять подвійний зв'язок між карбоксильною групою і вже існуючою ненасиченою частиною ацильного ланцюга ліпідів, які структурно характеризуються присутністю домену М-кінцевого цитохром Б5, разом з типовим доменом десатурази жирних кислот, що містить три високою мірою консервативних гістидинових бокси (Маріеєг еї аї., 1997).
Активність будь-якої з елонгаз або десатураз для застосування у відповідності до винаходу може бути протестована шляхом експресії гена, що кодує фермент, в клітині, такій як, наприклад, дріжджова клітина, рослинна клітина, або переважно в соматичних ембріонах або трансгенних рослинах, і визначення того, чи володіє клітина, ембріон або рослина підвищеною здатністю до продукування ДЛ-ПНЖК, в порівнянні з аналогічною клітиною, ембріоном або рослиною, у яких фермент не експресується.
В одному варіанті реалізації винаходу одна або більше десатураз та/або елонгаз для застосування у відповідності до винаходу можуть бути одержані з мікроводорості і очищені, тобто мати послідовність амінокислот, ідентичну поліпептиду, який може бути одержаний з мікроводорості і очищений.
Хоча деякі ферменти конкретно розкриваються в цьому документі як «біфункціональні», відсутність такого терміну не обов'язково означає, що конкретний фермент не володіє іншою активністю, окрім конкретно розкритої.
Десатурази
В цьому документі термін «десатураза» позначає фермент, що здатний вводити подвійний вуглець-вуглецевий зв'язок до ацильної групи жирнокислотного субстрату, який звичайно знаходиться в естерифікованій формі, наприклад, ефіри ацил-КоА. Ацильна група може бути естерифікована до фосфоліпіду, наприклад, фосфатидилхолін (ФХ), або до білка-носія ацилу (БНА), або, в переважному варіанті реалізації винаходу, до КоА. Десатурази загалом можуть бути розділені на три групи, відповідно. В одному варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою фронт-енд десатуразу.
В цьому документі «А4-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 4-го вуглець-вуглецевого зв'язку
Зо від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше «Д4-десатураза» здатна перетворювати ДПК на ДГК. Переважно, «Д4--десатураза» здатна перетворювати ДПК-КоА на
ДГК-КоА, тобто, вона є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «Д4-десатураза» здатна перетворювати ДПК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ на ДГК-ФХ. Переважно д4- десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ДПК-КоА, ніж по відношенню до ДПК-ФХ. Стадія десатурації з утворенням ДГК з ДПК каталізується Д4-десатуразою в організмах, що не відносяться до ссавців, і ген, що кодує даний фермент, виділений із виду прісноводних найпростіших Ешдіепа дгасіїї5 і морських видів Тпгаиз(оспуїгічшт (Ом еї аї., 2001;
Меуеєг еї аїЇ.,, 2003). В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Л4-
десатурази відповідає представленій в ЗЕО ІЮ МО: 28, або Д4-десатуразі виду Тпгаизіоспуїгічт, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮ МО: 28. У варіанті реалізації рослина, частина рослини (така як насіння) або клітина за винаходом або застосовувані у відповідності до винаходу, що продукують високі рівні
ДПК, наприклад, ДПК становить від 5 96 до 35 95 від загального вмісту жирних кислот, що екстрагуються, не містять гена, що кодував би функціональну Л4-десатуразу.
В цьому документі «Д5-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 5-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. У варіанті реалізації жирнокислотний субстрат являє собою ЕТК, і фермент продукує ЕПК. Переважно, «А5-десатураза» здатна перетворювати ЕТК-КоА на ЕПК-КоА, тобто є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «Д5- десатураза» здатна трансформувати ЕТК, естерифіковану у положенні 5п-2 ФХ. Переважно
ДАГдесатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ЕТК-КоА, ніж по відношенню до ЕТК-ПК. Приклади «А5-десатураз» наведені у Киї?-І оре? еї аї. (2012) і Реїгіє еї а. (2010а), а також у Табл. 1 цього документу. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5-десатурази відповідає представленій в ЗЕО ІЮО МО: 20, її біологічно активному фрагменту або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній 5ЕО ІЮ МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д5Б- десатурази відповідає представленій ЗЕО ІЮ МО: 22, її біологічно активному фрагменту, або послідовності амінокислот, щонайменше на 53 95 ідентичній ЗЕО ІЮ МО: 32. В іншому варіанті реалізації винаходу Д5-десатураза одержана з виду Тпгаизіоспуїгічт або Ептіїапіа пихіеуї.
В цьому документі «Дб-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, із введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 6-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. У варіанті реалізації жирнокислотний субстрат являє собою АЛК, і фермент продукує СДК. Переважно, «Дб-десатураза» здатна перетворювати АЛК-КоА на СДК-КоА, тобто є ацил-КоОА десатуразою. У варіанті реалізації «Дб- десатураза» здатна перетворювати АЛК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ. Переважно, Дб- десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до АЛК-КоОА, ніж по відношенню до АЛК-ФХ. Крім того, Аб-десатураза може володіти активністю Д5-десатурази, і при цьому
Зо носити назву А5Б/Аб біфункціональної десатурази, за умови, що вона володіє більш високою активністю Дб-десатурази відносно АЛК, ніж активністю Д5-десатурази відносно ЕТК. Приклади дб-десатураз наведені у Киї?-І оре? еї аї. (2012) і Реїгіє єї аї. (2010а), а також в Табл. 1 цього документу. Переважні Дб-десатурази одержані з Місготопах ризійа, Руїйішт ігедшіаге або
Овігеососсивз їашгії.
У варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза додатково характеризується наявністю щонайменше двох, переважно всіх трьох і переважно в рослинній клітині, з наступного: ії) вища активність Лб-десатурази по відношенню до а-ліноленової кислоти (АЛК, 18:349,12,15, 03), ніж по відношенню до лінолевої кислоти (ЛК, 18:2А9,12, 0шб) як жирнокислотного субстрату; ії) вища активність Дб-десатурази по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату; іїії) активність Д8-десатурази по відношенню до ЕТрК. Приклади таких Аб-десатураз наведені в
Табл. 2.
Таблиця 2
Десатурази, які продемонстрували активність на субстраті ацил-КоА зени | шин |, шен | жо | ее |енни організму доступу білка (ак) . МапіопієЇїа Нойтант ев аї., 110 онеоежннтви дюн ери
Реїне вї аї.,
Містотопаз ривіїїа | ЕЕНЬ8637 2010а (ЗЕО ІЮ
МО: 13 зени | шин |, шен | жо | ее енни організму доступу білка (ак) . МапіопієЇїа Нойтант ев аї., ення атоютююя (Виини | 000
Руштійт Хивє еї а!., 2012; 00000 мер |бммормиосово рова! 389 | ОдОововаевЬ.
Гриби Рпуюрптога Хивє еї а!., 2012; 00 езищев о |шлошто мем) зв Одоовюввввь.
У варіанті реалізації винаходу Аб-десатураза володіє вищою активністю по відношенню до 03 субстрату, ніж по відношенню до відповідного 0б субстрату, і володіє активністю по відношенню до АЛК з утворенням октадекатетраєнової кислоти (стеаридонова кислота, СДК, 18:4А6,9,12,15, 03), з ефективністю щонайменше 30 95, більш переважно щонайменше 40 95, або найбільш переважно щонайменше 50 95, при експресії з екзогенного полінуклеотиду в рекомбінантній клітині, такій як рослинна клітина, або щонайменше 35 95 при експресії в дріжджовій клітині. В одному варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше близько в 2 рази вищою активністю Аб-десатурази по відношенню до АЛК, ніж по відношенню до ЛК як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу Дб-десатураза володіє вищою активністю, наприклад, щонайменше близько в 5 разів вищою активністю Дб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищою активністю по відношенню до АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж по відношенню до АЛК, приєднаної в положенні 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату. В іншому варіанті реалізації винаходу, Дб- десатураза володіє активністю по відношенню до обох жирнокислотних субстратів -- АЛК-КоА і
АЛК, приєднаних в положенні 5п-2 ФХ.
В одному варіанті реалізації винаходу Аб-десатураза не володіє активністю Д5-десатурази по відношенню до ЕТК, яка могла би бути виявлена. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена ЗЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮО МО: 19 або 5ЕО
ІО МО: 20, їх біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 77 У5 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 16, 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІО МО: 20. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Дб-десатурази представлена 5ЕО ІЮ МО: 19 або 5ЕО ІЮ
МО: 20, їх біологічно активним фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 67
Фо ідентичною одній або обом з БЕО І МО:19 або 5ЕО ІЮО МО: 20. Крім того, ДАб-десатураза може володіти активністю Д8-десатурази.
В цьому документі «Д8-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 8-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Щонайменше Д8-десатураза здатна
Зо перетворювати ЕТрК на ЕТК. Переважно, «Ав-десатураза» здатна перетворювати ЕТрК-КоА на
ЕТК-КоА, тобто є ацил-КоА десатуразою. У варіанті реалізації «А8-десатураза» здатна перетворювати ЕТРрК, естерифіковану в положенні 5п-2 ФХ. Переважно О8-десатураза володіє більш високою активністю по відношенню до ЕТрК-КоА, ніж по відношенню до ЗТРК-ПК. Крім того, ДАв-десатураза може володіти активністю А8-десатурази, і при цьому носити назву Дб/Д8 біфункціональної десатурази, за умови, що вона володіє більш високою активністю Дв8- десатурази по відношенню до ЕТрК, ніж активністю ДЛб-десатурази по відношенню /! АЛК.
Приклади А48-десатураз наведені у Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот Д8-десатурази відповідає представленій 5ЕО ІЮ МО: 37, її біологічно активним фрагментом або послідовності амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичній ЗЕО ІЮ МО: 37.
В цьому документі «0ш3З-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вугллецевого зв'язку в положенні 3-ого вуглець-вуглецевого зв'язку від метилового кінця жирнокислотного субстрату. Таким чином, 03-десатураза може перетворювати ЛК на АЛК і ГЛК на СДК (всі С18 жирні кислоти), або ДГЛК на ЕТК та/або АРК на
ЗПК (020 жирні кислоти). Деякі 03-десатурази (група І) володіють активністю тільки на С18 субстратах, таких як рослинні і ціанобактеріальні 03-десатурази. Такі 0З-десатурази також є
Д15-десатуразами. Інші 3-десатурази виявляють активність на субстратах С20 без активності (група Ії) або з деякою активністю (група ІІ) на субстратах С18. Такі о3-десатурази також є А17- десатуразами. Переважними о03-десатуразами є група Ії типу, яка перетворює ЛК на АЛК, ГЛК на СДК, ДГЛК на ЗТК і АРК на ЗПК, наприклад, Ріспіа равіогі5 03-десатураза (ЗЕО ІЮО МО: 6).
Приклади о3-десатураз включають описані Регеїга еї аїІ. (2004а) (03-десатураза ЗаргоІедпіа дісіїпа, група ІІ), Ногідиспі еї аї. (1998), Вегрегісп еї аїЇ. (1998) і Бруспайа еї аї. (1997) (03- десатураза С. еІєдап5, група ІІ). В переважному варіанті реалізації винаходу д03-десатураза
Б являє собою грибкову Ф3-десатуразу. В цьому документі «грибкова 03-десатураза» позначає 0шЗ3-десатуразу, одержану з грибкового джерела, в тому числі, ооміцетного джерела, або її варіант з послідовністю амінокислот, щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні 03-десатурази, виділені з грибкових джерел, таких як, наприклад, Рпуїорпїйога іптезіап5 (номер доступу САУЗО87О, ММО2005083053; 5ЕО ІЮО МО: 47), заргоїІедпіа дісіїпа (номер доступу ААК20444, Регеїга еї аіЇ,, 2004а і патент США Мо 7211656), Рушіт ігтедшаге (МУО2008022963, Група ІІ; 5ЕБО ІО МО: 49), МогіегейПа аїріпа (ЗаКигадапі еї аї., 2005; номер доступу ВАБУ1495; М/О2006019192), ТпаіІазвіозіга роецдопапа (Агтбгиві еї аїЇ.,, 2004; номер доступу ХР 002291057; ММО2005012316, 5ЕО ІЮ МО: 48), І аспапсеа Кішпумегі (також відомий як засспаготусез Кіпумегі; Оига еї аї., 2004; номер доступу АВ118663). Хие еї аї. (2012) описує 03- десатурази з ооміцетів Руїйішт арпапідептайшт, РпуорпїШога зодає і Рпуїорпїнога гатогит, здатні ефективно перетворювати жирнокислотні субстрати 06 на відповідні 003 жирні кислоти, з перевагою у відношенні субстратів С20, тобто ті, що володіють вираженішою активністю А17- десатурази порівняно з активністю Д15-десатурази. Такі ферменти не володіють активністю
А12-десатурази, але здатні використовувати жирні кислоти в ацил-КоА і фосфоліпідній фракції як субстрати.
У більш переважному варіанті реалізації винаходу грибкова 003-десатураза являє собою 03- десатуразу/л15-десатуразу Ріспіа разіогі5 (також відома як КотадаїаєїІа равіогі5) (7Напо еї аї., 2008; номер доступу ЕР116884; 5ЕО ІО МО: 6) або поліпептид, який щонайменше на 95 95 ідентичний їй.
У варіанті реалізації винаходу 03-десатураза здатна здійснювати щонайменше одне з наступних перетворень: АРК на ЕПК, ДГЛК на ЕТК, ГЛК на СДК, АРК на ЕПК і ДГЛК на ЕТК, АРК на ЕПК і ГЛК на СДК, або всі три з них.
В одному варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє активністю А17-десатурази по відношенню до жирної кислоти С20, яка містить щонайменше три подвійних вуглець-вуглецевих
Зо зв'язки, переважно АРК. В іншому варіанті реалізації винаходу о3З-десатураза володіє активністю А15-десатурази по відношенню до жирної кислоти С18, яка містить три подвійних вуглець-вуглецевих зв'язки, переважно ГЛК. Переважно обидва види активності присутні.
В цьому документі «А12-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 12-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Звичайно А12-десатурази перетворюють олеоїл-фосфатидилхолін або олеоїл-КоА на лінолеоїл-фосфатидилхолін (18:1-
ФХ) або лінолеоїл-КоА (18:1-КоА), відповідно. Підклас, що використовує пов'язаний з ФХ субстрат, називають фосфоліпід-залежними Д12-десатуразами, другий підклас -- ацил-Код- залежними Д12-десатуразами. Рослинні і грибкові ДІТ2-десатурази звичайно відносяться до першого підкласу, тоді як тваринні Д12-десатурази відносяться до другого підкласу, наприклад,
А12-десатурази, кодовані генами, які клоновані з комах 2пои еї аїЇ. (2008). Численні інші послідовності А1Т2-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
В цьому документі «А15-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 15-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Численні гени, що кодують А15- десатурази, клоновані з рослинних і грибкових видів. Наприклад, в 55952544 розкриті нуклеїнові кислоти, що кодують рослинні А15-десатурази (ЕАОЗ). Ці ферменти містить мотиви амінокислот, які були характерними для рослинних Л15-десатураз. У ММО200114538 розкритий ген, що кодує БАЮЗ сої. Численні інші послідовності А15-десатурази можуть бути легко ідентифіковані шляхом пошуку в базах даних послідовностей.
В цьому документі «А17-десатураза» позначає білок, який здійснює реакцію десатурації, з введенням подвійного вуглець-вуглецевого зв'язку в положенні 17-го вуглець-вуглецевого зв'язку від карбоксильного кінця жирнокислотного субстрату. Крім того, АД17-десатураза розцінюється як Ф3-десатураза, якщо вона діє на субстрат С20, з введенням десатурації в положенні зв'язку 003.
У переважному варіанті реалізації винаходу Д12-десатураза та/або Д15-десатураза являє собою грибкову Д12-десатуразу або грибкову Д15-десатуразу. В цьому документі «грибкова
Д12-десатураза» або «грибкова Д15-десатураза» позначає Д12-десатуразу або Д15-десатуразу, 60 одержану з грибкового джерела, зокрема, ооміцетного джерела, або її варіант, послідовність амінокислот якого є щонайменше на 95 95 ідентичною їй. Гени, що кодують численні десатурази, виділені з грибкових джерел. У 05 7211656 розкрита Д12-десатураза із ЗаргоІедпіа дісіпа. У УМО2009016202 розкриті грибкові десатурази з НеїЇобаейа гобивхіа, І ассагіа бБісоїог,
Гоша дідапієа, Місгтосоїєн5 сПпіпопоріазієїх, Мопозіда Бгемісоїй5, МусозрпаєгейМа Піепвів,
Мусозраєгейа дгатіпісоїа, Маеєдієта дгибеп, Месштіа Паетайюсосса, МетаїйозієЇа месіепвів,
Рпусотусез ріаКезієвапив, Тгісподепта гевії, РпузсотіейПа раїепв, Ровійа ріасепіа, ЗеїЇадіпеїМа тоеїПепаогнії і Місгодоспішт пімаіе. У М/О2005/012316 розкрита А12-десатураза з Тпаїазвіовіга рхешйдопапа та інших грибів. У ММО2003/099216 розкриті гени, кодуючі грибкові Д12-десатурази і
А15-десатурази, виділені з Меигозрога сгазза, Азрегуйи5 піашіап5, Воїгуїйб5 сіпегеа і МогііегеПНа аіІріпа. У УМО2007133425 розкриті грибкові А15 десатурази, виділені з: Засспаготусез Кішуметгі,
Мопіегеїа аїріпа, А5регуйШивє підшап5, Мешйгозрога стазза, Ризагпйт дгатіпеагит, Еизапйит топіїйопте і Мадпаройне дгізеа. Переважна Л12 десатураза виділена з РНуїорнпіпога 5оі|ає (Виі2-І оре? ві аї., 2012).
Іншим підкласом грибкових Д12-десатураз і грибкових ДЛ15-десатураз є біфункціональні грибкові А1Т2/А15-десатурази. Гени, що кодують їх, клоновані з Ризагцт топоїйогте (номер доступу 0О272516, ЮОатиде еї аї., 2006), Асапіпатоебра сазіеПапії (номер доступу ЕБО17656,
Зауапома вї аї., 2006), Регкіпвив таїпив (М/О2007042510), СіІамісер5 ритригеа (номер доступу
ЕЕ536898, Меезаруоазик еї а!ї., 2007) ії Соргіпи5 сіпегеиз (номер доступу АЕ269266, 7Ппапо еї аї., 2007).
В іншому варіанті реалізації винаходу 03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю, переважно більшою активністю, по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж до субстрату відповідного ацил-ФХ. В цьому документі «відповідний субстрат ацил-ФХ» позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж жирною кислотою, як в субстраті ацил-КоА. Наприклад, субстрат ацил-КоА може бути АРК-КОА, і тоді відповідний субстрат ацил-ФХ являє собою 5п-2 АРК-ФХ. У варіанті реалізації винаходу активність щонайменше вдвічі вища. Переважно о03-десатураза володіє щонайменше деякою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА і відповідного субстрату ацил-ФХ, і володіє активністю по відношенню до субстратів С18 і С20. Приклади таких 03- десатураз відомі серед клонованих грибкових десатураз, наведених вище.
Зо В іншому варіанті реалізації винаходу ю3-десатураза містить послідовність амінокислот, представлену ЗЕО ІЮ МО: 6, її біологічно активний фрагмент, або послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95 ідентичною 5ЕО ІЮО МО: 6, переважно є щонайменше на 90 95 або щонайменше на 95 95 ідентичною ЗЕО ІЮ МО: 6.
Ще в одному варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-КоА, ніж відповідного субстрату ацил-ФХ. В іншому варіанті реалізації винаходу десатураза для використання в цьому винаході володіє вищою активністю по відношенню до субстрату ацил-ФХ, ніж відповідного субстрату ацил-КоА, але володіє деякою активністю по відношенню до обох субстратів. Як окреслено вище, «відповідний субстрат ацил-ФХ» позначає естерифікований жирною кислотою в положенні 5п-2 фосфатидилхолін (ФХ), в якому жирна кислота є такою ж, як жирна кислота в субстраті ацил-КоА. У варіанті реалізації винаходу вища активність означає щонайменше вдвічі вищу активність. У варіанті реалізації винаходу десатураза являє собою Д5- або Дб-десатуразу, або 03-десатуразу, приклади яких розкриті, без обмеження, в Табл. 2. З метою тестування того, на який субстрат діє десатураза, а саме, на субстрат ацил-КоА або ацил-ФХ, можуть бути проведені аналізи на дріжджових клітинах, як описано в Оотегодице еї аї. (2003) і (2005). Крім того, здатність десатурази діяти на субстрат ацил-КоА може передбачатися, якщо елонгаза, яка експресується разом з десатуразою, демонструє ефективність ферментного перетворення в рослинних клітинах щонайменше близько 90 95, якщо елонгаза каталізує елонгацію продукту десатурази. Базуючись на цьому, Д5-десатураза і Д4-десатурази, що експресуються із конструкта СА7 (Приклади 2 і 3) та їх варіанти (Приклад 5) здатні до десатурації відповідних ацил-КоА субстратів, ЕТК-КоА і ДПК-КоА.
Елонгази
Біохімічні докази наводять на думку про те, що елонгація жирної кислоти складається з 4-х стадій: конденсація, відновлення, дегідратація і друге відновлення. В контексті цього винаходу, «елонгаза» позначає поліпептид, що каталізує стадію конденсації в присутності інших членів комплексу елонгації, у відповідних фізіологічних умовах. Показано, що гетерологічна або гомологічна експресія в клітині тільки конденсуючого компоненту («елонгаза») комплексу елонгації білка потрібна для елонгації відповідного ацильного ланцюга. Тому, введена елонгаза може успішно рекрутувати відновлювальну і дегідратувальну активність з трансгенного хазяїна, бо з метою здійснення успішної елонгації ацилу. Вважається, що за специфічність реакції елонгації щодо довжини ланцюга і ступеня десатурації жирнокислотних субстратів відповідає компонент конденсації. Крім того, вважається, що цей компонент є обмежуючим швидкість в реакції елонгації.
В цьому документі «Аб-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати ЕПК на ДПК.
Приклади Д5-елонгаз включають розкриті у УУМО2005/103253. В одному варіанті реалізації винаходу Д5-елонгаза володіє активністю по відношенню до ЕПК з утворенням ДПК із ефективністю щонайменше 60 95, більш переважно щонайменше 65 95, більш переважно щонайменше 70 95 або найбільш переважно щонайменше 80 95 або 90 95. В додатковому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот А5-елонгази представлена 5ЕО ІЮ МО: 25, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 47 95 ідентичною 5ЕО ІО МО: 25. У подальшому варіанті реалізації винаходу Дб-елонгаза походить з
О5ігеососсиз їацгії або О5ігеососси5 Іюшсітагіпи5 (052010/088776).
В цьому документі «Дб-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати СДК на ЕТК.
Приклади Дб-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену 5ЕО ІЮО МО: 16, її біологічно активний фрагмент (наприклад, фрагмент, розкритий як 5ЕО ІЮ МО: 17), або послідовність амінокислот, щонайменше на 55 95 ідентичну одній або обом з ЗЕО ІЮО МО: 16 або 5ЕО ІЮО МО: 17. У варіанті реалізації винаходу Аб-елонгаза одержана з Рпузсоптійгеїйа раїеп5 (7апК еї аІ., 2002; номер доступу АЕ428243) або Таїіазвіовіга рзейдопапа (Виї2-І оре? єї аї., 2012).
В цьому документі «ЛУ-елонгаза» щонайменше здатна перетворювати АЛК на ЕТРрК.
Приклади Де9-елонгаз включають наведені в Табл. 1. В одному варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДУ-елонгази представлена ЗЕО ІЮ МО: 29, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 80 95 ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 29.
В іншому варіанті реалізації ДУ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в
ЗЕО ІЮО МО: 31, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 81 95 ідентичну 5ЕО ІО МО: 31. У іншому варіанті реалізації ДУ-елонгаза містить послідовність амінокислот, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 33, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 50 9о ідентичну 5ЕО ІЮО МО: 33. В іншому варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ДЛУ-елонгази представлена 5ЕО ІЮ МО: 35, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот, щонайменше на 81 95 ідентичною 5ЕО
ІО МО: 35. У подальшому варіанті реалізації винаходу Л9-елонгаза володіє вищою активністю по відношенню до 06 субстрату, ніж відповідного 003 субстрату, або навпаки.
В цьому документі термін «володіє вищою активністю по відношенню до субстрату об, ніж відповідного субстрату 03» позначає відносну активність ферменту по відношенню до субстратів, яка відрізняється за активністю 003 десатурази. Переважно субстрат об являє собою
ЛК, і субстрат 03 являє собою АЛК.
Елонгаза з активністю Дб-елонгази і ДУ-елонгази щонайменше здатна (ї) перетворювати
СДК на ЕТК і (ії) перетворювати АЛК на ЕТрК, а також володіє вищою активністю Аб-елонгази, ніж активністю ЛУ-елонгази. В одному варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє ефективністю перетворення СДК з утворенням ЕТК, яка становить щонайменше 50 95, більш переважно щонайменше 60 95, та/або ефективністю перетворення АЛК з утворенням ЕТрК, яка становить щонайменше б 95 або більш переважно щонайменше 9 95. В іншому варіанті реалізації винаходу елонгаза володіє активністю Дб-елонгази, щонайменше близько в 6,5 раз перевищуючою активність Д9-елонгази. У подальшому варіанті реалізації винаходу елонгаза не володіє активністю Д5-елонгази, яка могла би бути виявлена.
Інші ферменти
Трансгени, введені до рекомбінантної клітини, такої як мікробна клітина, або трансгенної рослини або її частини, можуть додатково кодувати ЛФААТ. В цьому документі термін «І-ацил- гліцерол-З3-фосфат ацилтрансфераза» (ЛФКАТ), що також має назву ацилтрансферази лізофосфатидинової кислоти або ацил-КоА-лізофосфатидат-ацилтрансферази, позначає білок, який ацилює 5п-1-ацил-гліцерол-З-фосфат (5п-1 (-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням фосфатидної кислоти (ФК). Таким чином, термін «активність І-ацил-гліцерол-З3-фосфат ацилтрансферази» позначає ацилування (5п-1 (3-3-Р) в положенні 5п-2, з утворенням ФК (ЄС 2.3.1.51). Переважними ЛФКАТ є такі, що можуть використовувати поліненасичений С22 ацил-
КоА як субстрат, для перенесення поліненасиченої групи ацилу С22 в положення 5п-2 ЛФК, з утворенням ФК. У варіанті реалізації поліненасичений С22 ацил-КоА є ДГК-КоА та/або ДПК-КоА.
Приклади таких ЛФКАТ наведені в Прикладі 13 і можуть бути протестовані, як розкрито в цьому документі. У варіанті реалізації винаходу послідовність амінокислот ЛФКАТ, придатна у відповідності до винаходу, представлена будь-якою з 5ЗЕО ІЮ МО: 40-46, її біологічно активним 60 фрагментом або послідовністю амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичною будь-якій із ФЕО
ІЮО МО: 40-46. У іншому варіанті реалізації ЛФААТ не містить послідовності амінокислот, представленої в будь-якій із 5ЕО ІО МО: 44. У переважному варіанті реалізації ЛФААТ, придатна у відповідності до винаходу, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, переважно ДГК-КоА та/або ДПК-КоА, містить послідовність амінокислот, представлену в будь-якій із ЗЕО ІЮ МО: 41, 42 і 44, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичну будь-якій одній або більше із ФЕО ІЮ
МО: 41, 42 ії 44. У переважному варіанті реалізації ЛФААТ, придатна у відповідності до винаходу, яка може використовувати поліненасичений жирний ацил-КоА субстрат С22, переважно ДГК-КоА та/або ДПК-КоА, містить послідовність амінокислот, представлену будь- якою із БЕО ІЮ МО: 41 або 42, її біологічно активний фрагмент або послідовність амінокислот, щонайменше на 40 95 ідентичну будь-який однієї або більше із БЗЕО ІЮ МО: 41 і 42. У варіанті реалізації, у якому генетична конструкція експресує Д4-десатуразу у трансгенній клітині, та/або трансгенна клітина продукує ДГК, ЛФААТ переважно являє собою ЛФААТ, окрім ЛФААТ
МопіегеїІа аїріпа, послідовність амінокислот якої представлена як 5ЕО ІО МО: 44. Як альтернатива, якщо генетична конструкція не експресує Д4-десатурази у трансгенній клітині, та/або трансгенна клітина продукує ДПК, але не ДГК, ЛФААТ переважно являє собою ЛФААТ
МопіегеїІа аїІріпа, послідовність амінокислот якої представлена як ЗЕО ІЮ МО: 44, або іншу
ЛФААТ, що здатна використовувати ДПК-КоА як субстрат для перенесення ДПК у ЛФХ, з утворенням ДАГ, що містить ДПК у положенні 5п-2.
Трансгени, введені до рекомбінантної клітини, трансгенна рослина або її частина, можуть додатково кодувати ДГАТ. В цьому документі термін «діацилгліцерол ацилтрансфераза» (ЄС 2.3.1.20; ДГАТ), позначає білок, який переносить жирну групу ацилу з ацил-КоОА до діацилгліцерольного субстрату, з утворенням триацилгліцеролу. Тому, термін «активність діацилгліцерол ацилтрансферази» позначає перенесення ацил-КоА до діацилгліцеролу, з утворенням триацилгліцеролу. Існує три відомих види ДГАТ, позначені як ДГАТІ, ДГАТЗ2 і
ДГАТЗ, відповідно. Поліпептиди ДГАТІ звичайно містять 10 трансмембранних доменів, ДГАТ2 звичайно містять 2 трансмембранних домени, тоді як ДГАТЗ звичайно є розчинним. Приклади поліпептидів ДГАТІ включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТІ з АзрегойШив Тштідашве (номер доступу ХР 755172), Агарідорзів ІНаійапа (САВ44774), Вісіпив соттипів (ААНІ11479),
Метісіа гогаї (АВС94472), Метопіа даіатепвіє (АВМ21945, АВМ21946), Епопутив аїайшв (ААУЗ31083), Саєпогпнараїй5 єієдапе (ААЕ82410), Вайив пог/едісиз (МР 445889), Ното зарієп5 (МР 036211), а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТ2 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗО з Агабрідорзіз Іпайапа (номер доступу МР 566952), Кісіпи5 соттипіз (ААМ16324), Метісіа їогаїї (АВС94474), Мопіегейа гатаппіапа (ААК84179), Ното 5арієпе (096РО7, О58НТ5), Во іїіаштиз (070М08), Мив5 тивсшци5 (ААК84175), Місготопав5
ССМРІ1545, а також їх варіанти та/або мутанти. Приклади поліпептидів ДГАТЗ3 включають поліпептиди, кодовані генами ДГАТЗ з арахісу (Агаспіх пуродаєа, запа, еї а!., 2006), а також їх варіанти та/або мутанти.
Поліпептиди/пептиди
Терміни «поліпептид» і «білок» загалом використовуються рівнозначно.
Поліпептид або клас поліпептидів може бути визначений за ступенем ідентичності ( 95 ідентичності) його послідовності амінокислот референтній послідовності амінокислот, або за більшим 595 ідентичності одній референтній послідовності амінокислот, ніж іншій. 9 ідентичності поліпептиду референтній послідовність амінокислот звичайно визначається за аналізом САР (МеєеаІетап апа Ууспзсп, 1970; програма ССС) з параметрами штрафу на відкриття проміжку - 5 і штрафу на подовження проміжку - 0,3. Довжина послідовності запиту становить щонайменше 15 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 15 амінокислот. Більш переважно довжина послідовності запиту становить щонайменше 50 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 50 амінокислот. Більш переважно довжина послідовності запиту становить щонайменше 100 амінокислот, і аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 100 амінокислот. Навіть переважніше довжина послідовності запиту становить щонайменше 250 амінокислот, і аналіз АР вирівнює дві послідовності протягом ділянки завдовжки щонайменше 250 амінокислот. Навіть більш
Переважно аналіз САР вирівнює дві послідовності протягом їх повної довжини. Поліпептид або клас поліпептидів може володіти такою ж ферментною активністю або іншою активністю або не володіти активністю референтного поліпептиду. Переважно поліпептид володіє ферментною активністю на рівні щонайменше 10 95, щонайменше 50 95, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 від активності референтного поліпептиду.
«Біологічно активний фрагмент» є частиною поліпептиду, визначеного в цьому документі, яка зберігає певну активність повнорозмірного референтного поліпептиду, наприклад, володіючою активністю десатурази та/або елонгази або іншою ферментною активністю.
Біологічно активні фрагменти в цьому документі виключають повнорозмірний поліпептид.
Біологічно активні фрагменти можуть бути частиною будь-якого розміру, до тих пір, поки вони зберігають певну активність. Переважно біологічно активний фрагмент зберігає щонайменше 10
Фо, щонайменше 50 9565, щонайменше 75 95 або щонайменше 90 95 активності повнорозмірного білка.
Щодо певного поліпептиду або ферменту, необхідно розуміти, що 95 ідентичності, перевищуючий розкриті в цьому документі, включає переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 95 ідентичності, Переважно щоб поліпептид/фермент містив послідовність амінокислот, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 76 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99, 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентична вказаній у зв'язку з нею 5ЕО ІЮ МО.
Варіанти/мутанти амінокислотної послідовності поліпептидів, розкритих в цьому документі, можуть бути одержані шляхом введення відповідних модифікацій нуклеотидів до нуклеїнової кислоти, розкритої в цьому документі, або синтезу цільового поліпептиду іп мйго. Такі варіанти/мутанти включають, наприклад, делеції, інсерції або заміни залишків в межах послідовності амінокислот. Комбінація делеції, вставки і заміни може бути здійснена таким
Зо чином, щоб одержати кінцеву конструкцію, за умови, що кінцевий пептидний продукт володіє бажаною ферментною активністю.
Мутантні (модифіковані) пептиди можуть бути одержані із застосуванням будь-якої методології, відомої з рівня техніки. Наприклад, полінуклеотид, розкритий в цьому документі, може бути оброблений методами мутагенезу іп міго або тасування ДНК, як детально описано
Нагауата (1998). Скринінг продуктів, які одержують з видозміненої/модифікованої ДНК, може бути з легкістю здійснений із застосуванням способів, розкритих в цьому документі, для визначення того, чи володіють вони, наприклад, десатуразною або елонгазною активністю.
При конструюванні мутантів послідовності амінокислот, місцеположення сайту мутації і природа мутації залежатимуть від характеристики(ик), яку модифікують. Сайти для мутації можуть бути модифіковані індивідуально або посерійно, наприклад, шляхом: (1) заміни спочатку вибраних консервативних амінокислот, а потім більш радикальних замін, в залежності від досягнутих результатів, (2) видалення залишку-мішені, або (3) вставки інших залишків, суміжних з розміщеним сайтом.
Делеції в амінокислотній послідовності загалом варіюють від близько 1 до 15 залишків, переважніше від близько 1 до 10 залишків і звичайно близько від 1 до 5 суміжних залишків.
У мутантах заміни видалений щонайменше один залишок амінокислоти в молекулі поліпептиду, та інший залишок вставлений на його місце. Найцікавіші положення для мутагенезу шляхом заміни включають сайти, що не є консервативними в природних десатуразах або елонгазах. Заміни в таких сайти переважно здійснюються відносно консервативним чином, з метою збереження активності ферменту. Такі консервативні заміни проілюстровані в Табл. З під заголовком «приклади замін».
У переважному варіанті реалізації винаходу мутантний/варіантний поліпептид містить тільки або не більше ніж одну або дві або три або чотири консервативні модифікації амінокислот, в порівнянні з природним поліпептидом. Подробиці консервативних модифікацій амінокислот наведені в Табл. 3. Як буде зрозуміле кваліфікованому фахівцю, такі незначні модифікації можуть в розумних межах бути спрогнозовані як не впливаючі на активність поліпептиду при експресії в рекомбінантній клітині.
Полінуклеотиди
Крім того, у винаході розкриваються та/або застосовуються полінуклеотиди, які можуть бути, 60 наприклад, геном, виділеним полінуклеотидом, химерною генетичною конструкцією, такою як молекула Т-ДНК або химерна ДНК. Це може бути ДНК або РНК геномного або синтетичного походження, двохланцюгова або одноланцюгова, а також комбінована з вуглеводом, ліпідами, білком або іншими матеріалами з метою здійснення конкретної активності, розкритої в цьому документі. Термін «полінуклеотид» використовується в цьому документі рівнозначно з терміном «молекула нуклеїнової кислоти».
У варіанті реалізації полінуклеотид не є природним. Приклади неприродних полінуклеотидів включають, але не обмежуючись цим, мутантні (наприклад, одержані із застосуванням способів, описаних у даному описі), і полінуклеотиди, у яких відкрита рамка зчитування, що кодує білок, функціонально пов'язана із промотором, з яким вона не пов'язана в природі (як, наприклад, у конструкціях, описаних у даному описі).
Таблиця З
Приклади замін
Приклади замін залишок пе() бМешхмараа./////777777771С
Рю(Р) фФу 77777711
В цьому документі термін «ген» використовується в найширшому контексті і включає дезоксирибонуклеотидні послідовності, що містять транскрибовану ділянку і, у випадку трансляції, ділянка кодування білка структурного гена, включаючи послідовності, розміщені суміжно з кодуючою ділянкою на 5' і 3' кінцях, на відстані щонайменше близько 2 тисячі пар основ на будь-якому кінці, що беруть участь в експресії гена. В цьому відношенні, ген містить контрольні сигнали, наприклад, промотори, енхансери, сигнали термінації та/або поліаденілювання, які в природі асоційовані з даним геном, або гетерологічні контрольні сигнали, і в цьому випадку ген носить назву «Химерного гена». Послідовності, що розміщені на 5 кінці кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 5' нетрансльовані послідовності. Послідовності, що розміщені на 3' кінці або нижче по відношенню до кодуючої білок ділянки, і які присутні на мРНК, позначаються як 3' нетрансльовані послідовності. Термін «ген» включає кКДНК і геномні форми гена. Геномна форма або клон гена містить кодуючу ділянку, що може перериватися некодуючими послідовностями під назвою «інтрони» або «проміжні ділянки» або «проміжні послідовності». Інтрони являють собою сегменти гена, транскрибовані в ядерну РНК (гетерогенну ядерну РНК, гяЯРНК). Інтрони можуть містити регуляторні елементи, наприклад, енхансери. Інтрони видаляють або «зрощують» з ядерним або первинним транскриптом; таким чином, інтрони відсутні в транскрипті матричної РНК
Зо (мРНК). Функція мРНК в ході трансляції полягає в конкретизації послідовності або порядку амінокислот у виникаючому поліпептиді. Термін «ген» включає синтетичну або злиту молекулу, що кодує повнорозмірні білки або їх частини за винаходом, розкриті в цьому документі, і нуклеотидну послідовність, комплементарну до будь-якої із згаданих вище.
В цьому документі «химерна ДНК» або «химерна генетична конструкція» або подібний вираз позначає будь-яку молекулу ДНК, що не є природною молекулою ДНК в її природному місцеположенні, яка також позначається в цьому документі як «конструкція ДНК». Як правила, химерна ДНК або химерний ген містить регуляторну і транскрибовану або кодуючу білок послідовності, які не знайдені функціонально пов'язаними одна з однією в природі, тобто які є гетерологічними по відношенню одна до одної. Відповідно, химерна ДНК або химерний ген можуть містити регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з різних джерел, або регуляторні послідовності і кодуючі послідовності, що походять з одного джерела, але організовані в інший спосіб, ніж знайдені в природі. «Ендогенний ген» позначає природний ген в його природному положенні в геномі організму.
В цьому документі «молекула рекомбінантної нуклеїнової кислоти», «рекомбінантний полінуклеотид» або їх варіації позначають молекулу нуклеїнової кислоти, що конструюється або модифікується за допомогою технології рекомбінантної ДНК. Терміни «чужорідний полінуклеотид» або «екзогенний полінуклеотид» або «гетерологічний полінуклеотид» і подібні позначають будь-яку нуклеїнову кислоту, що введена в геном клітини за допомогою експериментальних маніпуляцій. Чужорідні або екзогенні гени можуть являти собою гени, вставлені в неприродний організм, природні гени, що введені в нове місцеположення в межах природного хазяїна, або химерні гени. «Трансген» є геном, що введений в геном процедурою трансформації. Терміни «генетично модифікований», «трансгенний» та їх варіації включають введення генів в клітини шляхом трансформації або трансдукції, мутацію генів в клітинах і модифікацію або модуляцію регуляції гена в клітині або організмах, над якими здійснювалися вказані дії, або їх потомстві. «Геномна ділянка» в цьому документі позначає положення в межах геному, в якому трансген або група трансгенів (також позначена в цьому документі як кластер) вставлені в клітину або її предка. Такі ділянки включають тільки нуклеотиди, що введені в результаті втручання людини, наприклад, за способами, розкритими в цьому документі.
Термін «екзогенний» в контексті полінуклеотиду позначає полінуклеотид, присутній в клітині в модифікованій кількості, в порівнянні з його природним станом. В одному варіанті реалізації винаходу клітина є клітиною, що в природі не містять полінуклеотиду. Однак, клітина може бути клітиною, яка містить не ендогенний полінуклеотид, що приводить до зміни рівня продукування кодованого поліпептиду. Екзогенний полінуклеотид за винаходом включає полінуклеотиди, що не відокремлені від інших компонентів трансгенної (рекомбінантної) клітини або неклітинної системи експресії, в якій вони присутні, і полінуклеотиди, продуковані в таких клітинах або неклітинних системах, які в подальшому були очищені щонайменше від деяких інших компонентів. Екзогенний полінуклеотид (нуклеїнова кислота) може бути безперервним ланцюгом нуклеотидів, існуючим в природі, або містити дві або більше суміжних нуклеотидних ділянок з різних джерел (природних та/або синтетичних), сполучені таким чином, щоб утворити єдиний полінуклеотид. Звичайно такі химерні полінуклеотиди містять щонайменше відкриту рамку зчитування, що кодує поліпептид за винаходом, функціонально пов'язаний з промотором, придатним для управління транскрипцією відкритої рамки зчитування в цільовій клітині.
Щодо розкритих полінуклеотидів, необхідно розуміти, що вищий 95 ідентичності, ніж розкриті вище, включатиме переважні варіанти. Таким чином, якщо це доречно, у світлі мінімального 90 ідентичності, полінуклеотид переважно містить полінуклеотидну послідовність, яка є щонайменше на 60 95, більш переважно щонайменше на 65 95, більш переважно щонайменше на 70 95, більш переважно щонайменше на 75 95, більш переважно щонайменше на 80 95, більш переважно щонайменше на 85 95, більш переважно щонайменше на 90 95, більш переважно щонайменше на 91 95, більш переважно щонайменше на 92 95, більш переважно щонайменше на 93 95, більш переважно щонайменше на 94 95, більш переважно щонайменше на 95 95, більш переважно щонайменше на 96 95, більш переважно щонайменше на 97 95, більш переважно щонайменше на 98 95, більш переважно щонайменше на 99 95, більш переважно щонайменше на 99,1 95, більш переважно щонайменше на 99,2 95, більш переважно щонайменше на 99,3 95, більш переважно щонайменше на 99,4 95, більш переважно щонайменше на 99,5 95, більш переважно щонайменше на 99,6 95, більш переважно щонайменше на 99,7 95, більш переважно щонайменше на 99,8 95, і навіть більш переважно щонайменше на 99,9 95 ідентичною відповідній вказаній 5ЕО ІЮ МО.
Полінуклеотиди за винаходом можуть містити, в порівнянні з молекулами, що зустрічаються в природі, одну або більше мутацій, що являють собою делеції, вставки або заміни нуклеотидних залишків. Полінуклеотиди, що містять мутації відносно референтної послідовності, можуть бути природними (тобто, виділеними з природного джерела) або синтетичними (наприклад, одержаними в результаті сайт-спрямованого мутагенезу або бо тасування ДНК з нуклеїнової кислоти, як розкрито вище). Таким чином, очевидно, що полінуклеотиди за винаходом можуть бути одержані з природного джерела або можуть бути рекомбінантними. Переважними полінуклеотидами є такі, що містять кодуючі ділянки, кодон- оптимізовані для трансляції в клітинах рослини, як відомо з рівня техніки.
Рекомбінантні вектори
Рекомбінантна експресія може застосовуватися для одержання рекомбінантних клітин або рослин або частин рослини за винаходом. Один варіант реалізації цього винаходу включає рекомбінантний вектор, який містить щонайменше одну молекулу полінуклеотиду, розкриту в цьому документі, вставлену в будь-який вектор, здатний доставити молекулу полінуклеотиду в клітину-хазяїна. Рекомбінантні вектори включають вектори експресії. Рекомбінантні вектори містять гетерологічні полінуклеотидні послідовності, тобто, полінуклеотидні послідовності, що в природі не знайдені суміжними з молекулами полінуклеотиду, розкритими в цьому документі, які переважно одержані з інших видів, ніж ті, 3 яких одержана(и) молекула(и) полінуклеотиду.
Вектор може являти собою РНК або ДНК, і звичайно є плазмідою. Плазмідні вектори звичайно містять додаткові послідовності нуклеїнових кислот, які забезпечують простоту селекції, ампліфікації і трансформації касети експресії в прокаріотних клітинах, наприклад, одержані з рис вектори, одержані з реК вектори, одержані з РОЕМ вектори, одержані з роР вектори, одержані з рВ5 вектори, або переважно бінарні вектори, що містять одну або більш ділянок Т-
ДНК. Додаткові послідовності нуклеїнових кислот включають джерела реплікації для забезпечення автономної реплікації вектора, гени селекційних маркерів, переважно кодуючі резистентність до антибіотика або гербіциду, унікальні множинні сайти клонування, які забезпечують множинні сайти вставки послідовностей нуклеїнових кислот або генів, кодованих в конструкції нуклеїнової кислоти, і послідовності, які підвищують активність трансформації прокаріотних і еукаріотних (особливо рослинних) клітин. Рекомбінантний вектор може містити більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, три, чотири, п'ять або шість полінуклеотидів, розкритих в цьому документі, в комбінації, переважно химерну генетичну конструкцію за винаходом, в якій кожен полінуклеотид функціонально пов'язаний з послідовностями контролю експресії активними в цільовій клітині. Більш ніж один полінуклеотид, розкритий в цьому документі, наприклад, 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів, переважно ковалентно сполучені в єдиному рекомбінантному векторі, переважно в межах єдиної молекули Т-ДНК, яка в подальшому може бути введена як єдина молекула в клітину, з одержанням рекомбінантній клітини за винаходом, і переважно інтегрована в геном рекомбінантної клітини, наприклад, в трансгенній рослині. Таким чином, полінуклеотиди, сполучені у такий спосіб, будуть успадковуватися разом як єдиний генетичний локус у нащадка рекомбінантної клітини або рослини. Рекомбінантний вектор або рослина може містити два або більше таких рекомбінантних векторів, кожен з яких містить декілька полінуклеотидів, наприклад, кожен рекомбінантний вектор містить 3, 4, 5 або 6 полінуклеотидів. «Функціонально пов'язаний» в цьому документі позначає функціональне взаємовідношення між двома або більш сегментами нуклеїнової кислоти (наприклад, ДНК). Як правило, це позначає функціональне взаємовідношення транскрипційного регуляторного елементу (промотору) і транскрибованої послідовності. Наприклад, промотор функціонально пов'язаний з кодуючою послідовністю, такою як полінуклеотид, розкритий в цьому документі, якщо він стимулює або модулює транскрипцію кодуючої послідовності у відповідній клітині. Загалом, транскрипційні регуляторні елементи промотору, які функціонально пов'язані з транскрибованою послідовністю, є фізично суміжними з транскрибованою послідовністю, тобто, вони є сіз-діючими. Однак, для деяких транскрипційних регуляторних елементів, таких як енхансери, немає необхідності бути фізично суміжними або розташованими в безпосередній близькості від кодуючих послідовностей, транскрипцію яких вони збільшують.
Якщо присутні декілька промоторів, кожен промотор незалежно може бути таким же або іншим. Переважно, щонайменше З і максимум до б різних промоторних послідовностей застосовуються в рекомбінантному векторі, щоб управляти експресією екзогенних полінуклеотидів.
Крім того, рекомбінантні молекули, наприклад, химерні ДНК або генетичні конструкції, можуть містити: (а) один або більш секреторних сигналів, що кодують сигнальні пептидні послідовності, щоб дозволити експресованому поліпептиду, розкритому в цьому документі, секретуватися з клітини, яка продукує поліпептид, або яка забезпечує локалізацію експресованого поліпептиду, наприклад, для утримання поліпептиду в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР) клітини або перенесення в пластиду, та/або (б) химерні послідовності, які приводять до експресії молекул нуклеїнових кислот у вигляді химерних білків. Приклади відповідних сигнальних сегментів включають будь-який сигнальний сегмент, здатний бо спрямовувати секрецію або локалізацію поліпептиду, розкритого в цьому документі. Додатково,
рекомбінантні молекули можуть містити проміжні та/або нетрансльовані послідовності, навколо та/або в межах послідовностей нуклеїнових кислот молекул нуклеїнових кислот, розкритих в цьому документі.
Для спрощення ідентифікації трансформантів, бажано, щоб конструкція нуклеїнової кислоти містила ген селекційного або скринінгового маркера у вигляді або на додаток до чужорідного або екзогенного полінуклеотиду. «Ген маркера» позначає ген, який надає відмінного фенотипу клітинам, що експресують ген маркера, таким чином, що трансформовані клітини відрізняються від клітин, які не містять маркера. Ген селекційного маркера забезпечує ознаку, за якою можна «здійснювати селекцію» на базі резистентності до селекційного агента (наприклад, гербіцид, антибіотик, випромінювання, нагрівання або інший вид обробки, ушкоджуючий нетрансформовані клітини). Ген придатного для скринінгу маркера (або репортерний ген) забезпечує ознаку, за якою можна ідентифікувати, шляхом спостереження або тестування, наприклад, за допомогою «скринінгу» (наприклад, активність ВД-глюкуронідази, люциферази, зеленого флуоресцентного білка (ЗФБ) або іншого ферменту, відсутню в нетрансформованих клітинах). Ген маркера і цільова нуклеотидна послідовність не обов'язково повинні бути пов'язаними. Фактично, вибір маркера не є критичним, до тих пір, поки він є функціональним (тобто, селективним) в поєднанні з клітинами вибору, такими як рослинна клітина.
Прикладами селекційних маркерів є маркери, що забезпечують резистентність до антибіотиків, наприклад, резистентність до ампіциліну, еритроміцину, хлорамфеніколу або тетрацикліну, переважно резистентність до канаміцину. Приклади селекційних маркерів для селекції рослин включають, без обмеження, ген пуд, який кодує резистентність до гігроміцину В; ген неоміцин фосфотрансферази (прі), що забезпечує резистентність до канаміцину, паромоміцину, (5418; ген глутатіон-5-трансферази з печінки щурів, що забезпечує резистентність до гербіцидів-похідних глутатіону, наприклад, таких як, розкриті у ЕР 256223; ген глутамінсинтетази, що при надмірній експресії забезпечує резистентність до інгібіторів глутамінсинтетази, таких як фосфінотрицин, наприклад, розкритий у УМО 87/05327, ген ацетилтрансферази із Бігеріотусе5 мігідоспготодепе5, що забезпечує резистентність до селекційного агента фосфінотрицину, наприклад, розкритий у ЕР 275957, ген, що кодує 5- єнолшикімат-3З-фосфат синтазу (ЄШФОС), що забезпечує переносимість М-
Зо фосфонометилгліцину, наприклад, розкритий Ніпспеєе еї аї. (1988), або переважно ген Баг, що забезпечує резистентність до біалафосу, наприклад, розкритий у УМО91/02071.
Переважно конструкція нуклеїнової кислоти стабільно інкорпорована в геном клітини, наприклад, рослинної клітини. Відповідно, нуклеїнова кислота може містити відповідні елементи, які дозволяють молекулі інкорпоруватися в геном, переважно послідовності правої і лівої меж молекули Т-ДНК, або конструкція розміщена у відповідному векторі, який може бути інкорпорований в хромосому клітини.
Експресія
В цьому документі вектор експресії являє собою вектор ДНК, що здатний трансформувати клітину-хазяїна і здійснювати експресію однієї або більше вказаних молекул полінуклеотиду.
Переважні вектори експресії за даним винаходом можуть керувати експресією гена в дріжджових та/або рослинних клітинах. Вектори експресії, придатні у відповідності до винаходу, містять регуляторні послідовності, наприклад, послідовності для контролю транскрипції, послідовності для контролю трансляції, джерела реплікації та інші регуляторні послідовності, сумісні з рекомбінантною клітиною, які контролюють експресію молекул полінуклеотиду за даним винаходом. Зокрема, полінуклеотиди або вектори, придатні у відповідності до цього винаходу, містять послідовності для контролю транскрипції. Послідовності для контролю транскрипції є послідовностями, які контролюють ініціацію, елонгацію і термінацію транскрипції.
Особливо важливими послідовностями для контролю транскрипції є такі, які контролюють ініціацію транскрипції, наприклад, послідовності промотору та енхансера. Відповідні послідовності для контролю транскрипції включають будь-яку послідовність для контролю транскрипції, яка може функціонувати щонайменше в одній з рекомбінантних клітин за даним винаходом. Вибір використовуваних регуляторних послідовностей залежить від організму- мішені, такого як рослина, та/або органу-мішені або цільової тканини. Такі регуляторні послідовності можуть бути одержані з будь-якого еукаріотного організму, такого як рослини, або віруси рослин, або можуть бути хімічно синтезовані. Численні такі послідовності для контролю транскрипції відомі фахівцям з рівня техніки. Особливо переважними послідовностями для контролю транскрипції є промотори, що активно спрямовують транскрипцію в рослинах, конститутивно або специфічним для стадії та/або тканини чином, в залежності від використання рослини або її частин.
Ряд векторів, придатних для стабільної трансфекції рослинних клітин або одержання трансгенних рослин, описаний, наприклад, у Рошмеї5 еї аї., Сіопіпуд Месіоге: А І арогагу МапаиаїЇ, 1985, зирр. 1987; М/єіз5расі апа М/еізвбаси, Меїпосдіз Тог Ріапі МоїІесціаг Віоіоду, Асадетіс Ргевв5, 1989; ії Сеїмп еї аї., Ріапі МоІесшаг Віоюду Мапиаї, Кісу'ег Асадетіс Рибіїєпег5, 1990. Як правила, вектори експресії в рослинах містять, наприклад, один або більше клонованих генів рослини під транскрипційним контролем 5' і 3 регуляторних послідовностей і домінантний селекційний маркер. Додатково, такі вектори експресії в рослинах можуть містити регуляторну ділянку промотору (наприклад, регуляторна ділянка, що контролює індуцибельну або конститутивну, регульовану умовами навколишнього середовища або стадією розвитку, або клітинно- або тканиноспецифічну експресію), старт-сайт ініціації транскрипції, сайт зв'язування з рибосомою, сигнал процесингу РНК, сайт термінації транскрипції та/або сигнал поліаденілювання.
Описаний цілий ряд конститутивних промоторів, які активні в клітинах рослини. Придатні промотори для конститутивної експресії в рослинах включають, без обмеження, промотор 355 вірусу мозаїки цвітної капусти (СамуМм), 355 мозаїчного вірусу ранника шишкуватого (ЕММ) та індуцибельний світлом промотор з маленької субодиниці рибулозо-1,5-біс-фосфат карбоксилази.
З метою експресії у вихідних тканинах рослини, таких як листя, насіння, коріння або стебло, промоторам, використовуваним у відповідності до цього винаходу, переважно властива відносно висока експресія в цих конкретних тканинах. Численні приклади добре відомі з рівня техніки. Крім того, різноманітні промотори рослинних генів, що регулюються у відповідь на екологічні, гормональні, хімічні та/або пов'язані із розвитком сигнали, також можуть використовуватися для експресії генів у клітинах рослини, або може бути переважним використання орган-специфічних промоторів.
В цьому документі термін «промотор, специфічний для насіння» або його варіації позначає промотор, який переважно в порівнянні з іншими тканинами рослини, спрямовує транскрипцію гена в насінні рослини, що розвивається, переважно рослини виду Вгаззіса, Сатеїйпа 5аїїма або б. тах. У варіанті реалізації винаходу промотор, специфічний для насіння, експресується щонайменше в 5 разів активніше у насінні рослини, що розвивається, відносно листя та/або
Зо стебел рослини, і переважно експресується активніше в ембріоні насіння, що розвивається, в порівнянні з іншими тканинами рослини. Переважно промотор тільки спрямовує експресію цільового гена в насінні, що розвивається, та/або експресія цільового гена у інших частинах рослини, таких як листя, не може бути виявлена нозерн-блотингом та/або ЗТ-ПЛР. Звичайно, промотор контролює експресією генів в процесі росту і розвитку насіння, зокрема, в ході фази синтезу і акумуляції запасних речовин в насінні. Такі промотори можуть контролювати експресією гена в суцільному запасному органі рослини або тільки в його частині, наприклад, оболонці насіння або сім'ядолі(ях), переважно в ембріонах, у насінні дводольних рослин або ендоспермі або алейроновому шарі насіння однодольних рослин.
Переважні промотори специфічної для насіння експресії включають: ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі жирних кислот та їх акумуляції в насінні, наприклад, десатурази і елонгази жирних кислот, ії) промотори з генів, що кодують запасні білки для зберігання в насінні, і ії) промотори з генів, що кодують ферменти, які беруть участь в біосинтезі вуглеводів та їх акумуляції в насінні. Придатними специфічними для насіння промоторами є промотор гена напіну олійної рапсу (05 5608152), промотор ОБР Місіа Тара (Вайтіеїп еї аї., 1991), промотор олеозину Агарідорзі5 (МУ098/45461), промотор фазеоліну
РІпазеоїих миїдагіє (05 5504200), промотор Все4 Вгаззіса (М/091/13980) або промотор легуміну
І еВ4 з Місіа тара (Вашитівїп еї аї., 1992), і промотори, які забезпечують специфічну для насіння експресію в однодольних, таких як маїс, ячмінь, пшениця, жито, рис, тощо. Як придатні слід зазначити такі промотори: промотор гена Ірі2 або Іри ячменю (М/095/15389 і ММО95/23230) або промотори, розкриті у УМО99/16890 (промотори з гена гордеїну ячменю, гена глютеліну рису, гена оризину рису, гена проламіну рису, гена гліадину пшениці, гена глютеліну пшениці, гена зеїну маїсу, гена глютеліну вівса, гена казирину сорго, гена секаліну жита). Інші промотори включають розкриті Вгоцп еї аї. (1998), Роїепла еї аї. (2004), 0520070192902 ї 0520030159173. У варіанті реалізації винаходу специфічний для насіння промотор переважно експресується в певних частинах насіння, таких як ембріон, сім'ядоля() або ендосперм. Приклади таких специфічних промоторів включають, без обмеження, промотор ЕР (Еїегеігот еї аї., 1996), промотор легуміну гороху (Регїтіп еї аїЇ., 2000), промотор фітогемаглютиніну боба (Регтіп еї аї., 2000), промотори конлінін 1 і конлінін 2 для генів, що кодують запасні білки 25 льону (Спепа еї а!., 2010), промотор гена ЕАЕЇ1 з Агабрідорзі5 (паіІапа, промотор ВпоІ Р. гена глобулін-подібного бо білка Вгаззіса пари, промотор І РХК гена пероксиредоксину з Гіпит изнайізвітит.
нетрансльована лідерна послідовність може бути одержана з промотору, вибраного для експресії гетерологічної послідовності гена полінуклеотиду за даним винаходом, або переважно є гетерологічною щодо ділянки, яка кодує фермент, що виробляється, і може бути специфічно модифікована, при бажанні, таким чином, щоб збільшити трансляцію мРНК. Огляд оптимізації 5 експресії трансгенів див. у Ко/іеї еї аі. (1996). Додатково, 5' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з РНК вірусів рослин (серед іншого, вірус мозаїки тютюну, вірус гравіювання тютюну, вірус карликової мозаїчності маїсу, вірус мозаїки люцерни), з відповідних еукаріотних генів, рослинних генів (лідер гена білка а/ю хлорофілу пшениці і маїсу, що зв'язується), або із синтетичної послідовності гена. Даний винахід не обмежується конструкціями, в яких нетрансльована ділянка одержана з 5' нетрансльованої послідовності, супроводжуючої послідовність промотору. Додатково, лідерна послідовність може бути одержана із неспорідненого промотору або кодуючої послідовності. Лідерні послідовності, придатні в контексті цього винаходу, включають лідер Нер70 маїсу (05 5362865 і 05 5859347) і омега- елемент вірусу мозаїки тютюну (ТММ).
Термінація транскрипції забезпечується 3 нетрансльованою послідовністю ДНК, функціонально пов'язаною в химерному векторі з цільовим полінуклеотидом. 3' нетрансльована ділянка рекомбінантної молекули ДНК містить сигнал поліаденілювання, функція якого в рослинах полягає у забезпеченні додавання аденілатних нуклеотидів до 3 кінця РНК. 3' нетрансльовані ділянки можуть бути одержані з різноманітних генів, які експресуються в клітинах рослин. У такому випадку звичайно використовуються 3' нетрансльована ділянка нопалінсинтази, 3 нетрансльована ділянка з маленької субодиниці гена Кибібсо гороху, 3' нетрансльована ділянка з гена запасного білка 75 насіння сої або гена конлініну льону. Крім того, придатними є 3' транскрибовані, нетрансльовані ділянки, що містять поліаденілатний сигнал індукуючих пухлину (Ті) Адгобасіегішт плазмідних генів.
Технології рекомбінантної ДНК можуть застосовуватися для покращення експресії трансформованої молекули полінуклеотиду, шляхом маніпуляції, наприклад, кількістю копій молекули полінуклеотиду в межах клітини-хазяїна, ефективністю, з якою такі молекули полінуклеотиду транскрибуються, ефективністю, з якою транслюються копії, що утворюються в результаті, та ефективністю посттрансляційних модифікацій. Рекомбінантні методи, придатні
Зо для збільшення експресії молекул полінуклеотиду, розкритих в цьому документі, включають, без обмеження, інтеграцію молекули полінуклеотиду в одну або більше хромосом клітини-хазяїна, введення стабілізуючих послідовностей в мРНК, заміни або модифікації сигналів контролю транскрипції (наприклад, промотори, оператори, енхансери), заміни або модифікації сигналів контролю трансляції (наприклад, сайти зв'язування з рибосомою, послідовності Шайна-
Дальгарно), модифікацію молекул полінуклеотиду для відповідності використанню кодонів в клітині-хазяїні і делецію послідовностей, що дестабілізують транскрипти.
Трансгенні рослини
Термін «рослина» в цьому документі як іменник позначає суцільні рослини, але при використанні в ролі прикметника («рослинний») позначає будь-яку субстанцію, в якій присутній, одержану з, що походить із або пов'язану з рослиною, наприклад, органи рослини (такі як листя, стебла, коріння, квіти), одиничні клітини (такі як пилок), насіння, рослинні клітини, тощо. Термін «частина рослини» позначає всі частини рослини, які містять ДНК рослини, зокрема, вегетативні структури, наприклад, листя або стебла, коріння, квіткові органи або структури, пилок, насіння, частини насіння, такі як ембріон, ендосперм, щиток зародка або оболонка насіння, тканину рослини, таку як судинна тканина, клітини і їх потомство, до тих пір, поки частина рослини синтезує ліпід за винаходом. «Трансгенна рослина», «генетично модифікована рослина» або їх варіації позначають рослину, яка містить генетичну конструкцію («трансген»), не знайдену в рослині дикого типу такого ж виду, різновиди або сорти. Трансгенні рослини в контексті цього винаходу включають рослини та їх потомство, генетично модифіковані із застосуванням рекомбінантних методів, що приводить до продукування ліпіду або щонайменше одного поліпептиду, розкритого в цьому документі, у цільовій рослині або органі рослини. Трансгенні клітини рослини і трансгенні частини рослини мають відповідне значення. «Трансген» в цьому документі має звичайне значення для даної галузі біотехнології і містить генетичну послідовність, яка одержана або модифікована технологією рекомбінації ДНК або РНК, і яка введена до клітини рослини.
Трансген може містити генетичні послідовності, одержані з клітини рослини, яка може належати до того ж виду, різновиду або сорту, що і клітина рослини, до якої введений трансген, або до іншого виду, різновиду або сорту, або з клітини, що не є рослинною. Звичайно, трансген вводять до клітини, наприклад, рослинної, шляхом маніпуляції людиною, наприклад,
трансформації, причому може застосовуватися будь-який спосіб за рішенням фахівця в цій галузі техніки.
Терміни «насіння» і «зерно» в цьому документі використовуються рівнозначно. «Зерно» позначає зріле зерно, наприклад, зібране в процесі збору врожаю зерно, або зерно, яке ще знаходиться на рослині, але готове для збору врожаю, а також може позначати насіння після набухання або проростання, згідно контексту. Зріле зерно або насіння звичайно містить вологу в кількості менше, ніж близько 18-20 95, переважно менш ніж 10 95. Вміст вологи в насінні
Вгазвзіса, наприклад, насінні рапсу у зрілому стані звичайно становить близько 4-8 95 або 6-8 95, переважно від близько 4 956 до близько б 95. «Насіння, що розвивається» в цьому документі позначає насіння до настання зрілості, звичайно знайдене в репродуктивних структурах рослини після запліднення або цвітіння, але може також позначати таке насіння до настання зрілості, яке виділено з рослини.
В цьому документі термін «одержання частини рослини» або «одержання насіння» позначає будь-які засоби для одержання частини рослини або насіння, відповідно, зокрема, збір урожаю частин рослини або насіння з рослин у полі або в закритому просторі, такому як теплиця або камера для росту, або придбання або одержання від постачальника частин рослини або насіння. Стандартні умови росту в теплиці включають денну температуру 22-242С і нічну температуру 16-182С, із природним сонячним світлом. Насіння може бути придатним для насадження, тобто здатним до проростання і утворення рослини-нащадка, або альтернативно, оброблено таким чином, що більше не може прорости, наприклад розколене, шліфоване або змолочене насіння, придатне для застосування при одержанні харчових продуктів або в харчуванні або для екстракції ліпіду за винаходом.
В цьому документі термін «запасаючий орган рослини» позначає частину рослини, що спеціалізується на зберіганні енергії у формі, наприклад, білків, вуглеводів, жирних кислот та/або олій. Прикладами запасаючих органів рослини є насіння, плід, бульбоподібне коріння і бульби. Переважним запасаючим органом рослини є насіння.
Рослини або частини рослин за винаходом або вживані відповідно до винаходу переважно є фенотипово нормальними. В цьому документі термін «фенотипово нормальний» позначає генетично модифіковану рослину або орган рослини, особливо запасаючий орган, такий як
Зо насіння, бульбу або плід, не володіючий істотною мірою зниженою здатністю до росту і відтворення, в порівнянні з немодифікованою рослиною або органом рослини. У варіанті реалізації винаходу генетично модифікована рослина або орган рослини, які є фенотипово нормальними, володіють здатністю до росту або відтворення, по суті такою ж, як ізогенна рослина або орган, що не містить вказаного полінуклеотиду. Переважно біомаса, темпи росту, швидкість проростання, розмір запасаючого органу, життєздатність пилку, фертильність чоловічих і жіночих рослин, розмір насіння та/або кількість утворених життєздатних зерен становить не менше 90 95 від показників рослини, яка не містить вказаного екзогенного полінуклеотиду, при вирощуванні в ідентичних умовах. Переважно життєздатність пилку рослини за винаходом або рослин, одержаних із насіння за винаходом, становить близько 100
Фо відносно життєздатності пилку відповідної рослини дикого типу. Даний термін не охоплює ознак рослини, що можуть відрізнятися від рослини дикого типу, але при цьому не впливають негативно на повноцінність рослини з точки зору комерційних цілей, наприклад, фенотип балерини листя саджанця.
Рослини, розкриті або включені для використання у практиці цього винаходу, включають однодольні рослини і дводольні рослини. В переважних варіантах реалізації рослини за даним винаходом являють собою урожайні рослини (наприклад, злакові і зернобобові, маїс, пшеницю, картоплю, тапіоку, рис, сорго, просо., маніоку, ячмінь або горох) або інші бобові. Рослини можуть бути вирощені для одержання їстівних коренів, клубенів, листя, стебел, квітів або плоду.
Рослини можуть бути овочевими або декоративними рослинами. Рослини за винаходом або придатні у відповідності до винаходу можуть являти собою: кукурудзу (7еа таув), рапс (Вгаз5іса пари5, підвид Вгазвзіса гара), гірчицю (Вгаз5зіса |псеа), льон (Гіпит изйнайбзітит), люцерну (Медісадо з5аїїма), рис (Огу;а займа), жито (Зесаїе сегаІє), сорго (Зогоапит бБісоїоиг, Зогудпит мчІдаге), соняшник (Неїїапіпи5 аппи5), пшеницю (Тгййшт аевіїмит), сою (Сіусіпе тах), тютюн (Місоїйапа їарасит), картоплю (Зоїапит іширего5ит), арахіс (Агаспіє Ппуродаєа), бавовник (Соззурішт Пігзшішит), солодку картоплю (І ортоеа Баїайш5), маніоку (Мапійої езсціепіа), каву (вид Соїеа), кокосовий горіх (Сосо5 писіїтега), ананас (Апапа сото5зиз), цитрусове дерево (вид
Сіїгиб5), какао (Пеобгота сасабс), чай (Сатеїйа зепепві5), банан (вид Миза), авокадо (Регзеа атегісапа), інжир (Ріси5 сазіса), гуаву (Рзідішт диадама), манго (Мапоіїег іпадіса), оливу (Оїєа еигораєа), папайю (Сагіса рарауа), кеш'ю (Апасагаіїшт оссідепіаіє), макадамію (Масадатіа бо іп'егогію|йа), мигдаль (Ргипи5 атудаа!ц5), цукровий буряк (Веїа мцідагів), овес або ячмінь.
У переважному варіанті реалізації винаходу рослина є покритонасінною рослиною.
У варіанті реалізації винаходу рослина є рослиною олійної культури, переважно урожайною рослиною олійної культури. В цьому документі «рослина олійної культури» є видом рослини, використовуваним для комерційного одержання олій з насіння рослини. Рослина олійної культури може бути олійним рапсом (наприклад, канола), маїсом, соняшником, соєю, сорго, льоном (насіння льону) або цукровим буряком. Крім того, рослина олійної культури може бути іншими представниками Вгаззіса5, бавовником, арахісом, маком, гірчицею, рициною звичайною, кунжутом, соняшником, сафлором, Сатеїїпа, Сгтатре або рослиною, що дає горіхи. Рослина може продукувати високі рівні олії в плоді, наприклад, олива, олійна пальма або кокосовий горіх. Садовими рослинами, до яких може бути застосований даний винахід, є салат, ендивій або хрестоцвітні овочі, включаючи капусту, броколі або цвітну капусту. Цей винахід може бути застосований до тютюну, гарбузових, моркви, суниці, помідора або перцю.
У ще одному переважному варіанті реалізації винаходу нетрансгенна рослина, використовувана для одержання трансгенної рослини за винаходом, продукує олію, особливо у насінні, яке містить: ї) менше 20 95, менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:2 та/або ії) менше 10 95 або менше 5 95 жирних кислот 18:3.
У переважному варіанті реалізації винаходу трансгенна рослина або її частина є гомозиготною по всіх і кожному гену (екзогенний полінуклеотид), що були введені (трансгену), таким чином, що її потомство не розділяється для бажаного фенотипу. Крім того, трансгенна рослина може бути гетерозиготною по введеному(им) трансгену(ам), переважно однорідно гетерозиготною по трансгену, наприклад, в потомстві ЕТ, яке вирощене з гібридного насіння.
Такі рослини можуть забезпечувати переваги, наприклад, гібридну силу, добре відому з рівня техніки, або можуть застосовуватися у розведенні і зворотному схрещуванні рослин.
Якщо це доречно, трансгенна рослина або її частина можуть містити додаткові трансгени, що кодують ферменти, які беруть участь у продукуванні ДЛ-ПНЖК, такі як, без обмеження, Дб- десатураза, ДЛ9У-елонгаза, Д8-десатураза, Дб-елонгаза, Д5-десатураза, о3З-десатураза, дДа- десатураза, Д5-елонгаза, діацилгліцерол ацилтрансфераза, ЛФКАТ, АД17-десатураза, А15- десатураза та/"або ДЛ12-десатураза. Приклади таких ферментів з одним або більше вказаних видів активності відомі з рівня техніки і включають розкриті в цьому документі. У конкретних
Зо прикладах, трансгенна рослина щонайменше містить екзогенні полінуклеотиди, які кодують: а) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу і ДАб-елонгазу, б) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-елонгазу і Д9У-елонгазу, в) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Дб-елонгазу і Д15-десатуразу, г) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу, Д9-елонгазу і А15-десатуразу, д) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-елонгазу, Дб-елонгазу і А17- десатуразу, або е) Д4-десатуразу, Д5-десатуразу, Д8-десатуразу, Д5-елонгазу, Д9-елонгазу і А17-десатуразу, ж) Ф3-десатуразу або Д15-десатуразу, Аб-десатуразу, А5-десатуразу, Аб-елонгазу і Д5Ь- елонгазу, 3) ФЗ3-десатуразу або Л15-десатуразу, Ав-десатуразу, А5-десатуразу, ДУ-елонгазу і Д5Б- елонгазу, ї) Д12-десатуразу, ю3-десатуразу або Д15-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5-десатуразу, Дб- елонгазу и Д5-елонгазу, й) Д12-десатуразу, 03-десатуразу або Д15-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5-десатуразу, До- елонгазу і Д5-елонгазу, кю) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), юЗ-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5- десатуразу, Дб-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково Д4-десатуразу, л) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А15-десатуразу, Дб-десатуразу, д5-десатуразу, Дб-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково ДЛ4-десатуразу, м) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, Дб-десатуразу, д5-десатуразу, Дб-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково ДЛ4-десатуразу, н) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, 0ш3-десатуразу та/або Д15-десатуразу, Дб-десатуразу, Д5Б-десатуразу, Лб-елонгазу і Д5-елонгазу та необов'язково Д4-десатуразу, о) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), 03-десатуразу, Дв-десатуразу, Д5- десатуразу, Д9-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково Д4-десатуразу, п) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Д15-десатуразу, Д8в-десатуразу, д5-десатуразу, Д9У-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково ДЛ4-десатуразу, р) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), Д12-десатуразу, Д8в-десатуразу, бо д5-десатуразу, ДУ-елонгазу, А5-елонгазу і необов'язково Л4-десатуразу, або с) 1-ацил-гліцерол-3-фосфатацилтрансферазу (ЛФААТ), А12-десатуразу, Фш3-десатуразу та/або Д15-десатуразу, Дв8-десатуразу, Д5-десатуразу, ДЛ9-елонгазу, Д5-елонгазу і необов'язково да десатуразу.
У варіанті реалізації винаходу екзогенні полінуклеотиди кодують набір поліпептидів, що являють собою Дб-десатуразу РуїПпішт ігедціаге, А5-дезатуразу ТНгайзіоснуні або д5Ь- дезатуразу Етійапа пихієуї, Аб-елонгазу РнпузсотіїгеПа раїеп5, А5-елонгазу Тпгаивіоспуїтій або д5-елонгазу О5ігеосссиз Іашгії, оЗз-десатуразу Рпуїорпїнога іптехїап5 або о3-десатуразу Руїтійт ігтедшаге і Д4-десатуразу Тпгаивіоспуїгіа.
У варіанті реалізації винаходу рослини за винаходом вирощені в полі, переважно як популяція розміром щонайменше 1000 або 1000000 або 2000000 рослин, які по суті є однаковими, або на площі щонайменше 1 гектар або 2 гектари. Щільність насадження варіює у відповідності до виду рослини, різновиду рослини, клімату, умов грунту, норм застосування добрив та інших факторів, як відомо з рівня техніки. Наприклад, рапс звичайно вирощують із щільністю насадження 1,2-1,5 млн. рослин на гектар. Урожай рослин збирають, як відомо з рівня техніки, що може включати валкування, рядне компостування та/або жнива плодів рослин, з подальшою молотьбою та/або віянням рослинного матеріалу для відокремлення насіння від решти частин рослини, часто у формі полови. Альтернативно, урожай насіння може бути зібраний з рослин у полі в ході єдиного процесу, а саме, комбайнування.
Трансформація рослин
Трансгенні рослини можуть бути одержані із застосуванням методів, відомих з рівня техніки, таких як загалом описані в А. Зіаїег еї аї!., Ріапі Віотесппоїосду -- Те Сепеїїс Мапіршіайоп ої
Ріапі5, Охіога Опімегейу Ргезз (2003), і Р. Спгізіои апа Н. Кіеєе, Напаброок ої Ріапі Віотесппоіоду,
Уопп Уміеу апа 5опв (2004).
В цьому документі терміни «стабільно трансформуючий», «стабільно трансформований» і їх варіації позначають інтеграцію екзогенних молекул нуклеїнових кислот в геном клітини таким чином, що вони передаються клітинам потомства в процесі поділу клітини, без необхідності в проведенні позитивної селекції щодо їх присутності. Стабільні трансформанти або їх потомство можуть бути відібрані будь-якими засобами, відомими з рівня техніки, такими як саузерн-блоти на хромосомній ДНК або гібридизація геномної ДНК іп 5йи. Переважно, трансформацію рослин здійснюють так, як описано в Прикладах в даному описі.
Опосередковане Адгобрасієтійт перенесення є широко використовуваною системою для введення генів в рослинні клітини, оскільки ДНК може бути введена в клітини в суцільних тканинах рослини або органах рослини або експлантах в культурі тканини, з метою тимчасової експресії або стабільної інтеграції ДНК в геном клітини рослини. Використання опосередкованих
Адгобасіегішт векторів, що інтегруються, для рослин з метою введення ДНК в клітини рослини добре відоме з рівня техніки (див., наприклад, 5 5177010, 5 5104310, 05 5004863 або 05 5159135), включаючи методи занурення квіток з використанням Адгобасіегішт або інших бактерій, які можуть переносити ДНК в клітини рослини. Ділянка ДНК для перенесення визначається послідовностями межі, причому проміжна ДНК (Т-ДНК) звичайно вставляється до геному рослини. В подальшому, інтеграція Т-ДНК є відносно точним процесом, що приводить до декількох реорганізацій. У тих різновидах рослин, в яких опосередкована Аадгобасіегійт трансформація є ефективною, вона є способом вибору завдяки легкій і визначеній природі перенесення гена. Переважні вектори трансформації Адгорасіегіит здатні до реплікації в Е. соїї, так само, як і Адгобасіегічт, дозволяючи здійснити необхідні маніпуляції, як було описано (Кіее еї аї., в: Ріапі ОМА Іптесійои5 Адепів, Нопп апа зсепеїї, ед5., Зргіпдег-Мепад, Мем МогК, рр. 179-203 (1985)).
Способи прискорення, які можуть застосовуватися, включають, наприклад, балістичну трансфекцію, тощо. Одним із прикладів способу доставки трансформуючих молекул нуклеїнових кислот в клітини рослини є балістична трансфекція. Даний спосіб розглянутий Хапд еїаї., Рапісіє Вотрагатепі ТесппоЇоду ог Сепе Тгапвіег, Охіога Ргезз, Охіога, Епдіапа (1994).
Небіологічні частинки (мікрочастинки) в ньому можуть бути вкриті нуклеїновими кислотами і доставлені в клітини рушійною силою. Приклади частинок включають виготовлені з вольфраму, золота, платини, тощо. Конкретна перевага балістичної трансфекції, на додаток до того, що вона є ефективним засобом відтворюваної трансформації однодольних, є те, що вона не вимагає ані виділення протопластів, ні сприйнятливості до інфекції Адгобасіегічт.
В іншому альтернативному варіанті реалізації винаходу пластиди можуть бути стабільно трансформовані. Способи, розкриті для трансформації пластиди у вищих рослинах, включають доставку за допомогою генної гармати частинки ДНК, що містить селекційний маркер, і націлювання ДНК на геном пластиди за допомогою гомологічної рекомбінації (05 5451513, 05 60 5545818, 005 5877402, 005 5932479 і ММО 99/05265).
Інші способи трансформації клітини можуть також застосовуватися і включають, без обмеження, введення ДНК в рослини прямим перенесенням ДНК в пилок, прямою ін'єкцією ДНК в репродуктивні органи рослини або прямою ін'єкцією ДНК у клітини незрілих ембріонів, з подальшою регідратацією висушених ембріонів.
Регенерація, розвиток і культивування рослин з одинарних трансформантів протопласта рослини або з різноманітних трансформованих експлантів добре відомі з рівня техніки (Ууеіззрасі еї а. У: МеїШйоа?з ог РіІапі МоїІесціаг Віоіоду, Асадетіс Ргез5, зап Оіедо, Саїїї., (1988)).
Така регенерація і процес росту звичайно включають стадії селекції трансформованих клітин, культивування таких індивідуальних клітин через звичайні стадії ембріонального розвитку, зокрема, стадію вкорінення саджанця. Трансгенні ембріони і насіння регенерують в такий же спосіб. Одержані трансгенні укорінені пагони в подальшому висаджують у відповідне середовище для росту рослини, таке як грунт.
Розвиток або регенерація рослин, що містять чужорідний, екзогенний ген, добре відомі з рівня техніки. Переважно регенеровані рослини є такими, що самозапилюються, щоб забезпечити гомозиготні трансгенні рослини. В іншому випадку, пилок, одержаний від регенерованих рослин, схрещують з вирощеними із насіння рослинами важливих з агрономічної точки зору ліній. З другого боку, пилок рослин таких важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенну рослину за даним винаходом, що містить бажану екзогенну нуклеїнову кислоту, культивують із застосуванням способів, добре відомих фахівцю в даній галузі техніки.
Щоб підтвердити присутність трансгенів в трансгенних клітинах і рослинах, може бути здійснена ампліфікація шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) або аналіз методом саузерн-блота, із застосуванням способів, відомих фахівцям в дані галузі техніки. Продукти експресії трансгенів можуть бути виявлені будь-яким з численних шляхів, в залежності від природи продукту, що включають вестерн-блот і ферментний аналіз. Як тільки трансгенні рослини одержані, їх можна вирощувати для одержання тканин або частин рослини з бажаним фенотипом. Тканина рослини або частини рослини можуть бути зібрані як урожай, та/або зібране насіння. Насіння може служити джерелом вирощування додаткових рослин з тканинами або частинами, що володіють бажаними характеристиками.
Зо Трансгенна рослина, одержана із застосуванням Адгорасієгцт або інших способів трансформації, звичайно містить єдиний генетичний локус на одній хромосомі. Такі трансгенні рослини можуть носити назву гемізиготних по введеному(им) гену(ам). Більш переважною є трансгенна рослина, гомозиготна по введеному(им) гену(ам); тобто, трансгенна рослина, яка містить два додаткових гени, по одному гену в однакових локусах на кожній хромосомі з пари
З5 хромосом. Гомозиготна трансгенна рослина може бути одержана шляхом самозапліднення гемізиготної трансгенної рослини, пророщування частини одержаного насіння та аналізу одержаних рослин щодо присутності цільового гена.
Крім того, необхідно розуміти, що дві різні трансгенні рослини, що містять два незалежно сегрегуючих екзогенних гени або локуси, можуть бути схрещеними (спареними), з метою одержання потомства, яке містить обидва набори генів або локусів. Самозапліднення відповідного нащадка ЕЇ може давати рослини, гомозиготні по обох екзогенних генах або локусах. Зворотне схрещування з материнською рослиною і знищення нетрансгенної рослини також розглядаються, як вегетативне розведення. Опис інших способів розведення, які звичайно використовуються для різноманітних ознак і врожаю, можна знайти в Репг, в: Вгеедіпд
Меїподз їтог Сийімаг Оемеіортепі, УМіїсох у). ед., Атегісап босієїу ої Адгопоту, Мадізоп МУ/ів. (1987).
Підвищення рівнів екзогенної РНК і стабілізована експресія
Супресори сайленсингу
У варіанті реалізації винаходу рослинна клітина, рослина або частина рослини містить екзогенний полінуклеотид, що кодує білок супресора сайленсингу.
Посттранскрипційний сайленсинг гена (ПТСГ) є специфічним для послідовності нуклеотидів механізмом захисту, що може бути націлений як на клітинні, так і на вірусні мРНК з метою їх розкладу. ПТСГ виникає в рослинах або грибах, стабільно або тимчасово трансформованих чужорідною (гетерологічною) або ендогенною ДНК, і приводить до зменшення акумуляції молекул РНК, послідовність яких подібна до введеної нуклеїнової кислоти.
Широко досліджений той факт, що коекспресія супресора сайленсинга з цільовим трансгеном підвищує рівні присутньої в клітині РНК, що транскрибована із трансгена. Хоча це є доведеним фактом для клітин іп мійго, значущі побічні ефекти спостерігаються в багатьох дослідженнях коекспресії у суцільних рослинах. Більш конкретно, як описано в Маїогу еї аї. 60 (2002), Спартап еї а!. (2004), Снеп еї а). (2004), Оипоуег вї аї. (2004), 7Напо еї а. (2006), І емзеу 5О0 еї а. (2007) ії Мепо еї аї. (2008) рослини, що експресують супресори сайленсинга, загалом під контролем конститутивних промоторів, часто є фенотипово аномальними до такої міри, що вони непридатні для комерційного виробництва.
Нещодавно було виявлено, що рівні молекул РНК можуть бути збільшені та/або рівні молекул РНК можуть бути стабілізовані протягом численних поколінь шляхом допомогою обмеження експресії супресора сайленсинга насінням рослини або його частиною (МО2010/057246). В цьому документі «білок-супресор сайленсинга» або БСС являє собою будь- який поліпептид, який може експресуватися в клітині рослини, що підвищує рівень продукту експресії іншого трансгена в клітині рослини, особливо в подальших поколіннях, одержаних від початково трансформованої рослини. У варіанті реалізації винаходу БСС являє собою вірусний супресор сайленсинга або його мутант. Велика кількість вірусних супресорів сайленсинга відома з рівня техніки і включає, без обмеження, Р19, М2, РЗ8, Ре-Ро і КРУ-РО. У варіанті реалізації винаходу вірусний супресор сайленсинга містить послідовність амінокислот, представлену будь-якою з ЗЕО ІЮ МО: 53-57, її біологічно активним фрагментом, або послідовністю амінокислот щонайменше на 50 95 ідентичною будь-якій одній або більше із ЗЕО
ІО МО: 53-57, яка додатково володіє активністю супресора сайленсинга.
В цьому документі терміни «стабілізуючий експресію» «стабільно експресований», «стабілізована експресія» та їх варіації позначають рівень молекули РНК, по суті такий ж або перевищуючий рівень у рослинах-нащадках протягом наступних поколінь, наприклад, щонайменше 3, щонайменше 5 або щонайменше 10 поколінь, в порівнянні з ізогенними рослинами, які не містять екзогенного полінуклеотиду, що кодує супресор сайленсинга. Однак, даний(і) термін(и) не виключає(ють) можливості деякого зниження рівнів молекули РНК в наступних поколіннях, в порівнянні з попереднім поколінням, наприклад, зниження не менше 10
Фо на покоління.
Супресор може бути вибраний з будь-якого джерела, наприклад, рослини, вірусу, ссавця, тощо. Див. ММО2010/057246 щодо переліку вірусів, з яких може бути одержаний супресор і позначення білка (наприклад, В2, Р14, тощо.) або кодуючої ділянки для супресора з кожного конкретного вірусу. Множинні копії супресора можуть бути використані. Різні супресори можуть використовуватися спільно (наприклад, в тандемі).
Зо Молекули РНК
По суті будь-яка молекула РНК, яку бажано екпресувати в насінні рослини, може бути коекспресована із супресором сайленсинга. Кодовані поліпептиди можуть приймати участь в метаболізмі олії, крохмалю, вуглеводів, поживних речовин, тощо, або можуть бути відповідальними за синтез білків, пептидів, жирних кислот, ліпідів, воску, масел, крохмалів, цукру, вуглеводів, смакоароматичних речовин, ароматичних речовин, токсинів, каротиноїдів, гормонів, полімерів, флавоноїдів, запасних білків, фенолових кислот, алкалоїдів, лігніну, танінів, целюлози, глікопротеїнів, гліколіпідів, тощо, переважно біосинтез або збирання ТАГ.
У конкретному прикладі, рослини продукують підвищені рівні ферментів для продукування олії в рослинах, наприклад, видів Вгаз5зіса, таких як канола або соняшника, сафлору, льону, бавовнику, соєвому бобі, Сатеїїйпа або магїгсі.
Рівні продукування ДЛ-ПНЖК
Рівні ДЛ-ПНЖК або комбінацій ДЛ-ПНЖК, що продукуються в рекомбінантній клітині або частині рослини, наприклад, насінні, мають велике значення. Рівні можуть бути виражені, як склад (у відсотках) загальних жирних кислот, які є конкретними ДЛ-ПНЖК або групою споріднених ДЛ-ПНЖК, наприклад, 03 ДЛ-ПНЖК або об ДЛ-ПНЖК, або ДДЛ-ПНЖК, або інші, що може бути визначене за способами, відомими з рівня техніки. Крім того, рівень може бути виражений, як вміст ДЛ-ПНЖК, наприклад як відсоток ДЛ-ПНЖК в сухій масі матеріалу, що містить рекомбінантні клітини, наприклад, відсоток від маси насіння, який представляє ДЛ-
ПНЖК. Необхідно розуміти, що рівень ДЛ-ПНЖК, що продукується в олійній культурі, може бути значно вищим за показниками вмісту ДЛ-ПНЖК, ніж в овочі або насінні, яке не вирощувалося для цілей одержання олії, хоча обидва можуть мати подібний склад ДЛ-ПНЖК і обидва можуть використовуватися як джерела ДЛ-ПНЖК для споживання людиною або твариною.
Рівні ДЛ-ПНЖК можуть бути визначені за будь-яким із способів, відомих у даній галузі техніки. У переважному способі загальний ліпід добувають з клітин, тканин або організмів, і жирну кислоту перетворюють на метилові ефіри перед аналізом газовою хроматографією (ГХ).
Такі методи розкриті у Прикладі 1. Розташування піку на хроматограмі може використовуватися для ідентифікації кожної конкретної жирної кислоти, і площу кожного піку інтегрують для визначення кількості. В цьому документі, якщо не вказано інше, відсоток конкретної жирної кислоти у зразку визначають, виражаючи площу піку вказаної жирної кислоти як відсоток від бо загальної площі піків жирних кислот на хроматограмі. По суті, це відповідає масовому відсотку
(мас/мас). Ідентичність жирних кислот може бути підтверджена ГХ-МС. Загальні ліпіди можуть бути виділені методами, відомими з рівня технікию, з метою очищення фракцій, наприклад, фракції ТАГ. Наприклад, тонкошарова хроматографія (ТШХ) може бути здійснена в аналітичному масштабі, щоб відокремити ТАГ від інших фракцій ліпіду, таких як ДАГ, ацил-КоА або фосфоліпід, з метою визначення складу жирних кислот конкретно для ТАГ.
В одному варіанті реалізації винаходу загальна сума АРК, ЕПК, ДПК і ДГК в жирних кислотах екстрагованого ліпіду становить від близько 7 95 до близько 25 95 загальних жирних кислот в клітині. У подальшому варіанті реалізації винаходу загальні жирні кислоти в клітині містять менше 1 95 С20:1. У переважних варіантах реалізації екстрагований ТАГ в клітині містить жирні кислоти в кількостях, вказаних у цьому документі. Кожна з можливих комбінацій ознак, що визначають ліпід, розкритий в цьому документі, також включена.
Додатково рівень продукування ДЛ-ПНЖК в рекомбінантній клітині, рослині або частині рослини, наприклад, насінні, може бути виражений, як відсоток перетворення конкретного жирнокислотного субстрату на один або більше жирнокислотних продуктів, що в цьому документі додатково носить назву «ефективності перетворення» або «ефективності ферменту».
Цей параметр базується на жирнокислотному складі ліпіду, екстрагованого з клітини, рослини, частини рослини або насіння, тобто, кількості утвореної ДЛ-ПНЖК (зокрема іншої ДЛА-ПНЖК, одержаної з неї), вираженому як відсоток від одного або більше жирнокислотних субстратів (зокрема, всіх інших жирних кислот, одержаних із нього). Загальна формула для відсотка перетворення: 100 х (сума відсотків продукту ДЛ-ПНЖК і всіх продуктів, одержаних із нього)/(сума відсотків жирнокислотного субстрату і всіх продуктів, одержаних із нього). Стосовно
ДГК, наприклад, це може бути виражено, як співвідношення рівня ДГК (у вигляді відсотка від загального вмісту жирних кислот в ліпіді) до рівня жирнокислотного субстрату (наприклад ОК,
ЛК, АЛК, СДК, ЕТК або ЕПК) і всіх продуктів, окрім ДГК, одержаних з субстрату. Відсоток перетворення або ефективність перетворення можуть бути виражені для єдиної ферментної стадії біохімічного шляху, а також для частини або всього шляху.
Специфічна ефективність перетворення обчислена в цьому документі за наступними формулами: 1. ОК на ДГК - 100 х ( 9?6ДГЮ(сума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРК,
Зо ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 2. ЛК на ДГК - 100 х ( 9?6ДГКЮ(сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 3. АЛК на ДГК - 100 х ( 96ДГК) (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 4. ЕПК на ДГК - 100 х ( 96ДГКЮ(сума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК). 5. ДПК на ДГК (ефективність А4-десатурази) - 100 х ( "ДГК)/сума 9о для ДПК і ДГК). 6. Ефективність АІ12-десатурази - 100 х (сума 95 для ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК,
ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК,
ЕПК, ДПК і ДГК). 7. Ефективність 03З-десатурази - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і
Ддгюк)/сума 95 ЛК, ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 8. ОК на АЛК - 100 х (сума 95 для АЛК, СДК, ЕТрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГКЮ)/сума 95 для ОК, ЛК,
ГЛК, ДГЛК, АРК, ЕДК, АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 9. Ефективність Дб-десатурази (на 03 субстраті АЛК) - 100 х (сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК,
ДПК і ДГЮЛ 95 АЛК, СДК, ЕТРрК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 10. Ефективність Аб-елонгази (на 03 субстраті СДК) - 100 х (сума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і
ДГЮ/сума 95 для СДК, ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 11. Ефективність Д5-десатурази (на 03 субстраті ЕТК) - 100 х (сума 95 для ЕПК, ДПК і
ДГЮ/Ссума 95 для ЕТК, ЕПК, ДПК і ДГК). 12. Ефективність Д5-елонгази (на 03 субстраті ЕПК) - 100 х (сума 95 для ДПК і ДГЮ/(сума 95 для ЕПК, ДПК і ДГК).
Жирнокислотний склад ліпіду, переважно олії з насіння, за винаходом також відрізняється за співвідношенням 06 жирних кислот : 03 жирних кислот у загальному вмісті жирних кислот, для будь-яких загальних 0б жирних кислот : загальних 03 жирних кислот або для нових 0б жирних кислот : 003 нових жирних кислот. Терміни загальні 06 жирні кислоти, загальні 03 жирні кислоти, нові фб жирні кислоти і нові 03 жирні кислоти мають значення, визначені в цьому документі.
Співвідношення обчислюють на базі складу жирних кислот у ліпіді, екстрагованому з клітини, рослини, частини рослини або насіння ліпіду, за способом, приклад якого наведений у цьому документі. Більш бажаною є присутність в ліпіді вищого рівня 03 жирних кислот, ніж 0б жирних кислот, і таким чином співвідношення 06:03 менше 1,0 є переважним. Співвідношення 0,0 60 вказує на повну відсутність певних б жирних кислот; співвідношення 0,03 було досягнуте, як розкрито у Прикладі 6. Такі низькі значення співвідношення можуть бути досягнуті шляхом сполученого використання Дб-десатурази з перевагою по відношенню до субстрату 03, разом з ошЗ3-десатуразою, особливо грибковою с3-десатуразою, такою як 03-десатураза Ріспіа равіогів, приклад якої наведений в цьому документі.
Додатково вихід ДЛ-ПНЖК на масу насіння може бути обчислений на базі загального вмісту олії в насінні і 95 ДГК в олії. Наприклад, якщо вміст олії в насінні рапсу становить близько 40 95 (мас./мас.), і близько 12 95 від загального вмісту жирних кислот в олії становить ДГК, вміст ДГК в насінні становить близько 4,8 95 або близько 48 мг на грам насіння. Як розкрито в Прикладі 2, вміст ДГК в насінні Агабідорвзі5, що містить близько 9 95 ДГК, в якому вміст олії нижчий, ніж у рапсі, становив 25 мг/г насіння. При вмісті ДГК близько 7 95, насіння рапсу або насіння Сатеїйнпа займа містить рівень ДГК близько 28 мг на грам насіння. У цьому винаході таким чином розкриваються рослини Вгаззіса парив, В. |псеа і Сатеїйпа 5аїїма та одержане з них насіння, яке містить щонайменше близько 28 мг ДГК на грам насіння. Вміст вологи в насінні є стандартним для зібраного в процесі збору урожаю зрілого насіння після сушіння (4-15 95 вологи). У винаході також розкривається спосіб одержання олії, який включає одержання насіння і виділення олії з насіння, застосування олії і способи одержання насіння, включаючи збір урожаю насіння з рослин за винаходом.
Крім того, може бути обчислена кількість ДГК та/або ДПК, що продукується на гектар, якщо вихід насіння з гектара відомий або може бути оцінений. Наприклад, урожайність рапсу в
Австралії зазвичай близько 2,5 тони насіння на гектар, що при вмісті олії 40 95 дає близько 1000 кг олії. При вмісті ДГК та/або ДПК 20,1 95 в кінцевій олії, це забезпечує близько 200 кг ДГК та/або
ДПК на гектар. Якщо вміст олії знижується на 50 95, це все ще забезпечує близько 100 кг ДГК та/або ДПК на гектар.
Одержані на сьогоднішній день докази свідчать про те, що деякі десатурази, що гетерологічно експресуються в дріжджах або рослинах, володіють відносно низькою активністю в комбінації з деякими елонгазами. Дану ситуацію можна покращити, надаючи десатуразі здатність використовувати форму ацил-КоОА жирної кислоти як субстрат у синтезі ДЛ-ПНЖК, і це вважається переважним в рекомбінантних клітинах, особливо у клітинах рослини. Особливо переважна комбінація для ефективного синтезу ДГК являє собою грибкову о03-десатуразу,
Зо наприклад, таку як ФЗ-десатураза Ріспіа равіогіз (ЗБЕО ІЮ МО: 6), що є Дб-десатуразою з перевагою по відношенню до 03 ацильних субстратів, наприклад, таку як Дб-десатураза
Містотопаз ризйШа (ЗЕО ІЮ МО: 9) або її варіанти з ідентичністю послідовності амінокислот щонайменше 95 95.
В цьому документі термін «що по суті не містить» означає, що композиція (наприклад, ліпід або олія) містить невелику кількість (наприклад, менше, ніж близько 0,5 95, менше, ніж близько 0,25 956, менше, ніж близько 0,1 95, або менше, ніж близько 0,01 95) або не містить певного компоненту. У варіанті реалізації винаходу «такий, що по суті не містить» означає, що компонент неможливо знайти за допомогою шаблонної методики аналізу, наприклад, конкретна жирна кислота (наприклад, 0б-докозапентаєнова кислота) не може бути знайдена за допомогою газової хроматографії, як у загальних рисах розкрито в Прикладі 1
Одержання олій
Методи, які шаблонно практикуються в цій галузі техніки, можуть застосовуватися для виділення, обробки і аналізу олій, продукованих клітинами, рослинами, насінням, тощо за даним винаходом. Зазвичай насіння рослини термічно обробляють, пресують і екстрагують, щоб продукувати неочищену олію, яку далі гідратують, рафінують, відбілюють і дезодорують.
Загалом методи подрібнення насіння відомі з рівня техніки. Наприклад, насіння олійних культур може бути пом'якшено шляхом зрошування його водою для підвищення вмісту вологи, наприклад, до 8,5 95, і провальцьоване за допомогою гладкого валу із щілинами розміром 0,23-- 0,27 мм. В залежності від виду насіння, перед подрібненням можна не додавати воду.
Застосування нагрівання інактивує ферменти, полегшує подальший розрив клітини, об'єднання олійних крапель, і забезпечує агломерацію частинок білка, причому все це спрощує процес екстракції.
У варіанті реалізації винаходу більшість олії з насіння вивільняється при пропусканні крізь гвинтовий прес. Макуху, що виходить з гвинтового пресу, далі екстрагують, наприклад, гексаном, з використанням колонки із супровідним теплоконтролем. Як альтернатива, неочищена олія, одержана в ході операції пресування, може бути пропущена крізь резервуар для осадження з дротяним дренажним верхом із прорізами, щоб видалити тверді речовини, які потрапляють в олію в ході операції пресування. Освітлена олія може бути пропущена крізь рамний і фільтр-прес для видалення будь-яких тонких механічних включень, що залишилися. За необхідності олія після процесу екстракції може бути об'єднана з освітленою олією, з одержанням змішаної неочищеної олії.
Як тільки розчинник відділений 3 неочищеної олії, пресовані та екстраговані порції об'єднують і обробляють звичайними процедурами обробки олії. В цьому документі термін «очищений», використовуваний у зв'язку з ліпідом або олією за винаходом, звичайно означає, що екстрагований ліпід або олія пройшли одну або більше стадій обробки, які підвищують ступінь чистоти ліпідного/олійного компоненту. Наприклад, стадія очищення може включати одне або більше або все із групи, що складається з: гідратації, дезодорування, відбілювання, сушіння та/або фракціонування екстрагованого олії. Однак в цьому документі термін «очищений» не включає процесу переестерифікації або іншого процесу, що модифікує склад жирних кислот ліпіду або олії за винаходом для збільшення вмісту ДГК як відсотка від загального вмісту жирних кислот. юІншими словами, склад жирних кислот очищеного ліпіду або олії по суті є таким же, як склад неочищеного ліпіду або олії.
Гідратація
Гідратація є початковою стадією рафінацій олій, і його основна мета полягає у видаленні з олії більшості фосфоліпідів, які можуть бути присутніми в кількості близько 1--2 95 від загального екстрагованого ліпіду. Додавання до неочищеного олії 52 905 води, що звичайно містить фосфорну кислоту, при 70-80 С приводить до відокремлення більшості фосфоліпідів, за наявності залишкових кількостей металів і пігментів. Нерозчинний матеріал, який відокремлюється, в основному є сумішшю фосфоліпідів і триацилгліцеролів, і також відомий як лецитин. Гідратація може здійснюватись шляхом додавання концентрованої фосфорної кислоти до неочищеної олії з насіння, з метою переведення нездатних до гідратації фосфатидів у здатну до гідратації форму та утворення хелатів металів, які присутні в незначних кількостях. Смолу відокремлюють від олії з насіння центрифугуванням.
Лужна рафінація
Лужна рафінація є одним із способів очищення для обробки неочищеного олії, який іноді також називають нейтралізацією. Вона зазвичай слідує за гідратацією і передує відбілюванню.
Після гідратації олія з насіння може бути оброблена додаванням достатньої кількості розчину лугу, щоб відтитрувати всі жирні кислоти і фосфорні кислоти, з подальшим видаленням
Зо утвореного мила. Придатні лужні матеріали включають натрію гідроксид, калію гідроксид, натрію карбонат, літію гідроксид, кальцію гідроксид, кальцію карбонат і амонію гідроксид. Цей спосіб, як правило, здійснюють за кімнатної температури, з видаленням фракції вільних жирних кислот. Мило видаляють центрифугуванням або екстракцією мила розчинником , і нейтралізовану олію промивають водою. За необхідності, надлишок лугу в олії може бути нейтралізований відповідною кислотою, такою як хлористоводнева кислота або сірчана кислота.
Відбілювання
Відбілювання є способом очищення, за якого олію нагрівають до 90-120 "С, витримуючи за цієї температури протягом 10-30 хвилин у присутності відбілюючої глини (0,2-2,0 95) ії за відсутності кисню, в атмосфері азоту або пари або під вакуумом. Ця стадія обробки олії розроблена таким чином, щоб видаляти небажані пігменти (каротиноїди, хлорофіл, госипол, тощо), причому спосіб додатково видаляє продукти окиснення, залишкові метали, сполуки сірки і залишок мила.
Дезодорування
Дезодорування є обробкою олій і жирів за високої температури (200-260 "С) і низького тиску (0,1-1 мм рт. ст). Зазвичай, це досягається шляхом введення пари в олію з насіння із швидкістю близько 0,1 мл/хвилину/100 мл олії з насіння. Близько через 30 хвилин зрошування олії з насіння охолоджують під вакуумом. Олію з насіння зазвичай подають до скляного контейнеру і пропускають аргон, після чого зберігають за низької температури. Така обробка покращує колір олії з насіння і видаляє більшість летючих субстанцій або пахучих сполук, включаючи вільні жирні кислоти, що залишилися, моноацилгліцероли і продукти окиснення.
Вінтеризація
Вінтеризація є способом, що іноді застосовується в комерційному виробництві олій з метою розділення олій і жирів на тверді (стеарин) і рідкі (олеїн) фракції шляхом кристалізації за температур, нижчих за температуру навколишнього середовища. Спочатку його застосовували до бавовняної олії, з метою одержання продукту, що не містить твердих речовин. Зазвичай, цей спосіб застосовують для зменшення вмісту насичених жирних кислот в олії.
Переестерифікація
В даному документі «переестерифікація» є способом обміну жирних кислот в межах і між бо ТАГ або перенесення жирних кислот на інший спирт, з утворенням ефіру. Це може включати первинне вивільнення жирних кислот з ТАГ у формі вільних жирних кислот або пряме одержання ефірів жирних кислот, переважно метилових ефірів або етилових ефірів жирних кислот. В ході реакції переестерифікації ТАГ із спиртом, таким як метанол або етанол, алкільна група спирту утворює ефірний зв'язок із адильними групами (включаючи ДГК) ТАГ. За умови поєднання із способом фракціонування, переестерифікація може застосовуватися для модифікації жирнокислотного складу ліпідів (Магапдопі еї аї.,, 1995). Для переестерифікації можуть використовуватися хімічні (наприклад, каталізовані сильною кислотою або основою) або ферментні препарати, причому останні включають ліпази, що можуть бути специфічними до положення (50п-1/3 або 5п-2 специфічними) жирної кислоти в ТАГ, або з перевагою по відношенню до деяких жирних кислот в порівнянні з іншими (Зрегапга еї аї., 2012).
Фракціонування жирних кислот, з метою підвищення концентрації ДЛ-ПНЖК в олії може бути здійснено будь-яким із способів, відомих з рівня техніки, таких як, наприклад, кристалізація виморожуванням, утворення комплексів з використанням сечовини, молекулярна дистиляція, екстракція надкритичною рідиною, протитокова хроматографія і утворення комплексів з іоном срібла. Утворення комплексів із сечовиною є переважним способом унаслідок його простоти та ефективності з точки зору зниження рівня насичених і мононенасичених жирних кислот в олії (Сате? єї аї., 2003). Спочатку, ТАГ в олії розщеплюють на складові жирні кислоти, часто у формі ефірів жирних кислот, шляхом гідролізу в умовах каталізу кислотою або основою, внаслідок чого один моль ТАГ реагує щонайменше з З моль спирту (наприклад, етанолу у випадку етилових ефірів або метанолу у випадку метилових ефірів), причому використовують надлишок спирту, щоб забезпечує розділення алкілових ефірів, які утворилися, і гліцерину, який також утворюється, або за допомогою ліпаз. Такі вільні жирні кислоти або ефіри жирних кислот, що звичайно залишаються в незміненому виді у складі жирних кислот після обробки, в подальшому можуть бути змішані з етанольним розчином сечовини для утворення комплексів.
Насичені і мононенасичені жирні кислоти легко утворюють комплекси із сечовиною, кристалізуються при охолодженні і далі можуть бути видалені фільтрацією. Фракція, що не утворила комплекси із сечовиною, таким чином, збагачується ДЛ-ПНЖК.
Продукти харчування (корми)
Цей винахід включає композиції, які можуть використовуватися як продукти харчування
Зо (корми). Для цілей цього винаходу «продукти харчування (корми)» включають будь-який продукт харчування або препарат для споживання людиною або твариною, який при надходженні в організм: (а) служить цілям живлення або утворення тканин або постачання енергією; та/або (б) підтримує, відновлює або сприяє належному харчовому статусу або метаболічній функції.
Продукти харчування (корми) за винаходом включають харчові суміші для немовлят та/або дітей молодшого віку, такі як, наприклад, молочна суміш для дитячого харчування, і шрот за винаходом.
Продукти харчування (корми) за винаходом включають, наприклад, клітину за винаходом, рослину за винаходом, частину рослини за винаходом, насіння за винаходом, екстракт за винаходом, продукт способу за винаходом, продукт процесу ферментації за винаходом, або композицію разом з відповідним(и) носієм(ями). Термін «носій» використовується в найширшому значенні і включає будь-який компонент, який може мати харчове значення або не мати його. Як буде зрозуміло кваліфікованому фахівцю, носій повинен бути придатним для використання (або використовуваним в достатньо низькій концентрації) в продукті харчування (кормі), таким чином, що він не здійснює шкідливого впливу на організм, якій споживає продукт харчування (корм).
Продукт харчування (корм) за цим винаходом включає олію, ефір жирної кислоти або жирну кислоту, одержану прямо або непрямо із застосуванням способів, клітин або рослин, розкритих у цьому документі. Додатково композиція може знаходитися в твердій або рідкій формі. Крім того, композиція може містити їстівні мікронутрієнти, білок, вуглеводи, вітаміни та/або мінерали в кількостях, бажаних для конкретного застосування. Кількості цих інгредієнтів варіюватимуть залежно від того, чи призначається композиція для застосування у здорових індивідуумів або для застосування у індивідуумів з особливими потребами, наприклад, індивідуумів, які страждають на метаболічні розлади, тощо.
Приклади придатних носіїв, що мають харчове значення, включають, без обмеження, макронутрієнти, наприклад, їстівні жири, вуглеводи і білки. Приклади таких їстівних жирів включають, без обмеження, кокосове масло, олію бурячника, олію грибів, олію чорної смородини, соєву олію, а також моно- і дигліцероли. Приклади таких вуглеводів включають (без обмеження): глюкозу, їстівну лактозу і гідролізований крохмаль. Додатково, приклади білків, які можуть використовуватися в харчовій композиції за винаходом, включають (без обмеження)
білки сої, оброблену електродіалізом сироватку, оброблене електродіалізом збиране молоко, молочну сироватку або гідролізати вказаних білків.
Стосовно вітамінів і мінералів, наступне може бути додане до композицій харчових продуктів (кормів) за цим винаходом: кальцій, фосфор, калій, натрій, хлорид, магній, марганець, залізо, мідь, цинк, селен, йод, вітаміни А, Е, 0, С і вітаміни групи В. Крім того, інші такі вітаміни і мінерали можуть бути додані.
Компоненти, що використовуються в композиціях продукту харчування (корма) за цим винаходом, можуть бути напівочищеними або очищеними. Під напівочищеним або очищеним мається на увазі матеріал, який одержаний шляхом очищення природного матеріалу або синтезу де помо.
Додатково композиція харчового продукту (корми) за даним винаходом може бути додана до їжі навіть в тому випадку, якщо немає необхідності в добавках до раціону. Наприклад, композиція може бути додана до їжі будь-якого типу, зокрема (без обмеження): маргарин, модифіковане масло, сири, молоко, йогурт, шоколад, цукерки, легкі закуски, олії для салатів, олії для приготування їжі, кулінарні жири, м'ясо, риба і напої.
Додатково жирні кислоти, що отримують відповідно за цим винаходом, або клітини-хазяї, трансформовані таким чином, що в них містяться та експресуються цільові гени, можуть використовуватися як харчові добавки для тварин, з метою модифікації складу жирних кислот в тканині, яйці або молоці тварини до необхідного для споживання людиною або твариною.
Приклади таких тварин включають овець, велику рогату худобу, коней, домашніх птахів, наприклад, курей, тощо.
До того ж, продукти харчування (корми) за винаходом можуть використовуватися в аквакультурі, з метою підвищення рівнів жирних кислот в організмі риби або ракоподібних, таких як, наприклад, креветки, для споживання людиною або твариною. Переважно риба є лососем.
Переважні продукти харчування (корми) за винаходом є рослинами, насінням та іншими частинами рослини, такими як листя і стебла, що безпосередньо можуть використовуватися як їжа або корм для людини або тварин. Наприклад, тварини можуть безпосередньо пастися на таких рослинах, вирощуваних в полі, або їм можуть згодовуватися точніше визначені кількості в ході контрольованого годування. Винахід включає застосування таких рослин і частин рослини
Зо як їжі для підвищення рівнів ДЛ-ПНЖК в організмі людини і тварин.
Композиції
Цей винахід також включає композиції, особливо фармацевтичні композиції, що містять одну або більше жирних кислот та/або олій, одержаних із застосуванням способів за винаходом, переважно у формі етилових ефірів жирних кислот.
Фармацевтична композиція може містити одну або більше жирних кислот та/або олій, в комбінації із стандартним, відомим, нетоксичним фармацевтично прийнятним носієм, ад'ювантом або розчинником, таким як фосфатно-сольовий буфер, вода, етанол, поліоли, рослинні олії, зволожуючий агент або емульсія, наприклад, емульсія вода/олія. Композиція може знаходитися в рідкій або твердій формі. Наприклад, композиція може бути у формі пігулки, капсули, рідини для ковтання або порошку, в ін'єкційній формі або у формі мазі або крему для місцевого застосування. Необхідна текучість може підтримуватись, наприклад, шляхом підтримки необхідного розміру частинок у разі дисперсій і використовування поверхнево- активних речовин. Крім того, може бути бажаним введення ізотонічних агентів, наприклад, цукру, натрію хлориду, тощо. Окрім таких інертних розбавлювачів, композиція може містити ад'юванти, такі як зволожувачі, емульгатори і суспендувальні агенти, підсолоджувачі, смакові добавки та ароматизатори.
Суспензії разом з активними сполуками можуть містити суспендувальні агенти, такі як етоксильовані ізостеарилові спирти, складні ефіри сорбіту і поліоксиетилен сорбітану, мікрокристалічну целюлозу, мета-гідроксид алюмінію, бентоніт, агар-агар і трагакант або суміші цих субстанцій.
Тверді лікарські форми, такі як таблетки і капсули, можуть бути одержані із застосуванням способів, добре відомих з рівня техніки. Наприклад, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього винаходу, можуть бути таблетовані із звичайними основами таблеток, такими як лактоза, сахароза і кукурудзяний крохмаль, у комбінації із зв'язувальними речовинами, такими як акація, кукурудзяний крохмаль або желатин, дезінтегрантами, такими як картопляний крохмаль або альгінова кислота, і змащувальними речовинами, такими як стеаринова кислота або магнію стеарат. Капсули можуть бути одержані шляхом об'єднання вказаних допоміжних речовин в желатиновій капсулі з антиоксидантами і відповідною жирною(ими) кислотою(ами).
Для внутрішньовенного введення, жирні кислоти, одержані у відповідності до цього бо винаходу, або їх похідні, можуть бути введені в комерційні препарати.
Типові дози конкретної жирної кислоти становлять від 0,1 мг до 20 г, при введенні від 1 до 5 разів на день (до 100 г щоденно), і переважно знаходяться в інтервалі від близько 10 мг до близько 1, 2, 5 або 10 г щодня (у вигляді однієї або декількох доз). Як відомо з рівня техніки, бажано вводити щонайменше близько 300 мг/день жирної кислоти, особливо ДЛ-ПНЖК. Однак необхідно розуміти, що будь-яка кількість жирної кислоти буде корисною для суб'єкта.
Можливі способи введення фармацевтичних композицій за цим винаходом включають, наприклад, ентеральний (наприклад, пероральний і ректальний) і парентеральний. Наприклад, рідкий препарат може бути введений перорально або ректально. Додатково гомогенна суміш може бути повністю диспергована у воді, попередньо змішаній в стерильних умовах з фізіологічно прийнятними розбавлювачами, консервантами, буферами або пропелентами для одержання спрею або засобу для інгаляцій.
Дози композиції для введення пацієнту можуть бути визначені звичайним фахівцем в цій галузі техніки і залежать від різних факторів, таких як маса тіла пацієнта, вік пацієнта, загальний стан здоров'я пацієнта, анамнез пацієнта, імунний статус пацієнта, тощо.
Додатково композиції за цим винаходом можуть застосовуватися для косметичних цілей.
Вони можуть додаватися до існуючих косметичних композицій таким чином, що утворюється суміш, або жирна кислота, одержана у відповідності до цього винаходу, може використовуватися як єдиний «активний» інгредієнт в косметичній композиції.
ПРИКЛАДИ
Приклад 1. Матеріали і способи
Експресія генів в клітинах рослини в системі тимчасової експресії
Екзогенні генетичні конструкції експресують в клітинах рослини в системі тимчасової експресії, як суттєво описано Моїіппеї еї а!. (2003) і Уоса еї а!. (2009).
Аналіз жирних кислот методом газової хроматографії (ГХ)
МЕЖК аналізують методом газової хроматографії за допомогою газового хроматографу
Адііепі ТесппоЇодіеє 7890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного колонкою 5ОЕ-
ВРХ7О (70 95 ціанопропіл полісилфенілен-силоксану, внутрішній діаметр 0,25 мм, товщина плівки 0,25 мм) завдовжки 30 м, ПІД (плазмово-іонізаційним детектором), інжектором з розділенням/без розділення, а також серійним аутосамплером та інжектором Адіїепі
Зо Тесппоіодіеєє 7693. Гелій використовують як газ-носій. Зразки вводять інжекцією в методі з розділенням (співвідношення 50:1) при температурі печі 150 "С. Після інжекції температуру печі підтримують на рівні 150 "С протягом 1 хвилини, далі підвищують до 210 "С із швидкістю
З "С/хвилину, знову підвищують до 240 "С із швидкістю 50 "С/хвилину і остаточно підтримують протягом 1,4 хвилин на рівні 240 "С. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адйепі Тесппоїодіеє Спетое(айцйоп (версія Кем В.04.03 (16), Пало-Альто,
Каліфорнія, США), на базі відповіді відомої кількості зовнішнього стандарту СІ С-411 (МиспескК) і внутрішнього стандарту С17:О-МЕ.
Аналіз ліпідів методом рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ-МС)
Загальні ліпіди екстрагують з ліофілізованого насіння, що розвивається, через 12 днів після цвітіння (дпц) і зрілого насіння після додавання відомої кількості три-С17:0-ТАГ як внутрішнього стандарту для кількісної оцінки. Екстраговані ліпіди розчиняють в 1 мл 10 мМ бутильованого гідрокситолуолу в суміші бутанол/метанол (1:1, об/об) на 5 мг сухого матеріалу і аналізують за допомогою рідинного хроматографа серії Адіїепі 1200 з РХ та іонізацією електророзпиленням за допомогою РХ-МС 64106 з трьома квадрупольними лінзами. Ліпіди хроматографічно розділяють з використанням колонки Азсепіїз Ехрге55 КР-Атіде (50 мм х 2,1 мм, 2,7 мкм, З,иреїсо) в режимі бінарного градієнта із швидкістю потоку 0,2 мл/хвилину. Рухомі фази: А. 10 мМ амонію форміату в суміші НгО/метанол/тетрагідрофуран (50:20:30 об/об/об); В. 10 мМ амонію форміату в суміші
НгО/метанол/гетрагідрофуран (5:20:75, об/об/06). Переліки для моніторингу множинних реакцій (ММР) базуються на наступних основних жирних кислотах: 16:0, 18:0, 18:1, 18:2, 18:3, 18:4, 2071, 20:2, 20:3, 20:4, 20:5, 22:4, 22:5, 22:6, з використанням енергії зіткнення 30 В ії фрагментора 60
В. Нейтральні ліпіди досліджували відносно наступних основних жирних кислот: 16:0 (пальмітинова кислота), 18:0 (стеаринова кислота), 18:109 (олеїнова кислота, ОК), 18:26 (лінолева кислота, ЛК), 18:3003 (а-ліноленова кислота, АЛК), 18:4003 (стеаридонова кислота,
СДЮ), 20:11, 20:2, 20:3, 20:403, 20:503, 22:403, 22:5003, 22:603, тоді як фосфоліпіди сканували щодо наявності молекул С16, С18, 020 ї С22 фз подвійними зв'язками 0-3, 0-4, 0-5, 4-6, відповідно.
Окремі ММР ТАГ були ідентифіковані на базі амонізованого іона-прекурсора та іона продукту, утвореного в результаті втрати нейтронів 20:1, СДК, ЕПК і ДГК. ТАГ і ДАГ кількісно визначали із застосуванням 50 мкМ тристеарину і дистеарину як зовнішніх стандартів. ФЛ 60 кількісно визначали з використанням 10 мкМ зовнішніх стандартів ди-18:0-ФХ, ди-17:0-ФА, ди-
17:0-ФЕ, 17:0-17:1-ФГ, ди-18:1-ФІ ї ди-17:0-ФС (Амапії Роїаг Гірід5, Алабастер, Алабама, США).
Для вибраних видів ТАГ, ДАГ і ФЛ проводили подальше підтвердження за допомогою МС/МС 6520 О-ТОБЕ.
Визначення профілю жирних кислот і вмісту олії в насінні
За необхідності визначення вмісту олії в насінні, насіння сушать в ексикаторі протягом 24 годин, і близько 4 мг насіння переносять до скляного флакону місткістю 2 мл, із вкритою
Тефлоном нагвинчувальною кришкою. 0,05 мг тригептадеканоїну, розчиненого в 0,1 мл толуолу, додають у флакон як внутрішній стандарт.
МЕЖК насіння одержують, додаючи 0,7 мл 1 н метанольного НСІ (ЗиреїЇсо) у флакон, що містить матеріал насіння, короткочасно обробляють вихровим перемішуванням та інкубують при 80" С протягом 2 годин. Після охолодження до кімнатної температури, 0,3 мл 0,9 95 (мас/об) розчину Масі ї 0,1 мл гексану додають у флакон і ретельно перемішують протягом 10 хвилин в
НеїдоІри Міргатах 110. МЕЖК збирають у скляну вставку місткістю 0,3 мл і аналізують методом
ГХ з плазмово-іонізаційним детектором (ПІД), як було згадано раніше.
Площу піку окремого МЕЖК спочатку коректують на базі відповіді у вигляді площі піку відомої кількості таких же МЕЖК, присутніх в комерційному стандарті БІ С-411 (МО-СНЕК РЕАЕР,
ІМС., США). І С-411 містить рівні кількості 31 жирної кислоти ( 95 мас.), в інтервалі від С8:0 до
С22:6. У випадку жирних кислот, які відсутні в стандарті, винахідники використовували відповіді у вигляді площі піку найбільш подібного МЕЖК. Наприклад, відповідь у вигляді площі піку МЕЖК 16:149 використовували для 16147, і відповідь МЕЖК С22:6 використовували для С22:5.
Скоректовані значення площі піку використовують для обчислення маси кожного МЕЖК в зразку, в порівнянні з масою внутрішнього стандарту. Олія зберігається в основному у формі
ТАГ, і її масу обчислюють на базі маси МЕЖК. Загальну кількість моль гліцерину визначають шляхом обчислення кількості моль кожного МЕЖК і поділу загальної кількості моль МЕЖК на три. Вміст ТАГ обчислюють як суму гліцерину і жирних ацильних фрагментів, з використанням співвідношення: 9о мас. олії - 100 х ((41 х загальна кількість моль МЕЖК/З) « (загальна кількість грам МЕЖК - (15 х загальна кількість моль МЕЖК)))/грам насіння, де 41 і 15 -- молекулярна маса залишку гліцеролу і метильної групи, відповідно.
Аналіз вмісту стеролів у зразках олії
Зо Зразки близько по 10 мг олії, разом з доданою аліквотою С24:0 монолу як внутрішнього стандарту, омилюють за допомогою 4 мл 5 95 розчину КОН у 80 95 МеоОнН і нагрівання до 80 "С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі, у вкритій Тефлоном скляній пробірці з нагвинчувальною кришкою. Після охолодження реакційної суміші додають 2 мл води Мійі-О), і стероли екстрагують 2 мл суміші гексан/дихлорметан (4:1, об./06.) при струшуванні і вихровому перемішуванні. Суміш центрифугують, екстракт стеролів витягають і промивають 2 мл води
МІ-С. Далі екстракт стеролів відокремлюють після струшування і центрифугування. Екстракт упарюють в потоку газоподібного азоту, і стероли силілюють з використанням 200 мл М,О- бис(триметилсиліл)трифторацетаміду (БСТФА) при нагріванні до 80 "С, витримуючи протягом 2 годин при цій температурі.
Для аналізу стеролів методом ГХ/ГХ-МС, похідні стерол-О-триметилсилілу (стерол-ЮОТМ5І) сушать в потоку газоподібного азоту на термоблоці при 40 "С, і далі повторно розчиняють у хлороформі або гексані безпосередньо перед аналізом методом ГХ/ГХ-МС. Похідні стерол-
ОТМ5 аналізують газовою хроматографією (ГХ) за допомогою газового хроматографа Аодіепі
ТесппоЇодіеє 6890А ОС (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою з кварцевого скла ЗиреїЇсо Едийу"м-1 (15 м х 0,1 мм внутрішній діаметр, товщина плівки 0,1 мкм),
ПІД та інжектором з розщепленням/без розщеплення, а також серійним аутосемплером Адіїепі
ТесппоІодіеє 7683 та інжектором. Як газ-носій використовують гелій. Інжекцію зразків здійснюють в режимі без розщеплення при температурі печі 120 "С. Після інжекції температуру печі підвищують до 270 "С із швидкістю 10 "С/хвилину, і в кінці до 300 "С із швидкістю 5 "С/хвилину. Площу піків визначають за допомогою програмного забезпечення Адійепі
Тесппоїодіе5 Спетецайоп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містять помилку ж 5 до, від значень площі піку окремих компонентів.
Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МС) здійснюють за допомогою приладів для ГХ-
МС Ріппідап Трегтодиезі СО ії Ріппідап Тпепто ЕїІесігоп Согрогайоп 5С-М5, притому, що обидві системи обладнані інжектором для введення проб безпосередньо на колонку, і програмного забезпечення ТПпептодиеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Кожний з приладів для ГХ обладнаний капілярною колонкою, полярність якої подібна до розкритої вище. Індивідуальні компоненти ідентифікують, використовуючи дані мас-спектрометрії і порівнюючи дані часу утримування з одержаними для автентичних і лабораторних стандартів. Повну методику бо холостого аналізу виконують паралельно із серією зразків.
Умови ЗТ-ПЛР
Ампліфікацію методом ПЛР із зворотною транскриптазою (ЗТ-ПЛР) звичайно здійснюють з використанням системи ЗТ-ПЛР Зирегзспрі ПШ Опе-5(ер (Іпмйгодеп) в об'ємі 25 мкл, з використанням 10 пмоль прямого праймера і 30 пмоль зворотного праймера, Мд5О» до кінцевої концентрації 2,5 мМ, 400 нг загальної РНК з буфером і нуклеотидними компонентами згідно інструкцій виробника. Типові температурні режими були наступними: 1 цикл при температурі 45 "С протягом 30 хвилин для виникнення зворотної транскрипції; потім 1 цикл при температурі 94 7С протягом 2 хвилин, і далі 40 циклів з температурою 94 "С протягом 30 секунд, 527 протягом 30 секунд, 70 "С протягом 1 хвилини; потім 1 цикл при температурі 72 "С протягом 2 хвилин перед охолодженням реакційних сумішей до 5 "С.
Визначення кількості копій трансгенів за допомогою цифрової ПЛР
Для визначення кількості копій трансгенів у трансгенній рослині застосовували метод ПЛР, як описано нижче. Крім того, даний метод може бути застосований для визначення того, чи є рослина трансгенною по генетичних конструкціях, описаних у даному описі. Близько квадратного сантиметра листової тканини одержують від кожної індивідуальної рослини і вміщують до колекційної мікропробірки (Оіадеп). Далі зразки сушать виморожуванням протягом 24-48 годин. Для руйнування зразків з метою екстракції ДНК, до кожного висушеного зразка додають кульки з неіржавіючої сталі, і пробірки струшують на лізаторі для тканин Оіадеп. 375 мкл буфера для екстракції (0,1 М Трис-НСЇІ, рН 8, 0,05 М ЕДТА, рн 8, і 1,25 95 ПДВ) додають в кожну пробірку, суміші інкубують при 65 "С протягом 1 години, і потім охолоджують перед додаванням в кожну пробірку 187 мкл 6 М амонію ацетату (4 "С) при ретельному перемішуванні.
Далі зразки центрифугують протягом 30 хвилин при 3000 об/хв. Супернатант із кожної пробірки переносять у нові мікропробірки, кожна з яких містить 220 мкл ізопропанолу, для осадження
ДНК при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. ДНК збирають центрифугуванням пробірок при 3000 об/хв протягом 30 хвилин, гранули ДНК промивають 320 мкл 70 95 етанолу і сушать перед ресуспендуванням ДНК у 225 мкл води. Нерозчинений матеріал гранулюють центрифугуванням при 3000 об/хв протягом 20 хвилин, і 150 мкл кожного супернатанту переносять на 96-лункові планшети для тривалого зберігання.
Для ефективного і кількісного проведення цифрової ПЛР (ааРСК) ДНК розщеплюють
Зо рестрикційними ферментами перед проведенням реакцій ампліфікації щоб гарантувати фізичне розділення декількох копій трансгенів або множинних інсерцій. Таким чином, аліквоти препаратів ДНК розщеплюють за допомогою ЕсоКІ і Ватні, разом узятих, в об'ємі 20 мкл, із застосуванням 10х буфера ЕсокКіІ, 5 мкл ДНК і близько 4 одиниць кожного ферменту на зразок, з інкубацією протягом ночі при 37 "С.
Праймери, використовувані у цих реакціях ПЛР, були сконструйовані із застосуванням програмного забезпечення Ргітег3, щоб підтвердити, що передбачена відсутність взаємодії між праймерами для референтних генів і генів-мішеней, або така взаємодія не створює проблем за використовуваних умов. Референтним геном в аналізі був ген рапсу Нтд (група високої рухливості), присутній в одному екземплярі у геномі рапсу (М/епод еї аї!., 2004). Оскільки рапс є алотетраплоїдом, припускали наявність 4 копій гена Нто, тобто 2 алелів кожного із двох генів, у
Вгаззіса пари5. У реакціях референтного гена застосовували пару праймерів і зонд, що містив подвійну мітку, як указано нижче: Смисловий праймер, Сап11 дсдаадсасаїсдадіса (ЗЕО ІЮ МО: 50); Антисмисловий праймер, Сап1!2 дондадаіддіадсюдадоа (ЗЕБО ІЮО МО: 51); Нтод-РЗ 5-
НехлЛсісіас/2еп/ссадісісасаїдасас/ЗІАВКЕО/-3 (ЗЕО ІЮ МО: 52). Розмір продукту ампліфікації становив 73 пари основ.
У одній реакції ампліфікації гена-мішені, в ході якої виявляли ген селекційного маркеру ФФТ для скринінгу всіх трансгенних рослин, смисловий праймер являв собою Сап17, агасаадсасддіддаюддуа (ЗЕБЕО ІО МО: 53); антисмисловий праймер, Сап18 (дісіаасаддісіаддадда (ЗЕО ІО МО: 54); зонд, РРТ-РЗ 5-/РАМЛадсааада/геп/дашсаадснссідс/ЗІАВКЕО/-3' (5ЕО ІЮ МО: 55). Розмір даного продукту ампліфікації гена-мішені становив 82 пари основ. У деяких випадках, паралельно проводили другий аналіз гена-мішені, щоб виявити часткові інсерції Т-
ДНК. В ході такого другого аналізу виявляли ділянку гена ДЛб-десатурази за допомогою смислового праймера, Сап23 саадсассдіадіаадададса (ЗЕО ІЮ МО: 56), антисмислового праймера, Сап24 садасадссідаддачадса (5БО 0 МО: 57); зонда, Обде5-РЗ3 5- /РГАМИссссасц/геп/снадсдаааадаасда/ЗІАВКЕО/-3 (5ЕО ІЮ МО: 58). Розмір даного продукту ампліфікації гена-мішені становив 89 пар основ. У реакціях шаблонно використовували 2 мкл розщеплених препаратів ДНК. Склад реакційної суміші на зразок: референтний смисловий праймер (10 пМ), 1 мкл; референтний антисмисловий праймер (10 пМ), 1 мкл; зонд референтного гена (10 пМ), 0,5 мкл; смисловий праймер гена-мішені (10 пМ), 1 мкл;
антисмисловий праймер гена-мішені (10 пМ), 1 мкл; зонд гена-мішені (10 пМ), 0,5 мкл; суміш реактивів даРСКЕ, 12,5 мкл; вода 5,5 мкл, в загальному об'ємі 25 мкл.
Далі суміші вміщували до генератора крапельок ОХ100, який ділив кожен зразок на 20000 крапельок у діапазоні нл. Це здійснювали у 8-лункових картриджах до тих пір, поки всі зразки не були оброблені і перенесені на 9б-лунковий ПЛР планшет. Далі планшет опечатували термопластичною проколюваною фольгою за допомогою пристрою для запечатування планшетів. Після цього зразки обробляли з наступними умовами реакції: 95 "С, 10 хвилин, підйом із швидкістю 2,5 "С/с; потім 39 циклів при 94 "С, 30 з підйомом із швидкістю 2,5 "С/с; 61 "С, 1 хвилина, підйом із швидкістю 2,5 "С/с; 98 С, 10 хвилин, з подальшим охолодженням до 1270. Після реакцій ампліфікації ДНК у крапельках, планшети вміщували на пристрій для зчитування крапельок ОХ100, за допомогою якого аналізували кожну крапельку індивідуально із застосуванням двохбарвної системи виявлення (набір для виявлення РАМ або Нех). Цифрові дані ПЛР крапельки розглядали як 1-О графік, на якому кожна крапелька зразка була нанесена на графік інтенсивності флуоресценції, або 2-О графік, на який наносили флуоресценцію (ЕАМ) проти флуоресценції (Нех) для кожної крапельки. За допомогою програмного забезпечення вимірювали кількість позитивних і негативних крапельок для кожного флюорофору (ГАМ або
Нех) у кожному зразку. Далі за допомогою програмного забезпечення апроксимували фракцію позитивних крапельок до алгоритму Пуассона, щоб визначити концентрацію цільової молекули
ДНК в одиницях копій/мкл входження. Варіацію кількості копій обчислювали із застосуванням формули: СММ - (А/В) " МБ, де концентрація А - концентрація гена-мішені, В - концентрація референтного гена, і МБ - 4, кількість копій референтного гена у геномі.
Оцінка життєздатності пилку
Флуоресцеїну діацетат (ФДА) розчиняли в ацетоні у концентрації 2 мг/мл з одержанням запасного розчину. Розведення ФДА готували безпосередньо перед використанням, по краплях додаючи запасний розчин ФДА до 2 мл розчину сахарози (0,5 М) до насичення, на яке вказувала поява стійкої мутності.
Пропідію йодид (ПИ) розчиняли у стерильній дистильованій воді у концентрації 1 мг/мл з одержанням запасного розчину. Безпосередньо перед використанням 100 мкл запасного розчину додавали до 10 мл стерильної дистильованої води з одержанням робочого розчину.
Для перевірки співвідношення життєздатного і нежиттєздатного пилку, запасні розчини ПИ і
ФДА змішували у співвідношенні 2:3.
Рослини рапсу і гірчиці, трансгенні і дикого типу, вирощували у стандартних умовах в теплиці при 22-22 із фотоперіодом 16 годин на добу. Зрілі бутони, що були готові розкритися наступного дня, маркували і збирали наступного ранку у 9-10 годин. Пилок із розкритих квітів фарбували сумішшю ФДА/ПИ та візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопу І еіса
МАРШІ. Використовували емісійний фільтр із пропусканням у довгохвильовій ділянці спектру
СЕР-2 510 нм (пропускання червоного і зеленого світла) із фільтром збудження 480/40 нм для виявлення життєздатного і нежиттєздатного пилку. Нежиттєздатний пилок, який захоплював фарбник ПИ, мав червоний колір під флуоресцентним мікроскопом, тоді як життєздатний пилок при фарбуванні ПИ і ФДА мав яскраво-зелений колір.
Приклад 2. Стабільна експресія трансгенних біохімічних шляхів ДГК в насінні Агабідорвів
ІТаїїапа
Конструкція бінарного вектора
Бінарні вектори руР3416-сА?7 і руР3404 (також позначені в даному описі як "ЗА?7", описані в
МО 2013/185184), кожен з яких містить 7 гетерологічних генів біосинтезу жирних кислот, кодуючих 5 десатураз і 2 елонгази, та селекційний маркер для рослин між повторами лівої і правої меж Т-ДНК, присутніми в кожному векторі (Фіг. 2 і 3). У 5ЕБО ІЮ МО: 1 розкрита нуклеотидна послідовність ділянки Т-ДНК руРЗ416-с5А7 від правої до лівої граничних послідовностей. Обидві генетичні конструкції містять рослинні кодон-оптимізовані гени, що кодують А12-десатуразу І аспапсеа Кішсумегі (містить нуклеотиди 14143--16648 із «ЕО ІЮ МО: 1), ошЗ3-десатуразу Ріспіа равіогіз (містить нуклеотиди 7654-10156 із БЕО ІЮО МО: 1), Аб-десатуразу
Місготопах ризйа (містить нуклеотиди 226-2309 із БЕО ІЮ МО: 1), Д5- і Д4-десатурази Раміома заїїпа (містять нуклеотиди 4524-6485 і 10157-14142 із БЕО ІЮО МО: 1, відповідно) і Дб- і Д5Б- елонгази Ругатітопах согадаїа (містить нуклеотиди 2310-4523 і 17825-19967 із БЕО ІЮ МО: 1, відповідно).
Кожна із 7 кодуючих ділянок в конструкціях знаходиться під контролем специфічного для насіння промотору, причому використовуються три різних промотори, а саме вкорочений промотор напіну Вгаззіса пари5 (рВпЕР'1), промотор Агарідорзі5 Іпайапа ЕАЕ1 (рАгАЕЇ) і промотор конлініну 1 Гіпит и5наїййввітит (рі иСпі!). Сім генів біосинтезу жирних кислот спільно бо кодують повний біохімічний шлях синтезу ДГК, сконструйований з метою перетворення 18:129
(олеїнова кислота) на 22:бди710,13,16и19 (ДГК). Обидва бінарні вектори містять селекційний маркер для рослин ВАК, кодуючий ділянку, функціонально пов'язану з промотором вірусу мозаїки цвітної капусти 355 (Саму), що містить подвоєну ділянку енхансера, а також з термінатором транскрипції-ділянкою поліаденілювання по53' А. ішптеїгасіеп5. Селекційний маркер для рослин розташований суміжно з лівою межею Т-ДНК, тобто, дистально на Т-ДНК відносно орієнтації перенесення Т-ДНК в клітини рослини. Це підвищує вірогідність того, що часткове перенесення
Т-ДНК, яке, ймовірно, не включає ген селекційного маркера, не пройде селекцію. Кожний з руРЗ416-сА?7 і руРЗ3404 містить джерело реплікації КІА4 з Адгобасієегішт гпі2годепез5 (Натійоп, 1997).
Конструкція ЗА7 також містить дві послідовності ділянки прикріплення до матриксу КБб7 (ДПМ) Місоїапа їабасит, як описано нНаї! еї а. (1991). Послідовності ДПМ, які іноді називають ядерними ділянками прикріплення, відомі як такі, що специфічно зв'язуються з ядерним матриксом іп міїго і можуть опосередкувати зв'язування хроматину з ядерним матриксом іп мімо.
Вважається, що ДПМ зменшують сайленсинг трансгена. У руР3416-ЗА7 ДПМ також вставлені і розташовані в межах ділянки Т-ДНК для того, щоб вони виконували функцію розпірок ДНК, з метою ізоляції трансгенних касет експресії. Вектор руРЗ416 перед вставкою ділянки БА7 містить тільки касету селекційного маркера для рослин між межами.
Трансформація А. ІПаїапа і аналіз складу жирних кислот
Химерні вектори вводять в А. іштеїасіеп5, штам АСІ 1, і клітини з культур трансформованої
Адгобрасієгійт використовують для обробки. рослин А. ІПаїїапа (екотипи СоЇштрбіа і мутант тадг), застосовуючи для трансформації спосіб занурення квіток (Сіоцдпй апа Вепі, 1998). Після дозрівання врожай зерен Ті з оброблених рослин збирають і наносять на планшети М5, що містять фосфінотрицин (ФФТ), з метою селекції рослин, що містять ген селекційного маркера
ВАК. Саджанці Ті, що вижили і є здоровими, переносять в грунт. Після вирощування рослин до стану зрілості і надання їм можливості для самозапліднення, збирають урожай зерен То з одержаних рослин, і склад жирних кислот у ліпіді їх насіння аналізують за методом ГХ, як розкрито у Прикладі 1.
Конструкція руР3416-ЗА7 приводить до продукування дещо вищих рівнів ДГК, виражених як відсоток від загального вмісту жирних кислот, в середньому щодо конструкції руРЗ404.
Зо Ефективність перетворення для кожної стадії ферментації в продукуванні ДГК з олеїнової кислоти обчислена як ( 95 продуктів х 100)/ 95 субстрату, що залишився « 95 продуктів), і таким чином виражена у відсотках.
Найвищий спостережуваний рівень продукування ДГК в трансформованих руР3416-СА7 лініях То становить 6,2 95, додатково з 0,5 95 ЕПК і 0,2 95 ДПК (лінія 214). Вказане насіння Тег все ще було сегрегованим по трансгену, тобто ще не було однорідно гомозиготним. Рівень 03 жирних кислот, продукованих в результаті наявності трансгенів в цьому насінні (нові загальні 03 жирні кислоти, за винятком рівня АЛК, яка виробляється ендогенно в екотипі СоЇштріа), становить 10,7 95, тоді як рівень 06 жирних кислот (нові загальні 06 жирні кислоти, за винятком 18:289и12) становить 1,5 95. Це представляє надзвичайно сприятливе співвідношення нових 03 жирних кислот : нових 06 жирних кислот, а саме 7,321.
Насіння Т» відібраних ліній, трансформованих руР3416-ОА7, а саме ліній, позначених 7, 10, 14, 22 їі 34 в екотипі СоЇштріа, і ліній, позначених 18, 21 і 25 в мутанті екотипі Тад2, наносять на планшети із середовищами М5, що містять ФФТ, для селекції трансгенних саджанців іп міго. По 20 ФФТ-резистентних саджанців з кожної лінії переносять в грунт і вирощують до стану зрілості після самозапліднення. Було високою мірою вірогідним, що ці рослини будуть гомозиготними по гену селекційного маркера, і таким чином, містити щонайменше по одній вставці Т-ДНК в геномі рослин. Урожай зерен Тз з цих рослин збирають і аналізують склад жирних кислот в олії з насіння за методом ГХ. Даний аналіз виявив, що конструкції руР3416-5А7 генерують вищі рівні ш3 ДЛ-ПНЖК ДГК в насінні Тз гомозиготних рослин, ніж в сегрегованому насінні Т2. До близько 13,9 95 ДГК спостерігається в трансформованій рОРЗ3416-А7 лінії Тз, позначеній 22.2 в екотипі
Соїштбіа, що означає збільшення з рівня близько 5,5 95 в гемізиготному насінні Т2, причому сумарний рівень нових 03 жирних кислот становить близько 24,3 95 від вмісту загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Рівень нових б жирних кислот становить 1,1 95 від загальних жирних кислот, представляючи високою мірою сприятливе співвідношення нових 003 жирних кислот : нових 06 жирних кислот, а саме, близько 22:11. Так само, трансформанти в екотипі їад2 дають сумарну кількість нових 003 жирних кислот 20,6 956, включаючи 11,5 95 ДГК, як відсоток від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння.
Ефективність ферментного перетворення для кожної ферментної стадії в біохімічному шляху одержання ДГК з олеїнової кислоти наведена в Табл. 8 для насіння Тз з вищими рівнями 60 ДГК. Ефективність перетворення під дією А12-десатурази в насінні лінії 22.2 становила 81,6 905, і ефективність 03-десатурази становила 89,1 95, причому обидва значення є досить високими і вказують на те, що дані грибкові (дріжджові) ферменти можуть добре функціонувати в насінні, що розвивається. Активність інших екзогенних ферментів в дорозі ДГК була подібним чином високою по відношенню до субстратів 03, причому ефективність Дб-десатурази становить 42,2 до, Аб-елонгази -- 76,8 95, Д5-десатурази -- 95,0 95, ДА5-елонгази -- 88,7 95 і А4-десатурази -- 93,3 95. Активність ДЛб-десатурази по відношенню до субстрату 0б ЛК є набагато нижчою, і ефективність перетворення ЛК під дією Дб-десатурази становить тільки 0,7 95. ГЛК присутній на рівні всього 0,4 956 ії являє собою єдиний новий продукт 06, за винятком 20:206, знайденої в насінні Тз з найвищим вмістом ДГК. Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для незалежного трансгенного насіння наведені у Табл. 5.
Таблиця 4
Ефективність перетворення для окремих ферментних стадій одержання ДГК з олеїнової кислоти, що спостерігалася в загальних ліпідах насіння для трансгенного насіння Тз Агарідорзвів.
Та
Та Со! 22.2
ОА | СА7 | ФА7 | СА? | САТ | УА од | ЗА ОЇ (середнє | С9-2
ЕА02 ЕА02 2.2 бої |Сої |Сої |Сої | Со! оБ ЕАб2 18 значення /- (найк- 7.2 342 | 10.13) 22.2 | 14.19 0 І 21.2 1 | стандартне ащша відхилення) ращ лінія) а12- 75,4 | 731 | 75,7 | 81,61 73,4 | 66,6 | 78,5 | 63,1 о о а15- 85,3 844 | 862) 891 | 702 87,51 822 | 87,6 о о пи п п ПНЯ ПОЯ ПООНЯ КОНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ КО КОХ 5, аб-
Оме- | єло га-6 аБ- дес аБ- ело а4- дес 11 дес о о о о о о о о " о " о 5 аб- 79,0 | 81,1 | 79,0) 768 | 70,91 792 | 75,2 | 791 о о га З а5- 94,0) 946 | 94,5) 9501 97,9. | 87,8 | 93,3 | 91,1 о о а5- 91,9.) 91,7 | 93,6 |) 88,7 | 89,5 | 899 | 92,2 | 91,6 о о ад- 93,2 | 93,7 | 944 | 93,3 | 93,7 | 92,5 | 95,0 | 93,9 о
Таблиця 5
Компільовані дані з профілів загальних ліпідів насіння для незалежного трансгенного насіння.
Та
Со! 22.2 (се- ред- Та
СА7 нє Со!
СА7 (2А7 |(БА7 |2А7 |0А7 ЕАро зна-| 222
Параметр бої! | Со! | Сої | СоїЇ | СоЇ. 181 чен- | (най- 10.13) 22.2 14.19 7.2 | 342 щи ня - | кра- ста- ща нда- | лінія) ртне від- хиле- ння)
Загальні м/3 ( 9о від загальних ЖК) 50,0148,9151,6155,8| 38,6 | 47,1 1494 | 44,8 | 54,0 | 55,9
Загальні м/б
Співвідношення м/ЗЛув
Співвідношення м/блуз
Загальні нові м/З
Загальні нові ж/б
Схвдзаальшжю || 209 ме ою те ол | я сдіввідношення нових 13,58 12,67 |17.22 2209 8,33 |20,89 11,39 | 20,00 | 16,43 | 18,86
Співвідношення нових 0,07 | 0,08 0,05. 012 | 0,05 0,05 0,05 м блуз
Ефективність 141 1133134 12181102 1150116,81112 |) 204 245 9, перетворення ОК на ЕПК то то то то то то о о о по
Ефективність 12,01 11,4 | 11,8 | 18,0 с/ | 12,6 | 14,68 с/ | 17 о
Ефективність 1891184 |179126,91142122,91|21,8| 180 | 262 299 9, перетворення ЛК на ЕПК то то то то то то о о о о
Ефективність 16,02115911571222|12,01191 | 191 | 15,5 ) 21,9 245 9, перетворення ЛК на ДГК то то то то то то о о о по
Ефективність 2221219|20,7130112021261 | 26,51 20,5) 294 329 9, перетворення АЛК на ЕПК то то то то то то о о о о
Ефективність 199301 18,8) 1821 24,9 | 17,11 21,91 23,3 | 17,6 | 24,6 270 9; перетворення АЛК на ДГК то то то то то то о о о о кислоти жирні кислоти жирні кислоти
Загальні С20
Загальні С22 114| 11 |т108|15,5 86 | 121132) 8,9 | 154 | 175
Співвідношення С20/С22
Насіння Тз лінії руР3416-СА?7 22.2 в екотипі Соїштбіа, що є нащадками лінії Те» 22, висівають безпосередньо в грунт, і склад жирних кислот в зрілому насінні одержаних в результаті рослин
Тз аналізують за методом ГХ. Середній рівень ДГК в цьому насінні становить 13,3 90 ж 1,6 (п -
10) як відсоток від загальних жирних кислот в ліпіді насіння. Лінія з найвищим рівнем ДГК містить 15,1 95 ДГК від загального вмісту жирних кислот в ліпіді насіння. Ферментна ефективність перетворення наведена в Табл. 4 для кожної стадії одержання ДГК з олеїнової кислоти.
Здійснюють аналіз гібридизації методом саузерн-блоту. Результати показують, що лінії з високим рівнем акумуляція ДГК містять одинарну або подвійну копію Т-ДНК з конструкції руРЗ416-сА?7, за винятком трансгенної лінії Соїшмтбріа 22, що містить три вставки Т-ДНК в геномі рослини Агабрідор5хі5. Насіння покоління Т5 також проаналізоване, і знайдено вміст до 13,5 95 ДГК в загальних ліпідах насіння. Конструкція ЗА7 продемонструвала стабільність протягом декількох поколінь з точки зору здатності до утворення ДГК.
Визначення вмісту олії в трансгенних лініях А. Іпаійапа ДГК
Вміст олії в трансгенному насінні А. Ійаїїапа з різними рівнями ДГК визначають за методом
ГХ, як розкрито в Прикладі 1. Дані проілюстровані на Фіг. 4, де наведений графік вмісту олії ( 90 олії від маси насіння) проти вмісту ДГК (як відсотка від загальних жирних кислот). Знайдено до 26,5 мг ДГК на грам насіння (Табл. 6). Знайдено, що вміст олії в трансгенному насінні
Агарідорзі5 негативно корелює з вмістом ДГК. Кількість ДГК на масу насіння була великою в трансформованому насінні, з рівнем ДГК близько 9 95 відносно насіння із вмістом ДГК близько 14 95. Подальші дані для інших видів, окрім Агарідорзі5, продемонстрували, що дана негативна кореляція є більш вираженою для Агарідор5і5, ніж для видів С. займа або Вгаззіса (Приклад 8 нижче).
Таблиця 6
Частка і кількість ДГК в насінні трансформованого СА? Агарідорзвів.
Вміст ДГК Вміст олії (95 олії на Вміст ДГК (95 від ОЖК) грам насіння) за масою (мг/г насіння) аА?7/сої 22.2-1 142 14,89 202 аА?7/сої 22.2-2 143 15,02 20,5 аА?7/сої! 22.2-3 14,0 15,92 21,2 сіА?Т/сої 10.15-1 8,7 30,23 25,06 сА?7/сої 10.15-2 8,6 31,25 25,77 сіА?7/сої! 10.15-3 8,6 31,70 26,49
Приклад 3. Стабільна експресія трансгенного шляху ДГК в насінні Сатеїїпа заїїма
Бінарний вектор руР3416-сА7, розкритий вище, вводять в штам А. іШшптегасіеєп5 АСІ, і клітини з культури трансформованої Адгобасіепйцт використовують для обробки квітучої рослини С. заїїма, із застосуванням способу занурення квіток для трансформації (І и апа Капод, 2008). Після вирощування і дозрівання рослин, урожай насіння Ті. з оброблених рослин збирають, висівають в грунт, і одержані в результаті рослини обробляють шляхом обприскування гербіцидом ВАБЗТА для селекції трансгенних рослин, що експресують ген
Зо селекційного маркера баг на Т-ДНК руРЗ3416-СА?7. Рослини Ті, що вижили і є толерантними до гербіциду, вирощують до стану зрілості після того, як їм дають можливість самозапліднення, і збирають урожай насіння То, що утворилося. П'ять трансгенних рослин були одержані, тільки три з них містили повну Т-ДНК.
Ліпід екстрагують з пулу близько 20 насінин кожної з трьох рослин, що містили повну Т-ДНК.
Два з об'єднаних в пул зразків містили дуже низькі, ледве знайдені рівні ДГК, але третій пул зразків містив близько 4,7 95 ДГК. Таким чином, ліпід був витягнутий із 10 індивідуальних насінин Т2 даної рослини, і склад жирних кислот проаналізований методом ГХ. Дані щодо складу жирних кислот індивідуального насіння для даної трансформованої лінії також наведені в Табл. 7. Компільовані дані з профілів (Табл. 7) загального ліпіду насіння наведені в Табл. 8.
ДГК була присутня у шести із 10 індивідуальних насінин. Чотири інші насінини не містили
ДГК і були прийняті як нульові сегреганти, що не містять Т-ДНК, на базі гемізиготності інсерції Т-
ДНК у материнській рослині. Екстрагований ліпід із єдиної насінини з найвищим рівнем ДГК містив 9,0 95 ДГК, тоді як сумарний відсоток для ЕПК, ДПК і ДГК становив 11,4 905.
Таблиця 7
Склад жирних кислот загальних ліпідів насіння з трансгенного насіння Тг Сатвеїіїпа заїїма, трансформованих Т-ДНК з рОР3416-СА7. Склад жирних кислот наведений для об'єднаної в пул серії (ЕО5.46) насіння і для 10 окремих насінин, ранжируваних (зліва направо) від найвищого до найнижчого рівня ДГК.
Пул 140 | 0 1 021|02|о011|021|02|02 02|о01 02 /| 02 167 | 02 | 00|о01|о011|001|021|00 02|02 02 | ог 163 | 03 | 0 |о00|001|00|00|00 00 |о00 00 | оо 187 | 108 8080 | 86 | 8594 | 110 т102| 83 | 94 | 86 18306 | 02 14 |03|031|04|02|05 00105 04/06 18453 | 22 | 68 |64 | 57 | 72 | 57 | 41 00 | 00 00 | 00 2блію, | 04 03103 |031|03|03|00 05106 05/05 202юв6 | 08 | 08109108 /|06|08|07 13 | 15 | 14 | 14 20303 | 06 / 08108108 /07|08|07 06107 0 | 06 220 | 04 1 051|051051|04|051|05 06/06 0606 20453 | 02 | 031|03|031|04| 04 | 05 00|00 00 | 00 221 | 111 | 12 | 1 | 05 | 09 | 08 | 16 | 22 | 19 | 20 20503 | 07 | 13 |16|15/|16 | 11 |17 00 |00 00 | о 22 2юв | 01 00100 |001|00|001|00 02/03 02 | ог о22:40622:303| 03 02103 |031|00|031|00 04 |06 05 | 05 240 | 03 03103103 1|00|03|00 04|04 04 /|о4 241 | 03 04104 |031|00|03|00 05106 05/05 22503 | 03 | 11 | 12 | 11 | 11 | 09 | 08 0000 00 | о 22бю3 | 47 | 90 | 85 | 83 | 83 | 71 | 49 | 00 | 00 | 00 | о
Таблиця 8
Компільовані дані з профілів загального ліпіду насіння для трансгенного насіння, наведеного в
Табл. 7. Обчислення не включають «незначних жирних кислот», включених в Табл. 7.
ЕО5.46
Си | |ни| не |ва|но ях змо тло ме зо (95 від 36,1 46 454 45 482 | 442 | 401 128,91 29,9) 302 | 28,9 загальних ЖК)
Загальні м/б (95 від 25,8 204 | 20,7 | 20,3 | 19,5 | 211 25 33,7 | 32,6 | 31,8 | 33,8 загальних ЖК) ня м З/Луб ня мб/мЗ
Загальні нові
З. ви | лв5 | 18 | 169) 186 | 152 | 12 би (95 від загальних ЖК)
ЕО5.46
Загальні нові мб . 1,1 2,2 12 11 1 1 12 1,5 2,3 2 22 (95 від загальних ЖК)
Співвідношен- ня нових 7,36 8,41 | 15,00 | 15,96 | 18,60 | 15,20 | 10,00 0,05
М З/ЛМб
Співвідношен- ня нових 0,14 012007 10,07 | 0,05) 0,07 | 010 22,00 м б/мЗ
Ефективність перетворення 8.2 о 15,6 о 15,5 о 15,1 о 15,1 о 12,8 о 10,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 01 Зо
ОК на ЕПК
Ефективність перетворення 6,7 о 12,3 о 11,6 о 11,5 о 11,4 о 10,0 о 7,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ОК на ДГК
Ефективність перетворення 92 о 172 о 171 о 16,7 о 16,2 о 13,9 о 114 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 02 Зо
ЛК на ЕПК
Ефективність перетворення 7,6 о 13,6 о 12,9 о 12,7 о 12,3 о 10,9 Уо| 7,9 90 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,0 Зо
ЛК на ДГК
Ефективність перетворення 15,8 о 24,8 о 24,9 о 242 о 22,8 о 20,6 о 18,5 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо 0,3 Зо
АЛК на ЕПК
Дон точені вин ваз том во вом вом вот поч оотя перетворення 13,0 о 19,6 о 18,7 о 18,4 о 17,2 о 16,1 о 122 о 0,0 о 0,0 о 0,0 о 0,0 Зо
АЛК на ДГК
Загальні насичені жирні! 17,6 17,8. 17,8 | 17,6 18 17,8. | 181 | 18,2.) 17,7 | 17,68 | 181 кислоти
Загальні мононенасиї 398 155 | 16 | 16,6.) 143) 166 | 16,8 | 18,7 | 193 | 1946 | 18,6 чені жирні кислоти
Загальні полІНЕНаСИчЧе во Б 664 65, | 67,7 | 656 | 651 | 63 | 63 | 625 | 632 ні жирні кислоти
Загальніс2о | 96 / 93 | 98 | 9,9 | 8 / 89 | 85 | 86 | 11 | 103 ло
Загальніс22 | 54 /103| 10 | 9,7 | 94 | 83 | 57 |06109|07 07
Співвідношен- ня загальні 1,78 0,98 | 1,02. 0,86 | 1,07 | 14,9 |14,33| 12,22 | 14,71| 1443 б20/022
Гомозиготне насіння цієї лінії одержують в поколінні Т4. До 10,3 956 ДГК продукується в події
ЕО5-46-18-110, із середньою величиною 7,3 95 ДГК, спостережуваною для всього покоління ТА.
Наступне покоління (15) було одержане з метою додаткового тестування стабільності продукування ПНЖК впродовж декількох поколінь, особливе ДГК. Знайдено, що спостережувані максимальні рівні ДГК були стабільними у п'ятому поколінні, навіть незважаючи на те, що вміст
ДГК в пулі насіння не стабілізувався до покоління Т4 через присутність численних трансгенних локусів. Додатково, партії насіння Т5 пророщували на середовищах МС іп міо разом із насінням материнської С. заїїма, причому очевидних відмінностей у ефективності або швидкості проростання не спостерігалося. Подальші покоління трансгенної лінії (покоління Т6, 17 і т.д) не виявляли зниження рівня ДГК у насінні. Трансгенні рослини володіли повноцінною чоловічою і жіночою фертильністю, і пилок продемонстрував близько 100 95 життєздатності відносно рослин дикого типу. Аналіз вмісту олії в насінні, що містить різні рівні ДГК, не виявив кореляції між рівнем ДГК і вмістом олії, на протилежність кореляції, спостережуваній для Агарідорвів ІПаїЇапа.
У декількох подальших трансгенних лініях, вміст ДГК в окремих насінинах від незалежних подій перевищував 12 95. Співвідношення трансгенних : нульових для цих ліній становило близько від 3:1 до 15:1. Аналіз характерних профілів жирних кислот для зразків із найвищим вмістом ДГК від кожної конструкції виявив тільки 1,2-1,4 95 ГЛК за відсутності інших нових 06
РНЖК. І навпаки, було знайдено, що нові 3 ПНЖК (СДК) ю3 ДДЦД-ПНЖК (ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) акумулюються до 18,5 95 при рівні ДНК 9,6 95 у загальному вмісті жирних кислот. Ступінь Дб- десатурації становив 32 95, і вміст ЕПК становив 0,8 95 від загального вмісту жирних кислот.
Ефективність Д5-десатурації становила 93 95, і ефективність Аб-елонгації становила 60 95. ДГК була знайдена у полярній Фракції ліпідів насіння ліній СА7.
Було відзначено, що спостережувані співвідношення сегрегації (від «3:11 до «15:1) вказують на те, що один або максимум два трансгенних локуси були необхідними для продукування ДГК у С. займа на рівнях, подібних до рівнів у риб'ячому жирі. Це має важливе значення для простоти розведення трансгенної ознаки, а також для стабільності трансгена.
Гомозиготне насіння висаджують в декілька теплиць, з метою одержання сумарно понад 600 індивідуальні рослини. Олію екстрагують з насіння із застосуванням різноманітних способів, зокрема, апарату Сокслета, екстракції ацетоном і гексаном.
Здійснювали "ЗС ЯМР аналіз регіоспецифічності для олії насіння трансгенної 3. заїїма із метою визначення позиційного розподілу 03 ДЛ-ПНЖК у ТАГ. Подія із близько рівним вмістом
ЕПК і ДГК була вибрана для максимізації відповіді на дані жирні кислоти, причому співвідношення 5п-1,3 до 5п-2 було знайдено на рівні 0,75:0,25 для ЕПК і 0,86:0,14 для ДГК, притому, що об'єктивний розподіл повинен був би становити 0,66:0.33. Тобто, 75 905 ЕПК і 86 905
ДГК були розташовані в положенні 5п-1,3 ТАГ. Це показує, що обидві жирні кислоти були переважно локалізовані у положеннях ТАГ б. займа, хоча перевага для ЕПК була виражена слабше, ніж для ДГК. Той факт, що ДГК була переважно знайдена у 5п-1,3, був подібний до результатів, про які раніше повідомлялося для насіння А. ІПаїїапа (Реї/е еї а!., 2012).
Оскільки кількість незалежних трансгенних ліній, одержаних у розкритих вище експериментах із трансформацією, була низькою, подальші трансформації С. 5айма були здійснені із застосуванням конструкції мотиву ЗА7-тоаВ (Приклад 4). Одержана більша кількість трансформантів, та ідентифіковані гомозиготні лінії, які продукують ДГК в кількості
Зо більше 20,1 95.
Приклад 4. Модифікації Т-ДНК, що кодують шляхи ДГК в насінні рослин
Для покращення рівня продукування ДГК у В. паривх, в порівнянні з рівнями, описаними у
УМО2013/185184, бінарні вектори руР3416-СА7-тодА, руРЗ416-Сд7-тоав, руР3416-сА7-тоас, ругР3416-саА7-тодО, руРЗ3416-4А7-тоаЕ і рОР3416-СА7-тоав були сконструйовані, як описано у МО2013/185184, і протестовані на трансгенних рослинах. Ці бінарні вектори є варіантами конструкції роуР3416-А7, розкритої у Прикладі 2, і були сконструйовані з метою подальшого підвищення синтезу ДГК в насінні рослин, особливо шляхом покращення функцій Дб-десатурази і ДАб-елонгази. Спостерігалася акумуляція СДК в деякому насінні, трансформованому конструкцією (зА7, внаслідок відносно низької ефективності Дб елонгації, в порівнянні з Д5- елонгазою, тому, серед інших модифікацій, положення двох генів елонгази було змінене в Т-
ДНК.
Дві послідовності, що кодують елонгази у руР3416-СА?7, були поміняні місцями на Т-ДНК, з одержанням рур3416-сА7-тодА першим клонуванням нової касети Аб-елонгази Р. согдага між сайтами БИ руР3416-СА7, для заміни касети А5-елонгази Р. согааїа. Ця конструкція була додатково модифікована шляхом обміну промотору ЕР, який контролює Аб-десатуразу М. ризійа, з промотором конлініну Спі2 (рі иСпі2) щоб одержати рОРЗ416-СА7-тоаВ. Дана модифікація була здійснена з метою збільшення експресії Дб-десатурази, і таким чином ефективності ферменту. Вважається, що промотор Спі2 може давати більш високу експресію трансгену у В. пари, ніж вкорочений промотор напіну.
Одержано 8 трансгенних подій руР3416-сА7-тоаВ А. (Шайапа і 15 трансгенних подій ругР3416-аА7-тоас А. Іаїїапа. Спостерігається від 3,4 95 до 7,2 95 ДГК в пулі насіння руР3416-
СА?7-тоаВ, і від 0,6 до 4,1 95 ДГК в пулі насіння 12 руР3416-СА7-тоаб. Деякі з подій руР3416-
СІА7-тоаВ з найвищим рівнем висівають на селекційні середовища, і саджанці, що вижили, відбирають для наступного покоління. Насіння аналізують щодо вмісту ДГК. Оскільки об'єднане в пул насіння Т1 представляє популяції, сегреговані по трансгенах, і включають будь-які нульові сегреганти, очікується, що в гомозиготному насінні рослин-нащадків рівні ДГК будуть вищими, до 30 95 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння. Інші модифіковані конструкції використовувалися для трансформації А. Ійаійапа. Хоча одержана тільки невелика кількість трансформованих ліній, жодна з них не давала вищих рівнів ДГК, ніж конструкція тоавВ.
Конструкцію рОРЗ3416-24А7-тоав додатково застосовували для генерації трансформованих рослин В. пари сорту Озсаг і серії сортових ліній, позначених МХ002, МХО003, МХО005, МХО50,
МХО52 і МХО54. Всього було одержано 1558 трансформованих рослин, включаючи 77 незалежних трансформованих рослин (ТО) для трансформації О5саг, і 1480 незалежних рослин для сортових ліній, включаючи 189 для МХО05, що є лінією із високим вмістом олеїнової кислоти в олії насіння завдяки мутаціям у генах ЕАО2. Інші сортові лінії містили вищі рівні ЛК і АЛК.
Трансгенні рослини, які продемонстрували більше 4 копій Т-ДНК за даними методу цифрової
ПЛР (Приклад 1), були відкинуті; близько 25 95 рослин ТО було відкинуто за даним критерієм.
Близько 53 95 трансгенних рослин ТО містили 1 або 2 копії Т-ДНК за даними методу цифрової
ПЛР, 12 95 містили близько 3 копії, і 24 95 -- 4 або більше копій. Урожай насіння (насіння Т1) був зібраний близько із 450 трансгенних ліній після самозапилення, досягнутого шляхом ізолювання рослин мішечками під час цвітіння, щоб уникнути схрещування. Урожай насіння Т1 зібраний із решти трансгенних рослин після дозрівання. Близько 1-2 95 ліній рослин були стерильними з точки зору чоловічої або жіночої фертильності і не давали життєздатного насіння; такі рослини
ТО були відкинуті.
Пули насіння (по 20 насінин Т1 у кожному пулі) тестували щодо рівнів ДГК в пулі олії з насіння, і лінії, які продемонстрували найвищі рівні, відбирали. Зокрема, були відібрані лінії із вмістом ДГК щонайменше 2 95 від загального вмісту жирних кислот в пулі насіння Т1. Близько 15 95 трансгенних ліній було відібрано в такий спосіб; інші 85 95 були відкинуті. Деякі з них були позначені як лінії СТ132-5 (сорт Озсаг), СТ133.15-15, -24, -63, -77, -103, -129 ії -130 (у МХО05).
Відібрані лінії у МХО5О включали СТ136-4, -8, -12, -17, -19, -25, -27, -49 і -51. Забезпечували набухання двадцяти насінин з відібраних ліній, включаючи СТ132.5 і 11 насінин з СТ133.15, і через два дні олію витягають з половини сім'ядолі кожної з індивідуальних насінин. Другу половину сім'ядоль з ембріональними осями утримують і культивують на середовищах, щоб зберегти конкретні лінії нащадків. Склад жирних кислот в олії визначають; дані для СТ132.5 наведені в Табл. 16. Рівень ДГК в 10 із проаналізованих 20 насінин, за даними аналізу методом
ГХ, знаходиться в інтервалі 7-20 95 від загального вмісту жирних кислот. Інші насінини містили менше 7 95 ДГК і могли містити часткову (неповну) копію Т-ДНК із руР3416-СА7-тоав. Схоже, що трансгенна лінія містить множинні вставки трансгена, які були генетично роз'єднані. Насіння
Зо трансгенної лінії СТ133.15 продемонструвало рівні ДГК в інтервалі 0-5 95. Насінини без ДГК, ймовірно, були нульовими сегрегантами. Ці дані підтверджують, що конструкція тоав функціонує належним чином для одержання ДГК в насінні рапсу.
Двадцять або 40 індивідуальних насінин (насіння 12), одержаного від кожної з множини рослин ТІ після самозапилення, від відібраних трансформованих ліній, індивідуально тестували щодо складу жирних кислот. Було ідентифіковане насіння, що містить рівні ДГК вище 20 905 (Табл. 10). Два репрезентативних зразки, СТ136-27-18-2 і СТ136-27-18-19, містили 21,2 95 до 22,1 95 ДГК, відповідно. Загальний вміст 003 жирних кислотних у цих насінинах становив близько 60 95, як відсоток від загального вмісту жирних кислот, і вміст об становив менш ніж 10 95. Інші набори по 20 або 40 насінин 12 від кожної із рослин Т1 тестували щодо складу жирних кислот.
Репрезентативні дані рівнів ДГК у загальному вмісті жирних кислот олії насіння з індивідуального насіння Т2 проілюстровані на Фіг. 10. Насіння, що містило до 34,3 95 ДГК, було ідентифіковане, наприклад, серед насіння СТ136-27-47-25 (Табл. 12). Склад жирних кислот для олії з насіння, одержаної із СТ136-27-47-25, наведений у Табл. 12. Склад жирних кислот включав 34,3 95 ДГК, разом із близько 1,5 95 ДПК, 0,6 95 ЕПК і 0,5 95 ЕТК. Рівень СДК становив близько 7,5 95, АЛК -- близько 21,9 95, і ЛК -- близько 6,9 95. Нові 06 ПНЖК продемонстрували 1,1 965 ГЛК, за відсутності Ф6-С20 або -б22 ДЦ-ПНЖК, що піддавалися б виявленню. Загальні насичені жирні кислоти: 9,6 95; мононенасичені жирні кислоти, 12,5 95; загальні ПНЖК, 75,2 90; загальні 06 ПНЖК (включаючи ЛК), 7,2 90; загальні 03 ПНЖК, 66,9 95; співвідношення загального вмісту 06:33 жирних кислот, 9.3:1; нові 06 : нові 03 жирні кислоти, 37:1.
Ефективність кожної із стадій ферментації від олеїнової кислоти до ДГК була такою, як указано нижче: ДІ12-десатураза, 90 95; А15/03-десатураза, 89 95; Дб-десатураза, 67 90; Дб-елонгаза, 83
Фо; А5-десатураза, 99 9о; Д5-елонгаза, 98 90; Д4-десатураза, 96 95. Загальна ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК становила близько 50 95. Таким чином, було очевидним, що насіння, яке продукує ДГК в діапазоні 20,1-35 95 від загального вмісту жирних кислот в олії насіння, могли би бути ідентифіковані і відібрані, зокрема насіння, що містить від 20,1 95 до 30 95 ДГК або від 30 95 до 35 95 ДГК у загальному вмісті жирних кислот.
Вміст олії у деяких насінинах був зниженим від близько 44 95 у насінні дикого типу до близько 31-39 95 у деяких з продукуючих ДГК насінин, але був подібним до рівнів дикого типу в інших продукуючих ДГК насінинах.
Різноманітні трансформовані лінії рослин, що продукували ДГК на рівнях щонайменше 10 90 у насінні Т2, схрещували і забезпечували самозапилення потомства Е1, щоб одержати потомство 2, гомозиготнн по множинних інсерціях Т-ДНК. Олію насіння із гомозиготного насіння проаналізували і знайшли, що до ДГК складає 30 95 або 35 95 від загального вмісту жирних кислот в олії з насіння.
ТАГ в олії, одержаній із СТ136-27-18-2 і СТ136-27-18-19, проаналізували регіоспецифічним методом "Зб ЯМР щодо позиційного розподілу ДГК у гліцериновій основі молекул ТАГ. ДГК переважно була приєднана у положенні 5п-1,3. Більш ніж 70 95, фактично більш ніж 90 95 ДГК знаходилося у положенні 5п-1,3.
У декількох подальших трансгенних лініях, вміст ДГК в індивідуальному насінні від незалежних подій перевищував 12 95. Співвідношення трансгенних : нульових для цих ліній становило близько 3:1, що відповідало одному трансгенному локусу, або 15:1, що відповідало двом трансгенним локусам. Аналіз характерних профілів жирних кислот для зразків від кожної конструкції із найвищими рівнями ДГК виявив тільки 1,2-1,4 95 ГЛК за відсутності інших нових 0б
ПНЖК, що піддавалися б виявленню. На протилежність цьому, нові 03 ПНЖК (СДК) і 03 ДлЛ-
ПНЖК (ЕТК, ЕПК, ДПК, ДГК) акумулювалися до сумарного рівня 25,8 95 для конструкції тодЕ і 21,9 95 для конструкції тод, в порівнянні з 18,5 956 для (зА7-трансформованого насіння. Рівні
ДГК в олії із цього насіння становили 9,6 905, 12,4 9б і 11,5 95, відповідно. Ступінь Дб-десатураціїї був нижчим у СА7-трансформованому насінні, ніж у тоавг- і тодо-трансформованому насінні (32 95 проти 47 95 і 43 90), що приводило до зниження рівня АЛК у насінні тоаб і тоас, в порівнянні з (зА7. Іншою значущою відмінністю була акумуляція ЕПК в насінні той (3,3 95 проти 0,8 95 у двох інших трансгенних насінинах), і це відображалося у зниженні ступеня АД5Б- елонгації, що спостерігався у насінні тод (80 95), в порівнянні із насінням СА? і тодо (93 9б і 94 Фо). Спостерігалося невелике збільшення ступеня Аб-алонгації у цьому насінні (66 95 проти 60
Фо і 61 95), хоча кількість СДК фактично збільшувалася унаслідок дещо активнішої Дб- десатурації. ДГК була знайдена у полярній фракції ліпідів насіння ліній СА?7.
Проаналізований склад жирних кислот у ліпіді насіння Т1 для 70 незалежних трансгенних рослин В. париз сортової лінії МХ54, трансформованої конструкцією тоав Т-ДНК. Знайдено, що одна із цих трансгенних рослин дає насіння, що містить ДПК, але в олії з насіння ДГК відсутня. У
Зо насінні Т1 даної лінії (СТ-137-2) продукувалося близько 4 95 ДПК, за відсутності в пулі насіння
Т1 ДГК, що піддавалася б виявленню. Винахідниками був зроблений висновок про те, що це спричинено інактивацією гена Д4-десатурази у конкретній інсерційній Т-ДНК, можливо, в результаті спонтанної мутації. Близько 50 насінин Т1 від даної трансгенної лінії проростили, та із кожної проаналізували один котиледон, що з'являвся, щодо складу жирних кислот у залишковій олії. Відібрані саджанці, що демонстрували більш ніж 5 95 ДПК, були вирощені до стану зрілості, і зібраний урожай насіння Т2. Склад жирних кислот в пулі насіння проілюстрований у Табл. 11, причому у цих лініях спостерігалося більш ніж 7 95 ДПК.
Хоча фокус даного експерименту знаходився на демонстрації продукування ДГК у видах олійної культури, відзначені вище відмінності також були цікавими з точки зору перспективи дизайну конструкції. По-перше, перемикання локалізації ділянки, що кодує Дб- і Д5-елонгазу в конструкції тодЕ приводить до передбачуваних модифікацій профілю, коли акумулюється більше ЕПК унаслідок нижчого ступеня Д5-елонгації. Супутнє збільшення ступеня Дб-елонгації спостерігалося, але не приводило до нижчих рівнів СДК. Це було результатом підвищення ступеня Лб-десатурації у трансформованому той насінні, спричиненого додаванням додаткової експресійної касети Дб-десатурази М. ривзШа, а також заміною вкороченого промотору напіну (ЕРТ) активнішим промотором конлініну2 льону. Дещо менш виражене підвищення ступеня Дб-десатурації, спостережуване у разі конструкта тодо, було спричинене капіталізацією на касеті Д5-елонгазі з високою експресією у СЗА7. Перемикання положень ділянок, що кодують Дб-десатуразу та Д5-елонгазу, приводило до вищого ступеня дДб- десатурації. Активність Д5-елонгази не знижувалася в цьому випадку завдяки заміні промотору
ЕР промотором Спіг.
Ці дані підтверджують, що конструкції тоав, тоаЕ і тодОс є ефективними з точки зору продукування ДГК у насінні Сатеїйнпа, відносно Агарідорзвів і рапсу.
Автори винаходу вважали, що, загалом, ефективність обмежуючої швидкість ферментної активності в біохімічному шляху ДГК може бути вищою в мультикопійних Т-ДНК трансформантах, в порівнянні з однокопійними Т-ДНК трансформантами, або може бути збільшена шляхом інсерції в Т-ДНК декількох генів, що кодують фермент, який може бути обмежуючим в біохімічному шляху. Докази можливої важливості мультикопійних трансформантів спостерігалися у насінні Агарідорзіз5, трансформованому конструкцією БА7 бо (Приклад 2), де подія з найвищим виходом ДГК містила три інсерції Т-ДНК в геномі хазяїна.
Декілька генів можуть бути ідентичними, або переважно є різними варіантами, що кодують один і той же поліпептид або знаходяться під контролем різних промоторів з патернами експресії, що перекриваються. Наприклад, підвищена експресія може бути досягнута шляхом експресії декількох ділянок, що кодують Дб-десатуразу, навіть якщо продукується один і той же білок.
Наприклад, у руР3416-СА7-тодЕ і руР3416-СА7-тоас, дві версії Аб-десатурази М. ри5Ша були присутні та експресувалися різними промоторами. У кодуючих послідовностях кодони використовувалися по-різному і, таким чином, їх нуклеотидні послідовності були різними, з метою зниження потенціалу сайленсингу або ефектів косупресії але приводили до продукування одного і того ж білка.
Таблиця 9
Профілі жирних кислот у половинках сім'ядоль пророщеного трансгенного насіння Т1 В. пари5, що містять конструкт тоавВ. До 18,1 95 ДГК спостерігалося в численних зразках, що містили більше 10 95 ДГК.
Насін-| со | | | но у | | не - | ж | «ее | Ж | Ох | | | ку | сх я | | Ж
Ії (озічзіво волів і ве зве |в віза івя во со ол1|133|103 зе оз |0л1з21о2|о5| 55 т (еліяо оз 051037 ів 26235 10123065 в8|ао| 02106103 26 11001310 17 95 я ліз ол олово | зо тА 117 в31345|05|І50 опо 2134105 4 ооо оо ее! 8 Іалізаіозівів |за яке ї712.5 во за отіао во 1о6 132104 050010 105102100| 05 ль (ол і5тІоа 105153 |38 12241367 21) 72113103 13 100192153|08 55 (оо 10010510 55 аз долі во вла ха 255 іл іє аз з6е ово з |бо | олі11о105 35051012 160 1151 63
Таблиця 10
Профілі жирних кислот трансгенного насіння Т2 В. пари, що містять конструкцію тоавВ. ш - 18 З ||| хх у | ще || | т Е г ж а|чех
Зразок х ї Е ш ж 5 х ї- х й ї т й Щі 5 щ Ж | вт| В В а (насіння 2 - | як || - ш| ш щі т т о вики уЄтізбітляеє | о| 56 ол|ма зв зло) мо ов |з бі || ет вар ож 255 ва ому сстімнитлят вл 53) м|ел| 32 х6 4 і53| 22| 3 02 1о6| 05103195 пе) 352) 52| ме пло стізвітіяле
СтІМКІН сте стіннаннз ставі стім нях стіни ст136-27387
АРК (С20:406) не була знайдена в жодному із зразків. Крім того, зразки містили близько 0,2
Фо або 0,3 95 С16:1, близько 0,1-0,3 95 С16:3, від близько 0,7 90 до 1,0 95 С20:0, близько 0,3 905 5 С22:0, і деякі зразки містили слідові кількості (« 0,1 90) С20:1А13, С22:303, С24:0 і С241.
Таблиця 11
Склад жирних кислот ліпіду у трансгенному насінні Т2 В. пари5, трансформованому Т-ДНК конструкцією тоаавВ, з передбачуваною мутацією в гені Д4-десатурази. Ліпіди додатково містили близько 0,1 95 14:0, 0,2 95 16:3, 0,2-0,4 95 ГЛК, 0,1 95 20:1А13, 0,3-0,4 95 22:0, а 16:2 і 221 не були знайдені. бр : ! печах я - на - лк - зе - щ -т ВЕ - Б - БЕ щ - Е х - - а Е ж 35 | | хоп || аз хі кіп - м -- -к - ж - Я я т щ - -- - - де пе Га «4 ее т «1 її
Ж -щ - - а т- вже - «3 - - Ен т- «4 їі стамізв став стазтум |57|00| 02 46| 23 |за 3 |3а5|10|50|08|01 40|09|15 1285109 01 а2|02 тя | бо
Таблиця 12
Склад жирних кислот воли з насіння То Я. парих, транебормованого Т-ДНК з СА т-пювВ, т з - вся
Фе. т че че «- т ек Ке - 7 СК ях т", т - - т т З щі т Ка З т с З З я є КВ ре р шо щ ж я а пт є ще де де - дк ту - - - т-к чні р - інн - т- - "- їх т - ті іа -- - щи ш ми ГУ щи щі У че ж що м з - ш М щи ї- еінімінтві німі ві мі мів»
Зразки олії з насіння додатково містили 0,1 956 С14:0; 0,2 95 С16:1; 0,1 96 220:306; не містили
С22:111022:206; містили 0,1 95 224:0 і 0,2 95 С24:1, 2.6 95 інших жирних кислот.
Приклад 5. Аналіз ТАГ із трансгенного насіння А. ІПпаїапа, що продукує ДГК
Позиційний розподіл ДГК в ТАГ із трансформованого насіння А. Ійпайапа визначали за методом ЯМР. Загальний ліпід екстрагують близько з 200 мг насіння, спочатку роздавлюючи його під шаром гексану, з подальшим перенесенням роздавленого насіння до скляної пробірки, що містить 10 мл гексану. Пробірку нагрівають близько до 55 "С на водяній бані, після чого обробляють вихровим перемішуванням і центрифугують. Гексановий розчин екстрагують, і процедуру повторюють з додатковими порціями 4 х 10 мл. Екстракти об'єднують, упарюють за допомогою роторного випарника, і ТАГ в екстрагованому ліпіді очищують від полярних ліпідів шляхом пропускання крізь коротку колонку з кремнію діоксидом, з використанням 20 мл 7 95 діеєтилового ефіру в гексані. Позиційний розподіл ацильної групи на очищеному ТАГ визначають кількісно, як було описано раніше (Реїгіє еї а!., 2010а і Б).
Аналіз продемонстрував, що велика частина ДГК в загальній олії з насіння розташована в положеннях 5п-1/3 ТАГ, і невелика кількість знайдена в положенні 5-2 (Фіг. 5). На протилежність цьому, ТАГ з продукуючого АРК насіння продемонстрували, що 50 95 АРК (20:4А58и1и) розташовано в положенні 5п-2 олії трансгенної рапсу, тоді як очікувана величина для випадкового розподілу становить тільки 33 95 (Реїгіє еї аї., 2012).
Додатково, загальний ліпід з трансгенного. насіння А. ІШаїапа був проаналізований РХ-МС з потрійною квадрупольною лінзою, щоб визначити основні різновиди триацилгліцеролу (ТАГ) (Фіг. 6).
Знайдено, що різновидами ТАГ з найвищим вмістом ДГК є ДГК-18:3-18:3 (ТАГ 58:12; номенклатура не описує позиційного розподілу), і на другому місці знаходиться ДГК-18:3-18:2 (ТАГ 58:11). Три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18) спостерігається в загальній олії з насіння, хоча і з низькими, але знайденими рівнями. Інші основні різновиди ТАГ, що містять ДГК, включали ДГК- 34:3 (ТАГ 56:9), ДГК-36:3 (ТАГ 58:9), ДГК-36:4 (ТАГ 58:10), ДГК-36:7 (ТАГ 58:13) ії ДГК-38:4 (ТАГ 60:10). Ідентичність двох основних ТАГ, що містять ДГК, була додатково підтверджена квадрупольною часопролітною (0- ТОЕ) МС/МС
Приклад 6. Аналіз вмісту і складу стеролів в оліях
Фітостерини з 12 зразків рослинної олії, придбаних із комерційних джерел в Австралії,
Зо охарактеризовані за методами ГХ і ГХ-МС. як похідні О-триметилсилілового ефіру (ОТМ5І- ефір), як розкрито у Прикладі 1. Стероли ідентифікували за даними утримання, інтерпретацією мас-спектрів і порівнянням з літературними даними та даними мас-спектроскопії лабораторних стандартів. Кількість стеролів визначають з використанням внутрішнього стандарту 5В(Н)- холан-24-олу. Базова структура фітостерину і хімічна структура деяких з ідентифікованих стеролів проілюстровані на Фіг. 7 і в Табл. 13.
Аналізували рослинні олії: кунжуту (Зезатит іпаісит), оливи (ОІеа епгораєа), соняшнику (Неїїапіпи5 аппи5), рицини (Кісіпи5 соттипів), рапсу (Вгаззіса пари), сафлору (Сапнатив
Ппсюгіцв), арахісу (Агаспіз пуродаєа), льону (Гіпит ивіаїіввітит) ї сої (Сіусіпе тах). У порядку зниження по відношенню відносного вмісту, у всіх зразках олії основними фітостеринами були:
В-ситостерол (інтервал 28-55 905 від загального вмісту стеролів), Д5-авенастерол (ізофукостерол) (3-24 9б5), кампестерол (2-33 95), Д5-стигмастерол (0,7-18 У), ДУ-стигмастерол (1-18 95) ї Д7/-авенастерол (0,1-5 90). Були ідентифіковані декілька інших мінорних стеролів: холестерин, брасікастерол, чалінастерол, кампестанол та ебурикол. Додатково, були знайдені чотири С29:2 і два С30:2 стероли, але необхідне подальше дослідження для остаточної ідентифікації цих мінорних компонентів. Крім того, в деяких з олій присутні декілька інших неідентифікованих стеролів, але через дуже низький їх вміст, мас-спектри не були достатньо інтенсивними, щоб дозволити ідентифікацію їх структури.
Таблиця 13
Назви за ІЮПАК / систематичні назви ідентифікованих стеролів 24-метилхолестерин
24-метилхолестанол 11119 (|ергост7енЗВол | //// о4сметилхолест-7-ен-ЗвВол...97 24-етилхолестерин стигмаст-7-ен-Зр-ол
Вміст стеролів, виражений як мг/г олії, у порядку зменшення кількості був наступним: олія рапсу (6,8 мг/г), кунжутна олія (5,8 мг/г), льняна олія (4,8-5,2 мг/г), олія соняшнику (3,7-4,1 мг/г), арахісове масло (3,2 мг/г), сафлорова олія (3,0 мг/г), соєва олія (3,0 мг/г), оливкова олія (2,4 мг/г), рицинова олія (1,9 мг/г). Склад стеролів у 95 і загальний вміст стеролів наведені у Табл. 14.
Загалом, серед усіх зразків олії з насіння основним фітостерином був ВДВ-ситостерол (інтервал 30-57 95 від загального вмісту стеролів). Для олій спостерігався широкий інтервал частки інших основних стеролів: кампестерол (2-17 95), А5-стигмастерол (0,7-18 95), Д5- авенастерол (4-23 90), Д7-стигмастерол (1-18 905). Олії різних видів містили інший профіль стеролів, причому деякі профілі були досить відмінними. У випадку олії рапсу, вона містило найвищу частку кампестеролу (33,6 95), тоді як зразки інших видів загалом містили нижчі рівні, наприклад, до 17 95 в арахісовій олії. Сафлорова олія містила відносно високу частку Д7- стигмастеролу (18 95), тоді як вміст цього стеролу звичайно був низьким в оліях інших видів, до 9 Фо в олії соняшнику. Оскільки вони є характерними для кожного виду, профілі стеролів можуть, таким чином, використовуватися як допоміжні для ідентифікації конкретних овочевих або рослинних олій та перевірки їх непідробленості або підробки іншими оліями.
Порівнювали по два зразки соняшнику і сафлору, у кожному випадку один був одержаний холодним пресуванням насіння і був нерафінованим, тоді як інший не був одержаний холодним пресуванням і був рафінованим. Хоча спостерігалися деякі відмінності, два джерела олії містили подібний склад стеролів і загальний вміст стеролів, наводячи на думку про те, що обробка і рафінування здійснюють незначний вплив на два вказаних параметри. Вміст стеролів серед зразків відрізнявся в З рази і варіював від 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. В олії рапсу він був найвищий, а в рициновій олії - найнижчий вміст стеролів.
Приклад 7. Збільшення акумуляції ДГК в положенні 5п-2 ТАГ
Автори цього винаходу припускали, що акумуляція ДГК та/(або ДПК в положенні 5п-2 ТАГ може бути збільшена шляхом коекспресії І-ацил-гліцерол-3-фосфат ацилтрансферази (ЛФКАТ) із шляхом біосинтезу ДГК, наприклад, наданим конструкцією (СА або її варіантами.
Переважними ЛФКАТ є такі, які можуть впливати на поліненасичений С22 жирний ацил-КоА як
Зо субстрат, що приводить до збільшення вставки поліненасиченого ланцюга С22 в положенні 5п-2
ЛФХ з утворенням ФХ, відносно ендогенного ЛФКАТ. Цитоплазматичні ферменти ЛФКАТ часто демонструють варіюючі переваги по відношенню до субстрату, особливо, якщо вид синтезує і акумулює в ТАГ незвичайні жирні кислоти. Продемонстровано, що ЛФКАТ2 з Іітпапіпев доцдіаєі може використовувати ерукоїл-КоА (С22:1-КоА) як субстрат для синтезу ФК, на протилежність ЛФКАТІ з того ж виду, яка не може утилізувати субстрат С22 (Вгоуп еїа!., 2002).
Таблиця 14
Вміст і склад стеролів у проаналізованих рослинних оліях
Льон |Льон
Со- | Со- (на- | (на-
Номер Загальна назва | Кун- |Оли- няш- ня Ри- Рапс Са- | Са- Ара- сіння сіння! Соя стеролу стеролу жут ва | ник | ник (Чина флоріфлор) хіс пьо- | пьо- ну) | ну)
Хо- Хо- лод- лод- не не пре- пре- су- су- ван- ван- ня ня 1 холестерин. 02|08|02100|01|03|02 01|02|04|04 102 2 |брасікастерол.їі 01|001|00100|03|011|00 1 00|001|021|02 10 чалінастерол / з | і5|ОМ ово | чи | 24102 | ом ІБ А метиленхолес- терин кампестерол / 4 24-метилхолес- |162| 24 | 74 | 7,91 8.4 133,61121| 8,5 |174|15,7|1441|16,9 терин кампестанол / 24-метилхолес- | 0,7 | 0,3 | 0,3 | 01 0,2 0оз310210210,7 танол 6 |С29г" о0о|00|о01|02|00|011|05105100|12/| 1/0 7 |АБ-стигмастерол б4| 12) 74 | 72 |186|071|70 4616951 | 58 176 8 |невідомий,.ї 05/13/1071 06|08|071|07 13|04|07|06113 вод |невідомий,.ї 00/13/1091 08|12|09/|18 07|12|071|05107 11 |ебурикл..// /16|18/|411/44|15|10/19 29|12|351/| 33105
В-ситостерол / 12 2А4- 55,3145,6143,9143,6137,7І5081402|3511|572129,9128,41402 етилхолестерин з дев енер терм тв| мфте ве| на воорвнг ва, / ізофукостерол фени ов за) м оо ор те тя мм оо пе о спирт воду ре оо ол вв оо/ пе ве тя ме оо ов оо спирт
Сг9г" 00105107107|15|121|28119|20|101|07 105
Сг9г" 101091|231|24106|04|13 1909/1010 1
С30г2" 0о100|00100119|001|001001|001|00100 10 д7-стигмастерол 19 / 221|7119,3110,9| 23 10,5118,3| 1,1 | 7,91 8,7 | 5,6 стигмаст-7-ен-
ЗВ-ол |А7авенастерол, 13101140 136|06|021|20 47|07|041|04 106 21 |невідомий,.ї /07|71109108|00|041|03 04|00|30/|56 10 22 |невідомий,.ї 03/00/1031 09|00|00|12 13|02|011|00103 24 |невідомий,ї 00/31/1091 13|06|04|02 04|07|171|19108 (| 25 |невідомий,.ї 109|04|03105|03|011|05107|03|01|о0 106
Льон |Льон
Номер )/ Загальна назва | Кун- |Оли- Со- | Со: | ву. Са- | Са- |Ара- (на- | (на- стеролу" стеролу жут | ва няш- |няш- цина Рапс флорфлор хіс сіння |сіння| Соя ник | ник льо- | льо- ну) | ну) 26 |0302 |22|60 46|57|14|06|10|т12|тТ2 тот | 52 27 |невдомийї |00104 041093/|03|021|01|02|03 01100105 / |Сума / МобоМоб,ол100,01100,01100,0100,01100,01100,01100,01100,01100,01100,0.
Загальний 0 Іееролфтолю 5624 || 87 |19|6в зе зо|за| ав | 52| 30
С29:27 ії С30:27 позначають стерол С29 з двома подвійними зв'язками і стерол С30 з двома подвійними зв'язками, відповідно.
Розглядалися відомі ЛФКАТ, і багато з них були вибрані для тестування, зокрема, ті, від яких не очікувалося збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2, як контроль. Відомі ЛФКАТ включали: ЛФКАТ2: Агабрідорзів (пайапа (5ЕО ІЮ МО: 40, номер доступу АВО48392, Кіт еї аї., 2005), ЛФКАТ І ітпапіпех аіІра (ЗЕО ІЮО МО: 41, номер доступу ААС49185, І аззпег еї аї., 1995),
Зіс1р Засспаготусев сегемізіае (ЗЕО ІЮ МО: 42, номер доступу МР 010231, 70и еї аї., 1997),
ЛФКАТ 1 МопгііегеїІа аІріпа (5ЕО ІЮ МО: 44, номер доступу АЕЮО33305; 5 7879591) і ЛФКАТ
Вгаззіса пари5 (ЗЕБЕО ІО МО: 45 ії 5БО ІО МО: 46, номери доступу АОС97479 ії АОСО97478, відповідно).
ЛФКАТ2 Агарідорзіз (також позначена як ЛФАТ2) являє собою локалізований в ендоплазматичному ретикулумі фермент, що продемонстрував активність по відношенню до субстратів С1б і С18, однак активність по відношенню до субстратів С20 або С22 не тестувалася (Кіт еї аї., 2005). ЛФКАТаО І ітпапіпе5х анІра продемонструвала вставку ацильного ланцюга С22:1 в положення 5п-2 ФК, хоча здатність використовувати ДГК або ДПК як субстрат не тестувалася (І аззпег еї аіІ., 1995). Вибрана ЛФКАТ 5. сегемізіае ЗІСтр продемонструвала активність у вигляді використання 22:1-КоА на додаток до 18:1-КоА як субстратів, указуючи на широку специфічність по відношенню до субстратів з урахуванням довжини ланцюга (701 еї аї., 1997). Знову, ДГК-КоА, ДПК-КоОА та інші ДЛ-ПНЖК не тестувалися як субстрати. Раніше було продемонстровано, що ЛФКАТ МопієгеїІа володіє активністю по відношенню до жирнокислотних субстратів ЕПК і ДГК в трансгенному Маїтоула Іроїуйса (05 7879591), але їх активність у рослинних клітинах невідома.
Додаткові ЛФКАТ були ідентифіковані винахідниками. Місготопах ривзійа являє собою мікроводорость, що продукує та акумулює ДГК в олії, хоча позиційний розподіл ДГК на ТАГ у цьому виді не було підтверджено. ЛФКАТ Місготопах ризйШа (ЗЕО ІЮ МО: 43, номер доступу
ХР 002501997) була ідентифікована шляхом пошуку серед геномних послідовностей
Містотопабз ризійа з використанням ЛФКАТ2 Агабрідорзіз як послідовності запиту ВІАЗ5Т.
З'явилися декілька послідовностей-кандидатів, і послідовність ХР. 002501997 була синтезована для тестування до С22 ДЛ-ПНЖК. ЛФКАТ Кісіпи5 соттипі5 була анотована як передбачувана
ЛФКАТ в послідовності геному рицини (Спап еї аї., 2010). Чотири кандидати на ЛФКАТ з геному
Зо рицини були синтезовані і протестовані на неочищених лізатах листя інфільтрованої тканини листа М. репіпатіапа. Розкрита в цьому документі послідовність-кандидат продемонструвала активність ЛФКАТ.
Ряд кандидатів на ЛФКАТ був вирівняний з відомим ЛФКАТ на філогенетичному дереві (Фіг. 8). Слід зазначити, що передбачувана ЛФКАТ Місготопах не групується з передбачуваними
С22 ЛФКАТ, але має дивергуючу послідовність.
Як первинний аналіз різних ЛФКАТ щодо їх здатності використовувати ДГК-КоА як субстрат, одержують химерні генетичні конструкції для конститутивної експресії екзогенних ЛФКАТ в листі
М. репіпатіапа, кожна під контролем промотору 355, як розкрито нижче: 355:Ага(й-ЛФАТ2 (Агарідорзі5 ЕК ЛФКАТ); 355: іта!І-ЛФКАТ (ЛФКАТ І ітпапінез аїба); 355:5ассе-5Іс1р (ЛФКАТ 5. сегемізіає); 355:Місри-ЛФКАТ (ЛФКАТ Місготопах ризіПа); 355:МогаІ-ЛФКАТІ (ЛФКАТ Мопіегеї Іа аіІріпа); 355:Вгапа-І РААТІ1І.13 (Вгаззіса пари5 ЛФААТІ.13); 355:Вгапа-І РААТТІ,5 (Вгазвіса пари
ЛФААТІ,5). Конструкції З355:р1і9, що не містять екзогенної ЛФКАТ, використовували у експерименті як контроль. Кожну із вказаних конструкцій вводили за допомогою Адгобасіегішт в листя М. репіпатіапа, як розкрито у Прикладі 1, і через 5 днів після інфільтрації оброблені зони листя вирізували і подрібнювали для одержання лізату листя. Кожен лізат містить екзогенну
ЛФКАТ, а також ендогенні ферменти для синтезу ЛФК. Реакційні суміші одержували іп міо,
окремо додаючи до лізатів мічені 77С ОК і ДГК. Реакційні суміші інкубують при 25 "С, і рівень інкорпорації мічених "Сб жирних кислот у ФК визначають за методом ТШХ. Обчислювали здатність кожної ЛФКАТ використовувати ДГК відносно АРК і жирних кислот С18. Знайдено, що
ЛФКАТ пінника лугового, МогііегеМПа і засспаготусев5 володіють активністю по відношенню до субстрату ДГК, причому радіомічена ФК виникає у випадку цих, але не інших ЛФКАТ. Активність всіх ЛФКАТ була підтверджена контрольним споживанням олеїнової кислоти.
Для тестування активності ЛФКАТ в насінні, деяку кількість кодуючих білок послідовностей або ЛФКАТ вставляли до бінарного вектору під контролем промотору конлініну (ріиСпі1).
Одержані в результаті генетичні конструкції, що містять химерні гени СпітАгатй-ЛФКАТ (негативний контроль), Спі1:І ітаІ-ЛФКАТ, Сп1:Зассе-5іІс1р, і СпіїМогаІ-ЛФКАТ, відповідно, далі використовують для трансформації рослин А. ІПаїйапа, які утворюють ДГК у насінні, щоб одержати стабільні трансформанти, які експресують ЛФКАТ і трансгенний шлях ДНК у специфічній для насіння формі, щоб протестувати, чи буде збільшуватися інкорпорація ДГК у положенні 5п-2 ТАГ. Крім того, конструкції використовуються для трансформації рослин В. пари і С. займа, які вже містять конструкцію зА7 та її варіанти (Приклади 2-4), з метою одержання потомства, що несе материнські і ЛФКАТ генетичні конструкції. Протестоване збільшення інкорпорації ДГК в положенні 5п-2 ТАГ відносно інкорпорації в рослинах без кодуючих ЛФКАТ трансгенів. Вміст олії також підвищується в насінні, особливо у випадку насіння, що продукує вищі рівні ДГК, нейтралізуючи тенденцію, спостережувану в насінні
Агарідорзів, як розкрито у Прикладі 2.
Конструкцію 355:МогаІ-Ї РААТІ використовували для трансформації вже трансгенної лінії
Агарідорзі5 (паіапа, що була гомозиготною по Т-ДНК із конструкції СА?7, і насіння якої містило близько 15 95 ДГК у ліпідах насіння (Реїгіе еї аіЇ., 2012). Для цього застосовували ген селекційного маркера канаміцину в конструкції 355:Мога!І-І РААТІ, що був відмінний від гена селекційного маркера Баг, вже присутнього у трансгенній лінії. Були відібрані трансгенні саджанці, стійкі до канаміцину, і вирощені до стану зрілості в теплиці. Урожай насіння Т2 був зібраний, і склад жирних кислот в загальних ліпідах насіння проаналізований методом ГХ (Табл. 15). Три фенотипи спостерігали серед 33 незалежно трансформованих ліній. У першій групі (6/33 ліній), вміст ДПК істотно підвищувався, до значно вищого рівня, ніж рівень ДГК, до близько
Зо 10,6 95 в загальних ліпідах насіння. Це відбувалося за рахунок ДГК, вміст якої був істотно знижений у даній групі ліній. У двох лініях із вказаної першої групи сумарний вміст ДПК ї- ДГК був знижений, але не в інших 4 лініях. У другій групі (5/33), рівні ДПК і ДГК були рівними, із близько таким же сумарним вмістом ДПК « ДГК, як і в насінні материнської рослини. У третій групі рівні ДПК і ДГК були подібними до рівнів у насінні материнських рослин. Одне з можливих пояснень для підвищеного рівня ДПК у першій і другій групах полягає в тому, що ЛФААТ витісняє Д4-десатуразу на субстраті ДПК-КоА і переважно інкорпорує ДПК у ПК і далі в ТАГ, відносно Д4-десатурації. Друге можливе пояснення полягає в тому, що А4-десатурація частково інгібується.
Збирали насіння рослин Агарідорзіз, трансформованих Т-ДНК конструкцією СА7, що були додатково трансформовані вектором Спі1:Мога!І-ІРААТ, і з насіння екстрагували олію. Далі фракцію ТАГ виділяли з екстрагованої олії методами ТШХ і виділяли з пластинки ТШХ.
Одержані зразки ТАГ і зразки олії з насіння до фракціонування аналізували за допомогою розщеплення ліпазою НПі2ори5, щоб визначити позиційний розподіл ДГК. Ліпаза є специфічною відносно ацильних груп, естерифікованих у положенні 5п-ї або 5п-3 ТАГ. Це здійснювали шляхом приготування емульсії кожного зразка ліпіду у 5 95 аравійській камеді, із застосуванням пристрою для обробки ультразвуком, і додаючи розчин ліпази КПігорих5 у 0,1 М Трис-НСЇ, рн 7,7, що містив 5 мМ Сасіг, з інкубацією сумішей при 30 "С і безперервному струшуванні.
Реакцію в кожній реакційній суміші зупиняли, додаючи хлороформ : метанол (2/1, об/об) і один об'єм 0,1 М КСІ до кожної суміші. Ліпід екстрагували у хлороформну фракцію, і визначали відносні кількості 5п-2 МАГ, зп-1/3 ФФХ, ДАГ і компонентів ТАГ одержаного ліпіду розділенням на просоченій 2,3 96 борною кислотою пластинці ТШХ із застосуванням гексану/діетилового ефіру/оцтової кислоти (50/50/1, об/06б). Смуги ліпідів візуалізували, оббризкуючи 0,01 95 примуліном в ацетоні/воді (80/20, об/об) на пластинці ТШХ з візуалізацією в Уф-світлі. Окремі смуги ліпідів ідентифікували на базі плям ліпідних стандартів, нанесених на таку ж пластинку
ТШХ. ТШХ смуги ліпідів збирали у скляні флакони, і одержували з них метилові ефіри жирних кислот із застосуванням 1 н метанольної НСІ (Зиреї!со), з інкубацією при 80 "С протягом 2 годин.
Склад жирних кислот індивідуальних ліпідів був проаналізований ГХ.
Даний аналіз продемонстрував, що ДГК у насінні материнських рослин, трансформованих
СА? (лінії 22-2-1-1 і 22-2-38-7), переважно була естерифікована у положенні 5п-1 або 5п-3 ТАГ. бо навпаки, ліпіди в насінні МУ11 ї ММ15, трансформованому як конструкцією СА?7, так і трансгеном, що кодує ЛФААТ, були збагачені ДГК у 5п-2, причому 35 95 ДГК в одній із ліній і 48 о ДГК у іншій лінії були естерифіковані у положенні 51-22 ТАГ, тобто після розщеплення ліпазою
ДГК була присутня, як 5п-2-МАГ (Табл. 16). Аналогічні результати одержані для насіння В. париє і В. )їипсєа, трансформованого як Т-ДНК із конструкції СА 7-тоавВ, так і геном, що кодує ЛФААТ, і продукуючого ДГК.
Для того, щоб визначити, чи існує перевага ЛФААТ МопієгеЇа або іншої ЛФААТ відносно
ДПК-КоА або ДГК-КоА, іп міго одержували реакційні суміші, додаючи окремо ""С-мічений-ДПК-
КоА або -ДГК-КоА до лізатів листя М. рРепіпатіапа, тимчасово експресуючого ЛФААТ-кандидату під контролем конститутивного промотору, як викладено вище. Реакційні суміші інкубували при 252, і рівні інкорпорації мічених "С жирних кислот в у ФХ визначали за ТШХ методом аналізу ліпідів. Оцінювали здатність кожної ЛФААТ використовувати ДГК-КоА відносно ДПК-КоА. Гени, що кодують ЛФААТ з доведеною високою ДГК інкорпоруючою активністю ЛФААТ застосовували для одержання трансформованих ДГК-продукуючих рослин рапсу і насіння.
Гени, що кодують ЛФААТ з високою активністю використання ДПК-КоА, застосовували для трансформації ДПК-продукуючих рослин і насіння, щоб збільшити кількість ДПК, естерифікованої у положенні 5п-2 ТАГ.
Таблиця 15
Склад жирних кислот ( 95 загальних жирних кислот) трансгенного насіння А. ІПаїапа, трансформованого конструкцією ЛФААТІ, а також конструкцією СА7 для продукування ДГК. ж в т й т т З ж З т - З 7 п - Е п ш ж БА ж Ж Зк роЗ ее м Ж: - 7 - т СЯ р-Я т - - - м 5 є т к т т т т тк и ш ТП а З т НН Не Е К КУ ті т
За ж чий з зб - ек зак - Зак ке ськ лак за зак т ж ях 6 хе
І-ї 53 Щ|32 91 |55 83 Щ|05 38 (я 3 0т9 Зі 05 (05 05 (54 05 (05 13 | 5 р пз 35 035 (ло |5629 (603 307 |за (527 53 55 04 05 09 фе 05 (04 015 (36 во (ча 87 |з32 055 54 55 (025 9685 |30 37 87 5 09 05 2 025 2 |б5 012 (юю
Мечяя 83 Щ|39 55 |30 |з ф03 зал (18 35 7ло бій зл 05 8 (93 ї3 (05 бе (|в з уж я |за 50 (я 75 (003 ск я Зч4 54 05 87 (05 35 032 005 (05 її (33 Го (ж-е 54 Щ|54 125 (4 о раж ф02 285 (о 06 3 (35 10 (05 5 ф(зя 96 (15 05 | по (мУ-я вл (25 79 (в (но |02 з36 (з 076 53 07 їз (05 23 (94 03 015 07 |65 5 імУ-я аб 33 170 «3 (55 Щ03 Го (5 32 7 аа 10 Щ0бо є (о (005 08 05 34 Б
М? вя 52 055 53 |нлофо3 335 |32 Щ|35 75 |55 10 05 6 (55 96 |б5 05 ім аж 35 55 34 55 002 554 |з (38 71 07 13 бо 31 004 95 (ож 05 (|685 оз (мЖ-3 85 | 0 05 Щ|55 (53 зі7 Мло|з53 ре пя 15 (01 аї 055 пл (25 12 (|е5 ре (мх-35 (а |зж (77 (53 |і Щ(бя сзя |за (ча 25 (35 (87 (бо в: (55 (85 (95 є (55 Го
Таблиця 16
Присутність ДГК у положенні 5п-2 ТАГ у ліпіді із трансгенного насіння А. ІПаїїапа, трансформованого вектором Спі!:Мога!-І РААТ, а також Т-ДНК конструкцією СА?7, відносно присутності ДГК у ТАГ. Склад жирних кислот ТАГ і 5п-2 МАГ також включав по 0-0,4 90 кожної з 14:0, 16113, 1622, 16:3, 22:0 і 24:0. : «|| 58 а 5 А 8 БІ 5 55 | |з в 8
ІІ ВІВ | ХІІІ ВІ І іні п Гете я ре оа тя Гоа аез авт юо|ви завити ву ав ов си 1 ов1ви кл змаг б о3|53|53155| 1 в7|58|вз|55|вз |5і|5155|со|85|82|28138| 1 15512315 з еру я Трере тре гер 1 1152111. Те маг |в |зі|о3|зті2я|пло|зв|ієюрвз|з5і8а |елівліве со|са|62|о5151 | 16115 нуилаг|по|о2|за|ев|2в|вл |вз|а|те|з5|5з || о|5офве|яфвт|вя|ае| |верет |в нвяго |стоел|ео|5лі | нвівз|зва|во|37|95 | т5|о3|6о|ов|зя|вв|вл1в8| 151525 те
Тире реве Те рееТео 5 ев Те Те ее те ето ТеТеТе| Тер має |се вл|вз|єаітз| я аз|во|вз|зв|вя |1а|в2|58|св| в|ся|слівв|свів|52| |в
Приклад 8. Подальший аналіз трансгенного насіння Сатвеіїпа заїїма
Загальний вміст ліпідів 5 Насіння С. заїїма, гомозиготне по Т-ДНК із конструкції СА7, що містить ДГК у загальному вмісті жирних кислот, було проаналізоване щодо вмісту складу загальних ліпідів і як вказано нижче. Для насіння виконували дві послідовні стадії екстракції розчинником, спочатку із застосуванням гексану, і потім із застосуванням хлороформу/метанолу. В ході екстракції і аналізу не додавали антиоксидантів. Метод екстракції Сокслета, який звичайно застосовується для виділення ліпідів з насіння шляхом тривалого нагрівання і кип'ятіння із зворотним холодильником суміші ліпіду/розчинника, у даному випадку не застосовувався через потенційне розкладання або окиснення 03 ПНЖК, таких як ДГК.
Гексан застосовували як розчинник для першої екстракції, оскільки він є промисловим стандартом для олійних культур. Крім того, він переважно екстрагує ТАГ-вмісну олію за рахунок своїх сольватувальних властивостей і відносно слабкої солюбілізації полярних ліпідів, особливо при кімнатній температурі. Трансформоване і контрольне насіння Сатеїїпа (130 г і 30 г, відповідно) змочували гексаном і подрібнювали за допомогою електричної агатової ступки і товкача (Кеїзспй МийіІе, Німеччина). Суміші переносили до ділильних лійок і чотири рази екстрагували із застосуванням загального об'єму 800 мл гексану, включаючи статичну екстракцію протягом ночі для третьої екстракції. Для кожної екстракції екстракти фільтрували крізь фільтр з скловолокна СЕС під вакуумом для видалення дрібних частинок, після чого випаровували на ротаційному випарнику при 40 "С під вакуумом. Екстракти об'єднували в пул з одержанням багатих на ТАГ гексанових екстрактів.
Після екстракції гексаном шрот насіння, що залишився, далі екстрагували із застосуванням хлороформу-метанолу (ГМ, 1:11 об/0б) за такою ж методикою, як здійснювали екстракцію гексаном. Далі шрот видаляли фільтрацією, і об'єднані екстракти випаровували на роторному випарнику. Об'єднані в пул неочищені ХМ загального ліпіду далі розчиняли із застосуванням однофазної суміші метанолу-хлороформу-води (2:1:0.8, об/06б/06). Фракції розділяли додаванням хлороформу-води (кінцеве співвідношення розчинників, 1:1:0,9 об/о0б/0б6
Зо метанолу/хлороформу/води). Очищений ліпід у кожному екстракті, розподілений у нижній хлороформній фазі, концентрували із застосуванням роторного випаровування, і одержували
ХМ екстракти, багаті на полярні ліпіди. Вміст ліпіду в кожному із цих екстрактів визначали гравіметрично.
Для аналізу складу жирних кислот, аліквоти гексанових і ХМ екстрактів транс-метилували за способом СпПгізіе еї а). (1982) з одержанням метилових ефірів жирних кислот (МЕЖК), застосовуючи метанол-хлороформ-конц. гідрохлоридну кислоту (З мл, 10:1:1, 80 "С, 2 години).
МЕЖК екстрагували гексаном-хлороформом (4:1, З х 1,8 мл). Крім того, зразки шроту насіння (1-
2 г), що залишився після екстракції гексаном і ХМ, транс-метилували для гравіметричного вимірювання вмісту будь-якого залишкового ліпіду у вигляді МЕЖК. Загальний вміст ліпідів у насінні обчислювали, підсумовуючи вміст ліпідів у гексанових і ХМ екстрактах та вміст МЕЖК у трансметильованому шроті після екстракції розчинниками.
Трансгенне насіння містило дещо меншу кількість загальних ліпідів, на рівні 36,2 95 від маси насіння, в порівнянні з насінням Сатеїїпа займа дикого типу, 40,9 95 від маси насіння. Для насіння, включаючи насіння олійних культур, загальні ліпіди визначали як суму екстрагованого розчинниками ліпіду, одержаного послідовною екстракцією гексаном, а потім хлороформом- метанолом, і залишкового ліпіду, вивільненої трансметилуванням екстрагованої макухи після екстрації розчинниками, як описано для прикладу в даному описі. Такі загальні ліпіди здебільшого складалися із ліпідів, що містять жирні кислоти, таких як триацилгліцероли і полярні ліпіди, і невеликих кількостей ліпідів, що не містять жирних кислот, таких як фітостероли і жирні спирти, що можуть бути присутніми у вільній неестерифікованій формі або можуть бути естерифіковані жирними кислотами. Крім того, будь-які ефіри стеролів або ефіри воску і вуглеводні, такі як каротиноїди, наприклад, В-каротин, також входили до ліпіду, що екстрагується розчинниками, якщо вони присутні Вони були включені до загального гравіметричного визначення і були показані в аналізі ТШХ-ПІД (Табл. 17).
Із загальних ліпідів, 31 95-38 95 ліпідів від маси насіння було екстраговано гексаном для трансгенного і контрольного насіння, відповідно, що відповідає 86 95 і 92 95 загальних ліпідів у насінні. За допомогою екстракції ХМ добували ще 4,8 95 і 2,4 95 (від маси насіння), в основному багатий на полярні ліпіди екстракт із трансгенного і контрольного насіння, відповідно.
Залишковий ліпід, що вивільняється трансметилуванням шроту насіння олійної культури, який залишився після екстракції розчинниками, становив 0,3 95 і 0,4 95 від маси насіння, відповідно.
Тобто, перша і друга екстракція розчинниками сумарно добуває 99 95 від загального вмісту ліпідів у насінні (тобто, 36,2 95 або 40,9 95 від маси насіння, що в основному є ліпідом, який містить жирні кислоти, наприклад, тригліцероли і полярні ліпіди, які складаються із гліко- і фосфоліпідів (див. наступний розділ -- аналіз класів ліпідів)).
Аналіз класів ліпідів
Класи ліпіду у огексанових і ХМ екстрактах були проаналізовані тонкошаровою
Зо хроматографією з виявленням за допомогою плазмово-іонізаційного детектора (ТШХ-ПІД;
Іаїобзсап Мак М, Іайоп Іарогайюгіє5, Токіо, Японія), із застосуванням гексану/діетилового ефіра/льодяної оцтової кислоти (70:10:0,1, об/об/об) як системи розчинників для проявлення, в поєднанні з кремнію діоксидом Спготагой 5-ІП на кварцових паличках. Придатні калібрувальні криві отримували із застосуванням репрезентативних стандартів, одержаних від Ми-СНек Ргер,
Іпс. (Елізайан, Мінесота, США). Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення 5ІС- 48011 (Версія 5І5С: 7.0-Е). Різні види фосфоліпідів розділяли із застосуванням очищеної фосфоліпідної фракції, одержаної після колонкової хроматографії на кремнію діоксиді, з проявленням паличок у хлороформі/метанолі/льодяній оцтовій кислоті/воді (85:17:5:2, об/об/об) перед виявленням за допомогою ПІД.
Для відокремлення ТАГ, гліколіпідних і фосфоліпідних фракцій від ХМ екстрактів застосовували гель кремнію діоксиду 60 (100-200 меш) (0,3-1 г) у короткій скляній колонці або піпетці Пастера, заповненій скловатою, щоб очистити 10 мг очищеного ГМ екстракту ліпідів.
Залишкову фракцію ТАГ у ХМ екстракті елюювали із застосуванням 20 мл 10 95 діетилового ефіру в гексані, гліколіпіди елюювали 20 мл ацетону, і фосфоліпіди елюювали у дві стадії, спочатку 10 мл метанолу, і потім 10 мл метанолу-хлороформу-води (5:3:2). Вказана друга елюація збільшує вихід фосфоліпідів. Вихід кожної фракції визначали гравіметрично, і чистоту перевіряли ТШХ-ПІД. Всі екстракції і фракції зберігали у дихлорметані при -20 "С до подальшого аналізу ГХ і ГХ-МО.
Багаті на ТАГ гексанові екстракти від кожного із трансгенного і контрольного насіння містили близько 96 95 ТАГ. ХМ екстракти містили залишкові кількості ТАГ 44 95 ії 13 95 мас. ХМ екстрактів, відповідно, для трансгенного насіння і насіння дикого типу. На протилежність гексановим екстрактам, ХМ екстракти були багаті на полярні ліпіди, а саме фосфоліпіди і гліколіпіди, вміст яких відповідав 50 95 і 76 95 мас. ХМ екстрактів, відповідно, для трансгенного і контрольного насіння (Табл. 17). Основним фосфоліпідом був фосфатидилхолін (ФХ), який складав 70 95-79 95 загальних фосфоліпідів, далі слідував фосфатидилетаноламін (ФЕ, 7 95-13
Фо), при відносно низьких рівнях фосфатидинової кислоти (ФК, 2 90-5 95) і фосфатидилсерина (ФС, «2 95).
Склад жирних кислот
Загалом для насіння, що продукує ДГК та/або ДПК, автори винаходу спостерігали склад бо жирних кислот загальних ліпідів у насінні, за даними прямого трансметилування загальних ліпідів у насінні, подібний до складу ліпідів у фракції ТАГ. Це було результатом того, що більше 90 95 загальних ліпідів, присутніх у насінні, знаходилися у формі ТАГ.
Склад жирних кислот різних класів ліпідів у гексанових і ХМ екстрактах визначали газовою хроматографією (ГХ) і методом ГХ-МС, із застосуванням приладу для ГХ Адіїепі Тесппоіодієб 6890А (Пало-Альто, Каліфорнія, США), обладнаного капілярною колонкою із плавленого кварцу зиреїсо Едийу м-1 (15 м х 0,1 мм в.д., товщина плівки 0,1 мкм, Беллефонт, Пенсільванія, США),
ПІД, інжектором з розщепленням/без розщеплення, аутосемлером Адіепі Теснпоіодієв серії 76838 та інжектором. Газом-носієм був гелій. Зразки вводили інжекцією у режимі без розщеплення при температурі печі 120 "С. Після інжекції температуру печі підвищували до 270 "С із швидкістю 10 "С/хв, і в кінці до 300 "С із швидкістю 5 "С/хв. Елюйовані сполуки визначали кількісно за допомогою програмного забезпечення Адіїепі ТесппоЇодіез Спетеїайвоп (Пало-Альто, Каліфорнія, США). Результати ГХ містили помилку не більше ніж 2-5 95 площі піку індивідуальних сполук.
Таблиця 17
Склад класу ліпідів ( 9о від загальних ліпідів, одержаний для кожної стадії екстракції) у гексанових і ХМ екстрактах трансгенного і контрольного насіння Сатеїнпа заїїма. ЕС, ЕВ і ГК не розділяли.
ТАГ 77777777 Ї777171171956 | 442 | 9602 2ЮюЮфЮ| з
ВЖК 77777777 177717117109 | 73 | 08 | 14 вт 77777717 Ї17717171717109 7 17771108 | щфлв
МАГ 7 Ї7777117107 | 7 1108 | 62 9 Ф
Скорочення: ефіри стеролів (ЕС), ефіри восків (ЕВ), гідрокарбони (ГК), триацилгліцероли (ТАГ,, вільні жирні кислоти (ВЖК), не визначено (н/в), стероли (СТ), моноацилгліцероли (МАГ), полярні ліпіди (ПЛ), що складаються з гліколіпідів і фосфоліпідів; " ЕС, ЕВ і ГК із цієї системи елюювалися разом; "" Може містити жирні спирти і діацилгліцероли (ДАГ).
Аналізи методом ГХ-мас-спектрометрії (ГХ-МС) здійснювали на приладі ГХ-МС із квадрупольними лінзами Ріппідап Тгасе шйга (модель: ТпеппоОицеві Ттасе 050, ТНегто ЕПІесігоп
Согрогаїйоп). Дані обробляли за допомогою програмного забезпечення ТпегтоОцеві Хсаїїриг (Остін, Техас, США). Прилад для ГХ був обладнаний інжектором на колонці і капілярною колонкою НР-5 ОПйга Адіїйєепі У а М (50 м х 0,32 мм в.д., товщина плівки 0,17 мкм, Ааіепі
Тесппоіодіех, Санта-Клара, Каліфорнія, США) з полярністю, подібною до описаної вище.
Індивідуальні компоненти були ідентифіковані із застосуванням даних мас-спектру і порівнянням часу утримання з одержаним для аутентичних і лабораторних стандартів.
Холостий аналіз за повною методикою проводили паралельно із серією зразків.
Дані складу жирних кислот у різних класах ліпідів в екстрактах наведені у Табл. 18. У ДГК-
Зо продукуючому насінні Сатеїпа ДГК розподіляються на основні ліпідні фракції («ТАГ, фосфоліпіди і гліколіпіди) у пропорції, що варіює від 1,6 95 до 6,8 95, із зворотною кореляцією між частками ДГК і АЛК. Багатий на ТАГ гексановий екстракт із трансгенного насіння містив 6,8
Фо ДГК ї 41 95 АЛК (Табл. 18). Багатий на полярні ліпіди ХМ екстракт містив 4,2 95 ДГК ії 50 95
АЛК, тобто відносно меншу кількість ДГК і більше АЛК. Залишкові ТАГ з багатого на полярні ліпіди ХМ екстракту містили 6 9о ДГК і 40 95 АЛК. Гліколіпідна фракція, виділена з ЗМ екстракту, містила З 956 ДГК і 39 95 АЛК, і фосфоліпідна фракція містила найнижчий рівень ДГК (1,6 9б) і найвищі рівні АЛК (54 95). Трансгенне насіння Сатвеїїпа містило вищі рівні АЛК ї нижчі рівні ЛК (лінолева кислота, 18:206), в порівнянні із контрольним насінням, в основних класах ліпідів (ТАГ, гліколіпіди і фосфоліпіди). Частки АЛК ії ЛК складали: АЛК 39 95-54 95 і ЛК 4 95-9 95 для трансгенного насіння і АЛК 12 95-32 95 і ЛК 20 95-29 95 для контрольного насіння. Відносний рівень ерукової кислоти (22:19) був нижчим у всіх фракціях із трансгенного насіння, ніж в контрольному насінні, наприклад, 1,3 95 проти 2,7 95 у гексанових екстрактах (Табл. 18).
Склад стеролів у насінні
Для визначення вмісту і складу стеролів у екстрагованих ліпідах, зразки, що містять близько 10 мг загальних ліпідів із багатого на ТАГ гексанового екстракту і багатого на полярні ліпіди ХМ екстракту омилювалі із застосуванням 4 мл 5 95 КОН у 80 95 Меон і нагрівали протягом 2 годин при 80 "С у вкритій тефлоном скляній пробірці із нагвринчувальною пробкою. Після охолодження реакційних сумішей додавали 2 мл води Мій-О, стероли і спирти екстрагували тричі по 2 мл гексану : дихлорметану (4:1, об/0б), струшуючи і перемішуючи вихровим перемішуванням.
Суміші центрифугували, і кожен екстракт в органічній фазі промивали 2 мл води МіїЇЇ-О, струшуючи і центрифугуючи. Після відбору верхнього, стерол-вмісного органічного шару, розчинник випаровували за допомогою потоку газоподібного азоту, а стероли і спирти силіліювали із застосуванням 200 мкл біс(триметилсиліл)утрифторацетаміду (БСТФА, 5ідта-
Аїйгісп), нагріваючи протягом 2 годин при 80 "С у закупореному ГХ флаконі. В такий спосіб вільні гідроксильні групи перетворювали на їх триметилсилілові ефіри. Похідні стерол- і спирт-
ОТМ5і сушили в потоці газоподібного азоту на нагрівальному блоці (40 "С) та повторно розчиняли у дихлорметані (ДХМ) безпосередньо перед аналізом ГХ/ГХ-МС, як викладено вище.
Таблиця 18
Склад жирних кислот ( 95 загальних жирних кислот) ліпідних екстрактів і фракції з трансгенного і контрольного насіння С. 5аїїма.
Жирна (ексан! 0 ХМ 00001110 | Шротібексаніо///0/0/0/ ХМ 7/7 | Шрот льні шкові льні кові 16ле7| 01 | 02 101102 01 02 |о01 02|02| - | - | 03 160 | б2 |128) 68 |21,3 194) 104 | 67 128 7,8 |296113,7| 103 184ю3| 37 | 33 | 34 | 21 129| 36 | - | - | - | - 71 - | - 18лш9 | 11 | 47 | 96 | 72 28| 81 | 140 254 | 13,3 |147135,7| 143 20503| 04 | 021 03| - - | 03 | - - | - | - 1-1 - 204ю03| 04 | 04 1 04| - /02| 03 | - | - | - | - 1 - | - 20206| 07 | 07 | 08106 04 07 | 18 08 | ги |т12| - | 18 20303| 08 | 121 09 | 06 13 05 09 03| - | - | - | 04 201ю7| 06 | 08/14 | 06 02| 11 | 06 06 | 20 || - | 18 200 | 13 | 08/14 | 06 01 14 | 15 07 |20|14| - | 18 22б03| 68 | 42 | 61 | 30 16 54 | - | - | - | - 71 - | - 22:503| 03 | 11 104 | 06 14| 03 | - | - | - | - 1 -їЇ - 221ш9| 13 | 10 18/06 01 15/27 07 | 36 |091| - | 29 220 | 03 | 02/03 | 06 011 07 | 03 02 | 07108 - | 08 241ш9| 03 | 04 | 04 | 06 03 06 | 03 06 | 07 091051 10 240 | 01 | 04 102109 04| 11 | 01 04 | 05 |141|04| 13 інш" | 04 | 10/10 | 14 05 18 | 03 11 | 09011 - | и
Скорочення: триацилгліцероли (ТАГ,, гліколіпіди (ГЛ), фосфоліпіди (ФЛ); Загальні: багатий на полярні ліпіди екстракт, що містить ГЛ і ФЛ із ХМ екстракту; ТАГ, ГЛ ії ФЛ розділяли хроматографією на колонці із кремнію діоксидом з ХМ екстрактів; " Сумарний вміст мінорних жирних кислот
Основними стеролами, як у трансгенному, так і в контрольному насінні були 24- етилхолестерин (ситостерол, 43 95-54 95 від загальних стеролів), 24-метилхолестерин (кампестерол, 20 95-26 95) з нижчими рівнями холестерину (5 95-8 95), брасікастерол (2 95-7 95), ізофукостерол (д5-авенастерол, 4 95-6 95), стигмастерол (0,5 95-3 95), холест-7-ен-З3р-ол, (0,2
Фо-0,5 Уо), 24-метилхолестанол (кампестанол, 0,4 95-1 90) і 24-дегідрохолестерин (0,5 95-2 95) (Табл. 19). Ці дев'ять стеролів відповідають за 86 95-95 95 загальних стеролів, тоді як решта компонентів, що є стеролами, ідентифікована тільки частково за кількістю атомів вуглецю і подвійних зв'язків. Загальні профілі стеролів були подібними для трансгенного і контрольного насіння, як у випадку гексанових, так і у випадку ХМ екстрактів.
Аналіз жирних спиртів
Жирні спирти в екстрактах були дериватизовані і проаналізовані щодо стеролів. Серії жирних спиртів від С16-С22, із супутніми ізо-розгалуженими жирними спиртами були ідентифіковані як у гексанових, так і ХМ екстрактах. Подібні профілі спостерігалися для трансгенного і контрольного насіння, з деякою варіацією у частках спостережуваних індивідуальних компонентів. Фітол, утворений із хлорофілу, був основним аліфатичним спиртом і відповідав за 47 95 і 37 96 загальних жирних спиртів у гексанових фракціях із трансгенного і контрольного насіння, відповідно. Спирти з непарною довжиною ланцюга присутні 3 вищими рівнями у ГМ екстракті (37 95-38 95 від загального вмісту жирних спиртів), ніж у гексановому екстракті (16 90-23 90). 3-17:0 (16 95-38 95) переважав над 17:0 (0,3 95-5,7 90). Вміст інших спиртів із непарною довжиною ланцюга становив 19:00 (4,5 95-6,5 95). Інші знайдені спирти включали ізо-16:0, 16:0, ізо-18:0, 18:1, 18:0, з незначними рівнями ізо-20:0, 20:11, 20:0, а також були присутні ізо-22:0, 22:1 і 22:0.
Обговорення
Результати показують, що подрібнення за допомогою механізованої ступки і товкача із багаторазовою екстракцією гексаном при кімнатній температурі було ефективним з точки зору добування більшої частини ТАГ-вмісної олії із трансгенного насіння. На додаток до олії із трансгенного насіння, що містить помірні рівні ДГК, трансгенне насіння також містило значно вищі рівні АЛК в основних класах ліпідів (триацилгліцероли, гліколіпіди і фосфоліпіди), у порівнянні з контрольним насінням. Це показало, що активність А15-десатурази значно підвищувалася у трансгенному насінні в ході розвитку насіння. Цікаво, що існували деякі невеликі відмінності у складі жирних кислот і частках ДГК у різних екстрактах і фракціях, причому рівні ДГК були вищими в багатому на ТАГ гексановому екстракті і ТАГ із ГМ екстракту (6 У5-6,8 95) і нижчими у фракціях полярних ліпідів (З 9о у гліколіпідах і 1,6 96 у фосфоліпідах).
Рівень 16:0 був вищим у фракціях полярних ліпідів, гліколіпідів і фосфоліпідів у ХМ екстрактах (19 95-21 95), в порівнянні з багатим на ТАГ гексановим екстрактом і ТАГ із ХМ екстракту (6 95-7
Зо).
Таблиця 19
Склад стеролів ( 95 від загальних стеролів) у трансгенному і контрольному насінні Сатеїїпа. 11111111 | Траногенненасіння.ї | Контрольненасіння.//: га4-дегідрохолестерин.//-/:/ | 08 2 | 18 | 05 | 714
Кампестанол..//-/:/-/// |. 70417771 1 1104 | 2 щ(Б0е інші 1 оміСавтав 77777777 77117106 17771112 | 07 | 12 мзСгягав 77777777 77117109 17771711718 | 713 | 24 2 щФ - оміаСавтав 77777777 7717103 1777109 | 06 | 7
Скорочення: Н/в означає невідомий стерол, число після С вказує на кількість атомів вуглецю, і ар позначає кількість подвійних зв'язків.
Склад стеролів у трансгенному насінні і контрольному насінні був подібним до знайденого у рафінованій олії Сатеїїпа (Зпикіа еї аї!., 2002), біли присутні ті ж основні стероли, вказуючи на те, що додані гени не впливали на синтез стеролів у насінні. Рівень холестерину в олії Сатеїїпа був вищим за той, що зустрічається у більшості рослинних олій. Присутній брасікастерол, який є характерним стеролом, знайденим у родині Вгаззісасеає, що включає Сатвеіїйнпа заїїма.
Приклад 9. Продукування ДЛ-ПНЖК у насінні Вгазвіса |ппсєа
Трансгенні рослини Вгаззіса їнпсеа одержували із застосуванням конструкції 5А7-тоав (Приклад 4) для продукування ДГК, як указано нижче. Семена сорту В. |ипсеа, чутливого до тривалого світлового дня, стерилізували із застосуванням газоподібного хлору, як описано
Кеге57і єї а. (2007). Стерилізоване насіння пророщували у середовищах МС з 1/2 активності (Мигазпіде апа 5Косо, 1962), затверділих з 0,8 95 агару, з корекцією рН до 5,8, і вирощували при 24 С і флуоресцентному освітленні (50 мкЕ/м2с) з фотоперіодом 16/8 години (світло/темрява) протягом 6-7 днів. Черешки котиледонів із стеблом 2-4 мм були виділені із цих саджанців в асептичних умовах і використовувалися як експланти. Адгорасіегішт їшптегасіеп5 штам Асі 1 трансформували бінарною конструкцією СА7. Культура Адгобасієгіит була висіяна і оброблена для інфікування, як описано Веїїде еї аї. (2013). Для всіх трансформацій близько 50 свіжовиділених котиледонних черешків інфікували 10 мл культури А. іштеїасіеп5 протягом 6 хвилин. Інфіковані черешки промокали стерильним фільтрувальним папером для видалення надлишку А. їштеїасіеп5 і переносили у середовища для сумісного культивування (МС, що містять 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК і 100 мкМ ацетосирингону, і також містять І -цистеїн (50 мг/л), аскорбінову кислоту (15 мг/л) і МЕС (250 мг/л). Всі планшети запечатували мікропористою стрічкою та інкубували в темряві при 242С протягом 48 годин сумісного культивування. Далі експланти переносили у передселекційне середовище (агар МС, що містить 1,5 мг/л, БА, 0,01 мг/л НКК, З мг/л АдМО», 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивували протягом 4-5 днів при 242С з фотоперіодом 16/8 годин, після чого експланти переносили у селекційне середовище (агар МС, що містить 1,5 мг/л БА, 0,01 мг/л НКК, З мг/л АоМОз, 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) та культивували протягом 4 тижнів при 242С із фотоперіодом 16/8 годин. Експланти із зеленим калюсом переносили в середовище для регенерації пагонів (агар МС, що містить 2,0 мг/л БА, З мг/л А9МО»з, 250 мг/л цефотаксиму, 50
Зо мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) і культивували ще протягом 2 тижнів. Маленькі бруньки регенеруючих пагонів переносили у середовище МС без гормонів (агар МС, що містить З мг/л
Ад9МО:», 250 мг/л цефотаксиму, 50 мг/л тиментину і 5 мг/л ФФТ) і культивували ще протягом 2-3 тижнів.
Потенційно трансгенні пагони розміром щонайменше 1,5 см виділяли і переносили у середовище для коренеутворення (агар МС, що містить 0,5 мг/л НКК, З мг/л АдМО»з, 250 мг/л цефотаксиму і 50 мг/л тиментину) і культивували протягом 2-3 тижнів. Трансгенні пагони з великою кількістю коріння, підтверджені ПЛР, переносили в грунт у теплиці і вирощували з фотоперіодом 16/8 годин (світло/темрява) при 22 "С. Були одержані три підтверджені трансгенні рослини. Трансформовані рослини вирощували у теплиці, дозволяли їм самозапилюватися і збирали урожай насіння Т1. Склад жирних кислот ліпіду аналізували в пулах насіння Т1 від кожної із трансформованих рослин ТО, і знайшли присутність 2,8 95 ДПК і 7,2 95 ДГК в одній лінії, позначеній УТ 1-4, тоді як інша лінія, позначена /Т1-6, продемонструвала 2,6 956 ДПК.
Масло насіння з індивідуального насіння Т1 проаналізували щодо складу жирних кислот; частина даних наведена у Табл. 20. Декілька насінин Т1 продукували ДГК на рівні від 10 95 до близько 21 95 від загального вмісту жирних кислот, включаючи 1 1-4-А-13, УТ1-4-А-5 і УТ1-4-8- 13. Дивно і несподівано було знайдено, що деякі з насінин Т1 містили ДПК на рівнях від 10 95 до близько 18 95 від загального вмісту жирних кислот, за відсутності ДГК, що піддавалася б виявленню (х« 0,1 95). Одне з можливих пояснень для такого насіння полягає у тому, що ген Да- десатурази у Т-ДНК, вставленій в цих рослинах, інактивувався, можливо внаслідок спонтанної мутації. Насіння Т1 пророщували, і один котиледон, що з'являвся із кожної насінини, аналізували щодо складу жирних кислот в залишковій олії. Решту частини кожного саджанця зберігали і вирощували до стану зрілості, щоб одержати насіння 12.
Трансгенні рослини, що були гомозиготними по одиничних інсерціях Т-ДНК, були ідентифіковані і відібрані. Рослини однієї відібраної лінії, позначеної УТ1-4-17, містили одиничну інсерцію Т-ДНК і продукували ДГК і тільки низькі рівні ДПК, тоді як рослини із другої відібраної лінії, позначеної 9Т1-4-34, також містили одиничну інсерцію Т-ДНК, але продукували ДПК без продукування ДГК. Авторами винаходу був зроблений висновок про те, що оригінальний трансформант містив дві окремих Т-ДНК, одна з яких забезпечувала продукування ДГК, а інша забезпечувала продукування ДПК без ДГК. Рослини В. |їшпсєа, що продукують ДГК у насінні, бо були схрещені з рослинами, що продукують ДПК у насінні. Потомство Е1 включало рослини, що були гетерозиготними по обом інсерціям Т-ДНК. У насінні цих рослин-нащадків спостерігалося продукування близько 20 95 ДГК і близько 6 95 ДПК, із загальним вмістом ДГК жї- ДПК 26 95.
Рослини Е1 самозапилювалися, і очікувалося, що потомство, гомозиготне по обом інсерціям Т-
ДНК, буде продукувати до 35 95 ДГК і ДПК.
Близько 18 95 ДПК спостерігалося в ліпіді пулу насіння потомства ТЗ, позначеного 11 -4-34- 11. Так само, близько 17,5 95 ДГК спостерігалося в ліпіді пулу насіння потомства ТЗ )Т1-4-17-20.
Склад жирних кислот пулу насіння ./11-4 Т1, одиничного насіння ТІ, пулу насіння 12, одиничного насіння 12 і пулу насіння Т3, одиничного насіння ТЗ наведений у Табл. 21-24. У11-4
ТЗ сегрегант ОТ-1-4-34-11 містив у пулі насіння ТЗ 18 95 ДПК, і одиничне насіння від даного конкретного сегреганта містило близько 26 95 ДПК, у кожному випадку як відсоток від загального вмісту жирних кислот.
Наступні параметри були обчислені для олії з насіння, що містило 17,9 956 ДПК: загальні насичені жирні кислоти, 6,8 9о, загальні мононенасичені жирні кислоти, 36,7 90; загальні поліненасичені жирні кислоти, 56,6 95, загальні б жирні кислоти, 7,1 905; нові 0б жирні кислоти, 0,4 95 з яких складала ГЛК; загальні 03 жирні кислоти, 46,5 95; нові 03 жирні кислоти, 24,0 90; співвідношення загальних 06 : загальних 03 жирних кислот, 6,5; співвідношення нових 06 : нових 03 жирних кислот, 60; ефективність перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією А12- десатурази, 61 9о; ефективність перетворення АЛК на СДК під дією Аб-десатурази, 51 90; ефективність перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Дб-елонгази, 90 95; ефективність перетворення ЕТК на ЕПК під дією Д5-десатурази, 87 до; ефективність перетворення ЕПК в ДПК під дією Д5-елонгази, 98 95.
Для одержання більшої кількості трансгенних рослин В. іппсеа з конструкцією тоавВ, трансформацію повторювали п'ять разів, і регенерували 35 передбачуваних трансгенних пагонів/саджанців. Провели аналіз насіння Т1, щоб визначити вміст ДПК і ДГК.
Для одержання подальшого насіння, що містить ДПК і не містить ДГК, ген Д4-десатурази був видалений з конструкції тоав, і одержану в результаті конструкцію застосовували для трансформації В. |ипсєа і В. пари5. Одержане насіння потомства, що містить до 35 906 ДПК у загальному вмісті жирних кислот в ліпіді насіння.
При аналізі методом ЯМР олії, екстрагованої з насіння рослини, що продукує ДГК,
Зо щонайменше 95 95 спостережуваної ДГК було присутнє в положенні 5п-1,3 молекул ТАГ.
Таблиця 20
Склад жирних кислот в олії насіння із насіння Т1 В. їипсеа, трансформованих Т-ДНК зі СА?7.
Т1 Мо о 1а9|о0 1 паті 2 |ЗпбіЗп3| 0 | п3 Пат |2п6|Зп3|| п3 | п3 | п3 | бо3 т1-4-А-115,0 10,2 | 2,7 (23,5 3,4 |17,010,7 |24,810,7|20|111 102|0,814010,6124 9, т1-4-А 214,3 10,3 | 2,6 137,2 3,2 |11,010,3 |22,110,7|10,911,93 02|1,4|3210,3194 00 т1-4-А-3| 5,6 10,3 | 2,7 |20,8 3,7 16,010,6 |24,410,7|2010,9 02|11|4510,7| ЗЛ А т1-4-А-4| 4,6 10,4 | 2,8 І36,2 3,4 110,61 0,3 |24,510,819,911,7 0210,310,510,0125 00 т1-4-А-5| 500,2 | 32 (20,3 3,6 (13,7 0,7 |25,910,7|2010,9 02|1,3|44| 1,516 155 т1-4-А-614,810,4| 3,4 137,9 3,7 | 74104 |19,910,9|1,4|1,4 01108191 0,4 13,9 00 т1-4-А-7|5,610,3| 3,0 (26,2 4,018,9 10,3 (26,61 0,6|11,811,0 1 0111,815,7| 1,31 22 11,9! т1-4-А-8|14,8 10,4 | 2,9 140,39 3,4 | 7,810,3 |22,210,8|1,4|1,3 01Ц|0,8124|04196 00 т1-4-А-917,110,3| 3,6 117,7 4,3 17,910,7 |(231| 1.021108 02|1,513610,81 20 11,9
ТК вивела вія вв олив тов ог пита ов тов, тяж ово| вве вто корти ваваоя |та |о2 отв оз во оо. тяж ове|ев|не тва о|ва вет ов |в |ол тера т твоя тк ова|ее|ве ет нива вервн|оя 2 то|о2 тил ор тк овареєри во корт варите торол ов|ря ов тв тв, тк ви ва вена вв ве ов|юа витяг ов| и оо гео оо, т1-4-8-1| 551021 27 118,9 4,0 117,61 0,8 |241|108|22|11,0 02|12|46|09| 22 15 (ут1-4-в-2|15,51|0,2 | 2,7 |20,2| 4,0 |14,9| 0,5 |25,5| 0,7 | 1,710,9|0211,61|8,7|1,5| 2,2 | 8,5
Насіння |С16:116:11|С18:1С18:С18:1С18:1С18:С18:1020:118:41020:11020:І020:120:4|20:5|22:5|С022:
Т1 Мо 0 1а9 о 1 лат 2 |ЗпбіЗи3З| 0 | п3 латті2пбіЗп3З| пЗ | пЗ | пЗ3 | бпо3
У71-4-8-3 5,3 | 0,3 | 3,6 |3А.1| 3,5 35,01 0,619,310,810,211,4 104 106109 |0110 | 21 у71-4-8-4 5,3 10,3 | 31 |25,2| 3,6 (17,01 0,7 |2411 0,7 11,911,0102 10,8 |431|051| 23 | 7,8 у71-4-8-5 5,5 10,5 | 22 |ЗОЛ| 4,6 (10,21 0,5 |21,7| 0,611,4 111102 109124 |05 бло
У71-4-8-6 5,6 | 0,3 | 2,5 |19,5| 3,8 (1521 0,5 |27,7|0,612110,9 102 111137 |061|53 ТМ)
У71-4-8-7 5,9 10,5 | 2,0 (29,91 4,0 (11,21 0,3 |26,21 0,6 111,5 1,4 102 103104 |0,0 | 41 | 01 у71-4-8-8 6,2 10,5 | 1,9 |33,1| 4,0 130,01 0,5 |12,7| 0,610,311,3104 114109 |01144 | 00
Ут1-42-в-914,9| 20,2 | 3,4 |24,6| 3,0 118,51 0,3 26,2|10,8|11,3| 11 102|2,0|15510,610,8 | 52 тю 52 оз гл воло оо ов зов ол тв то|02 17 49 11 | 30 Гог тя ев ог о вия ев вя ви тв наве вне ов т вв, т |50 02 ав ев зя4 ов ов ово ов зи 102 09 55 09/35 17
У11-4-8- 13 5610,312,8120,9|3,9111,940,4 27,010,712011,0102|1,712,310,7 14,1 15,5 моб |в оз зи рве за вл от свв ов| те т2|02 09 ов 04/29 92 т |веровігл вв ат о ов ра ол |2л |09|о2 от ва | 19 |в | 85
Зразки олії з насіння додатково містили 0,1 95 С14:0; 0,1-0,2 956 С16:3; по 0,0-0,1 95 кожної з
Сб20:1А13, С20:306 і С20:406; 0,3-0,4 95 22:00; не містили С22:1 і С22:206; містили 0,2 95 С24:0 і 0,2-0,4 95 С241.
Таблиця 21
Склад жирних кислот ліпіду з насіння (пул) Т1 В. |їипсеа, трансформованих Т-ДНК із СА7-тоаВ.
Ліпід додатково містив близько по 0,1 95 кожної з 14:0, 16:3, 201413 і 16:2; 221 не була знайдена. 9 ке к ме 9 ее з 5 8 8 89 9555999
Б Б Б Б и Бе кВ Б 5 8 я я я 8 5 8 я ях В Я Я
З оо тво ооо чав з о
Ніж 42 35 2,5 агА За 25,7 31 154 05 ба 12 01 00 зо за 03 ба по 0 оба 02 34А бо да 5-3 83,55 03 2,7 446 5341 ЗЕ Пі 38 б по 1232 бі 000000 бл бо ооо 000: 4 запо тА 51 05 595 2585 35 17,4 055 29,85 й 2,5 11 095 00 000 313 55 2,85 б оо І ЩІ З 2,8 7.2 171-545, За 2, 416 34 ЗЕ бл 585 бу бо 15: 01000005 б 6000600 пваА за во
ТІ-6 5.8 04 9,5 373 33 3397 04 13.92 07 ВУ 14 03 00 80 87 0з 05 01 00 05 02 35 28 ВО
Таблиця 22
Склад жирних кислот в олії насіння із насінин Т1 (індивідуальних) В. їипсеа, трансформованих Т-
ДНК із СОСА7-таавВ.
Насіння |С16:116:11|С18:1С18:С18:1С18:1С18:С18:1020:118:41020:11020:І020:120:4|20:5|22:5|С022:
Т1 Мо 0 1а9 о 1 лат 2 |ЗпбіЗи3З| 0 | п3 латті2пбіЗп3З| пЗ | пЗ | пЗ3 | бпо3
Ут1-4-А-1 5,0 10,2 | 2,7 |(23,5| 3,4 (17,01 0,7 (24,81 0,7 12,011,1102 1084006 124 | 9,5
Ут1-4-А-2 4,3 0,3 | 2,6 |37,2| 3.2 (11,01 0,3 |22.11 0,7 10,911,3 102 11,4 |32|03194 | 00
Ут1-4-А-3| 5,6 | 0,3 | 2,7 |20,8| 3,7 (16,01 0,6 (24,41 0,7|20|0,9|02| 11 | 45| 07 ЗЛ ГА
Ут1-4-А-4 4,6 | 0,4 | 2,8 |36,2| 3,4 |10,6| 0,3 (24,51 0,819,911,7 102103 |1051|0,0125 Д|00
Ут1-4-А-5 5,0 0,2 | 3,2 |20,3| 3,6 |13,7| 0,7 (25,91 0,7 12,010,9 102 11,3|144|1,51| 7,6 | 15,5)
Ут1-4-А-6 4,8 10,4 | 3,4 37,91 3,7 | 74104 119,91 0,911,4 11,4 101 10811904 |13,9100
УТ1-4-А-7| 5,6 | 0,3 | 3,0 |(26,2|4,018,9 | 0,3 |(26,6| 0,6 11,811,0 101 11,8137|1,3| 22 | 11,3)
Насіння |С16:116:11|С18:1С18:С18:1С18:1С18:С18:1020:118:41020:11020:І020:120:4|20:5|22:5|С022:
Т1 Мо 0 1а9|о 1 платті 2 /ЗпбіЗи3| 0 | пз пат! 2пбі|Зп3| п3 | пЗ3 | пЗ3 | бп3
Ут1-4-А-8| 4,8| 0,4 | 2,9 |40,3| 3,4 | 7,8 10,3 22,210,8|11,4| 13101 10,8124|04 1961 0,0
Ут1-4-А-917,11| 0,3 | 3,6 |17,7| 4,3 117,910,7 23.1 0121108 102|1513610,8 | 20 (11,9 тю |5и|02|л2 ро за ев от тт ов т5|ое ог тт тв ов то вв по" |во|ов|зеізлє но ти ол тег ол те| тм ог ов те оз | 00 т |52|оз|зорве но в оз тя ов те|ое|ол тв за тт тв ог т |54|о2|зо ел я ве ов гео аа тоо2 тт 20 тт 20 тя мо |в|ом|зи вою ло тв оз ол ол | то|оліоє м ов та | тв шо |вл|ом|ов|мо зв во ов смол тет |ог ов 47109 5200
Ут1-4-в-11 5,51 0,2 | 2,7 (18,91 4,0 117,61 0,8 |(241|0,8|22| 10102|12|146Ц|0,9 | 22 115
Ут1-42-в-215,51|0,2 | 2,7 |20,2| 4,0 (14,31 0,5 |(25,5|0,7|1,710,9102|16|87| 132,2 | 8,5
Ут1-4-в-31 5,3 | 0,3 | 3,6 |34.1| 3,5 І35,010,619,3|10,8102|1,4104|06109|01 10 | 21
Ут1-4-в-4| 5,31 0,3 | 3,1 |25,2| 3,6 |17,010,7 (2411 0,711,91| 01021081 431| 0,5 | 2.3 | 7,8
Ут1-4-в-5|5,510,5 | 2,2 |301| 4,6 (10,21 0,5 |(21,7| 006114 |1110210,9124| 0,5 1611 0,0
Ут1-4-в-61 5,6 | 0,3 | 2,5 |19,5| 3,8 (15,21 0,5 |(27,7| 006|2110,9|102|11|37Ц| 06 | 33 ТЛ
Ут1-4-в-71 5,91 0,5 | 2,0 |29,9| 4,0 |11,2| 0,3 (26,21 0,6 |11,5| 1,4 (0210, 104 | 0,0 141 | ОМ
Ут1-4-в-81 6,21 0,5 | 1,9 |33,1| 4,0 130,01 0,5 |12,7| 00610,3|11,3104|14109Ц|101 144 | 0,0
Ут1-42-в-914,9| 20,2 | 3,4 |24,6| 3,0 118,51 0,3 26,2|10,8|11,3| 11 102|2,0|15510,610,8 | 52 тю |52|оз|27 во ло го ов зо ол те|то|о2 тт 49 1130 Моз по явоб2 зол зл вм ов зв оу тв|т2|о2 вав ов 16 9 т |5о|о2|2в ов за ав ов ово ов зи|ти|о2 ов 5609 3517
У11-4-8- моб |вЦ|ов|зл ре за вл от оз ов те|т2|о2 о ов ом 29192 тв |56|оз|2т ев а ас ов ря ол 27 |09|о2|от|зя|та|ов| ве
Зразки олії із насіння додатково містили 0,1 956 С14:0; 0,1-0,2 956 С16:3; по 0,0-0,1 95 кожної із
С20:1А13, С20:306 і С20:406; 0,3-0,4 95 С22:0; не містили С22:1 і С22:206; містили 0,2 95 С24:0 і 0,2-0,4 у6 С2471.
Таблиця 23
Склад жирних кислот в олії насіння з індивідуальних насінин 12 В. їипсеа, трансформованих Т-
ДНК із СА7-тоаВ. - у т 5 є ї- х дя оп ва 8 оби В'я В кВ а Б 8 Вади В ча ря и що оо Бе М я Бе щи - ча пот ал8 а 03 9 17305 2 А Б а ба 14 2 бл па ба 04 53 аа па по оби пі па 185 п5 35 05 п-іа--1а8 55 ба 01 13 3354 31 А ба 183 А 12 3 бл опо бл оо 5 25 па по ба 02 пп 15 ба Аа по ї-1-8-158 Бл па па БА 43 32 за бз зап св аа їх 02 по са 02 54 5,5 зв оС опо б о са па 55 па
Р-1-3-15 8,7 п оба 83 и 25 00 028 05 АЙ їж пз ба по 02 03 5 до си пі пл по пе ія ба
УІа-158 5 па п 1 55,5 5,7 а А їі52 05 до і14 па па по 174 03 б пз бо б пл обов 15 са ЗА
БР-14-15 а 03 01 1,7 355 7 ж За бга пух їй 15 площа по 7 па пз вд обло а по б п А 0
УБ-1-4-15 4,5 053 сп 1,85 38,85 3,1 7, 0, 202 п за їз Зі па бо пд оп я опо б бе пл зд у пд ії Аа тк-і-4-13 т па пи 177 3325 За 85 п ЗОЗ пло 07 за п 0 бо 25 203 2,5 б об оба па? по за о зад од п-іа--1а3 48 03 01 27 50 За з би о о 2 зд 02 по сл 03 55 85 па бо ба 002 по соя п го п---а БЖ 5 пі ов За 37 за ба Ба б й БА ой о па ов ва за бо ва бю по 195 па з по к-1-3-15 48 па па зи 471 2,800 та п 28, 05 А 1 01 по со 0 б 05 з 0бд об ог по 05 035 Ба ї-1-8-158 Бі бе паї 87,4 З ти ба пу; св й фа ові по сп 8 ПА 5 за би пі о о то па 335 по 13-15 8,7 п ОС БЕ 57 5 7 ща 205 055 їж ії пі ба бо 05 03 85 об си пі пл по дя б 323 ба
Ярлаїо яз пз 2 то 373 50 741 ба деф п5 зд 13 ві са Бо па ба яї1 п5 бю пл ад о Ою зі од зб од
Б-14-15 5,7 03 сі 18 35 З Ба оба га пу вл їй пл опа бо жи пз 30 об во сш пл од ої 05 3406 5 п---4 47 за піт я 37,8 34 2,85 ба 23,7 05 йв ії б, по па Бе Ви її за бо ва бл по 18 пз 314 по іт-1-3-34. 53 ба па 18 353 35 Вії бе 21 05 ва їз З по да об 33 3 дБ по бл бл до 18 пз 334 по 1-18-34 4 па паї За За ти ба 91 05 пи фл об по са п па 90 за бл об ой по 17 ба 323 бо 13-34 50 па Са 8 55А 31 тв па ба 05 пд ії За ба 00 08 0,2 25 Оз са б пл по го бл зз1 б їк-1-4-34 Бл оба п 185 33,5 2,25 в обя пк пе З 155 Зв па ба ра туя па оби оплопл осо їв пд ба
Б-14А-3Я а 003 01 18 38,2 3 та а пл об вл ота б опа бо сь сп 3 па бод об пі по 1,7 05 1354 0
Уугіа-3я БО 3 п 2 33,5 23 7,5 0 202 п з їз Зі па бо Я п пз ва бе зп4 Зо 15 05 15,8 б піз ат б щі 185 350 за ж а б б б 15 0,2 па бла 15 55 17 пл опо обл пі па 185 05 15,7 05 п-4--4 щи 05 005 24 33,0 44 ти Б 184 ба 12 12 02 що сб 5 ца п по 0 02 пп 1 оба о
Таблиця 24
Склад жирних кислот в олії насіння з індивідуальних насінин ТЗ В. |ипсеа, трансформованих Т-
ДНК із СА7-тоаВ. ее З оо В ов в в йо В В лов ов з В г з а т я дод З В вав Ваня он в
Яр-1-4а-35-1ї З па пло зва Мт 5, ба Її б7 10 15 5 01 по бий 51 03 14 Ох ой б во за 5 1553 0 3т-4-4-34-4Р 02,3 па в зд 433 Зв 52 о 18,5 ї507 0,8 3,7 щі плов вп 18 03 32 ба по б» вд ої З ззА Во я-і-а-33-431 45 ба па 2,8 334 44 54 04 ї85 07 12 14 2 оба па бо та 03 б 25 0 пз по 34 0А од од зт-1-4-34-114 4,5 04 пі 78 355 33 б п. зва пд за зд о ва й 00 под ї1д дз 357 пз пою 02 со 18 03 342 0 іі 4-35, аз 25 02 234 322 35 47 03 ал о бЕ 12 14 ці по ба бо 20 03 14 35 по 03 б 32 ба 1З3А по р-і-4-3з3-1ї 45 0бд о ді зо зві 32 58 03 254 0,7 4 15 05 04 до бо 127 аз 15 в4 ба аз по 13 бА І1Ба од 3т-1-4-34-35 0 54 пе 02 323 253 ай бб па 186 па зл за пз пл 03 бод 12 04 3,5 07 по 03 бо БА 05 225 во рт-1-4-38-11 5,2 ба 02 ов? за5 ал 8, 03 172 тд тА 14 03 ба по бо 15 дл 14 05 ба пз по 192 0д 194 вд 3т-1-4-34-3ю 0 5,3 пе б 34 Зза ЗУ бб а 176 па зл 32 ва Вл о о бод іл 04 35 об по 02 б Ба 05 207 Во їт-1-4-34-1ї Боба Злю зи ЗВ 3,5 54 б 175 08 08 тв За бі б Бо ва ба 13 ай обо б бл а оА 151 по л-1-4-34-11 4,3 04 ді зі зву ЗА Ба бл ї8ва бл оба з 0 0 по пд ід дз 14 03 ба да бо 13 04 127 б 3зт-4-а-3441 008,8 п в 28 338 За За па ї824 47 ї14 за щі плода 30 12 03 15 дб по б бод о їз ба года по рр-1-4-35-1ї доба 1 8,5 403 3,5 5,2 0,5 135 0,7 10 15 ща 01 по би їв 03 14 Ох 0 03 во за п 1385 0 зі а3ал1Р 4,8 па б 32 дв; 37 595 пз їЗ9 п їм за пі пл ба бо 14 03 15 85 по б вдо вл З 154 по
Яр-1-4а-35-1ї й б п 2,8 37 З Аз баз ї1зо б пе 15 в 01 по би 55 бал 13 05 ой 3 во 1 0 178 0 зг-1-4-34-11 4,5 04 да Зв 3 33 5 пло зва пз ї1 34 3 ба до пд ії па 33 ба бо баз бо за 05 178 0 3г-4-4-34-41 5.2 са 02 3 278 37 583 05 Ії бЕ 17 18 ці пл ба бо о ба 15 ал по баз вд ов ба я по рр-1-4-33-11 5,4 б, аа з ЗБ 4, 4,65 03 18,5 бод тд 13 0 би по ба ти 04 15 05 ба паз то 13 04 218 05 3т-1-4-34А-11 ви а О.Ю тих ща За 64 ба ї8а Б 21 здо Бі Б бою со оз 04 14 ал обо по ьо 5 бо р-і-4-3за8-1ї 45 0бд о ді 32 332 33 5,77 0,3 205 07 па 16 05 04 до бо 17 аз 13 93 ба аз по ї3 0 хро
У-1-4-34-21 а 0,4 1 ла 398 За 5 0.5 ло» 0 05 36 05 ді 00 по 11 25 15 п сю пз бо 18 бля ії 0 31-1-4-34-21 а а ОЗ, в Б ба їв бе 1 А 51 6 ою Зо ув 03 1,5 ви по ФВ свя б 155 Бо іа 3521 й оби пі Бо Яйа За 65 ба 19 б, 10 15 па б1 бо бл сб, б 1,5 035 с ба 6 тю п 128 0,
Приклад 10. Подальший аналіз трансформованих рослин і польові випробування
Гібридизаційний аналіз методом саузерн-блотинга проводили для відібраних рослин Т2 В. пари, трансформованих Т-ДНК із конструкції ЗОА7-тоав. ДНК, екстраговану із зразків тканини рослини, розщеплювали декількома рестрикційними ферментами для гібридизаційного аналізу методом саузерн-блотингу. Радіоактивний зонд, що відповідав частині Т-ДНК, гібридизували з плямами, які промивали в суворих умовах, і плями приводили в контакт із плівкою, щоб знайти смуги гібридизації. Деякі із зразків продемонстрували одиничні смуги гібридизації для кожної із сумішей після розщеплення рестрикційними ферментами, що відповідало одиничним інсерціям
Т-ДНК у рослинах, тоді як інші продемонстрували дві смуги, а наступні знову продемонстрували декілька смуг Т-ДНК, що відповідало 4-6 інсерціям. Кількість смуг гібридизації, спостережуваних в саузерн-блотинг аналізі, добре співвідносилася із кількістю копій Т-ДНК у трансгенних рослинах, визначеною методом цифрової ПЛР, до кількості копій близько З або 4. При кількості копій, більшій, ніж близько 5, метод цифрової ПЛР був менш надійним.
Деякі з відібраних ліній використовували як донори пилку при схрещуванні із серіями з близько 30 різних сортів В. париб5 із різним фоновим генотипом. Подальші зворотне схрещування здійснювали для визначення того, чи є множинні інсерції Т-ДНК генетично пов'язаними, чи ні, і дозволити сегрегацію генетично не пов'язаних трансгенних локусів. Таким чином були відібрані лінії, що містять одиничні трансгенні локуси.
Однопраймерні реакції ПЛР проводили у трансгенних лініях із застосуванням праймерів, суміжних із лівими і правими межами Т-ДНК, і будь-які лінії, що демонстрували присутність обернених повторів Т-ДНК, відкидали.
Деяка кількість трансгенних ліній продемонструвала затримку цвітіння, тоді як у інших було знижено утворення насіння і, таким чином, знижений вихід насіння на рослину після вирощування в теплиці, що узгоджувалося із зниженою чоловічою або жіночою фертильністю.
Досліджували морфологію квітки у цих рослинах і спостерігали, що в деяких випадках розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку із пильовиків затримувалося таким чином, що рильця товкачика подовжувалися до розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку, таким чином віддаляючи пильовики від рилець. Повна фертильність могла б бути відновлена штучним запиленням. Крім того, визначали життєздатність пилку у момент розкриття насіннєвих коробочок і вивільнення пилку за допомогою фарбування фарбниками для визначення життєздатності ФДА і ПИ (Приклад 1), і було показано, що вона знижена у деяких лініях, тоді як у більшості трансгенних ліній життєздатність пилку становила близько 100 95 від життєздатності в контрольних рослинах дикого типу. Як подальший аналіз для виявлення можливої причини
Зо зменшення виходу насіння з деяких рослин, аналізували вміст і склад жирних кислот у квіткових бруньках, включаючи пильовики і рильця/товкачики деяких рослин ТЗ і Т4. ДГК не була знайдена в екстрагованих ліпідах, вказуючи на те, що гени у генетичній конструкції не експресувалися в квіткових бруньках у процесі розвитку рослини, і виключаючи це як причину зниженого виходу насіння.
Вміст олії вимірювали методом ЯМР, і визначали рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот для насіння 12. Трансгенні лінії, що містили менш ніж 6 95 ДГК, відкидали. Кількість копій
Т-ДНК у зразках листя рослин поколінь 11, 12 ії ТЗ визначали методом цифрової ПЛР (Приклад 1).
Відібрані партії насіння ТЗ і Т4 висівали у полі на двох ділянках у Вікторії, Австралія, кожну у рядах завдовжки 10 м із щільністю висіву 10 насінин/м. Відібрані партії насіння включали одержану із В003-5-14 лінію, яка демонструє рівні ДГК в пулі насіння близько 8-11 95 і рівні ДГК для індивідуального насіння Т2 до близько 19 95, із кількістю копій Т-ДНК З у рослині ТО. Крім того, відібрані партії насіння включали одержані із В0050-27 лінії, які продемонстрували рівні
ДГК у насінні Т2 понад 20 9б, і кількість копій Т-ДНК 1 або 2 у рослинах 12. Насіння, висіяне в полі, проростало і давало пагони із такою ж швидкістю, що і насіння дикого типу. Рослини, вирощені з більшості, але не всіх висіяних партій насіння, були фенотипово нормальними, наприклад, демонстрували морфологію, швидкість росту, висоту рослин, чоловічу і жіночу фертильність, життєздатність пилку (100 95), утворення насіння, розмір і морфологію стручків, які були по суті такими ж, як у контрольних рослин дикого типу, вирощених у таких же умовах.
Вихід насіння на рослину був подібний до виходу для контрольних рослин дикого типу, вирощених у таких же умовах. Інші зразки насіння висівали на великих площах для масового виробництва відібраних трансгенних ліній. Загальний вміст ДГК в урожаї зібраного насіння становив щонайменше 30 мг/г насіння.
Кваліфікованим фахівцям в даній галузі техніки буде зрозуміло, що численні варіації та/або модифікації винаходу можуть бути здійснені, як розкрито в конкретних варіантах, без відходу від духу або контексту винаходу в його широкому значенні. Представлені варіанти, таким чином, слід розглядати в усіх відношеннях як ілюстративні, але не обмежуючі.
У цій заявці заявлений пріоритет по АЮ 2013905033, поданій 18 грудня 2013 року, і АО 2014902471, поданій 27 червня 2014 року, 05 61/697676, всі з яких включені до даного документу шляхом посилання в повному обсязі. Всі публікації, обговорювані та/або на які є посилання у даному документі, включені до даного документу в повному обсязі.
Будь-яке обговорення документів, дій, матеріалів, пристроїв, виробів, тощо, яке включено до цього документу, призначене виключно для цілей забезпечення контексту цього винаходу. Не слід робити припущення, що будь-які або всі ці питання утворюють частину відомого рівня техніки або являли собою загальнодоступне знання в галузі техніки, до якої відноситься це винахід, в тому вигляді, в якому воно існувало до дати пріоритету кожного з пунктів формули цієї заявки.
ПОСИЛАННЯ
Аррбаді еї а. (2004) Ріапі Сеї! 16: 2734-2748.
АРррбої! вї а!. (1998) бсієпсе 282:2012-2018.
Адаба еї а!. (2004) Магіпе Віоїесппої. (ММ) 6:251-261.
АЇмаге? єї а!. (2000) Тнеог Аррі Сепеї 100:319-327.
Агтьгиві єї а!. (2004) Зсієпсе 306:79-86.
Вайтівїп еї а!. (1991) Мої. Сеп. Сепеї. 225:459-467.
Вайтівїп сеї а!. (1992) Ріапі 9. 2:233-239.
Веацаоіп еї а!. (2000) Ргос. Маї!. Асад. сі. О.5.А. 97:6421-6426.
Веїїде еї а). (2013) Ріапі Сеї! Тівв Огдап Сиїї. 113:543-553.
Вегбетгісн. єї аї. (1998) Ріапі Мої. Вісої. 36:297-306.
Вгошп еї аї. (1998) Ріапі у. 13:201-210.
Вгомлп еї аї. (2002) Віоспет .). 364:795-805.
Спап еї аї. (2006) Майте Віоїесппоіоду 28:951-956.
СНнартаг еї а!. (2004) Сеп. Оєм. 18:1179-1186.
Спеп еї а. (2004) Тне Ріапі Сеї! 16:1302-1313.
Снепа еї аї. (1996) Ріапі Сеї! Вер. 15:653-657.
Снепа єї аї. (2010) Тгапздепіс Вез 19: 221-229.
Сно еї а!. (1999а) У. Віої. Снет. 274:471-477.
Сно еї а!. (199960) У. Віої. Снет. 274:37335-37339.
СнНтгівііе (1982) у. Гіріа Нев. 23:11072-1075.
Сіоцои апа Вепі (1998) Ріапі 9. 16:735-43.
Ратиае єї аї. (2006). Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 103: 9446-9451.
Оепіс апа М/еізвтап (2007) Сеї! 130:663-677.
Ботегаце евї а. (2002) Єиг. У. Віоспет. 269:4105-4113.
Ротегаце еї аї. (2003) 9. Вісі. Спет. 278: 35115-35126. ротегаие еї а!. (2005) Віоспет. 9. 1 389: 483-490.
Рипоуеєг еї а. (2004) Те Ріапі Сеї! 16:11235-1250.
ЕПегвіготє еї аї. (1996) Ріапі Мої. Вісої. 32:1019-1027.
Сате? єї а!. (2003) Роса Вез Іпіегпайопаї! 36: 721-727.
Сагсіа-Магоїй еї а. (2002) Ііріав 37:417-426.
СіїКе еї а!. (1998) Ріапі 9. 15:39-48.
Наї є! а. (1991) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 88:9320-9324
Натійгп еї а!. (1997) Сепе 200:107-16.
Нагауата (1998). Тгтепаз Віоїтесппо!. 16: 76-82.
Назвіїпоз вї а!. (2001) Ргос. Майї. Асад. 5сі. 0О.5.А. 98:14304-14309.
Ніпснеєе еї а!. (1988) ВіотесппоІоду 6:915-922.
Нойтанпт есеї аї. (2008) У Віої. Снет. 283:22352-22362.
Нопа ев! а. (200г2а) Гіріах 37:863-868.
Ногідисні єї а!. (1998) Ріапі СеїІ РНузіої. 39:540-544.
Ниапоа єї а. (1999) І іріа5 34:649-659.
Іпадакі еї а. (2002) Віовсі. Віоїтесппої. Віоспет. 66:613-621.
Ка|Кама еї аї. (2004) Ріапі Мої. Віої. 54:335-52.
Каїїкама єї а!. (2006) РГЕВ5 І ей 580:149-154.
Кегез7ї вї аї. (2007) Маїшге Ргоїос 2:948-952.
Кіт еї а. (2005) Ріапі СеїІ. 2005 1073-89.
Кпиїгоп вї а!. (1998) 9. Віої Спет. 273:29360-6.
Ко?лівї еї а. (1996) Ріапі Мої. Віої. 32:393-405.
Ї аззпег (1995) Ріапі Рпувзіої. 109:1389-94.
Ї еопага еї аї. (2000) Віоспет. 9. 347:719-724.
Ї еопага еї аї. (20005) Віоспет. 9. 350:765-770. 60 Ї еопага еїа!. (2002) І іріа5 37:733-740.
Ї емувеу єї аї. (2007) Ріапі 9. 50:240-252.
І о єї а. (2003) Сепоте Везв. 13:455-466.
Ги апа Кап (2008) Ріапі! Сеї! Нер. 27:273-8.
Маїогу еї а!. (2002) Маї. Віотесн. 20:622-625.
Магаподопі єї а!. (1995) Тгепавз іп Роса 5сі. Теснпої!. 6: 329-335.
Меезаруоа3зик еї аї. (2007) У Віої Снет 282: 20191-20199.
Мепоа вї а!. (2008) 9. Сіеп. Міго!. 89:2349-2358.
Меуєег еї а!. (2003) Віоспет. 42:9779-9788.
Меуег еї а). (2004) І іріа Вез 45:1899-1909.
Міснає!зоп вї а. (1998а) 9. ВіоЇ. Спет. 273:19055-19059.
Міснає!зоп вї аї. (199860) ЕРЕВЗ І еїї. 439:215-218.
Митгазніде апа 5Косяд (1962) Рпузіоіодіа Ріапіагит 15:473-497.
Марієг еї а. (1998) Віоспет. 9. 330:611-614.
Меєаієтап апа УУипвсй (1970) 9. Мої. Віої. 48:443-453.
Раке!-Ваттез еї аї. (2000) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 97:8284-8289.
Регеїга єї а. (2004а) Віоснет. У). 378:665-671.
Регеїга єї а!. (20045) Віоспет. 9. 384:357-366.
Реттіп еї а. (2000) Мої! Вгееа 6:345-352.
Реїтгіє еї а. (2010а) Меїар. Епод. 12:233-240.
Реїтгіє еї а. (20100) Ріапі Меїносдвз 11:6:8.
Реїніє еї а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147.
Роїепла еї а. (2004) Іп Міїто Сеї! Оєм Віо! - Ріапі 40:1-22.
ОЇ еї а. (2002) РЕВЗ І ейї. 510:159-165.
ОЇ еї а. (2004) Маї. Віоїесн. 22: 739-745.
Ом еї а!. (2001) 9. Віої. Снет. 276:31561-31566.
Ведау апа Тротазх (1996) Маї. Віоїесі. 14:639-642.
Ведау еї а. (1993) Ріапі Мої. Вісі. 22:293-300.
Вобет еї аї. (2005) Рипс. Ріапі Вісі. 32:473-479.
Вобет! еї а!. (2009) Магіпе Віоїесй 11:410-418.
Виї2-І оре? вії а!. (2012) Ттапздепіс Нев. 21:139-147. зага еї аї. (2006) Ріапі Рпузіо!. 141:1533-1543. зЗаїю єї а. (2000) Єик. У. Віоспет. 267:1813-1818. зЗакигтадапі єї а. (1999) Сепе 238:445-453. зай єї а!. (2004) Стор 5сі. 44: 646-652. зЗакигтадапі єї аї. (2005) Аррі. Містобріої!. ВіоїесНнпо!. 66:648-654.
Зауапома єї а!. (2006) У Віої Снет 281: 36533-36541.
Зауапома єї а!. (1997) Ргос. Майї). Асад. 5сі. 0О.5.А. 94:4211-4216.
Зауапома єї а. (2003) РЕВ5 І ейї. 542:100-104.
Зауапома єї а!. (2006) Ріапіа 224:1269-1277.
Зауапома вї а!. (2007) Ріапі Рнузіо! 144:455-467.
ЗПиКІа еї а!. (2002) У. Атег. ОїЇЇ Спет. бос. 79:965-969. зіпой еїаї. (2005) Сит. Оріп. іп Ріапі Віої!. 8:197-203. зЗрегапла еї а!. (2012) Ргосев5 Віоспетівігу (Іп Ргев5). зЗретпінпа єї аї. (2000) Єиг. 9. Віоснет. 267:3801-3811. зЗренпіпа еї аї. (2001) Агсй. Віоспт. Віорпувз. 388:293-8. зЗргеснег єї а!. (1995) 9. Гіріа Вез. 36:2471-2477. зруспаїа єї аї. (1997) Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0.5.А. 94:1142-1147.
Топоп єї а. (2003) РЕВЗ5 І еїї. 553:440-444.
Ткгашймувїп (2001) Еигореап .. І іріа 5сі. апа Тесн. 103:45-55.
Тмгаїк (2000) 9. Сеї! Віо!. 149:707-718.
Мепедаз-Саїегоп еї а!. (2010) Ргсоад. І ірід Бевз. 49:108-119.
Моіппеї еї а. (2003) Ріапі У. 33:949-956. маїїв апа Вгому5е (1999) Агсп. Віоспет. Віорпуз. 365:307-316.
Манз апа Вгом/зе (19996) Агсп. Віоспет. Віорпувз. 362:175-182.
Меїв5 еї а. (2003) Іпі. У. Меа. Місгобіо!. 293:95:106.
Мепа єї а!., (2004) Ріапі Моіесшаг" Віоїоду Неропег 22:289-300.
М/піїпеу сеї а. (2003) Ріапіа 217:983-992. моса (2009) Ріапі Віоїтеснпої у. 7:914-24.
Ми еї а. (2005) Маї. Віоїеєсй. 23:1013-1017. 60 Мапа еї а. (2003) Ріапіа 216:597-603.
2гапк еї аї. (2002) Ріапі 9. 31:255-268. -7апк еїаї. (2005) УО 2005/012316 «папа еїгаї. (2004) РЕВ5 І ей. 556:81-85. «папа еїа!. (2006) 20:3255-3268.
«папа еїаї. (2007) РЕВ5 І енег5 581: 315-319. «папа еї а. (2008) Уеаві 25: 21-27. 2 пои еї а. (2007) Рпуюснет. 68:785-796. 2пои еї а. (2008) Інзесі Мої Віо! 17: 667-676. 7ои еї а. (1997) Ріапі СеїІ. 9:909-23.
кп ЖІ Ки
ПЕВЕНІК ЗНІМНИХ сне Із Ох тку «ух Била ту ТК
ШМуслу Шивоци т пс Бочки
ЖИТ Ж ЖЕМАМІЇ ЖК ТМИ ТЕМА УК ММК Ел
Ук имомом З. Мекка ТЦ ЕК Ух, сту лихе ми ДИ ПАК МК НН ІДИ ВИК ВА ех
ХІЖІЛЕМ Ж КВ муці» ууєтд ода ск цицВ пом в МІ лере еп ехитіт МОЛІ НЕННЄСМЦЕЦЯ щКжнмо ОККУХЕАХОКЕВНИМ БОСЕМаНИВ ЛІКІД; ЩО МУЖА ДУБРОМНАКНМКЧХ ПОЛунЕнНоМчК
МАМІ их це У
ЖвиМІ КК М гуси шк
М пох ха щі км т тич
МИ тфУМ МО УМ М «Ущі сруф лм. хАЛАХ ХАТІ
КАК п тат мо сх жо ВИда А шля Зі дотькч
АТ ХЕ АК тт МЕ «Ми» Батестув вера З, сЕійх ох
КІС У пвх жів А «тіше ОПНЕ ля ДЕК «Ки щесчуу ПУ ММІУЖНИ ТК:
ОКР ЛЕТИ ПУЛ УУЮМА
МЕМ
«СЛЮДИ ю УКВ В ДМ. зихужогеєти их Ми, КК стихли т єкт ши ОПО БЯІТЩШН МпеклсстТидмя Ум диВИ Вк. мох я лави ох
А Кия ПО и р АН шу щих русі аса ллузсаисциа слава залорооший су Щ шви Ух КУТИ по Ки шу ККдетммх У Му м шипи ВХ сошИака сзуЧиКИие усу пцах сбозоомциМма ЛОВУ «о фев М мив ик КУМ туту плетених Киев жави Ту попалися сут айиа очах озна шоп дише лау по кис тиши У хау тсФеаспсоспиуу зевцоспиц чоло сі ОХ ко КН ацаполалесу чевозисака взуБуайлстла бЕштолсолах кових хЕКсравице КІ нн в КА ям
ИЩуАДИМВА М МАУ ОрАМТТТЯИ М ХИЖУ КА НИ ЖУК ШЛАКИ плх цитат бом ає пд мулаАаєиямо ЗАМАКАТУУТАИВ Вали АК тую дрьт ММ МКК. иа вх са КК мм кю дв зи попласдносих часа сосащтихуаз свааМмУукнх угсмаа и укмощалоакх запи уюут ух Куди і фатдитих Ми пм УВК (мл мок ку сімя що. пжипкОотУти пила сус зунти гоп а таз спиця сусла ща
Мати Кап иддХ мем УВ Хм (мае ми моді МасУдуиуистих У вт, дпищй -стшоиюювУЄ падало «поси пошита чу зацпацазлаУ сек цеаця Зня чних ТИВ ий ом сітці мам КІМ В гг сх
ПУХ Ти чтмутв апа пп скор утох ссгцадти Ж не ецІМИМ ІМУДЄЧЦцоОКОМ тик МІНУ ФВ ХК им ше лю ух че жисжучумжи доли чУм пумуанвулели бппрасевУута плями капи М ди щини Фоми ХВ уки одіху зують Угдикитик а ше моКх У обои снлми зе цаМим пасе м пд сити ап и хх ОМ
МІМЕКІМУК ВИМ сок м сегітстти тих уж ті ик пектини ЗУ ин вит
ТЯМ смути писачнимих запчхоумим аа пли иках п шоп аиа ух слоти с сооааа ршАССВИ о ТрЖХлтизоа щи Фр цищи ча пал МИЛИ КІ специ МІВ ем В сем им ую муч шюх см палат ає сехпсскцах заиацицате сржиищаслах своп лику аиий ЕХ зппепикхтх ай вицоиояюх ТОБИкааУ вуаль учух дало. ме зиккавалла дао здлаасях зони мапи трююи б лоруслх чп5о пптпій а жопа ЖИ лайок: Топи пяиуах апа АТ зач садова вка сІх виплкхучаш уран м ЦМВ ке пиву сусих тосапаїсую щоссачевчуа залапумоия щабпспчзпозиМму папа усуца їхеЕ ач умц сива вВи ис ща муими лиш лого ІЗ пишу мими М ММ ХА ММ У А МК У МУ Ам чвуссзивтй базу задлжчовосу Заллозаино зазуеуцих шфуууунупия 155х
Зсочуховува абсо ав чесаат зсолусай офоскщао пуху їж сожуоола пами пуомараакима кофсухиійя проф окоал плов ултих МН жадіситипах Зозіжопапи лхсеоховои кВ ТИКИЙ сежустсац зас пайия За зсасайадийл дику Т жає свия лукаво ступи трудах ук хоаптацият слоти дурості вуцезоаваця ксжожоавит зицауу МНН: това їсвИщолспв супами шати сллМмщепояи пупспаааУв т цзиаддспичих стопах заощатльів восабидалай саолайиаче зи МН прозалозлюі ХМ КІМ хникнятх Я олеекеюкт ФІКІМатоМоя сце лчх пива типи ку и МУ ХДУ КМИН МУХИ иМ ФАХ АКА У МУ хлмУ плаче ууу умру сах ложи сайт лаз то ааМОхув ЗКУ їла тут спла пита попа оме пийте захо ї330
Зплісфхуоа пилку хІї дайтаазцасч бив то сапилавікх фата РО пи попере схитухшуяє вало кщов «сито ппевечЕНеу яІох катушуюаця папилемтиу Безе пауошивя саке адавовжииа жи
УК стих Блюм прикро пли пла хкуАВИ пЕЖИ пзичаукосе печивеижиа попи ллжао пивом ухиют зайзтшолюююх запа жасх ХЕИ ураоувжцЕк заМусозака зодеучаови пазивеета пижмо ВЕлевушищИ тах саше Ффозузуущу педзаЗИКО) плзеуккуцКА дшттусвемода кому кту ши удувавкка хижа зі чтатай пвжоцувоет кл усаиу зе вАБО сегдапапи зхшжцапано соми дахт ужитих жона сухий шІшИ туаааутит Туоцевили ЗІпстаплля межи лока топа ЖЕ кефалоутиз сзащаваМуХ заеаааьиву вісмут сигтпагллия звтжцадячх Ж
СУ жНЖХ спині Штам у ШжаОИаЧІЬс стада Мче куту у порлкилююююи бапайлтоюхх апп Есоча пат нос спййстілизи спред у ям квзусувеуча попа пецахткашос забаайлимох пила кала ЗВдИ хшшИзшАКК пошле Кекороююто пах иа Еу полку ре
; ке у чуда «шабомзал зе кидкам Крем акиюки Бод ааки ВкасазвиЕ щаапатвшвх зі пвабаиайллМ чозахпата росла гиспаааа зов чАлу зу си лих пк дещо Екшн Оп КиМУ МН дет: З души мх сла диа така сли Соло п шутешсциа МУК ЕшиМХУМУ УПЦ Уч МКуу УБУТКУ ох зима мщЕ жо КУ дім зт сеззцикк силова Балик Череда Вослллавіш ам щущшуадалоя сирами умами диХИЦиА т рухи» х З БУ х У кс» х Тип за здпхакЕкхх сушею паска подала Битви х ПИВ оВ зі хайтахихоху соузУиноюус засинає падало оба сто ШЕ : меми ств ами ти м рану зів 2 кадсппкатю сапки ливжх Оса хЗиЕ Чеки х ВИЙ ЗЕ кцлатзаих хоп плалею сао тех осами х стала уз Ул ї ще Зах помсти сдтатавнід самки стук Кава баладах их здо завозити сапаливауА патч ВуО сли х пайакктОМмА СалаЙяИВИ В МО 4 Ук В Едеце пдтК да ЗдцЕ зезусктвиа пил свзоиси пла воззсва апллвсаудив аильгвиацЕ папи Зх
ПО ЦЕ ВАМА УМО ТУКА ДІВИ ВАК ЛИ КИМХ МИ КАМ А У КО М
- кі пі ин де сеї ета пак дек що зрости патини птн пі учсущи пк свивсши пейежосоко І зсоужомшуки пихи ук пиття муКИи чех увиущМ прис сваКжМм пайкИОмлим поси х спа рсущко перила й заз песо тци точ ут пити гост тат усиаВ Веасцопоке 3435 лезу ци ТУЮ сито шуиМ ИЖеУчшуим лишити М М УМХ
У у і зал С капи и пекан пеки тими КиК Сачко алое во з«82
ПЕКУН ТММ. «Мои АМЛУ пЛИТУЄУХМмУ лИМирОсумиМх аляичмумр
Ост КтОК цик зсуви Вир ЕКИЗ из усотцо плашчуєвйо До ЕЕ зах шосе МиУх пихючиующкуи пУуупутумка тезу суци палю уви «жо З шуми, поливу слоюмадеоат штоки пеки спосте пЕПН тохцлтнтІйал плекс ала пезечжрспах хошІККустий ЗІ ХХ ЦИ КУ ще и я зкні
МІМІКУ ІМИЗАИ УК ув я Ісуса КЕ мУ сизиИК лах ак щоцтамнийи пишних Ел шила ЗЕД НМІ ЧОЛ Х у дув стик ктм я пд У хидаспаМах глдадовл вКДДИТ пай туаалийпув сУушЕтпизут попадали чл вла аспитю ховала БУАДНІАТ У «КАЄ с зак ие КіІм дик впИпдОолИамо хрпдитвих мимтщемтВ с хек піци кали ах мукигатих ОА АМУА ТИХ АМКУ ВИНХ ФУ ІМТи у КИТИ МУ жпи пупка пики меду мем КрідеВ Вих сміх пес дай му узи мила иКи МУХИ Мо ФЕМ оливи и ШМК х х У о у пет запл піччкор сайаатитик Кідман птаитлетяЗ тами попу запа чаї чакцаєхауту ших чтус стул триста леш со ЖК х с й дак итияк чад с І ч (ІМК до Киев МОВ авМк Єкиеапожим пит зЗащи хстайткуья мм Уує ково буття уми у мМ ум. : с. хх додибожиссути пт зних ЗЕОКадиніз Мадвали соболя ЗК сват у киш
ФЕМ ОЗ УИН ЗОАЦДНИТИТУ МУ Мем уЯ СЖЕХАИТИИМУ. ФАО 28 п . полюиитМх ий тку птіатохлм ККУ ев пута Кіма пдв е «пай пак шсуу сптКлпаини СБК пецедтатту уИИтатуми пики х аптек вачко Екс сво стопи поса щит ВЦВК ІКО аа пра чее шу руюсяф спимо хЗеповзеччу стале тео шими Е дол
Ух КІКи БУМ мІ Є Ве и тт домі пу ап
Фк усущ спали шч я шиплоалилеа пилаиоо епунришосм пики ; х січох ад сиоі ме ай
Зими г талУММХ пачісудщу поз локи Клтидит ВВлерл нити Іо вич ИКаа пили лив ліІшІКаЄ паличок О пп тУт КК ; 5 хх : з ни кт хими 2322 зріст ки стираУвена тах хво ефе сахих КакпчкацеО парти «322 зххщумаккц полу уха тату утиуг ТКУ лУ паллтуулекух паборуцююку с г : х зем 38 тавааишище тазксуши паса тоа вавивитаво сплив тувна ВИТКУ шеВ 5382 узевщижищу хааксужмих Заст ухув Зах Тукес спа ЛАВ ВПУ ХМУКХ
Звич йшиий айви фтазвгищих вази тах вухцт КВИТКИ 4252 хкиупашпицих йшли ууМми ул унАХО ИМЯ липу ЗЛИМ її згас МИ хе раке спри літо дк щити дж сивстяалай ахіжВоозавх іс сАМО зп ваца чіптУусвиВа азу уаией Ум спадала варити плашки Укл ее ваших дме. мрМрчадаих сут пошли ис иа сс шиии ЗО п
ПН В гм КК ре КК кепі Кума ВУЗУ хижак Фуууаацмт змидулУуйанЕнт тю йа ою тупих хе р НН НА Музи в ТУ ВХ ай пилатоутяу звисали зсзиаеалта суда я ЧИН ВІЦІ Х и сжботутутютвс Косово соди ушпидипт по ОКодлих свишидлавх лай пкчепутиих хошовикоєу сбусааийслему уфкифваци ум Укуси пмуищила я ХУХИ ща н шк Кожен ікла" чсивзвусасауо сутпуиаутмА статти супи фисз поишиайлат ппжилачуцу х запалила т хоатосциВх паси свавайсима Жстсейлях ВИяАглл У вм ттайаааитАХ песссоуцах суотлайлао жавталиває жапаалавяо вщевалтаки їщихЗ
ВПЕдЛІМИХ ФЖЕТПЕИСХ Улас хоспиплалу зааспипуви отих щу сти укус ул сих сапалечиКи ВОпдоллишия Жожопсмтяви вадалацяи ве карні шли Ка виш м г одрінио сланцевих да сяк кзЕишец щи чзихужЕ капциюцчуую пилку мадцаи похмура пами ажхвисзпуо ттдислачух цдааличет стдтчсчишчо гео ви славу хіща дис оочоузиа супу щи бовми мл пут ує тамупттецуй памесчич ие
МАМА ОКУ ТНК ТИ З АКМ ДУПИ МТУ УДЦУу ТЕМУ ММ жи У пл диму сон рум пусту мТл щити с павлекши иа ткчасфрашх поета тчосу босу атаку сацалуюнос зару хуси Іа сктжузсвиаи плете пехоіюасох Завуч пазкукучИий позика ази тела Зухтщациоа уче опай спец ош Бути тоІй покути ЗаЕО усжикццала персики ломота плову боцххоцца сус АТЦІ Ко чату учити суки вино ХУВЕшИКИЙ лурсвщаацх Бе тжоддимутут УК НМЕ Веди стулку х кеВ ЦВК швах старими чусттУуюум здали чоикекикаМ зущацилау сспоуУуюу вшЯУКІ пкт ХоКТИКАЖКУ УФО УЦлщОив сесттощіУуєь ЗФетанакку ПТО пппратіло» позувати чиоисталУу» чола сзиштатюуа при рЕих МО шипи ту сЗзотаиаХ ЧчЧихпдалаУч тот ицитУх пуд узопикивату БНО ки дупи порада сч супи робили Ой сосок ЗВЖО зщллілнишк изсщжяме шоп. зсцитажкая сили диски НМ пеучишечиом здтспелиакичо топатахсюх аспект оспацактои салламиуух, щКУХ флоеми пост Уджии дполаєеу й Випічка. палав пасиви іс
АМКУ У мли ух ему атм ФОМИ К МКМ мМ МК Ат шузацизоцо аиблтмеухо зала узика здавалішсня заплаче запалу ів сізеорууни Хапсжукчиг пасує о зоппацонзаУ дпазлевуюи дату чо шчжитилов атайзтчсуши кави иа аллеучукоо «чуму атаки пи ЩЕ хживаипийх ішов зккзацово) лалтсзисви спеку аууочеких Ж трата ЗК ттту вка Ес соутизоузга паху зово поемах и киаайсотата Четсциваас т»зоатааак песо ЗИ КУТУ й апр ихоХ сомювкщеому ЗБУуЖКаАМОМ ус зт уовикаааах БА аивкличато сзхапсидай КЗоайдайата квитках ЗезещУдиУтУ поза вЗау ниви
ТАнквуввІх Тополя Забатовати зВеасетаєт ЗсусЕкикл оз аатаю Я
Мих уюияу Міда сопе кивх жадав кадети кХе ГАОДЕкя сх. ІЙ
ВЕУ МИ УВІМК УКХ Костенка, у А НК ХУ петик ска доплату жв закуска плотЕкУшЕК сппссЗи Ку пебзуштииа ІЗ межелумоо ув икємим фік июня УК КЕ вико мУ ор вх фогетг ті СХ звкитужусва засл кізуа табло ктїтки пазкоусяа плани иц вкл сущиа «3: хкехккмицих дека киМхЕК УКХ бакаккихи: тЕКАМхинКтІ УКУСИ ще шле вхчалююкус ня апамиашискух. алишиЄИущ ПІТИ Х ОКУ АМХУ ОКА КУ Ми
Же хижий СИС их ху ке ккк вік и В ЧИ, шо
ЧИХ КИТ ПИЛА шУЦДУ ДИЛИ ККИЦЯ паиш уми Мини али Аа ше вх ат ака хсиви демії пазу туди мі в песика суду твумжумуух пблакклясижа алтея дили бдайллясвруий зер уКикА шу
КУКА АКА У МИ ОШ КА ВИМИ АХА МЕМ ДЕК ЧИМ ДУХ КМ ки Кк сип КІ ву ммМ Сех зі сла уча пиву у ша спплтушаемі сим спра ми Руку Ти прпеетхдюютічих гуд ки ЕМ Киев сут М Киця прут ЕМ Вих пет гута ззИпсщайсгпа заточка зник КСО дохужаномиу яжхисаастлиу У пт диссисшштт задали КидедитКовМ дише ваВМ ик уУ Ватт Ім дисовйнладях лесссоваки сюезаациих їжа ппвса зіуВавЕ захв алх як фік КМ Кому кі ДОКИ дж вус М пт їабсвайати сісцаалех ізо тва зіозаопиха їафосотіа зиЗсоачиМх ши пре спи катлкх педа вика ла хоста ВМ здий зайадолнути стекло пев зве іЕстазаино БИТИ пОау їни де ик сус ІМ ув песо МомІУух жив м ФМ ж хіміко МІУ пкт пли чани ууиуцилеу лаціаацуєт дисци х скляним меЦццатлитин уч о дуктів (ДІЄ бі ммУлувх мати пах Зап падати ФЕДУ МУ УНН УуеАДМУ ЗОДИАКУ. МАМ Іо слжспизЗзещемУу Мциуааслило пап ецяуєх ХОМ КчИТЮ ЖИТЛОМ Х МИТИ ТИхУє тосупти м сою ет Дачне МКУ дети зу фот мо ІМ ке тез лази чазУчМм пащу пуща учуєа мптаблшузчиу моиоптелоясуа райапикуцуо ТАКИ ючи ие ІМ чИ І плачу ІІ ев мм ПТУ теща засто виозу Ко далуюци гисУудзавеЕ пубуачичяя солаличлан пабу юту ТМ мякі Я зичних ух глині док ин фу и и ит ді МТУ ттееххлоапи пжавалеМсси палала сас птавстацо шпат плитку та кукудУкаст пилки їх злети пЕВАКЕдіін Затока дит идмищИВ ЗМУ пекла плавок падллжови АКА рма пили Х а ДИКИХ ММ
СКК Ж Ки Ж и «йо и жк пули ті ит их п УгІ ема Ки ти уЕллкш: падку пакт ситЕ падав ос ПМ Пл ОсХОе ТО ект сем ові браком Блум сит ЧК щи СІМ мук ІЛ зшетцоиавИ пріо поко есцово у оссвоава зале овцо ап шовВ ЗО пхкгищих сив скромукий Бемукпуссмт схе упищУ спеки ТЕТ
УМА ТТ ЮтАь Лю КуУЄИХОМ Бета сртшавих АТ ЩИТ УТ Еш У зиск Вечозоевитт печусосотя зсвтшущияиє помесовиаа пучка шІНО сейму: зусовгодай НИМ НОМ пілоти диат СО Иуах мк
Мп сим ММ гі фе мІмома пнстмеммадВ пе дМИ дх пк папи суму зофипаие бюсхжищцоа мити сту ух ШВИ дало сет юх ие аЬК вих А стих цім В дитя до да ЯИЦМх ху слиухх сбизуутаУк зам ча сримУтьу ди спол ЖК дутики му Мк иа Скит В ие аку СК иа аку ую СК ит шк пипшшийтити ХХ иМмо супи спос оКуи БолустОотиЕ КОКСУ НЯ фосиихумис В Комі Кома сзф чию з, «уж ут пагу плити Кжвовисавих іхзаасглвІ ТоЗропЗакх зрозсвалеа ЗЕВОСОшиях шу
Хеасллиецкцм «пдмимици піни м смт ги ОК хи пох панни дими шу удримцо у мата х смжосицтм мах уамцуа и пам кожимакиК м липи ожеу сих подала у «ищичплшим пух пах зогМлщ ІМ М Фоми ЖОВ вити кову Ма МАФУУВ В ит вазу и дл туф щци апетит плас подало попки пишефжчучу ХМ
Попит тв вжи пледи спек стих пекла СЯ шжУМУЖМУИХ Ул беМуткИи пиитЕжкух пили селу випуєтомкху ТЕМИ пи ІМХЕ В дети спі всиміІх вки х ВАМ МКУ тазчнкимит пад
Ішов палузувикиі пуфузеаиа дату суоя пакту падку М шож те млбисутвсУєм МиУАТУЄ ЦИ ще МУК ее ут и 4лва соди сУує мщаалУтМмУу тд чамуй ципи н житла пимах диму км ; : ; деки азс пт нінхх мвипаалаави падати вии ВУ лю НУЄУ СИдЛЧуиМиЕиокУ хуулаемУече пути счупаапиреюи даними ІМ) пасм иця Мови Іти СатВчвЕши Мале падав пий заду сааолдикоаию вцопалецияви сала вва паЯсме дах цихО пекли см зазвОо апа лчинзий пталсвмив тлу али ц85 плткхчуваи булла апаачичами цеапесеюва тує земними их пяБО їй
Кз весцаих пики Ви леованом пилок пиппалеои апа 334й шоу му шиуимлУ Мого щен Ми пушком пила чУМм ЦКМ кра пе - с а лу си зай века сппложУчи пас чусий залозу паплличаии валах ВОМ пк чи ЖИВИ сусло пулу Ех дод их ум ЗО с-ехсИивааля плтеутажсна Затчосийа алое Зара иитий плебмуєчама М тсптдадиий кдд сум Е кох лу Кох суеоталто чага за шичІгадИипи ЗЛАКИ ПИ ШК КИМ спОшаєкК сх шржЕ хуя МИДЛюЮЖКИВ. М зхиихтатит о Кесмгоихрауки Хєсседиущиит Зудтоцеаєст Бучзихеаало зЗавмрЕимл ЗІ
ЖИ ХМАУЦАТИТО КОруюкухуєих пекан Ул шу и ля гуулику й Кжх - гот х пт птпициоаму цими ХМ минут сумму чКищІМУНМ ЗА
МЕІДАЧУЄЯЯМХ СКЛУ СЕУ ІІ БАКЮЩИКІУЄТМХ ОСИ АТИТ ПЛОВУ УК ЕМИИАЄ шах ми МУ АЦУХМИТИ Пуми т УЧИВ РИЗУДЛИВЦАУ ФММ ТИМ Ух. лиці пам я 7 «КУ З » ща зло ГИ п щІМУдУю сміх а Зригмцюай КОП АУХ Бе заапащухх Уищцаилах Чути дизМиацози вубуваццай усМиЕсиуХх ТУЖХУХ. пплйлдлта чималу беипщцмуУваа стих ЗихсціІММАЄ ЧИТИ 5агИ поипиВада уче х шсощаМмаєаи осла ЗУухуцмих фаишУу т дика ЗинкйВахі спплдилчае ОХ Зитйиттати пИКДЛрУЮИИХ вано зилеалухтя зишуцеКтою соц мух учукалт зичу даму х дк спам. Смт депо Стомаоацню Джем аскик Зола зжап треш о сера пора тк Зп педа тих шому ааНх ходити ; пай
СОКОМ пи Метт СбІхбмаутК ОККО сильних Маю МЕ пива КМ Зала цитхікихх «сокола копали ихх ссациллути сагширу мух упали КО х с аж еских мережі фотки кока ско иими хід
ПТОІМКИ ЧК АУ, СА ОСТЮТЬКИХ лам ами Ел сами ьих малим уУжи ЕЕ 5. т У г шуми к еВ сх: ІЄЖК ем лІМЕ, хуломи иа чУх ЗА аккшкх уві ЕщХХ «сипкавтіх дбала миру укх ЗТ х: 5 шен ТУТ тзчуткутка длизичима пола и век чзузі пила оит палаУшчици ХІІ пуштутсутта зпоприрох подачу ваті поцитхічие шаЗауучицу ПІВ с ДК вити тих а, с Ж пис тіцм ух сеатрснойа ЗЕ опЕ палічзукаии і чоВкОий ал земних паллувекои ппллесчеоця вело зуюцу пили АМм ЗУ ВИКИЗ ЗУ ; й Я я зайл созралити мтіуцутий псектдоцице да уєвиво ам сзвикийх злоспвхуди ан мужхоскихта щуку Муув плкужичиц «сви алу ци сдусиукиа тм х тацеспопват пт лабаш стрий хар Мі пока виеи кад вгикх сут ххх аюмішиух слушну ума слизвеиИимиа хви упи ЗАВ УХКАИХ ших уку ки а уу М рити Во кКгреиудх В фоистите А вити СВО Б кед ІННИ
ЗІ мимачи зу Ізоушца зб зсшиас ЗКзасипави пло рушаВ ТО Ки МАКИ
ХЕ ВИЙ озиму кит УК КІ фі гий жу чів Мицик ІННА швами талии зо сзакИи лиса а Хомут М ря ї ща ку РЕМ г КЕдхмдин темі Ж лут ЖУПучцк вит Мини иУх кишка ІК
Числа слккжжатя Усю упо ложа КК ХК И піди чигустстив Зола свв певен ЗСОохииати, 10 мата латник БУХ усу ХУ ТИуИ ЦІЙ ПММ Ти ЗО КЦКали те подо ЗИМ скалі хитання ККУ пгт и зп поло тсомо хеспуциам ом атим сема пуд айаМе КИТ У МИЛИ : плат судах. СКК соту ДІМ тик плов сю Куди зп пісруялнсВї совшеакляхв чок узви спаму скла ши МОУ 4 потай кс пидлаляком (Крут щи спите поле асищ пики зеуїдй скочив пода кх Форум санок шоста аюю посли к їпаа3 ; - сх еникх зд ди
ЧТ КЕ КІМ по ккудим ВВ муюих вач еких ВИК чнУУЯ пап
ККУ СЕМиЖО ЛАУЛОУТИЖУНЛЮ ТИМИ щох тала леЕих ТМ Ух ла рУТУ т, АТНЕЖИ зсзозосппо папу рваи дну вапенсмувии Сітки мудитучова за кузсазосшто ет уувау цтяту думі паппляуаи слот авшажиий муфту МУФУ удроелийи Хек ие Е чесна мУ дет КК ім ву Ох самим Вл али уучоае алое мо зач показу кщу КЕ
Мушу топа сплю поз ЕЦ сплески ВЕБЛЕН уПпБЕИ клчахутумх апепоклх зеовезатОто сопбклкакв саке зсспдавіасу Іпсао тиху жх заповіт впли абтлаваїсе вапеиамю пи иктх сх МЕЖ пуху х сайллпоскх аплеочся пило ну ва пойлптекжи БеапЕшЕУшеИ МН: звуквЗуицу сталих пшлевувиува склу ти стола лик кимоих іп шНУусиулмам прали лоусвуюааву пак пиву МелЕшКУКЦХ, МИХ чхаисиприет ачаччуский усу кив стзнвуссиоа пошу мцМ плеуоаких МИХ зусоцеастоу сечу гакоц зсесосааих зоззстооах зов сус шикавА іш и «сепарати лЕсюсжтода ЗсХсааваах тва прис леооцшешИх м: лапслийлта сут осспа чола паса йай ота ссспти впро ТЕБЕ; запор: коор ЗЕпоссоеа скопоева укрити фонову ія зпакатлику лесових скрптрумсл дросдеасвах косах сухих МЕ тааккипкису ящиштиптух Уа сусяпалкстх зиажесопачя шукало МЕНА зт тих чесати штуку туцидллт Чер тижм шо тиВ. хи алу уштралаляс пекаазУсуу тоцпоууу спот уя поклик Ма паті зичу пу ок мас сш «ву 115щ па уЖН Би МЮ Кри ух рутхУч пущусуюхьх марку ХУ х киш чх сопла чо пай смиру пихампіклох ажкоВкаи садах Ку пет насу здшастущиа шопаечеца спасе сих сх опару ЗХ хкхловісуст спйпаллуза коплазеоссм: птлазатіцх йпихахаюниз ап адялхх ДЕ
Хаскі ст стбафатусе абетку Еи Хтватаясея зок ало стстаех ЗК
Хахксака сш пилка о балакати т спцтаххчкц пЕКалеюко ІІІ сушуватока пал шсАиа пускав тест цев Ми усАо пови ко ЛІВО сива сівчивеуа пезсетцудата звуть заз цомАе плете умах ТЕЖ «щишивцики Бус осикКих Зоосстатаї соска пугучхцаца сему циих Іс тости улиих слі гзсздаата вжоссакциа сосзоссвай тецтва Іо цепловаом: кешу ТД ИКИйЕ Ева йий Осо Коймх ша: де
Хатадлячву сосиапосайи ТощИлійааа своп пили епос лах сосопиида МЕ зехвсосзсу стакана сайти сза сиапелалав сифасвахву ух МАЯ пт кИпММоиеу СИТО м: пУухраєл у щих ДИКА М УМА тушу шУо поливи дАИ ПЛИТИ КИ Лич отохз дип у спека ТЕЗ зустеваат папі плиту аби ЕЖКЕлотекос пада МАЧЕХ чинила ХАКожууоК МОЗу уссоц зливи паливо бклакех хво
ЗиХаКУ ну сових Заобилена КОМИ соц собийежуюУ МЕВаЗ стало уух ЗОЛИ зопалу зажив Зуб уУюю визачадчув ВХ аа сІшЦук щикзЗаакот сімка узи АК Займи МеВ такса зпстцикаюош Чопа ссбалакуту уселамань зашацаско МЕТКИ плячиктЕЖу стекихтешх тополі свита оту пискайовкс сацпивтау їдтАО пилу сжуц тд сх ашотЕкшох стопа аиме сопохикошчх спитає ХхЯНЖ зи овоу апплитууц «пити ловив БотЕАЗЕ саппвтох и ЯК пмвсутюму тобіувутво здайплякщжес аайапруоююсх сороки юх валу ї1йЗщО лизмучуци сло апа еше прпомууМиЕ соти уюа попу ММ
ДНУ УЗАИ ПУЛУ Х Вип ссро) вових тЕцх пий жккКа Бодя УчИЗ МН зжшслочации пахлусучни стусутощт алиуекуких дплеуєкуки списа ци Зі кизосстоха роза зуто зукзсуоуци сулуукзоо полуссшуий вхо изиту І синиці шх сучок згзрозова закусууска ситу круг Та хсбсспспапав сосочасоах зів соцозосвоа дрон пре ссвеца Мих сплата схцстплтйлх лжожсаса сода істо Федак Маши
Клдатллжтимо ут щежлпивами восжашвиа Числа тусоспха Ка
Тут у ЕТ Отинттх Ващдобките сс йлов животи чали МЕН цалтловаха сжжоскльат совка лек ціа ФТІ му темх ММ толаполтту точааалафу софта зицосоака зкцасвалях уки сХ МИ цапачавува соробалалув гщкцтадиза ката аах дащцистсалав зобпазигує хаНИ ау затчу садах ЩМКиасилвну щусосоуюау чадом шпат Мао пилафозис «пциатід спека о пре і Ко пащтлаюцхя паю оо ХА каїлажкуза Вста сос пайфалсвас сктескувус садах обер Бу поему тя пкт папи цов псалеожаокх пику папу ска А Мо пиши Е ТУЯ аплевивИх віце попофієка впало випа юя ХТО уузусдуаи йлаляшувкя товка Епа птаха о аа птиця. ШИ ттисуВкхда скллхзвИисит КЗ с плазазовов попу пава КІС
Фрастимиу диск срузсжкиту ачусотасов докум шоу КуИИх МІ полон тевусцтиво тоФіиМуЄ сосзрсрики зууизшиа збописиома І ИИЗ кола уохузеплх знаипчабайо жещудаво сода жзивасаваая МАМІ хвалили ухшщциаиз схопили зу зжоатайтих ЗащдлІх туди МАЯ паБАЖХХХ ашаканісу покаккка утилодлнхв СВБ аляви ой Ма павлкчисттИ «вкла ЗбастотіІВс здедвавоео задавали ост аваушо маки тачтрастачх свастики дхеспкахтус сову зИпхатаїася порами завд питевштитй сдаваппносо зпапаатус падпттатотх боподихідо ззаду тАЩНО пемчтлчемуваА ВатЕдлатах спадали пайситали саападали спала МК пИВМИБузюю тт ака уВ дпа Коса соби атих МЕ
ПИНКІВЕ МЕТИ ТІМІВачльХ Ци И І бХллювах. Хіт пола ук зошумтКОовиИ Мукнетнк хмплвосатиа адек кода пока 1чпди зЗоізссрзца) чадаеууспих алсуусуптиє алуоуцік сазацвувии пу ци КН хкзссисио аутууутом какао ом КЗ ОссУИК песни татвомтМка щи мощами йи малшуссоший плавним Кузов сума жк изшица пишу сииих ІЩЕ ссопизашска кс свіча ложе ЕКО осаВ калу ти УМО туазопатих ледащо зЗомоттоятх суджостоах дик ростиа МУФТИ 15
Вагаслттите сао сиуваоашлив судощвоасяй сало лає зашити їв:
ТтТАЧУ М сплвжщаши Ктпашіалц сувецай тут сеочосояцх ІБ пибстау» кумжпиааке зИижайловУх пооацильйх зеттсаапал суто ТІНІ часи ка сок итттвх ЗИЧУ; залито моб секуИтпла ів аабдбаллтв сутотОцез зоссситллву туда Зззоаащтуо судах ІВащ: тус лтутв усу цодамт супасстежу паштиауту уотИжх свиЩадайиУу МпЯнЕ ксззатувоч чудово зжшоалесчце соц леу» сахотрутуу заст МУКИ
Мор хлксех сзосджкУкю садовиасх шабсоталиві состлахвос засципкя МУК патурткх сопвоаую опт стайлялкя засуха випити МБаБо супиажусох спасти кс амплуа во яке св спливає попа оє ши ствухсталаа сли лук суцао лезу ад уноюя пат укия АКІВИ зУустуужаица лпадцевижев Удуззарийи Зкушевацти Меутафикит тд ущи 13
Уунаооссца засос цумеє Зо Екиє щКввсовумиа сейпуссови ЗБуЗуВневОа Во сінажу та атака сла икат тачезосихвИи аличнизота тевачуНта ХИТ «Злі та алихузасав хво ззецеиеех ау сасачотуа Іо рада оих вивсвоасеу зухчазалаш зомиазалау зако зшмрирр МНЕ згсадлазкщ зуп спкОц аю заадтдоаия сша тчия сеоОВаМу МЕ питахтушеє узи круєу ХУСТ дихала свити соту у Мали пл шИх опор попа впало села колек МЕ пусуувацих дккоауоми дати спла мих «опали зпипоошмца ха о
СУХУ Ж полю Ми Миях хо кій жк. МУИМИИИИКИ з грисскеги ит позитив ОЗ
ТАНЯ пеуХМУКра педа ІЕМ поли пс оВосах ІЗ мЕдацедав сем Кум мциие уки масажним щів кута кам тка стала Уста пхкссоопах ау иве кпаусувио дулі чосвий ІщФ48 комети МВ жи гр будов птах Деу ати уж гг ті хложмцнни й пташки пече х затчиччусяа били пауза КУКИ пдосмІетмх МУКИ ис селу мли зум хх ма «ЕК сзстспсваоц пі ззпов зтазсаакаа пак уих дазусзипай здох уза нав ШЕУ ВЕ аденоми Ум Кри ет грі ок судо а тишу хказспасапа ЗІ та Вот ата Зник и Еф супта зазбозаипа ЕН мом МЕМ УК У тсжия СФЕ УіВ УРК К и мг я В ВОМ горе ЗЕ дкавпсожипля щитки зт слиапийт ду оххикх зусазууакв КДЦ ми БА
ТЕНТ гВуТОЩ ев заоваалі звсидадиса вата зі ТИТА; тла узЗутоауео зов аласт повааллв слини ЗЕ тах нитки «кі аижай КН уватх пікет ххх дних схххнотвЕ тиша капалатаву соска итткатаца вуКутИтека лежати М вовжщлавих І
Кн тк пифалт у осока свЕті ух зЗтжкоанх фест кеграВс Му Ці; спадом КК Дитини Кс чи Ком уию дві Х ТЕЦ папа у Сол упицахс Зимує хижа тіуттм; ЛАВКИ Сех БИКА еко иситух дж смолу Вик сю см В ЮК давав еомжАЮЮИ МУ щих ЗУВсшжаАЄте сайдатекаю бак жуки сбооптайюу ЗНО залі хддлик копа аУхЕ додатки дпа дити ами кана хаА Ук узи д. зпзкчлязк: бодакавххх зайти зпшжпахвос Вих хата саспахАхОх УВО аку юМи штами ами хх сви. що Жуана Ми хижак х Ух пкт и жтжаМлвск хай спи ладвля Копиматкх спорах Кх ри «кому товки пов оуюидКИ КМ тщи: ПМК Ко В АМКУ д ЖК В
ПИ лУММКІЦІ ПИЛИ шевлашеои Мп лалета вади аа АДМ кіктххумій пса кикЕ сптза»нххиа вазу сталу ки Каву Зсаух ккІгхзухоамх МоптлунутЕ ппллажжаа ках кктх спшаласвкв пакетів суа Іво тиха нихкЕК іти св вникКд зви кнмких ванн МММ опт тм ТМ
МЕМ УВЮКУ ХА. ум Ко МИ У АТХ. ЛЕЛЕК ох ИНА АОЛЯМКИ мис мо фииии спорт славу зпичеумии ефе уаих ТАКО кфсцешепщ милими фони єси ики акне щ ка ке заг хустка уши млина МКМ ТУДИ лим йм пи АТМ козвицеео піт зоЧевай сн ьчеиак ак посоваа ФВ Учсвща попе оции та кизвсщушит пусти спос лашх атака кокс лише ци КК ззаду кл КУ пове уже у сим еліту УуВехита тк в Ук В шля сузужумсих зо осав ко ззаоала дуссстзусиа щихчузаеАХ ду уИаох ВИ е тацшискиа вози паче ищ дл деУчавива сел иВод УЖ, кчатшсевИа лоежахчстсопй гост нит алеросусиє втцзвозицОа дос тВица У мжтсапиии специ тм фоххцишайл хехчосуоий ет УМ пазегадлие угргхцвова ЗАПИВ ОВ ОЇ ЖеКУсИщІМтІ хиндаппкя вх еВмх теці заслали гост айоо зуІжоцпвей зі сизаса важча Оки і кити мин УдИІУН ФК ту улов кожи савя ках катвах тт питксттайя швами пуста пи еКАх хетухудо рижики Б шле МУ Кн Мушу ДК дачям АЛ АДИИІМІ ФУ КУЩ ТИИ Кал спуууюуєв льно «ПІК ФМУВ Кп ММ УК ТЕ Ки подути СЕМИ В мити Мои ик учице ситу туттуз чисто рив ти аловлив аличу ЗубалУуєчях ут же кох БЖ К дек п Ким самок у ди п ВІЗКУ ще св дос та пплидаалюу тппутййллєх стоаацеосо зу х «оо у задуху ХУ ідаузваВиИЦі: ДИиВалеужай левом паску папизаідки дала мий гапИх
Увуллицх зала луюьй Тдалюха пакті зпапиззвІща апа ду жхузасуищц птужецуеду пак и палати смт ЦО МІХ У СИ МІК
МІ сишЕ ПТК КОсуии доз а халухухоха сипле аща п уцу АКА УМО хеозпвиво сутки Ким соло суді дини чвІША хоспвипкамоий сут коцмиє вкозажкаа плини плувушуца Саки жщІЖУ чапомааяа чУшупитяат вусами фі Чоецейи пазесовспа зо ожиийи зва пали чивус дощу алем Жжадебітев скоса вавх сопла зов івли тТтодлцайтаа Зоо тлтту пизда сзеоетсрпа падзуушовиай злим ік
БК їммійли шви то Оу зазощиииикіа стозусЕйих ВЕ ЗииККах аг паслайліла»» жащтааьях» щеаскавау» сасдесевов заз сіхх сш цоциа тан засада лужоу жадав и дизиккукА КЄпапакоух жопа вя ХЕ пак Кп зайву вучих шила вузх такахуклум садтовисияй Жука плвхх сбзциваиих МЕНІ лкачопчзоу йппаєтуузу стипрадучучу збоазаМчлву сазан у запасу МиМІ хамам сил дпцупайня пищить митну мала уєу МЕТО паху уси Бапеахуаееу позує тодцадламу стада у реасмаатиху ХЛ дапетзкохас ашйпайтеуо шиацу всозу жали саталийоче сопахаюючо МЕНЯ такси збе токі паза сао тайпслуєча стаю МИнМЕ тліттовастю ПОМ укх еп ов сита во сказу пооошттьки заз пекстокко ВлАлплїжой ппплюхісхВ пали єсна ицииіаих попожатсоо Ви зутжсдВосВ поле ся йолевстяає фіз шаскюсювос зму аке РКО хжлюожикцсти Муувусущий ЗУукупцевят ктспсіад пеккасоцял БУузаииит о списом Зтучвувеаа пише аст Місзссваєс бутси Боючииий вв чухощасаяо стцузицека вуста савУусшкатт зучеспакаа уза цих ТИ
ЖИВУ ВІДДАНА ВТХ ВИНУ ЕИИМ сИТОАИЯЛУ пути тсвусмевох Ішла И удштакааай суч аитя бучскиаае уузоуукоциа ета полоси ІБН чизипкцаке зучузикихх суквоцаалМ Уфусовике зЗузоотайл чУууусгцуаи 15355 чвацищедтмя смосовцалих зе иккта зи цеатх чуФфижЕдеях зорова иха В сасстпшиках чбсаплайия сосни Ууюх зсросолках суксовиитих же пасох КжнНМх пайлитик Зіїипсйлях сеааотошка сосппштовнк: кози жопа» НЯ пад ТВО МОсСсАТуют сеспатоуанях сао ауху аву ММ) апреля вик стложлтеу ваповнхшуа капа ах ЗаайиокУХ БВТстК тт МЕН ак ювуссчу ааталаучус валки дааплвзиом Бас щупа АВК хоусссозух сдавасосуу золизусува випал пузаув Блок кааах пахла, ХВО хвулеудттат влас тс алетекаста аклажуувус важка е пак ривки ІЗ
ПОВАЖАВ МУВшУуАСВИ пісі ама поз крос пюре профе Мем мсощаялиии пучки а пзукиааях пуд орав пеки ТМ шосе цаанмах соозувсаца ЗУсопкдоу звсусвжеоас зво ивава бут оитова ЖтІсО лаком пшиоасатамх Ходи хата пази Соуопцйу: пі ем смем с ЗиЖІиЮМО ня щи ема ою ие МОЗу бозууєгМ Ме Мом пошуки КМх «МТ КаиКИ плаский далалевис суаалаиссс бор вес щих
Мк десмакилих Вам. в зош ол пиво КН
Модно фест статки палатах гора полова Пиво пиучемлЕЕ типи шоа паси пола писемні ши УМ КА хи пишу ю Тодппипоаскиа сами тИсИяВ пилами пипттуоц муч кАц ХО ІЗ пкт мул вх им плавки пайки смт вм запив
ПАВЗИЗУМ НМТ ТИММЖЧНиИАВ ПІНОЮ сайт сади КК
Кісззавимщщ су мм абс лк поем суч УсмоМІ схо КІМ спи
КК АТ УТІМ СИХ ДЛ ЯВКУ ЛИТОК УМ АЛІ ДІ ХХ ук
ПУЕ ИМі жджоике кювет звису фі свутКий длучанихии сих совусскуукх соуси хто сужушеьа воЧа УКВ Ус УхКмО, дпа ееиу ван чис аа ссазхзуица шУосрсаца пок дип умицаи пери вик ран кИпВо то во оте усу КІУВ среди кед МІ сок цем К БУ Я щас такато жучок очок и физосовзиИикам пусузцами пев мккта ХМ при т слоти мщв КИМ. сЖКИЧ мими охі ма супе лм
ММА МЖК СУКУКЕККУ ЕММА ШВУ ПЧ НКИ ОМ удищийтей фури ета и у Ні я саше сжхавиаистих боби ча це За жу чик зо иц лица ХТО
ХдДМУК ОЗИМА побила ЖЕК баках КК лІМ В дуга є скЕушлигь
АМІНИ Зсув у пЕКЖсТаЙтУ ЗасестроВа КсЕВОсЧЕКК держави тов могу МИХ ПКІМУую мм пкт фін УК Тех доки В хх хиину пацислсастяс зедаиттудит рупцаблтає пох тлщиУ сжпстоптла вчора жи НО пики кодажетх ММ Мем им АМФ Додон М Кок де иа «цих лаече уковацитий Отців цилиух увесошттх сютавицийт КЕДИ ВИ дме мат СІК ІМ ДУіИВ хи хо лами мм р вики лети шу И УЮ СУТИИХ ХМ ЦЛМУ яшЦаИМИМк що і міс МИ июукуют ких ІДИ ОУ Ви дв икикиту ХІМ В Ви ФІМІМУКТ их мур хи щит сем піалу ти суми закууив МКУ садимо мусили ХУВХТИХ
ШОМУ ди (ДІ ик их ен кт муж ФК виною пок хІзм алихлисатх созпикеьу сКайитанну уТКсИицтпаУи зукпаааяах топ цИиаа Кох ХК яКЕкКОеУкКкщ стеми ЖИФ ут хх Кім Штат мив тий пчтуєтлкх паккааакси папи шили х штиль ЗКУ жхМИЙ пвх тихх «пий лазу зчайлпайтставо стащецллмча пику Еву заг х жи
БЕК КМ сп мини ОВ УМ лит. дод о ММ тя ле: хухеитеи, туп пика паспиплютиь ЗпІЩтастує удален шпали» ВЕБ ШМК сем КВ газу ох оно о ко щУ оЄсу 7 вка ж хек: ти птво»ятсужац лапи мими чеч тс Каслазассь спуска ЕХО ск мхх хм смичок цмими Кум гр спо «ті пи чл
МУШУ олтиуту аплактулвмх сшртиуттхх зепклаххул пики ХО
НИКІВ ТВ мечами. ВЖК ст вео ім. ЗИ сЄВ М М ис ее міхи зга
ТУМАН им М ММК УКХ МИЛЕ МЖК ПМК дл КУЄ п ЧИ жити ММ В ие их ки хугжеМУ шуми палали зумаи сту лому ма плит «АЛ жи й ит МЕ
Ех ХХ кто оПИих ою бух сети мем хи,
РІЖУКОДІ МУЖИК ТОМІВ
КК
МДУМУ 0 ДЕОЕТИКНА ШКО МУКЛЄКЦИ МИ МТМ ДОТИ ТА «енНКУх поток М ХУ мм вумовиси КИМ км тю сх ИН мит кун хи пли Фест Уузищааухв спи цато мита мимо пи саміт жщеговувилю що зам т М мдтвумьууинитхю Вл хм понос, хол аачнумтюиюх юмжппсЕааха аптек сотИиктаху уушопидтите зуль ди кмин млимси ВЕБ пт омусутими (Мами БІК суми «кір тні пи
Мушу веум жУдоМийала слоти у папа лат спсшоптащеу Чи Килиу ХК
КУМ МІ Іо ФММ Щи В ІМ Мити кури кити М м зай
Ум иЄ Фа уУ МЦлеУциц валити покинути осот дя
; че пасаниксто рераамутиє сигиблози КИВЦБВЯКЕ скиди покла ий ахиустачиусу усиаащуусу оцприбтузУ КИ х Сскицилиири пещілахух я Е кого ПиДГІаВ мкм МИ ВАМ МКУ чай бинта звжди хват тайкиу жа тмсв дачний шусрцпита Ох ; заатгіза ака» Утукигаї дача ЖЕНЯ СиКеТІМм УК пам ями
УухМмутеастумімь думжущумуМю» тТукцтасяя кати ДУХИ МЕТИ х сд- с ох й сит «п соозн тЕо пхКевани МКК ан Мав пт яку
У дшетюю дк ую ук ПАМ ЛІВНЯМ МИМО УТИЛІТ хи до г с зи - Кадри, ка хр ІЙ Ки аа хиталЗеис ск айдчих питома хеплаваги кеВ куасжоІося опи туваог «пита ух зиутадазня жийтихахчи зро аУу « зак: ткбивеї чт здала с ЗКааайих зйдолхамца гтртдаалаво аа залишки чото супи зцатлакоки дув зшдтттиух гадали палали ви Сода х СЕК КВЕ пидладіпя Втйцаалив зидаплау Кк модуля шо алазеУ Саки лУхЕмУу рижумцУуВича зидилпалийУМ М ана
Я чит пуск питати Мийте поем ОК ттирви КтКашКаюОВ з тт ччимх паллаткоху шалот оМв похеаКучус КІ и пато - чай га ми вив удкИх І2 ттвттакуко пЕВтВЕКТЕа пе дЕвав Втплткици бач сит кавкс тай тк ту ул пийтлЕХхХя пилку папки пд ЧЕ ОСИ г пувзитивоИий Вел доит ВЕУ ик підт киих Мила тд цих 40 тузчушациий пЕлабонит болти фату побтассх их шЧЕ дим с да схтедемх Кк меми хе зсвсзвиики попка сапичіжика длачамсвоє Купа пплвмних, хтЕ
МУ ЦНЮААМУМ ХутИ Уют ЧюО пмуюикюум рифи МИЛА ЧЕЕЦх ит ку г ножу Мед си іму СН ссопалоцада павесихико Брохсовадо пупвчоотоє аву ища пиВияив ЗК
СКУ ИУЧКАВИЯ ЛЮДНИХ МИ ЕЦЛАОИ ПКП ЕМИУНХ ПКУ УВІ я х г ен НЯ Чому
Чпашахпиціатим суузузалих слазствиука ливусовІя плов ив ППУ КИх ТАТУ зпаспопасо віз ососюі чзорсзеова ппосуцніса птзсуазидий паски ки ІБК зсалсдт ч«изосаі Кзечзуаах засни сливи а ЗКУ Ки пе паса сзечсаза пис Кпапосвийа совка 1т45
ЕРИ МИ ШИНА ДУ тУХИцИ пс иАЦОУ ЗСУ ХК я Я хо поту тлюлюту пеиК В ох пеаспиаас рчиЗииахмха часи раси псих ТО хпппталонИат ім мримеу Счуззосасно часи аса ас сашуиах душею З т ж пощИсИЕВе кЗЗошиоВа оз иаци ЗІООвшаа пе оа 12 зайсикцата сонних Козоспаоа смрееоцаце зушсааа остов ї ; с а НК я хсвлюту пива и стаз шести зачзцомицаз зло зго КЕШ чЧитЕлихиа свой х шоп х Зачзазопиаз зі плеча
А я зрив В пос са окис скла ВЕ
Взаплппасех пу оИлий перх би числа сЕжоИлсова Опов ай КИ - с хо ходи жду МУК их у пити сек КМ ад
Злити у судах пк щита арт хмллщоатах фути и 45 4 Мллюих щит лово соти чи Забави постах сощуспих уп
Мун тити мя Оу мисок: зчопвпплакх УДрлетивиах ських Ії с мих р им зики видих сам здат КОбдИчи Зоо таяя СЕОТВВХВХ хна пола люєтвх (му. зоАпутитею упо иауєт сут циях шЕшТЛУУ х х рем диню здий папка СВУ соми ПІ и Кит Иддинни ДКИИд їх папка шипи «Фаза гирпаптитвле уцеларейтиим лякум МУ стусочазса питво пайки ш паплаквтв ПОЗІ опяни соакатакаи ММЗ
УК шпийлатущу алисделеои подачу попа юттяо поса как х.
Є 5. твоигх чай звис кисх плив Бк и пимоажации Зпатаациєв ака лай ру УМХ МИ юкУх Бк ощає педа спла АК Мт чо во о аж а фУМоиити шошфохикизии щи возежциетоя алко стллауєо оо жу саке щас МЛ : У н У Мо пхати С о їв сеаузоаиищ т ствоит папа палить планка спи їй
УмУВшНЕМИй ТІЛУ АИКМУ сапАКеюхУУ ситу ОМ ро МК : х ти фжчвихИисИт зичИциие НА «апп ладити пачзнлие сир оє Мав ухийик ЗиЗеЗиищтУ :922
Жим СУДОМИ хуй МИ БОЖИХ УУАТО МОЮ яки здпаспале ктаровайса Бзкзичйоах соозптоспа орто из ищх пий кцспяспемумх ліхчоикаолоа СЗЗ уаадах слзоузникапа дшузчцитщих зач щух 175 : з пух, пух аа фс цтити тавосроскаг симво. Кохаю селам зла
ТУ пИЩОМт УКУКЩІМУТИТИ ПЛИКСЮсмИИт МОХ КсИоумИ. Хром лома імиох шИЗ птахи Хати стату висмиталав сплщеоИтлмх пу Я паю ЗОЖИИИткит ПАК Даслоу пшомоамата сгижустиих Кк а ї пуфи сасплазахцу пийте ці вид вачних савидеокує маток лм пиши хних спамиляакс попа иа илсаиаи мащиавлуми Ост у ук пес чек ЕІМУ жа ем ке хАхЕмКиВий Мем Кн зжУувизаиал аужчувтцає ласішШкиваах зсезиКаеяя пах ЕЧуКкиМ БОКУ ДиТ хм види тА ОА СК ит кю ми, кашки сему емо хек за тЧпухмиааУ мч ужиаи КАК АМ УК ЖУУ УМ БОКУ АМА КИШЦІ ТАИИЙ хи пдфлматаУтх КАТКИ суки ММУЮ КЕЗЕМЕпим чих пихи злив чущалщттт суч чеше ЖУКУуЖУИМ Ор КЦцт поши ша
КІМ УДІМаИКО сер КІМУх с МІММУВ Есе опоммчУВ Мем хВейЕ о мех Комм ик аа тушипвиата спузеаецуаа слух мудра сх шт пре еутм о даму СВК Крему в ВН з8ка зучацититий ушу слух мозку ит спмУшЕЦУть пуююшеУ тий ХЛюУ сис ата чума см вициу чу пах ОРЖІВ МВ, ям птах киця спеку дикому Ким кути ДТ счишиаийлллях годи сласовуюту жестом Сзщутуших сеео сами ту жУщо
ЗЛ М МУК зах КиМУ М де сита списку пек шапаястухо жаток созихатихУ рий ругх дуришайлої аоапивацх йБАЗ томах ІМ У ом сем В щем Кк у Ем пталутачяд пипаслатах» сааатазкух созсиниалх сахзоцатву СЕзааотту ЗО как а поко КД УЮюю виведе мех М плутає купала досманвлчх їжа КОС др ж ЗЕ шкалах ШИ сип дпІ тий км ВЕУ кавсм ММ Кир юю Кім вк шити «Указу Михталауха тукакКвзох датах Еоблсцавию феспвамих у ВИ пк ки КК сти пдв ІМК УК УЮ репу хм Мк чи
ХУ к МУ АТ МУАНУ Мудаки ХЕЮ ЩТУЛТУЛИВОТИ Аа «МІ
СлЛДИМК ЦИМ МІЯ иМ ЩІ ОЮИХ У МЛИНМИІЬ ЗАЖОКМІЛІЛЯНИ ЗМИВУ НКУ ЛІК сосоочепсу аск с спадом пиппаксуує жуаадиасяу думати жНх и оИей че сатани дали суди спммулчамтЯ КИ чи асожисхссш пк саду Зиои допису чи салону запи ТНК звзупиокхащи впли паці маиочлеєкиИ саду міка их чл зешщижаати ваші пацан зайти су задали иВи шипів ЗАХИ
Вже иНии дикими п пох лУк мий подлул згід ВІ у до зай
ІІ АЦИтИ йппалиас вала сивоо плавххнУсза пайдалониво ВОК аВух Ічо зи зіцмаам пе ум блоки адек почує (Ск 2:
АСК АЦУДМУ Петрі лилльлуяа папера пи умуя дип Зх сизий оа Кто Уста и пики луку пла пкт здІй
ЧУМИ пити Ахх: пиши палалсжсоч сви пп ох УА
ІОН списи кй Вега г ЗМУжеміЕ Кф окЕ пеки 3 кжшишУуМмцмх сблУуувтшухму Ю впЗишмчииа кпк ЛАПУ ПКТ КХ. МУ схилити лезом х штами Беуцихова Флркомлудцив саму 5872
УМ ДИАМ МКУ Ии ВЕ МАМЦУ ЛІЩУК ЯКУ ЛЮЕЧИ паНЕОЧХ МУх пасе Хчеспцлтииа Злуки іс еит Ве мІкиммя Мети уд
Чапека муу Єчозаспипимпа бззсукаимя Боссваеат водфозтжало путем МЕТИ пив Км КОМ КІЮ спливет ДККД пппкик в ех ви ЕК за са муиха фони сиФооамкайиа ес умнни лезами ма павщю ут МЕМ сет бокси куме смус і пес УМУ кими ВЕ мих зай питаннь хх дежораоих слух зоцуВустий давати иМмУ сучас МЕ ув ху МК дух зотте В сюк ему лив ом ча тушки мопхоалимлав хувущИишкц сич пУсЗзИпууцт спав УЗ зЗиита ЗЕ пчтсут В зм Е ДВ Веди спаси плакав КУм'доеме а Я лити тМММх кю тчЧиая теки Чопик алззвзашаєв стоЗоипуа КВ току к мщі тих М о МЕ суку у дике у Мои Вк МЕ
ХА УШВЯКТУ КЕ ТтИщя ух МУХХ луку аух склало папа шпайиа ШТ верх вмцви «дм пд Ех дм ІК ВИ саму чик мющозстлвач споді пейцтЕсоз сааталайус: говааваку сади ащлчЕ ПА
Еш УАНМиХ СОМ ЖИТММх Коди МмиМ: солити шатра дату п ссвсвпсики бпедусвусох содлавещок ссозтухакеч сало або чаш сова є пахла мтх сдопйсавЕжмУує спа садпллае ак ацх пТеХ
ЗІЗ боком рити сети них пошко спапекки кий: зп заекрпица Зазажоосик давала павука вся сон ков паплилвюци ШО
В В шодо
УА УТВ сф шо смути Тиха лето ститТалукХх Ж
Чишки та блисваокоа сзихшеосцима сиві пок шжаова жо 3145 заз жуцате аспалумаю затазкцзуєт кпк зааллучаах пів цєх їх звуттвгета зок о пухку ЗЕ УВи КлютухВи атака уух їх хоткцісс статусу хвя уза по етче око соуси ЗХ шиття пита тхутй Чозезешщи Зх УщуІИи пас сакЙй спа чрі їщ-а тзеакЗиати бако»шдуаах зірвав шили КАото век сва За УчЕвох зала ходи рпицах задвоккцуу пчусзуднова ззсвтрякаа слевевзугаац палет ВЗН запацитиїх ачрущонах сосзукроад взучикктту повезе ц Мучать Що заяпиаоасмуі засуха сзазррата Сосочижамх бусзушоайа бачу З
Млувоатих часова х рез алАках зИЗпакаМи сзошртиваах псує икцу авЕо
Мапалавука скадишаках жтткшзати ЗКспсоиних ззосжшщЕайх усзоиплата зт55
Кикнлуханут СуЗпапии чес сжажсалацх сосозишайх себусиптуатх 1825 плачавттї сохоаапаха гопссашллау жуслкшащаах сосок са вка зо аудит вуцу мщхсайиих жзопсатаахи сзаайпалавх зчищсопшлива селах зх
Меч оту СЕжЖЛЕК ля гани аа ев пикка КЗИпеасВих ХК пЕвВах БОНН купа зЗуУсУ шадтлтутсв Тоцалттахв Куаатксозї: ВЕавайатіх судсваол» ВА ххх зитттуоа осла щу висаскасуу тщтлаптазуч рупатлуаауч ВИМ екзо Вдтататеся сапки є саБахМКуцуУ аа о сищаисалтива ЗА тка оса Едиаалии Кисла квуСЕ пихи ууи БЕК лтазовВ падала ВкхМ зуІтукзсжаи паттаттажс пасадсУуво васала уави дебапивусе Алла у ВХЯЙ
ШКЛО ММ пошта осу Зичу м ХОДИ хцпиашмух ЗИ зстужиавус божа жосо пудлаоссз оті валик сало ує ат сисцткцао птесечивис пасе осов валика пилки плати За «жита Ухиічовцах сиву скова птушуМЦюВо пила бат Уж писать мх дтовувииє бусом патучати ялтЕтЕЕи пилешоКИд ЗЕ зщопсбстух тасоузаику сома т «усосивага Хазстшикаа лузукшциця же акатлютау тУДЕсюОЮИх дос ЄшОШИХ схожа КеВЦИМКИХ дроти ШО паху уидооасих МТомувитттмУ БИТИ МтКнм ЖЕсоишхо дими пи ко кош сзушо петлю Ую сут аякахш жадомиу: сКДЕвИдеа Ку аиК ЕХ часа ст ссдамаоку собупахує вища х мЕХщсоиву ЗО леХ ІЗ
ЕХ вс уєхлткт завдано жуласстав боса сохавптуух и
ЗСУ спалити уд птвтасошнт попе шини и стул косу щи їдисттиавт псоущоциват Фпзаалаку ОЦК копосасви пхжеуєха НЕ хата плати лазсвациеу КЗЗ НИ) Соком НиМІ мжцоригу щі потому ла лусоВася ставом» зежкавсдай штрсвопася лати ВЕ
МДУ МлАк Корок аах зу готував суїжецма кл тц а Ме щита дтт вуду хю суша чеУу кс ски КУпОряпова плоту Ще таастладтй зушушацату суттавачуз» уузаааааай ЗІ алий ЗІТИщАТА КИ бМслеталіввх запа ссйпжтаккюз тучавкайла завали зшрааля пах клксрютуюх запи поставою ох поспіх фЕвоспадоКув чайку пано пишЕуххі хх сІплахувмес скине зпотхт ук апа опи як атлета зстайсахсася стайазхтоюх саБасазху «счопЗихасу зош х ММ
Кк льох ФИппалеой соткиалих сива потопає здала о
Хикмихутвоя топи спайтехуия спицлктсоИй аппивляхих сне тю Я2ю лувузавут аоплвуєшецо спатЕмЕХ апа ааалистнума апапалих ж чзусззшажаи алалессзмо абжиукуукиа алавихзоо апажуваика апайнмивих УЗ вохсущинит пастасбоозий пабтуносисас масу тусих захи апп увуцо. УМ шрот ишитув лісо сшив ЗКозеудице счоузеуомт ажчачозио! асазицавашоуд У чавсаиласи засо зекзоспаєух клосзаоєти кузови але ще хихзпатийчк піз сосип) ТКчзазастаа чсузосеак оз оваМи асо тав
Хвоавстаех пазвотовса ахасусивай Зкоостсик Дефо Коло тіл зУаптсоклис зупинку дібров счееспссва зачеровсса аужаспца ЛЕ застати зішіжкслаци сефсропжит суч їІЗохочИка попав ах тІщИ заиталатих чутпиТлия судова судова Кам лу ТЕЦ ТІши касу чуток х сиза зтпцибтактя спади палатах НО ппЕденНоКлих сша топос серпа пити йтаи ЧИ ув та
ОЕМ ЯКЕ ИВНХ сосцкаєсцих соді сапиаютюю лети МНЕ
Зжитухиниово засплачако сппатассох село хаКє спеки кя зсевадуи тика учсхлачууу валова спала Стоп абоюааюх зоселикищи ТОдИ шосотоивИо алко езихсукцо хорах ел к же пелет та о
ОИжосроо поетесу опе стКх хагусусввя пхлвувужо дип ту 73 кодлипвапи пхжлжспяас зт а сур ссе Укуси ка пеквовотий Тато
МИБІрмеули вуфужиатий пуск Хо исиив паужесмсшо ве вих ТаФе пот лкаах чворсшецив сутірутиая ехо вжооВошИва сут ай попав Хо аАХ пає ВЕК коссвивтоу вуслуцаия, Тако скайп жих ЖуИсВИйах Кох оводак ОВК зптвовата позик тмх Зо попа цпашиал орати ох сесошуцевау спонуки срУШЧИКВТОВ СО УКХ, віп пзастдахихА здисташтиз соски сезЗцаццаат вушка зач КИицет ІК злаках ш пат ствах панства ори сузсийклах ЖК памитвакку соаптаваху водллаашсо спсвалтаакі ззиштцивах чсзппатух ин ампулу ТАМ ЕМІхВ поаккаатх сподптатив сзсаЕтевах жодопалух п ад ут уміоуттв остаццатА абпдкотроу Фест ставала ВаїКХ али тайна сода слати авх сопе осот ада ЖІ лин хухих ЩИИдалтя ащбасн»и Кдпайдипихх жезиайяии пп дях ЯЗ
МКК зоза ПОТУ щиаекоїсув зайдтямкку псоапьлеусу помах нзу ЦІМИ) ацхізчуузш птах сленг рух щплавлуюух вата кати уси зач «тк шусзуи вазу со пазаюєчоюо паж уує клип улусвзуя кесаласцу а зхаватсуштс ваззкусусв тако оссвх поза уссох ази паху юи АКБ жжатлкансти ласі втпа КЕЗІКІоИй Вісзітипи Ето вИих вах оКи зах жхусктопепай ппкхшжкаий Зхзоввсовай залезсощи плилазооасти спалахами ЗЕ жхаущтсв Чосзутааци зом Істиси Зтіаувавап кіз ав пахЗуВЕВ, Іо тжжвжназай во»шТІсВат Козова зір оссаи садами; впали БЕЗ зтухаваатий аХУК КИТА отак дасте форума пливи Ока сахасидатл сизасоОцава зи зУККуцаеве ува аи ПОВЗ. іт шсталпвикацие фозостикай судака тувати лививещиноа Смик КО спеБуксаато коси сжшовавасї засо бЗозущОих Ше воах Іо пилка т стопах йау Мртадтаюн бзатсвайт чзусстайай лаву а ке укаккаах дутики пефацар касти Косова сових Бо лляна стсу ази залити сага астух ззозаийкахі пепайшаииях що
Балта уда стани» запасах тпапайттких счушсттават адек шІки
МскзозоазуУ пила ууус пек увусу фаИпакдис стссопитх Каса пиВакХ мВ хІчркскас айву ми БИК ати уяи дало спалио Оса их КІ ит БЛллюЮюкас папа шипацжувоза сщуклтвуса попе теоКої БУ сутуткаота сту пектовавово алеї уви Сиппаюуєюоя додешутоса Зх печиспжкат ау Сти сидр ую Мітяалоя Холовусвой Корукев ЗО зцацелоня косе пуФфоусотх влучили цо ек иєта дове зо кацехІшит Ффіпвспвсико ссадитесох Фо статичну вотум Бач
Клалеуцоює дасте ропи посту ооцалти вектусуюає Ми пвх х зпалпитвісз заплави пп ооо уообоспасня остачу МО пЕЗЦУуВЄ смт уижию пЕПТЧИКИ плита салон зпдаттуву Мун зпажосочожИ салату пеки уумх Сокаваласс заппадиокх сайвака цк зпІ5 птшЧнЕИ ЕХ КДлй пилюки ММ ЕК ОВ опи дУЮ КИ ВиВОКУ у ТІЙ
Кзшузизцої публіки стави зла тісм пошжсативі Сапа хтях, УБКяЄ усуцажишиий тазуечуцки пкедузопа ствах ати Х паби ух, ЗаОЕя сеукжоции сатлкшсвиц БЕКОНА бару алюх дпалататиа сля, Ми мех ЛИКІ трудшсцзжоки сапчуусосмй заду ппласвуішуЕи Му ци Мн зссксоваеа пилососа аск усетаа пе исие адсюосиика дили цих Аа хоча тних ложе лапа сочанусфоо засув пре ице АВ топи впадях пости скутості потом птеурувоасі валчюссцих їз спвБпадлилх тати жожхраацаах оче споема дачу ипйа зо ашова З дис х ожину кара лаца ЗК ИХ зач иут пока исца іх
Зааплилух» зЗеозчамаа зслапавцйуз оце ого щали мухи Х В поділив чуилспимх фттужесцааво осно зрос уопжцаекя ЗІННК пафалитттвуи си жисеу хацормт ме цих зигжосая шу олиа МЕНЕ цілу сумо сука зажила ю ЗА ЦИУ уСоТИациа ВУ:
Бачити чсупаєалх резцеесу стксолаеу сулоцопчу у узшциуадтуе УМ зайти шус топосу собисеасг сипкахжшов сток сива зу валити «алко зола цЕ подав кородатеий поета лосо 3188 злюстіжцІх зпащевжцоз дети ссво аспблакУюсс заахтсова дес аки ЗІ5де плюювиавОх сала апа циева дипааежс дпайличажцо ие 11 ЗО зЗазмевишцоа зало лшев ати лиави авплавіжас апазаташил зппапаху зало кузссзодта адасвухуви плеса аплштусеех паца попе шецх МНЕ саезпцилато скучив зазусуцциа студ щеавави ЗЕбуюсниау Зк и ТІК поли тттт туспохтавае зеюзчсайти сиссясшшии сера цИйи пілЧощоиих Мо стелею х сусжуаттитв прийжоцочна ссЕсаеасах ший тік ух Вино кахлкахоч тс тус утоуаавея хуцеаазик Ферум МК лЕхччухсіх свати сзипсЗа м тсапцм зсграза я чсокцатух Му жчвуччичин Слава тх доплати дату попу зсув Ми
ЗчеВуВоМУ ЧОН ЕзиЖЕх ср септуєх переви хоздеааах зозпоипааии Ві лика уасему жопа ав тов тутах ЖвсвакИаюу суша вокалу віжки питво зезапахкх зок ахУкх ЗсссйпЗсхОї бортика вусусоща 1153 пИлежичттІ сЕшаОптоя соОплиВияХ шозеакивкМ зазепийаца соцввекуда м
Моря» жвава с завадити хсосстасатах чо сосйала дтувисціИи іжико ашжжрУвтусх судак майже папашуути хзйайоакат Козирсшаа РІВ зкозузаих аааллусиву пзазлизах ааааисваихив зок те птоз їжі
Хакочоевки аспек вусс казуси впоаллмууух стос волепац тиж ссощире памоцалечих мазі чучу ацоачичшиу Тай о садопелиЕ ХищмМІ чу ои адісуучум спесуцусуи паллувутує сапки Зааолкцсх, МИМО сек сзозося запас оух со суки михаскосув цибуфувнув пихи уи МИ вуста спати повезе ахатеяй паче чуго коту х Ма зчЧестткнн зобу пезасоуєси хну м пу коци щас сви хащах шужосаЕече ааесоеите заФескчасо слот созе каско гаку ЕХ пЕнаФухц ФЕВ плелжусктстда Зла пва пааоешіцсовс ап еиКИ їх зжочтдисся тк» ссово ввосваалий вошей весело дили НЕО зсжадьаали ЗТ ВИспі сову зош шИ петтткпааа ЕІ тТИ ІТК само пуузеесицва дет оах вчимо палет ЗЕ ВВ 1хаИ чоти. слвуБиций ми цеаои песик ти путуссиво деттсновая по зер ува уже слоумухииітт сотки пили То ттЗспдазат пузусвИиВт чЧЗзипспекиала ЗУчІНпцеа уеусащаиса вУдвимиииа Іо пиппаллаах чзисоайльу сзиппааута чисааайслай зовсоайтля спушеиими МИ золота зсусосдиу спабткеи заст семи уоспосаа ІТК зцазатліщі господа сови ошо спи иахта отим шосе кх ТЗН холах м созппекако зевплатоашх Зосплакахх спаси диполь Мпа попку стовпах Вкакллтушує ЗВпЕдивлт собору сспуоитутти ІЗ
Упавчуссвух цикомизусо щаипотазнугє помууечим папи моти кх. МЕМ пли фр ж чн ВІТИ дис тнони су чучи пен уцх Уміло чик ит висжкЕтиаи сксізсопий авоїі сере процеси ТИХ зкЕспаттада Суворо жо стлзесацех ззитмоимІ лЕхжюЦВОВО Вико аоц ІЗКИ «стадо узами ззирКааплт дугу ЗЕ позІївааа 13Кща аакляхлила сих ощийих уза ака усу еаат вата пвиКигтЕ ВІКИ ж ТТ: дощі КО гр гу жі У 2 Ки см г ЕХ
Еко вала сихах ВЕЦловбитко Ксоашатава спав Каси асаза МЕНЯ дає ф ж хи м кденеитнкує сфдапйму фжтують сер сву есе а ких жд зспипалалиу жжжуяатлав сасосвапих заеаспоМоух заикащета Ума ІК ие АТУВ ММ МУК УЮ Кк депо КМТ ит ПКТ А и ізикай зплипававич бхптаптаку хрспаалижао шЗопЩенийує пий: ЗЕЦОЦОАТли іш додам ою миі ФМЕ СИ У Кам димом щі ВІКУ сиг иик и ху. я зу
МИТА шеИ АТМ У лпттитатикх СТАТИ ФО КТ суха ул МОХИ татами пекти пкт со папа и сдтослах паста зчаий скла чхчус ска докасавах оаааллияус сабспатув засппаацая МО ежежетектюкт МУКУ ОВ єси пази му ШІ са іо ризи туту, ЗУ тоди жоСмСтпМлМиМи щрИсляактшттх хтдІвлуутА т клали ЖИ ОСиМт МУКИ зжисв сю Котик МмІлІМУЗиеКИ Си ут ииие м Ота и КК УК ЖУК и ко оо Ізу язахсА ЗАМ дтп пюИтиттн ема Тана ВИЛО СЛУЖИТИ ус лива МИХ мож ЕМ Ж Кит М ки дід мим Ед зал меш КИМ Кмх шлами штати схемам лющопайтлАмУє житах МАТИ Х хво МИМО мули щитом уми мех и МУ шк тиме сша щи ДВ Кім Р тоже и щем ДУЖЕ ХК мав ситу хАКх счЧуссжимИх зМруутесзоко чую уми топлений пал црум мамо закл жирами аж ХЕ і УТ Вовком ит ся МЕ Витоки І зу хи КК сдшхмусаси осо ччес чуму мих пою сужжм ую ювВиу пода уци АЖІММ
Мак ЦціКаМО УЮ кейс Кіри соку пи КК з тік В В В сиг им, 5 ТМ епшусищеоми матку АКТ ЕМК Паша мМ Мила мим АЖЯМИ котик ВИ Ве К стит. пули иа и АМКУ Ж ВИХ кн Ко тд ахлулсатата преп зіаеосга застати плели фо уци хх вики лайте пеки прак щови повлскЕуи клени На тЕшЕЗОсТоЦха двахеючЕво пЕжеКУЗВой Зріжосви палевЕтчвИ тане зт "КІМ мем уМ ую Ма уза ую жу ази КМУ оз Зм и М: хлоажхми у пт суцек пкхжкдопаКи пору совциє вехузсхомі палет по зорищттх, сус тс тожтв проти ЗЕкувиЦоти пава гад
МКУ ЖИИМ ФУ МУИтТ ТИЖ СУ ШТ Тя Кф Х У ЖЕМАТАХ ТШХ ЛЮЛЕМТУЦ Алл иКЦАТе це пн НН НН НК тики
ШУМИ МІУ ЗВУКУ ТЛМ сту юуати Зк ЕуИМм Межа ТММ мами «Кс аж пен мі жи КИ Іуди ее МК вих хи ся хУлдуї хзитадихаМ чути пузжиест шЕстцекаалт шишки чикати ТЕКИ пам умов ки песик МК у. КІМ КИМ ВК ІУКОВ х кмк мухи НА спалах чпзиоаляй сови зсетоаацау свое КЦТлЛЯ ус ИВ ІЗНЕВ зді ня І КІМ пани ук КиМУ пи хом а хай пудипйихайхм чуми меми итдя шепщІнрутУ сешмчцущтм Уудзмщислах пгзшимМ пе дв млі ми ие ФУ и и МК пе См Кит ул зацак пийптамі ше фсгіусунму сушки тк чсукивциах сусуивИйоМ бита мех
БК о я кн Ки НН НН самє у у У пайптактеасл зслошполатчи пупіЗит пизийлнилих спос алив шому МИМО) ситах мист гав поь пед Ею Тонке ис МБ пора іщаш состав та Зоб запи лих ЗОЦовлихЕЕ асо ММ уко Килими Боспбеомикх спосте удо птах стопах ткіУй чЧипиілячуук Хоодпцислу топку Кух сосепихляю сттаптяхих сс сатах МАХИ фижук жк Мем МТК В Км Бінжав мим фаду ню м уие вже Міли талону Меп сцках лик ХАІ пЕ ХИТ Х ЗАЛИ ЧЯХХ ФАЙЛ «ак папі тчВий повіки РИБІ ИХУ спати щ катів ее «щЗай укшусемоише апоостізио ЗЕМ уи пов уцаому паузу шу Киаплихтух, УБЕЯЕ ни ВН В и НВ пол птамУВкимиІ присжесемми плдлушмчми зле цмами лиха єм злу ум мк АЛММ
ЗУ Ум Мем моих сумом У оминув нити й и М плини дю посту парки вому схссаАсссаа піл залою свий покКушосоки ІЩЕ жити У ЕМмУщит ЛДУ ЛТЛЬМ ПУХУ ТУЄИ ШИХ УКОЖ МИ А ПЛЮЖХИМ зуп лолуУх кову щит лотеувипало мули сети й по ЕДИКЦОВ ТБ пайок Е СКП СсКиа пис миав Как ИУийх Мамі ккд тиха папи иртх демо усе мцоуєт узеВиМмихцах хззучаилаащ межу вима М целаАйахваУ лица дили схуд сова пимал свист ІНМЙ сода «Кая мини СХ ХК я соми гаВ кп іже. сЗафчаееу состава уаакцадпз» сухим чусогваттх кмувеосовах МЕН фифусУАла гу КсмЕТУВАТЖІХ СІВ хижі Юьк ех дк же іс катозатате можут алтКк тчтциьх зу етьх тужВаллатя воша МТ ен в А КН лихим дакахасмМе ул иканх СОДИ КУКИ ут ехо зо
Калла байк снами пабийостал стола ЗеущЕСпОВКХ зей
СЕМИ МОЛ ЯКИМИ КАМИ ЖК ХА ТАЛУЦИА СТ ХАХКТ М НКУ прут КАШІ МИУдЯя ЛЮД ОЦЦац Зм АМАЖИЛУМ УТ Ма тим сей, Ба
МАМАКОКАЖ ПІ ВЛУВ ДИТ Мф ЛВ ЦК ідум ужити сег ки епос рин, тел кадети. зсопитатув са Алупиш ул астиду соди зЕтсоесспашх ЗИМ соку хтЕ долали «(ТІМ «ММА КІМ «КПК Умудих ідпей
Чалистужух заслайпавзтс сту х сис чебицць чисАцащля УБИКИ
КМУ МКМ еВ коки. ит дужки мВ ут лутий (ТИМ ит и ит зе пити зааплонутт пицолашос спина самими ВЧИВ ЯЛлУХ УщН
Міс У ж СВ Юста С жилки пз
Мила пт татятІх саспиашівч числах сопе ср дципуних Бій сек щі пу кори овочу Кри си А стих их К МАК сю: дети с залий пектини тИ опо осю Еба руку саше олова всипати івхпй ми МІМХУМІМ УМ Ох рем сплю зитсї си ЗМ м силу уч ги. цифр их ав
МлШшеО Ух рми вл (рило деп ххх сода о зику АБИ чесним Ки поданими сичевЕдкеа Вефксихик падках Щи му ча
МУЛУ Щи АКАТ МШЕИН КК ХХ пиши пайлтшомюх мап Мих Ал тру мМ ПУЄМУТ ТІЛ еп хв Е, УК КЕ НІМ сти иа І СМ М ЩІ зи
ЧУМИ ЗИМА Х папу кИШеЩУ ЦИ ПпИпИИЛевКИ сади чеи КУ
ДО Не НН Я їй сибвутиаииа циклу слуху Тл яещумУ. попу улу аличу у Аж неитккв аи суйю А, КИ ум ет ли ЕМ жити мов иган ки ззекіх хоима ЗЕМ мими М Дух ем ТАС уКАМ ТИХ КДКА У пон сюди Мах тиме одуи УТ гуТе кл ситет ИВди судить им ЕЙ зусзиссасмхи пашиууиупи зализусщий адлсеВозайа засизшаи аалслУцих БОМ Е век е на А МАВ КК мітки мА ВЖК КІМ В доки йвії сети ет жди шкузсжориеас песо су удемици у озоссИих ауру аУутувапаи Ам питцМмівии УКВ плед хи м Мами сел дмУ ду пи заг
Фешашумисє лезу лома ймк сума Оси пошу Кими продо я СВ М ут сом юу. рЕОсу тиху юри вів ЗК Кам Мох СКитичит ота зал засни сучок пошко ажмлах ззечоавишко песо а слшпусакца іо м В В НН НИ НЕ зжитий чистий лежачі ву стозосспИиких стссодсли Кс пвоита оо сопичх зи
КН ИН НН я ійдйций «ТИШІ ЗАКОНИ Тел ТИХ МИ СПУ ЕАТАМІМА ОКХ Км тайм же Мхаи в МЕ БК СИМ мя ХК ТМ х над таня ХХ ПЕТ пуп фр тму пимИш ти Миклх
З З - УЗ . ЙО З дала пис ет оди палата ХДУ ТМУя УКХ х ідпищи капсопцихту удари тлслр сума спцасаллва дпосекитлюх вул х Учити кущі он ВИ і В тла ца шуму мишу тних пусти СКМ ЗМУ ом крилом т ке ІК сти с стійке Код суч МАУ ис пу ВК Ух поту Хл жласоцалочу числа тчи щити чидашлатич вухами ШУ Дт
ЧЕ КІМ Км пи сг ДВ солей МК ВВ мим чик ла пс сосоципип плплатео паса дих ацчаИ БК ил отушуєа ЕН секту тищи павуки Мідулде Витоки Єви коддіх ми та
ОрЕлуЛуДр пн ук БідюрюОСИ ших пил ват АТХ
ЗлищинимМУг жахом Все сади фам мими В М кю яса
ЗУМИЖІСЦУВ МАМУ БОБ ЧІЛЯс широко папи ХлрККЧ палю Я доки сич сатин ФВ дети еім вами щи і в екв чеижату чашки лек уюи ме уююии мли уу у пит І пли ОМ межи ме ую Кум віх о и КН люди шШУитлслМмлч деку лекиосцив Ссослоспоатлла суду щиуземик узи тм дити туєхую ВІКІ чч М уд мує чу Ко Ки кити СК Коен лапи
УТ уюм УмМмУКИтМх депюуа ди см ро тий дошк ниВ каси МІапо
ЄДИ ОК ХК т ХДС исит МІУ же Мещи мль ах мреевеа я и верфі и ЗІ цик Кума М Му шк МтйяМ скеля оком Кто спла их тпицитвоФфе зеаОовпасЕсто ЗОБА ах пока завити ТУНБИ аппелахахт ттссавцах» созтезазас соте вусвитах чих пт пппвттихат жиди камо спосте фс виаах взути ЧЗЗаийаа ІТ сімжуттижоє оаоолоаих тала зош каатя уссгкиаи срсцимааьа ІТуУнИ поживою цагалтескио ттплелакекї сопкаатахс стави чести ІТИ плити бадлоивУше чипатеьух асом. зоапициалає фостиууєЕе ВТинЕ
Хлвчазуфих бадлплачнях ЗаванвушиВ боаалаичх безацетечх Чезаре УМО касувзечи аа чечеи зпаподзвииа воапацачая заалацекі капа их мин чі чзаЗи талони тлу тав иа лнлУх Халл иМ нір ожину м ХУ вуи пт УучуМУ мтайинияи маше ут чиМ ЗКУ; члсузусмх все тшцо зулутутсуи допаллвзико сапаадции цу х МАХИ селу пааетосчрл пазузччеоа асист освМм масть цитусу доми їхащИО тексту тавцп плакуча иа чиаи пижжи слуха чочУо пада ТВО І чвучащиІ позі ссвцс осла сй сопло и плач пруток та жуштадниви шІснИлвАси зп лосцу вини: адосзоспйя зоЗиоота ТЕ
Мито сусла жкцпощтаи кто ай заїхав вхо аке Ву засзитипов чудеса зезаоавийт лу дилий пес вЗоссчеВаки Жак хапати чи ЧМТ зпажкчепаму шЗІЩеаШайЙ тт плати МАХ поаоаааллат зписстоцтяМ дише ротаїт состава пВіІсОоВалМВ УЗИКІуВих ВН зате чита цал ззвасаайьо ссзалиаай свв: зЗувталаю знали
Ккал атл ЩДооскккату злак чл узихаааиу сізпадзакмаих 1ВТдИ кпдизалоту стейк «папок узешеакуав чести ащ МЕШИККайех МУБУКе пкзалиахі Зопполевош пошптиЕоі зов зсопаайохтею здповиктхшх Інв пхзкхххкоо аск локї сдесйпваохох зповгавакос сей вуЕ СЕЕклвЗУХ, ММ
Мвт чиюхх Кллтиулих ставив Івах аБапевлкх совка кка паби ух, МО тевзЕКККЕху Воїни пев тте пли дО алиКЕх Вих ізпшИ
ПОМУШКУ МУ ХАКХ. жибчхи ис спайиЕжеи патч оних ділу хт еп туюхх; ТК плоду алУупю куки ахазеужииа порухи охх адизавЕииЄ пови Ах МУ сзурусшшка пакожучтаА Пузозсипай закувнвуЕк балуваосвиай пахву узих зі хмусаааайт ЗЕ лен кщи ШежижЕиоак сила свашаа асжажосеца ад адкостоах засотсоцела влосоаапхта зіссхазасий везе ЕТЦ а жиле сЕхкцататя сзоомащити зУуццлить ТуущИищиист зжвісавайт Зап лкаи ів бкжпладати КЕЗЕЖВВаЗВХ зок ВОЗОЛИМоа ВЕК Ие Жуля х МЕНЕ дпмижуижуєм пута кс апвйласюу Фасисиоаюу фест зпппайКОх їіпащи лева кові св суюі и пет щік м хім зма пикщехитІВ зеазаатакс созацтахов зга у оізсохацаа зум ВОМ
ПОВ В юилуч: під екв У доми ув и (ому уж ик маки хм Комо хаочиуи тех спахЕкалахі павжоисвиав сзсаайцату сзужаацтця МуцаАцито вази ЦЕ ЗКУ зима о деееиічоомль сдМмемл КепІКгМмУ ск Кк ехекеКх 4ожгех зппнайлааі збе сайсо зЗаїаодеся фуги аа сззежоава КЧвЕжЕНх ЗЕ пак пудсощшММАатУ «мимо омйсх мМ МУВТ ци хх полуХ пика Ззозадато состава ззчисациМ росу кщиа калу ІЗ О ке и НН зум ех деуз ах діри ихяка счсопосщада ооо пост цоца дор та вве ВО в НН іхуутих ал футтат спа уух срокваа с саке дивах Зак але усе ЗТ дупи к М, мо УКХ и КК ЖІ и диву ит УЮ лелек зай аанутишаив спалює шаСжплавкЕс соту затв атуМ зузуспкаату ік
БУХ мМ ЗКУ ХМ по еуМ ем сити Му ТРИ тити хх и зодесхх ти вулляах пуфи» засдализтО холах дпапапицахя кощошеуа. МІЙ долину Вааплекаас ВІВ ХА ЩВпЦаВИлІча ЗаЦИплва чали ММК сут утесекмх уст чу саптчнушу поплпаАсттхс жалИди ту апп лада мк плекати Микити ам драже Мних ли зимумацуху мупуцдт яму сук оувезУу зап шУу ле ум ул ТАТ уламок мим МУК ме ще фугу минув дал МКК ки па
Хлдвутузни зазулустух паща Кксзжус МОЗ Очуки воадличуви щадталувух ААУ
ВА црит м сим ДВ лют мдф ев ит поділи стихій кеш сзКаУуш ллтдттеув числа умуи МмшЕлттвух тлу теацадивУВМ ЖТКЗТМ се ит кит пасмо иииту и пу у (ТИМ КВ грою ис ті УМА ИЮВ В пдуя ин тата й шпшуучосави апа уує уд кщ пола ми дача уву уми ку Км хиМ вет КО ом о м са ко сад ТіІмтуєдоф що тм ю зп34й жлмззусаса битозачивмих пасе осиу мпадасоуузи бусалачу тла у КУ пустує подо і фЖВтдм Маму КВ учи ВЕ пити, зпагах атсузозау о падала кизуМм хашУузвекоти шал у липу шеуу МУКИ Маю ен о і и зп
Хлюклскчацой плашок щи товки Хахешжцєи пралалома пах КККимяо ОКО поетичні ую Ви в НН А ОЛУБИех соки чи паахітачки пан И баоевуцичи сахіхічсиси пилу дошка ткЕодисийх стіни пікових кліпи зва кОой коди см тЕБОСХЦІВ птажОЖоВуВ пікова вИ Еліта Еко Вк соВоВЕ шо : ; : : Що з скол : Уж проОтхцитит зе ЕКИКОЇ ЗВИК Зусходаш ВОК вав зи шпустужавтой тож Еустй ми цувату осика пишу вело иах ЛИ пеодртИВ се содиса крупах зваощищисо МертвОокаса ВУВиСКВой тоди
УХА Т МЕТИ СІК ХОТИ ХВ КК МАХІ ШУМИ Бе АЧАНОЯ ХМ соку ких стих хо сте КІМ я КМУ І піки чити пути иИиплинмти спали уми т ЗШ ИЛИАИТ СУХЕ У ВИ рах «им пахв и КоеМУкіріюти Ме ццєи КИМ томУю а УМІТИ ВІУВ ке к шли
Мащцлилтитих шуму менти узи ллмтха дет цитуМ ушу шММЖАМ пз жиию, пики Ка ки. МИ щии Вецмввинви мису жеткїн цих шати муси ами пмимуФтхи Соми МИХ тАтТУМ МУКУ МАУ томи певсюь о ктих пів МУ вро ТКУ м (КК ВА Мт тшатийою стели защие сазаттуюаи сусптмуюте хиптпккахи совопхахюит тропи справи щНКе семою в па ж ьшяМ УК В ую их ЗИМ у их МІУ Живи дити КН длтвиюін Доопіцасю сооплотоі заазїаос спаданню дарує ШІ «ЖИ и М Ім лих сему Кох б см Ких уми с у ІМмІ Мем дм м ме яти части ухуме папу тиЗбатемус плать СТИК ккх орали хіп
Ек Оожуу цпИисжслтееошу мучкиноснм стуку ЩО ИВИКИ ЛУЛИМЙЛЮИКУА МАЮ кі и мити рий ебезегхи тая ке орсиїка ними Деу АВ лити ка их дахи жаолщстутаий лихо осоа дасбоичага цисти ома смлошчнумуих птапучуми хіхе швидка Зак усцуиа УВК сушею ур си дути злим хвиааротаст вті сжуцой пасе клай вжссхобося судових Хагосвиотх зІ02й жит Уго ск мщіІих км, кими мускус КА ДИНЮ аг
УшМиМУутит вушко слова Зк єуоиай лес За шЖИпод ХА ВИК поз В Вих Емми КИЕВ смт жк ким ур см стю чЧишцичалах прориву музеЕеитик семисот тки пев оултня ТЕ звик х вої стйлах ЧосОожх сус цу сови площа ша хжомтхкац звик а Фориврииду душать модеми пакет 1428 пирспуцету осзеоти уз фсусоттаум: лувецеїилай Кортх та ті спо иЦцех довтоФітах сотосеваку суусутоцуає еоугекоУЄа пакожжуулаи хо саплпихллка чужу чеасщнимрІла фчусисаах сузеошаца сити шішо лети есте Мои УБссОдккУЄ сша ах пашОктатея, ТІЛО
Тмляле»тЕу жуспеаако ЗБОплцавотї каста х хашоскайкх прохати тІТЕВ адпалутуси ооаетвалх петанк ктлайтуаха геол скидка КО лання хах ща тавакхІ садксвикий баповатала Ктжвкавихя БІВ пІБпй ауливслюх свппклетаті аАлксеУхої дайапацовха ВвЕБЯаЦайИх шЖОостдлаи п лу топи веув цілалоувух сапакалюри состав схопить ЯИМИЕВ аачетжжрм васацехяу вра Бедлнитюстю щури паяти ки ххиНО дела сзусти Кацелиимсих шалену цум мли; щталлиднув Та х. ХлАЧО чола ссзва цицпазууча ак КОсВ паза ува Кат теюх пили уя. ЕХО ксдсзуощос спосізусео паті соВсе цеЗахузощт поузадаачох ах суєо лХКО хну йти ічоси тво ща прусалимиолР: порі чЧосИИ популяції їх зчиєссзахс сзпфрососи зтсовпцала слу гоп спхЕлиВос ЖЕО вопжишесає устави щусчиа пЕчщецах вітушоВтВИ Вовк Бувстоие Ххало тюжисщосави пихотожаса ств литой Зквужвоадая істо пекло ЖОВ зсасзццоца секта узусвциесих фор лЕекадкає палреосху ЖЕ звузсвцота зУзушцотай хЧчттоеаа витеущаяст всЕЗожесОа ах УМХ ШО чикати бика пошеаєтлтй оззущауии усивеаат сф АЦе ЖИВИ савзатазчах зсоспгтааиь счобцекчеу ЧетпауУсу ропи мшу зали кляя ша зи раткх дозах зашомриилас саствалх босими срок аухх. ШЕНЦо постах жусдотмрваух попали похапилацу зопоскоати смогу пи И ахоувечттс валах лиц ЕЧЕх Зикойлахтш спапвопикав сопло, хЕБШИ
ЗУсзчзиууи ака усу Бупекасвих цибаиуця сптабтемуи босу ЕТНО злдшжсоои аку ци ЗК ИИий пшлллаави ат лаих Билини ХОЧЕ чшисазасстмі «тат сосси патесаоайи уки ероси падосчуюосй аасиоуций хід звуйаацьтй плтлмажетс взіоссеет пилові сстци закблзоеасто акатизусто хі тИпкЕчиатю пули узужатла тисках лапа й КВК ха
ТЕКА Чеоувсшко сосках вохуткадта хоста цах вишка нах же дипенТпок ххх Кит ум КК ж ПВА Кк кв пд рми ут нта
Ух удо мтаМІИфИИИ СІЙ ПК ХХ шкалу папИидоикаУх. ШИМИ кети що нтутяюілхи ФМ еВ дику епох дека запи
Заідинму идалстувис пифукалвих Ззаааплалю дова вика пт ходив КТК УКМИВИ мо чаВеви мм ФМ щИК ит зхіІпдй лУМИ УТ МУ МЮЮВМ ЗИМУ У КТ ЛІЛТИСУ ЦИМИ КОМИ ко ШУМ пуфики ких чую д и ле дев Метт пи мм ТУ пис дасушчиои лопух «лише УсноКМ цель апа чх пе ШОК мл ІЇм х
Жди «Тв ОТЕщЯ
НЖюни Мі. саше дих
Кт Шечоена силі ме пер
ХХ УПМ НИ ХАІ МОВ МАО им
ЕКО лу; кис в по щі міо будо ЗИ ПИ мл сжжии МодОоМмемотТмиМшовАанте цідкуеа мамиз зипитУканнв для клини їх пелахующмм бак тщ Кімукі щц смути
Мо щуку удНя Ви Маллозсса хуМуєкКА Б оМослимаи плїмни Ох ломи о : ; г стуки сх мкм В Км тив жк ун жи КИ чем ца жЕуцджчисито пляшицетає куплет холецвиси да шитИ палях ОЗ писовалаи Муза кзтуджосшй ледащо ЕЕ МЕС ЕХщя :28
ЧК Золя пт кис влтІазамІаВИ ВИКУНИЙ МТА : утовллдиив плакат без лкатл сехтикддик песо ши палат НК
УТТИВИИщтТАтИ прожи: паль стлтаеале плацу: па дат пути пах З кЕмеипгщКиє ВкукимІМмУ Віск мИи 2435 жУдумлттМит шуму слати Матусі пливи плести ж сдтдайатти опали тию сстиде Квийиитива дсвиситаВ бек шу:
САД МУУуШИШУМИУМ семи х ЗАМКИ КИ МКИВТАИУМ БУВ М МУКУ М ге що сем ма лі «ма ую чай зр дн БИКІВ с ат СУКА семи Моди папи зап
Ммичцуиу мшимшиихУує дому сагуи сеухимцпай Усе Чим ях : : паж ще СА нти песто ММК фі ва іа
СКУ в нив ис «се МИ Коли Би ТКА тих зах ЗКУ ії садах часа утсостлотиу ушжсоцпачя тсеащицаке сспотузаих ху
ШПУК де сЕпИЛОІяЕ (ИТКЕОнЕХ лю гий тича Вста вили шИУуєахх чий пу УуУтаме мими к ярма ушишмулуй са шжшмиут КОТИ Ах х. сх дах сили ЗМИТИ гаки СВИЩІ ЗІ татадпоуюи буси иалих чим ацаде Ззучщкм удшокцисмх пк м 23 дич се аанкк сип кля сема зстогпаа веспопакх лий пила «соапоавих сего спомини золпоБцаь песхимивох о зт ї щепи вай лааскА СИВА. ОВК ІСТИН, зви зцивттжшуху пили ою апп скора ріал сстлактеу : порив ку У пек судити мВ я Мих сто мелену хи
ЛИХІ МНИХ ХК ЧЕХ СОМИ ПЕЕННИ ВАДА МУЛ МОУ ве перо ксиво Кттлчасих Вапачнісих стлвавЕсу ТИСК МНх Готи бай
ФТІ ЕТИКА ЛУТЛУТиН саму аТХ. ТАТИ ІМТИХЮ СТАТКИ ХАТИ ДІВ М пфтвсмглвиий дпдаттзкусЕ Касвмрусни Касанлавяу Води писку и І лим уи ЗАМКУ ЄЕ Кале люШиИ Єесайлеику ода м щих уК у З : с зач зай усе пихи пав дсимеаоомх ЗичеениВе помах зи зЗЕслжшихнук поси иуи пакшусемих ати мумми типи шишх мелахУмиху ую т ї ї- ХУ папсдошк: УюсЕаИвий зосводем втім поклик можли хе
ТИКЦИНІ І ЕК товста засос ци замшу ший спуюва ЗК : - пері с зІУхх пк МУ мех пап бак щі кине цеиВЕ мк ІІ
МИТТІ МЯ ЛИХІ Хр У оо пох КІВИ уки уКих плити Ки хтипдищную ЗІ уюЦИтлй Жюля тки паю ша Мч кощо т2щу кипцаоалтит вусущеттий сет итих Вттхмачапй каїссезсола зеркс ІЩЕ пийтитоал тезу ой ЗсУщтниО сосУшОКРася СТЕ ЩЕХонВ стави 1145
ЧИБИИЛІу КУМ ОКО КТ ми ииий БУХ ЛЕНІ» сторецрювиа тх МАХ суломувломо ВБЕКИсалЕт ооо УЄЄЙ фони КІФхІМУВІУ ами УМ зді попасти Бутодааахи бттовууи косити угозозаів запи МЕН, скиту прати ІВ «(рев п зе т РТИ їх сип УюЄ Даля слів ю чолом їх сус Зима о могу т
МОЖ ДМ її сту дл хх чій
«МАМ ЖілОох и кошт яку М стиму я сема мика Масу саплх 4 «хо я ми му Втім ща смеу ММ) Мк їТах Фіне Мамо хе бли фу йо г
Мем о беи міш ах їМж УАЗ Хвх лу Жах Бар гу їж Бий дез шМу дех я х хх хх
А х МО ТЕ паре фр дошео Мі: 2342: пух ла УКВ фі клем МТ АЛ Ж до йди до Ха пт ЗІ вжц УМХ МВА ОІВ МИ МІ жу МУЖТЕ ХТКІ ве її5 7юВЕ Тих пе ст тт ув
М хи. и піл да ЩО ІпУуб МК Мщі пе Щи ціх лм фіш о тю ох Тім вдає Мі
Зам ее ЗО ВолотшА М Мат жзЮ ББе о Хоах біт же Бе о Бішж Бамопіх 2х Б Ка щі їх Шу МЕ Щур су. т аз сдроиту Що ит ПЮЛОВ САМ ил Темою дкалє їде Ку Ма щБІМ ста УЖЕ ЖК. Аха мч еп Ввха Хв Жту же сту
ЗЕ Ух що зизаж ЗЕ дію люкс Й Тора Сус Шк дух сені и ПИ Ти ти ту ю
Тут ММ Мпз оМиет дар тів те шуй Мех ем тих ТК ОБКу Жук їх ТИ шк чл за де їх ТТ ТВ 2 шу ма ллдею леви Сук Моє їду їде їі йду Хек Ту ща оту йо Хі пз іме дат леви ТУук Мис жа їн 44 шщшж ХУКХ Ту Щет Мет Мет Ка пи Зх те їй ск их гла їн М спжем Це Сбате Ах Ту лаку фу о МУК птрух Ті Хот ех
ПЕЖО мжтл МТМ ЗУ Мих ХА йСЯ ІМ ДУ КЛАЖО ЮК ж УМ ЗКУ дико мли тах чих С ше А пОАТЕ мії ху бу тм ше дну ВА таму ж ві ії сла МЕТ кет (ДР оо б
Мшш мМ Ж са вах ух ха декм МАЙ ОСМАСЮ ХУМ Оу Вам ЖК ЗАТ лю КУМ
Ух «ху зх їх хх хе пдт ожив тут Ше Жіш балом па штна Падло іх кт Жах і паж у пвх лиш Тут ШІ ХХ За одЕВ ба оЇце Мал осїу ЖжЕро жа Бец кіЖ пПеЮ х3а 55 145 дж ж МЕХ МД Би бук ХБУ тю буроМмую Ту Бех Мів щіу бе о Ніх з 5 В НК зл
АЖ пе хх АХ піз у Дій тпк міфу КІН мех тм вт БеБ МЕТ ЖАКА Ме хщМ КО Віз
Че чт хх ї1К5 А ел тих жо Ух «ля Пе Сток отит Хелси От. Мггу у Іі х ьо щх
ТВХожуш барв оса же птю Муз ех жа ецпожцв КВУ фу Дай Мжо Жіз «аг «па да 132 хх Не
Гу Ж пах м 2314 Дах пу чеках каси Мф Зх лихах 0 фаду тити ха оЖХук пед схема дае пе є їм) Бої ТК фо сту Би фо см УщУ зт спати
ХУ ММ ТЕ рух лі им іх Журавка до сим т уми кл Му УДО Мем лу
ТІМАЙ ТАЖ ЖУК АЖ АЖ ТЕО В Вал о туу Вам ОКтУх щі дМмй о Хза тих пу рН пт тт
ХІЙ 215 шк М мав оКжо Тут БжОо БароМ КхО Бер отр о БеЕ тт ДЕЙ ОН. Бу км Бе 25 т пк, Ул дк ж МК ЯКІ пит Мем Вк боатум чаю (114: Ло ду фони В лу пи Фурий.: Хеино «Пиух.
Кйж Єбж Ме ши Кп цім мап они МК дай мам Туш ЖАВ Кт. Ха Ех
БЕ ти ва
Хату їм Ці блідо тм Ме т Ді тт ми гум СЕН Там. диму мом ми
Зароі у іє ідм) ТКХ ШУ ПА їі шо Бе ТвЕ фена Те» Туд бух м де пе хм ХА Щл тихих ЗМ і пу бра сем тами (МУ СІМ фа Лем Ух АК З Лех СТ
Му Бе о Біж МУ Жхр опе бе КБ лі Вшм Тхв 8не Уві Бже Тут АВ
ЖК ХО ЕХ тд Щи щамі БК бю жа а УМ Во и М бі Із М м Мія дю
Кал А АНІ ЩЕ ЖЕО ХМ А МІМХ БМ для УїмЕ Само Ма св ди: зах ек па
КОЖ ОКХ ями кЕе тТвЕ о Мшо Бер пав тую ит Мів ша МУ У шОСКМт тм мл пух АЖ
ПКУ Зо ЗІ За хіх о йіх юю сему ті: овен слуг томах ду. «123; МИчиЄ СКМ, «і шину Ці ті
Мамо жо СУМ тіФ и ТОЧ Шум КП об У ЖиФ о Ххй Бу ж НЛО жи тк У чл
ЗК 338 НУ
ТЕМІ я ее пожеж ог МИЛЬ ТУ тя ДЮ сло М з тки пи ж
Ше Ніж же Хі сій ШИ Те НІЖ УАХ цем іш Ні Тут Су пек лез
ЗО ТИХ ЗЕ тім шЖжи п прак Мк МОХ пи КИ їх Пи Ек у тіФфоїж Ж Ти іш вто газ Ту Азд ДВ Атоа Еко Біла дек Ми БІ іш о Муйх ую У чив щи ЩЕ с ги ти М: о сухує му Хе Ффже прє (0133 ни Ме: ижах боях мо б
Ма муж Бжи Ма Тут Ма ет аж Мой охід Веп Мах тТтроБжа деко Бем
Ж хв зи мертх Федосов пере (шо ля сш зм бух 211: хх щи 03 ах їжроБцеа Пед оКчЕш Ажц пехослУж ПМб от ЖЖ вав ЗаУ джМ о лио мів МУпХ зе КУ ЗХ Ай тих ТА Оу йос о ті ОЙ я їх. Пк Ця тю ди ШТ ім Мет Фе дво дЕВ їіжш ЕВ де Су дух ві ВУ Ва Мк ші бує їх дай ях
М То М «их Ох «ЕХ Іл милу ли
УХА АТО ОТ
СУ БтІЮнід пасив
УХАи о тІСния ТНК Тх
БАНЯ т ему Ох акшепом Кущ ихчиМ мушу ща ям судить ради у мМ - дві сумую митті ел псМмМа у мезги Уфа МОВ М есте в члюх тщтчмхвІи зезлічиЗпИ си пали Мі хтів тии пута и У мими яз ау тт емо и аж ТМ узи ТИХ три Люгугуитисии З
ЧУЖИМИ Лифар стажистом заз сосили алое роюм лади їіхх я я ду Ме с сті цлахшеомимм лоУшмОМисУМ сушимо ж пат спри птива чКсухситВ Ух гогУжа км КдиВ ех мех тд капа цадат ротора чксукцвле кЗоЧКоца пиву русел пай пами дич мамамик Коси жа кити пилу У ук ми, ЗІ «птах сити гзискаеаМу ошумктивлє ува пита п жур Уж риси УК лики каф утит уми пак их и пойижттих мури йишх чипоклтаюи фот чапля шко ак сечу юМуУ пе ги дімвочнчк пн мире о Кс у тчитнутих іспиту поийттткох заслузі спек ааттз сприцКцих КИ іш КІМ єди жа де КІ Кв аю М Ки ВМ ви зп шу умжпс апьскеЕтЦ пилирух от Колтисжцае пок римо бохо що слимак хочем Ж сю хх Ж мо суч хч и тити щі ствжемнужацц сталим слтлускоа палатах попи сальса па махи онмм Укр А свв З фе Мих жи оливи пвх Мк дО сах шУулкЯ виплати зшита плачу тлипруїтлимуча ааплляшеи ТУ тишлижиК глас Кит пустки зб сжиции БЕК су чееких т сБСТИЕЦКЯ Млесусшото песни ласо пЕштжтівеа список иє ай
МІ шІМІ залак Км кеВ века хокеИие санок свати зи зом ущики цалсазаорукиа птитуючицУт Мпа УУАХ ли Ущ плетена. ТМ
Іл ті ТЕ КК МИ УМІВ фе хКи Жвемевогим Ук нк и здо
СКпИиИиМ ККУ дими КИ ІК ПИ МЦІНХАИ, ТЕ а а НС НК ИН НН ІКих ши алом пп Емуат УлУуЗеецит МаслимУЦМиКУХ ЗКУ СУ пилу юкк ТУКА зиппошал ее и пет Ви домі миУ КЕНЕ КІМУуВ фаєр гмУх дити. влпсасаеух хору узусскиу ззосзостоци ТО Ууєтиць хапоцнУ тм умулелауєт МУК сем вом сумом МІУ кпк дим кл паппалатттх зІжгИтеивих золоте ах запросив ЗшопЧасвих запо ЖЖ питосдлхов суда опи па дет кукі Вр зу зплодийцив тіжроааваЗ узи сяЗа жусстодиша шок ойвисха по опихх МД хату и ех ММ ІМК хо КК му В м диню Ккал сю зи.
ХАПАТИ ТЯ ЖИТНІ офісом п шосслишкх тлума х Ще дина Я див вих Химия Умов ПхОБаголмх Мих мая зхін шритиуд ув шо лах КТК УХ сВсоксамт ЗИ атв скат мах пк линии пихи Фіг Фахові МІМамим ВХ Кс вх зу олацичихх соках твоакомисо ажоблої вузкосатов тако Ех пупок вики МІзИ да МУКИ МО лен Мити зл аішустсчув зскциаатю мити уєс адислвоу ищлишну МЕТА стук що
КАМИ стю
КАМ КІХ ших Хілл
МАО Жаном чик ие сх хх г. паж ххІЖ Білий пабі «апп
Тл ее те ЗИ З и, пси ях лою Тім лам І ТІ шим Ку
МУ ОСеКт був дл тес Ущ ВК ОМу теж Се іш ілМм) хх мах шОЖ ЛЮ : с, т т : ле КЕ Ай т ме ал фея ще сих й» й ца ція ще тигм ша т тод пух Тк о Уді хз Дт Шеж лір дай Ма йів о ЗЕ ББ5 пр ШИ СХ бух
ХО МУ п ту діх КЗ жЖету ЧЖКуУ ух фс йщУу паї ба їх Ж бує дю бе Ме
УМУ АТ ХМ МЕ ТМ гля у ВИ Ул й Му ха Жти що ЖЖ ТІ
За за зх
У я хо ск Ех хх с - «ех, г - с з с жи ті їдма Ме йгш Ти ші Туз Цой їмщ сечу ха Що шдає
Май овмуЖ миро дат о їАЙМИ Ух сф ав о КАК ДУМ ПОЗ шу ЖУМмУ хх ли Чч шеХ чи те 5 пи Я щО
Т:Ж» п Удех х Ж дою и ДЖ зм до Тем Оу бих п жи Жиху чЖмозаА мул соку Мшлолят тут чи ха слмр дж лі ЗМ Ба дк ВХ
ТМ то х З
Щі лій дідо лини МАЛО угАк тах ри лен Ул зх ад бле лм доку Ух хат лішд Мід жук жа жу Бмм ХВ о тУх Ху Мже СИ сх МА Да ОК
А рю З
ЗМрхя лих бог пек ЩІ й ту ше Вл М шах слуг и же и
Же зу тор оКит Мі Дів уже жу Ака сук чаї типа о цпек її Щщах душ зи У зх
Мт ша 112
Фу хх У ти Лк о сМчанму СХ фо фохууу ТЗ у УК жу ми СИК я ЩЕ ІМю ОМ жит ФУ Ба о пуу ді тв хів ішжи ПАЖ Зі Би Сх пі Щі пежх міх 1135 їхг ккх,
Ко їх ХХ ху; иг Ху бах пи о жу ДЯ дод я ВМ хм ше уч хи ма
Жнсе Жеу Ашхуи ужк Пежо їту Ма Ави бар о ЖБХ УМ лю Хдрю о жжМ ідм) ВІ ятчгх хх хх жо МУ мВ
Фі тоди САМ ФММ УК ую ім їх Муми: Моях тляхх М хз ох не жу
Жак іїви ах Мох ЗІ Бо дух Бце Кех Тр о цтх Кре Зех пі хв хух ід: 155 це сш ідх ї15п НЯ й пк мив МУ ЛІВ ТК ОСаЖ Щі Мет ЇВ лу: дев Ме Хі Бврароздаі ТЖИ зх 175 зх
ТУтух АХ КЕ ди юю іх фл МУ. ло піч жук ща сту мкВ а : ; гу пох ЩО БМ лу І рив міш сх т ри ЖУК ж Ка
УМХ ля Мая сх шалі Бі Був см зе міш са ад ТПУ пал оди міш здтх «их, зах
НЕ дл у доми Щ ба ЩІ теє ех чх іа Жим п си: Во Лак Ти ВИ водив піз піц ШМо ТВх бус хх тую Жах ех БМе ді без їв те ух, пд стук,
ХХ йМИ Ох піїах теку фас ФТІ гі и Тихі: боже зх мо бах з сВМм да Мі Сну пуху пМмоАт фо сі МУ Беможнет фе» Жух їдчн лав о ЖМе двтпобБая» жТму Му ях Ух р
КАМ шо ЖЖ
Тр. их Пд йебрах 1 ки ЗК дл Люсеех Жду Що У т Жим Ам Мих Те
ХеАЖЬ КАХ ЖЕД ЖЖ СХ ба пак був шМВ бМиМм о бузЗ шу пам ожуХ фтТу мо чук ою ек зай паз хм хх мА
ЗЕ п и их Пх од КО о НО о Скажи ху у, Їх їм «уж пе ле Зто ЗУ Бл дар обу Буд дар о Хжж гр о жуж хх УЖ ід БУХ хх ОО ЯМУ
Ту та тк тич М хо Же тк и, Сх жк и МИ кчю Ох,
Лйлш їжа сіу І.Б па АЗИ їЖМо Бе отих бек У Ту ХВО Аза тех бух жд. их с
ІВ ШО ж
З ум ух ДЕ пкую їбЄе тм пи прю жу їге біт ее п СО ФЕ
ТВі дона цім тю» їх Ко ТМХ ма Гше5 тв оттр о Кце бух Вс ТЕО с кг «Ку, ж ж ЯКЕ там Мило м Ми емах Лохеєю ЗЕМ пах 1 лу. їЦеку Злх ФІ пл оте Дому шишМм о жщоМ ВлМм палю ТУЮ спи жа ЄпаА УА жму ГКс о МОм о шіц пай ХОВХ жу
НУ х З ше Міка ХМ и: бю Ме ких ФУБУ Ла сб, Ск сирних ДК Хо МИ как мех тел стос Ми тус о жр о Аха спо мл уже о не тис ЯХа Муз му
А п ЗІЗ ЗЖЕ полою фу ию ЩО хо тк ЖД му думу 35 ХУ БІ и Ж бух А ст МіІх КЕ да ав ліз тат ХАз о йлю ба Зі Бе ху Ще фепй ШУ бі ВМа КтуУ пек дл як
А Я ил
Ніз Дж біс ТІ мл ТпкЕ Ні бзі см ній ція ее ца Мк да ті
Ба лм ше лов пам ЖпУу йЙХя Уза СЕМ Мав Ома тут аа ЗУ ЛУ ЖАЄ
У х45 ЗУ ем в в и Но НА ЧА
Вус ле Ту НКлй Вів Ата Пі» Дія ТрА За Су Тв Мей Буш чай Мах слу ше Ух маш ши Між тую МЕЧ ові жпх лм ОМ оМит Му жу Май ет їде ТлЕ сек «ЖЕ ке и ЧТ ВН тр ие слутю дим ее сум біт ми и сії; щи ців бе Мі дал осв жи о тчжЖ о огур ом с-еК о СУух ЩАЛОЖВИ ЖК о СМс смх МЕ беропі» УА ХУ
ВХ 185 ЗЕ г
МО КУМ ач хх Фтллх Пса: Лютут ск чи не Зокеию Тх пе
Му Би обр бх» Су Вп йетл УВУ Пам чаї Ку Бто бух ар ТВ
Зх 12 515 ув СЕ чіт хжрмк СУБ «шо пд «жі дик ж АТЛЕТИКИ ЮВЄ ДИВИЛАаАЛ ких т
ЩО 7 шефи. п песик диву Бех Ми ек умамх ким м, її
ВУМмУЦИМИЦИ СНИ КМЦОИ ПМ АЮХ МеССММИЦят пит уиаи поштАя М косі муинтух лечо ивиа сера еп мии спите цуца тки амАВ У
СЕСПИЦЮТОВІ лечо Зеров са чпоици сейрунімУ Зевсом іЕТУ проса учи зе ицих чис цає пече оицице здецуилц ТО ил х «ле ІМК ет х СУДІ УКЛ, Є ї х пкш УК й ї чЧаплалаа сосок спувошпимих тазичивцма бавузиКиха сао цих УМ
УФ КИТИ Мом ВИК мини их ТИЛИВ АЮ КЕКВ пкт КО ап жуи Іл лИИ рати ІАЦ ЗиЗЦслца ЧИ мх «ММ попасти Худ ес ою мм мв сот ФОМА Кемер пах копит шоласух осо шоссе Коші сопе У пику КМУ Ми Кум ую пе «ери еу х поттх сти щИМ Хщутолкуа шумери Кози их лили х сир иуи ЩО пИляЯАлІХ плевпагимо» Фони нЕсх сопишаплиу хупусивии поту ах пух ХВ Ирина У зем пеки мух мат стопи состав сук сосок соссапошоани соц є замору оу ТЯ еВ лес МКМ иУ им Кр овоиЖ Вих м ДУМУ ФЕВ ИМВІ ЖК ВМЕУК Іти ді тлитЕ т уєрим сом КТ песо у попалашиих висту КІ плтчушуц мурал ос спблизешио але укуи пита чмуУ: дуету ми УМО скора айви цисти Малешиихміщ ІМ хеУйщщ До щИ ла жиму щити уи цидпизужев папки спіда уми хх «едикт БІК иІ щи лу ІЗИАВ ЮК КОМ Ко іму и пуд пай зесжунрсс хоудастесчви путч ус пику сух дидлстжину пуд ои ТЕ
МОРЕ и М узи мури. слуху Моитигилит птах у тю пдТх чтщетупосзат сирі цІ соми поко сапу шаеЧео башт оа зу зАбЗУЗМ см Беж узи ее Кути ЖК дути и «жи ие Ж КК Вих с вотгуссцции тіше соа пас літі с Кара дооЧи пла жекВиу За сеанс апезаноцх розі вес плплюшщиоя папку за
Чума ПИ лиКОму ро уХутц лютує плисти й патсутси ТЕ шшсміуузатлея Уа уу пушок тици тВеуЮоИтИпий першим попу БУМ пити Цими ТКУ ср ходу ин ее жагу тд
ТММУМОМІТХ ря шарм Сени их чудфавиває Уучеумцямий свшепкццу Ми
ЗМ пегут І ФММ м ЕК и КК жим дану вик поли, апа сстну срок соочусантече хуспамиких жусосийнлля подала ЖИ поклик у Мі УдяцяМ Меч ИееКг сидите КМУ ее В ех тд
МАЛИМ ширму х щИсосииюу лусцтятитех асп чол итх «М
ЖК КМ ІМ КИ уиси К і ПДК жит пику ин ди тех зро пожобхв зола м щееалпихуе аццеілах перлину папа ІМИТХ екс КЕ, смт кт дм Му Ми ем де ммс ІЗМОД хуя зем и ошукло сзивитаусв тазові пациахкзоу щицбпаяуую пижмо ВВ даси я покщрх даси ци ат по ОКХ пи її
АТМ ОМ ЖКУ
«УМ КН. те Пежо ФМ вл тує ПИШУ Маю ХМК ТИ «Тих жи Милиці тм МОЛ. шШзихи ЩІ укланих М КшИІЕМЕИХХ пАлжшНКиОхя ТМІЮлЛ лих б дюехишмизщи В о вощиинзх ЇшврНдН Кі хамий ж метом сив бом даишвк обоє КК я с зкобултх пдухацаєтьмів тгопцаадаттх гогостацах сесозстеай сце даа пе пу жив КМИН ву ІМК МК кіно вику ІМК дух Упц
УДУХМТМ ТУТ МИ УУТу шоу шток МЕТИ шМмУХадИах Мих фл ухулуииик мя ФММ Ви ІМК Ме МК Ме хі ме жд КК ж мов хну
УЛИСОДАИТК У Ву У ЮУММУИКУ КО АКОТ ши ових УшАЩЦАЛИОМХ чИЧ ідпут лави КВ дід ММ ФМІфБІМУ вки Мох Ук що Ум и чах целухнНУХЧ Маки ю мпапцидлилю пуща тлмкт ДеМАУАУ ВИТ ЗКУ ЦИ У ях пд к ки ФСК ді ІМК ЕММА В и хек патини зп паипхУ шу списи М СсацихКУм МУК М вМщУЦИУХ ММ МАА КУ У сукук тив яти Км ФММ Вт п (Мф ужисмиу Пмада дать Ми ик здо іїиуалатеучу ссацацтуМ спос клізуз сити» гопаацалико уппцлиушиму ЗЕ максі єки й Вилка КВУ я с БІМмуУиЬ що пава Щшл думу МОм ШУ ОюВОХ УЩЦМмчюсУм шу лоти ит куМ ТА дедюусдудийтитит т УЖ рити ин кутики лами Ви мазут ю кт Воду Ки що скла Е пийтиастоя ХО КузИи щупищечучс щу плиБоце хапаКоскоу Ку
УК Клесів им мм ще ие ук тики тм кВ ЖК му ех 35 шУусштлзуУши пі тасщех пор дфуиуо сучас мули мишу Ту засекщи пла Етком пло смажоуліцес пазами Метали иа ЩІ тхори плазахтів птоурт Коза сеслатачос баовклсво Бптевооца що
Фк ккд Пієвщемм сжиомерт сВАММ таит зви Всю мох рт ЩІ тех хлод сплата впливи: пепалтокчос пишу ВлшЕОЗеКЕИт ВО скткспищЕце сита ющУ пекли суток пес охииа паузи му
УКХ ИІМ суп. Та и ВІ СІМКИ МЛ ИМЯ СИ КЕ Ж сук УсМІДЖ Там ВТМ ев усщ домо КХ Блум За
Ул уснІху Таз щИ пли писку апетит окОх. Мапи ЕеКУ зихилиМІМи Кс пИикмІи рум шІМицк зм тимці ск мкм иі УК зх
ЛЕК КУКИВ НМУ ж НЕВЖЕ Ц ПЕЖО МИКУЖЕХА шах р чн и в НИ ВАК ЧИ Шеинх зисумуции туту юшшкУуми пику мим мм ХИ ТИКИ ИУ щи «му КІ МИ
НН и В НЯ дже счуташсдаца пусзосакца шуму посух пуукумикц ур тим чЧешхвусхиайци чечшеЗиихци лес умю слу ицихлу служ шиМмимХх сли Куумуа ІМишУ азаСхдиичмт меми семи му и соки ли Дю уюа шому мим паж хо У пихи МКУ Суди одучую акт МАВ сити ВК зх пили А МІЦНІЙ СИ ИВИК ж щоби ам соуси ХУ ца Х Ми
Джоан М им МК ІКДММТВ МО ФК доку меш Кі о п. аклодктику суха сугоайтьову стопах жесскшатля розаопламгу І седана Пущі ІМЗО уВ с МІД Маму ис МАТ вим ЗУ пусту то умислу постави щиадолацтии пуцувалним матку ХМ
МЕ КЕоНм Ії ЩІК Мате щи подумки пи А уУ кеитеми пою тес чи тиж сщоох пий пилиаоузо Заццлошьсу метали Купили ХМ лм КІМК. ТИМ У Бо митом и Ж си ВОМ коки УК шишки ЙмИиВІКТтТЖ хх поши уИУЄмрОМ далеку диму уми УК АМУМ
Дошки ккіхмиУв см лук,
Ваши щит апа 55
Ап Ох
АХА ЖЕ шкі кум «ля Вих г х Містєесттсмлах кі їх хи Містожолав щеЗа вд «Мних
Ма о бим Шу Шусх Тл САУ дух, ЩІ юю шує Му Шум лу Кум. пух ам
Мах о Муж Кри Куй СУК ТБу АвробаУ дЕи йих Зза То вх Ззш Туа Б 1 З. ї5 15
ЗМ Ус. Ще гай лу их КЛ, пи и І. Фелеи Т САНОК И
Ж ОМ ЖЖ мух ЗБжЖ ЗЕ да Бім ож Мем Беш АХа НУ УЗИ два Пт
Ту Ат лог жк дім покім Мало щомті Тім ско СКМ обме іч паз Тр юю б моб лю пік
ХМмЖ о АТВ фусю жало жи їм Му ТМЕ Мем піз Вт Мо сі їм Ма ліх я ах Я зАУю шм ПІрхЮ Ли що му 1 ду и 131.1 бах ую троси дедемм ЗЕ
ХВу їпж хуй ХУБХ ву їтроуві АтУ ах о Адже УА Мід Отут Миші
М Мп о че дош» Фпхує Іди МА діжух Тулі ил дп ЗМО 15У ФММЩАЮ Чі ЖИМ З ше М
АХБЖОЛАЖИ ЦИМ суп маш БУС ЗДУ же МЖК А ФМ КТМБО СКУ ХО ММ АК
І пу ук сх
Кх т ТЕ КУ доми Ху їі Мои ших ха жк Ку хю АОМ Фохлух КК ун Мина С ож
ЗвпотвЕ Су ги пер о дХа ТБЕ пу Мха ЖКе Пух ЗАЗ ЖМме НА Мас АКЗ
ЗЕ - Зк шт о ібеп мм ліж тт МЕжа Мш Змі Ме Лід фе) бо Бек Бо Вт вх рих пох, КН ід Ме Мш дтш бах баб За баз ба ДІЯ Бк Ме бо Зам Авво рив шк кру вх ту Км жи хо ві уп Ма си їду лайм диму с их ІУудо бдехо фугу Ши
Аїа вк Ха ти Вха піз ідМвобум дос щу бу вдо БВЕ Буз ЖК палю
І Мк 135 тт се Мі ми ло бек дж їли тами ти Ма Тіма ж Мк при ЩІ
ХХе тв Хіз Маші) Бу» отут дей кзу їв пух Мей ба Хі тм бив обі»
ХА Іо ї5х ха т Сак хх її ви ри І Локк пут їх 1 Уха й шою ЛІ мем біт Тит дія мезо ому ТУ Між ЩЕ Тує бро ЇМо Хі Аія Шеко ут сих си жк
Ж ХЕ МТ ук лу Щі ла би Биз міс Дім ут їм Щі ху Мат и пів йІіЦ
Хна Жух ШОУ ля Кв Бие паж Аіж дит пея у Жхо Хакоякий Навої
Уцпх А с:
АТ КН мЕО
Що ша щі мли Жуйхо о гмих тв пі йог тщі беж са дхо Бу ус їй
Ем ХиЗму Мт о єМмМме хм ЗИМ ЇБу сх сю ХО Ух ВА АшО Мже Би мим
АТХ ІМ ЩО т зо Мат см глум сф фрах 91 Жимлі фе Мк їм 2: Я МИМО писк
Ми оМхя Ме тлу Пув ру БВе о Зау Ха Мах ХВл дат Шу Зі Мах бле їй пох сли Й хо жом ЖИ пт гм Му Що цк, бо яю Мі А уз даних ЧУДО хи Я дя ПІ
КЕ ослів М внук дяк мух ту стат АЖ МК МАУ тЧ жУМм мУуй хі АТ МАЙ чек за Ух зах пай в Ух ж ас Мих дам где) пли Зйу Єр фут да Ма: дідо дриУ Му чи п Кл ав оМеї Акроїдо Би їй ТВ то дій Уві Віз Баа об дви тн Біг зак шо пуд ях шлю ВВ соти йху зує ЩУХІ ШжмУх Щури (1 Мох дет за стух під се ти:
За ти дви ваз Б Бо Вл з1іу Бпе Зах Ата іа Тор Ах дк Гхкх хм ХУ шт
Пози хх люду. ск Мер Идуло ух ХААСЮ ю б пикх жди ху У ях мжпольа тр о Хпх жи УаА БХс ЗА ХвХ пе ох Зм» ум УМ пав ОА пт с хх, «ІМ шиИ КЕ
ШУМ Ле ютах І тири МЕ. ЗОМ ух ет 11-10 Ша й Мк пох па тїкрохів ХУЮК Ха меч Віз Бус Бк Зфй УМ Мз ВуЧ БУВ БЖ дл ще «жу ба г шле ха Я біжу лах бі мл Шоу уч Мих лама (МАТ Хм Шшл Лащ Зим о аж дур ом,
Кук ши хи баз о шшх Уж Мет іа УВІ ЗУ Ха ХА Ж бу ст Аа пух зх че зртте пил ЗАМ ШК тим тла юю хи. ги М ою ж хи щу ж Фе Ли Тс Ся зх же
УВА Хже мук ша ла ТВК шШУу ушЖи ше їтроБжо уві йіш їх Тсротже и Тх люд Я
ПИ пе їх
Із СИМ ЛУ с ех СКУ Тих ВД Ті а фбиех зму ше ЩИТ Щі Сх
Ба охнх ЕМ іт ВЕ ТтЮ Зі Віа тТУЄ Мах Тех Ждшжа Бпе ЛІ» Уа Ка пдТю ав тухді п її лю
Щпеї боже де Міф тТвх ВІ їх ет шЖі чали йо Вих Зх Щі їх шакохпх пе ощів тпх Ма їм КжЖе УМ ОЗаХ Мат дат дих Му ця м дух В Дж пуге Слежу МАТ да тс щім ах миє пів Же паї йхм уча ли пуп лах шмх ХЕ ХЗВА ЛЖИ МЖЖ Між УЩА МИ мл жпХУ хва АЖ МЛ ЛЯ КТМ Чех зх чик ох кт ЖИх ЩЕ пох ре Ме Щи Мило міх ох М п ми Жиші бодхю сих 0 лю тих ох жу тут МАХ Зав ЖЕ мяз Ме КУ ХЖК Хе Дам обмв шли ах ХА
КУ Іо 335 щ
Мом М'оє тумих Ме ТУ ДУ ля зи ДМЄ Ук Вих У печі І цк щує
Бі оніз їі Бце оби йеромМех Бус шу Се го шайа Броз ша Май дет дк, дв хх, щих речнУ ІЗ дачі йамі шлях їм бедо цМ щодо їни фох св о Зах Ж ат Тих ліхА вчтшодта ке Ха же Ки гів Бум фе Те ших Мем Ла КУ Му Ж ак ЖИ де тд: й ж см ФУ Ма сут їла тА Не прмо ху шко дя Мат їм ши ост Уже Туд ЗІУ Ва тТжмобйув БВ ЛмЕЖ ББа ЗБ Ай о цич Бзвоїов кА г ЗЕ
Жах мах мА ЕЕ ТЕЖ ТУЮ ЗІ дав ПІ Був Бі ШУМ БУ Мі КІВ га Ах5 Дт
М 12 ЕК ки ха «хай 15 хх ща ух яІ ук хх хяХ «Міли спори жемхємчуті мМ В і ер яйо1юж Мар уммММмидех ис «ап аБЦБоаовоу авасоссца суши шт сс спаду салом сксс ще їсососп сло парку цаиц слини мО алко їнсжтувучлу авацичалтКи дО
ЕХ ЖИ среткорвай мови лом уюа сланкі попало К
ЧУса ЕОМ се уже Воси асо ссуки пусто аадосуусих Зп уВКтК В й короантека афожеосак сучас оз кущий божу ла пушиня Зк
Зассослагую пунк ай сферу од Макочцусо вала уусчоВ папок Ку ДкНх
ЖЕКи атидт соках аусВозопоЗ зле оки песня пики чи колота зчїхшхинуа зош ин патідлниві вужа вчижии Зо засди «38 тири оютЕЦИй теща щімит дому цни: коахчецосо фев ои ій спи зстозесигя зовочесвих хоопвоавтота п тоесвозВ пкКоБІоИои ШЕ щицидатату гуски орлом оиоааке уко єтвх леза метих ІК щира чазуІпиаая стутмлисий зом соши кФеоціоцех пУчоса у ТЖ швщааслайлти уссзосдасих Чишки зипопсиаав зникали ув пи пику спусойахле (вра є закису туу Куцпжацайи липа кап чпахілаткх зп спсопоспУсуаз сиспоцуаашУ шоп еху пази ПКУ пишручіоцо усосписріиву сито укч спо ЗоспоцУюя злсипадатту З паотраантаюу поет пекло сао наккє содлудуве сасоаакю ЗИ
ЧИ ПЛЕИХ, ЗедннУМУ осо спи, ФщиЧпицалу АІС КИ аа шухасть бойтрофах сетер обла саєто зок ах сабо еуеи ща бул свос типо цх попатахс сппщаляьих «сатляацях сааллицннки їлОЄ превтеЧумц поссастшиї даху стпавтетос зайтлацюмх попити їдо почую тосту юшпялеех пт пилки пера а їжи зивчусиащиє баатмоусосвя ську вату) собаче палаци іже ххссуцаас) пуху ви усу кдии дечозшмае пкт це ладтзуиику 1455 таро ецти пе іха5 жию їх хЕМх я ххх ЗИ
ХК Ще КчЧНУ пет цевитТАвь. «СИХ»
СИЛІ Жоден ситвмауковаих вВідешнвтуЗ рамка заитукщиама для шкимрмнУії сжКТЕОСМУЙИ 1 Цсмадкауемх пУудесаууєти к ришлицах «Де і зиЧучучуус подали уучя фуда пластах сбаасекоя пастка МІ тсовсттово Косова ни Бюдовсуои (Ус укуВикоа баоавоцча алко их Не
МЛ лам КМУ ою УМ кити пилу ет тити -йих
ЯКУ ИКЦЯ плити. ПКТХ сшсмиВ пложоТосоа плаває Коди їщкО ес хуІОСЮщ дм поли Тов Мет ки коду ко пах пеувуселуя прут сперму куо плесо сс мав папа чує М діди пд мми тя туту лет фирма ле ме чих
ПУХ тТтТля й МІУ ХКІ палко піхілунои Паші ах, чих ТКУ пика МмУ КИ тт КИиДдО п Ім ИМУ ПУУК КІВ пер ити о ВК еВ их що
ЧЖЕМИУУНИТИ ЕХ Х ТИВ МУЛ КАКИИО Ух ХУнхлатуах силах алое Ус спигммУтах ек міммУ чем кеди сук Кн пожити ду
ММУуЦииУИтат себе Мт ухрай плас диф лихах ФІН ХУ заднхауі шк ЕМ ий я «ее з хек и мхокахк Мем км 3: чтрУиєсвалух муусцився чула а ану жоцяеЕ прита ипй шип есюкЦо їв тему ІМИУ ОМ МК КІМНУЮ ет у Кі люди имя кп их ек ек дл
УМУДЧНИМТ ПІКИ отя пЕКЮИЙ ормепулцтує пл юи Кит тшорили У стеми пф мимті ее вІмУК дек нхфчх Види ВЕК пт
УМЕМКУа т пе УуАЦт І ЗИ У ТИВ муху пряму емо ух. Га
МК ЛІКАТІТХ ЕІ КИ КИДУМИд МА ІУДИ ИЦ ПІКУ УХХ ХИИ ин В НН НН ж тиша аци сревослишецт босу Зоукоициал сш ухимти мишу Ж тсетааиваха счоЗошалий озислакулУ зиосумИипици соду сщийиа сиру мца їм пийцпалцалтьв ссср У чию мух спав й ЗЕ УХ п» пихи ув лю щити жізум ПИЛ «КЛІ дУчИЙ НДІ МВ Мука пий спалила чо піМО сплив опти ЗОЛИ ВІМИОХХ диму Ту МИ
КМ ожужа рю жу мух л Ух пеки х су охи з пе ати з М пах зику фстйастацаї зееоВвкскс папспиоась опо ляои КООПаутх УЗ кед СКК мих пек К Осад ом паче км еалУд му, пихи
КкЕпщоатаци ступив ловуи сли сало павсторутух баклавоуух АПиВ самок ис пи вок ех Мак Ме Ул Н хи иММуЕ "пи пМлВКИШОНМУ. щити х сппевашуИл зопалу чем ску щу У Му АТАК сикою ве ох Кк «КУ Коло услУИ. ЩІ МУ КТ ММ УЛ, тї«4й плиту Еа липи «селптллшамию тлплалачтеи апллллаЕщІ ЧУМИ иу Ач
НИТКИ БІЛКИ ЗОВ Х пли уе и тИВА ПИ КТИКУШІЮХ. Мат АВ пон ин и НК А НА ук одні милу ик их доку патутутухкм зонти шсу спати пове тушее суху паз лусуху КК галери цем УК мі сублееткрщі ЗУК ЖК кс УВК итет коми ВО Коти ха 38
УшУхзузуми полину ууви чплпшишушии цеси ЦусшчоМмеи Луки АлеМ лемеша фтдоиск кі зу Е ие не ктєие УВК ичцеМм ПАМ КК В домом липу ПУСК тую МЛК ММ о АКА КК ше вивих М М игиттстии фреттєки спини М М гри зилии, НМ изититгоеиВи жуки Тих звоссокасті ах поестнсоїди Іс сову Вар їди ис ици ГК еп шюиа хижі КИ тут ЖОВ чи «пи тю помити шик БЕ МИ кю іш мем му хатку
ЖАВ СКК КЧшКИИИМЕ АДАМ ИЙ скда ях
КЕ ЩЕ
Мем о тесх щі и МЕ саме т КТ ту иа Мухи башт іх гм ро ВшУ
ЩВиях слух АК МИЛЬ ЖМХ тих Самому таж пед ді лих мех із ДЕМО ЗІ М
А хх АТ КН децосуУ доми ум ие дордує Щек сб сохух ТУ. Лю мли Я тугу Мк ах дсщотицк шех Пе ех шах Пех хе мих ЗАЗ сі шум ТВА Бтга бл ха
ЩО шх ха кх У т тих сах мс мит ші па ци дет ла ім о Бцещш бод ви ух щлл МУ те тах Заж Ме щЬу бе Зі джровіж ЗВУ Шу Мка ТЕ ЖуЗ хжа АК
В п Зх дик ЖІ тих за Мету ім Ждим ДЖ У там Мар бу І іх ГА з хи
Зах чаї ТВ Во тТхв отв Буз Щі їли Бо БО Ів Лів Кіа Ві» Ку щі цк чи по УХ 5 «Че спи У Ма ще уи ЛюЩО мує ЖИ МІ: сту ЩА ХУ зх пу ка їй отив лай овуз дтс уже ха отае Хуе ЗБ ожЕе УВІ Би тує Ме Уві ми ЗА а зт
Ко КІ їх що тки ди М)еь Дух ММ Бжоз піз щі п І ї1м бек вух мит Збед чоу. тик омпр о мих з»ух мимо хуруУ щем см З БУВ КА ЩИХ ЩИХ мм су шк сут, ух а Зо З пи тик іс ДІВ ШЕ Вій тик оо Мах Шо Ту ла міці Мат сборе ди хаМмохпж су мі ОджЕРр МА жит ФУ Блю Муца жа ПЧ лу Мат СУК А їла «те їх шк кл АХ
Шуєе їдутю Умтдо ді х о ту им ДУ тм: ІМ Рош зи ух Ці їдемо у га мя дж фуд лІЖ Ми жи Аа зимі Лід я Змі ЖИ 3 Бжи га Хе «їх. БЕК улик; їх 178 КАТЕ пе ща щі маги ес ММ: шіжух Ух ше ля дюмдух «6. АТХ МОВО о хх У
ВероБла Віз тцу ВК Бій Бо Хі ЗІ Вхр оса АІіВ Мет Ме цБцтх Зх «лих -чк пак
Ех ї75 1550
Яке щі і люиєю Мтмт сто жи. бр ЛИХ лу УК: (МЛ МАО МІ тм Мати яиет тах хе ошжує МА дет мм М Же ра А ж МИТ ХМ УМ МАТ т, Зх Кх, ЗзЩщл хх то А МУ ее ук: й очи Щи йо Ж щока Же жд ста охо У Хіщ ще мм бя-с ох Ліз ситш БА йдіш Ту БК ЖЕ АХ Вас де Ва 0 МЕ сте хх Ка їх
М ХТ її ів мі й ХМ хім Тих Му Ма сло дуть бе ій МИ До с М
Віл ом шу ЖжВаЖх Ві оси Мих БЕЗ ХВ ж ТЕ ОМ УА МІВ ОШаЖ і їн ТЕ5 ЕяЗ чі хх Муки Меюю ох Фичиє КМщ 00 а щу лу М Му и ма міх
Жах жі Кжи Пехосбух Б Ме о біу йхя Баш бук ШОЖ жи УМ Св щі
Ж у З Оу ХО їх дек Урх,
ККУ Ми АЮ парам міх пі рим їпуєЄ бах сМре схе щі 4 те Бачу дм дих ди шоу ЩА ПАТ КМ м МА. БЦцт мах НМ КшОСМИТ ЇЖЕЮ МИ Муй и
Щщїх ТК пий тла ох Ук. вл м Моз Щі ФМ ли сти У «з Ши и Щит М.
Міома вха Ме дов вда МІУ Бе о Суу шжи Ха дек дет ОПХж зв Має тал тах пили пт
КЕ хи шу йЗИ
Згровихз Бма Мах Бо паза їде Мій пів аа ТВ БО ШУМ мул УЖ дж
А жо ХХХ
Ша ще Меп дом титру Йостх Мі. Ма мм іх МІ дім М Мсшо дфмух М
Піх с мес АЕЮВ Мт бар тва тТЬвУ тгтО їБк сві дід Кне Меш о Ами пх тт лм сум п ШКО ХІМ діщш ил м М и и НН НН дух пт
ТД Ж ЖД деАЛО МІ тех МУ Ер ОшУ МБО ст пу сука тром мг ша Ко жд
КИ жи ХК там мл ДЛ хати ЧИреє. Да М ферм МАЕ Микує суч жує Мі (лу Хш й пити шт вад оХЕш ЖЕ оБОмх Жеі то о Хад оче Ша БАЖ МК Ущо ска Ж
ІЗИ ша ЗО мини ет дію має Міо хна Мі й се хх йо з ду дл ї ди
Жуне Кум Жи МБе ві іше Віз Вт дк) лами МЕа Мем» Лют А Бую Де
ЗЕ дід пек т 7 ккия
ТЕГУ Ми Мт ЖЖУ змо «лх 73 Мі дід межу Мих шк; Має хі Ма ОСИ там ще ли міх хиш ший мам оМмАЛ о УКІх Слух ТУБШ ЖЦя послом Фо жяиА Ла МИ УЖ МІВ а МеЗУ ВХ ма тяж що хи М ІК кує мук Му її Молодому су сх ла дю ую ТАТ ШОМУ В Уу СКК МАО ЖЖ БО МАВ ЛеКЖ Жук у ху ща У в
Зо Вл хід сем Же сту До дл ке мо мує Ми Ж Ва п УА кп лів вха ма ЖЕ КМ Біх шат МажЖ МЕ отбут Ме пе Аа пій сів
З ІВИ ЗЕ:
Фан ЛЗижує Тлюю Мих Че І МО га, се Де У Форам, и Дт ха Ми и их дет олих беж дта тик Ніл їде Ашр ої ЗВ Бий дес йзЗроБуш Бах хи пу а 35 їхєбех й МЖІ Хоб ка ох Мк дю М. чу їм хи Ххяхяч о Меюжи Лх
Мах ХАТУ лі Мтсч Жук Між Уа Бек Кк Тих ХХ» Ар ЇЗе веб о Бес дай
КУ Зо БЕ ну тич, пек ММАОТО худу хеиту тауму Мо І де Зх йо сах а жк ж
ВжтьмеА кі КМ хв тТХЮр ої м: хі Тук Мей ААЖИ ПУБ МУ ЖК ОКА
ЗУ СЯ Ії ши Мі жЖищ: фах (ре; мі» дю кс судам птах Зх (Дах ізн МІ дк се назоваз шМ Баш Мал дамо Мас оду Кб МжО шал оКдо Ма оЗах не алі ле пути
З ЗИ Яат масу щит штці а ри Би ДА зиг блужо бчоуч ща лм Кап фмк їли щі
Му Ми щ шими МАМ Мал ТИФ Ай мул цу ку (ЗИ Бищ ол МУ их хх али дл 1.
БУ т ах ті На Жму бхує ті дл бек. те Вл лм ВКМ м ту то ВХ м меж мМ Ху Ух МАУ лмй Х яд уз мУдо хм МЕ шт сУЮтх хеБи ДЕЙ УЕ га і 5 чі Ша сою Вл. тут ЖК Мі Ві пе пес пп йхш мЖі б дв Бех жі шу їжк Маля туг жк хві Вів пуф бе ЩШ3Мповил УЖ мух Пеж Бух зх ий ат вих
СУК чий аз ВЩЕ
Феу Вл штсу мМ поих їз
МАК МЕ
ЧИТ о Бах тла Пазутупориспиточи іцдбікакатиїх
АЖ Пикш ужити ДДТ КУМА КОТУ «ах КЗ
Му соха б пт с ФЛ тю щу Дим сдаме и іш дж Мом худ позу ж
Жук еВ ща хм СХТА МОМ ть ги: ЖЖМ ОСА Даж рт ОожпХ лі ОМ ЛАЄ ї К. ХЕ її я тм мує ШУЄЦИУ (ТУ йодом ТК У - ххх ха тк г ятружх їмо тис Щеро пам бтш й За Ага Ата пос піз дев Заі душ БМ) пе оду пх хх
У І о
З Ії лаз ща г ден йо тихе хи Ж. Ми У Кт ік мок
Мат жа мо нуВ Ма по шпо пла ЗЕ ММ Віа Буш ЖЖ Кп Міз Ато БЖ
Зк ах сх ах 8 45 тпм мимо мм сю 13 Ме ДУМ 13 хи юка МВ МА уже Ж А ТІ я
ТУуХожь УЖ о МАЖ СТІ М ЩШшОУЖХ МАЛ ОМ жу що УЖА бах дов ЖЕБе ха Над
Ме З п
Ух мол юю лтюхи лю. Мк Ул УМ ху ЖЖ хом бах Ж ко лк хх
ХУсоФЬу пиж Хях Ма Хе Мур Бут ВХа Хенх Ваходаз ТМ Шту Аза ми шо У т: ща дл щоспмуи У Мб ожекця до ЛУфІ. ЕП у (34 мо для Ми ом бля док чума жИихо см т ЖММЕ БУ ЗАМ гЦмО май Бл Аа ХК Лшм бум вав оси зи Чех Ве
Хо Ул Тум Мт лю та Ме Фуко Дюех Мужик Фу т би их
Му два пвМ обі» щМіш ЦЕ ЕІ щоб Вк Мир оАМа ЗУБ о ТМ АхМа уже ххх яоту «их їх
Км ХПІ Ме п ї-- я КТ пох сп ІЖЕНи. ЩО о Фу пи ун т Тіз Жах
УжО ец пла ач Ж Мо А дир оМл о йіз ба ХК ОДуЧ Бхи БІЗ їлд ххх тп их,
Кк кам Ух
Прі деки фу: ЩІ ли фірм МАМ То Шету бах Ж Вллу Моя шо Ж Чет дих
ШІ йка о Вяим ОсБу Кпо МБ зу Ки З Сус дав З УМ йха тус дп
Й Бих ЕМ ші т. ЄМ к чі. М М ТА Ім тах бе ум тк МІ Мох кю 4 бек тю
ЖБи Ффля СМ дещо Вл склеює ЖКАЙ ул їх АЖ ШК ух Бе Мох. бжЕ
АХ ЛДУ Ух У чобіт міт ЕМО дл сту ах А раму р сим в їн Мо фік Ме да ма ту УКХ Мах пек пах Ма»а жа таз Худ АТ Пуш М жпа оБВАу
Ух МУ: т дя ока ги голу лоді щої тт жу Мо фліу гу су жом пн Мк тм УК дай мар мух му салю Уа. МИ БА хі МД ША ЗАУ. ХОБЖ пе леж сем ХХ
КИ Жт їз іл» Адм тля Маму г: даху що Меню СТ тізот; ох Дома Имя юз зх лу УКХ дАУ ам Оодив ху сжв ОАЕ БУВ й В ОА опа Ою За тьх дув пу ХО ОХ ушц хх тп хЖо -Е хх
ІЛЮ галі 1 уж ду хі Мо МО сту хм іє фак лом по їдх х лі Беца вза пою дет шЖ Бош о Має Стро Алое Ват Меч ла деп Було дія ті Зх, МІ мл: дл є ши. (І хи М дя лох хе Мито Мо ті ау Же сту
ВЕ АТА ХМ Бдту Бім іже Хві АТО Наш обр Мих бер ем йду» МЛ ОТцХ сутух пд сет т ди ких От. ши пеню Кл МхІ міх дих пах буєзх ню М Ал ж Ко йому луєть Жемех Ху
УЖ АЮ ХЖОІ ФМ ЖИ МЖех УМ ТИЖ Мі м ІДУ ЗИ одшин вх тус ди 45 ШТ М
ПУ Шк Мешко бом б ту» ід фут їди ша роз су Труб та ре
ПХУ Міст Зеу тк тТук Тероіши Вже цем ша ВІЗ Ттробих БМе лів Бету ди я й мМ КОХ я ті тм Кат ШІ Тих Ма їм їм Ід Жухх Мне їпух Мне їжи й ої
ВІ тат Вжт ШУМ їхнх Ма бом оБеч Бипо Хто Му База Юзи Ма ОБУ пт; ТА Зх щх ЩЕ зах сен стоянка До Тая жена мл г пис Ку ЕІ шля їх: зМучху їж хх
ТУЖА СХЕМА смУх МУ ЖЖ УМУУ ур СКЖй МАМА ЖД ЗИМ ХЖОМЬ СКЖТ МЕ Ух хх п й алі мі р ою ми Ам жі Кім Ж. Ж лумо Млю ЗУМ пу ЖК Ух
МАХ ла М ЖО ХА ЛА Оу ДОК ОЛдтМ Ол АЖ МУМХ МАО ТЦ Ба Ж лю люк чій зх ц оолюжкиу щщ х І УК жк Вій мат йт Щи Же і жала іЦамє З Ал й хи смт мат хкму їж АІд ще пів ск Ж Бі ша Бай кзи дія Хек ЗеБу тТКВОМАХ ЗХ лук. суху ях
ЗЕ М я ші стмшо Сех ма Жтм йла із Бе оцю бри беж Мій Ввк Мік їн для
Ку муМмохук их УТ Мляа Буш упо паЕ Хм ще ваз о їву ме об Кз
Уггл ЕН чл
КИ З ЛІ ожжА МЕ Хіж бро бля Віз Сем опе їхросах Лечо Тук ва Хей дер хх 5 ПЕ ссрух Мет с хх Улах хм о фоутх Пеюм о (1 пі хи ттчуку Мхі хиб кт Хм хг падотлтнк аж АИ о Що БаК БТ пЕлос щу Еш жі бо ХА о ДЕц М.
Чу КК. Уг ати В ММ ппіхи чут їні Вк ха Мін ожчнма їла жіх ій фшм Жим шт Мине Мф й пух ту Мао Ах пжи Зід ді ха Мі Нік о бем жав Бл Мех МЕ Бк
ХПІ Зх ух шт я ЕХ ЛУ М тка їм. Що Моє Ми. Мі т дж км дозу Мис ЗМО що МКш В л т
ШМлоУтТиВ йЕч ож КЗ ам уп ММ БІО Мт КБУ тА ха МФ АК УЖ кл г дух
КУАЯ я зї5 тоди Сбюк нт Фолух ул км тил Мід Жим Ми ик тла домо пек ти
Нут ЖЖ АЗИ БбЕмобле Буш жи Ул мат хво тТух МІВ бСаж піз тїтвоМух
ЗЕ УЖЕ та м пк от пт и пер йо А КІМ Си Ел із бе Іа міх ка тво ої ПХУ М сво ВЕУ ЗЖИ ТАКОМУ пу МАХ ОТУую Бех УВА Мі
ІХ ГА Ал пі нів Мед щЩію пев Ве ді иЖж ЖИ мм пеХоХ мук ло млуд ху пух, етики ешіпйе їх «лі па
МОНУ хі шйи ПНИ пит НИ
КМТ ери мур ит ух ЗИ т. леви КжлавівиіІіхВ пев чини 1 прбожеоя Кум ІУКеиию ки ую Кг; среди ут ВІК п апа т сусп сома опи ним косе ко сб мих Ок тиж ф мети КІМ УЮ М Шхуна М ДМК ожини б дич су падав стцокатикх песадитасс посадила ЗИ х Ка ИпИийиХ їх) ис етику Діви иг В пи кі уууутииєк иси ит очі музужужиов ит АК иуиюитя них чщЩх
Фу лшлмцик мишу штуку Ци ую ур у АТМ КИ АЗУ шосремсизУ ще жи жд Ким ом ихвсиви в хх ух В из стем пива дими Зах тхоФитХоо пиВийасоОФу пола сучсв ск х лоз плпадатувоу симптоми ХМ кв лам к вищ пики К фону Ки зп хижа зачати о септик зи чи ки овВ ЦИ 1 оо ро УТОМИ ХМ с КІ ВЕК УМ МИ ЗК ден я, сих ПЕ шуми ДУ УАщУ ФУТ ТЕФДАИ пл ОТ ЖК ТХАкІ плати п с : диму г копи д алтея ситим соки То УмІВИК сф У ши
ХшИПЕЛИ МО полтава сптишелви ступНУкиВ дух СТИК їх : - «й кеЕсоВостив подало бач ороцто сапвичеуох лови коКЕ пхйцининаий зап
БЕСУуЖениМму УА ДН ЯЮЦУ шпал ух пух «ним с Н ; пкт пекли Тих ХЕ У ЧЕ гул, пики пами векм ух чистим луку є дослічІчущи пайсеюууме спайок сабо па. зКизеовист хижих пусті ПУХ млину сш «а зшізусвоот ахухудумосм поруч уци цип еЕхие попи сапки
Еко дик зуосви кс КМ дела Коленновх папа «о чичИищциц зслазчусиое зіасусуки дош еЕмМм ЖІМтТЦиИшюх пару З щі . сх
ОсОЖммй петасирики З цпиМи Тими шари жи пгт жамикИ зх з позаслссцса зсзусуста ее ици сльоличяуми поса ппллташуги
Я Я -к зах кісахогасе Вест ссоои ехК у пл вимомй Мале х пет О 288 юс поааси Стос осцци Зі сукосики поулувиуоик пал омум стппивасууу у я х 4 хо фах юю залиті пий дупи пек силоси йи дл ктй уми савлухстци вай исюрассм песо шевсзоники азасучишсва килусиюсоя салату
Івищлившай ха щ плода дач подав пТлх 334 титан дже симх сел и соуси плати чих Чиї
КОЮ щі пили
АБ ТКУ Х
ХМ МНЕ.
Ти лих хиМа шУучна паслЕдовність
КИ ах пі скекнци опти дим хо ки мий п жених ух пІМЕН З ІМТ КІмтІмю МІД шим йпчихунМх Да ЗепциеиИмА ї хм слюкмо х септики смтоцецх м гелем ма С шіцці
МудиМілМІцщи слух ТТ ЕННОНдМИхМ ОО ТМ МОВАХ ТЕМИ ма МО ЛАСКА 7 с. ж т ско х хх їди моумах фотмуніснаймих Фе екамі сезитн
АОЖТАУХКАХ фУМиНАа Са ИММиМ ЖИТА ВХІ: БОШ М чай шх с зх имокчх, ше биків микоми ЗК хІМм КУДИ дп акуааалуту соожойитли СИХ ЦИтах ФО Е Кут. ХК ПКУ ЛЕТИ : по с ї па ик «ІМК ек міІММ и х т ака сочипавих дику єюоє сабуипалує «шару у ушу хх ее Фати ку их сви м НН я їди
ХИСУтеЧИЕМІ ку ц МУМУТУЮЩАЮ МАУС МТЮТ. «МАТИ МЕТИ ре ; птн бордо сІМУКЯ В ах С ИШОМУМКВИ: сим 248
Ок лнуу ЩрссиКакУу щепаллоца см укахз «свааиаУуКу сиптдулиуу ТАК клала звойтитав постити соку птппввалав САКЕ зпо щу цих зЗшчУпимийек ммиМлуєдиня мими и мУЦИиМУ т КМУ ки силою пливли стату ока Капоте лих За пли ссстлоатеє спиоппшлошм;ф сиза щасті упора З х долу еко жакнтУмкко З тутІстоЗа дозвляскта Павлов садах ца балади Кайлежшако її ксіттсудзц пово павлютЕЧоЄ сваалізица балі жвне Батсбшаки с х ще я - сода икЕ вл крстзойпкца слані сув плавзкКощеИа ака пак аскох сайти їд2
ДЕшуиемКІА ФпяУмуу ух соку факахееит пихОоусюємих сх укх ші го я пе КАСКИ Зо ммКЦ ха чести й тя коте латок кщо папа скамсксуаа заклик оц ха
ФУШМУ І тп МУ ЛИКУ сел еКХ. лишити ЧО зкизсрщо адплокзетис із Е попав Сб еия пайку Ки зичу ппплишущи уча пила мт пп ИхА 3 с. : г : кеди ке тму інки мм іде вомимй й "рема ІМ стек ках тк МЖК Кк пе ха ОД Ж ІА
ЧЕукентМи заду и пок ККеК дети орки полтуюа дети тус се пикава ватку дазееишищ песик Зам
Мити ЖК У ШИМИ СУК М АНА КИМ М ДУМ ЕМ КАТ ПИ М У ї- таоатланли КЕсхоодици Оу Беасекх «порцій діло лЕна сема х ІІ то айтт КЕ Еооди Кс асовх сроцвотоки двіссоства сосозий З
Ку : и пад длиултиии помах пекаря взевоплсвля шосЕиКВИсх пастка пай один УухОоу лЦІ шУлАаЦИХх ЛЕНИНА ХО ТЦ) ЖК М ї золи: пе цІМИУЮ У пк х дя хасАКАляу оса сови аМя
Зі ле кам пк схажо ух кА а
МЕ щпІлих леми Беж пижх «КУ. МЕ. лих МИ ЩЦх мат МО ке ши. Жим. п чт Мишко ВЗ (и Мф муку м А
Меаху Фа бле маіз іп о Бтоз Бзш ах Вхз Ме АМа ба М о пумй ХуК МІВ ї х хх хол
Вл тла ему Міщ ши МАТ й пи Мі лі І Ха МЕТ хо и щі: меду бл аж Ам ФА шо ах їм ЄСЖОа паз 15 Кп пех ХАІ СЮМмХ Бе шу т пх за
ХМ хе З г ут ему щі» току Лиш Є Ж ще Кік МІ Зиухх томи Дюк, Ті) щих
Мт су ХхЕЖОу їх» леж ККО ше ДеЖ мах Мая ТВ Ху у йею Бец Бу дл о с навмохах Зі ет жо ЖМу то фям; БіФ о Бвм о севл дека ішдоа Ба тує КВЖ
МЕ п їз під жі хі щем шу КОХ тд барі Чехи дуліу Здиж щ ОпЕ дж ДУ вх
Вха хи За іх пох ФУ Пмлх Хв Тут Ву Му Уві гпе Бе Ату лох дх т ЧЕ п
М ТЕ ГУ п зм: лу: 1 с: є ля фета Іхх Тит: Жах лини Кі Жах ще Хо В я хв. Бу БУ п Ваш о жжо Бах мес Хе Вже З са Мих Ми АкаоСНІтї дл Б ЗЕ умо Ми дини Тім Ро М ух на НА НН бои долля Ми
ТЕЛ. Ук. ЖЖМІ МУМІЄ жу ММ ЗВшу іа У ЖК ОУЖУ МУШ о УтТМ МмЖШ ММ ж ях УКХ зх
МІУ КУ їх пек шт ШК лек ЗА ДУ Жде су ши НМ Си ех МАЛ тут й лек хх
ТуК жів Віа Худ жі вшапобее Тут бах Же ТтрошіУ Ве Аза Ту дах їх Ул лях ххх їжи не тус дім щі» пе «ту Ух Юм тн у тло ех ки Ки Му ЛШ МІ пиу. тт Аза Ма ХВ дід Ме Бі буз Уа Яле Тр оду БМ Тух Май йдеш 1 1.15, зі
М КУ ж ож М яю Му Фк ЖК: ДИКО сих СМ МИ. од кра кош білих ТМ ит до
Буш ІВ Жук ам ша ше Варождж лик биху Мшл Має їм бух БАХ дам їм: А ін 1КО
Ялосїкен її-. М аж Мн тім щи і ках ца Мі ші зу буре Ж фі. Ем
УАОСМЖИХ ЗАТ ЖК шиВЖ Тех ХА Напоаю жУух Б ОМА ж плАК дАхшО ЕНИХ зах тик Чек
ІБ о ААУ
Ти и Сжтьжю Ж теух Зак т ре йтюхи М о дам, «ЛИС ММ, Ту. Що хи
Му Хше ЛлюЕ ТтроМиЖ Лі Тк Та мів Кі Бже Зху БІУ БЕЮ біз тТух та до «ай
ВжМ Ах Кл пром одех Віз дім імп йхм де бут мі ні МУ без маг бух тиме стук
УЛЕЮЕХ ІМК ТАЖ АХ ім Ми Же КО жу ж. МУ Хйх лих КО КЖХ ТМ ОхУУК
ЖК як ХУ туш о ре о Жшт Мі, щі Мах би: их їх дах Її бою ст умо дсиу їх уд отнЕ жасп май лі жало мех Жуо Ше Важ За ти пу Би Дія мий дл зле мл шю п. пп
Зах стаж Лех ла. М фут сан: бодух М Кі му У Защє фДУ, угоду
Бук ої те ХАш Еш Ве лух іди БЖ ЗБ: МабощіЗз' меш ва Пій ка
Іще ап лети де
ЖЕ ши жи то пе ще Та ТІ ти й, МИ. ї» ее ния о С а НА НК
Кп мал пе суха демо ота ліз мах Ху щем оКема Хек о жсу ПО Ззу БО пет ТЛУКЕ з її ЗІ х5і
Зі. фею їж ХМ ТІВ ДАО Б т тні З ех ми Мк ДА САТ М жому
КЖМокКкО СУ Ти БМ ВХ ми ім імез ЗО Мах Хук Му ЗХ ХУ»Х хац
ЗЕ зах ти
У У Ли
Іоюух ДАВ Зх; ХУ Ло ом мо ЖІН є Сію. Ми Те М 31 ж ДУМ и ох пвМмотвх Деми іще АЖ БА Ожпе УЖ тр Мах Му Му Між ВХ ех Мух шу, ий ув ях ШІ ВЕ
ЖИ МА ух їх Вха ех бух фує ІД з мещ ха АХ ря ува
ХЕ ХВ ем Ж ле хліхк Біпск ую енд до сті
ТК жуУЛрМующо Ума есдих «пп 17 тах. ФРІ: ЩИХ ЛЮ: т щи Хіт КІ М и мое и: ТВ лу М мех біз Епе Аа пін о Бто цем Узі дів Мах Віз Ша пу ЗМ о тТуК сх ї З ЩІ її пів фіє Фо да УВІ Зах Від вто Мі їі Бва беж дії ТИХ баройет
ІВ п Що
Я мо мих Уа схе ту жи ху Мі Шеху. Мхх Ві хх отлух дам Ук ех тд му Стр їх У. ЯК МО сУКИ АЖ ФА пеХ КК АКЯ ДОВЖ муж миро зем) тгуг п МИ х баки а п мех Фк ти бус яз Ха Самі Шу бю, Єв Ма стук Кох -ед УМ шу Зх то БА Сус Бщм лає демо шах Зі сем ха тух БЦ
Пп ХЕ щИ лов ле до с» ху 0» тема Шах сю де їли МІ прах их бач ух їх За о хад ау шжж о Плу дмжм хдА Ху АК мтс ЖІ шца Бо пучки х их 7 Зх пт
ШЕ Бо ТВ ЩО
Зах Кз ат. Фу дже; жи Лк Ти Жук Уго жа лах. Ві ча Був пу мів Ат Бде тжмпФе Баба МУш БУ йха Бас Мк п олія сне их що ЧЕ та ДЮ ли го Лк іх лою «и тах бе ж шк Тих ЖИишЖО т аУх Хх. дат стві Жж вав лав біу веб пех зи Худ мех Шу бео бух їм Хо
БАКУ МУ МЕ то ТИ: ЩИТ: йбхуше МИТО йод сф ук стем Фішм ІМ сами ФІМхи ДУдим 4 о Муд М
УЖЕ и дов Жут жду ДАЖЦ Муй дух шу Ти ТХш о щМу Вшт жа ЖМм Хй як п чтх
Ки їхЕ їх пу дл п тЬд СІЙ КМУ Щі БЕ паї тіш бе їїм шко Семко Ма Жак турожха м хв» со м Між Був ва іш Жкр ода Жора Худо Малі Бах ча р: кт їх :дх їж тех А ЖЖ маса ТП па Зв отв ім: ЗІ Мат їм: ши Му Мі дам зх пе пл Ех
МАЙ хл їп5 І
Мао щит гм тм шиєю бХмм бух Ці мило лк штх Мій ока Сир Срок ха йзЗаОБІЖ УК ЖМя ЛШ цей ХОМ ЖЕ ОКХ МІш ЧУ дяЖ Бі ойих
ТБ М ї175 лм т Хежу. сушу Же яру. пу. и М ВЛ пн «и 0 ях феод Що ху шах ів о УдуЄ ТК Хе ХА ТБ ту Бів о щіш Ки обу ЩІ пВровіз тух лах ях «пи
ЩИХ КУ ї55
Но пам щіх дім ої ялм фатум ЖІ Фе ді (ух ЩУВ беж Кр сб
МИ ОТПЖА Малою см? ск ЖетО ЖЖ жі мий Жива о ссІх МмилОжЖХ Мт о хЖх 135 аа ших пече ІМА: Му ДТ чо МЕТО Маму фкжи лум хх ху: жо Ж Зими же їм Кт Му Ага вх Хві пшм Бай Мур бер аб ух їТпх Буд ДАКЦ ЛжЕ ет т ц во пАМ чпхп мож пу тю ою ем Кл ди у У щі Мито стру, Мито Ук жи и их ІМК їже Мем ТГК оОжжЖи пл Ах тує Моз о тцу іє Меу ФІ оМмеМ Муз ій гле з скчх луг зай
ЛИ. ж ХУ ши
Ух ти фам Зм жом ШИ лю то УХиИ дюни Жим хм люк й им ни Тис
Се Мат бай фе о ед ШУ о лід Ма бух їм їм с ши Щаж лу
Я Ки пт сви ШУМ 1 їх Ко ОА ро их ТолУ зма тк чую аю М п тус о бти Був МУ Ті й біб їжи Мей УБі уз) Жук УС УВІ ШВх усу
ХУЙ ВУ хи сот 1 ума зд: спяує ск Ми ув пі міх дл пи лох
Ми М ідУд 0 б» Вал БР тУук Люк Му Бод пав Віл АЛ ВВА Ух пл кВ у
ПУХ те ху
УЮ ле
АУМІВ МИ
«ЛУБІлУ 107
ЖК їх тлюрш НЕ пжжш ДЕК ж уж ут КУМ
Уолт та жатоо» ХВ шеІМлИИттЮхИ ПК ЛИ ие мив: СИ КЛІІКУВІВУЮВ сицИФИ ді. Зуе КИМ У ях
МЖИЩИМмулиух пчирхумдима ле у ми фу МКУ Ел ри Су пе пихйохіеме их попа Код мадик ем Кп ИВіУМ: ех пет мя ун счатисвих заз спопка Сезпайццад шими: чеччзооппови жпузсипшу Ма дис схвс фсопдосисо мч» папи схеми Кцпоповоких пд зсппдаслияшст спадом а бос юу п паЕМИту пхущоеомимах Супи МТМ пуд ММи МІВ У ух см Ки спори маки За зх оюмоу сослая суїсевижу сецесадиня зодзосоаиаа кс аая а сретвинихУ ММК сМохи о Кукул Моск: пех ке зи поцпіетих сипсдосот иа фоатлеодилт Фасполовоа є оапих ПЕ
І КТИШНЕМ КУЛЬ ТИХ Олю МЕ МАТВІЯ РЕЗЛЦИТИМтН ах сек ЩІ: дим ту ПДВ ик мМ УК ІМ чуюжи КМУ хи її птпУлУдчиВМ шили шує шипа м шоу шцмуиттут Ах
МУТНІ, пилки пінку тм пацюки чит окт іжидичимі см че пчи :35 плудшев» апалекоци прозі пло піежоецо ому яц я
ТЕЗЕ ІМ ШОМУ лук ие свати юю и фут их жд
Уч сусчцо алла поппліассо спис х пил шжеску фі сшучси то уки и ку ик ит ких Коси сек КК І Же зжтижу тити ЩІ
ВЕМИЖАИИВ МУ и пз ПОЛО ПВ ИИМІ ВИПИВ шо
СЕЛІ МКК милими ую описи кт жк ми ечяжМоМмімІМИМь у ми ших скасоване оса пилусаманя бла: агижусикоми сироту ЩІ пепсглчкнтм секту семи пен пече чмамУ ск кНІМИ булу меси оо усомімуІй сжч мил дво иа сином це дичини ТИ жали важ цім СМАК кеуючих. коп вити Кн НЯ зи
ХОДІ па ушоАЦЦтН Если мииу пухчітайна сушочимои шушцкух Тих пули вишу нии списав мееиаитох паща прис пл бХаомееонє вистциалеу оадисайаиа скрутатия фо ватх кових пу ква Же МК МИ макітри Мих ЦІМ путч заг зрос олсв пи Ууходи пУтОоросии пасом сис сзица псуцииии КК скік ек думі имвух ек ил о кеВ у сикелтик и и, п чечешоциму: зтіжососпит зФозочптплаз зиосива узи судомами же
Мом бики сус емаий тиме жу жав ее зу ее ем яна песо лужехоасих посдчиваек зачосовасо птсоцокає ЗУ нумиду ца в в НН НН опеитту тик ум дм.
ТА иди КОЛАМИ КМИН ТІМ УС МІАК Х сапки вежу ТК галки зиск микопвох клею Вуха осел зії тапитлайих зсоваатие паса х хаспопбиса фусоповох подо оу 1145 пн жити кМломдиаІжлю ха в дм иа СУД В уми Зах апа стсиццінио слюди мовакх длежацев оо сиа пущу пицйх Бе пилок ся си МУКУ хМмІМІМУЮВ ВОМ мем МмІт М пи мі и дивини 1
ПОЗИ ЗМММИУХ МАСОВИМ МОСУ РК МАЩАИТ ТИХ КОШТИ промощихнимі жи спадали ушсвитав ТЕ «ВХ з я Зк
ХЕ ДАЛМ їх о жк хихи ЕХ «п шщжуцлна пІМТІ ЦИ ЗМІДКек «ЕЛ
УмАух доми КИ ОІВ МгсІдмии ВАК, ЗЕУре мих х тат си хх пе МО УК ях
УИйлОМ жодамсмтумміваМмиа ВАШИХ пиМмил амжУУВаМнЯ щи шМлпрУАї КаМІУХА ххІіїх Що пемдлтУМ хо гуми МмоОМи меті 1 зжіиа ОБ о десжмеураши жо шосмлимих івсрака М сим 15 пек сефедн мм ух им ар Сеул ух. жа ж м Кмин, шк пох пкассиулука цолатлустух слива чоюм опиптишух сталяталех соди яко. и перу тях сатин о стаття сю палями лопух ХИТ р о НА па и м и ПУ пити С рижики хи пу утиск стека пилу стУлатинюнх топили АТМ слині Кс сти кКиКе хи сем имк пав икки а
ОКОМ У І СУКА ІМК Кет апа хтУиуя МЕТУ слух МУ рамами и оче фо жені Боком ува мю ТІ ких Б
Шум тшистих шле шуУмУ ЛИТІ НЕК ПУ шумких папку тичних ОКХ ект ис иМвю УЖ Ким хек міх схе ие феЖВ встик У сум. їЗуууссиви апшуссуесищиа пцлевсеу плечем а ЗИМ ПУПКА КУ свичмуУтиМх песо пи ууИи пики ЗКУ пилу и
Когут жи Мф ючи, рег тринижкия форерт нти ОВК вселити пи китатих лох.
Хллодтциий втабЕсшрсосо проц анна ЗЕ сзосга ЗАЧ уЦИ що тщасостАли вт ивИМие вс удлотеИих лаошжохопай асесХомох пиши й дпАг вплповацумх суускгзса осух рай узи чесв пути прошу пМмМ
СОДИ ДОМИХ ММК ЦОАТ ЛУЛУЦКАНИ ЛИЧКО ВУХАХ тк иа ши
ІМ «Имя сімю КК ІКТ ОТЖЕ ЗМ ІМ мое кола пити
МИТИ Фууусико ща ОКО Цлмя сх м т Драми МАМ дім В Ех ГТД Хм Кум МКУ В сини ФІ ВК Ж МТУ ум ик чай ха орх Іотайцело етиці сота сет полу п пек щи хи шинки: ІД МЕ Ак ом ВУ их пап
МНК КУ жекти пла маси тии су ФувМек аспидиагтише уст п
УК схему. СУДОКУ Кер опи У М ув дити Мети тугих дл. чеше Усні пп сопе липа соку ПУ «іх М ло і жи см ПУБ у ж Жук пи ди пет тосдуютиих пила цуку бло ппппозажух Харлан у спппавамі го Па «СТВОМ ТММ пу уки здо щцему пожеж мі фе ле чести вових сисузухУхК сдапистзвен аппдииуи еп иЧу па хом МУЄІМУКИМ ди тУК щих фолисв и сус Мих ит сххжВітк их ХК ит ЗІмМ уж уаултя ситу с дало смачних полу уто зп шеиих МЕ
Карти дози вуєци пепткаиити ВА КиЦещ фл мащее пичасвихм «хай
ШшИлрущаик палицю питеМмтеаюНтМт МАЮ УК ТШХ А ХЛУ ФЛАУ ї 2. : ск мих «ух звспвгоцого салат пса о лази войї паски вя плашки а СІ
НМТ УСЦИуИ сома пишу мУути ММК иХКс смт ТИКИ СИХ ; ; дамо «кет сек тд ук тет одИи Мзаивито пчооззооуки квасу ций плас жи 122 зу ика плити МЦИи пу МУХтуИ злелвеки оц аКлОХшиИ пПитемюло С - : сад
МЕЖІ диму «ЛЬ и
АЖІММ ЧИ яд ВУХ УПЮ пд Малу дзЗихла я за
ШАХ а с, Фати Ку дю М. переросли у. Ме осн й я їбанту Жечу уми щіщ лох м: Мт» Ме ЛУБЩр ОВ по ук сих ТУЮ да да бас о тЕуо шилОоткьх щшМ
У х зу ТЕ : міш М: У ую Ж жен іх Щі Ні дуети бохо тою Міс бл Мал ім опа о віо ма Вер ТМ бто бай біц не фох» мух Му З демо Уад
Й - За шт їх За шо Ж пів опт йо дк; Мій Туї дхов Мві тлу дай пбе кі пех БЖ Мід БЕХ
Мхпомау ЗМ ож вла тут ер хлА то май Мб жАМОПУуВ ОБУ пог зе г хх
Зх я ли
Урі Пити хоч ТУ їзеа діш Зх іп ді піє тву ду Мій му дв від
МАЖ Ку Вуж хо АХ УЖ ЗАМ ОА МУ УМХ ЖИ МА ТТ ЖИМ ОМАВ у це що тек Буз іп Ба оці зі Ду Мих діа пек ВМід дхм пев Мис їм) Тур
ЖК Му МА Бо піз Узі Да Зеу Аа Було БІ КІ Ммжл ГУ му
ПУ ле п за -Іх х їх ї дід т хх - г. 2 фоні из що с У - пла ї «до свахи хи бо: Щи Ми: прі Ло: ее дим пам ех тд з їжш пі УЖ шиж Бр йо дип міх пек жи Ес шах АБУ то УДА МОЗ їж пАУ ЖУК аж БО МО Ди ТА: де да цк лх Б ЗХ д с х Мі йде ха, аз тХ м то М яю ті ШО ЗУ ух она ва Хе Віз дао Бпе обі Щи Бім ть -ЗЖШОШАТК зУжМ лами. йля ЗІ 7 зу 7 й СЯ мк МКУ ММ пл пу ЩІ ск; и Мих ти жа ДІЇ Зх Дому ск пе ких Мр машомиц кп БАЗ гум пек мм Буг МАТ ж ка шуХ ЛАГО п БІВ ха хіх зщи ТЕ хх МКУ хх чт їх їх мат жк па щі пу ла ім ід Жлею студ ле Міс хм
Уява зе йха у меж о Удх Віз ЧУжЖ МАВ Аз фжм Ха Тур ох Ду Тух ча аг пшМ
М 15 їй сим, зма морю хх ща тео Хм 2: Ж дало я (ху чт пот Ук
Тпх Сье Дів щі хів іа Мет мезо ЗБу ЗЕ) Жах За шу Ву пух Су 145 І 155 їди м 1 Ух шк бух їм Мер о міх с Що ж Біло змхуУє Штох Ук Сью мМлє йди За ціх
Ме лм Меу меж пух У ПУуж Біш тет Цех Мей отит БАЖ Вам ХКа ща» їдж Ха ут пе ди дп біл ба пий ді да ме теє и пам ги пошу М
БМ дхи дто За лі Ід очі Лія сСуюш ТУЮ ЗУ щи іх Ши ФУу Ме ий дих їжи
Фіз сил хе ЩА «аж Чому ра Ми: (лах Пій Дату Міщ Ма м М Мк жу заї ші ха де Тур ку пзд ом Нд дай БУ Мав Ваш АТа ТВХ ТО хх п пе
ЛИХ А лм йпжю Фк Ли, 12, ок дини ХК ж хг поши Я. Му пет гм і віх
МАТ ЩЖМ сжие Ухжх МІ ВИХ зло Мр им) мЕМОУМИ Зо сто пп ох» ДІ ха Ук -сху хм шах МІУ што ші пі бат 1121 щімо їли Ша жнщ їпУє миє іх Мк Уцех міх тТиФОолджшм МАХ ЖК М Веш лю же ЗшИ хх муж ши МЕ Алою мял Му лЛл лют ех ло. пед хІММ Ух ж хЖУКМ
Зір Тому ет МошУ 0 хУ юю сти. фоюмхя Хм. ШуД с жеч ЛУЇ Чу Ду Ми Туз
Тхробво пох мех ша ба» Буш МшМм Бе МУш Бут хі Тих УБА Хм цей тах тт ех п Це ХлУЦ пух их такі тях шу «Мо стамую бак болі Щі Зк дує Шо м МеАЮ бом аз
Мах ож дек іт ХкОа ск о їем Ух жа Ні Хе Ас нов мех Феи алу
Ж Сх г пд о МА моху Ме Фі їж КІ бо Тен 231 У шо Мих пу т
Мих Муз Кіх Тут бар ій іш Біл Мах Зез о сму За Ве туру шу Бех ах хво ХНУ дин ФУ1 и но тожля Ма дО ДМ Машею ху ту КОМІ мо тюки ущ там В сих хна КУ Тух цЖм о мАазв Аг ат ут ЖЖ МАЙ ОМА ЖИ хлпА АЖМ ОМ СУКИ хЗЕ хи МН сет Умщії Жищм сМари ЦЕ Філ 1-21 МІ дз о Мию тиу фу ім дм шо даму ДК
МЖЖ мМ Ж СМ ХА ХХ см МО ЖюМ УМОЄ УМуУ Ж УТУВ МушОМмМм УК чих тіл хе схе
З ІФ ЗЕ КК и Су Фим я ЗЕ Ав ще Ло хек АХ Ма Щи у Домі ШИ. МЕ ся
Мат сш Мах НажЖ лих міш Ух жЖто Ух ЖЖ мім Битом шМО Мля сх
УМХ їх п
Ж ую Мк ло зи ДЗ зе Чех м См паху бач зах Маю ау КИМ
ТнКОожтв о Уайї бів Ту іа Біз Дей ОНля їмт Хех дет суз беломух ах
ОМ ЗЕ БЯзи
Зп и їх В У Мам, їм ще и ХХ се, лам їі ле пт іє
ТтротхрвосСух Баш о ТтроХлю Мет с еи Ту ди Ват тує щі ХЕ БІВ На
ЗА ЯМ ЯКЕ ті мо бе сві бачу ме Ми мусу М щ Мх Ву Пп ббсу іл тла дім пе
Мп о ж УА жук МУ мк ДА АТ мож ду пд ЖИ 2ЖМ АД ОУКІМ ТО ччй лек За я ХВ ЗЕ доска Ед: Хо ІЛ Лимуу ЗМ (013 тус МЕ яю у. Зоо лиху Кт МЕД их дкв жа уз жіи Меб ВБе см зуп ВІВ СХ кс МЕЖ дух Мам ожа. Мох спЕ5 35 Ух ЯКІ
Лід тух ка Шут дів Моб Бі) дай тлпх Ми діх де» ти аг ст МІ
Зі тує тва уп Лів мет іа Джо о їтпЕ КК одіж депо ом: Аврофаа хі кл да хх их Еш 3 1 пок. я сти. ОЗ 5. доку тт с ТУ
Міх мій хв БК міш жи бул ММК ОТКЙ
ЗЕ їх «паї па
ТИХА шу ту
ІА хаки дих вах КАСА ИМ ЗАЯВУ чліці Ух
ФК ізивжУх СІМО0ОМ З ВИХ МВ прик тив лити КК сууюх кими ших
Ух Ал дика или ха серии асо щоисапиа суми ие І запивати Вк СКК щИмлмях Меса шеха емо Ума чу цикли ЗІШОЛКМИА Ї хол чссипах уд мих плаву а ЗКУ Мии ОК пи вив х МУ ЦІМ ПММ В до теги ИВІ ух рисетуф у сек мМ НЯ спомини сце: спос ат шести х пита пусозшдциа То
В Ве ПОЛКІВ СМ ких екущує жопу итии тя мстити вк сегрецтеиви вх пеня
Заспаквих умах сросопслто ооо соовсишвх пмкровоц ха
УТСВожаВ фе ФІ ЧУМІУКУВ мес ФМ В. Ве Маувивия вик фени Кума сгаТх зали пршацтмляв сосапольхи собор ссбогоцєйий себаоломх З
УМВОВожисНисуХо ЩИХ ЛИ УКИ МИТ Казав мкк Ку ЖЖ. се и Вих СРФУК ТИМ кю тіж
ДЛЛИДЛИМЖИ УМА ИУУ ХИЖІ ХМО УХА ШлЛиМІЙТВ ЛУ АМИИЕ и дев Кк Луки од тки «ІІ ММКю им МІУ им м и иххитня доти ери ку пущацимстзя ум луу чудо пожесдосв загиплу ак дужі еиисіея КДКА нини МУК Уже Димид ФІ Ки сему ки яп пошу маму им МЕТА лАЦЯІНЛЕЛ УКХ МУ АД ИИТЛИЩІВ Б
ФУ ФИиММуА т им до МатуууєттмИ ТІМУМУ В их. Кі імуєдистх МЕМ Мун пап шоу чппзич ую суми уадимУути шущрЦИЧ ших по
Васко их сім ді фа Кир мам ит міІМУмУК МИ дом кл
Чака тухуз ства у списа чву жициплух водиці у Стщуицлао й паску тчах ПОКИ стакан дими попасти сппйахх що
Еш шоу учо сто пад малу я по иалчтухя У спдуудо єм ех ШІ оаууиУ: Мати ер Поу ит КД Імми В ей ддни ча палтаттоьчи псалаасчу попа ччво зислллУус спас Му сапиаатноу їх тек киев пюжУ КО тім сухо или су захи тип уківссузтї дела За уко СБУ свазіосоКо КЕ се К ке тю мити буку ги Вес ММ КІ МУКИ ЖАТ шиком ле шоси палко пли руди пелюшееИти БИ ме зеМиеивеиих ЄСВ КУМ вен АК и єкт схеми ме СК
МКТЄИсКМИ УФХ ТОМІ пІтчинсяИ пат лерамв Бр Ещит широ Б тлом фс мУкІН Ми пами факсом Вегемимии о сю хвости Мластумит питсоарисм вози кЕжоацИ Бор Ито ж пам тІниВ ломка сома ВВ УВиКЕтОм Белл у ками Стус ІМ таостоося путиоувеай позчедоват сахахіІєтоя Бивоеевийо зуссшовиви ІІ
ОХ ЛИЦЕ КАМИЦ МОроамИМу лому ПЕН КОМА миши сили пезусищати писк Месхитжат пазу слух 1152
ПЖФМАЦИОМИТМ СМУЖКА ЛИБКЕКМА КІТ КУ МІ ЕК МУ КУЄ пУМмЕ ть. шо сиспатлзади посзеркуєх песто пекла метот сви цах Кз иимУх ши птвахфродох ум ПИЛКИ ІМ ід н(тМдачуюиих Кит Йо пли ки ЖК им ук хх сипоалидам соесочеклцл дЗапопм тест цтац зудусмицину созЗущимкух ШЛУХ пек прощ хо І ую уримт ет булу Фу маму Киев т м МИ спссатаету жооссойсал стазсскавах звоссгодла соусвоспеах рожопси ах МЕН п м зи «хм лх
МАО УЕ ги, мінолх якАМИ МАМО М пт етиці мох «кА я ЖАДК ОО ШУ АМОТИХ КОКО сами Зх пк ж ше позах ти ЖЕ (у я МОФ м. Фодає Мох тку Чи я хо тю тк худу
Мет шт МУ ЗАУ КУ ВЕТУ Кі (шк Біа Ба Тих ВІ Буд Му Ух 1 ї ІІ пл тав їх пт. фе блотв ри сфету ду і сну до Юм йду пря ут спі мМ Ав Оос Зму шу сти стуу ру хв СТУ дер МУ ФККЦ МІЖ тТЬ ЖАХ ЖОМУ хх -к «к
Є лх Ви пло ком Тл гл слати ЩІ. п и Ач маша Ко ли Ж зЗау Шсеж Біш Ухе Буш ББХ зле; дщу ШУМ Зеж чу Ва М АВ ЛИХ Млою пЕ що ях бури Чек о дог тіху Мих км ох т кує Щлє ХХ Зо Мах жах ШЕ зо ти КУЖ Жм май мтшЖ мВ па суши Ба о жух ма МЕ леж КиФОмемх сх сх щи
Зк У шхМ їж Ве їаму БКухе Зк дж бліц ді ва: іх; ЩИТИ ст бами пом ла щі чух кцЕ Мем оБз джем ом пс АД МЛК КК ОшІЦ ЦУп У шУЩщ ФЛ МО, п че ст Ух їх її її МО хм сих ЩЕ поч їз - Щщхх ех пу, Щит МЛ ит, и А лу Мих т омол Млш п Су Мем обу ЖЖ БЖ ЖК АМПУ Зк КОД о пмю МЕ ке тегу щих ж ше КУ
У їх зчеє їюМме Там 0 Жим З Ж Дещо тим кути; Музи Люки ОПЛНУЮ г. тт сщ хбЖ Блюфочец Мав жУХ ЩО ЛОБ ОМІЖ сп Лю Бу б сте ЕК їй хе хх
І М МА діх пі Мет 7:41 (Ух б т фе ЛЮ хі: хі Дю ДМ: Хо Шу Дами їх
Як кис о Ммкту суда МИ ММ; локшЖ фл ле зхКу КИТ ОКУ Мущ мМитовамх Кіш ух ха хи пут ціх ША МАТ фе мат бла ому сх ХМ А щіх ит Ще хід сщА гжОо НпХи Уа хв бю А ОІВ Тих ЗАМАХ тя МУ ше міз ах уче «тк, я
КМ хх А
М лю ит Ми мкУх МАО пи ху М щомиті МЖх хлух сАкю тоахи пя йха о пжх Ж Мет мил Узі Іа сх Взи да Мт хі да тВК гец сх
За кт хх тТКи
МІХ АХ А Км
Мих тот фани Ії Ж ух ВК Ки. Ми ті З ик т их ІІ
Май бо її й паж її: Ма спів ВІЗ дж лю Шіу Ткр ож МшЖ Опує ха ялх. -чх
У ля Я сх хи тІх (ті пла бю Що к Її "ве Ол кю им п ух жу ХХ Фу М
По ЗхІж Ку міш Жук жах Мем» отВЕ шах Був ЖАш МОХ ХХ МБ оОдидоОгау их 155 Зх.
МО Зх іо тк фо бів Фо жа: сМхує Тура ск: суху емо стю що ую І т Ву
Без би діа ех Ще тує ШК бе Шу пПжиЕ слу св бе обі ха бух ху зма зх ту З 23 бе дум му ле іш думу Кичошім цій Щі ви (ет Міри їх лем ім
ТКУ мМ схо пі Оомигм мжш дух МАЙ ба ту пл лась мух мно сх шу ЖАХ ил" шва м лют: дм сх ем Там ем, Ті Ж о хло Мюци. уж щит ДО пз ово МИХ дл о хл АЄ лІі їви Без бши ЖЕО Вла Між ий Мо би п, сх пк пули пд По В хі
ЗИ Строк божих пу Лі ки ЖК тн сх бю мк Тими ст у мі и ке мн вл о дтоу Мже УЖ о Муш Бжж му щі МН уки ха їни ТЕ
Ах ж ЇВ
Зх пдв тю ле щі Ха їх ІХЕои: сбмах діжа ком ки ужию М ис току
Мих жу щУг жи мл юВе дама Кт» ХУ СТО ЛА ЖМУ мех ма ААУ сих судо ра
ШІ ЕЕ Ххт тут Ук Щі еух пе С ЖмУ МАТЦІ їх шин юЧІ по сєлюи Ж мих Ми
ЗАЖ м шУМ тр шВХ їмо хах мА ММЕ КУю о маш ПеХ Ще МИ ТЕ їх ЛИ ШІ їх ЩІ ХО бує ОМ (Таз тму Жумі ібн ли щИКдО дя. Ди зд Во уже УМ шу НІ Кух ББж сій їху Бесп су Меї Кі Дії вх) бух Ак йлм Би тпцц суху чи ж І НК
Зі дід дме шмх. Щі фу дум Чет їх ла долу Жрию СМл мо клички
Мал хх сти Ве Ліз ЖЕО Буш ЖжМУ щу Мел БПоз (АЖ Мхл сх п вико
Ох 5 ЗБ о тако там Алі ут Мер Ж Мат їз ххх екю ин ух ни. З хх їхк..
ТуК лк суми ХК УТ але ХА шу СХ сту тУук ІХа кВ фі Ав Тех зах Зхо за как а пах Дах сти ші будо ше Шмі лише 3 дугою й Ла ба дм ет УдМ стх Ні» Тис Мах Ха Кко Хазі йжк жАуУ Ха ех сти уже уки
ЕВ ЗХ БО іш їтМр ода Уві Тут шим вдів Гі Мав ОТМО Тими Бай лів ув део ЗЕ чах пі зе лим сома с Ву: жа би. Мк деки Мих тон мм ім шт жза Ма шім
Мо їм) же МзротуМ Зкш Ме пас Муєе їшщ ддиа Муж жім фе бо мІх
Я я що паю З хм. ес дн МИ фут тла, ЇМ де щі Жан тла тла Мих фіг маш осям сте УЖ шт (С ТЕО суб Кс АЖ Бл Муз ВА Хе ЗХ Ж шик слуг дл до
ВК 5 КУ дп
Малик АЛ би М що їм Ще Яд М о й хх Тим ХХХ Мк люпуу МАО ах тк о Мад о мух ва фік ме хна МУ ВІЗ фу Б Уха ТЕЖ ВШ УК о щЕЗ ко де
Мт слу ЖИ оМує Вів Мак Ма дме би Між обох дав Зм дхи Ва Зі рило тУх ТтТКоспу Віа МшеК ахв блю То Б»з буз бай оф» Аа вет Ха
КК ОТИТ ситу хо ши жк
А ех дм Во ж Мах ших Зизм йЗ ІМ пл ох ту хх жів Віз беж Мід пежх Бух За ние їх 3 ст тух у «КАМ СЖЕ
КЕКВ сви дЕЖ лю ли Шероиличт ячрии о скучив АК
БУРЯК ТЕО ММНОЮ МИТ уМУ т
КЕ Су а СИ
МКМ. хижак ниви чук ик их жу цет ках спе М У Во сс ли У зимоссістий лише со срросСди ЗогуЧчИВоо кож оВИЕ дао що
КІЗ жи ми ЕМ М оии зи кити СИМ лита суч тиви лу
Есе пПІМАЩІИ ВИЗ КНИ ДЖЕМ пиши ЗИ еЕНАИЧИИО їх ект сало к ких ами Мавки фев кцевЕ вкла їду
ІАттдоаоди полю евро сИЙ па ОХЕОоє вивів валіза аопаЗ ІВ
МУ КІріуєтизиою Мо МІМУмИмєх МІ МІМ Кухие ЖМ киии у МУ МІН ск дили Ви тюдх зкпафцаалв зтзпижсий ацекту тисни пуху кети Ки Ак псук ду КЕ же мммієвм ШКІВ ХВ В В ТІМ Уіинх семи мив чгцу утииМмраинвих сСимуюамит пути МмашУУштМюМ шеслюрууєимити смути «М во в НН Я Заг поч анюма хтіхниміас сани уту зву лцениВ зош сууюу чіл ЯКО гер хи Миси Жмзаме м ж жу ФВ КК пит КиМУ В пелети уд ам МАПИ зв о писоациишо песалпахихк сороки чх в Зх ушу МІруєтлудтитх ЗИМУ слимак Х своих аюи сш М кипугкЕхцт піт юксти Ким прот К чи ув в Кін 5 славі хоизтржо зу Завесочои сопе допов уУ оцих туми ЗО пфлвгттту еще пс шіуюат МІМІКИ смути: КІМ МУ Ія їн писхввситех ХТД сВИ спасає ОЦК острови чого ге
ШКТ см МИМУВ и кину М ІММІМа тік Кермо ХК іт акти суламжаці узоувоцину вууощоадт бсивцетитя Каву мецомих ку
Мицилиттша рушили миме ошижуцидуих лежу пуциМ боти меУци Шу сюУцлені ЇМ пф мі дУУю КІМ УЮ и Боммлумаитю Кметюк г скпищур у: сапопшасах Чугозтаа угсрлоади бсузбоцеаа зу вова тн сироти смішна щи ше ацишафууася соках чу ша
Ії па
ХМ У
«ку ди их От суху як чиЩИа дл 2 Міри ІМ іви их щАІММО МТУ ЦНЯ ЛОМПІЛКЕЛВО ВІ СМИХ «МІХ
СПУ худ м мим кпк. імищммуУа мами пори етичи мий смт У лом жде ВсихиМмажеваМма вІлЛюНхя памхл» схдежувимних из ампул ї егідою сМожат « шим пошили май іти тити етапи т Щи Миатм: Ж шмоспиМмамх зешжииМа АХ гай о сх «ча са печу труси топи уУ. цитшавиятем гладдю Уч у их пелет міх ІК УжиВ ДІМ оду іму Док пе УК ли МіО пред кими зу тОопчсСувати МтшалзЗУушеИи шлам ша уМм ЩМЛУгТИТЬ УМЖУ. пис А з, з г. я г. с чим
Уузоскмичижи мчхахувусни палтузуушмии мапУучууУх хи уувиКу паза чинУ АЗЕ ем щІмй суч мис ем ик ІМ УВА Мі ВО дети одїх класти пишу УКОСИ тс мм меду ау умКи хом купити ииИм кити МИ ІІ и их дак ит З дит ту І тзпсзиВиИк Хихксзасоц) так цеакиа пасуотиса стаю соспи пижучиприщи Мах пазоскецио Вени са вл кхма ЗВУК МИХ зако пі пззсизаца сук цоазай сакоостсат таз омота всеж осцтв авксвсвоу ПІ
Мекки Вади соди Ум денв Ве масщеий мк имдиекя дл зЕжавстуци плас соши палет ЗК Холркокосих пит жукі де
МКІщІмл м ск ичщиМх УСІ У Кк де еВ селам МКУ ІМ: зуміла св ал спасоа поможи со свожипе шеттласиовс сло М ХА
УІПТКІЗ ін фури МИ ОМ саьлмИК жк Уцх мемйх сУК ШК Жм Ім юохх, ША хочесабои тка заз оесеа сті ЗЕКЦИТЯИМ хуй йтх па
ЗЕ ами сус саке Км см ЕК ізиютоткни ОМ ІМК т, ці
ЧУТИ ЛЕТИ КІНІХ СЕ ТАТ КУ ХЛЄВИ ЧО ЛаМДтТицУЯ ПИШУ Х и мімУКІУУ ВИ Ви их ІМ я с дмірини м ММА ТІМ и их у у мих ди
ФОИТИТИМТИТМ. ОМАН ДЖ УаВНЕМу Куна Фут КУЦ їх фам укв ин амідів Ки мімУЮВ лк хе ПЗфІММУЮ ит МА ДІМУК В ит залу
Ул МИю Ушулищитиу мухицтлвти щу думутхУу умумтУуєчх мухи Не ен о НК и НИ "аг сист Мют ушу дакими пуху мтЕм шу атМ шмущуьи часах Не мутлатощУу сусла мпучатих їх чити» хх «Мо ЕК жмеиМ ДЛЛУХ жк ТУТ МТА
ЛИ п, «а по лах для пк ти йі а лах Шев. в пт ках 1 сло дю - аз кхж
Мах вх пал Ті йка її Ехо АТа Аі їх Да пі ТБ пам оЗіу Тех ї ї т те
Шут. Ми: шим ше ЩА Щі домах іме; бля їж хи 8 То «фам ФУ охміх ду хх а УК КІ за ВДК КМ МАЛУ ЛМХМО Ко МТ МІЛА ЖЖ мА ХВ УА я лют. зи ях я («У пу Вл лиху УК Мен ли, ЛО Му ха Мех Ми їМми Мом СХ и их Км
ТХо ДАМА Кжж КМе Меї сла Хлі хуй хух ТМ ОпМу Ккхо Тит Ме Ху ТУ ки У зх
Ті У зує зм било Шут бі смеж іМлх ів» обов Вл лах Ма пів одхк ідеш шу УЖЕ Мем жди ких да скух Кійх БІт тя бак тів Мей се Олах хо Ух М
Де дж су дже Мезим ЖІ Утім їх віх нм хм би ща Ух
Тр ОшиВу ШАХ МА ЖМЦВ МАЖ ХАЖМО МУК о Мох Хі МИ сх жа. СКМ МЕКу; БІНХ с та ча ж и т 18 жи тях для Же Шуми їдзею Ум Шуми Мале дб. Таж ау мм Жим ЩА СУМ «ли їм опа ол Біо шив гом дах ХУ бух ЦБ о Ужа Ма Жце Сад о твЖх шах пт щої хух,
С - З шо Кк о щм ствах му Жаміь їхув їх го схуму су ом ся ІВ : киш М
Нав Ба Аів пів бБау пе же МВА тТтр ШМу Вл ОТ)ш БЕО Мою Мет ТОх її так й
М хх хх
ТОЖ хе Зк Тех Моє Ж рах шило Зі лк Мем тгзуМ ШОЮ лу. Мозух пехоух май оМнпй пет кт шАШЖ ЛІШ ЩЕ ОМ УЖ МАТ СУА БЕХ МЕ х ЖК ВИ Ей 115 ях чх ве ХХ МІХ гджшу ли МКМ І пої ах бах Хм ух СВО ба пічка Фе М ЩА ду і їх жи судо жі Фі Ме Ха Вау» сТМмХ тТцеа Кпе Ме УКМ Мах дош ід мух - жу пк хи
За 155 їла тич Ми ЩЕ ам Мало иа аж ВА шо Мімобои Мал шк Ми: Ха Тохух Ст ти ФМ ЩЕ ІТ ЇЦЩМ СпеЖ ДІМ мЖиМ АЖ ОА ЗАЛ ЛЮК ЖІК жевм МО КАХ хх т че Зк ках ВМ ХАТКИ А тиху Ми Спжї:М (зх ут ЗМХЛО МУЄК що фмо Ж 0 Жееха су Х «1 ДошІх лу Али
ХК ох ТтТв Баш лі ЗУ Ме Буш БеМ о бах ЖЕО УВА бі дЕрОсСтє тТух
Же ту «ле ї55 Те КТ
Ж. зи Жим ку ЛО дення УЮ йиоих ЩІ Мох Зайка ЖК, Мр ку З уж
Бох ку Жах пвх Хі дЕЛОТМе Ве тла нал Ух ХХ Ме Тк пе Оотух
І М І вами и тих ДО Хо стою ТУ хи дюіх «ідо ШИМИ би, би т Жак т
ТК ВМу май вза Зіз бо» злу У ет Су ве Тер ме Су Тух Бе
Зп «В ах
АМО МО СХ
Жие шій їз ба МУ бй-а ім пве будо ї1юв хв ЦМіж й па лют КІ:
ТАЖ ОШшМИ лот саж МШлОфиМі іо удо лом Щжй Маю щи БАдЖОСМЕУ КМУ тп піду до ж Со тих
Мік. Др мл сел хв хіт дк а Що. ххх сУчуих Хі Жфіму Скит Ж им сш осипи пАЛОЮУХ ща зап ОАЖЦ ЛК ва тММ КУЩ жи гТТУу МА леж МИ цк пух зх пи ше ке ДІМ пал їжу боки. ЗМ швах и мм Тс щі болі лм лох о ух МУКИ ем До уя іє) Жяфт мл Мел ал суки Мей Бех ща: лм) ЄТех дій дим Фе БУХ дих
ХУ КІ ХЕ їж де Чет г им сб 01 де ДОМ сту. дет: ВУЛ:
У иЧ жук щуп сМжЖА мимо УК МИ Му оОмац
ЛЯХ ХХ хм ОяЕ чо МУК пев КАТА Ха ла едлптух пд пошме ХЕ вумписголца Зпуошицва довга досзисаух чести ци гидиа КИ чего сухо пе умх чер зошит дви 1хе
ПІ МаЄУх смути уми риси йіми ох атох пучишмимм пе Кути 15 часщитщутуМЄ хлзЗзУМИциай сили ше шуми циция чуму мМ топи ле форвициа соссадовааах чочушоасух зчозпливис идпосгиимуу їх желе є кути У ск ФВ ка сус «км чл пипІМмУуИчЧУЮИи дих триу слмиппеотує сраки спо ишМ спапипим о ЖК ек А ази со сиза Жити ВИ ие очи СІВИИ дачі ти атаки ТЕ
ПИТНОЮ ІДИ ЗО пили селах «УК У сквери х Колот пр ау соди Юхим в ун КИ
ЛИТИХ. Хомути припи аякшч сдидагуутики соту п ки Ми «о ке в НН НН спи
Кл рсу Є сире у хуптлчаему «зливи сей тє змиви М
ПОС ЕЕИУЕ СУТО У Ху цююьс ятипапртах пива лких «синю ти пп
МН ХМУБИМИИИА ТИНОМ хни ха опиту «идмиКеии їз себсхе рю ІМ МйолеєттютІМ СУКНЮ КІМ. ЗУохею ці Ім ІМК Кс ВЕ лохзусууцу попити пцизиуууучии аби них балимлюх думу мМ ашхчеосоми щимоахлячим Зиплецсним мтс усти щупа маси тях
ЛИШЕ ОІД мВ ФО зи м ШАХ ще ММ у Те тки иа уки м тю КВ ии М ее М тити сут иртрисити ти бурити гав щІЙ оцю оси Клаус полови Ваше по уиЧенА цу уми БУ а ВН У жжчсхвос зоре сих пахоссст пижстосстоса поши ПОЖЕЖ ЦОИ ЗІ
КК очи жу умовив еи их сек ства мем Е у Кк Ух тІхдіспсли Зоо ва се перси вч Есовай педа еак поакочопоп и п м В а о КН ОН пІММУ точи мпи спо ша Чем плаленим ТЕКИ ис палтус чу о нн Но НН НЯ так зони пози зас вксесоасей пово вИиМІ пох осихе МК стики рута стшциєсати ЗЕ нни люрожауєой паселолиай ВКпМ чиИисцаписла втокзосяаве Зсчзисаипса сш тисита зчопуцищима пору Мч пк фууучиив ит ЄМ УК ки СІМ В ижииуи «СМ ММЗИМАВЛЮ и КМ жи хід
СТИКИ ИЦИКлуь пу МУКИ ЦИТ УМА ХХ іхуминичюитию КЛ ауучитю СЛИМВІВУЗАВ итит МЛМ уд МЛМ КК нити фути пед тйпспсдічя увуцаацллв состава ус зсзисаахнх зшита чсбивуту Іди шал спозщиниМша ча хчЯ
ННЯ чЕД ОО ш «ил їла
СК х п дили ах сх ом поті див МмИ ехо
ТА ЛО МуБУМИХ ПІТ ДИММА ТИХЕ итмуЕн «КЕ
Ех МОУ соку восмами ДЖ сзимеайа ям жуйаяния мим лит Блчаоух
Фа Он ми ховаючи іти бачу шу шкахид о б деслитуюазм шОбОслмнах шуй а
ХХ п зтцпоалика пучки помпа зо со зі ссали СУПИ по
МИХ УЮ ЖЕ МУ ИН еУИЦа т СЛУХАТИ ЗЛ1ДЮКТИМИ ТИ ЛИКУ УТ МОЗ пити денді хм сс диа фест ж мікицои фев 12
Чпатит жстузочоекай чо тсада соспоцаслиаух сошоопцми Сом уцуєт ЖИ
Оп ужцКкоо дату УусовскОав хусток авсвзуотаа зво 245 сУчиишипсинта дапецумуАЗ шеоеюшуЄє умо муюмиу пюшмузиуца пи мМУАКУх КМ
НИ НН В А НИ 27
Чомапепама аучешасму: сдолжасшкимкх зтпозмочакиц созесамух душем Еш жав лер юю Кемер Ку Бомиуух Ус Ки жири да Км омКІМ ат ллМилимлеат пошли сшлошлммиУІ же ау иМ суб иМх ши дози М о Мото СИХ ХХ ЖУНУм М гост ую Си ких ему уми г атлупличит Боссмкйнах чових зузашоадах урстилитих узуссути, зо пи ЕЕ коки писали дрімати сексу Ки вк спаси Хоцо пах ха пила р ацпиале схорлуадима Сом п мб алект сухостою ск егиюКХ спцимисв де игмат счрцемеатУх пу
ТЕНи АТ тосола сс х пеаопит у чина сфуцзлаих НИ аж рве моя о КК хи сзичовнинк М иевих сети дк щих ялуйтлтТишЕ щелопиайлао чЧидпщиших хоп лийих бсопзплоплаа соезупикцах її шу Мк мк ею М жит ВУЖ Кози ссання Ки Сг ЕС затахистий зроду Водою пібацалимха досл сива дика Ти неврити дими МТВ де и Віа євітем МімгваМюх сом вт чих позу динюуу щшимтлтчнжув КИБАкКатиуу бБецоепіаки жоцаптаМчяхх пл жтвлмка ЕНН
В БЕТУТІХМІ ЖБІпуди ит Від К В Щука силу ФМ вних пІй ещхккчсуюи трудо Утус тачку чух Ваза поза шипа кчксу пах сот чсти цилалтучуу жати еусу пт осоВ піша у пт вий о и Кн Но АН АН чуа етос ууУ поруку шишбууоо ших сауя муху МУує паху мМ спец ок пицаишуЕ Мт СмМ ММ юю мУ Мити мапу КК
Євою кита ти зхф уки бах уигщ их си медик тих Дао уМ дити итет курИ литии Яд же учшую мити мес усу птиасютшуш бІмрусцемМм котам Ку АХ т ккд тут МЕ их СЕК Кк ВК зах ххх дк ленхяюи ЗК Кк ХА ЛАК МО алко НУ
УЖЕ фестини. соди ть бюро ин КЕ из кю нини фо К их по чт исои пита совазу паажовоои позі паж сеоси Казали 1хМИ
МЖК юю АЖ и и мк се «муч туєии и я ако а о нь Аком ЛК това сссц пес уцит флак птхулоцова За же і дпа цоВЕ ЕКО кліщі бити У щи МКК КК суку щидо пуп домим ММ подаИ ТВ
Касопкстя сор соа пикЕВИЙтИх злосксжовос йевІшевусє плив Іжа зепосевоо птдатаеса Зв ІхаУ
ЕМ хи шслююя ок
МЖК як
Ж ВАЛОК.
Лю я орати, СО хи ОМ ждтжа ЖИАКАЛИ оди чх
ЖК хи ин ни НК МИ НН ща сМиху. пуи ху ва ЩО
ЧЕ пе юс шу АХ Ві цу пав оМсх піжЖ Бл» шех ЗХ ЗУ ЕМ НЕ ї З То ї5
УА В зи и Міс лАюч Ми й мо пакт Ам ти лик хи зо иа
За опау шо тик Бе дат пи АТ ОБОВ тах АЕМ ож Ве АК Важ ТИ пп п ху
КЕ Кі по фалон їх х ок 11 ТИ хе їмлуу Мт Мо слициа Щити я тТокиті ШИЛО ти те дж Меб тв фу Ужі Шіх ВЕУ Зсг Маї Жук бар о йха мжЗ Діта чик пт ах ші дж спіл 311: домо ди: дл у ах діа му М йдуй Зої Ж іх
ГПУ ол лк А ЖИВ КБЕЩШОДЬЮ ЩШАМ МОЮ ЩО МіМЬ Хлі жає фмМм; СЕ о Фхх
ЗИ тт шу
БО їх о йому пилу Мо Ми Ті пл її М УТ Ах ук ЗА холу жим Мох мучу щ-шЖ Ммждмаум сх мих сою сей рам ЇМ піЩМОУЖЕ МАХ ОдТЦ МАЛ ОІВ те хк чн чт ше
Ми о п ЩЕ
Шуст Тк. Ди Мк БУВ ше тк Мч Мі хи МКУ м Хом Зі хи ж
ЖЖ меш ЗХ ди Меч ех Ат по Біш УМ пху ЗУ їди Вал йеу УКХ
МУ с ХЕ,
Тл их Ми: Хе ту діт ве ту, МЕ тями Тохумє З: жом пи я
Шхи пам о Боз УЗ. іа Біх АВ оОлдМ БЕУу УЖ ПМ еп пух Віз Ат
Зір ах ЛІ
Ще ЦК хм п їх» ждех ми г: шу Мо би Жили ЖИ я бу. М ск хАВОВІіх мух Мат Хай боса ек Хлі бек Шев бі не Аза ох Міх бек т «й ЕВ бю сбдли Мі Бод іа ЩІ сджу Жіш їду ММ луг дід їЗа дів Ул М
КЖх ЖАВ жк. пБтжх Мая хгу сам дах Мам МАУ Ж ліф За Мій Молю
Кк 5 їх лож вик Ми хм сб Дім ТІ тим мік т Ти: Ше еко 110 да з
За оту Му их тухХ Аа АЖ пк Дт Ме мам Бте Пелд о фіш од Мак їх НЯ я Ей
МУ о хх ХО фури пт, Ту МД. Що пу сити: ФУ Фа Мих. І 124 я М дме А Мо
Ах жу мамо сгпл оз цем ОА шт пил оЗлю 1 одАТО пал АЖ бдп пл кт чт 5 їх АТО їть дім сім вл тм ом схе й ам пу умі для клю щі їжа Пс» тд ців жу АВ ляже Жеш ха ОоЗшЕ ВМ ща УВА ДЕЙ Ме МБіз фа ощіУ ла
ІП 145 ху бок Що сах Стану Зх МИ жи Шижо Зх СТ тижнях лу тезу 3 ЩІ ЩІ У пу шій о вшв ж біш о шАУ Ху жи Ме с ідм) Хм їх МАТ ЗІЩ ТХ
ЩЖУ ж КУ чим КА їде М м. ЩО тихої М м дом дує (у похо їн Мету ут Му жі Мах Мах Ві Ніл Зм: Щіа Тих пок дар ува й ої йзУ ти Зщ» а ще ше пу хла «тм єтууи дах ож я хек; Миксу. ОК тику
М пу Ба Мі Піх Віз же Ба Хе пжа Бят ли варовіз Тур пок
ТЕ я ях щи фея Шум Прі путь їм (Мф; фета ці бек саду. їм: сит дл ФІ Ж Маю тЕМмоситу мА ОжЖЕМ о зМим о ЗА пе ме осуху щу мч тФЕИ шу УК жиЖ МІХ 8 Зк ах нн НН НН НН т Що ху о КУ ФК уч їж Ді БЦє Буш дона фей Бе їі: йо її Зеу Ша Ше ЩА БУК Три
ДУХ шМХ В даеровмту тіфах Шри ФВЛлі: фен Ж шою тоди Жди Жди чехи ех МК ме вжч жу хім му ШИ Кто іш шет Мже Хеи АІВ АЖ ух шем Кри МУ ота хай с
ІМ шк КУ
Фет хТухає Мижах темі ом Ус: їі Межа ЖЕ біжу фам. фімА МН й тих
КО лю ЗМ; Ммащозяц Му ан ТУ ме КУ о жала см тив ха ЛА їла яд тех хгугу ши ШЕ МО фр» Тампо соту лади фо кт дж ра міш ре Біо ка Мет о бфи ва іа
НУ ем УДК ВМ ТД КА ей МАО МЛ СКУ МО АВ ОМ АЛАЖК АА МАВ
У Ре ГУ ЗиВ бу аі Ме не щі бум фр ббет З алі В шо пфВуЄ Кс шрам бо шу
Тих Мих Мх це бі Лех ВБе Хух Сез Дій КВБе бу по Про її щох
ПИ Зо 55 пі болт Же ім пали хі Вл й ми й пух млі ум ув чо піх
Ну оБив Же пп оса жа) вза бек Ух) ШУ» Без йзродіш бек їі Тих
ХА пд З тркени Феєу му дулу МЛ дім іде МК би бю мл (и о «Зо ре ему пек Ома Ту БІЩ бСауУ Ліж щжЕ ББе бе) пуб Вже і да Зі Ти пах
Зх ЗМІ МУ усе Ми. хщо бік ХК фут Та Ук дім бл фах йоду мс Ж фам ххх
ЯМАХ ВМаЖТИ ХІІ ЕХ УЗА Ж ТУЮ ПК ЗМ КК МК ЗА КК о Ж ЗМУ АВМ ОСМЕМТЕ
ЖЕО я пКХ тая ЛУКИ: СТА ТЕ Мі Мах т ЗУ ху Ми ко зм Мі щі І ІПМ ие
УК ОД іш Шамо Баш о маш би: МімЕ ТЕО Ви ХАІ ца оп ОКУ га ОХуХ
ШО БЯ Каже
Тут мч Тай ФМ а ри бсиму мл їм Жар їла би ім МА ДЕЙ ТІ ті
КЗ АХ шшМм ом КАК ММ ЛА мух ЛАВ АХ ММ МжМд АЙ МЕЧ ОСтАЖ АА згуг, я су 325 ДИ 535 прі ху т пі тую ди, Ск їі пи, и й тах Мало Жизує Ки їх сліз Жуг був Бах тує БхО ТЬо їіс Тек Зх ди ЦЕз 5із Бех ТВХ фе
Яд ІК ІК дже і щи бухту Дім би «(ік ел дю М йачия Щур Код зо ж г бле Ніз Мел тв АЮ і; біу вхо лю бра из Не БУВ ха їла дай зах
Оп ка ях лов ли пткутю и хЖМКт Мамо лк жит кім з их
МУК 0 ХЖІМЛІМУ КМ р АТУМТНВ
ХВ ОМ
Я У ха пок думах фест ДЛ и ІМ. уж У ку Мі ми й Те
МК ВІ Мо щіш ди Бзр дм пу іс Ат Хуе хро діа БІ Ха ТВХ : ЗУ т ВЕ дош пи, «1 т: 1 тлі УЮ Мах Ж ди сля Жолт Фолух Ти бою
ТЕО Бе де МФО Шев ліс Шах ХЕ ЖБе ших Хе о ецо ої Ба ПУЕ Би ве су уп т хх 2 п ж М
Зако тщи йец м зу пох З зим су гук їх тихе р м ик ще
Мем си та овал ех ж фиюї МА. варю са Ху Му ХХ Ат ух йо пх о чІх сум ме ме о тлу сут бю М М лох Ук мо жах ЗМ Шлує Мало Ум су шах Ма Ха ТУЮ оси ТМ УМ пост МО Аіщ лик: М3ми ди хі Ха пт пит до
Фах Ше би Мщо. Уфа сташух Ду тамлі 41 беж и Чем Кік Мк духу ат кита ХжЖ ХІІ Твт Ва тТне ха са су ТЕР дою Тук САЖ тм о шух пи ТЗ. пи Ки ки У 5 чи зажди уу доки Дек ЛИ: ки. Ж ци поме ЗУхю. Ми 2Домо дімнх Бищег ЗХ т ід тю Бех Ж омжІ ЗАТ ТИЖ МАУ ЗЕМ ОСТМм Є Бдтю пал Кт фмМмх тах мм
ПЕ ЗИ си
- т доню дих У х п т пу . г х тої яв Мо» дуг бує Ма б Ді Шк іш Тиха по свррх пулу лю ЩО ї си КЕЖО пе Усохах ток оОУВа пк МУЗ сша БИйш ВУ Ттв ОХ МІВ ХВ 85 ЗІ У шим Ж я ла їх Ум буку меми ба Чрху. Мо Лтд би Там щи Мами щи Чех
Ма БВ Тує Бут пех буз тую Маї Би туї це дзротвЕ Мі Бур Кей че й ти
ВІ то 15
МЕ Тех Тим м Жду У Маю МК ШІ Там зи Мо пе мо лю шу
УпХ їі мух ШЕУ Бук Ле Зах пех бре їм) ПАЛЄ Зі вав пі Кіш Бе «МУ злу Здох
КчВЯ М їх по ут ур сужухє ул Зх хек Ж пов Ж они фам о хм 3 стро
МАУ МА ЖЖ Стус юне Ул ОММх ХМ Шу МА ОБЖ МецомауЕ ТМ мод АЮ их НЕ г Зп її Бл Ух шк длиеЄВ сват пло Фіхую Ми» Фі чаю Що Флуж М віщо ща в му тм кв ха ум оліІШ ГИж ОХ Била тм жа ЩшШат Кп дає па Оп ла мах КУА чит. ах Ех
АХ УТ уз: тири ла Мей У Хошеі Меную щі юю пи Мои Мі зт том, пусту тту Щі їже це Вій ді кім ех Фе опи дів пешЖ ре хи ОХУХ ЖТУЖХ шу ММ отду МАЙ Мав жу хЖА муж Кит МмЖМ м ЦЖя МАМУ тай их хе ди ях хо он я Би в т чи не дю ми МИ Ул: гм пах Ми: МК КІЗ «Кс Щезих ТахУх ти вишня ДИ му МмАЙОГУЖУ Ап ат туф жекію ктмто и. МУЖА У а М С та тк пах
Іо шК У
МА ЖтИ Дже ТЕЖ бе дж УЖЮ ЖЖ У ж ма дв обжо ЗЕ Му ТУ УЖ хх ле смт ке хи тю тоІЕМ. щих Тіни Ус М. Ще дю бл їх пвх КН Ж Ж Дю п їде
МщцовпФ о мбх ЖЕ а Мі» УК О ХУХ Бл Тут ад бміу шт а лЖМме ме хЕ ОМ ШЕУ ан сом Ми чую МіО дум: сх МЛН охо доми Зх охо ря рих Жоихмо «кв щц Упф МЕ ЗМ КМФО УТ» КУЄ мить МУ сх зим: Мсю Тит Бу Ж мих ди пек тел так жи хе соя тї ша їм МЕ ЛУ
Аз іа БІВ Охіу іїма Зі яд
КЕ
ЕЕ хими ди сту о лів хи у сію вах ках ДЕх
СК ун, яки ВЕ ЗВИК
ЖИВ друзях птитмлоаммих ге. ою «ЕЕ
У Ким тек вва ни ВізхиМмта сах звужений пед жзкелии із ідпіх
ТИЖ ХОДОМ СТТУХМЕИ схе нИи ЛДУ пи МИ МиНЯ ДЛЯ КЕ ХМХ ТАЗА
ЕМ УА т вщлМиМмидилв лоугпИилМинмях кг оту пал ОТО матики хи ума. вити ЮК Келих сне кати Витинанки Ех шупимримакщ пжуусмо пан уссуви пабу ссчашиц жук ускиа ушу У
ІМК К суєти ХМК КУКИ дю Мк ую тини пити ЖИ трит вих Кри кК гу муитатослтий хетусттийа КТК ИпИйи дес оийий слав ийя пелети КЦИ у Мо «КІМ ММК я ВІК ам ке В. омоем и иК оо ин В
МАТОК ММ МАЦИТУМ ЛДУ ФТИТЛТХ. МУКУ сотих ШЛУТИраИТт Ух 2 пли или КУТИ ЗитІнЕО ВЕ тпм ща. кА плоти липа Усика зитщилопея тку ццианое чати ах лика памолити Семак слати ЗМК МмАаКт дим ли их чтиджт я хрипи сСечпсхваАошжУ оФпУСпаапллУ уКудпиаУх шипи ях пе піші маціІмУ мохвли ти КК Ум ие ем пев міх уЕту чоуушиниа палет уУ дути щуки мит ЛИ луМ паху ицул М
М НН А ке чевчУузсихуц акалучоука УСЕ Ки слудузваца вок кусие стики ЧИ у воштамикі Фо УК босими Фо дисери м ужитих Я коФсжУсикУ ту чсиМ ЗСррицех ака муку дати МИ чЧохинш Ох Чласчуусих тстазищнтки зосозизока Музучузищи бтамувоа НХ пк лодик мс цеех жде понти и Вис ще пр умі сих спосо позу асай лу сзсавца дечоостксий бум цар цих м ж нн НН и ННЯ ши сайпилипит шу ипіІмМа сади песо птцоуиИиий Кс иИх КУН ех Кун иКуну ММ ЮЕ ї З ї пох пев КІМ жа де АК ект ки Мрру юю хижа тих
Зали лат скул штат пиши еф Озеро лиих дО
СУК юки ке мит. МКК вх СУКИ Во лети МІК Я стпвкктезис зошестоста сжодпапивих хишосвайу сізасесвав оз исгх ще піалу МхМУМУЄЕ ВХ х щої дИилапиУаа золу хх «ІПМ Зі січ туди
ЖАВ ООМУХ
ХАЙ ВА ною
АЛ сих лави пишу хату ді їдких б: Щомо ди: 5 жук бу: ббхгй улов лою Ж жк сю Щи хи Ми
ММА мим АБЕ ОАТІО А МИХ пжЖ сш мулом АЖ ЖІ ТИ лай па сою - « «т тк м. т хх о
Ще їм: й 1 ую їжа; Ту жара Вл дтку сах Сбаию Тим сти бами Фу їм:
ІМ КА мМ дж миж ШО зу КМУ гц осо ук Мам оз мшжМ пжп ОКХ
Кй «5 З
Тан їі Де пах си (ШАХ зах. Б ли бл ди пом У ді бек Кк мм М Ух КИ МА ОМеМУ МУ ЖК Мих Ма ТКУ Му обу мих ху ТМ як Дт В м щ-я З кру ух ММ зач бяиюю пум Зйа3 да ху ДОЗ Тих Хм ших Ву СКМ їМЕ о Зву Кей лих т КОКО лМЕх ами хм Ма БМ; шт Мах БЗая 7 щи хх, пи х п Зх пех Бвш бек бді бу Зі. ми Ма З іх би фа Цех Має ФМ іх штж Би хЖМ аа Тит ваз їМму Уа Меп охо тро о муж МАУ ТМи ЗУух п Я ч-Е п
Бе я Ти м по и, іх фрес пеуже Мт: І б; Щомх хглхк дж, 33 іа топа жху т
ШУМ Ок іме БА шах Зм о тТпЕ пху УЗ ЖЖ БО а ОшМй мае БЮ ОпХи нКл шт ше хо во хх їм т ее йо мА суч уд док ом даму ПМ: Ж бах. ли лм їх
МУ о КхоО Бе олус УпА Ла (их Бе Му ік) ББбох Хм ткрохму са Бхш дигх дет прах
Мк Вих ЕКЗ з Ки Мигу бу сію о тиошо и М піз лем тими Воду МУ Км о Мах М
Мало Ме тую Кут ех Фу Лує ті МК ЖЖА и дрож ААУ МИ
Ух дит чт
КЕ хо Ахх
Мк жом то Міхов шим Юх пе й лаз ви ша цім ВУ
ТР їжи іх Пі жу БПмя Хві Бак Бе дач ШО піт Бе Міш Бал Бо ух «ух, Ж
БАд шу її: пл вл ме зни тая фен тя УМ м миня жк тм ши м уки іх Ака Бжхо Ху о джро За о тТух емо бік іш дта и Ст Ваз с: їх їх ЯН я М та Же Жах Шіує Моє ла ІМчи: о Деші кме Мчаю Ж щі а має ЗМ мих мя
Уа ТЕТ Кий Бер о фца бо зи пат КОе фі На Тло Узі Ме ту
Кк ат учк их ОКХ ГУ паю муж жує ТУ Ж жу ща, Зх ма лю меси, М пи УА лох ух, тКОЖжутТ ух САУ Мем тих Дха лі юю Хек ому км яті У Ж дл «й тих ух їБо Ук То тім ті м мих ля ж бу мпуряя Ли М тру спи Ме КАМ ли ве оких Май Бек сю хуя ськ АВ БТ Ха щу пуК шва МДУ мо
Упц сутух. чих ще ту» че
МЕ то ХА зді Хрому т бе Бів йея МАТ ом бе сни Щі пи: А п
Ті Зтробво Ту бів би Малі Кто СЕе Уж ВОЗ Аза Ба ВІВ уж А
Іо віх хо хм пу сікеє сб: Ми пло Щммостакм Фу му їх тус: ие у Мих тлу сі ЖИВ ОСИЕ ХХ МАК оКпе мжхдОСушИи Ба тт Ух СажЖ лег оди КМібх Хе
Я ЛІ тюх тай сою Що це Мій: лм ІМ Мем мує Мерилін У ух Ма що ламо М Удек Ві ти ЖЦпе Олув паз тци Бпб ту Мак Базу жи 138 Бав о Му ка ух АТ лаг скшух т, ша р ЖЕ буси Гей дії базї йла м до цу йіцз їз
ШЕ ут тай Улпа ма АТАКА ФХКМО УМ МА КВ
ЕЙ Ех
Кк я
У сх пух пу пи пл кох тих шими
ВИМ Батічух ріпцаІв «али Зо за ЖК рили пдеоииі жриаиие Ср У н жує узитец си треки їх
Зпапопоаляє своссавийх «россии сем юг пузаоентав Фаосолаухя 5 кре уєими хдптлвЕв пиво Ук пила Кору пд тала хи пктачучете жо тив спБийлиауюЄ Чопик БОоссйолут пасли паулмя їи мтутттК их МІД УЛІТКУ: пк ска у ІКЦ дл ї1па пилу У Іру улля (прин иМ Зиппаплат зизпеалеху питати А вира о мех Мох пише фот терм жор терен ІЗ скиви зах кл нуцу мот утує ит уми тла ктлутома постопляши стору х чо см МИМО ау ТК Ко м МІУ МИ, ми ми заи палет жастлльзуч золи склала вичадатучу стуку во м нн В НК чУух сли ицЕмУ мими Усомм Мпцплккшумо аапепууюшу МКИидаеУууке чик УК ки І сзУлАХЯ КК флак в ре Ен сні ристик. па К І побути ех ги
АЖ АМКХИМ ЦММКХОзОКУ ІА паче умуну томах пики їх
УМІВ Ю. феом м мтм оОВ птит их Мотя чив рити МИ Ко км Іцї перу тнти лиштви пташенюио плач циси коло цьойс пла Кусоо тщї
Же И и зем Іи а у уза тю у ти ВО Же ких пУХМАИи ТУТ сИД КИМ платі пут лом саше ти
КУМ У у пл Ук ДМЕ уинх «Хна Кок мухи Бір х п упав Ох лезом ущиць фл чшусеовиа кс НУ цт щиИи мтУЛІТИДУЄУЙ КАМ духи зош безусиеиа ших мл о КН НВ НН ННЯ пелет мМ Мк ЖеУутенимТМмю босими сосисок СОУ дез олиатту ЩО пеатлиткточимх ХМ акту ик веуют пдв мес МУКИ чи
УК Ом УТ слчтяхм МДЖЦИИПИллЕ ощураотаєх попа ТХ
Седрик «Мужик «емо мс Мох М зазчаеуусос ступити спон хатах пз статую Сх «КХНк Ота «и гак ст гі мук «КАХ Жілох их, списа жагУЧИЙ М
УА ДУ АТУШМЛОя
ІІ, лю «сами дух ми КІ САЛО пз рек 174 Ми Ждши пада сажі сит Фолух Ми Жедю Тих ху
ЖиУу ха кеш Кт МАО ІД ОХпА Ам ММ ХА ХМ им пе Тур Семи Мт « к 4 -
Кк т Аля ХХ том ди Вл Ма а ТО щі Ша ЩА ки оту. ЩІ доге їла Ж тм мух би ів ові Зни ХХ Бі М Мах ХМ жук КВ» Зх КМ Му туї хо й ж таец о пви іме щів фу Тл би хв дк КУ шШуєу бі Мщі баз Мк да ма Ббеофен Мів Бто хів дей Му ВХ тТМмт о ЖтоО їрУ;. УЮ Во ТМ Ата
ШО зи їх їхудо ту Кл сим гом АЮ Й МАК Ж р йо хи щи хо удо Ме тм муж омху ЗАйОЖУХ КУМ сСяА жу ж АЖ АКА ОУЖХ мот ЖЖкоМАЖ ПКУ Юух
ЗА їх «и хи Іру Ма бі ЗИ сумо Жмою Ул мех ПИ мч Щіх й ій ЩЕ суху
ФЛ ОМ ит МЕМ МАЛ ЛІЖІЮ НК А ЗУ ЯхІЩ ФЛ МАЯ ЛІ МИ МДУ СКМ кг -х пк ши шт 2 їх т: фуї МУК Фі Чигвобаує ТВ: музу МА йди фі тях ЧУ сх Мед ДЛ СК ххирошмщ ж гшЖЕЖ цим ос Кущ о жа кущ ММіІ сміх ТУ ще ФУ ме КК
ШІ цу с
З що Я яю джу Хм ін п ую ит ЗЛ СТУ шести Шеки бр; й ее дю У ех зах оБлхеїша Жух П3Х» йавобау й хо Шех Бо Аз Бе ет Авт злу
Уже Ух обу ших А м
Зо 0Тхк о дуужх Хух ПеХ Жат ЇуВ АБВ Бра Ма Хро Бех МЕ ТУЮ ЗВО тік ху тах
РІ ТК хи пу Ме Ам ме щі М ех фихє ХХ дО тил Філ бли бум м дм хи
Тух Мет Ар оупх Дів Тер оїму; УЮ Мех Муд Бу Мув БхУ УМ Бех Хец 1олкг, ух, ха
ВЖИ Ах МАВ рез жирі пе Віжх Пе юн жі Зла Бі тти вео» ТБ ту пчеБосу
Ач М ОЕ. Уж ташш дим фі ту ШЩошив КІЗ 1іл Тл чит ЗМУ мА д2АЛ ОСА лм хи пл
Тіш иЕ Кп мав Ази осУуз Зіу ЇМ отТУю зі Бцпа Мах Уа БТ Халл жу зах чої Кк
ХА КТК КОМА
2 я ші зм у ТО ї пі ли ри. шу ДК НИ тва МАВ Мій ТМт о ММа Мах тТук Був Тег о Жук ВІВ ліз Ту Мав Лія шу іо 1 Мк х тим ШУКше Же тії Ж осккх ж їлох суї Же: Ме тю СТУ Мету єр іш Мж те тех Мем Мух Бий хлі 115 ТВї їжа Мет шу да тЦх пух же с ЩІК зм щит хім ти Мом ик ЩДжк о МЕМ ук 2 хо сту тод ум дя уУку ох
Мтумх их УЖ ОПХУ Бве оті Мет Узі Тух Ніж тує Тї28 тВЕ Бай Ма тую дих пух піч
Іс ха шо б Де шт пУку Вус млі тні що Ж Б и пт га Вип пех жа сло ме: уві Бай дер тую мя Мих Аа Тмх БІВ х, чу ЗЕ омже а Я ХЕ дай тає Хе тю ЖК КА Ток уки ошла І. мі Мило КІ ЗХ У ОК, Усе
ТЕТ УКВ ЖВх б їжа їжа Щи Бе обма; шМі Бе БЬз Тру Меж МЕН: сдх ом 7 чкх 7 во М ши дм ших суки Жорж иа ск дів АХ дім Від Мо Тео тими Лю бли жи Баж ПУЖ Мул бук муж Дів йїа Ка дЛіж іш су буз Хв їжа КБух хо Ж шт дЕі ДА окт ю ВЕЙ плюровяю ло леШ НМ ОБШЕЖА МУ СЮ МУ, зом У шкпЗиВалутл цим нуує посипати х сучищИтиаци зп ици упо що шпакхцииіає Соц чити тал пут семи кци зок І шТТМЗТ УА ПИЛ МИ ТИМ СКМ КІВІ МУУУ Гомес Мо Мих це шЕсСитивало псусасициУх степ мщаиаау чужим вежу суку шу счсепиайлалиях слсотпапвут дис ктУуєх дуссгшахиА Бопосптапиа чер ФУй ситу джин ик писанки пе У ох пий сполхихху зКодИсплий ссспсвах пусто Козоопла сапосуму ю пива тьсхи жим В прик, ХОДИ ем п Кк пжМХ «ати схуоастат особис: чобота ховали «сота У питвом КИийщиКаєкс хиба пдоавае хищиалект мета Я питав рочу урощебалуєс зааутахухт застала су ховзсаиутх парез їх зали ми МмтУ тих песен ЖЕсчтМИк ЖепилтвІЄте МУКУ Х її зайти сито пейооерутх шосту Козплтто зкпапялатх ре и нан в НК В НН НН щах папи иа хсв завали спалаху штату савоциЗк в
КМИН ХИТ ем имий щи шу ин АТАКУ ж члаЧчуучиеслни пит иа лапу тчМм цап опти УЖ теєсетв сю и пу есери екв узами тес МВ ІжВ ср Може кет А
Ум им пилою умух пух димим ламууточеми мух че птаслиучКуМ А тек ек ит сири ин скиди ЖУК Кіз су ціле Ех слклсхаує смутно ихи папери писку рт сох рсушУккаи т коми есе у ереити оди з. М озезо ее Ки ложе теги ил. З
МУХОЮЩИЯщІ платиш ПИКшМХрИщшо паесоеа емпотОжоцао палацу па «же ЛО зага де МАМ бек опа АиУх шли
УМО Ж
Ме пів тм ЩіМм У Мох бусю дл тіш лтТуд Б. МО бУЛУ їх дл ІДУ мих ой тмт мм ОА ЖК їхОо о дХха да Жипх ме БО УЖ си Ха ших ї х їх те пе іс їши ех би ДІ Чаї бі Ще шлю 1. 53 фму Ж о йЖжнх щи кжх аж кемоїти За: йі Зах ле Ф3у САУ пам о уаМ о фока ЖекоЖве ПЕ п пк. У: щи їх З
Те щіх ме феу мії тими Трх фрх Ті їн ох ніх и ту Фах
Ха (ре уже Мих ТА їи ПАХ Біх: Ті оїлн судо оди ек о тхо ве сві т пл хх и пи ах їх Тушех Мо Тож я Й що ки ки Мк Хто х злак хлоу
КМиш щже Лу Мсух пу Ді т Меч йац Пи МщоО ЇїМа вха тУх АщИи Ху у У т
Жищі Мі бах. ФГюе ХК: Маки бі ЩО. ул ММ ХК ух шах т щи
Ти Ме жк аж дб фах їжа МЮУ Ме тЖхМ Сув Пів Ме АХа АТ шт Я їх ци ню у пем о бив Аж злу Вів Сем ШУ КБ т Ви й см Ж Пух ще БІ М ха їх ді Щи ім ід Шик Щі ух Мат щме Ше му фут Вл йКх пзможат Ух УлА Ж і ЖЖ Ра оду Уві шт Моз лето Вт Вів бе мк МІ ща яр свому Лот Тит Же лює фу хи що Уж ою Ім що 1 мо Муки Мщом Ж ух
Міз Аж Зжжа Мер обцае ВЕЖ Тут дип Був Узі Ака ря» Між бух ЗХ Ух хх їх ії
Чин м т ма Жеат. люищж: а ех суч: Та ДІ ско жом ж; Жде вм тужх ЖаХ па тут МИ Бод ТЕЖ оАХМа ХЕш ши УА Юеч Бу ПУХ БЖ ТЕО ти чик їй
Дт АЖУ ЕУ сЕх. ттиєк СИ таті є ТІМ Ще дію що ших Кук щдіащ пак М М
Увх бек Же Ба ша лу Ба Між пуз Баз Су йі« йхе Те Ар тв 14х ту хх мВ бши Ба сбжу Тіш Ж» Ж шип Ветобід шУх ЖТх жу Ух КТ МА би
МКМ М Ук мас одйав дів Би хі Між Тих Щї15 Май ХА ТВ тує Худ Зі Аа хи т п я
Ми ЕХ ху х туба шум Мік уж 11 Шах МщиМ о бйещ Мхтю Ти і Ма дк му ІМТ ля Віз КУ іх Буз 118 Ших Мек уд бжтю шес ка жбеА їх МЕТ Ая т У чих
УЖЕ яму. дм
Хол СЕ Пе ЩТххУ. Тут Жохку тки Ма У то ХЕ бум Ми Чт ю их Мих хало ЖІ Малі ЖИйМх Бех сам пиж ММС Адм Ха ож КЕ Тух кю ТУ тура т М
ХА хх я їх: 1 Лук БВ Ат Та лес бто ШМУ їж УЩІ ТЕросМее тТук їм Бр ххх, сктрі тохті суд кож я яхт ЖЖ АХ
Мамо Кл свнк мм її иех Мк Да Захує ВИ тахме М Ме баня ЗМ ше
Ази тує ха Жух ММ Мем МУ ах сю ЖЦе Кат Ме МЕ Вк Кіюю КИие
А пт «уко,
УЮ ММ ТКУ чек іх дм й мМ ща теме Сл окт ект їх ж боях Млл ошую Же жЖЖк пдв ою ложа Кп» лег пух Нас о Бу БЖ їХя Бе дуц ХуЗ АБрОпВЕ щих хи та
М ХК ЩО джу Мав о дуц Мат Було тм ПМ сутук. ки пт ле сліпо ДЕ в Мих
«ЕІ» ЕЕ хи миті сея подих та де
ЗК ТУУ
«аб екхуюьнснтети ВИК икк «уки КВ утеплити Кк ет щи перу туту сфоосацатаеу саскфууоч дипоийлту сопла попи п: «жесту. «КИМ ст. «ІВ НІК СІК ПЛ ЖІ кити покміА В ІК «М ВІ зал тутшасотщоо мило кч сало час попиааалучо ппсапакое сота такчи кл сус МОМ УК УК схо Ум ЗОВ кити Кук чи Кия пестити тах ззоллиу атлетика прибл жеи отри сирах «пил ютосу Са зпмттІМмащеВИ лив пил мщи Балла комУк лев мки пе ІЙ зушкуушлждц алу дип иа бла шух. апп припуск Кк іч вм лив КІМ ев ему КАМИ я хе ЖУК уки я чих ит
ВЗ алу МИт пипулящуІсе пед хниКо спцпицамКи сиппчтиІшчИИо пі женці ген мім жимі кми дека че момІ Річки ІЙ шхФмумухи мхопюхуимиа опе уєчюво плову флритреицу. темах У с В НН пи теЗуузунжи пе уюиму суп ушашито лілаашеуєих фрпплиукх. сипихлиеким али скиира фс уцИк сапу ину птоз спиш Ешоми стуки кН часу мкЗ ук уЧчузох список леми в ас удуций плату цти УМ. кс пошив лосі хз иВ саше пекло т
ЖЕН Єтташх КАХ УК МУ почи сф пеки и ис М пк хропе сстму Іс оххрх поч очивца сечо апа БУК о диплому ЖЕ с Ву п цим мм кт В ВК ДІМ М х теле зссзатави зожмрспаа сососсасавх зазор счсрчсттах зраопсошще її доми ММ ю НВО пгиит М зиму пит М пух Ки ВХ жита хжлацтм Чижусхутттюх доросли цаго шило сімуи пери поло иа М зппппптща щадним шу форми; чор птщу зп ка долу: сМідодоМИИ спади СЕОпИиАК тю Упр сх дт чий щопецетх соваоахх ра поє сосок коцисовлия сс й пики спидилтаа пгдондткт кома Усик сиди си цип аихх Тупоощсво сіджссайпти сусло шлаки шоп их ВО пи УМХ У схуд жом тома окт см Муло Мапи зЗиппаледля тупа ху хмииполтитиях дж тт МАТИ Сеат. ММ цілмутувенних уми виУ пихи аті сплата х сисдпрашаМ муси Ммнип цеха мв шипи скали шосе стумоиаатну муза МН о В В НН НИ її
ХІД ЕК ХМІЛЬ ли ДКЗ МАМА С ЗАМІНИ МАЛА КИ М
Ето Ми, ТИМ пт. дитя музик Ж Ко посьсхиї зола аплахтисвах поплавати о спирт зус садимо спидиее сти Ух уст Кр МИ дев лик у УК КК ув ик им КВК Ким хЗди пасеожсхі плит сіл авсохо зба вос сосцоюаея сагпУзі ог хи
КАМ даже В сх лЕОВЕТо ЦК ВЖЕ тд шихти чт «ІП Ол жі. хін ст АЖ
НИЖНІ ДІМ дО ЖІДУХТУТЬ ОДУ дак, ТІМ дюшех «Що» 3 Мо є сМкую її и Ша Вл мах отут ДА щіщ ПВ хи. мух БЖ ожіУ пхх йеро вел пе пі ши да пух хо Віа Ліз ШИ 3 х ІВ 15 її пз лмМуї дмуть Шуми Фе йокху Мл ЇХІ12л о хжмМ см шу Ах гм ду б жи май пул о хпі тус пл пз ода МАО Біш Чаї Пех дав оійа Бародшт ТЕ
Зо р З
Ма Хм. ЩІ Тл МУ Жид; пк 112» Тома дюєтх І йошту ул Тема тм чу ав леми ХВ б ах Хе Жбуж бпау му й) па о Ддшр ах шмАу ух гг хе ух и їх З Бе тхжуєю Ще сур дія шо ІЗМКАУ З ТУ Шу стаю Щек УК вк У М. УТ и пк дош ТНК МУш о Бжо Бін іх дек су до бе А; Хе мн ІМ БЕ з «их п п зи За що фл хм Мід ік ля ПО ФПУ 3111 Живу. При Мі МипУ. фе ща: Віл ул пипрююе лах жк пачка Бе бЗім шши УЖш НАВ ОожеХ ПМ ЗУ АТ ОКУ
Б та х ще
Тдим Ме Мік 0 зх суї Ми т тумег Том. луки Хі йоптх ДЮХ їни: шо ту
Був Мех мет маш башж Мах пед уз шу Ж Зоб дж р йха Вко Дія ВК щу Зо ЗЕ три МІУ БУ ЦК шк м теки М БНО Тл з ву п. Ох. х М вк жо бам КА ЗЕ щЩіл ЗБ Жто МеВ Обплу уз жо Б Луз вла М їй тих цк
МЕ АЛМТЬ ММ с: ИЙ силі Шо м уд Ма цк полоюх Уже Сдеме воша їз схаїмо Жора 1 йод
АдшЖ Ж М МТ пап ос. МКдо вал ож у ЖК КуЖ АЖУ КЖТУ було ФУ МтМхУ РОБИ
Ух ті «г
КУ же ах пій ба шує для тими: суми Жар ги пляж б хм: ЯМ Ки да тлу Ме
ПЕОМ ІМТ миші шЯХ МН Ж Ім МУЗ ЖиО СПА МБ УМА ІА У КихУ тхл «М. яд жпМ А Мт
Чен ШДеММ хто Хо М сли Мило "Му. Щеете дллах «іт МО хх ДК, її Ме
ТУЖ МИМ м: уз дай осла МВ ожЗХУ ЗХ о бКо Мам оХеЗ шу Аха Бех МЕ та5 КМ 55 ЗБ
Зако пек Бье бі Фев отТуУЄ їжи МЕТ ОСЕУ Ттроіму Кіз Між Ме Тут цес пп ух лк: хи ЕЕ КІх
ЕХ сі ше лит щі м лк МА й ее тиж хи та ск ех ох
Вів пуп освж Уві Кп мух Зіу Пежо Узі йівз Вк те У ЗА ТттИ ЗЕ їжО 1 о зи ЩА дід ах ик фі том бує фбімо са с31 хіх Жук щі хо хи ху
Ввт БІВ Важ спів Ук Кім іш бу БЕ Сало т ху Жух Бі ак ОА я дО яИМТУ
Хтджу Тк Ше В смии Мо ач Свв жах шо, ТМ мм люд Щодо У Міг
АБО ЛЕМ о МУС УуМа ткоу Ук ЩММм ум У м мл жа щух о хлА пи хм Ось зу шт хАЄ ши ХМ тки ре й Диуєюю дути их тую СКК лю пи, Хот Жила УК яю КИМ Мт пл ет АЗК о КхОМ лЛлш КІВ Кв ТІ Аа БЖ хз) Ми Ха Ту Ті т «Ух, Б Я За яАІУ жук хх і щи беж же ех тт Вл пух деп обєм щи дз ІЗ пІіхй Вуй бук під щац КУ Бтс Меж Лів Вл Булодує мем одли Аз Бе пімх ба ТЖХ ша
У УК ту, тах ЖИ ТИХ пуфи Леди бак тую и пли. 3 дев ЩІ А тих 1 філе Сб их кни Ли шій Ху Хух тет сш Бо УЗ МО Вів СЮш о пем обзу їй їує Тр Ах
ЗІ зах за
ТА ДЕ йо тах ЄМ меш 1 т зд ху ем стояк голу жи Мн хоммух СТВІ
Мах ох меш іп омвла бут ВИ Маз Меу шо еюу ШРІ Тут Ме їдМмі пить ск, де чих
ХЛ У пи
Ух щів їж й Зм СІ Уа Мах дич Даю ж ЕМ дл ли не Ум пі хиМтК МІВ жа па МЕУж Уж Аа ІЗ тТух йпха ха ж АХА тло щУ пе за тай шт шле ж щи п пір сли Зб ЩІ дм їх Тату так ід АВМ ин там МУ Мт ях ІМ пла лу сУхп жим маш хХшмо цем ЕХ їм що ХтМХ жал. МОСК У Те чих ту дах дп
УМХ МАК в ся пі тк паю тла жи их їй ща чем цлшо свіе полях її Щи 1 тм паж Тек ову Хе ХВ ужхі Б)е Ліс їпу Нхш ТтЮ ШІ сім бзр о В1в о Бях
Зх ПО Ії
Тек ЩІ х ж ух Лк жі Дотзе лілах УМО ж. дам ММ Ту Кк Си ДЛ Тих
Миш діз АЖ оп ХО Ат міш Меж Тйх фМемо жа ФІ ХУ мг ОД сх
Зяг пах пе
МАХИ ПТУ хх змо били у жі букет Ж бами У І х ба уко ЕХО уже ІК бом у ях
Тпх ше Ат вит Хе Бай Зі Бі Ухо? оМех Мі Мей Мал леви ХВя бу г щшх зле лий пихи ЛПУ
ХУдУ Спр шодо ШРІ носу ЖХє і ша ЩЕ ж: хх Му Ми их СУ чех
Ме гію фу баб ім оЗиж З мі ле Мао жма БО Мах МЕМ о Беє жму
Ії Зх тил піз одежю їли КИ блимм о муху тку: пелет ж М й хлоп Ух Ця жуки Ж
ЗА жеши мем ОожтХ ДУ Км САУ СТО МАЛО Ума ЛІД МАЙ КІ СПИ Буш ОжиЕ
З КН ЇЕ ЗК
Що Му хх тм «3111 нам дюфія ТМ зи т та 1 ку «ла ет Що ую ФЛ їж му щмиМмоую жЖУМ ФК ЗА юс см УМ Ам О МЕМ МА ТК ши лк, пл йо: мМ лм БУ є же дк іх дл шу м міх з
У стих Діх бом Дів шу: Й Щім тм Їду
ТивИОМАжОМЖТ МА ША ФУ ЖшЕМЕ ХКУМО ВАЖ АВИ ІТУХУ. зх хе. їх ТЕХ
ЕІ ЗЕ
МУ 5 дл Мід бю ТАНАУТИН
М Містом жууючихх маму дує зом у. чиї о Міує им лузериути драма доМмжтУ «НЕ ЗВ шт Світ: мії шфоміх То балі уко ЗЕ: іх фета, Містом дух МІ іх Кг
Хе ЇТКС ойам ОБО Бей де Вп Зі; Баш Кс и жет УВІ Мі сум КЕ ї ї тхй 15 по Ями Мін Жлмх МЛ сг їжи Лу жду и; у хм жу ЩИТ. піхва
Ву Муз Ме емо Біж Мжи Туг емо ЗеЖж Уа лаз ша Во Ху т хв люте «ХХ У м пр ожта ЕТ ХВХ жи ШУЮ Біб баром; тіж бе Зав Бей МХе пе ху
ЕЕ ді їх
Мило душу що Щит. бом Ми ММ тії Мі мем о ужію Мч Мах люліку Міо гам т жа пл Зкч дЕю оїжЕ УВІ Шо Зіз Тцу вежу Бач тут Бсе Зіш Бр їх хх З
Шо ДК УМО ТУ ПЛ «гля шу Ми ОТ «Тло хг ма а Ще сх
М ОфМук см лем сю су ик Мити мух ла сх БИ о Муцріхх КиФ лах че то У НИ піт бле МІ спе У гом Шео Міх сом пут бук ід ог Зі діа тв
ПпХМБ оба Бо сухо Суп бух Бто Міх Су хо Бхб щі Пи ЗІБ Аза ТВ
МяХ ЗИ Б5я хі Ми йди ла сів. ім щі що плн щем ім ше Ж о пи жах хх Вес дрож поь ві Нав охві фр с Зал Фф3ий ит Де (3 диму яп т «ах
МО м Ки
Хві же бух Бхо у
М
«ПЕЛаух ЩО кох зах ждали ЛИХ «КІМ пи ій ДЕК сага ЇКМрМмитт сжтувюхИ У КУТИ ЖуАТИККИКИУ. ЛЩИЕШЯЮ КеНАЮТУ ситне З сш ПЗ зусуцатата сатуусудиа позу ицих павусусуто влуднукуиа кавуна щи сипушшУйад яке КИмКи ПИКА УХА ЦУ ЗКУ МЕС ІА жу
Уушшжахиа у дес ошуцт ЧУВ ЧПУ сиМаАм пу мхци пи мИА УМ вжи ІМК ких МК ет кг У Сколе а візи пек ких ау пити ть уижаииаУуМ юусвомимухи ЗУуусотщцче Зппуосичациу ЗИМ учу полу дув «хм спиш лие см Кін ле вИи ща леми Ам Мед чих свмносаиспах том их пЗувсискима «зцсисшайо дачоопвизах сао а Ка о и І ПИВІ АЮ ее тек пі х. лапписсата шссосспийицх слизпийпиата пацани их зда нниМих З ПнХ дум о
ШУ БІ ти, 11 ниє п СМАК
ММ дхашішеряне піні
Му й щем лу її ВА іх ля ша жа щої бари Жид (01 їх Жди Шия ДУ шел Хв. фа Я Би с ши да ЛИХІ МЕТ» Хе ФфМУ БМ: МА Буд фу»
З х Мі її зле Мк ся с міц ох ху Тих: б ії. Мід м ах сво лах ее
Хе Зерг діт Пшм баз» хі дай Мзи ВМиш ПУуб Віз Зах бує Тук Удх Зк пп ше хе
Ж ща: ач Її бу Ж дн СВЕри паху Мале тих 3 Щит дам кла ді хе. ЖУК о жк лм су имя мЖтТ УяшО ГУЖ ГЕ шу ММ о зІхМ ХК Мах ха хи пух ди пи 3 ЕХ хі пам ек роках тажею ТК жа. Маша бкм лі дл. см: их бю люд ЛАКИ СЗдТЙ Мі ТЕ лю лаб сел Мих тТиш Кеш мах са Ер охюр Лі «г хх х пи в я шою схе тд Ж г МІ Ти жу «у пам шу гаю ВУ Бах дуже що МОМ -Іу ВА ше: Хі Ів МАХ щі ВХ МипфшоАЖИ му ЇЬА ЕІЛя Мило БЖ МУ ще 4 -к п пи їх ее щи пла ди «и Ма з жі: М лою сн й Щі ож ша Ми Ж Воля
ХУ уж бій пз Ва суха Зі Мах бух ДЕБ Ніл дже шеЖ баж іш Аве
НУ хе з де, Хе В «ліку и Жду там ую пі м шик З пу ху би бо ж ду ук меч ува Фе ж іш дм За. щі кп ех жу шШуж ХА Мт пиХ
М 1 ВІш
Міз бе Мід ли Ме о бомо будую Се. Хе Том Мних. Хом ти МТ так: май ле ліВ Зп пах Му оїйми з жшЕ пу БИК ХУ Буш Халл ГІВ мах ах у а
У дк їй
Чак щу. Ми сб Ка: Жду бак, Мою даху Ша Ум (15 жу Щи их А
Тр о леко меш Ж молю хм сл ДУХ сш гало мл ж мл и ТМ МА
ТІ їх 155 жа й пОбах ПФ аю там Зм Вих У ложу ер й ій мм о доли ІМ муж сУуВш мм о бех ЛИХ мом оМее шу Ум Бач Зі ожЕуд мим Бе АЖ стих зах уке ВАВ ща
ХУ: УМ ск ТАКА СТУ лем, Що мм Ще М жі лях Ж Дози ли во
ЖЕКу ТИ КТ ТК ли Май дм кКпОа Ул вм су Ма ЛУК МТМ лу тп чи члух,
Ех в яОТІЮ пі дія пох їм уш Віа мів ЩІів Щоб бутку діх Ма баг Ще ах бмхц іш дів бух вм пу вха Вів ім Ол тую Аїж Ва беХ шат ЇМ їмкд їй Зих ча
АТУ МИ ІМ їх ТЛ г цесі й дл Ма т ігежу уже Мк где а ца ЗУ мА я КтТЮ МА УМ МА КО І МО МАО ТМТ пПЖжеЕОІуУ гпяЖ УА сСМЖХ 14 ситу. «ххх,
У ЩО пох діц що шуми флт Меує досту и хм Що зхекшо й ху гу. Мк» Мих бех іх тшх ШЕж МецпоМес Мою Зеї пе Ха Кс Аза ХА тТух дюрок тих шк Ух Ух шо шо БУ с ми фу. и тк Же щухи би, у. Шекіх іш Мишк Тилеє ух Тими. МИ
УМ ожих Та ЖИ ОЗСжи Ж ах Мито Бр што ЖЖ Ки шви Блер сем КТ
ЕЕ о ре чи тех Туру 31. дим цем Мі бах мих хі пт Ж. Хо ме Мід кпує
БжЕ їХуЖ Зі Ви мех ува ЩА Мах УЖ Нуя Хіе Хо пух Вал жеатл мех хіх чний сх
Я ших шиї : сх: пущу тілу зм бохо дл а Кі (и бу их дю дк
Ту ВЕТО Мем ТтИ сує се бжрофе лі Тв Бізоій ХЕБ Чув АТО Ла 7 теле Тодек мА
ТЕХ ЯК хі им ж ЖІ ть ЗМ УДО лоти ши М Ушт Жокпу фодух Уцих пд ота ЩО ВО ми
ПМ Ме Зі Аза Муз йаро Віа бас ци Ва» Муз щля Хуе ВІЗ Аха Мои т Х мому 5 се, ск злпд
ЖІ хе пий пи Му Мк ТЛ «і чу а, ФО дату У и. мах мину, Ли Том
УВО жтУЄ Жис шАЖ ЗаЖО шхй За жи ХХ Міу джу Кз Біо бух ле зо у чи
ШОМУ пу З їжи Дів Мах паї їднд Шпех Же дів сш Ма) таму Ск її ух юр т ха о жа хи а мих ЕМО лу жі ля ЖЛЖ сх мАЖ БА ВКА зум. чай Ух тиху
ТМ АТХ МЕ ХЕ тиж пух хм Щі сржу люту ШІ; о гою Мн шу. Ффауєю Лук. сту ТІ Ж ра У рух.
Оу о жКпб мя мах жЕхюв обБаш зам ом ми ет пах ха мух мах ліФ« м
ЛИХ ШИ щих туї Шеох о дуїсю їдМма ЛУ Лк п бю т 1» ху Зм си Жим ПА ТЗ тк
Ха о пех осів си шию ли шум ЩА іш лих сок буд Май Ла біФ їду п де Ук ши їх М т щіхт Ми шШижт був, МІ лу, Мои бо бе з В бе МО ХЕ думи аб ад ле К МЕЖ С БЖ пух вч ше Уйх БЖ дід МмжкОЖяИ МАХ АТ ах Уч сх.
М о ВУХ прю ат Мету Тл секу дк НІ Мі фе лин Вщж о шин Мем УМ Жфє зх кха муз Што пув Зл Аза о Ній Бі Бто пе Зею пат пелОбій УйлопІ о чих чит
За Я а жви піц тих їм їх хо зд ду МА МЖх
ВХ хі ВУ «ія ЗВ лереУ. БАйОК
ЖК ТАШМОотУхТнюх ща
МІХ. ох.
Па Я х як З іже МУЗ дам Мам ВМ з м й ех ко й СИ аз Ж бо
ХеЖ ія Ме ЖВХ Ат ХВж ляже бек Ме та бо БхЗ Ася шу пе Буш : г тт 5 і й То їх
Фазуі Ку Ат щі щи дм мит Мо дих дує дом ПІїхЮ Ул ро МЕ це ха Уда Вів хід уМае Аа Млю МЗЗМОАЖЮ Пуй ЗЕ щу ХА ХЕ МИХ «ух с «А ях я «МІ
АЮ лат сх сао тях сраку шеЕзих АЙ ил ех т. та хх ї їх а пк ої мех шжи Мне су хат юЖМи Мах лез ЖК ха Ха Ми МЕ зх сх д їх Ба Зо тла жа пла МІ ла Се ШІ лю З ще Ма тами ФМ Зигі усю Мр хе отв піс У. АХа тт о ша Ше фКФ о шех жі др їм пед Бус тТлЕ 3 Б ж рис тую Му й ті йий лихим 431 Фуде блюд Мою Маю цім ті Хлаю ро
Кит ожУЮ МУ йус ХА йгц фею; сіу Ввй ЇМ Тук ПАХУ Най фе МБ ому
З о ТЕ що сх жнив уд (і У думи тім Му Ж см ть ху паж сих УКі Таз Тк їй Ху Ффішж ХМе Кат іш ПУ» Же ЗМО пхУ ех що ЗО В га: ВІ пору її хи Жим ді Що гл хи хо шує Ми МіО Ма Ми ск пас міх ТВ їв Мух дж Біз Різ о тбую ді шежЖ бле ВУХ АМа лек тує «тих ххх їй
ММ хи ле гло пед я ЛЮ ИЄ Ми. жах МАТ Мах суч Ти. Вс Пе ОТ: КИ хх бух хх іс Дер іа Ме фце Уаї Мей тку хз Дів БО іє ШіМ ТВ УВО ФУ 115 ХХя МБ «ех сля ти Хо МОХУ я Ж кю Му а феаутею Луча Ж аовх КОХ умо ЖзУх Лк жщ свй мжи Муз ХМ УЛАС БЕЖ ХЖЕ тут КУ Ма емо шеЕу соц УЖЕ
З з 1
КМ Зх КАХ пре їн Кв ші М. ті тує м вх су дк дам пт дім Вуд ох здтТй МЕМ мул ду поАй лож мм Ках ЛОТУ З Зежх дам БЕЗ йіз Аза Бі»
МА їш їх МО ж ФР ЖбІхах Жди туту Ла ЛЮТ х Хм я Чл Тоз ся жін Кукіуї Ж люусхх ср.
Хі іх Вей Мох Бк Шум Вів ах Ки хаі Бі ТВ біз Ууш Вл бос ще ЯТЬ ск, дев отімі Ух МАМ УМ. тю ФУ (Ії тм Ма се УУКІ й піду ре ову
ЖИ ддМмО ММ жУМУ М КАТ А Ж Ал ОАКЧ пат Ку КИ ХрлУ МЖК САМ пу ак «пи
АЛ КУ МІ їхщи жу ПТ ЗУ из ля Шах ЗІ Щіє їли Ал бом 12: Шоу ЩІ с хм бтоа ге Му бух пхУ ШТ Зах паж За ВІЗ Бема М Ше Нр о юеи п Ми сх, тпм їїжо дз Мис Мао з Хі Ма Ма: ММ крах тич ЩА мя рих кг ту ЗМЕохах Бу Мет Хе ад оїпх бу ТМК МІЖ Бех Віз Тхр опе БЖ
ХО шт Щи
ФІ ую ЦП щує ЩА се ж ЗА дк, и іх ЩА Оз сх Зжкк Та Тих піт ве ги» ому А) вка Бод ах Би тіж ТВ Зах бух Тух їз Вис пелет. тру ки ат
ЖЕ ил ж каш то 112 дат зт ДЕ зх Шут Ух М Хм ок їля да: ВЕУ Жеу Ук їж зма оват ХБХ АВюоваю Ттвотйх Ха дже опух ХХ ба баб Хух Ж скл ку зх
УМ М ях томи Му тлу. Мо му и: Мел мо ДАЛО Що йому саме зач й ую КР: гук,
БУШО МОХ тіж МіЗ диво охАВ туї УдА ОХ АЖМй Мед БЖ Аїд о Бек Зіп Пух сиг Ех Б шах ХЕ Ко и ач в А А жо Мо сіжЖ ЗЕ ПИ бле ду диХ БК хх, пах «ки ай
Ам ОВИ гу не
ЖАВ МІХ ее жо кА ших сту ух, «подих фа духи ше мг, чи ломи сущтУут мекежтЕл
Як Зх мк ому умі КЗ с: думу ШИЯ Тим: СЖумю бе Жим й Маки МІ ам МА
Б-т ех ті БТза му Ар омпв шзи Тут Хух Ха Атор над лю іш Хв ї : Я хк х У хі М шал укл дім дм мл тлу бує В: рух сист ту дж Во пу У тА мшжуС АН мимо У уже Оу ги ОКУА бу УМХ АЛ хід мих ДА
ХМ пи СМ
Жовті. тає Ля та М тий. МЩІЛОюЮ Ії. їй ии ми е Ту ДО а. кчш мушожипХ мух дж Ж МУуш жа папок хі МмАпОХЖБО ЗВ ХТЗ зи Ах їх п 35 Ко
Може чик ДИНА СЛ Фолс мк тю Тит пи Ж Тл х пи о тт Кух пе тую міш Мах Мек бушщ Б Ме ої Са бе дяроМаї пив ки Б з х щі са тд хх 311 «иа деку чі Ла ЛиммО бо ни вони що ШУ
УК ах зу ме Ми блю лем й Муз пух Кхо Же тів Ме лі дід їх 3 15 ВІ дики Щцла щи Мом стфєю зх Жде бли шо МУК сїхюї сх бує Ул що Же
ХЕМОМАВОСАІ ЩЕ СЕМ ЗУ; ФЖИ ХЛ ЖІМЕ ЖАЄ сих (Хі дл ХА ШЕ КХ у За ЗЕ дія се Фо их ЖІ в я Зо бозик оту: ж Ми шо тт,
Ми о уУ Су Тих а тве вка муж бух ех Мем фуш УЮ Мі жо Бе
Мох М ІМ т та тю ІД. Ми еЄ Сл я лох сю ТУ Ух сіє ФПУ Мат слхкюху треит ве м'ж ММ Кровна Ме Аа їжи) МшЕ ФУ ХВ Туж бе Ме) бЕроВКл ех «ях хни «Зк
МІ ВН Іїх
Хлух Джип пе пл, дів Тех де Миу 3 щоих сти сли Мих ШУ дих кщЗ
МЕЖ ЖУЩ УАЛО МАМ АК МАВ дже КОМ м) сУЖІх ЛУЖЕ ОЖ фиже ММА ІМЗО СХ ах «чк пожу їх ин їди дю мил їх пхжее хе думу бом) ех луг тім лиж, Му ШУ духу, (41 МАЮ ММ є дюни
Пук о Бти мех був Вк Лів Її Же В Бе Блж Бі шіх ТВК дкч ех
Б НО ІЗУ 155 уми бе му «у токюку ЛЕ сх ла Її и ше лихих Лос Мо ДК КО
ТЖА ХК йпеЖ ід обл Ме Май ме» Бра Би муж Бу Шіх Вів бе мів
МУ ХЕ ВЖЕ тич Мі лю Із Мілля хм Ух шо ФО ДА ОФЖАЛЬО Уматех. УжШМ МАТ УМО коуч Мч іже Між жимі ша ку шуш Ме КЖс за о Уда Мис ща ай Ха Бах Зх їх 1 уж
Шк о щию Су там АЛ Ом Шум демо Ме си М фу дя Щачі ЛІ як ких
Те одех ТБу ем УдА шеуУ Бе Зх ТУї ПХю Уні вца вах Бу УЖ був
Ух сх сллуц
М. МО шип мм ті ЗЛО бут ЖІ Тому тд фе їЗ си а при дюн ЛИЖ их Ток ехо лішж жи пл лі йо МБух БЕО ота п Тих сум лих Хюши уп уз спід пк си
ІМ да «ам рн Не лаг ІВ шк їм паю їн Мх дже. ша, КО б б Кожг ди ув Бе паж бід овпе Віз пі мух УЗІ Атоа Ар лі Мет ХВА Аж зх За ик за зх. тм тоже 2Уїи тло ту уд би Мет віх и ще м че ке гом
ТАЖ ОМ О МУМйОАМ я КУМУу Тут жах Мжт мІЖ Же мае си их ЖБХ КЖМ так ЖД й шує фот сю Ву 1105 лає сту ду В тд сю Ці дим где хи хи тб гБух ПАМ о Ба ша Ту вка Ба МИ БМ Май АЕИ МУ ДУШ ОУДХ сук ке ЗА
ХО ХУ хи дих уж Ми шо рю си т пек ЗА феміз Фиу ЛЕЩО пжо ти Мі сук ам осжа Буш аж (Ма ОЗБлІЗ ШІд оБЕО ТВА БО бшжЖ о Хя Щщат ХА ЕЕ ДИМ вк ди ше
С КИ МИ дит Па ул Тв ім Би щШллу іш шк Їйхи Шк: Тех фу Мих ЦІ дМшроМаї бе ТБу НІЖ жи Ша Піу Заг ошах ХВІі був Бе МЕ іа зцпи так люд, ре ЩО ЗЕ
ЕТ хх ши сх «я ОТ
АХ о «ил КИ Х -уї3 містовстах мижУуМха та ах
Фе су: фан сМугк ХМ: Мемах Мч що догм ал МАЯ Жим лу Мі ШИ хх дес М
ТвЖХ БЖ тку Сх ХА тТжЮ КпОЇ джлм Ущх жа шу мих зма жу ХЖК ха ї 5 їх 5 1 м АМ їх гі пре ск Хі хо Ме Мою спе тики І рю де тил еф піхоту мкм о гиж о Щипх Віа тТух ХЕ о жет тбих Хлі тбце Мей се УщЩМ Мжт Лі ММ и Ук зх о їх 55
Жах Тому зд що гра ИКІ Жлляе кю Мом Там жиє ЩО мо уж їси Ме сх
МАХ ОМЖИХ Уж МАС г ж А шт Мах БЮ Мам ОюЖХ МО МТУ УЖ иЖ мяю 15. с т
КУ КО А зи ік КУ Зв УЗ м Мучюх бю, СК ж уд хе и рах ту Му Жах ие
Тк а те Віз пух ТтроХяр ТЬБо Бсах СУБ ом по ЗК ТигоОШі» Мох «У х т
СІ ОЗ ко їдким пр ли г Та ЛЕ дока Му тує І хе Міс мо гам Зк Ж му хх їду йо оку УщМ КУБ схі Ах УА ТД шу Биш Мі ім МАО ви для
У ТЕ пп т пух бом. тю Ж, хитає ет фо гум сти тили хуя о Москет Му умі ла Же їжа фо Хе Мої шах Блоз Вів пов Сус да бух о Бає Жбрро МУ п п щ
ІМ бі кум фо у Мід тах рем Му хе ху ЩЕ міх ЗЕщлоО пади
УТию ежМ ттТМ ох пеж ся зма ос) ЖИкх опо Зес Мсу Ба ОБІіЗ У ПУХ зи ячуй ті
Ще КЕ. 1 тр о жЖню ох Віа хз Від зби хх ім їх децоах її бео тла пед ві жЖне Кох За хв Віз Був лат Ш3ій Хі дра Бах Хе Шес Ля ма тт тих ясУк,
КМ 1 їдо
ТЕЗЕ учня ую жити Ж охи одАуху. Ми МИХ Мдди. М. Мем тю м Вк шию тя
МАУ Те ожу СШЖИ муж им МБ шу Кт Мал туго ЗаАА МЖХ УГО акт хж з їх К їх хх М: рен и НЕ НН а о НН и НА пежожек АТ йод у УВО ЖпХ МщК жЖе о фІіш ММ пед с кА ВУС
Ах МО МУ Її
Дегу ся Ти по слу ин ж ді: СТ хх тати Із КУ зує дких
Агочойхо Ме» дл йіш ВЖИ Ту шоп зше Аджш ЖпЕВ БЕЗ ори Су М оду
М іт 175 пи жа ем. ук М т. хо ЖІ У у Феї щетк дам деки пами ЩІ ток ле тт лих МЕ Зже ап ому іп Вк дою ДЗрофдм) Зх Шут Віа Мух Вжр п «х «-ййх
ТМ АТХ МУ поіхк там був. Жити Мам дух пох ФЛ. т гам Ве ЗУ ди щК Хо лу
ЩЕ вел баз Шас Метй Бжа щі мо Че ім бВяа бж дер шлю шМх 745 тай ти
АВ М МЕ тм Віа зимі Ти ій бле ЩІ пок Дім бо ік фі» щу буд оскУух Вк
Ким ОХ М АКЖЕМО ФММ АНУ ЗХІДІ А КІВ мух МмАЖ о їхиИХ ща хУЖ ТЕКУ мА дм М шЕ
Тлахи Ст У, 1 дих ммУю сту ФІїс: емо сріи Мен й ам М луку ІМ.
Пе Ха ЗА дж ої. ТУ Ка б Ту ЗУБА Бар олій Ва ЗМУ Буш БУ пух У зе скдкх
Ах ки Мо я т. . уся ШІ. З їм Жах тка ух би ЩУКИ МО Ах зи, ЖІ М. жі
Маеаз опух Бу 3За вда Хм Сію Тв ойха Суб бите Фу слот їм ВМ мух зах й ХВ пе Бім бом бус Мал дів зу бом пі Пі ія Шрех доху Сх ІМ дет паж ша мем Ко Ха Ака житя сСУуЖ ЯМ Ха: дл: Ки мяд УЖ о Ктм» БЕХ
ХМ 55 КЕ
Ма уже хе ЗМ фут Пп прі: ліз мочити: 043 хау у: МО У ЩО що Мем
МЕЖ ОлУшОММих Ул жЕкр йХа су шум освщ ж Амур сад Ха мом олах ТУЮ хх ий пе,
Я М ХЕ
«3 Ххху Здем Щи ех дк ен АН йо МН тниу ШЛ ЩЇ о Не ЯНе
УМ ох Му МАС жиром Бу Му о Між зп оМаКл меж ши Віз Су дія «ав под
Іа ие Іл її їв па тех. ЩІ по пл м сУф.:: ФИ1 а. ДИ ді Івах сб в Мі Ми ПМ ху пси їла гу ап БГВе БЗаО жіх УДА АХ ЩМИ ХАШ ПЕЖ ЖИХх ЗХ щОх их пок, кожи чхх чит
ПО ІВ ККУ Зх пі Ми шує ї жішкх Си пу кю М Б ом ситу ІМ. ел ему
Ма УЖ окис ім; меш тТпЖ п ОТпЖх Аха Мт му Ума Мімю ЛИ ЗаА лк ас ках с хх У «а ба ПФ х тим А бігах Зал 11 ри ух пл Ми Хо Он М Ц. сік пав опу Меп сах Пуз Зі пу За Уа Пух Зх Пат ТВА Ді БКБа бас
За ве Зо хм ом З лю пух лою Фу ях сил т Ко ку жи пф
Вів оттжк ам ів Су ха ві УЗ УЖ Лів із УВА Хі Вії па св и ТКУ Зх ди Кто бід осбую ТкИ бро Кт Влдо тА ттИ чай едій АХ -ешжії п п 0 деАУМОМ
АЛЛО Тю СМ и В г им А КУу и лот мушу скшшАлаА ЩКУМИИО пам ад ах
Хихє аж Ж ст Жадж дієт: Дом Ши ЦО ж сам щі що Кл уми Ук пох
Хе пВЕ Ху іх шех сек оВЗи Бша о Ула сецдоіша Біб Аіш ХХ БЕо пе яму б мо Жде аю ти: фу Дрю ДО там ідо Мб ам ре те тот
А ЖЖ шк Хе МХ Ме жує Ми УА Ва пха Ше ва ЕКЗ о шіповУє з сх бо и кх лк пк Гея У: ох В. Жіваих ух о ХК КМ у пи ьо МУ т я жк
Ж піз ЙО їі ла ду шт Ще Ж УМ бо 110 АХА то їі Її
Зк чИ 5
Фу ад ди й сті жо Же лк ЩА тя и Те т сла Дек
ЖнВлОУвЖ. ЖІ ХР ШУ юх БИФ Да шт Кл ОЖад ух ма дих їли Жих ха тик: ОТ
В ТЕ З тий щі Мем и хо мм би Мк ХХ мм пе бо ОХ жо Мі з пу шу Жеу УМ хів ди ек ХвВі Мщх плоско їди Бір» ет Кп бмУй
У НК Тх ТП пап Мід дум пух Ми суд м МАЛО ВУ сМхми Зх ФІ м хе Фі а МТА КІМх. ЗІ. мли лав АК рт сухо жу адм тут мул да УщА Му ФІ ОМХ МА
БУ пт з жа йо гнучкий Ах Ул Ід ких чо Жошаю ЩІ хи Жжщ 23 ре їси Ашуро муж Тух Бо АТ Хі. За сві бух Ди Нійо ой: Ще пе МЕ
МІ м п: боді Ми ЖЕО Ще Ту Ки ою пу бази том ЩЕ, зи ЦИНК ДОК Хуг. бою Мат ми. Май і шах Арч УДО КпВе би їЕ НІіз Пух МЕ Хаі МЕ прю УМ кг. хх М іх
З'- лхл тдіво Щщіїг: Їсхзай тх зфолую ІДАи Мати: еехх сфомиєу; ФМ Мі ІМ Ма ох
Таш мує скул БАК ЇДИ слуха Тут КИ б Ку фан БУ Су Мет Ту» Маг ПУ и «хх е х а хв їк
ЗО 115 42 іже ПХжКу ХК Міщ тла Тлах о дежхту ЩО Тих Щит Ма шо таз Том й т точ А ЗМх Же хм жк Ма яж мКч о мжЕ Ве ВУЗ уж МЕЗО Дія МАК хх тех см п ха ВО Ах І по даху ХХ зу у МА ім Млитх Мих тоди Хот ккд пре з ТУ шли шах УМ тиву шШІім о Вал Уч ХЗа БЮ Мак пуп Буш ма Ми меж іх 1 Тут пе
І то КТ те о бет ті ки фс бли пе Шве мк ау дл бі дме іди щік де
МішФо жЖжрохає КМшж губ мамо шму ХВО Муз штх вх о юзо АшМ Ме Вів Акр «Ж ях Ай їх ЇЖУ Мк пКЮ. ТЗ. чих Ук. Та ДАО ги ж ЩІ тк ІМ я щ НЕ я М МИ пам офМимо хе фіпФ обу ШЕ ШХжЖ БУ Жпе Кіш МеУз Лі ІМе се із шуй ях по У тий ди ПФ іду Милту іш Хе уж пи ща тує азу пд ті тм Бах
Зм: фдтю ла Бахм Мал Лія МАВ ж ща лу уд о щак о Наш Ті тТук БЕк до ХА о
Цуе дум о тлтм доріс фіна. 1 иу Мр пої хх Мак ами (аю ж ух ал Ук силоси ух тлу ХЖЖ гли о гаХОе Мам МмУЖ їх мем мам ла и тд зм. п ких ух СЕ жи шо жк ЖИ
Фл.ю ЗУрт: Тім пт МК Кір. ТІ и Уха три Ума дл дае паї ам да ти мА ОКА ла гЖ ЖИиХ ЛИЖ ша ХЩИ СМ АТХ сМЗм ЖММм о ХУмлА см мух КО. зах ятх тих ях я и
МУК йде т Уфі щачт Ва тиці або имя Ти 2 Талхи Хо МО яю Мк ой
Мех одзвосує ЗВ ЗК АЕВ Ма Ме беж мух Кіш БЕ Муз ЩІ. МК БІВ їй ШХ З "де І бю ушу щує жа СВУ З я М ШІ жи б ку хр, же Ту, ежЖК ЗМО Сх жук дюши ша о СТМЕ ОМ сх ож су БО ме МЕЖ ОА хар пух гум За
ТЕ ЗВ: ХЕ щі вх тя ї у Ше М ж йо У дує дю ху Ди жає хо Дозу
Аіж Аве ЇТ5 ло бух Ше Те в3а ЩТВХ дет ів о біу жи ХХ ОБлЕ АЕр
ТО ДЖ ОКХ
ФІЛ Кк о хпх Бухта МЕ отит КшоОо Би о ЗЩИ пихе пи
М ПАЛ
«дію я уп пт
Зак лмА п Ти Мои
Мк 0 ІМАЯЕМХК,
У діт ми мух хШАЙМ Випоспіьши Мдумо
ХЕ 4х
Мах кла Ме іш Віа л!іа вів УЗ Її Мас Бгто фізи ПАЮ Іс ід Бех х З її ух
ЩІ тім нує пл Тим ще джхи бли еп ціх Мій МА сих тек Мі
Біб їіз дет шу Мо УщХ жаб дав обеи Мез іл діа Мал суд Туж мі си жи пМ їй гла вх йхех їши ВІ Бра Див ли Жум Ду бул ВІ длу до Ми
Ммещц Май Ку Ба сли ше ух лип ОХ Тухк АК мух Ко дпМ МІ о УшУ поп кое ати хкщо дл У м дух пут му 1 тим ща беж тім мА дому уч тя тд Май МА му ЛАМО САШ де мл ла УМ ЕІ Ломх що ВЕУ ТТ бу
М п Же діш пу ад Ат Кі Мат алі штих МіЗ дим Ват ій Жву | ді дих
А ОМУЖ УВА Ту Гівз хоп о у Кпе Віз дз одЕар опа Тру БеВе да) де
В НН ке ме се М ше Міс іх Мі їж Мах Мал бу вк ід де: Шеж йди г хат шому МжЕ ЛО Ба ла Хухм За Май бух вшй Біб Бго мех дев Ті ке За зх їх 2 Ф
Хм леух Тех ХМ пах лежу т би іх зах ук 1 ме Хі іх дюМоккро іже: Мо: сі ск іш по Віл сій йка бею фу Сув са шу
Нм ж хх
Фіз и МІ ХА СМАЛЬ Сткмо Му ЗД ші їди м ся 1 ТК атомах мл МАМ Ол АУМ МУ МОХ сш ж ЖК де: Мт хо Ка
МА їх ТЕ хек ТЮТУух (МТА ку СКТуМ бу лем М КшЖ БЦ МК МА КД МАТОМ СУТІ
М ТУ КМ ха вжи Зам ошід пЕжЖ ТВІ іш оМжх ЗХ Мі оз ЗІ Ва Ме АЕпоОдЕК зах аж ах «ди
Тк 15: їх ти 2 тп. Дом шлю МАМ ек джу Кр лю стих Фк ДІ ля й МК хиж Жкох
Ба оте Аофофує Бе Тгроїа біз їсти Баеоулі Ши Пре Тато у М тих їЗа зи хх їто МІВ тки опти; й гло тм з хіщ прю Фен лов ля дує де Чім їв оЗіш дія пев їм буй Віа діа Фа спа Туг дьа діл Щат Пелходбіх
ШО Ук Тк
Укщи фу ЧО їМиє щу й МАЛО бах що усу ди су Жим пт ЇМ Зм ме: тТтш ЗД Мис Да йяшто Мал о фей ХА Же Дюдолвх дж ПУ Бім Мщ ху Я сухо зх МУ МЛМ дкук о дім чд песх ху их буре Шин Шо ше ВИя СБ Миює Мах МАЕ пеЖОМЛІЖ що ля УВЦ Оп Баш еко УМ; І Ктй бХя ЛІ ЖК ЗЕ Мах
Ко Ж ях
Чан киш удо се ву жи Км кп ДУ Жереу Філ ТАК М хм от Тух пу чаш ВУ ха жу мий му фах МЕ ТЕб бус Ж МЕ ом АТФ ОБУ шхУ ї3З КІ Жах
Штна божі пла фут дже ці ді ція ми ни бі лим бух Щі Па хащт МмуУМ о Мау см ту осики Зах ЛА ше ЩМмхй а ш МшиЕ У ММ МИХ пиц сут хец
АВ го их их їх му: їх ія сті: Жук фу Мп ло тлу Мін лах рю Се Же
Ма ОБЖ лю їси ЖЕО без шех ДІ З оллш Ха сб АВ мух М лету пев, кА
КМ ТК п гМахжіу ФУби Хе й Кл доста уд ЩО мо їм Мат Ще. тм Мещо ллАОМХ мч
Варобіо Шуж Уві Був» Ззух Вл» Віз їм б; Бзробша Мав Оф12 Аха Біш сухх зав Ек
У ие МУ буму ск дич у «Тюнери іх Ма шує ЖІ їх ми тМит о кИиз о МжІх слу ФМйпомул ж маю о слев фа шУуж ВЧ оКхО Ах ОуВ
ХУ п ЗО
Фізмає Тіма хо МАЮ Мищя ді Му Ми у Мк зм глум ху: хх їі хз шк Мви йха Ха ще ад шк тр оБів сбУуш Мамо бо тТцт Ме Єоу ув пих яд пет чий
МАЕ САУ ми ЯМ киУК о тозхм Фа дк ШТ ск, Сажшее ол Жажід Ши и ке Тім Задля
Мет пуд БЖ Мем КЕ АФ сет ши схо Жца аж Цю їди МУуБ бі Хе тк зп хх, пед ЩО УТ
Хіх ід пек Мі бує у Ума Ме Ху ті Чу бум ча Мет щі Ті
Таж ої мижА їла сепосАж Мем ж М ЩА лІіш КИих Би Су М пає Бе уд: «зах ххл
БИ Ах п тамі Гікйо сх су ув мл ме сла Кут им і тут по злих мм ді
КІ хх хо бл йие оз дує йпе Чі Кто діа сме Мхі й
МО ХХМжО ЕЛЕ МК У тхАЇ лешжт УЛ ВШ Лех скля ХО ТАМ му ОЖлЛІЦ УМА
ПІТ Я ших пус мів бах Буг о їзе Ми ЛОВ НЕ піт їцУуЄ їЛуу ЗЕ їж пах ПЛ КИ тоб омха зу жу УМ тМжм Ж я пал осш Мат о мУМ МУ дж пох Ба окмх зх Уч ох я ті до пи ША ОМ пах Ту тд пли ах од Фи о пео ЗБ йуВ чих лем
М ЗЕ шій У ті У шт лугу
ТИХ Ух ау щі
Кен оНкя лу, оедумі о хомути хи» жоВосіша йлрмх «ап Як пек ощіх Мо Мт щіх дз Ох ті пи ки мі лоти дм Мч
Шех віл Мак Вів Віз дів Мал сля УМ Мах М ШУ Хі фдшц Кл ФІ
Н ї м т їі З ї5 КК жа вм позу тм Ух пах сту Му ЕЕ то Мт м у пот їі Шах і бду» Хі бах Блу ід же Зі її: Хе ух тек Сп їде
ДА ЛИЖ АМКУ Іл) ЖІ. Мах СТУ. ХМ МЛМ СЗАЯЮ Ж АЛЬ СУМИ ЖК МЕ я Ки жу її хи по їх жопа бло СсКиЕ скоб їх тоЩщбхи й Майї щі аж ОУЖЕМм ТАТ МИХ ЛИКЖ Цмя мЖУ ТОЖ КУЄ Хор АЛЬ С УМЕТЕ Ж УТА ЩЬХ сх хг її
КУ жи У дів лаз чує б мах Тіхею і їх пит ост Тік щі дит ит ту В ер ше хи. ЗИМІ ЖщУМ о мУпЬ М МЕМ ОЖлА ТУЮ кхж УВА Мр ож жом току хх ха
Ми У хи паю ох дохо тт силах М ших МУ Хе ди ко Ср ші деді йеу д дж Іі ВЖИ паж Пп Ода Же Аза Ма дшп оба ТЕ ЖиБ ляє АЖЧ ОМ
Ж Зп ЧУ п гію дик р йо хз ої пра БА уко Ма Ям джу ау ми ТА Мах пХж о Мук Зі ка Вл» Ха ЗдМ Ма бух био Міх Ат мих йлювоЗів КЗ пі щі ЧЕ пет їх М сх жи Фо ам Щі х п п и ТІ у фт Жшм п Вше
КЕКВ би жа Жш СМАЛЬ ла п ОМА жк КЗЖХ ЩО Ж УУУтТВ АЖМА ХОМ У УТА
М ММ шо
ТАТ. сш Ме Мч ок 7, рамо Ж жи Тіз ТУ Хуг ет ту 3
БВілсішц ла св. Ве Бук МЕ о Бшту пвх Бех шЖпа ім; КО ах Ха ху хх Мк іт беумту лу дих Сет: мі уж ЗЛА Ух фі А тями; 31 дж мг вет Ж
Муї» дпУЖ Мехо т мий пек пл Я як ШІ ми 32; Ддуй Моату ВЕ ДІ
УЖЕ МиЖ тА ДАМО ЖИМ хмМтТК ЗД Ум Мч шжМм Меп Ах КІ ТІМ ХМ Ома
Мп Ук їх
М хх їх : їших Штє Жив снтк їх Ти Шу із тому іх Ді тд Му Вих мк
Бут об пла с Ж о Меє душ бю у їм пле Лус ої Фсха й ОсНе їх ММ МУ МЕ: жи дня ША Ми Се тка Що Лич УМ ід Жах 22 сМЕхах слютх ХК я
ЖЕо с длс Бо Ба Жкроває Міз Бей Же УЗ шо бі Тйг дк) шо тих
М МЕ ЕТ йо тя змо балі лес Зут А ДІ туї 2іц зує Кл А ДІМ Ох ІМУук ФЙім тм
Ши вла фже ХХ пуш МІж» Дів бабі їж Бав Хі них пПех оба Мет іо ТЕХ кю пжух Мало і бий ба Мці бах т усу джу Ку тозм и ном щі ие
Бо Жах хо Ахи Ват о жві мм о ХАз жКОо ху СХ Цук спЕЮЄ Бе УМ пох пох сх зт
Ах о МЕМ пта Млї Мек оди іха щи дет бви Муз пе Вій їі Жуг ця мит жи
МАО ЖЛА ЗШ ШИ ЇМТУ муш ша МКУ У Кшоб Фах За ОХУК МоМоМмжХ пу ід 25 ет
АХ шу ек
Ха хи Одна Ту лик яє сс юх з Щи Лу Су БД, ут Ди Тож т тт
Ул Мі Щі Бжі цух Тих ж ВО Бо Бе ви ех їзма Аа пам ех ях, люте люту За
ІЗ ВИ я ХІІ шкмо тет хх лу дику бик Яд ххх ша і мом ті зош хм ша В Ме
Ме щу шМа Бит дет Зах Ма Кв жах Ві БКа Бе слух Кіш Пежо МКЕЕ ї4х хо Ух фудтм ду Там їж, 2(1Лі (іх Що дам ма іш дій шле сут тм Мкщо ціх
Був с АЖИ МВ БАЗ ІМ Бик БК Авр оВла їі Аза бхе тую Су Бк даю ви МУ ле пли тим ца о МіАО Томи Мат Щщімога тен ща» їж Шім лі йза Мій дих зая гц ах БліМ Ум мМироїМех ЦИМ оси мджМОо пек пла їм хи Ві жур по жи люди я «ХУ «ХХ ру фпмх Пт. 131 с (ШІ ла 211 13 мл 110 Ум Мі шфусх МУ Ум ШУ їму Бий оБто іх іа пл ШІдД 3 Ваз 112 пХхУ Боз Туо КТ Мушх Щах пд зх ях я ЛЮ ва тами Вл ці Ми тм й сруту пут само Там хе Ж бах Ти М МАЄ ем оМа Уа Уші Мар) лек отТкр Фея був сад пижмо ївс па пу Лів мех тех дл дж чт
МУ ДАХ Ж ми
Тк ЇМ лу М бю хе дет Ткмі ФМ бою ро сту їду 0 :Х ТЗ Б
Мут КВ оМмМех хіх тТкродег бат Ме: вс птах леж ттробув Лі Віа Ія
ПЕ ЩЕ зи пря мам іх ау М бі а: бро Кі м и ге Ма ім т ух
Кт пе лі МБхцп обу лем мАЖ ЛА УМО Ап леД МИ ММ ХІМ Лем ла пав о тю рих Шина: вки. сі; Жнаж діла що мумис Ми МКУ Дю Клей що будо кт
Хол душ Жак ше ЗМ; аж из дум шт Ж Ту вха Буз мак зд МхУ
ТИКИ ТУ ЗЕ
Мих М ЗКУ дом лом о Шусю бот Джо вел шах би дроту Де лм ли Ще Шолш пал; УК лі Тех Ехо дув ЛИ обив» піз Во бимп ет ШУ пе ше Шах Пі» ТП п їх ва дося АЛ 2 Жак КІ їди
Ми хи мА ми КМ Ми п за сте а «МКМ ОО ЯЗ
ХА ЗЕ я хр ха АМДИ ОМА ИМ п Мем Кг дж
АД ХК МФЧМЦУЇЦІКЙ Душа «ий хх
АК Ж ме» щіх Чіу. бли Щі Віл че Му Щі ри ЧАЄ фдма Же Ла Хі б
Мих із ТУ Му іш Віш ЖХжи зі Ве Без Ту ідо ЖвБЕ ша Хіа Куз х 5 я Б
Х т МО 35 пи Ми сти Кк Хо т. ие, вух ка ил ЦИХ їжи бе. сшю и Хі
ПУХ дет ма БМК БУ дрож Же ФУ Віа ЗеЕЖ о УаХ Ба їсцпошеХ де п й г із см я М ХВ тю КАН хх що Ам хх. Же рах М Ім
Ту тут їйх Малі дет Сук Ух МаВК її дів ЗМ Ха Хе Твх ББе сту чик ак 5 п йо ль за Дан бю ЩЕ оу до мл ом уч. Шерех 2 зд лих щук Шем бу Щі дм
УА ЛУКИ КЖЖх Май» Ат Бала лек МИ Маю жі ші А ЖЖ КУТУ Ма мМ хо Я ЩО дм ДУ іє У сплю Мк Із стихи тах жлма Іаме М мо суху Ул щі ху
Аджр оАха Зхдк ма ста Хих ді» стжкЕ ЩА оц бшв Мі шує Хі Б ОСБВе
Ж у ТЕ хо
Чек ТІ и ФМ: Лю іє УА філАх Ци. Що Мо стт Має зи): Щі ких й тжропУую тих Же Тих хХві ФО Ні зр Аха лою МЕш ОСІ Буз Кит обеХ
ЯЗ за як жи бат Мі мо тим тям Мом Сх У Ми та сижух Щижю МхуМ Що. Ше ТУ дж хУуЄ КІЗ ди Пк ДзЗи Биро хі Мах Су ЕК БТ ЇХ пі пелОоеКА хну зах злу
М) ІД іпАх же т бух ше Кк. Пн ди жа тома ами ве мож т Щі плж ціх
З15 Ше ТВ Бхо бе Фій Ше ТЕ уп дез ТЕ о МУв пІш ВЕЖ НПАЖ МІ зак тех М
МЕ їх тд ин и де фс жу Маю Мет жах а до
Пуш дою ТИХ ОсСІЖ дм Му Віердо оо вар біз ще КБе Ту Бто бля АКш тв ух, 43
КИ ІМ «а
Ук віх дам мех М мо фі бик ба жах що: бам хи жк Да їх; Ах
Му лів двро до ВЛж Біо фо шаг кп Мам їм ХАз Хм ох ючи Ух ах щи я т хх КЕ БЕ їв па вла су утиліти щю у ялу 0дк Х ШУхіе Шрумаж Мас лози ЛАД аз о дів УжЖр ом бшш УУК мам ЖаМ Бу Оу Бце ес гкуО лю Му ах іще ІЗ її
Фоезую Зло сдУМо Мо, рутину СЛЖЖ, у Зх ди я,є ові Дереих ІА ем УЗ у З Ку ВО
І ЗМиеО МТВ СК КхІх Же МІ БЖ з Ж ах Ммуц МАВ ХУДІ ЖИТ МАЙ чн лаг уд іже Ех те пи фі чо шко Тутає б св а Вам фо Мах Мщі1 ймА тфіл: дих ІЦЬ: т
ЖАХИ ЩІ ШУ ФУ АХА Мая БВІлЛ гц Ми я. ЖЕ ЗДУ АХА ММК ДИ лм «ких зх
МЕ дО ХМ слух тових Шим Т мат (ТУ Тит Тк тних точуєі ТАЖ Меію Що СТфи ббкухю аю у
ТбЖЖ ож жах Мем бл зма ДЮ Хм Беж М май пла ті Сх ух жготух гу - хюхи м спе дя Дю жу Ме хх «є М Кв Фаю фр ему их нд кам
ШЕ БЖ УДА БЖ САУ КтТМ ху жк би бе Жах лю жит УА ті їх ших поема пчи ча шк Бе мМ о пі омід дили ух Т1ї: ТІ: М ут Му пк ІМ зуу рю І ту ему
Пл оВаАв джи яр обаз іа п Бас ттрохул Лі двропех бід ТЕО отвх хіх Й ВВ тк ЗК тТеомо а же Ще: їду єм фа м Ма щксі шоахє Сну ЩИХ Ко ті хмЖ жил АаЖшМ МІЖ тм: за слжА смуг УА Моше ЗК О мИт КУ ту Ва Та
ЖІ жил «І хе АЗІЮ Адм іш; Їж ЩЕ Бо ТЕ шМу ХА МЛ ШУЙ ДА КЛ ПАЙ МК мч спи хе п з ще й Во 285
ТУоє уж ТАЖ Ума ЩЕй до Тит сти Тахо лим жом кА СаАмоє Вл ли Ух жтТЖ ЖЖ зе ХА ХУ ММ Ух МЕМ нм мух шум ОА СУ пот КИ сук пак ил «М ках Зам пи ПО Ти. межи Жак ерю Ми їй Зо ше їюч Ух дім ХГ Тл зи мето мл Мт жує сам емо жщО ВО Му ше ЗЯаБоОЕМм ож лі ва и: З ПТУ пХ по ла ІМ ЗМ жи до гпіхх Мих Тихі ст Кл хо хм о сХюю ке ЗіМі па пух ВЕ Бін» бу йте Ма собу б бохо тук ВВ оп Тук МБАЖ Мі Жах чл. пл Ух мух літу Мі: йіх о їж бі: Фо ти лав ли іх їм кі що ува: щу шТАТК УМА КІЛ Ж ММА КМ ТУ ЯКА УЖ ХА МІК Мжи йаА й ХХ їтО тах УМ пуз Мі Бі дід пе ТУ їлев лек тку шАМ ОМА МА Ат мжЕ же Ну п му
ЗУ як
Ж Тух «в щік В
ХА О Я сич ХУ злети хх Віник
ХА УКЛ ЖАТЬ ДМА ТЬОКУХ
«ай хи ча «45 пк см дач їх Же Жшу МШЖвг Шк баку тіж дій ем Мід дк Дак ща
МеХ о тТуК МЕ Шамо ле Жех ТБ ре іа Хах Ава Бех Хід Епа бело пу ї т. па чх, бе тії дае Ма ми пу бу пз фо ем Фе дур им ула пк гу дек тіж ав пав» ма Мбж Би іп б бе Кто Бе жит ХХ ХУ ла У я дек пе ал дл: фі р щі їду Юджу Біо пу Жуу дом дих лих ух пеЕу Мом УА ЛАТ леми СИ СУуз. ММ ОКА тТ фол Кт УЮХ УМ миром о чмлИ а ду зх йжт КБУ гей о Бк і Ламу доз і ди дих Ххщо беж ду Вл» бу
ЕТ МЛК хто ЗД жу о сздух ХА ФМщро см хурму маш СВ Уже СА ООМЕХ по І хх по кл У діжі. УЮ Км М іл мя що Ми гу І бами Жим
ХА ФМ ТМ Бо Бкб ДАТИ Вл Еш ди Ха Мах ий Буш Хувщ Бут хх щ То ТУ Ве
ФІ Вве ші доме Тіп. вм Мах щі у и Мі ст шню ЖД й ЖИ ПТ Ме паж КцвКокпе дЕТВ із дж УМХ пів хви ЗИ Хе пхж туш Ей ОПАЖ Ме: їх КУ КУ дек лай Кн; 1 мо хв М Мем де г пл Кім дл ня хі Ії шах
АвиоМал дв дів ду Ула диву Бед Му Мт Мез хшжи ем Бав ії ах т2е пт зх
І МЕ ХАВ зх. сіюже Миті М Кут Ліфт Во їм ммс фа ТУвер тим Тл Кох лом у пат оце Баш ШІМсуЖУу БуЗ АБ іме ЖУС цим о КБЕО мам ПМ Бі млід Тих -К соту 55
ХХ хм Мо
МАО УЛ. Хрих. Жеху МА, Хати. Фах Мі до ах Му. Щодо Мрха. бика сій М лег аХ Хе Вес шПО Пе зи ін: ДМіз Шіх БВе ДЛіз Майї їв бух М уко ї4х «Кк зах
ХА МУ МА ех і яю дл дому й СУ ом. Мужує фу. їх В Ммаюю им сфе їла Му пев лі Му БМВ обо іш ау Бі Жак ХВ УХМІ Шех Муз Тйг ом ЖК
Б вних кк тп
АЖ Кп АХ щи «ах ойхм джу дж кі тм, си кі ка Бім шими Мощі пк мі Мох
Хі Аа бта да ві ск па ух) вла Віж фат Жда Ха (Ома бум; МУ тих пеки ях 1 ТО хх які біо хи ди му ТІЛА. Ма ше лож ме ТАМ іл М шо тд м А лдЖ ЖИ УМ Ми ТЖЮК о МАТ Му шт пал Ж М о мУМО А мл їм БИУ КХ їх3 ХУ х фот ще Уже 2341; бум Мих СФиху плуує Пі тими би не адує джут ще ПА вжи НУ и ЗАЗ Буш ЗМ Тух Мвжш паз Зуш Ттр жу ше ЗБ ЗВ ша зп тп зах ув ШК ши зи дах дамі ти іх 1; ХУ: бури ати: СПО ЩІОМ Що бу шин ЩУКИ их
Ше АЖХровниу Ха ШУ ЛЬ Мем ЖИ БУуЗ ТИХ ЖАЄ схіу Жух ВЕК ВО дЕЗ пут тк лек хї15 1 їх ах из ОК тло шия п жом б НУ. ММ ІК Ту КК жи ЩО мех май пу Хчо Бус КМе їди ТЖх Бне Мей оТухХ жи бля Ме» ошМУ ХА ой 71 235 тай
Я ІЗ ях ЗО жо дЕВОЛІУ ШКу маш о УМІ Ул ККе Тут Ж Бо МТ Хяв ЗЕ шк Мі
Оу ІМ КЕ пн суша. ЖІ мо фо Уоегі хкду Жду йог В ха ну МАЛО ЩІ ЖИ мае мих
ІА МЯЖЕМЮ ЖІ ЛОЖА МІ ФТІ З-щУу Аіж Ма хі джу Уа БАЗ ЖЖ пБя сих
КИ. шли шо
Мі осв ді гтУцу Мак ТА тон: Ме дю МВ и м Же діло о пи Чу
Бі тих Ак опуж Зеж о ішМи ХВ ом дим МО ому ХпЕ Міс дЕБ ОБР Тих ще вдо са
ЖІх жо хх доле зак М до ди сли бихею ДА Тлтіх ідюю у Мир фаху Маг МиХе. тві о ежх су мех ті БкоО тер ідо ал сти ех Теж о жЖтробБем са ех то. люух, ОН ше хх ЗО хе Мр бе бами 0 М Щі ем 05: джу сфе лам балує Сбагю СККУЄ Ддукя
ТК Тих ТХулоди М Пай що жіВА ЗІ дЖробм шШУЖ било буд СЕЦт ж
ЖИВ ЗО МО ЗК
ГечоЯ и ро Чую ХМ І я Її. поли МЛ Лоза, ЛФ) дб ДМ щити, у "Жер
ОО ТвХ Зк Тих БВ ЗИ Буш оУру ВлЛЖ БКВе Би о бвж Малі дар Акор о
ЕЛ По КУ
ТУЖ Бу УЖ іл ах ди Бха Мат о пех Зі п БМ Мет дао Бу хіх
КІ сих я ва Я лм ча хі цик пів Хм ше УВУ Пд Му ді бе ціа стою й їм пли хі УВК онкж Нав Мих Кпе Бе БИ Ах уді Ето нів отУЮ ко пвх іс пл де дк
ВХ КК «КУТУ пі А щі тю лах щі там ША СЮ ко мух Мих дих ау я пт Жоттг паз ожих тих сум гл де ал Му сах Мих бр осв УК жі пав ОБУ ца ях ЗО
Мі ої Тух Був Сг КА Вею Би бжхо йош Бе дЕВ Дів ШО їі УБІ
За ЗІ пан: усу
СЕТИ ММ УМО УМХ де сію пе цу дк ож змі хі пи піц сх б
Ази осі» Кп БАЧ АжЕ За ТУЮ ба обл УЗ М За біщ бай Хе Цех
ЗО 1 Б дп пі
АЖМ ММ п ечН хи АКТ ї5 чЕЇМХа да ща ОО мА «ТИСК, ПИ іі й мом оміх тих
ЗАМ пуУФЦВІія Зиумусімуи
КИМ і з. б и пек мк засяє ю йде лю лютя фе бек МО ше ди зей Віа пер тиж Сбвломіх Віа пав в діа ЗІЗ Бто ХМлОоЗіМ вБпе о Бхт к з 1
ЯЮЖа бищч СИ ПІ Ох оз бо ж Ух Зх с Из схе Кх їла ЩІ х іПшл бешу ТвгОшУх Ха фу Вя!ожіх їм Кут дет ПМ пу тм ММ БІ
ЖАХ У пМ мо Лижі бум стаже бек їдмі бу Моє Зйує віз йду Шк Ххмо Дім бжех Ді пах ові БК опеп опе Бай ох Тут бйх Мав Ат жак ММ Мія бе Кіз шх о ж
Фа дме там Ма щі іш леді ще хе Мем одкц вли удщі фу Ті; Зк ау леж іа ха Ха»і Аа змив; шт УЖЕ Бі Да ВХ щем ГО Бем Уч хо М щи плат али хх тел же фо Вище: ВЛ ох й Усі стю Ж йім тб Ми дах ем ЛВ мим сп южшМм МиИМОосУБЮ лЛьаохих ежм ШУМ о хпХ ам ух УА ТИ їх т ТО Ми темі пе М жі Зло вм сек Шк лУМи. ШтмУ и Хі щі Міх до їх їжи ШАпОлІію Ті З Бе ТоТроБую БМ Бве УБх Узі шіх МІВ Аж сжх ї оту зу
ЩЕ зе ох; ші паж бі ді поп Ями дух йех Міх Удл зи Дхй пт йму муці лу шАЖ МЛ Йй АД МІЛА МИТ ЖД АТЯЮ па т ЖАХ зи лЖЦ гий ОляЖ ком Ау гу пах зи що шт М теж о Ху бак ма ки їх же та я Лк их ЇХ. сут є дих тем.
ТБ ол Ме Наш пеж Ті Хі Ха Тпх БЕе Бе Уа ес Тов оБУв їх міх їЩ 1 меш мо жах МЛ Мі мо Млах сУимо йоху мом іс Се Щост тових дум (2 пек міш Ат) повз Ві хе Муз Ахми о УвБих Зіт йщи Ха о АИМи іме о Биш схіш хо ше чи 7 ши АД Ах хз. Ту Стах Щеєем Й Вкч шій Віза бар шах Ні Вус биі пед дро НІЖ її БУ» Тук Жто ЩІ Дюу Бий Віл о блр Жах Кіл Бус ба дек оду ге с их гу ії хлух зл
Та хх МАХ Ми :. Чаї Мк их мм піуУу Жду Вхй тує Бе оВла Фу їду М дів Шу іїви Зах МУ Зеу бмх ма шиат Вха ТАЄ БВе Бла Тут їм БОБ х ик т г
Ух Ути 15 їл т - 2 діжки Мк дж нія Ше Мами Ме бу щім Щі Мшт уеу
Кипе обл Боб вк хви Мес ДЕ НІВ Бе ДЕВ Без Тур шМм Буд Мшї о тух ях Ух ло тт їх ММ ке І: ї Я х ї ядро жі іш Шу їж ше щі бути птн дід сті для Дтриа чЗдлоМмі хі Ми жі Ті Псую їх ЦЕ пі сухм їн ВЛ чштА Вл Мгц оУща вав лі МА Жах іх ИМЕ шжма У Жах зУшМ го х ів КО ШІ к т мкг уж М
Ктео дав о Фру іш ХХ ат ЖЖ Май Ти МБ» УВі іши СХ Ме Тбпх ТВХ
А чех лютяху
ХЛ Іл КЬ щі . : 5 тт т для пен зе» ді Ті оте Тух ваз Зі бра їх Ме біш Биз Віз те аб пе
Мех АЛІ Ба оте Тух ВВ бу бра їх: КБ іш Бпе» ді тат 8 7" 7 й поль ск ях жи хх жа
АТ :отну УпЕ Мр см паля під Вот ба ФІЩ Ся Ту Вус отв пух чхві мі ти жи я фам о пая іх дв мл о кі мл ТБХ БИ З ке до : пу сх їх їх ЗХ ас дою шШж бро фур тк бух ЖІ ге ЕУу ДЕЙ ім: Зеу дах Май дар
ЖД ТМ ШУМИ Ал ШКО лу КМ А Ж Ду ХВ У У т х зи Кук ши я дна А с : 2 цех й жув ІлЮ их
ВкКч одах Жук пІіУу ді ії» їі Деродовь іїши пЕх піз йди Х45 о 5іу Тих пЕЩО дм УЖ уУ сх БМ да Ер лу КшМмОСВ щи ТУ " Зк дн че
ШИТУ п В : х Фі Ми М, дк ню їх їз М і« 5 їі ців Мі їж Шішв Бетті г) Би ція бек фот Би Вей ві спо їду БІ МЖашО Мже ІМ Кт ХМ шт ом Се ти мул МЕ з
Щі чи жим п шЩИ шх ЩО щ злу чу з тух дій за КБ дів мою дій Се Мує ів їж ві дж ЗАВ дародля ТВХ Ах бій Бех Афа Бук дів Ба БФ ід і Маю йта ЗМУ у 7 че чой п М ЗУ жи пк ях г ха Бі Фуо Хе Чім пт о тву Спа попе Ббхч Мат ха мія Мат оте дхи Зло Біх тус Хе бів Бто тБХ ме Бйх Бач Ме За ВІВ Ме Хуг діа ки тд
С шо пл х пе ог ШУ» Чаї Узі дер о тьи дар Віл без блаж пе Жеих ем Буд
Ха вух Ту ШУ» Зах УЗ) дюю Ти ЕМ обла БЖ ЖИ КВУ ТВ ївух х 7 " ; тА ще
Я т, ел
ШКТ тих ме пі о йтиої Хі іх дл тд сви е гм йме шує тка хі лу МАВ АЛІ МУд ДУХ ЛК Бум лек я
ВЕ В яку тк м хі ХЕ ди Ми
ІЛ шежумною цехлло диму «ЖИ» пк, ніде кврнимй пис жиАЙ ЗАНЕССсКуковуни пусти ме
ГТУ. гг
ОКХ МУ
«ИсЕлтЕихИик МАЛІК ТТ її «хо М пат А
КАК ОХЕ
КУ ибкиКИ кад КАК
КЕ ЖМ Котоц мезхнілммм і лек
ТКУ МТУ АВІ пошу ДдИ ВМ ю п «ХХАГе
ЄЕХшУ 0 ХТО уми гу ЄкЕуУ «Ух т.
КНУ НШЕНИЯ пір кими утекти хи чола сцИито тато ко
ТЗ їх и ту «о ОпЕ пе дик ярих щжухМа Лесі ДОВМОТь штлулхерх
МУК
ХЛЮТя був мот пи «Р» блуксНМс сти цних праймер шшЖМ шлю мая ах фу щем ШКТ ДА ЩИХ шу Тл кі
Щи ІКТ хЕЖЛ ох Бех
ХЕ сть щоілско Яцек хм ДАТ УшЖУМУВ таШЕ У г дО Імре х оелЕлитІ хощо бух
ШУМ ож ше «ЕЛ шли які зи ау пу хх ізо; Хо МІх ни "кА рт хиди ЇшЖХрха б п. х ще УТ ВЩВЛУКУ
ХИХА М я ПІДВККО сепих че «ПИ че пут дими ВТМ ахерит ті плятлуІлежни сспиплиалимО слу ше сх со «шЖтИиМ В силах р ву» пре скажи дик
ШИ ут. цем, Гек І Ух Му жим скЕтудма послдаивматую пхту, стик
ДАТУ 0 жу и и ака соти жк,
Ж ХмудучУм Мезим пуп Иу пацпша їх худ ск 15 муси цийи ем жи жан Оп «Ех клей пох «Мих пе
КА дих
ХА ЦРУЖКОЗИЛЬ ЦИЛУМТА МИТ ААКЮЬКМ
«МОХ сИЙЕх улігсМуклУтминиМ пуошю х м Кошики
МІ 8
Качусувих дпплУувАц ма ХЕ
ЖИ Оп шк шВ є з 1 Зх Жим чи послідовно»
«везе ПММ ЖКНеТМДНМИ спраЕвАжИ соти У ЕМ свое свое мо ЗЕМ
«ли 5 пірати ІТ песо їк сія» дерчих цесі лені
« 5 В х з иа дштнуМцастняНиХ Прайм
«ами хо лайдлализу зсуаадясич сх ХЕ
«ди МУ
«ЖММ» го
«ХА ВВ
«те з» шапфтокУкодмнм умжниею котові пані В х з: З г Пед конурлемкиЙй Ппрайуках синам Мох ТАМ,
«Шах Мох МАЖЕКИ
«ант БВ мтс уу МОУ додана т

Claims (23)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Екстрагований рослинний ліпід, що містить жирні кислоти в естерифікованій формі, які містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, Фб жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК), 03 жирні кислоти, які містять а-ліноленову кислоту (АЛК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше із стеаридонової кислоти (СДК), ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК), докозапентаєнової кислоти (ДПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), при цьому рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 до 16 95, і рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менш ніж 1 95, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить: а) від 20,1 до 30 95 або Б) від ЗО до 35 95.
2. Ліпід за п. 1, який відрізняється тим, що має одну або більше з наступних ознак: ї) рівень пальмітинової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 до 15 95 або від близько З до близько 10 905, і) рівень міристинової кислоти (С14:0) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить близько 0,1 95, ії) рівень олеїнової кислоти в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1 до близько 30 95, від близько З до близько 30 95, від близько 6 до близько 30 95, від 1 до близько 20 95, від близько 30 до близько 60 95, від близько 45 до близько 60 95 або від близько 15 до близько 30 95, їм) рівень лінолевої кислоти (ЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 до близько 35 95, від близько 4 до близько 20 95, від близько 4 до 17 95 або від близько 5 до близько 10 95, м) рівень а-ліноленової кислоти (АЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 до близько 40 95, від близько 7 до близько 40 95, від близько 10 до близько 35 95, від близько 20 до близько 35 95, від близько 4 до 16 95 або від близько 2 до 16 95, мі) рівень у-ліноленової кислоти (ГЛК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше 4 95, менше ніж близько З 95, менше ніж близько 2 95, менше ніж близько 1 905, менше ніж близько 0,5 95, від 0,05 до 7 905, від 0,05 до 4 95, від 0,05 до близько З 95 або від 0,05 до близько 2 95, мії) рівень стеаридонової кислоти (СДК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж близько 10 95, менше ніж близько 8 95, менше ніж близько 7 95, менше ніж близько 6 95, менше ніж близько 4 90, менше ніж близько 3 95, від близько 0,05 до близько 7 905, від близько 0,05 до близько 6 95, від близько 0,05 до близько 4 95, від близько 0,05 до близько З Фо, від 0,05 до близько 10 95 або від 0,05 до близько 2 905, Зо мії) рівень ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж близько б 96, менше ніж близько 5 95, менше ніж близько 4 905, менше ніж близько 1 95, менше ніж близько 0,5 95, від близько 0,05 до близько 6 95, від близько 0,05 до близько 5 95, від близько 0,05 до близько 4 95, від близько 0,05 до близько З 95 або від 0,05 до близько 2 95, їх) рівень ейкозатриєнової кислоти (ЕТрК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 4 95, менше ніж близько 2 95, менше ніж близько 1 95, від 0,05 до 4 оо, від 0,05 до З 95 або від 0,05 до близько 2 95, або від 0,05 до близько 1 95, х) рівень ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 4 до 15 95, менше ніж 4 95, менше ніж близько З 95, менше ніж близько 2 95, від 0,05 до 10 95, від 0,05 до 5 95, від 0,05 до близько З 95 або від 0,05 до близько 2 95, хі) при рівні ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду від 20,1 до 30 95 або від 20,1 до 35 95 рівень докозапентаєнової кислоти (ДПК) в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 4 95, менше ніж близько З 95, менше ніж близько 2 оо, від 0,05 до 8 905, від 0,05 до 5 95, від 0,05 до близько З 9б, від 5 до 15 905, від 5 до 10 або від 0,05 до близько 2 95, хії) рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 20,1 до 29 Фо, від 20,1 до 28 905, від 20,1 до близько 27 905, від 20,1 до близько 26 905, від 20,1 до близько 25 оо, від 20,1 до близько 24 905, від 21 до 35 95, від 21 до 30 95, від 21 до 28 95, від 21 до близько 26 уо або від 21 до близько 24 95, хії) ліпід містить 0б-докозапентаєнову кислоту (22:5А77л01315)3 серед жирних кислот, що містяться в ньому, хім) ліпід містить менше ніж 0,1 95 0б-докозапентаєнової кислоти (22:54 7101316) серед жирних кислот, що містяться в ньому, хм) ліпід містить менше ніж 0,1 95 однієї або більше або всіх із СДК, ЕПК і ЕТК серед жирних кислот, що містяться в ньому, Хм) рівень загальних насичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 4 до близько 25 95, від близько 4 до близько 20 905, від близько 6 до близько 20 95, від близько 6 до близько 12 905, хмії) рівень загальних мононенасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот 60 екстрагованого ліпіду становить від близько 4 до близько 40 95, від близько 4 до близько 35 905,
від близько 8 до близько 25 905, від 8 до близько 22 95, від близько 15 до 40 95 або від близько 15 до близько 35 905, хмії) рівень загальних поліненасичених жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 20 до близько 75 95, від 30 до 75 95 або від близько 50 до близько 75 95, близько 60 95, близько 65 95, близько 70 95, близько 75 95 або від близько 60 до близько 75 905, хіх) рівень загальних 06 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 35 до близько 50 95, від близько 20 до близько 35 95, від близько 6 до 20 до, менше ніж 20 95, менше ніж близько 16 95, менше ніж близько 10 95, від близько 1 до близько 16 95, від близько 2 до близько 10 95 або від близько 4 до 10 95, хх) рівень нових б жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж близько 10 95, менше ніж близько 8 95, менше ніж близько 6 95, менше ніж 4 95, від близько 1 до близько 20 95, від близько 1 до близько 10 95, від 0,5 до близько 8 95 або відб, 5 до 4 Об, ххі) рівень загальних 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 36 до близько 65 905, від 36 до близько 70 95, від 40 до близько 60 95, від близько 30 до близько 60 95, від близько 35 до близько 60 905, від 40 до близько 65 95, від близько 30 до близько 65 95 або від 35 до близько 65 905, ххії) рівень нових 03 жирних кислот в загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від 21 до близько 45 95, від близько 21 до близько 35 95, від близько 23 до близько 35 до, від близько 25 до близько 35 95 або від близько 27 до близько 35905, ххії) співвідношення загальних 0б жирних кислот: загальних 003 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше ніж близько 0,50, менше ніж близько 0,40, менше ніж близько 0,30, менше ніж близько 0,20, менше ніж близько 0,15 або від близько 0,10 до близько 0,4, ххім) співвідношення нових 0б жирних кислот: нових 03 жирних кислот у вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 1,0 до близько 3,0, від близько 0,02 до близько 0,1, від близько 0,1 до близько 1, від близько 0,1 до близько 0,5, менше ніж близько 0,50, менше ніж Зо близько 0,40, менше ніж близько 0,30, менше ніж близько 0,20 або менше ніж близько 0,15, ххм) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ЛК під дією Д12-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, від близько 60 до близько 98 95, від близько 70 до близько 95 95 або від близько 75 до близько 90 95, ххмі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на СДК під дією Дб-десатурази щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 965, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 30 до близько 70 95, від близько 35 до близько 60 95 або від 50 до близько 70 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення СДК на кислоту ЕТК під дією Лб-елонгази щонайменше близько 60 956, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 до близько 95 95, від близько 70 до близько 88 95 або від близько 75 до близько 85 95, ххмії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕТК на ЕПК під дією д5-десатурази щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 95, від близько 60 до близько 99 95, від близько 70 до близько 99 95 або від близько 75 до близько 98 95, ххіх) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЕПК на ДПК під дією під дією Д5-елонгази щонайменше близько 80 956, щонайменше близько 85 95, щонайменше близько 90 95, від близько 50 до близько 99 95, від близько 85 до близько 99 95, від близько 50 БО до близько 95 95 або від близько 85 до близько 95 95, ххх) при рівні ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду від 20,1 до 30 95 або від 20,1 до 35 95 склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ДПК на ДГК під дією Д4-десатурази щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 9б, щонайменше близько 93 95, від близько 50 до близько 95 95, від близько 80 до близько 95 95 або від близько 85 до близько 95 95, хххі) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення олеїнової кислоти на ДПК та/або ДГК щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 у6, щонайменше близько 25 95, від близько 10 до близько 50 95, від близько 10 до близько 30 до, від близько 10 до близько 25 95 або від близько 20 до близько 30 905,
хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення ЛК на ДПК та/або ДГК щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 956, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 25 95, щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, від близько 15 до близько 50 95, від близько 20 до близько 40 95 або від близько 20 до близько 30 95, хххії) склад жирних кислот ліпіду базується на ефективності перетворення АЛК на ДПК та/або ДГК щонайменше близько 17 9565, щонайменше близько 22 96, щонайменше близько 24 9б, щонайменше близько 30 95, від близько 22 до близько 70 95, від близько 17 до близько 55 95, від близько 22 до близько 40 95 або від близько 24 до близько 40 95, хххім) загальні жирні кислоти в екстрагованому ліпіді містять менше ніж 1,5 956 С20:1, менш ніж 1 до С20:1 або близько 1 95 С20:1, хххм) вміст триацилгліцеролу (ТАГ), в ліпіді становить щонайменше близько 70 956, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше 95 95, від близько 70 до близько 99 95 або від близько 90 до близько 99 905, ххумі) ліпід містить діацилгліцерол (ДАГ), причому ДАГ містить ДПК та/або ДГК; ххумії) ліпід містить менше ніж близько 10 95, менше ніж близько 5 95, менше ніж близько 1 95 або від близько 0,001 до близько 5 95 вільних (неестерифікованих) жирних кислот та/або фосфоліпіду, ххумії) щонайменше 70 956, щонайменше 72 або щонайменше 80 95 естерифікованої ДГК та/або ДПК у формі ТАГ знаходиться в положенні 57-1 або 5п-3 ТАГ, хххіх) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 58:12), ХІ) в ліпіді найпоширенішими видами ТАГ, що містять ДГК, є ДГК/18:3/18:3 (ТАГ 56:12), хії) ліпід містить три-ДГК ТАГ (ТАГ 66:18).
3. Ліпід за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що є олією з олійної культури.
4. Ліпід за п. 3, який відрізняється тим, що містить або є олією виду Вгавзвіса 5р., такою як Вгазвіса париз олія або Вгавзвіса /ипсеа олія, Соззурійит Вітвийит олія, Г/пит ивйаїїввітит олія, Неїапіпиз 5р. олія, Саппатив псіопив5 олія, Сіусіпе тах олія, 2еа тауз олія, Е/аевіх диіпеепів олія, М/соїапа Брепіпйатіапа олія, Гиріпиє апдизійюйи5 олія, Сатеїїпа зайуа олія, Статьбе абузвіпіса олія, Мізсапіпиз» х дідапів!из олія або Мізсапіпив» 5іпепвів олія.
5. Спосіб одержання екстрагованого рослинного ліпіду, який включає стадії, на яких: Зо ї) одержують частину рослини, що містить ліпід, який містить жирні кислоти в естерифікованій формі, при цьому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 006 жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК) та у-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які містять а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і одну або більше з ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) і ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить від близько 2 до 16 9б, і рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить менше ніж 1 до, причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду, що екстрагується, у частині рослини становить: а) від 20,1 до 30 95 або Б) від 30 до 35 95, і і) екстрагують ліпід із частини рослини, при цьому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот екстрагованого ліпіду становить: а) від 20,1 до 30 95 або Б) від 30 до 35 95.
6. Спосіб за п. 5, який відрізняється тим, що екстрагований ліпід має одну або більше ознак, визначених у п. 2 або 3.
7. Спосіб за п. 5 або б, який відрізняється тим, що частина рослини містить екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) ДА15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Д12-десатураза, ю3-десатураза та/або ДЛ15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) Ф3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Д8-десатураза, А5-десатураза, Л4-десатураза, ДЛо9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) Д12-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і А5-елонгаза, мії) А12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза та Д5-елонгаза,
їх) шЗ-десатураза або Д15-десатураза, Лб-десатураза, Д5-десатураза, Дб-елонгаза і дД5Ь- елонгаза, х) ш3-десатураза або Д15-десатураза, Д8-десатураза, Д5-десатураза, ДУ-елонгаза і дь- елонгаза, хі) А12-десатураза, Ф3-десатураза або Д15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Лб- елонгаза та Д5-елонгаза, або хії) Д12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, До- елонгаза та Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторів, які регулюють експресію вказаних полінуклеотидів в клітині частини рослини.
8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що частина рослини має одну або більше, або всі з наступних ознак: ї) Д12-десатураза перетворює олеїнову кислоту на лінолеву кислоту в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, від близько 60 до близько 95 95, від близько 70 до близько 90 95 або від 75 до близько 85 905, ії) Ф3-десатураза перетворює 06 жирні кислоти на 03 жирні кислоти в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 65 95, щонайменше близько 75 905, щонайменше близько 85 95, від близько 65 до близько 95 95, від близько 75 до близько 91 95 або від близько 80 до близько 91 95, ії) Дб-десатураза перетворює АЛК на СДК в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 Фо, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 956, щонайменше близько 70 95, від близько 30 до близько 70 95, від близько 35 до близько 60 95 або від близько 50 до близько 70 р, їм) Аб-десатураза перетворює лінолеву кислоту на у-ліноленову кислоту в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю менше ніж близько 5 95, менше ніж близько 2,5 95, менше ніж близько 1 95, від близько 0,1 до близько 5 95, від близько 0,5 до близько 2,5 95 або від близько 0,5 до близько 1 905, Зо м) Аб-елонгаза перетворює СДК на ЕТК в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 до, від близько 60 до близько 95 95, від близько 70 до близько 80 95 або від близько 75 до близько 80 95, мі) А5-десатураза перетворює ЕТК на ЕПК в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 75 до, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, від близько 60 до близько 95 95, від близько 70 до близько 95 95 або від близько 75 до близько 95 905, мії) АбБ-елонгаза перетворює ЕПК на ДПК в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 85 95, щонайменше близько 90 Фо, від близько 50 до близько 90 95 або від близько 85 до близько 95 95, мії) д4-десатураза перетворює ДПК на ДГК в одній або більше клітинах частини рослини з ефективністю щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 95, щонайменше близько 93 до, від близько 50 до близько 95 95, від близько 80 до близько 95 95 або від близько 85 до близько 95 95, їх) ефективність перетворення олеїнової кислоти на ДГК та/або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 15 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 25 95, від близько 10 до близько 50 95, від близько 10 до близько 30 95, від близько 10 до близько 25 95 або від близько 20 до близько 30 о, хх) ефективність перетворення ЛК на ДГК або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше близько 15 9565, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 22 905, щонайменше близько 25 95, щонайменше близько 30 95, від близько 15 до близько 50 95, від близько 20 до близько 40 95 або від близько 20 до близько 30 95, хі) ефективність перетворення АЛК на ДГК або ДПК в одній або більше клітинах частини рослини становить щонайменше близько 17 95, щонайменше близько 22 95, щонайменше близько 24 95, щонайменше близько 30 95, від близько 17 до близько 55 95, від близько 22 до близько 35 95 або від близько 24 до близько 35 95, хії) одна або більше клітин частини рослини містять щонайменше близько на 25 95, щонайменше близько 30 95, від близько 25 до близько 40 95 або від близько 27,5 до близько 60 37,5 95 більше 03 жирних кислот, ніж відповідні клітини без екзогенних полінуклеотидів,
хії) Аб-десатураза переважно здійснює десатурацію а-ліноленової кислоти (АЛК) відносно лінолевої кислоти (ЛК), хім) Аб-елонгаза також має активність Л9-елонгази, хм) Д12-десатураза також має активність Л15-десатурази, хмі) Аб-десатураза також має активність Ав-десатурази, хмії) АвВ-десатураза також має активність Дб-десатурази або не має активність Дб-десатурази, хмії) А15-десатураза також має активність 03-десатурази відносно ГЛК, хіх) Ф3-десатураза також має активність Д15-десатурази відносно ЛК, хх) Ф3-десатураза здійснює десатурацію ЛК та/або ГЛК, ххі) Ф3-десатураза переважно здійснює десатурацію ГЛК відносно ЛК, ххії) одна або більше або всі десатурази виявляють вищу активність на субстраті ацил-КоА, ніж на відповідному субстраті ацил-ФХ, ххії) Дб-десатураза має вищу активність Дб-десатурази відносно АЛК, ніж ЛК як жирнокислотного субстрату, ххім) Аб-десатураза має вищу активність Дб-десатурази відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5л-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххм) Аб-десатураза має щонайменше в 2 рази вищу активність Аб-десатурази, щонайменше в З рази вищу активність, щонайменше в 4 рази вищу активність або щонайменше в 5 разів вищу активність відносно АЛК як субстрату, в порівнянні з ЛК, ххмі) Аб-десатураза має вищу активність відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) Аб-десатураза має щонайменше близько в 5 разів вищу активність Аб-десатурази або щонайменше в 10 разів вищу активність відносно АЛК-КоА як жирнокислотного субстрату, ніж відносно АЛК, приєднаної до положення 5п-2 ФХ, як жирнокислотного субстрату, ххмії) десатураза являє собою фронт-енд десатурази, ххіх) Дб-десатураза не має активності Д5-десатурази, що піддавалася б виявленню, відносно
ЕТК.
9. Спосіб за п. 7 або 8, який відрізняється тим, що екзогенні полінуклеотиди ковалентно з'єднані в молекулу ДНК, інтегровану в геном клітин частини рослини.
10. Спосіб за п. 9, який відрізняється тим, що кількість молекул ДНК, інтегрованих в геном клітин частини рослини дорівнює не більше одиниці, не більше двох або трьох, або дорівнює двом або трьом.
11. Спосіб за п. 9 або 10, який відрізняється тим, що молекула ДНК є молекулою Т-ДНК.
12. Спосіб за будь-яким із пп. 5-9, який відрізняється тим, що загальний вміст олії в частині рослини, що містить екзогенні полінуклеотиди, становить щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, від близько 50 до близько 80 95 або від близько 80 до близько 100 95 від загального вмісту олії у відповідній частині рослини, у якій відсутні екзогенні полінуклеотиди.
13. Спосіб за будь-яким із пп. 5-12, який додатково включає стадію, на якій обробляють ліпід для підвищення відсоткового рівня ДГК відносно загального рівня вмісту жирних кислот, причому обробка включає одне або більше із фракціонування, перегонки або переестерифікації, такої як одержання метилових або етилових ефірів ДГК.
14. Олійна рослина або її частина, що містить: а) ліпід в її насінні, який містить жирні кислоти в естерифікованій формі, і б) екзогенні полінуклеотиди, що кодують один із наступних наборів ферментів: ї) А12-десатураза, ою3-десатураза та/або Л15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, або ії) Д12-десатураза, 03-десатураза та/або Д15-десатураза, Д8в-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, при цьому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше специфічних до насіння промоторів, які регулюють експресію вказаних полінуклеотидів в насінні рослини, що вирощують, причому жирні кислоти містять олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту, 06 жирні кислоти, які містять лінолеву кислоту (ЛК) і а-ліноленову кислоту (ГЛК), 03 жирні кислоти, які містять а-ліноленову кислоту (АЛК), стеаридонову кислоту (СДК), докозапентаєнову кислоту (ДПК) і докозагексаєнову кислоту (ДГК), і один або більше з ейкозапентаєнової кислоти (ЕПК) та ейкозатетраєнової кислоти (ЕТК), причому рівень ДГК у загальному вмісті жирних кислот ліпіду в насінні становить: а) від 20,1 до 30 95 або Б) від ЗО до 35 95,
і при цьому рівень пальмітинової кислоти у загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить від близько 2 до 16 95, і при цьому рівень міристинової кислоти (С14:0) у загальному вмісті жирних кислот ліпіду становить менше ніж 1 95.
15. Частина олійної рослини, що має одну або більше із наступних ознак: ї) одержана із олійної рослини за п. 14, або її) містить ліпід за будь-яким із пп. 1-3.
16. Частина рослини за п. 14 або 15, яка є насінням.
17. Трансгенне зібране зріле насіння Вгаззіса пари», В. їипсеа або Сатеїїйпа з5аїїма, що містить ліпід, за будь-яким із пп. 1-3 та вологу від близько 4 до близько 15 95 мас., від близько б до близько 8 95 мас. або від близько 4 до близько 8 95 мас., причому вміст ДГК у вказаному насінні становить щонайменше близько 28 мг на грам насіння, щонайменше близько 32 мг на грам насіння, щонайменше близько 36 мг на грам насіння, щонайменше близько 40 мг на грам насіння, щонайменше близько 44 мг на грам насіння, щонайменше близько 48 мг на грам насіння або щонайменше близько 72 мг на грам насіння, або від близько 30 мг до близько 80 мг на грам насіння.
18. Спосіб одержання рослини, яка містить ліпід за будь-яким із пп. 1-3, який включає стадії, на яких: а) здійснюють кількісне визначення рівня ДГК в ліпіді, продукованому однією або більшою кількістю частин рослини від множини рослин, причому кожна рослина містить один або більше екзогенних полінуклеотидів, що кодують один із наступних наборів ферментів; ї) ю3-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) ДА15-десатураза, Аб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, ії) А12-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Дб-елонгаза і Д5-елонгаза, їм) Д12-десатураза, 03-десатураза або Д15-десатураза, Дб-десатураза, Д5-десатураза, Да- десатураза, Аб-елонгаза і Д5-елонгаза, м) 3-десатураза, Ав-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9-елонгаза і Д5-елонгаза, мі) А15-десатураза, Д8-десатураза, А5-десатураза, Л4-десатураза, ДЛо9-елонгаза і Д5-елонгаза, мії) А12-десатураза, Дв-десатураза, Д5-десатураза, Д4-десатураза, Д9У-елонгаза і Д5-елонгаза, або Зо мії) А12-десатураза, ю03-десатураза або А15-десатураза, Ав-десатураза, А5-десатураза, Да- десатураза, ДЛ9-елонгаза і Д5-елонгаза, причому кожен полінуклеотид функціонально зв'язаний з одним або більше промоторами, які регулюють експресію вказаних полінуклеотидів у клітині частини рослини, і б) ідентифікують із множини рослин рослину, яка містить ліпід за будь-яким із пп. 1-3 в одній або більше його частин, і в) одержують потомство рослин від ідентифікованої рослини або їх насіння.
19. Олійна рослина або її частина за пп. 14-15, або вирощене насіння за будь-яким із пп. 16-17, які містять олію за п. 2 або 3.
20. Шрот, одержаний із насіння за будь-яким з пп. 16-17 або одержаний із рослини за п. 14.
21. Корм, що містить одне або більше із ліпіду або олії за будь-яким з пп. 1-3, рослину олійної культури за п. 14, частину рослини за п. 19, вирощене насіння за будь-яким з пп. 16-17 або шрот за п. 20.
22. Спосіб одержання корму, який включає стадію, на якій змішують один або більше із ліпіду або олії за будь-яким із пп. 1-3, рослину олійної культури за п. 14, частину рослини за п. 19, вирощене насіння за будь-яким з пп. 16-17 або шрот за п. 20 щонайменше із ще одним поживним інгредієнтом.
23. Спосіб лікування або попередження стану, при якому прийнятним є використання ПНЖК, у формі одного або більше з ліпіду або олії за будь-яким із пп. 1-3, частини рослини за п. 19, вирощеного насіння за будь-яким з пп. 16-17 або шроту за п. 20, при цьому вказаний стан включає серцеву аритмію, ангіопластику, запалення, астму, псоріаз, остеопороз, камені в нирках, СНІД, множинний склероз, ревматоїдний артрит, хворобу Крона, шизофренію, рак, плодовий алкогольний синдром, синдром гіперактивності і дефіциту уваги, муковісцидоз, фенілкетонурію, уніполярну депресію, агресивну ворожість, адренолейкодистрофію, захворювання коронарних судин серця, гіпертензію, діабет, ожиріння, хворобу Альцгеймера, хронічне обструктивне захворювання легенів, виразковий коліт, рестеноз після ангіопластики, екзему, гіпертонію, агрегацію тромбоцитів, шлунково-кишкову кровотечу, ендометріоз, передменструальний синдром, міалгічний енцефаломієліт, хронічну втомленість після вірусних інфекцій або захворювання очей.
МИХ залік : - ! : ! си п, б, А1І дес | б, б, в ПОВНО , ; Іво (ЛК не о ПОВ ШИН . СЕШЕ ее о ОДНЕ му : - ПЕКОЕНОВН дн пвАВадяНТЮ 00000000 валова нн ПЕН ее | я ) й ЩЕ о ЕЕ ух: в с | вату : КОЩВАКЕННося ПЕОННОрІ я в с пе СМР АЖ СВО ПО Е МИ еле сб, о п маша ія зола ЗЛА ДК ; таз попав жи едк ма ТЯ ЯЕХ ПІ я. че ка 1 ЇАРЮ Й ПІШЛИ М ЗО, ї 3 да затЕ; - ПИЛКИ о. беж оавдл тата о що г дкена і квт що шо ПІШІИИЦИИИИИИИЕ шо ПИШНИМИ ПИ ШИ ПЛИНИ МИТИ ксенон «ЄДИ ПИШИ ПИШИ МІ
Вико МЕ Вісраче Зі гос ВАВ ВИ Мірена о лою | РА РЕ р В у ! : ї ! г жо МАЮ аб онко |. с Мей хр Те МО г іс Мо с. І МЕ Сей хе 3 КО ВО ОЕМ с сю Св! Б О35ю
ФІГ. 2 КВ Ружо-АбЕ бужо А БА МіджААВЮ /Вероче3о Баха АС ВсуннАЗО ВАК ІВ мові | щи | їй ЖЖ зер я й ес Я ав й 15 х х сі 15 Я В МО Бер Її. «й УР «КАК ОР а б щодо В хм дж я ду я А М и рн З А ТЕ, КО МТК вод «ЕМ ВКМ о еВ ой ШУ К з М СКК МОХ БК 1 ше Ве й ше ВИ о пише шле ката З АТ АТ пвх сво 0/5 07 сов ою 1 1 ВОМ КЕ я ЕОР КАК КА 1555
ФІГ. З ню А мисі ДГге-альфа ДЕК-бета 4 д і На г : НН НЕ дюн гі г і а / 4 / ї що 3 ї ї 5 ї ї і у і? ої , 1 кА ля х той з ї я АКхдТЄ вес КЕ - Я У є . 2 - звекотй т я ше ен УТ щ и а ен М и ситі лк, кону, Я сх : вер рем і ї л тла НУ 1ІхО 1724 БО тяж ТИТА НЕЖЯ 1 пк В А (пропроміле) : ДПпсальфа даху і я, ДдлЄбета дов НА : ЕЕ 4 я ' ще У НИ ка АЙ У ях Ме х ко у 1 діж ті ке пк ло як ЯК окон ; дя а ан еф кнтйх МАЙ АЙ Ан ин : венеерня Кене : а х гбоннеетретттеттттттт тт росте ооотторстсресстттттртсосеснрттотесресстсс того оортоооронтогустсосроснесетертетесессуегтестсня зга 1775 НН 1 НИ ту УМ ІЇАХ їла В (пропроміпе)
ФІГ. 5 й. : я БІО в ві : я що жо тю мо й ю мою юю й їх й 5 в бою юю юю а о а ща а жа теме с се саме ик ож а Ма ку бла тет ет ек теп Ма сте о я тет бак ек ку лк зву ку бла Ж м м ж м я хм ж хх ж ж ох ж м ж жк ж ж хх - - че о т в ча чна ча и м
ФІГ. 6
А) зв, ня тн же ТАМ Доу - бо ей ЖАТих 1 ШО бони шен ак ях ША
З х. ке я ее их понти, дл З як б й. ГУ Зх Й нн ек и у дити и ті КхЯ ні т а -ж - под а Ши Ух Дон я ко. по НО й й З холестан -30-ол В) зоря ХК . ма сер зе ху і і і і хо , - и А мою ке поні ! у І Ї т 7 т ск Налити кампестерол ситастарол г ї І ; и п я днях з их шн се М а да я , ! і | Кй дк ж , Т сих г « ни тенту, я ходи ГГ х 5 У км ж с . я й п я 7 о брасікаетеропо 7 76 стигпмастерояло 70760 авенастерол ФІГ, 7 х х и о. ; ще ї 5 7 їх ї Ку ї - СЯ З ш ї . К , ї З - ж х ; й ди їх. Ух т Є У ря Х х Х ЖК х їм. 5 й ї й х т ж Я х Х ще Є. ЕК т ї х те Ж х х х Ма Б 5 ' 7 х т У т ' Кк т м. ХУ ; ; г м КЗ 1 у до т ! ! " й т ХЕ у Е ї їх їх т ' " у х ЩО х , З ! У Я Ж; ї : т
Тих. м У : / й г х х 1 ; / 7 Кк є й х « ! ї 7 я я, хх. їй і і " ? во Ух ж і 1 с - М , К Я ' х Ж сим » У ! ї ї 7 Є хо У ї і 4 и в т В, Ж х х 7 й 7 7 ' ях, х х « і й 7 ве їх к х 4 1 КЕ як од х І ! щу - а ск, ї і І . ї ці « є с с У 1 3 г ' ж ши й і У ї і : 7 7 я хш ч ї : : , - М щ . Е з : " що й ж хх » 1 ' ; 7 7 7 що к 5 х ,. : з ї 7 7 ЗК х х х : є и -7 5 є ух У і ' ї х К 7 їжу « Аа » ке ж х я с ни ха х хг. й - ди
« . хаіікаг 2 7 ще . ий як шо - « . ТЕ ее градтМиНО КАТ ши мою ЕНИМ Моя НМ у мит - Мій ї т т : Аа Х сем Я УК АК сля пентиехкт ха тя М ГУ З КО пеня ща ві.
! . ТОК рент Ор вен Н У У ; ! я і т і бякжж ше А тА не Слгжав Ме у . с Пейдж зни 7 Я я ж САТ ауа дині БУ г. ж сх дини и й Кк ее щи с х вн ше х аа Кт я о х 7 тку 7 Ко ! «7 . ку . ще х я ХХ : х у в пух сх є тії Мк ж Е Я х МК их - т и / 2 ї ех т Мод а є, кі ї Є х а и й й май г х 7 Й г і - Я у у с аг щік р й ! 5 у х щк Я, й Кк й : і х х т ще вк Ко ї і х у т -х ; ї Її 3 з з й : г ї , Х Е х г й ; : ' А У З Яке я / Е 1 1 я З К- Й и і Е ї М Що й й Ї : х х й. я Н Н ! х з 5 в 2 ! і х ' З С у / і х х - о й і ; у З а й , ! і ї Б ех ДЕ г. і ї ч З ї и Ки і У т 5 7 є Ж З у "З Е Ко : ' Ж я Ф х У - й Ка її ї 5 х Ф М я х З Ж 5 5 х в, 5 р ї З З х ч З х в ; х т з Ж х х х В У т 5 ій 7 й х 5 КІ г ро х й ж й я т
ФІГ. 8 п пи А ЛФКАТ:. по й о іх Кенеді : п ух : ян 0 ХФССЄ лю 0000ФХА : о : В 1 ФДАТІ; не ПК пи о Поп якжевкияют ПИЛ С Ферменти . з . те Її що | а ДГАТ о ї ше 0000 ТАС Ї дшильнітупи у п ПН ПИЛ ПО оо , Ж а ' . РОЗД донних нен сну ніна лення дина никнення піекутент путем ет нетеююню ше ' | ; Ї КОЗУ ооснннннннттенетянютентитлетиюти сопе пет чнттатоотеттннікоентнптесі петпосіте тисне нс ння тий ткнтен ато ттетюіпвттистнвенен тис Яенненененянннк ши ше а 2 г Я в і м й тенет нт техно енафенненннтттентній Бен : : ї : З : 5 ж ! той ін У кто опт тю ння ; ! я ! КЕ 15 прннняфенняя нин нин о о шо и Як ння В «3.32 05555305. : г СХ. - З і Х жов З Є - : А ви їз шипшини св ж, ї; й є а ) і г ее й я о З і ї ЕК. пили ; о й ; . ї Ко ; 7 пз пий ; х і Аеуннн яння ннтння В ниудетнтенин нути ктуденвя ст утиттння нти ун нкоктютчаня не фрунеенттденннст ня чути тя нтрчнннтен нти ранні що не : Події !
UAA201607729A 2013-12-18 2014-12-18 Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти UA122768C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2013905033A AU2013905033A0 (en) 2013-12-18 Production of increased levels of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
AU2014902471A AU2014902471A0 (en) 2014-06-27 Production of increased levels of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
PCT/AU2014/050433 WO2015089587A1 (en) 2013-12-18 2014-12-18 Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA122768C2 true UA122768C2 (uk) 2021-01-06

Family

ID=53367674

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201607729A UA122768C2 (uk) 2013-12-18 2014-12-18 Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти

Country Status (18)

Country Link
US (6) US9725399B2 (uk)
EP (1) EP3082405A4 (uk)
JP (3) JP6726619B2 (uk)
KR (2) KR102535223B1 (uk)
CN (2) CN111154724B (uk)
AU (1) AU2014366839B2 (uk)
BR (1) BR112016014508A2 (uk)
CA (2) CA2933909A1 (uk)
CL (2) CL2016001560A1 (uk)
EA (2) EA037817B1 (uk)
IL (1) IL246275B (uk)
MX (2) MX2016008270A (uk)
NZ (1) NZ721036A (uk)
PE (2) PE20170253A1 (uk)
PH (1) PH12016501194B1 (uk)
SG (1) SG11201604871VA (uk)
UA (1) UA122768C2 (uk)
WO (1) WO2015089587A1 (uk)

Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
CA3056163C (en) 2004-04-22 2021-04-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
AU2009317860B2 (en) 2008-11-18 2014-03-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
CA2876519C (en) 2012-06-15 2020-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
US11718577B2 (en) * 2013-12-18 2023-08-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid compositions comprising triacylglycerol with long-chain polyunsaturated fatty acids
CN117305343A (zh) * 2014-06-27 2023-12-29 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
AU2015345049B2 (en) 2014-11-14 2021-12-23 Basf Plant Science Company Gmbh Brassica events LBFLFK and LBFDAU and methods for detection thereof
BR112018076323A8 (pt) 2016-06-16 2022-11-08 Nuseed Pty Ltd Segregante da linhagem de canola endogâmica ns-b50027-4, planta de canola ou parte desta, método para obtenção de uma linhagem de canola endogâmica, método de produção de ácido eicosapentaenóico (epa), ácido docosapentaenóico (dpa), ou ácido docosahexaenóico (dha) na semente de uma planta, semente da planta, método de produção de óleo de canola contendo ácido docosahexaenóico (dha), método de aumento da produção de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa (lc-pufa), e linhagem de canola endogâmica
EP4338586A3 (en) 2016-06-16 2024-06-26 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd Elite event canola ns-b50027-4
CN110381992A (zh) * 2016-12-03 2019-10-25 Uab研究基金会 组合了肺炎球菌表面蛋白A的选择的α螺旋结构域和脯氨酸富集结构域的肺炎球菌疫苗
CN107048405A (zh) * 2017-03-03 2017-08-18 武汉锶博睿医药技术有限公司 脂肪酸组件微胶囊及其制备方法
US11913006B2 (en) 2018-03-16 2024-02-27 Nuseed Global Innovation Ltd. Plants producing modified levels of medium chain fatty acids
CA3096389A1 (en) 2018-04-13 2019-10-17 Cargill, Incorporated Method of cultivating lc-pufa containing transgenic brassica plants
EP3560342B1 (en) 2018-04-25 2020-06-03 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
KR20250004393A (ko) * 2018-04-25 2025-01-07 누시드 뉴트리셔널 유에스 아이엔씨. Dha가 풍부한 다중불포화된 지방산 조성물
EP3586641A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586640A1 (en) 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586643A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Dha enriched polyunsaturated fatty acid compositions
EP3586642A1 (en) * 2018-06-21 2020-01-01 Nuseed Pty Ltd Ala enriched polyunsaturated fatty acid compositions
CN108929784A (zh) * 2018-06-21 2018-12-04 江南大学 一种富含多不饱和脂肪酸的甘二酯油脂及其制备方法
CA3129494A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Cargill, Incorporated Brassica plants producing elevated levels of polyunsaturated fatty acids
CN109796328B (zh) * 2019-03-14 2022-03-25 浙江工业大学 一种高纯度香榧籽油金松酸的分离方法
EP3938480A4 (en) * 2019-03-14 2022-12-28 DSM IP Assets B.V. Methods of obtaining lipids from a microbial cell composition by enzyme and ph shock
US20220346340A1 (en) * 2019-08-26 2022-11-03 Nuseed Nutritional Australia Pty Ltd. Brassica juncea Line NUBJ1207
CN110438175A (zh) * 2019-09-16 2019-11-12 东北农业大学 一种冷冻分离后的轻相米糠油与共轭亚油酸酯交换制备功能性油脂的方法
EP4048252A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Nuseed Nutritional US Inc. Enriched polyunsaturated fatty acid compositions
US20230397562A1 (en) 2020-11-04 2023-12-14 Cargill, Incorporated Harvest Management
EP4263837A1 (en) * 2020-12-18 2023-10-25 Rothamsted Research Limited Increasing the accumulation of epa and dha in recombinant camelina
WO2022204454A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Cargill, Incorporated Fertilizer management
US11186597B1 (en) 2021-06-24 2021-11-30 King Abdulaziz University Method of extracting phospholipids from fish roe
US20240423241A1 (en) 2021-11-08 2024-12-26 Can Technologies, Inc. High plant pufa fish food

Family Cites Families (291)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
EP0131623B2 (en) 1983-01-17 1999-07-28 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US5504200A (en) 1983-04-15 1996-04-02 Mycogen Plant Science, Inc. Plant gene expression
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
ZA871352B (en) 1986-02-27 1987-08-12 The General Hospital Corporation Plant cells resistant to herbicidal glutamine synthetase inhibitors
MA20977A1 (fr) 1986-05-19 1987-12-31 Ciba Geigy Ag Plantes tolerant les herbicides contenant le gene de gluthathione S-Transferase
US5188958A (en) 1986-05-29 1993-02-23 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in brassica species
US5177010A (en) 1986-06-30 1993-01-05 University Of Toledo Process for transforming corn and the products thereof
SE455438B (sv) 1986-11-24 1988-07-11 Aga Ab Sett att senka en brennares flamtemperatur samt brennare med munstycken for oxygen resp brensle
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
CN87100603A (zh) 1987-01-21 1988-08-10 昂科公司 抗黑素瘤疫苗
RO114469B1 (ro) 1987-12-15 1999-04-30 Gene Shears Pty Ltd Compus oligoribonucleotidic, procedeu de preparare si metoda de inactivare
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5932479A (en) 1988-09-26 1999-08-03 Auburn University Genetic engineering of plant chloroplasts
WO1991002071A2 (en) 1989-08-09 1991-02-21 Dekalb Plant Genetics Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DK0472712T3 (da) 1990-03-16 2002-01-14 Calgene Llc Sekvenser, der præferentielt eksprimeres i tidlig frøudvikling og dertil relaterede fremgangsmåder
US5451513A (en) 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5877402A (en) 1990-05-01 1999-03-02 Rutgers, The State University Of New Jersey DNA constructs and methods for stably transforming plastids of multicellular plants and expressing recombinant proteins therein
US5861187A (en) 1990-08-30 1999-01-19 Cargill, Incorporated Oil from canola seed with altered fatty acid profiles and a method of producing oil
US7135614B1 (en) 1990-08-30 2006-11-14 Cargill, Incorporated Brassica or helianthus plants having mutant delta-12 or delta-15 sequences
US5518908A (en) 1991-09-23 1996-05-21 Monsanto Company Method of controlling insects
PH31293A (en) 1991-10-10 1998-07-06 Rhone Poulenc Agrochimie Production of y-linolenic acid by a delta6-desaturage.
US6355861B1 (en) 1991-10-10 2002-03-12 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of gamma linolenic acid by a Δ6-desaturase
US6683232B1 (en) 1991-10-10 2004-01-27 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ linolenic acid by a Δ6-desaturase
US5614393A (en) 1991-10-10 1997-03-25 Rhone-Poulenc Agrochimie Production of γ-linolenic acid by a Δ6-desaturase
JPH07501701A (ja) 1991-12-04 1995-02-23 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 植物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子
US5593874A (en) 1992-03-19 1997-01-14 Monsanto Company Enhanced expression in plants
US5683898A (en) 1992-05-15 1997-11-04 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
US5798259A (en) 1992-05-15 1998-08-25 Sagami Chemical Research Center Gene coding for eicosapentaenoic acid synthesizing enzymes and process for production of eicosapentaenoic acid
EP0594868A4 (en) 1992-05-15 1997-01-02 Sagami Chem Res Gene which codes for eicosapentaenoic acid synthetase group and process for producing eicosapentaenoic acid
US6372965B1 (en) 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
US6872872B1 (en) 1992-11-17 2005-03-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and related enzymes from plants
DE69410247T2 (de) 1993-03-11 1998-09-03 Canada Nat Res Council Verbessertes regenerationssystem für getreide
CA2092588C (en) 1993-03-26 2008-07-08 Narender S. Nehra Enhanced regeneration system for cereals
SE9302431D0 (sv) 1993-07-16 1993-07-16 Ab Astra Use of indenoindole compounds
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
GB9324707D0 (en) 1993-12-02 1994-01-19 Olsen Odd Arne Promoter
GB9403512D0 (en) 1994-02-24 1994-04-13 Olsen Odd Arne Promoter
US5545818A (en) 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US6310194B1 (en) 1994-09-26 2001-10-30 Carnegie Institution Of Washington Plant fatty acid hydroxylases
US5834293A (en) 1994-09-28 1998-11-10 Vanderbilt University Cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase genetic mutation associated with hypertension
DE4435392B4 (de) 1994-10-04 2008-02-07 Immuno Ag Verfahren zur Trennung von vWF in hochmolekularen vWF und niedermolekularen vWF
JPH08163991A (ja) * 1994-12-15 1996-06-25 Mitsui Petrochem Ind Ltd タキサン型ジテルペンの製造方法
GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
US6342658B1 (en) 1995-12-14 2002-01-29 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
EP0880312B1 (en) 1995-12-14 2006-03-08 Cargill Incorporated Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles
US7541519B2 (en) 1995-12-14 2009-06-02 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
SE9601236D0 (sv) 1996-03-29 1996-03-29 Sten Stymne Novel plant enzyme and use thereof
CN1208437A (zh) 1996-06-21 1999-02-17 孟山都公司 农杆菌介导转化法生产稳定转化的可育小麦的方法及其相关组分
US5850026A (en) 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
CA2259942A1 (en) 1996-07-10 1998-01-15 Sagami Chemical Research Center Process for producing icosapentaenoic acid by genetic recombination
US6337266B1 (en) 1996-07-22 2002-01-08 Micron Technology, Inc. Small electrode for chalcogenide memories
US7109392B1 (en) 1996-10-09 2006-09-19 Cargill, Incorporated Methods for increasing oleic acid content in seeds from transgenic plants containing a mutant delta 12 desaturase
WO1998018952A1 (fr) 1996-10-30 1998-05-07 Nippon Suisan Kaisha, Ltd. Procede de production de matieres grasses contenant des acides gras hautement insatures contenant eux-memes un acide docosahexaenoique a concentration selective
US6194167B1 (en) 1997-02-18 2001-02-27 Washington State University Research Foundation ω-3 fatty acid desaturase
AT406373B (de) 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
ATE408701T1 (de) 1997-03-04 2008-10-15 Suntory Ltd Verfahren zur herstellung von hochungesättigten fettsäuren und hochungesättigte fettsäuren enthaltendes lipid
US5977436A (en) 1997-04-09 1999-11-02 Rhone Poulenc Agrochimie Oleosin 5' regulatory region for the modification of plant seed lipid composition
US6075183A (en) 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US5972664A (en) 1997-04-11 1999-10-26 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
DK0996732T3 (da) 1997-04-11 2005-10-17 Calgene Llc Fremgangsmåder og sammensætninger til syntese af langkædede polyumættede fedtsyrer i planter
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US6428990B1 (en) 1997-04-11 2002-08-06 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
US6051754A (en) 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US6432684B1 (en) 1997-04-11 2002-08-13 Abbott Laboratories Human desaturase gene and uses thereof
IL132393A0 (en) 1997-04-15 2001-03-19 Commw Scient Ind Res Org Plant fatty acid epoxygenase genes and uses therefor
US7589253B2 (en) 1997-04-15 2009-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Fatty acid epoxygenase genes from plants and uses therefor in modifying fatty acid metabolism
US6235529B1 (en) 1997-04-29 2001-05-22 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for plant transformation and regeneration
US6566583B1 (en) 1997-06-04 2003-05-20 Daniel Facciotti Schizochytrium PKS genes
JP2002510205A (ja) 1997-06-04 2002-04-02 カルジーン エルエルシー ポリケチド様合成遺伝子を植物内で発現させることによる多不飽和脂肪酸の製造
WO1998056239A1 (en) 1997-06-12 1998-12-17 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
ZA986574B (en) 1997-07-23 2000-01-12 Sanford Scient Inc Improved plastid transformation of higher plants and production of transgenic plants with herbicide resistance.
WO1999014314A1 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Regulation of gene expression in plants
DE69836552T3 (de) 1997-09-30 2014-10-09 The Regents Of The University Of California Herstellung von proteinen in pflanzensamen
GB9724783D0 (en) 1997-11-24 1998-01-21 Inst Arable Crops Research Novel polypeptides
US20030152983A1 (en) 1997-12-23 2003-08-14 University Of Bristol Desaturase
JP2002508932A (ja) 1997-12-23 2002-03-26 ザ ユニバーシティ オブ ブリストル デサチュラーゼ
US6100447A (en) 1998-02-12 2000-08-08 Applied Phytologics, Inc. Method of barley transformation
US6838594B1 (en) 1998-03-20 2005-01-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
CA2319727C (en) 1998-03-20 2012-09-25 E.I. Du Pont De Nemours And Company Limnanthes oil genes
US6492108B1 (en) 1998-03-26 2002-12-10 Incyte Genomics, Inc. Delta-6 desaturase homologs
WO1999061602A1 (en) 1998-05-29 1999-12-02 Ohio University Compositions and methods for the synthesis of fatty acids, their derivatives and downstream products
WO1999064616A2 (en) 1998-06-12 1999-12-16 Abbott Laboratories Polyunsaturated fatty acids in plants
EP1895009A1 (en) 1998-06-12 2008-03-05 Calgene LLC Polyunsaturated fatty acids in plants
US7135617B2 (en) 1998-07-02 2006-11-14 Calgene Llc Diacylglycerol acyl transferase proteins
EP1105486B1 (en) 1998-08-20 2011-04-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for plant fatty acid modifying enzymes associated with conjugated double bond formation
EP1107975A4 (en) 1998-08-24 2003-07-16 Univ Rutgers SYNTHETIC FATTY ACID DESATURASEGEN FOR EXPRESSION IN PLANTS
US6677145B2 (en) 1998-09-02 2004-01-13 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US20030163845A1 (en) 1998-09-02 2003-08-28 Pradip Mukerji Elongase genes and uses thereof
US6403349B1 (en) 1998-09-02 2002-06-11 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US6913916B1 (en) 1998-09-02 2005-07-05 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
WO2000020603A1 (en) 1998-10-05 2000-04-13 Abbott Laboratories Altered fatty acid biosynthesis in insect cells using delta five desaturase
AU1097900A (en) 1998-10-05 2000-04-26 Abbott Laboratories Delta 6 and delta 12 desaturases and modified fatty acid biosynthesis and products produced therefrom
CA2346006A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Merck & Co., Inc. Delta 6 fatty acid desaturase
JP4182192B2 (ja) 1998-11-26 2008-11-19 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸の生合成に関与する酵素群をコードする遺伝子
US6864077B1 (en) 1998-12-03 2005-03-08 Edgar B. Cahoon Membrane-bound desaturases
JP2001095588A (ja) 1998-12-04 2001-04-10 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth 緑藻のω３脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びその利用
US6825017B1 (en) 1998-12-07 2004-11-30 Washington State University Research Foundation Desaturases and methods of using them for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US7211418B2 (en) 1999-01-14 2007-05-01 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US8003772B2 (en) 1999-01-14 2011-08-23 Martek Biosciences Corporation Chimeric PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7271315B2 (en) 1999-01-14 2007-09-18 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7217856B2 (en) 1999-01-14 2007-05-15 Martek Biosciences Corporation PUFA polyketide synthase systems and uses thereof
US7247461B2 (en) 1999-01-14 2007-07-24 Martek Biosciences Corporation Nucleic acid molecule encoding ORFA of a PUFA polyketide synthase system and uses thereof
US20070244192A1 (en) 1999-01-14 2007-10-18 Martek Biosciences Corporation Plant seed oils containing polyunsaturated fatty acids
WO2000052183A1 (en) 1999-03-05 2000-09-08 Monsanto Technology Llc Multigene expression vectors for the biosynthesis of products via multienzyme biological pathways
EP1035207A1 (en) 1999-03-09 2000-09-13 MultiGene Biotech GmbH cDNA molecules of the members of gene family encoding human fatty acid desaturases and their use in diagnosis and therapy
AU3308500A (en) 1999-03-18 2000-10-04 University Of Bristol, The Polysaturated fatty acid (pufa) elongase from caenorhabditis elegans
DK1181373T3 (da) 1999-06-07 2006-11-27 Basf Plant Science Gmbh Delta-6-acetylenase og delta-6-desaturase ud fra Ceratodon purpureus
CA2378423A1 (en) 1999-07-06 2001-01-11 Basf Plant Science Gmbh Plants expressing .delta.6-desaturase genes and oils from these plants containing pufas and method for producing unsaturated fatty acids
WO2001004636A1 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Ohio University Mammalian cells expressing desaturases and elongases
US7070970B2 (en) 1999-08-23 2006-07-04 Abbott Laboratories Elongase genes and uses thereof
US7067722B2 (en) 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7531718B2 (en) 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
CA2382693C (en) 1999-08-26 2013-10-01 Calgene Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
DK1214418T3 (da) 1999-09-10 2008-07-07 Nutrinova Gmbh Nucleinsyre fra Tetrahymena kodende for en delta-6-desaturase, fremstilling deraf og anvendelse
FR2798391B1 (fr) 1999-09-15 2001-12-14 Inst Nat Sante Rech Med Enzyme thyroidienne nadph oxydase, acide nucleique codant pour cette enzyme et leurs applications
DE19950589A1 (de) 1999-10-20 2001-05-23 Gvs Ges Fuer Erwerb Und Verwer Elongasepromotoren für gewebespezifische Expression von Transgenen in Pflanzen
JP4221476B2 (ja) 1999-11-19 2009-02-12 独立行政法人産業技術総合研究所 イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻
ATE460490T1 (de) 1999-11-22 2010-03-15 Plant Bioscience Ltd Erhöhte expression von transgenen durch co- exprimierung mit einen suppressor der post- transkriptionelle genabschaltung (ptgs)
US6620986B1 (en) 1999-11-23 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Transformation of Ricinus communis, the castor plant
WO2001038541A1 (en) 1999-11-25 2001-05-31 Basf Plant Science Gmbh Moss genes from physcomitrella patents encoding proteins involved in the synthesis of polyunsaturated fatty acids and lipids
GB9929681D0 (en) 1999-12-15 2000-02-09 Implyx Ltd Transgenic insect
JP2001169780A (ja) 1999-12-15 2001-06-26 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti ドコサヘキサエン酸生産細菌の遺伝子
GB9929897D0 (en) 1999-12-18 2000-02-09 Slabas Antoni R Improvements in or relating to conjugated fatty acids and related compounds
US20030172398A1 (en) 1999-12-21 2003-09-11 Browse John A. Novel delta-12 desaturase and methods of using it for synthesis of polyunsaturated fatty acids
US6591257B1 (en) 1999-12-23 2003-07-08 Hewlett-Packard Development Company Apparatus and method for a compositional decision support reasoning system
JP4547122B2 (ja) 2000-02-09 2010-09-22 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 新規エロンガーゼ遺伝子および高度不飽和脂肪酸の生産方法
US6686185B1 (en) 2000-03-07 2004-02-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25934, a novel fatty acid desaturase and uses therefor
US20040157221A9 (en) 2000-03-07 2004-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US20020065406A1 (en) 2000-03-24 2002-05-30 Meyers Rachel A. 18221, a novel dual specificity phosphatase and uses thereof
US20020111307A1 (en) 2000-06-23 2002-08-15 Glucksmann Maria Alexandra 46508, a novel human peptidyl-tRNA hydrolase family member and uses thereof
US7411054B2 (en) 2000-03-07 2008-08-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, 25934, 26335, 50365, 21117, 38692, 46508, 16816, 16839, 49937, 49931 and 49933 molecules and uses therefor
US6492577B1 (en) 2000-03-16 2002-12-10 The Regents Of The University Of California Leafy cotyledon2 genes and their uses
CA2301158A1 (en) 2000-03-24 2001-09-24 Stephen J. Allen Screening methods for compounds useful for modulating lipid metabolism in disease
AU2000234588A1 (en) 2000-03-31 2001-10-15 Idemitsu Petrochemical Co. Ltd. Process for producing lipids and lipid-secreting microorganisms
US6974898B2 (en) 2000-04-18 2005-12-13 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Method of modifying the content of cottonseed oil
EP1328189B1 (en) 2000-05-16 2016-08-24 Dario B. Crosetto Apparatus for anatomical and functional medical imaging
US7091005B2 (en) 2000-05-16 2006-08-15 Merck & Co., Inc. Gene responsible for Stargardt-like dominant macular dystrophy
AU2001263360A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 50365, a hexokinase family member and uses thereof
WO2001092489A2 (en) 2000-05-26 2001-12-06 Washington State University Research Foundation Palmitate desaturase gene
AU2001261764A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Boyce Thompson Institute For Plant Research Fatty acid desaturase gene and protein for modulating activation of defense signaling pathways in plants
EP1297155A2 (en) 2000-06-29 2003-04-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 25869, a human carboxylesterase and uses thereof
AU2001275990A1 (en) 2000-07-17 2002-01-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 16816 and 16839, novel human phospholipase c molecules and uses therefor
GB0316629D0 (en) 2003-07-16 2003-08-20 Univ York Transgenic cell
WO2002016591A2 (en) 2000-08-21 2002-02-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human transporter family members and uses thereof
AU2001289457A1 (en) 2000-09-26 2002-04-08 Xenon Genetics Inc. Methods and compositions employing a novel stearoyl-coa desaturase-hscd5
EP1911837B1 (en) 2000-09-28 2011-05-25 Bioriginal Food & Science Corp. FAD5-2 fatty acid desaturase family member and uses thereof
CA2429469A1 (en) 2000-11-29 2002-06-06 Xenon Genetics Inc. Human elongase genes and uses thereof
DE10102338A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Expression von Biosynthesegenen in pflanzlichen Samen unter Verwendung von neuen multiplen Expressionskonstrukten
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
US6635451B2 (en) 2001-01-25 2003-10-21 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
CA2435685C (en) 2001-01-25 2011-06-07 Abbott Laboratories Desaturase genes and uses thereof
DE10106660A1 (de) 2001-02-12 2002-08-29 Celanese Ventures Gmbh Verfahren zur Herstellung von gamma-Linolensäure aus einer Ciliaten-Kultur durch Zusatz geeigneter Vorläufermoleküle zu dem Kulturmedium
GB0107510D0 (en) 2001-03-26 2001-05-16 Univ Bristol New elongase gene and a process for the production of -9-polyunsaturated fatty acids
WO2002081702A1 (en) 2001-04-05 2002-10-17 Idemitsu Technofine Co., Ltd. Fatty acid δ6-position desaturase genes and plasmids and tra nsformant containing these genes
TWI337619B (en) 2001-04-16 2011-02-21 Martek Biosciences Corp Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
TWI324181B (en) 2001-04-16 2010-05-01 Martek Biosciences Corp Product and process for transformation of thraustochytriales microorganisms
US7045683B2 (en) 2001-05-04 2006-05-16 Abbott Laboratories Δ4-desaturase genes and uses thereof
US20030082754A1 (en) 2001-05-04 2003-05-01 Pradip Mukerji Delta4 - desaturase genes and uses thereof
EP1392623A4 (en) 2001-05-14 2005-05-04 Martek Biosciences Corp PREPARATION AND USE OF A POLAR LIPID RICH FRACTION CONTAINING HIGHLY UNSATURATED OMEGA-3 AND / OR OMEGA-6 FATTY ACIDS FROM MICROBES, SEEDS OF GENETICALLY MODIFIED PLANTS AND MARINE ORGANISMS
EP1423521B1 (en) 2001-06-06 2008-08-13 Bioriginal Food & Science Corp. Flax (linum usitatissimum l.) seed-specific sequences
DE10134660A1 (de) 2001-07-20 2003-02-06 Basf Plant Science Gmbh Fettsäure-Desaturase-Gene aus Granatapfel und Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren
US20050089879A1 (en) 2001-07-31 2005-04-28 Ivo Feussner Method for producing arachidonic acid in transgenic organisms
US6875595B2 (en) 2001-09-13 2005-04-05 Divergence, Inc. Nematode fatty acid desaturase-like sequences
JP2003116566A (ja) 2001-10-12 2003-04-22 Osamu Suzuki ｎ−３系ドコサペンタエン酸の製造方法
US7211656B2 (en) 2002-01-30 2007-05-01 Abbott Laboratories Desaturase genes, enzymes encoded thereby, and uses thereof
WO2003064638A2 (de) 2002-01-30 2003-08-07 Basf Plant Science Gmbh Elongase-gen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
US7700833B2 (en) 2002-03-01 2010-04-20 Cornell University Process for the production of unsaturated fatty acids
US7705202B2 (en) 2002-03-16 2010-04-27 The University Of York Transgenic plants expressing enzymes involved in fatty acid biosynthesis
US7566813B2 (en) 2002-03-21 2009-07-28 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid constructs and methods for producing altered seed oil compositions
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
ES2542420T3 (es) 2002-05-22 2015-08-05 Monsanto Technology Llc Desaturasas de ácidos grasos de hongos
WO2004000871A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Monsanto Technology Llc Thioesterase-related nucleic acid sequences and methods
WO2004005442A1 (de) 2002-07-03 2004-01-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung von konjugierten mehrfach ungesättigten fettsäuren mit mindestens zwei doppelbindungen in pflanzen
PL377071A1 (pl) 2002-08-12 2006-01-23 Monsanto Technology Llc Sposoby zwiększania całkowitych poziomów oleju w roślinach
DE10246125A1 (de) 2002-10-01 2004-04-15 Aventis Behring Gmbh Konzentrat eines Faktor VIII:C-haltigen von-Willebrand-Faktors und das dazu gehörige Verfahren
MXPA05005777A (es) 2002-12-19 2006-03-08 Univ Bristol Metodo novedoso para produccion de acidos grasos poliinsaturados.
US20040172682A1 (en) 2003-02-12 2004-09-02 Kinney Anthony J. Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oilseed plants
US8084074B2 (en) 2003-02-12 2011-12-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of very long chain polyunsaturated fatty acids in oil seed plants
US7537920B2 (en) 2003-02-27 2009-05-26 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids
JP3840459B2 (ja) * 2003-03-20 2006-11-01 裕司 島田 グリセリドおよびその製造方法
ES2421138T3 (es) 2003-03-31 2013-08-29 University Of Bristol Nuevas aciltransferasas vegetales específicas para ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga
DE10315026A1 (de) 2003-04-02 2004-10-14 Bioplanta Arzneimittel Gmbh Zusammensetzungen enthaltend omega-3-fettsäurehaltige Öle und Pflanzenextrakte
EP1613744B1 (de) 2003-04-08 2015-09-09 BASF Plant Science GmbH Delta-4-desaturasen aus euglena gracilis, exprimierende pflanzen und pufa enthaltende öle
US20060206961A1 (en) 2003-04-16 2006-09-14 Basf Plant Science Gmbh Use of genes for increasing the oil content in plants
US8313911B2 (en) 2003-05-07 2012-11-20 E I Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7238482B2 (en) 2003-05-07 2007-07-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US7125672B2 (en) 2003-05-07 2006-10-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts
US20110059496A1 (en) 2003-06-25 2011-03-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
US7267976B2 (en) 2003-07-02 2007-09-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous yeasts
DE602004027250D1 (de) * 2003-07-09 2010-07-01 Nisshin Oillio Group Ltd Verfahren zur herstellung von symmetrischem triglycerid
EP2166067B1 (de) 2003-08-01 2015-07-01 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
US8173870B2 (en) 2003-08-21 2012-05-08 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from primula
US7504259B2 (en) 2003-11-12 2009-03-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Δ12 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeast
WO2005047480A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-15 desaturases suitable for altering levels of polyunsaturated fatty acids in oleaginous plants and yeast
MY140210A (en) 2003-12-22 2009-11-30 Suntory Holdings Ltd Marchantiales-derived unsaturated fatty acid synthetase genes and use of the same
BRPI0507716A (pt) 2004-02-17 2007-07-03 Univ York célula transgênica, planta, semente, vaso de reação, e, método para dessaturar um substrato de ácido graxo
WO2005083093A2 (de) 2004-02-27 2005-09-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen pflanzen
US9458436B2 (en) 2004-02-27 2016-10-04 Basf Plant Science Gmbh Method for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic plants
AU2005217080B2 (en) 2004-02-27 2011-02-24 Basf Plant Science Gmbh Method for producing unsaturated omega-3 fatty acids in transgenic organisms
DE102004017369A1 (de) 2004-04-08 2005-11-03 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Screeningverfahren zur Identifizierung von PUFA-PKS in Proben
DE102004017370A1 (de) 2004-04-08 2005-10-27 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh PUFA-PKS Gene aus Ulkenia
WO2005102310A1 (en) 2004-04-16 2005-11-03 Monsanto Technology Llc Expression of fatty acid desaturases in corn
CA3056163C (en) 2004-04-22 2021-04-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids by recombinant cells
CN103451246B (zh) 2004-04-22 2018-02-16 联邦科学技术研究组织 用重组细胞合成长链多不饱和脂肪酸
AU2005250074B2 (en) 2004-06-04 2011-04-14 Fluxome Sciences A/S Metabolically engineered cells for the production of polyunsaturated fatty acids
WO2006012326A1 (en) 2004-06-25 2006-02-02 E.I. Dupont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
DE102004060340A1 (de) 2004-07-16 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Erhöhung des Gehalts an mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
JP4587451B2 (ja) 2004-08-20 2010-11-24 サントリーホールディングス株式会社 ω３脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの利用
US8557551B2 (en) * 2004-09-10 2013-10-15 Dsm Ip Assets B.V. Compositions and methods for making and modifying oils
DE102004044421B4 (de) 2004-09-14 2010-06-24 Biotest Ag Verfahren zur Trennung eines von Willebrand Faktors mit einer spezifischen VWF-Aktivität von wenigstens 50 E/mg VWF-Antigen von einem von Willebrand Faktor mit niedriger Aktivität und Verwendung von Hydroxylapatit dafür
GB0421937D0 (en) 2004-10-02 2004-11-03 Univ York Acyl CoA synthetases
US7879591B2 (en) 2004-11-04 2011-02-01 E.I. Du Pont De Nemours And Company High eicosapentaenoic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US20060094102A1 (en) 2004-11-04 2006-05-04 Zhixiong Xue Ammonium transporter promoter for gene expression in oleaginous yeast
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
US8685679B2 (en) 2004-11-04 2014-04-01 E I Du Pont De Nemours And Company Acyltransferase regulation to increase the percent of polyunsaturated fatty acids in total lipids and oils of oleaginous organisms
US7192762B2 (en) 2004-11-04 2007-03-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina glycerol-3-phosphate o-acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7198937B2 (en) 2004-11-04 2007-04-03 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina diacylglycerol acyltransferase for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7273746B2 (en) 2004-11-04 2007-09-25 E.I. Dupont De Nemours And Company Diacylglycerol acyltransferases for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US7189559B2 (en) 2004-11-04 2007-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Mortierella alpina lysophosphatidic acid acyltransferase homolog for alteration of polyunsaturated fatty acids and oil content in oleaginous organisms
US20100120103A1 (en) 2004-12-14 2010-05-13 Avesthagen Limited Recombinant Production Docosahexaenoic Acid (DHA) in Yeast
DE102004062294A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten langkettigen Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102004063326A1 (de) 2004-12-23 2006-07-06 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Organismen
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
WO2006127655A2 (en) 2005-05-20 2006-11-30 Washington State University Enhancement of hydroxy fatty acid accumulation in oilseed plants
CN101321872B (zh) 2005-05-23 2012-09-05 阿凯迪亚生物科学公司 高γ-亚麻酸红花
WO2006135866A2 (en) 2005-06-10 2006-12-21 Martek Biosciences Corporation Pufa polyketide synthase systems and uses thereof
WO2007005727A2 (en) 2005-07-01 2007-01-11 Martek Biosciences Corporation Microwaveable popcorn and methods of making
WO2007005882A2 (en) 2005-07-05 2007-01-11 North Carolina State University Methods and compositions for expressing proteins in plants
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
AU2006316610B2 (en) 2005-11-23 2012-06-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
JP2009523414A (ja) * 2005-12-21 2009-06-25 ブルーディ、テクノロジー、ソシエダッド、リミターダ 細胞の酸化的損傷に関連した病変を治療するためのｄｈａ、ｅｐａまたはｄｈａ由来のｅｐａの使用
WO2007092460A2 (en) 2006-02-03 2007-08-16 The Texas A & M University System Enhancing expression of value-added genes by transgenic expression of tombusvirus-based p19 gene mutants
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
EP2004835A4 (en) 2006-03-15 2011-02-23 Martek Biosciences Corp MERHFACH UNSATURATED FATTY ACIDS CONTAINING PLANT SEA OILS
US7943823B2 (en) 2006-04-28 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Delta-8 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
WO2007133425A2 (en) 2006-05-01 2007-11-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fungal delta12 desaturase and delta15 desaturase motifs
MX2008015182A (es) 2006-05-29 2008-12-12 Icon Genetics Gmbh Sistema de expresion inducible basado en virus de plantas.
DE102006034313A1 (de) 2006-07-21 2008-01-24 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure
CA2659993C (en) 2006-08-24 2016-01-05 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
CA2661697A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
EP2054509A2 (de) 2006-10-06 2009-05-06 BASF Plant Science GmbH Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
US8916361B2 (en) 2006-11-17 2014-12-23 Abbott Laboratories Elongase gene and uses thereof
US7709239B2 (en) 2006-12-07 2010-05-04 E.I. Du Pont De Nemours And Company Mutant Δ8 desaturase genes engineered by targeted mutagenesis and their use in making polyunsaturated fatty acids
WO2008104559A1 (de) 2007-02-27 2008-09-04 Norddeutsche Pflanzenzucht Verfahren zur herstellung von mehrfach ungesättigten fettsäuren in transgenen organismen
JP2010523113A (ja) 2007-04-03 2010-07-15 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー マルチザイム（ｍｕｌｔｉｚｙｍｅ）および多価不飽和脂肪酸の製造におけるその使用
US8119860B2 (en) 2007-04-16 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 elongases and their use in making polyunsaturated fatty acids
US7943365B2 (en) 2007-05-03 2011-05-17 E.I. Du Pont De Nemours And Company Δ-5 desaturases and their use in making polyunsaturated fatty acids
CN101677517A (zh) 2007-05-31 2010-03-24 孟山都技术公司 用于生产高油含量大豆的组合物
US8318914B2 (en) 2007-07-31 2012-11-27 Bioriginal Food & Science Corp. Elongases and methods for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
PL2176433T3 (pl) 2007-07-31 2012-04-30 Basf Plant Science Gmbh Desaturazy i sposób przygotowania wielokrotnie nienasyconych kwasów tłuszczowych w organizmach transgenicznych
US9506075B2 (en) 2007-08-01 2016-11-29 Bioglow, Llc Bioluminescent plants comprising bacterial LUX operon and methods of making same
US8119784B2 (en) 2008-04-02 2012-02-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-4 desaturase and its use in making polyunsaturated fatty acids
FR2929514B1 (fr) * 2008-04-08 2011-01-14 Lr Beva Compositions comprenant de l'acide myristique, des acides gras comprenant un diene conjugue n-5cis, n-7trans ou un triene conjugue n-5cis, n-7trans, n-9cis et leurs applications
CA2722275A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Polypeptides and methods for producing triacylglycerols comprising modified fatty acids
WO2009130291A2 (de) * 2008-04-25 2009-10-29 Basf Plant Science Gmbh Pflanzensamenöl
BRPI0911892A8 (pt) 2008-04-30 2018-06-26 Rothamsted Res Ltd polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, polipeptídeo e organismo não humano, transgênico, e uso dos mesmos, processo de geração de um polipeptídio com atividade de desaturase ou elongase, anticorpo e processo para a produção de uma composição de óleo, lipídio ou ácido graxo
JP5047872B2 (ja) 2008-04-30 2012-10-10 篠田プラズマ株式会社 ガス放電管および表示装置
US7807899B2 (en) 2008-05-08 2010-10-05 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of hybrid corn variety CH720554
DE112009001385T5 (de) 2008-06-03 2011-04-14 Basf Plant Science Gmbh Fettsäure-Dehydratasen und Anwendungen davon
WO2010005724A2 (en) 2008-06-16 2010-01-14 Engineering Services Network, Inc. Systems and methods for automated simulation of a propulsion system and testing of propulsion control systems
US8168858B2 (en) 2008-06-20 2012-05-01 E. I. Du Pont De Nemours And Company Delta-9 fatty acid elongase genes and their use in making polyunsaturated fatty acids
EP3431607A3 (en) 2008-07-01 2019-03-06 BASF Plant Science GmbH Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
ES2603530T3 (es) 2008-07-21 2017-02-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Aceite de semilla de algodón mejorado y usos
CA2768737A1 (en) 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
WO2010023202A2 (en) 2008-08-26 2010-03-04 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
AR073855A1 (es) 2008-10-14 2010-12-09 Monsanto Technology Llc Utilizacion de desaturasas de acidos grasos de hemiselmis spp.
AU2009317860B2 (en) 2008-11-18 2014-03-27 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes and methods for producing omega-3 fatty acids
PL2376638T3 (pl) 2008-12-12 2014-01-31 Basf Plant Science Gmbh Desaturazy oraz sposób wytwarzania wielonienasyconych kwasów tłuszczowych w organizmach transgenicznych
CA2760326A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
JP5931721B2 (ja) * 2009-06-16 2016-06-08 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ アシルＣｏＡリゾリン脂質アシルトランスフェラーゼの発現による長鎖オメガ−３及びオメガ−６多価不飽和脂肪酸生合成の改良
US8188335B2 (en) 2009-07-17 2012-05-29 Abbott Laboratories Δ9-elongase for production of polyunsaturated fatty acid-enriched oils
CA3161358A1 (en) 2009-07-17 2011-01-20 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases and elongases and uses thereof
CN106222166B (zh) 2009-08-31 2020-09-08 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中增强种子特异性基因表达而促进增强的多不饱和脂肪酸合成的调节性核酸分子
EP2504427B1 (en) 2009-11-24 2018-06-27 BASF Plant Science Company GmbH Novel fatty acid desaturase and uses thereof
WO2011064183A1 (en) 2009-11-24 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid elongase and uses thereof
TW201144442A (en) 2010-05-17 2011-12-16 Dow Agrosciences Llc Production of DHA and other LC-PUFAs in plants
AR083323A1 (es) 2010-06-28 2013-02-21 Commw Scient Ind Res Org Metodos para producir lipidos
US9062315B2 (en) 2010-10-01 2015-06-23 Kyushu University, National University Corporation Method for transformation of stramenopile
CA2814892A1 (en) 2010-10-21 2012-04-26 Basf Plant Science Company Gmbh Novel fatty acid desaturases, elongases, elongation components and uses thereof
TW201307553A (zh) 2011-07-26 2013-02-16 Dow Agrosciences Llc 在植物中生產二十二碳六烯酸（ｄｈａ）及其他長鏈多元不飽和脂肪酸（ｌｃ－ｐｕｆａ）之技術
AU2013246661B2 (en) 2012-04-12 2018-12-20 Rothamsted Research Ltd Production of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids
CA2876519C (en) 2012-06-15 2020-09-15 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
CN104520313A (zh) 2012-08-03 2015-04-15 巴斯夫植物科学有限公司 新的酶、酶组合物及其用途
GB201217524D0 (en) 2012-10-01 2012-11-14 Rothamsted Res Ltd Recombinant organisms
WO2015196250A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Lipid comprising docosapentaenoic acid
KR102535223B1 (ko) 2013-12-18 2023-05-30 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 장쇄 다중불포화 지방산을 포함하는 지질

Also Published As

Publication number Publication date
NZ721036A (en) 2023-07-28
CL2019003105A1 (es) 2020-04-17
WO2015089587A1 (en) 2015-06-25
CL2016001560A1 (es) 2017-10-20
IL246275B (en) 2018-12-31
PE20170253A1 (es) 2017-04-14
CN104726473A (zh) 2015-06-24
PH12016501194B1 (en) 2022-04-22
CN111154724A (zh) 2020-05-15
JP2017503053A (ja) 2017-01-26
PE20170431A1 (es) 2017-05-10
KR102386838B1 (ko) 2022-04-15
KR20220052373A (ko) 2022-04-27
US9718759B2 (en) 2017-08-01
KR20160111921A (ko) 2016-09-27
IL246275A0 (en) 2016-07-31
CN104726473B (zh) 2020-02-14
US20170305834A1 (en) 2017-10-26
CN111154724B (zh) 2024-02-06
EP3082405A1 (en) 2016-10-26
BR112016014508A2 (pt) 2018-07-31
JP2020023700A (ja) 2020-02-13
MX2016017355A (es) 2017-07-11
EA202092987A2 (ru) 2021-04-30
EA201600471A1 (ru) 2016-10-31
PH12016501194A1 (en) 2016-08-15
US20190194572A1 (en) 2019-06-27
JP6855249B2 (ja) 2021-04-07
US20150374654A1 (en) 2015-12-31
US20190100485A1 (en) 2019-04-04
JP2017532949A (ja) 2017-11-09
EA037817B1 (ru) 2021-05-25
SG11201604871VA (en) 2016-07-28
JP6972074B2 (ja) 2021-11-24
CA3241340A1 (en) 2015-06-25
EA202092987A3 (ru) 2021-11-30
US20170211013A1 (en) 2017-07-27
US11623911B2 (en) 2023-04-11
EP3082405A4 (en) 2017-12-13
US9725399B2 (en) 2017-08-08
MX2016008270A (es) 2017-05-26
US10190073B2 (en) 2019-01-29
AU2014366839B2 (en) 2021-07-01
AU2014366839A1 (en) 2016-06-30
US20150166928A1 (en) 2015-06-18
KR102535223B1 (ko) 2023-05-30
JP6726619B2 (ja) 2020-07-22
US10125084B2 (en) 2018-11-13
US10800729B2 (en) 2020-10-13
CA2933909A1 (en) 2015-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA122768C2 (uk) Екстрагований рослинний ліпід, що містить довголанцюгові поліненасичені жирні кислоти
UA117223C2 (uk) Спосіб продукування довголанцюгових поліненасичених жирних кислот у рослинній клітині
JP6749978B2 (ja) オメガ−３脂肪酸を産生するための酵素および方法
UA124293C2 (uk) Рослина, яка має біологічну активність гаплоїдного індуктора, і спосіб її застосування
UA111935C2 (uk) ТРАНСГЕННА РОСЛИНА, ЯКА МІСТИТЬ ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Ab, І ДНК, ЩО КОДУЄ ІНСЕКТИЦИДНИЙ БІЛОК Cry1Be, ДЛЯ КЕРУВАННЯ РЕЗИСТЕНТНІСТЮ КОМАХ
UA119135C2 (uk) Спосіб отримання трансгенної рослини
KR102771934B1 (ko) 신규 미세조류, 및 그 사용
CN101184844A (zh) 固醇酰基转移酶基因的鉴定
UA128281C2 (uk) Одержання маїсу, стійкого до північної плямистості листя
US10000764B2 (en) Gene for increasing plant weight and method for using the same
UA120172C2 (uk) Одержання омега 3 довголанцюжкових поліненасичених жирних кислот з олійних культур при використанні синтаз pufa траустохідридів
JP5856638B2 (ja) 植物の油脂を増産させる遺伝子及びその利用方法
AU2008332275C1 (en) Genes that increase plant oil and method for using the same
UA73267C2 (en) Recombinant gastric lipases of dog (lgc) and human (lgh), polypeptide derivatives thereof, method for producing by plants tranformation and use thereof
JP4581098B2 (ja) 植物でのペプチドの発現・集積方法
CN109477079A (zh) 增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法
JP2020036591A (ja) コロラドハムシに対する抵抗性が高められた植物、及びその製造方法、並びに植物におけるコロラドハムシに対する抵抗性の判定方法
UA126971C2 (uk) Інсектицидний поліпептид з поліпшеним спектром активності і його застосування
UA122770C2 (uk) Ліпід, що містить докозапентаєнову кислоту
AU2013200358B2 (en) Genes that increase plant oil and method for using the same
BR112012033692A2 (pt) Métodos para produzir lipídios
KR20240121188A (ko) 콩 알레르기성이 저감된 유전자 교정 콩 식물체 및 이의 제조 방법
Huang Evolution and functions of oleosins and oleosin-coated oil bodies in plants